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CN1973029A - 含有细胞和组织培养的纳米纤丝结构和应用 - Google Patents

含有细胞和组织培养的纳米纤丝结构和应用 Download PDF

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CN1973029A
CN1973029A CNA2004800324541A CN200480032454A CN1973029A CN 1973029 A CN1973029 A CN 1973029A CN A2004800324541 A CNA2004800324541 A CN A2004800324541A CN 200480032454 A CN200480032454 A CN 200480032454A CN 1973029 A CN1973029 A CN 1973029A
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梅尔文S·辛德勒
侯Y·钟
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Michigan State University MSU
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Michigan State University MSU
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Abstract

公开了用于细胞培养和组织工程的纳米纤丝结构。纳米纤丝结构可用于各种应用，包括用于增殖和/或分化细胞以及制备组织的方法。还公开了改良纳米纤维，包含脂质、亲脂性分子或化学修饰表面。纳米纤维可用于各种应用，包括形成用于细胞培养和组织工程的纳米纤丝结构。

Description

含有细胞和组织培养的纳米纤丝结构和应用
发明领域
本发明涉及用于细胞培养和组织工程的纳米纤丝(nanofibrillar)结构，和用于增殖和/或分化细胞以及制备组织的方法。本发明另一方面涉及用于细胞培养的、包含纳米纤维(nanofiber)基质的培养基。本发明另一方面涉及改良的纳米纤维，其包含脂质、亲脂性分子或化学修饰的表面。改良的纳米纤维可用于各种应用。在一个应用中，使用改良的纳米纤维可制备用于细胞培养和组织工程的纳米纤丝结构。在另一应用中，使用改良的纳米纤维可制备用于细胞培养的培养基。
发明背景
体内细胞增殖和分化受细胞间独特的空间相互作用调控。结合特定粘附分子拓扑区别位置的空间插入，和特定体液因子的释放(例如生长和分化因子)，作为细胞增殖，分化，迁移，保持静止状态，或引发细胞凋亡的信号。细胞对这些信号激发(signaling trigger)的应答能力依赖于特定分子表面和细胞内受体的有效性。由这些分子刺激的信号转导途径依赖细胞骨架的组织结构，其中该骨架的结构具有多点细胞表面与这些信号分子、周边细胞(surrounding cell)以及细胞外基质进行相互作用的功能。
设计细胞和组织培养环境时，重要的是考虑生长环境应包括细胞的相互作用。细胞类型、空间插入物(spatial cue)，和化学激发物以及调节物在调控相关细胞内的基因表达中发挥重要作用(Li等，2002，FASEB J.，17：97-99；Botarro等，2002，Ann.N.Y.Acad.Sci.，961：143-153；Kunz-Schughart等，2003，Am.J.Physiol.Cell Physiol.，284：C209-C219；Cukierman等，2001，Science，294：1708-1712)。过去在细胞和组织培养实践中进展目的在于提供接近组织中体内微环境复杂度的生物化学和物理条件(Cukierman等，2001，Science，23：1708-1712；Li等，2002，FASEB J.，17：97-99；Chiu等，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97：2408-2413)。这些努力一直受到包括细胞系用途的因素限制，其中细胞系被持续培养，并根据它们在缺乏空间插入物和化学激发物以及存在于体内组织中的调节物的平面培养表面上的增殖能力进行挑选。
近来的研究证实由三维纳米纤丝的空间组织(例如胶原质和胞外基质的其它纤丝元件)产生的独特微环境和纳米环境，对细胞粘附、信号转导和分化功能的类组织模式是必不可少的。细胞在固体平面培养表面上粘附和生长，引起细胞组织模式不同于从体内组织中观察的细胞组织模式(Walpita和Hay，2002，Nature Rev.Mol.Cell.Biol.，3：137-141；Cukierman等，2001，Science，23：1708-1712；Mueller-Klieser，1997，Am.J.Physiol.，C1109-C1123)。当在通常的平面细胞培养表面上生长时，纤维原细胞，例如，呈现高度伸展和粘附形态，其中位于细胞质中的肌动蛋白网络被组织成厚应力纤维阵列。相反，当纤维原细胞在胶原质凝胶中生长或在组织中被观察时，其呈纺锤体形状，带有被组织成皮质环的肌动蛋白(Tamariz和Grinnell，2002，Mol.Biol.Cell，13：3915-3929；Walpita和Hay，2002，Nature Rev.Mol.Cell.Biol.，3：137-141；Grinnell等，2003，Mol.Biol.Cell，14：384-395)。此外，相对于在三维细胞培养中生长的癌细胞，在二维细胞培养中生长的癌细胞的药物敏感度表现出显著的差异；对包含化学疗法的癌治疗的设计具有显著影响的结果(Mueller-Klieser，1997，Am.J.Physiol.，273：C1109-C1123；Padron等，2000，Crit.Rev.Oncol./Hematol.，36：141-157；Jacks和Weinberg，2002，Cell，111：923-925；Weaver等，2002，Cancer Cell，2：205-216)。
细胞培养和组织培养的重大进展，是引入了由非毒性和生物相容的材料组成的基质，被设计成作为支架(scaffold)和用于划分体外和体内细胞的三维空间组织体(美国专利申请号20020133229；美国专利申请号20020042128；美国专利申请号20020094514；美国专利申请号20020090725)。这些方案的目的在于提供生长面，具有类体内组织几何学和微米和纳米环境，以用于细胞增殖和分化为功能性组织或再生受损结构。这些支撑功能细胞的结构可用于各种用途，包括修复或替换体内的受损组织，以及促进新组织和器官的生长。
然而，三维细胞和组织培养技术的成功制备，主要是依靠单独实验室和尖端仪器起的专门作用。明显需要从单或复合材料制备培养基，提供与标准组织培养平板相关的使用方便、均一、质量控制以及适应性。另外，培养基材料和配方应考虑到所确定组合物的分层装配结构，更准确地反映组织中细胞层的组织。包含通过粗纤维载体分离的多层细纤维的介质，例如美国专利5,672,399中公开的过滤介质，不能提供用于活细胞生长的环境。
发明概述
纳米纤丝结构可从纳米纤维材料制备，提供可重复的纤维和基质尺寸，使用方便，均一，细胞反应，质量控制和适应性。纳米形貌，纳米纤丝结构的纳米纤维网络形貌以及纳米纤维空间网络的纳米纤维排列，被设计成提供体外仿生底层，该底层对于在单层或多层细胞培养中促进同型或异型细胞生长和/或细胞分化更加组织相容。
本发明的一个方面提供包含脂质的改良纳米纤维。纳米纤维直径小于约1000nm。改良纳米纤维可用于各种用途，包括细胞培养和组织工程。
本发明的优选方式包括结合了附加组合物的聚合物材料，影响聚合物的填充，使得聚合物电纺丝(electrospinning)导致生成大量多分散的纳米纤维，该纳米纤维与来自不含添加剂组分的聚合物溶液中大量多分散的纳米纤维电纺(electrospun)相比，具有更多数量或百分率的细纤维。在一个实施方案中，聚合物溶液包含约0.25％到约15％w/w的添加剂组分。在另一个实施方案中，聚合物溶液包含约1％到约10％w/w的添加剂组分。在优选的实施方案中，添加剂组分是脂质。在另一个优选实施方案中，脂质是溶血卵磷脂、卵磷脂、神经鞘磷脂、胆固醇，或其组合。添加剂组分也可作为信号分子诱导细胞对纤维补充和粘附。
细纤维优选具有约5nm到约600nm的直径。在一个实施方案中，细纤维直径约50nm到约400nm。在另一个实施方案中，细纤维直径约300nm。在另一个实施方案中，细纤维直径约5nm到约200nm。在另一个实施方案中，细纤维直径约5nm到100nm。在另一个实施方案中，细纤维直径约5nm到约50nm。
具有更小直径的纳米纤维提供促进纳米纤维和细胞之间多点粘附的表面，细胞粘附至体内细胞外基质的特征。优选至少约25％的大量多分散的纳米纤维是细纤维。在一个实施方案中，至少约30％的大量多分散的含有纳米纤维的脂质是细纤维。在另一个实施方案中，至少约40％的大量多分散的含有纳米纤维的脂质是细纤维。在另一个实施方案中，至少约50％的大量多分散的含有纳米纤维的脂质是细纤维。在另一个实施方案中，至少约60％的大量多分散的含有纳米纤维的脂质是细纤维。在另一个实施方案中，至少约70％的大量多分散的含有纳米纤维的脂质是细纤维。
在一个实施方案中，从聚酰胺、聚酯或其它适于体内、动物或人类应用的聚合物制备改良的纳米纤维。在另一个实施方案中，聚酯可以是聚(ε-乙内酯)、聚(乳酸酯)或聚(羟乙酸酯)。在另一个实施方案中，从包含至少约10％聚(ε-乙内酯)w/w在氯仿的聚合物溶液制备纳米纤维。在另一个实施方案中，从包含至少约15％聚(ε-乙内酯)w/w在氯仿的聚合物溶液制备纳米纤维。
本发明另一个优选方式涉及纳米纤维，包含一种或多种生物活性分子，包括但不限于，肽、多肽、脂质、碳水化合物、多糖、氨基酸、核苷酸、核酸、多核苷酸，或其杂交混合物。多肽包括纤维蛋白、粘附蛋白、生长因子以及分化因子。一些优选的生长因子包括VEGF，NGFs，PDGF-AA，PDGF-BB，PDGF-AB，FGFb，FGFa以及BGF。一些优选的分化因子包括神经营养物质、集落刺激因子和转化生长因子。
在一个实施方案中，将生物活性分子掺入制备纳米纤维的聚合物溶液。在另一个实施方案中，官能团可粘附于纳米纤维的外表面并且纳米纤维的功能性表面起反应以结合一个或多个生物活性分子。在一个实施方案中，使用等离子沉积法(plasmadeposition)将官能团粘附于纳米纤维的外表面。在另一个实施方案中，将官能团掺入制备纳米纤维的聚合物溶液中。
本发明另一个优选方式涉及包含荧光标记物的纳米纤维。荧光标记物允许，例如，纳米纤维可视化，在纳米纤维混合物中识别特定纳米纤维、识别纳米纤维或纳米纤维周围的纳米环境的化学或物理特性，以及评价可植入的纳米纤维和/或包含纳米纤维(含有用于设计组织的三维结构)的结构的降解和/或再分布。
荧光标记物可包括有机染料荧光团。在一个实施方案中，在纳米纤维电纺之前将荧光团加入聚合物。在另一个实施方案中，荧光团通过掺入纳米纤维表面的官能团结合纳米纤维。在另一个实施方案中，荧光团结合粘附纳米纤维的生物活性分子。荧光标记物可包括无机胶质半导体纳米晶体。在一个实施方案中，纳米晶体包括CdSe核和ZnS帽。在另一个实施方案中，纳米晶体包括量子点(quantum dot)。
