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CN1946423A - 诊断和治疗先兆子痫或子痫的方法 - Google Patents

诊断和治疗先兆子痫或子痫的方法 Download PDF

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CN1946423A
CN1946423A CNA2005800121081A CN200580012108A CN1946423A CN 1946423 A CN1946423 A CN 1946423A CN A2005800121081 A CNA2005800121081 A CN A2005800121081A CN 200580012108 A CN200580012108 A CN 200580012108A CN 1946423 A CN1946423 A CN 1946423A
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sflt
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vegf
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CNA2005800121081A
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A·S·卡鲁曼基
S·迈纳德
V·P·苏克哈特姆
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Beth Israel Deaconess Medical Center Inc
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Abstract

本文公开的是使用增加VEGF或P1GF水平的化合物或降低sF1t－1水平的化合物治疗先兆子痫或子痫的方法。本文还公开通过检测sF1t－1、VEGF或P1GF水平监测先兆子痫或子痫治疗的方法。本文还公开通过检测sF1t－1、VEGF或P1GF在主体中的水平诊断先兆子痫和子痫。

Description

诊断和治疗先兆子痫或子痫的方法
发明领域
总的来说，本发明涉及患有先兆子痫或子痫的主体的检测和治疗。
发明背景
先兆子痫是高血压、肿胀和蛋白尿的综合征，影响怀孕的5至10％，导致大部分的母亲和胎儿发病率和死亡率。先兆子痫每年导致全世界至少200,000母亲死亡。典型地在怀孕第20周后出现先兆子痫的症状，通常通过常规监测妇女的血压和尿检测到。但是，这些监测方法对于早期综合征的诊断是无效的。如果能得到有效的治疗，这样的早期检测能够减小主体或发育中的胎儿的危险。
当前还没有已知治愈的先兆子痫。先兆子痫在严重性上可从轻微到威胁生命而不同。轻微形式的先兆子痫可以用卧床休息和经常监测治疗。为减轻严重的病例，需要住院治疗，施用血压药物或抗惊厥药物以预防惊厥发作。如果病症变得威胁到母亲和婴儿的生命，则终止妊娠，将婴儿在终止前取出。
胎儿和胎盘的适当发育是由几种生长因子介导的。这些生长因子之一为血管内皮生长因子(VEGF)。VEGF是内皮细胞专一性的分裂素，一种血管生成诱导剂和血管渗透性的调节剂。VEGF还被表明对肾小球毛细血管修复有重要作用。VEGF作为同型二聚体与两个同源的跨膜酪氨酸激酶受体之一结合，fms样酪氨酸激酶(Flt-1)和激酶功能域受体(KDR)，其是在许多不同的组织中获得的在内皮细胞不同的表达。Flt-1，