荧光标记物可作为离子敏感元件。在一个实施方案中，纳米纤维可包含荧光标记物，其中标记物的荧光或荧光强度依赖离子浓度。所述的离子敏感元件可用于检测包括pH和钙，钠或磷酸盐流动的离子浓度变化。在另一个实施方案中，荧光标记物用作报告元件，以证明在纳米纤维表面和配体之间络合物生成，配体包括但不限于DNA/RNA核苷酸序列、碳水化合物、或肽/氨基酸序列。这种络合物生成可通过荧光发射波长的变化和/或在吸收器和发射器之间的能量传递进行说明。
本发明还包括识别纳米纤维的化学和/或物理特性的方法。在一个实施方案中，荧光标记物被赋予纳米纤维化学或物理特性，并且纳米纤维用给定的荧光标记物进行标记。所述化学和物理特性包括，但不限于纤维直径、生物活性分子、官能团、纤维的分解或降解速率、包含纳米纤维的聚合物组分、纤维的疏水性和亲水性、包含纳米纤维的聚合物溶解性、聚合物毒性、生物活性分子毒性，或其组合。用特定荧光标记物标记纳米纤维，例如，以便识别纳米纤维混合物或细胞阵列中各种纤维。纳米纤维可用多于一种荧光标记物进行标记，以便识别纳米纤维的多种化学和/或物理特性。
本发明另一个方面是包含一种或多种纳米纤维的纳米纤丝结构物，其中纳米纤丝结构物由一种或多种纳米纤维网络限定。在一个实施方案中，纳米纤维网络沉积于基层表面。可通过各种聚合物或聚合物系统制备纳米纤维。聚合物或聚合物系统优选是无细胞毒性的。在一个实施方案中，纳米纤维包括本发明改良的纳米纤维。在另一个实施方案中，可通过聚酰胺或聚酯制备纳米纤维。在另一实施方案中，聚酰胺或聚酯适于体内人体应用。在另一实施方案中，聚酯是聚(ε-己内酯)、聚(乳酸酯)或聚(羟乙酸酯)。在另一实施方案中，聚酰胺是尼龙6、尼龙66、尼龙610或其它生物相容的聚酰胺。在一个实施方案中，薄膜是光学透明聚酯薄膜。
在一个实施方案中，基层包括玻璃或塑料。在另一实施方案中，基层是培养容器的表面。在另一个实施方案中，基层包括薄膜。薄膜可以是水溶性的或水不溶性的。薄膜是生物可降解的和/或生物可分解的。薄膜优选是无细胞毒性的。在优选的实施方案中，薄膜是聚乙烯醇薄膜。
可单独使用或分层纳米纤丝结构物，以形成用于细胞或组织培养的纳米纤丝结构物的多层集合。在一个实施方案中，纳米纤丝结构物包括隔片。隔片起载体结构的作用。隔片提供充分的开口以允许细胞渗透和粘附于纳米纤维网络。隔片是水溶性的或水不溶性的。隔片可以是多孔渗水的或非多孔渗水的。隔片可以是生物可降解和/或生物可分解的。隔片优选是生物相容的。
在一个实施方案中，隔片包括第一和第二表面，其中隔片的第一表面接触沉积于基层上的纳米纤维网络表面，隔片的第二表面接触基层表面致使纳米纤维网络和基层被隔片的直径或厚度隔开。在另一个实施方案中，隔片包括第一和第二表面，其中隔片的第一表面接触第一纳米纤丝结构物的表面，隔片的第二表面接触第二纳米纤丝结构物的表面，致使两个纳米纤丝结构物被隔片的直径或厚度隔开。
本发明的纳米纤丝结构物具有许多体内和体外用途，包括修复伤口，培育人造皮肤、静脉、动脉、腱、韧带、软骨、心脏瓣膜，器官培养，烧伤治疗，以及骨移植。在一个实施方案中，通过将特定化学和物理特性工程设计入纳米纤维网络，基层和/或隔片，以构建适于细胞或组织生长环境的不同阵列，其中纳米纤维网络、基层/隔片包含单个纳米纤丝结构物元件和/或连续分层排列的单独纳米纤丝结构物。在某些实施方案中，从纤维直径和组合物的多相特性(heterogeneous nature)可获得唯一特性环境。单个纳米纤维，纳米纤丝结构以及纳米纤丝网络的物理特性和/或特征，包括但不限于，质地、粗糙度、粘附性、多孔性、硬度、弹性、几何性、相互连接性、面积体积比、纤维直径、纤维可溶性/不可溶性、亲水性/疏水性，以及纤维密度，可以不同和/或更改，以构建可促进包括增殖和/或分化的预期细胞活力的纳米和/或微米环境。在单个纳米纤丝结构物中或包含两种或多种纳米纤丝结构物的单元阵列中工程设计特定纳米和/或微米环境。
特定化学特性和识别基元(motif)，例如多肽、脂质、碳水化合物、氨基酸、核苷酸、核酸、多核苷酸或多聚糖，包括但不限于，生长因子、分化因子、纤维蛋白、粘附蛋白、糖蛋白、官能团、粘合化合物、解粘化合物以及靶向分子可被工程设计入纳米纤丝网络、基层和/或单个纳米纤丝结构物的隔片中，或以各向同性或以梯度性地提高包括生长和/或分化的一种或多种选定的细胞活性。一些优选的生长因子包括VEGF、NGFs、PDGF-AA、PDGF-BB、PDGF-AB、FGFb、FGFa以及BGF。一些优选的分化因子包括神经营养物质、集落刺激因子和转化生长因子。氨基酸、肽、多肽以及蛋白质可包括具有任意大小和复杂性的任意类型的所述分子以及所述分子的组合，包括但不限于结构蛋白、酶和肽激素。
本发明还包括制备组织的方法。在一个实施方案中，将两种或多种纳米纤丝结构物分层，以形成多层纳米纤丝的集合。活细胞沉积于纤维，且该结构在促进沉积细胞生长、迁移和/或分化的条件下进行培养。在另一实施方案中，通过改变和/或更改生长基质的选定的物理和/或化学特性，可在单个基质中工程设计促进细胞活性的纳米和/或微米环境。
在另一个实施方案中，在不同培养条件下将多种细胞类型在单个纳米纤丝结构物上培养。然后将两种或多种单个纳米纤丝结构物进行分层，以形成多层纳米纤丝的集合，并且该集合在促进预期的细胞活性(包括细胞生长和/或分化)的条件下培养。在另一个实施方案中，通过改变和/或更改纳米纤丝结构的选定的物理和/或化学特性，可在单个纳米纤丝结构物中，或者通过选择性分层单个纳米纤丝结构，可在纳米纤维的集合中，工程设计促进细胞活性的纳米和/或微米环境，从而获得预期的纳米或微米环境。选择同种或异种纤维的直径和组合物以优化增殖和/或分化。
本发明另一个方面是细胞培养基。在一个实施方案中，细胞培养基包括纳米纤维基质，其中网络具有约50nm至约1000nm的纤维直径，至少约2微米的平均纤维间距，约30％的基质硬度，以及连同外壁的顶部和底部，其中外壁高约10微米至约100mm，其中顶部和底部面积分别为约5mm2到约4×105mm2。在另一个实施方案中，外壁高度与顶部和底部面积适合于可用的培养血管或容器的尺寸。
细胞培养基包含基质、网络、垫片(mat)、片(sheet)或卷(roll)。在一个实施方案中，细胞培养基包含纳米纤维网络。在另一个实施方案中，使纳米纤维网络适于插入培养容器。在另一个实施方案中，细胞培养基沉积于培养容器的内表面。
附图说明
图1A-C是纳米纤丝结构的电子显微镜扫描图。图1A和B示出由随机沉积的聚酰胺纳米纤维组成的纳米纤丝垫片可组装为分层的表面。图1C示出纳米纤维可被电纺带有特定取向。
图2A-E是显微照片，示出了对来自含有脂质增加量的聚合物溶液的微纤维电纺丝进行比较。
图3A和B是显微照片，示出了对生长于组织培养平板上的正常大鼠肾纤维原细胞进行比较，该平板包有含有脂质的纳米纤维或不含有脂质的纳米纤维。
图4A-C是显微照片，示出了对生长于聚酰胺纳米纤维网络，玻璃和包有聚赖氨酸的玻璃上的正常大鼠肾纤维原细胞进行比较。
图5A和B是显微照片，示出了氨基官能团掺入纳米纤维表面。
图6是显微照片，示出了带有量子点的纳米纤维的荧光标记。
具体实施方式
I.定义
本文所用的术语“纳米纤丝结构”指包含适于活细胞生长的环境的结构，包括一种或多种纳米纤维，其中该结构由一种或多种纳米纤维网络限定。在一些实施方案中，纳米纤丝结构物包含基层，其中纳米纤丝结构由一种或多种沉积于基层表面的网络限定。工程设计纳米纤丝结构的纳米形貌、纳米纤维网络形貌以及纳米纤维网络在空间的纳米纤维排列，以提供体外仿生底层，该底层对于在单层或多层细胞培养中促进同型或异型细胞生长和/或细胞分化更加组织相容。将纳米纤丝结构分层，以形成多层纳米纤丝的集合，单元阵列或组织结构。
本文所用的术语“纳米纤维”指包括直径为约1000纳米或更少的聚合物细纤维。聚合物优选是无细胞毒性的聚合物。聚合物可以是水溶性的或水不溶性的。聚合物是生物可降解的和/或生物可分解的。聚合物可以是聚酯或聚酰胺。聚酯可以是脂肪族聚酯，包括但不限于聚乳酸、聚(羟乙酸酯)、聚(ε-己内酯)及其共聚物。聚酰胺可以是聚已内酯、尼龙6、尼龙66、尼龙612或其它尼龙材料。
纳米纤维可包含脂质或亲脂性分子，包括但不限于，溶血卵磷脂、卵磷脂、神经鞘磷脂、胆固醇，或其混合物。纳米纤维可包含一种或多种生物活性分子。优选一种生物活性分子是肽、多肽、脂质、碳水化合物、多糖、氨基酸、核苷酸、核酸、多核苷酸，或其杂交混合物。纳米纤维可包含一种或多种醇基、醛基、氨基、羧基、巯基或感光官能团。感光官能团优选是卡宾(carbine)或氮宾(nitrene)。
纳米纤维可包含一种或多种生长因子和/或分化因子。纳米纤维可释放一种或多种生长因子和/或分化因子。通过纳米纤维的降解和/或分解速率确定释放速率。
本文所用的术语“网络”指控制纳米纤维在空间随机或定向的分布，以在选定的纤维之间形成可提高生长和培养稳定性的具有间隔的互相连接的网状物。网络在纤维之间具有小间隙，包括在网络中形成孔或通道的网络。孔或通道通过厚度有约0.01微米至约25微米的直径，优选约2微米至约10微米。网络可以包含纳米纤维单层，由连续纳米纤维形成的单层，纳米纤维多层，由连续纳米纤维形成的多层，或垫片。网络可以是解开的或网状的。网络具有单个纳米纤维直径至约2000nm的厚度。可将网络的物理特性，包括但不限于，质地、粗糙度、粘附性、多孔性、硬度、弹性、几何性、相互连接性、面积体积比、纤维直径、纤维可溶性/不可溶性、亲水性/疏水性、纤维密度，以及纤维取向设计为预期的参数。
本文所用的术语“基层”指纳米纤维或纳米纤维网络沉积其上的任何表面。基层可以是为纳米纤维的沉积网络提供支撑结构的任何表面。基层可包含玻璃或塑料。塑料优选是无细胞毒性的。基层可以是薄膜或培养容器。
基层可以是水溶性的或非水溶性的。水溶性的基层优选是聚乙烯醇膜。基层可以是多孔的或非多孔的。通过细胞渗透确定基层的多孔性。细胞能渗过多孔基层但不能渗过非多孔基层。多孔基层的孔优选直径约2μm至10μm。基层可以是生物可降解的和/或生物可分解的。基层优选是生物相容的。
基层包含一种或多种生物活性分子。优选一种生物活性分子是肽、多肽、脂质、碳水化合物、多糖、氨基酸、核苷酸、核酸、多核苷酸，或其杂交分子。基层可包含一种或多种醇基、醛基、氨基、羧基、巯基或感光官能团。感光官能团优选是卡宾或氮宾。基层可包含一种或多种生长因子和/或分化因子。基层可释放一种或多种生长因子和/或分化因子。通过基层的降解和/或分解速率确定释放速率。
本文所用的术语“隔片”指从基层表面隔开纳米纤维或纳米纤维网络的层，或从第二纳米纤丝结构表面隔开第一纳米纤丝结构表面的层，使得结构被隔片的直径或厚度隔开。隔片可包括聚合物细纤维或薄膜。薄膜优选厚度为约10微米至约50微米。隔片可包括聚合物，包括纤维素、淀粉、聚酰胺、聚酯或聚四氟乙烯。细纤维可以包括微纤维。微纤维是含有约1.0μm至约10μm直径的聚合物细纤维。微纤维可以是解开的或网状的。
隔片可以是水溶性的或非水溶性的。隔片可以是多孔的或非多孔的。通过细胞渗透确定隔片的多孔性。细胞能渗过多孔隔片但不能渗过非多孔隔片。隔片可以是生物可降解的和/或生物可分解的。隔片优选是生物相容的。
隔片包含一种或多种生物活性分子。优选一种生物活性分子是肽、多肽、脂质、碳水化合物、核苷酸、核酸、多核苷酸、多糖、氨基酸，或其杂交分子。隔片可包含一种或多种醇基、醛基、氨基、羧基、巯基或感光官能团。感光官能团优选是卡宾或氮宾。隔片可包含一种或多种生长因子和/或分化因子。隔片可释放一种或多种生长因子和/或分化因子。通过隔片的分解或降解速率确定释放速率。
本文所用的术语“生物活性分子”指影响细胞或组织的分子。术语包括人体或兽医治疗法、营养保健品、维生素、盐、电解液、氨基酸、肽、多肽、蛋白质、碳水化合物、脂质、多醣、核酸、核苷酸、多核苷酸、糖蛋白、脂蛋白、糖酯、粘多糖、蛋白多糖、生长因子、分化因子、激素、神经传递素、信息素、抑素、前列腺素、免疫球蛋白、单核因子和其它细胞因子、湿润剂、矿物质、电子和磁性反应物质、光敏感物质、抗氧剂、可代谢为细胞能量源的分子、抗原，以及可引起细胞或生理反应的任何分子。可使用分子的任意组合以及这些分子的激动剂或对抗剂。甘油氨基多糖(glycoaminoglycans)包括糖蛋白、蛋白多糖和透明质酸。多醣包括纤维素、淀粉、褐藻酸、壳聚糖(chytosan)或透明质酸。细胞因子包括，但不限于心脏营养素、基质细胞衍生因子、巨噬细胞衍生趋化因子(MDC)、黑素瘤生长刺激活性(MGSA)、巨噬细胞炎性蛋白1α(MIP-1α)，2，3α、3β、4和5、白细胞介素(IL)1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、L-13、TNF-α和TNF-β。本发明所用的免疫球蛋白包括，但不限IgG、IgA、IgM、IgD、IgE及其混合物。氨基酸、肽、多肽和蛋白质可以包括具有任意大小和复杂性所述分子的任意类型，以及所述分子的组合。示例包括，但不限于结构蛋白质、酶和肽激素。
术语生物活性分子还包括纤维蛋白、粘附蛋白、粘合化合物、解粘化合物以及靶向化合物。纤维蛋白包括胶原质和弹性蛋白。粘合化合物/解粘化合物包括纤连蛋白、层粘连蛋白、凝血栓蛋白和肌腱蛋白C。粘附蛋白包括肌动蛋白、纤维蛋白、纤维蛋白原、纤连蛋白、玻连蛋白、层粘连蛋白、钙粘着蛋白、选择素、胞内粘附分子1、2和3，细胞基质粘着受体包括但不限于粘合素，例如α5β1、α6β1、α7β1、α1β2、α2β3和α6β4。
术语生物活性分子还包括瘦蛋白、白血病抑制因子(LIF)、RGD肽、肿瘤坏死因子α和β、血管内皮抑素、血管抑制素、凝血栓蛋白、骨形成蛋白-1、骨形态发生蛋白2和7、骨粘连蛋白、生长调节素样肽、骨钙素、干扰素α、干扰素aA、干扰素β、干扰素β、干扰素γ、干扰素1α、以及白细胞介素2，3，4，5 6，7，8，9，10，11，12，13，15，16，17和18。
本文所用的术语“生长因子”指促进细胞或组织增殖的生物活性分子。本发明使用的生长因子包括，但不限于，转化生长因子-α(TGF-α)、转化生长因子-β(TGF-β)、血小板衍生生长因子(包括AA、AB和BB同型(PDGF))、纤维原细胞生长因子(FGF)(包括FGF酸性同型1和2，FGF碱性2以及FGF4，8，9和10)、神经生长因子(NGF)(包括NGF2.5s、NGF7.0s、βNGF和神经营养物质)、脑衍生神经营养因子、软骨衍生因子、骨生长因子(BGF)、碱性纤维原细胞生长因子、胰岛素样生长因子(IGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、EG-VEGF、VEGF相关蛋白、Bv8、VEGF-E、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、胰岛素样生长因子(IGF)I和II、肝细胞生长因子、胶质细胞神经营养生长因子(GDNF)、干细胞因子(SCF)、角化细胞生长因子(KGF)、转化生长因子(TGF)(包括TGFsα、β、β1、β2和β3)、骨骼生长因子、骨基质衍生生长因子，和骨衍生生长因子，及其混合物。一些生长因子也可促进细胞或组织的分化。TGF，例如，可促进细胞或组织的生长和/或分化。一些优选的生长因子包括VEGF、NGFs、PDGF-AA、PDGF-BB、PDGF-AB、FGFb、FGFa以及BGF。
本文所用的术语“分化因子”指促进细胞分化的生物活性分子。术语包括，但不限于，神经营养蛋白、集落刺激因子(CSF)或转化生长因子。CSF包括粒细胞-CSF、巨噬细胞-CSF、粒细胞-巨噬细胞-CSF、促红细胞生成素以及IL-3。一些分化因子也可促进细胞或组织的生长。TGF和IL-3，例如，可促进细胞的分化和/或生长。
本文所用的术语“粘合化合物”指促进细胞粘附纤维表面的生物活性分子，包括粘合化合物。粘合化合物示例包括，但不限于，纤连蛋白、玻连蛋白和层粘连蛋白。
本文所用的术语“解粘化合物”指促进细胞脱离纤维的生物活性分子，包括解粘化合物。解粘化合物示施包括，但不限于，凝血栓蛋白和肌腱蛋白C。
本文所用的术语“靶向化合物”指作为诱导细胞补充和/或粘附纤维的信号分子的生物活性分子，包括靶向化合物。靶向化合物及其同源物受体的示例包括粘附肽(包括衍生于纤连蛋白和粘合素的RGD肽)、生长因子(包括EGF和EGF受体)以及激素(包括胰岛素和胰岛素受体)。
本文所用的术语“脂质”指不溶于水但易溶于无极有机溶剂的有机分子。术语包括亲脂性分子(包括但不限于植物和动物甘油三酸酯)、固醇、卵磷脂物质，包括溶血卵磷脂、卵磷脂、鞘磷脂，以及胆固醇。
本文所用的短语“使适于插入”指为用于或适合培养容器尺寸进行制造或制备，或为用于或适合培养容器尺寸调整大小，包括，例如，从片、卷或垫片削减尺寸或切片直至适于插入培养容器的尺寸。
本文所用的术语“培养容器”指容纳用于培养细胞或组织的培养基的容器。培养容器可以是玻璃或塑料的。优选塑料是非生物毒素的。术语培养容器包括，但不限于，单槽和多槽培养板、小室和多小室培养载玻片、盖玻片、吸杯、烧瓶、试管、瓶、滚瓶(roller bottle)、旋转瓶(spinner bottle)、灌注室(perfusion chamber)、生物反应器以及发酵罐。
本文所用的术语“垫片”指大量密集交叉、缠绕或粘附的纳米纤维。垫片中纳米纤维的分布可以是随机或定向的。垫片可以是解开或网状的。垫片沉积于或不沉积于基层上。垫片厚度约100至约1000nm。
II.发明实施方式
A.改良的纳米纤维
本发明一个方面提供包含脂质的改良纳米纤维。优选纳米纤维直径小于约1000nm。在一个实施方案中，纳米纤维直径约50至约1000纳米。改良的纳米纤维用于各种应用，包括细胞培养和组织工程。
i.聚合物和聚合物系统
改良的纳米纤维优选包含无细胞毒性的聚合物。聚合物可以是水溶性的或非水溶性的。聚合物是生物可降解的和/或生物可分解的。聚合物包括第一聚合物和第二聚合物，但第二聚合物是在升高的温度下经过调节或处理过的不同聚合物(在聚合物类型、分子量或物理性质上有差异)。
将共混聚合物反应并形成单个的化学物种，或通过退火过程物理组合成混合组合物。退火意味着类似结晶、应力松弛或取向的物理变化。将优选的材料以化学方法反应到单个聚合物种中，以至于微分扫描量热仪分析揭示单个的聚合材料。所述材料，当与优选的添加剂材料结合时，可在纳米纤维上形成添加剂包被的表面，当接触高温、高湿度和艰难的运行条件时，提供疏油性、疏水性或其它有关的改良稳定性。该材料种类的细纤维直径约1000nm至约小于5纳米。所述纤维具有光滑表面，包含不连续层的添加剂材料或包被添加剂材料的外层或者两者，该外层在聚合物表面是部分溶解的或熔合的。用于混合的聚合系统的优选材料包括尼龙6、尼龙66、尼龙6-10；尼龙(6-66-610)共聚物或其它线性常规的脂肪族尼龙组合物。优选的尼龙共聚物树脂(SVP-651)通过端基滴定来分析分子量(J.E.Walz和G.B.Taylor，determination of themolecular weight of nylon，Anal.Chem.Vol.19，Number 7，pp 448-450(1947))。数量平均分子量(Wn)介于21,500和24,800。通过三组分尼龙(约45％的尼龙6、约20％的尼龙66和约25％的尼龙610)的熔解温度相图评价组合物(第286页，Nylon PlasticsHandbook，Melvin Kohan ed.Hanser Publisher，New York(1995))。
报告的SVP 651树脂的物理性质是：
性质                 ASTM方法                 单位                 标准值
比重                D-792                   --                  1.08
吸水率              D-570                   ％                  2.5
(24小时浸液)
硬度              D-240               支柱D                65
熔点              DSC                 ℃()               154(309)
抗张强度          D-638               MPa(kpsi)            50(7.3)
@产量
断裂伸长率        D-638               ％                   350
弯曲模量          D-790               MPa(kpsi)            180(26)
体积电阻系数      D-257               ohm-cm               1012
具有87至99.9+％水解率的聚乙烯醇可用于该聚合物系统。优选这些进行交联，更优选它们进行交联并结合相当数量的疏油性和疏水性添加剂材料。
聚合物可以是单个聚合材料，可选与添加剂组合物结合以提高纤维寿命或操作特性。本发明这个方面所用的优选聚合物包括尼龙聚合物、聚偏二氯乙烯聚合物、聚偏二氟乙烯聚合物、聚乙烯醇聚合物，以及更具体地是，当结合强疏油性和疏水性添加剂所列出的那些材料，能导致微纤维或纳米纤维带有添加剂材料形成在细纤维表面的涂层中。此外，本发明可使用相似聚合物的混合物，例如相似尼龙、相似聚氯乙烯聚合物，聚偏二氯乙烯聚合物的混合物。另外，聚合混合物或差异聚合物熔体(alloy)也在本发明预期之内。在这方面，聚合物的相容性混合物对形成本发明的纳米纤维或微纤维材料是有用的。
添加剂组合物可以是有机或无机的，金属或非金属的。在一个实施方案中，聚合物溶液包含约0.25％至约70％w/w的添加剂组合物。在另外的实施方案中，添加剂组合物是生物活性分子。在另一个实施方案中，添加剂组合物是陶瓷。添加剂组合物可以是光学添加剂，提高或减少显微镜使用的固有纤维荧光性。在一个实施方案中，光学添加剂是量子点。在另一个实施方案中，光学添加剂通过提高信号噪声比使纤维的荧光背景最小化。光学添加剂的示例包括，但不限于量子点或FluoroblokTM(BectinDickinson，Franklin Lakes，NJ)。
本发明聚合组合物所用的聚合物材料包括加聚物和缩聚物材料，例如聚烯烃、聚缩醛、聚酰胺、聚酯、纤维素醚和酯、聚亚烷基硫化物、聚芳基氧化物、聚砜、改良的聚砜聚合物及其混合物。属于这些种类的优选材料包括以交联和非交联形式的聚乙烯、聚(ε-己内酯)、聚(乳酸酯)、聚(羟乙酸酯)、聚丙烯、聚(氯乙烯)、聚甲基丙烯酸甲酯(和其它丙烯酸树脂)、聚苯乙烯、及其共聚物(包括ABA型嵌段共聚物)、聚(偏二氟乙烯)、聚(偏二氯乙烯)、各种水解度数的聚乙烯醇(87％至99.5％)。优选的加聚物倾向于玻璃质的材料(高于室温的Tg)。这是适于聚氯乙稀和聚甲基丙烯酸甲酯，聚苯乙烯聚合物组合物或熔体，或对聚偏二氟乙烯和聚乙烯醇材料用低结晶度。
例如聚(ε-己内酯)、聚(乳酸酯)、聚(羟乙酸酯)及其共聚物的脂肪族聚酯，是生物可降解的和生物相容的，并属于食品药品管理局(FDA)批准的、用于某些人体临床应用的几个合成聚合物，例如外科缝合线和一些可植入装置。在一个实施方案中，从适于体内人体应用的脂肪族聚酯制备纳米纤维。优选聚酯是聚(ε-己内酯)、聚(乳酸酯)或聚(羟乙酸酯)。在一个实施方案中，从包含至少约10％聚(ε-己内酯)w/w在氯仿的的聚合物溶液制备纳米纤维。在另一个实施方案中，从包含至少约15％聚(ε-己内酯)w/w在氯仿的聚合物溶液制备纳米纤维。
聚酰胺缩聚物的一类是尼龙材料。术语“尼龙”是所有长链合成聚酰胺的属名。通常，尼龙名称包含一系列数字，例如在尼龙-6，6中，其表示起始材料是C6二胺和C6二酸(第一个数字表示C6二胺，第二个数字表示C6二羧酸化合物)。在有少量水的情况下，通过ε-己内酰胺的缩聚作用制备别的尼龙。该反应形成线性聚酰胺的尼龙-6(由也称为ε-氨基己酸的环内酰胺制备)。另外，尼龙共聚物也是可预期的。通过在反应混合物中结合各种二胺化合物、各种二酸化合物以及各种环内酰胺结构物，然后在聚酰胺结构物中形成具有随机分布的单体材料的尼龙，以制备共聚物。例如，尼龙6，6-6，10材料是从己二胺与C6和C10二酸混合物所制备的尼龙。尼龙6-6，6-6，10是通过ε-氨基己酸、己二胺以及C6和C10二酸材料的混合物的共聚合作用制备的尼龙。
本发明的方法中也可使用嵌段共聚物。对于所述共聚物重要的是选择溶剂膨胀剂。选定的溶剂是使得嵌段都可溶于溶剂的。一个实例是二氯甲烷溶剂中的ABA(苯乙烯-EP-苯乙烯)或AB(苯乙烯-EP)聚合物。如果一种组分不可溶于该溶剂，它会形成凝胶。所述嵌段共聚物的示例是AB的Kraton类型和ABA嵌段共聚物，包括苯乙烯/丁二烯和苯乙烯/氢合丁二烯(乙烯丙烯)、ε-己内酰胺/乙撑氧的Pebax类型、Sympatex聚酯/乙撑氧，以及乙撑氧和异氰酸酯的聚氨酯。
加聚物，像聚偏二氟乙烯、间同立构聚苯乙烯、偏二氟乙烯和六氟乙烯的共聚物、聚乙烯醇、聚乙酸乙烯酯、无定形的加聚物，例如聚(丙烯腈)及其具有丙烯酸和甲基丙烯酯的共聚物，聚苯乙烯，聚(氯乙烯)及其各种共聚物，聚(甲基丙烯酸甲酯)及其各种聚合物，可比较容易地进行溶液纺丝，因为它们在低压和低温下是可溶的。然而，如果进行溶液纺丝，类似聚乙烯和聚丙烯的高度结晶聚合物需要高温、高压溶剂。因此，聚乙烯和聚丙烯的溶液纺丝是很困难的。静电溶液纺丝是一种制备纳米纤维和微纤维的方法。
我们还发现形成聚合组合物的基本优点，该组合物包含在聚合物混合物、熔体形式和在化学交联的连接结构中两种和多种聚合材料。我们相信这种聚合物组合物通过改变聚合物属性提高物理性质，例如促进聚合物链弹性或链流动性、增加总分子量以及通过聚合材料的网络形成提供强化。
在该原理的一个实施方案中，为获得有益性质，混合两种相关的聚合物材料。例如，高分子量的聚氯乙烯可混合低分子量的聚氯乙稀。相似地，高分子量的尼龙材料可混合低分子量的尼龙材料。另外，可混合普通聚合物属的不同种类。例如，高分子量的苯乙烯材料可混合低分子量、耐冲击的聚苯乙烯。尼龙-6材料可混合尼龙共聚物，例如尼龙-6；6，6；6，10共聚物。另外，具有低度水解的聚乙烯醇，例如87％水解的聚乙烯醇，可混合具有98和99.9％以及更高水解度的完全或超水解的聚乙烯醇。混合物中所有这些材料用合适的交联机理进行交联。尼龙可用与酰胺键中氮原子反应的交联剂进行交联。聚乙烯醇材料可用羟基反应材料如单醛，如甲醛、尿素、蜜胺甲醛树脂及其类似物、硼酸和其它无机化合物、二醛、二酸、氨基甲酸乙酯、环氧树脂类以及其它已知的交联剂，进行交联。交联技术是公知的和理解的现象，其中交联剂在聚合物链之间反应并形成共价键，以充分地提高分子量、耐化学性、整体强度以及机械降解抗性。
电纺产生直径不同的纳米纤维(一般约5nm至约1000nm)群体。本发明的优选方式涉及聚合材料与添加剂组合物结合，影响聚合物填充，使得聚合物电纺生成纳米纤维群体，与来自不含添加剂组分的聚合物溶液的纳米纤维电纺丝群体比较，具有更多数量或百分率的细纤维。在一个实施方案中，聚合物溶液包含约0.25％至约15％w/w的添加剂组分。在另一个实施方案中，聚合物溶液包含约1％至约10％w/w的添加剂组分。
优选细纤维直径约5nm至约600nm。在一个实施方案中，细纤维直径约50nm至约400nm。在另一个实施方案中，细纤维直径约300nm。在另一个实施方案中，细纤维直径约5nm至约200nm。在另一个实施方案中，细纤维直径约5nm至约100nm。在另一个实施方案中，细纤维直径约5nm至约50nm。
更小直径的纳米纤维提供在纳米纤维和细胞之间促进多点粘附的表面，细胞体内粘附于胞外基质的特性。优选地，含有纳米纤维的脂质群体至少约25％是细纤维。在一个实施方案中，含有纳米纤维的脂质群体至少约30％是细纤维。在另一个实施方案中，含有纳米纤维的多分散多个脂质群体至少约40％是细纤维。在另一个实施方案中，含有纳米纤维的多分散多个脂质群体至少约50％是细纤维。在另一个实施方案中，含有纳米纤维的多分散多个脂质群体至少约60％是细纤维。在另一个实施方案中，含有纳米纤维的多分散多个脂质群体至少约70％是细纤维。
优选添加剂组分是无细胞毒性的。在一个实施方案中，影响聚合物填充的添加剂组分是生物活性分子。生物活性分子可以是脂质。优选脂质是溶血卵磷脂、卵磷脂、鞘磷脂、胆固醇及其混合物。
添加剂组分能或不能影响细胞活性，包括迁移或细胞粘附纳米纤维。在一个实施方案中，包含添加剂组分的纳米纤维不影响细胞活性。优选地，添加剂组分包括一种或多种生物活性分子。生物活性分子的一种或多种是脂质。优选脂质是胆固醇。在另一个实施方案中，包含添加剂组分的纳米纤维可影响细胞活性。所述纳米纤维诱导细胞迁移或促进细胞粘附纳米纤维。优选添加剂组分包括一种或多种生物活性分子。一种或多种生物活性分子是脂质。在一个实施方案中，脂质是溶血卵磷脂、卵磷脂、鞘磷脂及其混合。在另一个实施方案中，添加剂组分包括胆固醇和一种或多种生物活性分子，影响细胞活性，包括生长因子，分化因子，和/或粘附蛋白。
聚合物或聚合物系统包含一种或多种生物活性分子，包括但不限于脂质或亲脂性分子、纤维蛋白、粘附蛋白、生长因子以及分化因子。优选至少一种生物活性分子包含脂质。在一个实施方案中，脂质分子作为信号分子诱导细胞对纤维复原和粘附。脂质分子还可引起细胞增殖或分化。纳米纤维包括生物活性分子，例如脂质，促进细胞定向迁移和紧密粘附，可用于体内或体外应用，包括修复伤口，培育人造皮肤、静脉、动脉、腱、韧带、软骨、心脏瓣膜器官培养，治疗烧伤，以及骨移植。优选脂质是溶血卵磷脂、卵磷脂、鞘磷脂或其混合。
优选一种或多种生物活性分子是生长因子、分化因子、纤维蛋白和/或粘附蛋白。优选生长因子是VEGF、骨形成蛋白因子β、EGF、PDGF、NGF、FGF、IGF或TGF。优选分化因子是神经营养蛋白、CSF或TGF。优选分化生长因子是神经营养蛋白、CSF或TGF。
本发明聚合物系统具有粘附特性，致使当接触纤维素、聚乙烯、聚酯、聚苯乙烯或聚酰胺基层时，以足够强度粘附于基层，使其牢固地结合基层并能经受与机械应力有关的脱离作用。本发明的纳米纤维可用于构建三维功能组织，包括肌肉和腱。在该模式中，当经受与例如肌肉或腱收缩有关的机械应力时，聚合物材料应坚持粘附基层。纳米纤维对基层的粘附起因于：当纤维接触基层或纤维通过热或压力在基层上进行后处理时形成纤维的溶剂作用。然而，聚合物特性在决定粘附中起重要作用，例如特定化学相互作用(类似氢键结合、在高于或低于Tg的聚合物和基层之间出现的接触，以及包含添加剂的聚合物形成)。在粘附过程中通过溶剂或蒸气增塑的聚合物具有增强的粘附性。
ii.功能化表面
将官能团掺入纳米纤维外表面。这些功能化表面可起反应，将肽、多肽、脂质、碳水化合物、多醣、氨基酸、核苷酸、核酸、多核苷酸或其它生物活性分子结合到纳米纤维表面。在一个实施方案中，纳米纤维的功能化表面起反应，以结合一种或多种生物活性分子。优选一种或多种生物化活性分子是生长因子、分化因子、粘附蛋白或衍生于粘附蛋白的生物活性肽。优选生长因子是VEGF、骨形成因子β、EGF、PDGF、NGF、FGF、IGF或TGF。优选分化因子是神经营养蛋白、CSF或TGF。优选分化因子是神经营养蛋白、CSF或TGF。优选生物活性肽是RGD肽。
在一个实施方案中，官能团通过等离子沉积沉积于纳米纤维外表面。等离子沉积在纳米纤维表面构建本地等离子体。然后将处理的表面与气态分子(例如丙烯胺和/或烯丙醇)在反应室里反应。在另一个实施方案中，在电纺丝过程中将官能团引入纳米纤维表面。十二烷胺、十二醛、十二烷硫醇或十二烷醇也可加入聚合物溶液。然后将聚合物溶液电纺成纳米纤维，其中部分添加的胺、醛、巯基或醇半体分别暴露于纳米纤维外表面。
iii.荧光标记物
纳米纤维可包含荧光标记物。荧光标记物允许，例如，纳米纤维可视化，在纳米纤维混合物中识别特定纳米纤维，识别纳米纤维的化学或物理性质，以及评价可植入的纳米纤维和/或包含纳米纤维的结构物的降解和/或再分布，其中该纳米纤维包括用于工程设计组织的多层集合，可降解并可运送到远离移植原始位置的其它区域。荧光标记物是可光漂白的或不可光漂白的。荧光标记物是pH敏感的或pH不敏感的。荧光标记物优选是无细胞毒性的。
荧光标记物包含有机染料荧光团，包括但不限于，Texas Red、BIODIPY、Oregon Green、Alexa Fluor、荧光素、Cascade Blue、Dapoxyl、香豆素、玫瑰精、N-甲基-4-肼-7-硝基、丹酰乙二胺、丹酰尸胺、丹酰肼或其混合。可在www-probes-com(Molecular Probes，Eugene，OR)中获得关于这些或其它适宜的有机染料荧光团的更多信息。在一个实施方案中，在电纺纳米纤维前将荧光团加入聚合物。在另一个实施方案中，荧光团通过掺入纳米纤维表面的官能团偶合纳米纤维。在另一个实施方案中，荧光团偶合粘附于纳米纤维的生物活性分子。
荧光标记物包括无机胶质半导体纳米晶体。在一个实施方案中，纳米晶体包括CdSe核和ZnS帽。在另一个实施方案中，纳米晶体包括量子点。可在www-evidenttech-com和www-quantumdots-com获得关于纳米晶体和量子点的更多信息。纳米晶体的吸收光谱广，从紫外线延伸到可见光谱界限。发射光谱窄，优选20-40nm的半幅值全宽，中心波长是选定的纳米晶体粒子大小的特征。纳米晶体优选是光化学稳定的和/或无细胞毒性的。
荧光标记物可用于识别纳米纤维的化学和/或物理性质。在一个实施方案中，荧光标记物被赋予纳米纤维化学或物理性质，并且纳米纤维标记有赋予的荧光标记物。所述化学和物理性质包括，但不限于纤维直径、生物活性分子、官能团、纤维溶解率或降解率、包含纳米纤维的聚合物组分、纤维的疏水性或亲水性、包含纳米纤维的聚合物溶解性、聚合物毒性、生物活性分子毒性或其组合。在一个实施方案中，生物活性分子是生长因子、分化因子、粘附分子或其混合。带特定荧光标记物标记的纳米纤维，例如，允许在纳米纤维混合物或单元阵列中识别各种类型的纤维。纳米纤维可用多于一种的荧光标记物进行标记，以便于识别纳米纤维的多种化学和/或物理性质。
荧光标记物可包括生物活性荧光探针，以确定生物化学环境中的变化。在一个实施方案中，纳米纤维可包含荧光标记物，其中标记物的荧光性或荧光强度依赖于离子浓度。所述的离子敏感元件可用于检测包括pH和钙、钠或磷酸盐流动的离子浓度变化。在一个实施方案中，荧光标记物包括SNARF、SNAFL、钙绿(calcium green)或其混合。在另一个实施方案中，由于和其它分子络合，纳米纤维含有能改变它们的荧光性质的染料的能力。
iv.应用
改良的纳米纤维可用于应用纳米纤维的许多已知用途，包括但不限于，过滤器应用，计算机硬盘驱动应用，和药物应用。改良的纳米纤维可用于各种生物学用途，包括细胞培养、组织培养和组织工程应用。在一个应用中，使用改良的纳米纤维，可制备用于细胞培养和组织工程的纳米纤丝结构物。在一个实施方案中，纳米纤丝结构包含一种或多种改良的纳米纤维，其中纳米纤丝结构由一种或多种改良的纳米纤维网络限定。在另一个实施方案中，纳米纤丝结构包含一种或多种改良的纳米纤维和基层，其中纳米纤丝结构由沉积于基层表面的一种或多种改良的纳米纤维网络限定。
在另一个应用中，使用改良的纳米纤维制备用于细胞培养的培养基。在一个实施方案中，培养基包括以适于插入培养容器的垫片、卷或片的形式的纳米纤维基质。在另一个实施方案中，培养基包括沉积于培养容器表面或作为纤维网孔加入培养容器的纳米纤维基质。
在另一个应用中，改良的纳米纤维在适于细胞或组织培养的三维结构中进行喷涂或纺丝。将得到的三维结构放回细胞培养装置用于连续培养，其中电纺丝结构作为细胞生长的平台。在另外的应用中，将改良的纳米纤维电纺成用于三维矩阵分层结构无纺网孔和/或编织层，以作为组织再生的模板。在另外的应用中，改良的纳米纤维在高通量药物分析和药物敏感分析中作为细胞培养基，以提高每孔细胞的数量，提供用于检测细胞应答的强信号。在另外一个应用中，改良的纳米纤维在高通量药物分析、药物敏感分析和其它治疗设计中作为细胞培养基，其中纳米纤维在体外环境中提供更接近地模拟细胞体内特性的环境。
B.纳米纤丝结构
本发明另一个方面是纳米纤丝结构。纳米纤丝结构包括活细胞生长的环境，包含一种或多种纳米纤维，其中纳米纤丝结构由一种或多种纳米纤维网络限定。在一些实施方案中，纳米纤丝结构包含基层，其中纳米纤丝结构由沉积于基层表面的一种或多种纳米纤维网络限定。工程设计纳米纤丝结构的纳米形貌，以在单层或多层细胞培养中提供用于促进同型或异型细胞生长和/或细胞分化的更类似组织的底层。
i.纳米纤维网络
纳米纤维包含纳米纤丝结构，可包括如上所述用于改良的纳米纤维的聚合物或聚合物系统。在一个实施方案中，从适于体内人体应用的聚合物制备纳米纤维。通过许多技术制备纳米纤维，包括优选电纺丝技术。聚合物的选择和/或工艺，通过其制备纳米纤维和/或定向并取向在基层上，允许特定选择和控制纳米纤维网络的物理性质。生长面的物理性质，包括纤维大小、纤维直径、纤维间距、基质密度、纤维质地和弹性，被证实是组织细胞中细胞骨架网络和胞外基质蛋白中细胞信号基序的暴露的重要考虑因素(Meiners，S.和Mercado，M.L.，2003，Mol.Neurobiol.，27(2)，177-196)。纳米纤维网络的物理性质可工程设计为预期参数，包括但不限于，质地、粗糙度、粘附性、多孔性、硬度、弹性、几何性、相互连接性、面积体积比、纤维大小、纤维直径、纤维可溶性/不可溶性、亲水性/疏水性以及纤维密度。
改变和/或更改纳米纤丝结构的一种或多种物理性质，以制备用于细胞生长和/或分化的特别定义的环境。例如，工程设计纳米纤丝结构的多孔性，以促进离子、代谢物和/或生物活性分子的扩散，和/或允许细胞渗入和透过纳米纤丝结构，以在能促进细胞和纳米纤维网络之间多点粘附的环境中生长。工程设计纳米纤丝结构的纳米纤维网络的互连性，以促进细胞-细胞接触。通过将生物活性分子加入制备纳米纤维的聚合物溶液，可提高或降低纳米纤丝结构的纳米纤维网络的弹性。在一个实施方案中，生物活性分子是脂质。在另外的实施方案中脂质是胆固醇。
工程设计纳米纤丝结构的质地和粗糙度，以促进细胞粘附。选择同源或异源纳米纤维组合物，以优化细胞生长或分化活性。例如，纳米纤丝结构由多个具有不同直径的纳米纤维组成，和/或由多个由不同聚合物制备的纳米纤维组成。工程设计纳米纤维网络的纳米纤维的溶解性或不可溶解性，以控制生物活性分子从纳米纤丝结构释放。在一个实施方案中，生物活性分子的释放速率由纳米纤维网络的纳米纤维的生物可降解或生物可分解速率确定。工程设计纳米纤丝结构的纳米纤维网络的疏水性和亲水性，以促进特定细胞间隔。工程设计纳米纤丝结构的硬度，以促进细胞生长和/或分化。在一个实施方案中，纳米纤丝结构具有约3％至约70％的硬度。在另一个实施方案中，纳米纤丝结构具有约3％至约50％的硬度。在另一个实施方案中，纳米纤丝结构具有约3％至约30％的硬度。在另一个实施方案中，纳米纤丝结构具有约3％至约10％的硬度。在另一个实施方案中，纳米纤丝结构具有约3％至约5％的硬度。在另一个实施方案中，纳米纤丝结构具有约10％至约30％的硬度。
电纺丝工艺使用电场控制聚合物的形成和沉积。通过电压注入聚合物溶液。电压引起电荷不平衡，导致聚合物溶液流从例如针的喷射器尖端喷射。在溶剂蒸发和形成纤维的期间，电场中聚合物喷射至接地的基层。得到的单个连续细丝作为基层上非纺织纤维收集。
制备具有随机或指定取向的电纺纳米纤维网络。如图1A和B所示，随机纤维可组装成分层面。在一个实施方案中，本发明的纳米纤维包含随机分布的细纤维，可结合形成联锁网络。纳米纤维联锁网络在纤维之间具有相对小的间隙。纤维之间所述间隙的范围一般在约0.01至约25微米，优选约2至约10微米。该间隙在纳米纤维网络中形成孔或通道，允许离子、代谢物、蛋白质，和/或生物活性分子的扩散，和/或允许细胞渗入和透过网络，并在细胞和纳米纤维之间促进多点粘附的环境中生长。
如图1C所示，纳米纤维网络以取向的方式进行电纺。所述取向的电纺允许制备纳米纤维网络，包括纳米纤维单层或由连续纳米纤维形成的单层，其中网络高度为单个纳米纤维的直径。通过在电纺丝过程中控制纳米纤维在基层上定向和/或取向，选择物理性质，包括多孔性，硬度，纤维密度，质地，粗糙度，和单层网络的纤维取向。优选孔的尺寸允许细胞渗透和/或迁移穿过单层纳米纤维网络。在一个实施方案中，纤维之间间隙约0.01至约25微米。在另一个实施方案中，纤维之间间隙是约2至约10微米。
个别单层网络的成层在纳米纤丝结构中形成通道，允许离子、代谢物、蛋白质和/或生物活性分子的扩散，和允许细胞渗透纳米纤丝结构，并在细胞和纳米纤维网络之间促进多点粘附的环境中生长。
也可使用相位分离技术以制备纳米纤丝结构。相位分离工艺一般包括聚合物分解，相位分离和形成凝胶，从带水凝胶中溶剂萃取，冷冻，然后在真空下冷冻干燥。使用如下通常步骤：将聚合物加入溶剂中，例如加入THF使溶液约1％(wt/v)到15％(wt/v)。搅拌溶液直至均匀。将聚合物溶液(预热至50℃)加入Teflon小瓶。然后迅速冷藏含有聚合物溶液的小瓶以形成凝胶。凝胶形成时间依赖于温度、溶剂和聚合物浓度。凝胶在一温度下保存至少120分钟。然后将凝胶浸入蒸馏水以便溶剂交换2天。溶剂交换后，从水中取出凝胶，用滤纸干燥，并冷冻于-18℃。然后在低于0.5mmHg的真空下将冷冻凝胶转入冷冻干燥的容器直至1周。然后将干燥的骨架保存于干燥器中。
包含纳米纤丝结构的纳米纤维，可包含如上所述用于改良的纳米纤维的一种或多种生物活性分子。生物活性分子可在制备网络时被掺入纳米纤维网络，或可通过官能团粘附于网络表面。在一个实施方案中，制备纳米纤维的聚合物或聚合物系统可包含一种或多种生物活性分子，包括但不限于脂质、生长因子、分化因子、纤维蛋白以及粘附蛋白。脂质可以是溶血卵磷脂、卵磷脂、鞘磷脂或者混合。生长因子优选是VEGF、骨形成因子β、EGF、PDGF、NGF、FGF、IGF或TGF。分化因子优选是神经营养蛋白、CSF或TGF。分化因子优选是神经营养蛋白、CSF或TGF。
可将官能团掺入如上所述用于改良的纳米纤维的网络表面。网络的功能化表面反应，以将肽、多肽、脂质、碳水化合物、多醣、核苷酸、核酸、多核苷酸或其它生物活性分子结合于网络表面。在一个实施方案中，网络的功能化表面反应，以结合一种或多种生物活性分子。一种或多种生物活性分子优选是生长因子、分化因子、纤维蛋白，和/或粘附蛋白。生长因子优选是VEGF、骨形成因子β、EGF、PDGF、NGF、FGF、IGF或TGF。分化因子优选是神经营养蛋白、CSF或TGF。
ii.基层
纳米纤丝结构的结构性质，例如强度和弹性，大部分由沉积纳米纤维网络的基层提供。基层可包括纤维素、玻璃或塑料。塑料优选是无细胞毒性的。基层是薄膜或培养容器。薄膜厚度优选不超过约10至约1000微米。
基层是水溶性的或非水溶性的。水溶性的基层优选是聚乙烯醇膜，可与聚乙烯醇纤维基质使用。基层是多孔性或非多孔性的。基层多孔性由细胞渗透率确定。细胞能透过多孔基层但不能透过非多孔基层。多孔基层中孔直径优选是约2μm至约10μm。基层是生物可降解的和/或生物可分解的。基层优选是生物相容的。
基层包含一种或多种生物活性分子。生物活性分子在制备基层时被掺入基层，或通过官能团粘附于基层表面。官能团可掺入基层表面，如用于改良的纳米纤维所述。基层的功能化表面反应，以将肽、碳水化合物、多醣、脂质、核苷酸、核酸、多核苷酸或其它生物活性分子结合于基层表面。
在一个实施方案中，基层的功能化表面反应，以结合一种或多种生物活性分子。一种或多种生物活性分子优选是生长因子、分化因子、纤维蛋白和/或粘附蛋白。生长因子优选是VEGF、骨形成因子β、EGF、PDGF、NGF、FGF、IGF或TGF。分化因子优选是神经营养蛋白、CSF或TGF。分化因子优选是神经营养蛋白、CSF或TGF。基层可释放一种或多种生物活性分子。释放率由基层的分解和/或降解速率确定。
iii.隔片
纳米纤丝结构的结构性质，例如强度和弹性，还可由隔片提供。隔片还可在纳米纤维网络和基层之间提供充分间隔，或在两种或多种纳米纤丝结构之间提供充分间隔，以允许细胞渗透并粘附于纳米纤维。
在一个实施方案中，隔片包括第一和第二表面，其中隔片的第一表面接触沉积于基层的纳米纤维网络表面，隔片的第二表面接触基层表面，致使纳米纤维网络和基层被隔片的直径或厚度隔开。在另一个实施方案中，隔片包括第一和第二表面，其中隔片的第一表面接触第一纳米纤丝结构的表面，隔片的第二表面接触第二纳米纤丝结构的表面，致使两个纳米纤丝结构被隔片的直径或厚度隔开。
隔片包括细纤维或薄膜。薄膜厚度优选为不大于约10至约50微米。细纤维包括微纤维。微纤维直径优选为约1微米至约10微米。微纤维是解开的或网状的。可从许多聚合物，包括纤维素、聚酰胺、聚酯和聚四氟乙烯，制备微纤维。
隔片是水溶性的或非水溶性的。隔片是多孔的或非多孔的。基层的多孔性由细胞渗透率确定。细胞能透过多孔隔片但不能透过非多孔隔片。多孔隔片的孔直径优选是约2μm至约10μm。隔片是生物可降解的和/或生物可溶解的。隔片优选是生物相容的。
隔片包含一种或多种生物活性分子。生物活性分子在制备隔片时被掺入隔片，或通过官能团粘附于隔片表面。官能团可掺入隔片表面，如用于改良的纳米纤维所述。隔片的功能化表面反应，以将肽、碳水化合物、多醣、脂质、核苷酸、核酸、多核苷酸或其它生物活性分子结合于隔片表面。
在一个实施方案中，隔片的功能化表面反应，以结合一种或多种生物活性分子。一种或多种生物活性分子优选是生长因子、分化因子、纤维蛋白和/或粘附蛋白。生长因子优选是VEGF、骨形成因子β、EGF、PDGF、NGF、FGF、IGF或TGF。分化因子优选是神经营养蛋白、CSF或TGF。分化因子优选是神经营养蛋白、CSF或TGF。隔片可释放一种或多种生物活性分子。释放率由隔片的分解和/或降解速率确定。
iii.纳米纤丝结构的多层组合
本发明的纳米纤丝结构可用于多种应用，包括细胞培养和组织培养应用，用于药物发现的高通量应用和过滤应用。在一个应用中，纳米纤丝结构可被单独使用或分层使用，以形成用于细胞或组织培养的多层纳米纤丝的组合。纳米纤丝结构具有许多体内和体外用途，包括修复伤口，培育人造皮肤、静脉、动脉、腱、韧带、软骨、心脏瓣膜，器官培养，治疗烧伤，以及骨移植。
细胞或组织生长环境的不同阵列可由将特定化学和物理性质工程设计入纳米纤维网络，基层和/或隔片构建，包括单个纳米纤丝结构和/或连续分层的单个纳米纤丝结构。改变和/或更改单个纳米纤丝结构的物理性质和/或特征，包括但不限于，质地、粗糙度、粘附性、多孔性、硬度、弹性、几何性、相互连接性、面积体积比、纤维直径、纤维可溶性/不可溶性、亲水性/疏水性，纤维密度，和纤维取向，以构建纳米和/或微米环境，促进一种或多种选定的细胞活性，包括生长和/或分化。在单个纳米纤丝结构中或包含两种或多种分层纳米纤丝结构的单元阵列中工程设计特定纳米和/或微米环境。
特定的识别基元，例如肽、多肽、脂质、碳水化合物、氨基酸、核苷酸、核酸、多核苷酸或多聚糖，包括但不限于生长因子、分化因子、纤维蛋白、粘附蛋白、糖蛋白、官能团、粘合化合物、解粘化合物以及靶向分子可被工程设计入纳米纤丝网络、基层和/或单个纳米纤丝结构的或多层纳米纤丝组合的隔片，或以各向同性或以梯度性提高合适的细胞活性，包括细胞生长和/或分化。涉及氨基酸、肽、多肽和蛋白质的实施例可包括具有任意大小和复杂性的所述分子类型，以及所述分子的组合。示例包括但不限于，结构蛋白、酶和肽激素。
许多细胞类型可在纳米纤丝结构上生长，包括但不限于，干细胞、定向干细胞、分化细胞和肿瘤细胞。干细胞示例包括但不限于，胚胎干细胞、骨髓干细胞和脐带干细胞。用于各种实施方案的其它细胞示例包括但不限于，造骨细胞、成肌细胞、成神经细胞、成纤维细胞、成神经胶质细胞、生殖细胞、肝细胞、软骨细胞、角质化细胞、平滑肌细胞、心肌细胞、结缔组织细胞、神经胶质细胞、上皮细胞、内皮细胞、激素分泌细胞、免疫系统细胞以及神经细胞。在一些实施方案中，不必预筛选所要使用的干细胞类型，因为通过将单个纳米纤丝结构或多层组合传递至给定的器官，工程设计单个纳米纤丝结构或多层纳米纤丝组合的物理和/或化学特性，多种干细胞类型可被诱导以在器官特定模式分化。例如，通过将合适的分化和/生长因子工程设计入纳米纤丝结构，或将包含干细胞的纳米纤丝结构植入肝中，可诱导干细胞成为肝细胞。纳米纤丝结构中的细胞可用于提供细胞种植、生产某些化合物或两者的目的。
本发明所用的细胞，可在体外培养、从自然来源衍生、遗传工程设计或通过其它方法生产。可使用任何自然来源的原核或真核细胞。纳米纤丝结构被植入机体的实施方案，可使用来自受体的细胞、来自非特定的供体细胞或来自不同种的供体细胞，或者细菌或微生物细胞。包括从来源收获的和使用前培养的细胞。
一些实施方案使用非典型或异常的细胞，例如肿瘤细胞。可工程设计纳米纤丝结构的物理和/或化学性质，包括生长和分化因子，其上生长所述细胞，以模拟肿瘤的自然体内纳米或微环境。在纳米纤丝结构上培养的肿瘤细胞可提供用于评价药物治疗的体内自然肿瘤环境的更准确的说明。肿瘤细胞在本发明的纳米纤丝结构上的生长，便于特征化类体内环境中肿瘤的生物化学途径和活性，包括基因表达、受体表达和多肽生成，允许研制特定靶向肿瘤的药物。
一些实施方案使用经过遗传工程设计的细胞。工程设计包括设计细胞程序以表达一种或多种基因、抑制一种或多种基因的表达，或两者。一个用于本发明的遗传工程设计细胞的实施例，是遗传工程设计可产生和分泌一种或多种预期生物活性分子的细胞。当包含遗传工程设计的细胞的纳米纤丝结构被植入机体时，所产生的分子可产生局部效果或系统效果，并包括以上识别的分子作为可能物质。在实施方案中细胞也可以产生抗原性物质，其中纳米纤丝结构的目的之一是产生免疫应答。细胞可产生物质以帮助下列非包括性列举的用途：抑制或刺激炎症；促进愈合；阻止免疫排斥；提供激素代替物；更换神经递质；抑制或杀死癌细胞；促进细胞生长；抑制或刺激血管形成；增大组织；和补充或更换皮肤、滑液、腱、软骨、韧带、骨、肌肉、器官、硬脑膜、血管、骨髓，以及胞外基质。
遗传工程设计包括，例如，添加遗传物质至细胞或从细胞除去遗传物质、改变现有遗传物质，或两者。细胞被转染或被另外工程设计以表达基因的实施方案，可以使用暂时或永久的转染基因，或两者。基因序列是全长或部分长度的、克隆或天然存在的。
在一个实施方案中，活细胞沉积于纳米纤丝结构上。通过改变和/或更改纳米纤维网络选定的物理和/或化学性质，促进特定细胞或组织的细胞活性的纳米和/或微环境可被工程设计入纳米纤丝结构中。物理和/或化学性质可被工程设计入单个纳米纤丝结构中，如上所述。将包含细胞的纳米纤丝结构在促进细胞活性(包括生长和/或分化)的条件下培养。
在另一个实施方案中，将两种或多种纳米纤丝结构分层，以形成多层纳米纤丝组合。通过使具有选定的物理和/或化学性质的纳米纤丝结构分层，构建促进特定细胞或组织的细胞活性的纳米和/或微环境。物理和/或化学性质可被工程设计入单个纳米纤丝结构，如上所述。将活细胞沉积于多层纳米纤丝组合，并将组合在促进沉积细胞的生长和/和分化的条件下培养。
在另一个实施方案中，在不同培养条件下将多种细胞类型在单个纳米纤丝结构上培养，然后在无菌条件下以手动或机械层层组合入特定多层纳米纤丝的组合。在单个纳米纤丝结构中通过改变和/或改良选定的纳米纤丝结构的物理和/化学性质，或在组合中通过选择性分层单个纳米纤丝结构，可工程设计促进特定细胞类型的细胞活性的纳米和/或微环境，以获得预期的纳米或微环境。如上所述进行工程设计物理和/或化学特征。然后多层纳米纤丝组合在促进细胞活性(包括细胞生长和/或分化)的条件下培养。
在另一个实施方案中，在不同培养条件下将多种细胞类型在单个纳米纤丝结构培养。定制单个纳米纤丝结构的物理和化学性质以用于特定细胞型。纳米纤丝结构的基层和/或隔片是生物可降解的和/或生物可分解的，允许在培养中控制生物活性分子的释放。选择促进预期细胞活性(包括生长和/或分化)的生物分子。然后在无菌条件下单个纳米纤丝结构以手动或机械层层组合为多层纳米纤丝组合。将多层纳米纤丝组合分层，以创造促进预期细胞活性(包括生长和/或分化)的纳米和/或微环境。将包含生物活性分子的生物可降解的和/或生物可分解的隔片，插入包含组合的分层纳米纤丝结构之间，以在组合中精调纳米和/或微环境。生物活性分子从隔片释放的速率由包含隔片的聚合物的生物可降解和/或生物可分解的速率确定。然后组合的单元阵列在促进细胞活性(包括细胞增殖和/或分化)的条件下培养。
在另一个实施方案中，单独包裹纳米纤丝结构并进行灭菌。去掉包装后，纳米纤丝结构在培养容器中以手动或机械进行层层组装，以形成多层纳米纤丝组合。
需要评价人体中用于体内应用的新材料(例如本发明的纳米纤丝结构和多层纳米纤丝组合)的降解和可能再分布。植入人体特定位置的材料，可以被降解，然后可运送到远离插入的原始位置的其它区域。为了检测体内纳米纤维的降解性质，将包含单个纳米纤丝结构或多层组合的纳米纤维网络、基层和/或隔片可由荧光标记物进行标记，如上用于改良的纳米纤维所述。在一个实施方案中，荧光标记物是量子点。由于量子点对于磁共振成像是荧光的和不透明的，使用多重光子荧光显微镜(用于检测分离组织)和MRI(用于体内分析)以探测和追踪组织中量子点的分布，其中量子点含有多层纳米纤丝组合的片段或分解产物，并确定当插入体内的不同组织或位置时组合的分解产物是否引起显著的异物应答。
iv.附加用途
在另一个应用中，将本发明的纳米纤丝结构用于高通量应用中以分析药物/细胞相互作用。高通量应用是用于发现新药物的重要方法。高通量应用使用密度高达每板约1536孔的多孔组织培养小室。增加每孔的细胞群体可利于增强检测信号。在一个实施方案中，将纳米纤丝结构插入孔中。在另一个实施方案中，孔表面起基层的作用，使得纳米纤维网络直接沉积于孔表面上。将该纳米纤丝结构引入孔中，可提供用于细胞、配体和/或酶粘附的额外表面，而不影响实施光学检测的能力。
在另一个应用中，纳米纤丝结构可用于纯化和/或分离用途。将单个纳米纤丝结构分层以形成层析柱。使用物理和/或化学性质(包括尺寸、电荷、疏水性和对其它分子的亲合性)从，例如，溶液中分离蛋白质。在一个实施方案中，将单个纳米纤丝结构分层以形成层析柱。将物理和/或化学性质(例如，包括特定官能团、包含特定受体的多肽，或免疫球蛋白)工程设计入或粘附于纳米纤丝结构，以从溶液中选择性结合特定多肽。溶液穿过多层纳米纤丝组合，使得多肽结合基质。通过溶剂从组合上释放结合多肽。在另一个实施方案中，将单个纳米纤丝结构分层以形成过滤柱。将物理性质(例如，包括多孔性和纤丝密度)工程设计入多层纳米纤丝组合中，使得根据多肽尺寸从溶液分离多肽。在另一个实施方案中，将单个纳米纤丝结构分层以形成离子交换柱。将化学性质(例如，包括负电荷和/或正电荷官能团)工程设计入或粘附于纳米纤丝结构中。
在另一个应用中，使用本发明的结构制备生物反应器。
C.细胞培养基
本发明另一个方面是细胞培养基。细胞培养基包含基质、垫片、网络、片或卷。在一个实施方案中，培养基包含纳米纤维基质。纳米纤维可由聚合物或聚合物系统制备，如上所述用于改良的纳米纤维。细胞培养基沉积于培养容器的表面或内部。
将培养基制成适于培养容器的预期尺寸。在一个实施方案中，细胞培养基包含纳米纤维基质，其中网络具有约50nm至约1000nm的纤维直径，至少约2微米的平均纤维间隙，约30％或更少的基质硬度，和具有外壁的顶部和底部，其中外壁高度约10微米至约100mm，顶部和底部面积分别为约5mm2至4×105mm2。通过削减含有培养基的片、卷、基质、网络或垫片的尺寸，或从含有培养基的基质、片、卷、网络或垫片切下预期尺寸的切片，筛选或调整培养基的大小直至适于培养容器的选定尺寸。在另一个实施方案中，细胞培养基包含纳米纤维网络，其中网络尺寸适于插入培养容器。
细胞培养基可用于各种应用，包括细胞培养和组织培养应用。上述任意细胞可在细胞培养基上生长。在一个实施方案中，单独包裹培养基并进行灭菌。去掉包装后，将培养基置于培养容器中以形成细胞生长表面。在另一个实施方案中，细胞培养基沉积于培养容器内表面上。单独包裹包含细胞生长基质的培养容器并进行灭菌。去掉包装后，细胞在培养容器中沉积于细胞培养基上。在细胞培养基中生长的细胞具有许多体内和体外用途，包括修复伤口，培育人造皮肤、静脉、动脉、腱、韧带、软骨、心脏瓣膜，器官培养，治疗烧伤，以及骨移植。
改变和/或改良细胞培养基的物理性质和/或特征，包括但不限于质地、粗糙度、粘附性、多孔性、弹性、硬度、几何性以及纤维密度，以促进包括生长和/或分化的预期细胞活性。在细胞培养基中工程设计特定纳米和/或微环境。例如，改变和/或改良细胞培养基的多孔性和纤维密度，使得细胞渗透细胞培养基并在三维环境中生长。细胞培养基的物理性质可被工程设计，如上用于改良的纳米纤维和/或纳米纤丝结构所述。
特定的识别基元，例如肽、脂质、碳水化合物、氨基酸、核苷酸、核酸、多核苷酸或多聚糖，包括但不限于生长因子、分化因子、纤维蛋白、粘附蛋白、糖蛋白、官能团、粘合化合物、解粘化合物以及靶向分子可被工程设计入细胞培养基中，或以各向同性或以梯度，以提高预期的细胞活性，包括细胞生长和/或分化。如上述用于改良的纳米纤维和/或纳米纤丝结构，工程设计细胞培养基的化学性质。
在另一个应用中，本发明的细胞培养基可在高通量应用中用于分析药物/细胞相互作用。高通量应用使用密度高达每板约1536孔的多孔组织培养小室。增加每孔的细胞群体可利于增强检测信号。在一个实施方案中，将细胞培养基插入用于分析的组织培养小室的孔中。在另一个实施方案中，孔表面作为细胞培养基的基层，允许纳米纤维网络或基质直接沉积于孔表面上。将该细胞培养基引入孔中，可提供用于细胞、配体和/或酶粘附的额外表面，而不影响实施光学检测的能力。
实施例
本发明通过下列用于举例说明实施方案的实施例进行解释。然而，可对所公开的发明进行许多改变和实施方案。在任何情况下实施例并不用于限制本发明。
实施例1
电纺包含脂质的聚合物溶液，产生增强的细纤维群体
为了用光学显微镜目测与脂质加入聚合物溶液有关的纤维直径的变化，电纺纤维以获得微纤维。从包含分别补充0，0.25，0.5，1.0和1-％胆固醇(w/w)(Sigrma，St.Louis，MO)的15％聚(ε-己内酯)(w/w)(Dow Tone Polymers，Midland，MI)的氯仿中电纺微纤维。用毛细管针系统电纺纤维。Eppendorf微量移液枪吸头(黄色)适于5cc注射器。将聚合物溶液倒入注射器，并将连接Nanosecond Optical Pulse Radiator Model NR-1(Optitron，Inc.，Torrance，CA)的正电极插入溶液。电纺电压是18,000伏。将纤维以水平垂直于注射器的方式电纺到平底金属板靶。靶距离微量移液枪吸头2英寸。将纤维收集到位于靶上透明片上。在光学显微镜(Insight Bilateral Scanning ConfocalFluorescence Microscope(Meridian Instruments，Okemos，MI))下以20X物镜观察纤维，并通过CCD相机数字化拍摄图像。
如图2A-E所示，胆固醇加入聚合物溶液，生成直径逐渐更小的纤维。增加加入聚合物溶液的胆固醇量，生成直径逐渐更小的纤维。从不包含胆固醇的聚合物溶液制备的纤维，直径范围是10-50微米(图2A)。从包含0.25％胆固醇(w/w)的聚合物溶液制备的纤维，直径范围是5-30微米(图2B)。从包含0.5％胆固醇(w/w)的聚合物溶液制备的纤维，直径范围是2-20微米(图2C)。从包含1.0％胆固醇(w/w)的聚合物溶液制备的纤维，直径范围是1-15微米(图1D)。从包含10％胆固醇(w/w)的聚合物溶液制备的纤维，直径范围是0.8-8微米(图2E)。
实施例2
包含脂质的纳米纤维诱导细胞紧密粘附纳米纤维
包含脂质的纳米纤维提供可促进细胞复原和细胞与纳米纤维之间紧密结合的表面。将正常大鼠肾(NRK)成纤维细胞在纳米纤维电纺丝上于Dulbecco Modified Eagle′sMedium(DME)、37℃以及5％CO2中培养，并在光学显微镜(Insight Bilateral ScanningConfocal Fluorescence Microscope(Meridian Instruments，Okemos，MI))下以20X物镜进行观察，其中所述电纺丝来自包含补充0.25％鞘磷脂的10％聚(ε-己内酯)(w/w)的氯仿溶液。图像用CCD相机拍摄。
如图3A和B所示，包含0.25％鞘磷脂的纳米纤维诱导细胞快速复原和粘附纳米纤维。图3A显示在包被了含有0.25％鞘磷脂的纳米纤维的组织培养板上培养两天后的NRK成纤维细胞。成纤维细胞紧紧粘附纳米纤维，并展开和分开以填满形成单层的纤维之间的间隙。图3B显示在包被了不含有鞘磷脂的纳米纤维的组织培养板上培养两天后的NRK成纤维细胞。几乎没有细胞粘附纳米纤维。含脂质纳米纤维的定向迁移和紧密粘附性质暗示纤维可用于体内或体外应用，包括修复伤口，培育人造皮肤、静脉、动脉、腱、韧带、软骨、心脏瓣膜，器官培养，治疗烧伤，以及骨移植。
实施例3
在纳米纤维网络上生长的细胞具有类似于组织中细胞的肌动蛋白网络
细胞肌动蛋白网络可作为标记物用于确定更接近组织中环境的细胞培养方法(Cukierman等，2001，Science，23：1708-1712；Walpita和Hay，2002，Nature Rev.Mol.Cell.Biol.，3：137-141)。当在二维组织培养中生长时，成纤维细胞呈现高度伸展和粘附形态，其中位于细胞质中的肌动蛋白网络被组织成厚张力纤维阵列。相反，组织中观察的成纤维细胞在外形上是具有被组织成皮质环的肌动蛋白的类纺锤体(Walpita和Hay，2002，Nature Rev.Mol.Cell.Biol.，3：137-141).
我们比较了在二维和三维表面生长的普通大鼠肾(NRK)成纤维细胞的肌动蛋白网络。成纤维细胞在聚酰胺纳米纤维网络、玻璃以及用聚赖氨酸包被的玻璃上生长。用旋转喷射器系统或毛细管针系统电纺聚酰胺纳米纤维。两种系统都产生基本上相同的纤维材料。每次喷射流速是1.5mil/min，8英寸的靶间距，88KV的喷射电压、45％的相对湿度和35rpm的旋转喷射速率。
通过对由NRK成纤维细胞表达的绿色荧光蛋白(GFP)-肌动蛋白嵌合体的分布进行成像，监控肌动蛋白网络形成。简要地，将用GFP-肌动蛋白(Dr.Sanford Simon惠赠，Laboratory of Cellular Biophysics，Rockefeller University，New York，NY)转染的NRK成纤维细胞在聚酰胺纳米纤维、玻璃或用聚1-赖氨酸包被的玻璃上，于DulbeccoModified Eagle′s Medium(DME)和37℃、5％CO2中培养，然后用Insight BilateralScanning Confocal Fluorescence Microscope(Meridian Instruments，Okemos，MI)检测。
如图4A-C所示，在纳米纤维网络的三维生长环境上生长的细胞，组织成类似于体内观察的那些细胞骨架网络。在纳米纤维网络上生长的成纤维细胞显示具有filipodia的类纺锤体形态，并显示几乎没有张力纤维(图4A)。相反，在玻璃表面上生长的成纤维细胞通过许多张力纤维进行展开(图4B)。在聚1-赖氨酸包被的玻璃表面上生长的成纤维细胞更加地展开，并显示更厚和更明显的张力纤维(图4C)。
这些显微照片也表明共焦显微镜提供快速方法来监测活细胞或组织中细胞骨架组织中差异，具有包括纤维网络物理性质(包括但不限于质地、粗糙度、粘附性、多孔性、弹性、几何性和纤维密度)和纤维网络化学性质(包括但不限于生长因子、分化因子、纤维蛋白、粘附蛋白、糖蛋白、官能团、粘合化合物、解粘化合物和靶向分子)的各种纤维操作的功能。比较在纳米纤维网络上培养细胞或组织的细胞骨架网络与体内观察，允许纳米纤维网络的物理和/或化学性质的精谐调更加模拟细胞或组织的体内环境。
实施例4
官能团掺入纳米纤维
将官能团，例如醇基、醛基、氨基、羧基，和巯基官能团，和光敏官能团，例如卡宾或氮宾掺入纳米纤维表面。这些基团可用于共价偶合生物活性分子，包括但不限于多肽(例如生长因子或分化因子)、碳水化合物、脂质、多醣或治疗药物。通过将官能团加入聚合物溶液，官能团被掺入纳米纤维。如实施例1所述，从补充2％十二烷胺(w/w)(Sigma，St.Louis，MO)的包含10％聚(ε-己内酯)(w/w)(Dow Tone Polymers，Midland，MI)的氯仿溶液中电纺纳米纤维。为了证实纳米纤维表面的修饰氨基的有效性，将纳米纤维与荧光素异硫氰酸盐(1mg/ml储存水溶液)(Sigma，St.Louis，MO)的2.0％磷酸钠缓冲液(pH8.5)反应。使用Insight Bilateral Scanning Confocal FluorescenceMicroscope(Meridian Instruments，Okemos，MI)显示荧光素掺入纤维。如图5A所示，在未改良的纤维表面上观察到低水平荧光，这是由于纤维表面吸收未反应的荧光素异硫氰酸盐。相反，与荧光素异硫氰酸盐反应后，在含有掺入氨基的纳米纤维上，沿着全部纤维观察到显著的荧光(图5B)。
这些数据证实纳米纤维改良表面含有用于偶合生物活性分子的官能团，允许按设计掺入分子(例如生长因子、分化因子、纤维蛋白、粘附蛋白、糖蛋白、官能团、粘合化合物、解粘化合物以及靶向分子)，以在纳米纤维网络中创建纳米和/或微环境，在细胞或组织中促进一种或多种选定的活性，包括生长和/或分化。这些数据也暗示包含特定空间和几何排列中不同官能团的纳米纤维，可通过导入具有合适反应团的肽被诱导进行自我组装成几何限定的阵列。
实施例5
用量子点标记细纤维
为了制备具有不同化学和/或物理性质的纤维并将它们掺入纳米纤维混合物或特定单元阵列，同时继续保留在混合物或单元阵列中识别各种纤维的能力，我们研究了将荧光标记掺入纳米纤维。将1％量子点溶液(Dr.Sanford Simon惠赠，Laboratory ofCellular Biophysics，Rockefeller University，New York，NY)加入包含12％聚(ε-己内酯)(w/w)的氯仿的聚合物溶液。溶液然后如实施例1所述被电纺，生成包含量子点的微纤维群体。在488nm激发纤维，用Insight Bilateral Scanning Confocal FluorescenceMicroscope(Meridian Instruments，Okemos，MI)收集微纤维中量子点分布的图像(图6)。
在水环境中淬灭量子点荧光。将水加入微纤维并不能淬灭量子点荧光，表明量子点已经植入纤维基质而不是被纤维表面吸收，这是它们用于水系统的重要考虑因素。
以上说明书、实施例和数据用于解释本发明。然而，可对所公开的发明进行许多改变和实施方案。本文附后的权利要求可具体解释本发明。

Claims (135)

1.一种包含在细胞培养中用于细胞增殖和/或分化的环境的纳米纤丝结构，包括一种或多种纳米纤维和基层，其中所述纳米纤丝结构由一种或多种纳米纤维网络限定。
2.权利要求1所述的纳米纤丝结构，其中所述纳米纤丝结构包含约50至1000纳米的纤维直径，至少约2微米的平均纤维间间隔以及约70％或更低的硬度。
3.权利要求2所述的纳米纤丝结构，其中所述纳米纤丝结构包含约50％或更低的硬度。
4.权利要求2所述的纳米纤丝结构，其中所述纳米纤丝结构包含约30％或更低的硬度。
5.权利要求2所述的纳米纤丝结构，其中所述纳米纤丝结构包含约10％或更低的硬度。
6.权利要求2所述的纳米纤丝结构，其中所述纳米纤丝结构包含约5％或更低的硬度。
7.权利要求1所述的纳米纤丝结构，还包含基层，其中一种或多种纳米纤维网络沉积于基层表面。
8.权利要求7所述的纳米纤丝结构，其中基层是多孔性塑料基层。
9.权利要求7所述的纳米纤丝结构，其中基层是无细胞毒性的。
10.权利要求7所述的纳米纤丝结构，其中基层是薄膜。
11.权利要求10所述的纳米纤丝结构，其中所述纳米纤丝结构包含约50至1000纳米的纤维直径，至少约2微米的平均纤维间间隔以及约70％或更低的硬度。
12.权利要求11所述的纳米纤丝结构，其中所述纳米纤丝结构包含约50％或更低的硬度。
13.权利要求11所述的纳米纤丝结构，其中所述纳米纤丝结构包含约30％或更低的硬度。
14.权利要求11所述的纳米纤丝结构，其中所述纳米纤丝结构包含约10％或更低的硬度。
15.权利要求11所述的纳米纤丝结构，其中所述纳米纤丝结构包含约5％或更低的硬度。
16.权利要求11所述的纳米纤丝结构，其中所述薄膜是水溶性的。
17.权利要求11所述的纳米纤丝结构，其中所述薄膜是非水溶性的。
18.权利要求16所述的纳米纤丝结构，其中所述薄膜是聚乙烯醇膜。
19.权利要求11所述的纳米纤丝结构，其中所述薄膜是生物可降解的。
20.权利要求11所述的纳米纤丝结构，其中所述薄膜是生物相容的。
21.权利要求7所述的纳米纤丝结构，其中所述基层是非多孔的玻璃基层。
22.权利要求11所述的纳米纤丝结构，其中所述薄膜是多孔的。
23.权利要求11所述的纳米纤丝结构，其中所述结构包含一种或多种生长因子。
24.权利要求23所述的纳米纤丝结构，其中至少一种生长因子是血管内皮生长因子、骨形成因子β、表皮生长因子、内皮生长因子、血小板衍生生长因子、神经生长因子、成纤维细胞生长因子、胰岛素生长因子，或转化生长因子。
25.权利要求23所述的纳米纤丝结构，其中所述结构释放生长因子。
26.权利要求25所述的纳米纤丝结构，其中释放速率由薄膜或纤维的分解或降解速率确定。
27.权利要求11所述的纳米纤丝结构，其中所述结构包含一种或多种分化因子。
28.权利要求27所述的纳米纤丝结构，其中至少一种分化因子是神经营养蛋白，集落刺激因子或转化生长因子。
29.权利要求27所述的纳米纤丝结构，其中所述薄膜或纤维释放分化因子。
30.权利要求29所述的纳米纤丝结构，其中释放速率由薄膜或纤维分解或降解速率确定。
31.权利要求1所述的纳米纤丝结构，其中所述纳米纤维包含无细胞毒性的聚合物。
32.权利要求31所述的纳米纤丝结构，其中所述聚合物是生物可降解的。
33.权利要求31所述的纳米纤丝结构，其中所述聚合物是水溶性的。
34.权利要求31所述的纳米纤丝结构，其中所述聚合物是非水溶性的。
35.权利要求31所述的纳米纤丝结构，其中所述聚合物是聚酯。
36.权利要求35所述的纳米纤丝结构，其中所述聚酯是聚ε-己内酯、聚羟乙酸酯或聚乳酸酯。
37.权利要求31所述的纳米纤丝结构，其中所述聚合物是聚酰胺。
38.权利要求37所述的纳米纤丝结构，其中所述聚酰胺是尼龙。
39.权利要求31所述的纳米纤丝结构，其中所述纳米纤维还包含一种或多种生物活性分子。
40.权利要求39所述的纳米纤丝结构，其中至少一种生物活性分子是脂质、碳水化合物、多醣、氨基酸、核苷酸、核酸、多核苷酸或其杂交分子。
41.权利要求40所述的纳米纤丝结构，其中所述脂质是溶性卵磷脂、卵磷脂、鞘磷脂、胆固醇或其混合。
42.权利要求40所述的纳米纤丝结构，其中所述多醣是纤维素、淀粉、褐藻酸、壳聚糖或透明质酸。
43.权利要求31所述的纳米纤丝结构，其中所述纳米纤维还包含促进细胞粘附纳米纤维的生物学化合物。
44.权利要求31所述的纳米纤丝结构，其中所述纳米纤维还包含一种或多种醇基、醛基、氨基、羧基、巯基或光敏官能团。
45.权利要求44所述的纳米纤丝结构，其中所述光敏官能团是卡宾或氮宾。
46.权利要求1所述的纳米纤丝结构，其中所述纳米纤维包含一种或多种生长因子。
47.权利要求46所述的纳米纤丝结构，其中至少一种生长因子是血管内皮生长因子、骨形成因子β、表皮生长因子、内皮生长因子、血小板衍生生长因子、神经生长因子、成纤维细胞生长因子、胰岛素生长因子或转化生长因子。
48.权利要求46所述的纳米纤丝结构，其中所述纳米纤维释放一种或多种生长因子。
49.权利要求48所述的纳米纤丝结构，其中所述生长因子释放速率由纳米纤丝结构的降解或分解速率确定。
50.权利要求1所述的纳米纤丝结构，其中所述纳米纤维包含一种或多种分化因子。
51.权利要求50所述的纳米纤丝结构，其中至少一种分化因子是神经营养蛋白、集落刺激因子或转化生长因子。
52.权利要求50所述的纳米纤丝结构，其中所述纳米纤维释放一种或多种分化因子。
53.权利要求50所述的纳米纤丝结构，其中所述分化因子的释放速率由纳米纤丝结构的降解或分解速率确定。
54.权利要求1所述的纳米纤丝结构，包含适于插入培养容器的宽度和深度。
55.权利要求54所述的纳米纤丝结构，其中所述纳米纤丝结构的宽度和深度适于插入培养板的孔中。
56.权利要求54所述的纳米纤丝结构，其中所述培养容器选自单孔培养板，多孔培养板，小室培养载玻片，多小室培养载玻片，盖玻片，吸杯，烧瓶，试管，瓶，灌注槽，生物反应器以及发酵罐。
57.一种包含权利要求1所述的纳米纤丝结构的组织培养容器。
58.权利要求57所述的组织培养容器，其中所述培养容器选自单孔培养板，多孔培养板，小室培养载玻片，多小室培养载玻片，盖玻片，吸杯，烧瓶，试管，瓶，灌注槽，生物反应器以及发酵罐。
59.一种包含聚合物和生物活性分子的纳米纤丝结构，该结构包含细胞培养中适于活细胞生长的环境，其中所述纳米纤丝结构基本上是无胶原质、纤维蛋白、纤维蛋白原、凝血酶、水溶性差的药物化合物，或其混合。
60.一种制造权利要求1所述的纳米纤丝结构的方法，包括电纺一种或多种纳米纤维网络。
61.一种制造权利要求7所述的纳米纤丝结构的方法，包括将一种或多种纳米纤维网络电纺到基层表面。
62.一种制备组织的方法，包括：
a)分层权利要求1所述的两种或多种纳米纤丝结构，以形成多层纳米纤丝组合，包含在细胞培养中适于活细胞生长的环境；
b)将活细胞沉积于所述组合；和
c)在促进沉积细胞生长和/或分化的条件下培养组合。
63.权利要求62所述的方法，其中所述分层的纳米纤丝结构通过隔片分离。
64.权利要求63所述的方法，其中所述隔片包含解开的或网状的微纤维。
65.权利要求63所述的方法，其中所述隔片包含多孔膜。
66.权利要求64所述的方法，其中所述微纤维包含纤维素、淀粉、聚酰胺、聚酯或聚四氟乙烯。
67.权利要求62所述的方法，其中单个纳米纤丝结构包含一种或多种生长因子、粘合化合物，和/或靶向化合物。
68.一种制备组织的方法，包括：
a)在权利要求1所述的单个纳米纤丝结构上培养多个细胞，其中每个单个纳米纤丝结构含有特定细胞类型；
b)分层两个或多个单个纳米纤丝结构，以形成细胞的多层阵列；和
c)在促进细胞增殖和/或分化的条件下培养阵列。
69.权利要求68所述的方法，其中所述分层的纳米纤丝结构通过隔片分离。
70.权利要求69所述的方法，其中所述隔片包含解开的或网状的微纤维。
71.权利要求69所述的方法，其中所述隔片包含多孔膜。
72.权利要求70所述的方法，其中所述微纤维包含纤维素、淀粉、聚酰胺、聚酯或聚四氟乙烯。
73.权利要求68所述的方法，其中单个纳米纤丝结构包含一种或多种生长因子、粘合化合物、解粘化合物，和/或靶向化合物。
74.权利要求73所述的方法，其中选择每个单个纳米纤丝结构的生长因子、粘合化合物、解粘化合物和/或靶向化合物，以促进特定细胞类型的生长和/或分化。
75.一种包含脂质的电纺丝纤维。
76.权利要求75所述的电纺丝纤维，其中所述脂质是亲脂性化合物、磷脂化合物、鞘磷脂化合物，或其混合。
77.权利要求76所述的电纺丝纤维，其中所述脂质是溶血卵磷脂、卵磷脂、鞘磷脂、胆固醇，或其混合。
78.权利要求76所述的电纺丝纤维，还包含无细胞毒性的聚合物。
79.权利要求78所述的电纺丝纤维，其中所述聚合物是生物可降解的。
80.权利要求78所述的电纺丝纤维，其中所述聚合物是水溶性的。
81.权利要求78所述的电纺丝纤维，其中所述聚合物是非水溶性的。
82.权利要求78所述的电纺丝纤维，其中所述聚合物是聚酯。
83.权利要求82所述的电纺丝纤维，其中所述聚酯是聚(ε-己内酯)、聚(羟乙酸酯)或聚(乳酸酯)。
84.权利要求78所述的电纺丝纤维，其中所述聚合物是聚酰胺。
85.权利要求84所述的电纺丝纤维，其中所述聚酰胺是尼龙。
86.权利要求75所述的电纺丝纤维，还包含纳米级无机填料。
87.权利要求75所述的电纺丝纤维，其中所述纤维直径约50nm至1000nm。
88.权利要求87所述的电纺丝纤维，其中所述纤维直径约300nm。
89权利要求75所述的电纺丝纤维，其中所述纤维还包含一种或多种生物活性分子。
90.权利要求89所述的电纺丝纤维，其中至少一种生物活性分子是脂质、碳水化合物、多醣、氨基酸、核苷酸、核酸、多核苷酸或其杂交分子。
91.权利要求90所述的电纺丝纤维，其中所述脂质是溶血卵磷脂、卵磷脂、鞘磷脂、胆固醇，或其混合。
92.权利要求90所述的电纺丝纤维，其中所述多醣是纤维素、淀粉、糖原、褐藻酸、壳聚糖，或透明质酸。
93.权利要求75所述的电纺丝纤维，其中所述纤维还包含促进细胞粘附纤维的生物学化合物。
94.权利要求75所述的电纺丝纤维，其中所述纤维还包含一种或多种醛基、醇基、氨基、巯基，或光敏官能团。
95.权利要求94所述的电纺丝纤维，其中所述光敏官能团是卡宾或氮宾。
96.权利要求75所述的电纺丝纤维，其中所述纤维包含一种或多种生长因子。
97.权利要求96所述的电纺丝纤维，其中至少一种生长因子是血管内皮生长因子、骨形成因子β、表皮生长因子、内皮生长因子、血小板衍生生长因子、神经生长因子、成纤维细胞生长因子、胰岛素生长因子或转化生长因子。
98.权利要求75所述的电纺丝纤维，其中所述纤维包含一种或多种分化因子。
99.权利要求98所述的电纺丝纤维，其中至少一种分化因子是神经营养蛋白、集落刺激因子或转化生长因子。
100.权利要求75所述的电纺丝纤维，其中所述纤维包含一种或多种粘附分子。
101.权利要求100所述的电纺丝纤维，其中至少一种粘附分子是纤维连接蛋白或层粘蛋白或衍生于这些大分子的粘附肽。
102.一种制造权利要求75所述的电纺丝纤维的方法，包括电纺亲脂性分子和聚合物。
103.一种制造多种纳米纤维的方法，包括对含有聚合物和影响聚合物包装的添加剂组分的溶液进行电纺，其中与从不含添加剂组分的聚合物溶液产生的多种纳米纤维相比，通过该方法生产的多种纳米纤维具有更高百分率的细纤维。
104.权利要求103所述的方法，其中所述细纤维直径约5纳米至约1000纳米。
105.权利要求104所述的方法，其中所述细纤维直径约50纳米至约400纳米。
106.权利要求104所述的方法，其中所述细纤维直径约5纳米至约50纳米。
107.权利要求103所述的方法，其中所述添加剂组分包含脂质。
108.权利要求107所述的方法，其中所述脂质是胆固醇。
109.一种通过改变弹性生产纳米纤维的方法，包括电纺含有聚合物和添加剂组分的溶液。
110.权利要求109所述的方法，其中所述添加剂组分包含交联剂。
111.权利要求109所述的方法，其中所述添加剂组分包含脂质。
112.权利要求111所述的方法，其中所述脂质是胆固醇。
113.一种包含纳米纤维基质的细胞培养基，其中所述基质包含直径约50至1000微米的纤维，至少约2微米的平均纤维间间隔，约30％的基质硬度，并且所述基质具有带外壁的顶部和底部，其中所述外壁高度约10微米至约100mm，顶部和底部面积分别为约5mm2到约4×105mm2。
114.一种权利要求113所述的培养容器和培养基。
115.一种权利要求113所述的培养孔和培养基，其中外壁高度和顶部及底部的面积适于培养孔的尺寸。
116.一种包含纳米纤维网络的细胞培养基。
117.权利要求116所述的培养基，适于插入培养容器。
118.一种包含荧光标记物的电加工纤维。
119.权利要求118所述的电加工纤维，还包含脂质。
120.权利要求119所述的电加工纤维，其中所述脂质是溶血卵磷脂、卵磷脂、鞘磷脂、胆固醇，或者其混合。
121.权利要求118所述的纤维，其中所述荧光标记物是非光可漂白的。
122.权利要求121所述的纤维，其中所述荧光标记物是纳米晶体。
123.权利要求122所述的纤维，其中所述纳米晶体是量子点。
124.权利要求118所述的纤维，其中所述荧光标记物是荧光团。
125.权利要求118所述的纤维，其中所述荧光标记物是pH不敏感的。
126.权利要求118所述的纤维，其中所述荧光标记物是离子敏感的。
127.权利要求118所述的纳米纤维，其中所述荧光标记物对与其它分子络合敏感。
128.权利要求118所述的纳米纤维，还包含诱导纳米纤维自身荧光的光学添加剂。
129.一种识别纳米纤维的方法，包括用荧光标记物标记纳米纤维。
130.一种识别纳米纤维化学性质或物理性质的方法，该方法包括：
a)分配荧光标记物给纳米纤维化学性质或物理性质；和
b)用荧光标记物标记纳米纤维。
131.权利要求130所述的方法，其中所述物理性质是直径。
132.权利要求130所述的方法，其中所述化学性质是生物活性分子。
133.权利要求132所述的方法，其中所述生物活性分子是生长因子、分化因子、纤维蛋白、粘附蛋白，或其混合。
134.一种多层纳米纤丝组合，包括权利要求1所述的两种或多种纳米纤丝结构分层以形成多层组合。
135.权利要求134所述的多层纳米纤丝组合，还包含具有厚度和第一和第二表面的隔片，其中所述隔片的第一表面接触第一纳米纤丝结构表面，所述隔片的第二表面接触第二纳米纤丝结构表面，致使第一和第二纳米纤丝结构被隔片的厚度隔开。
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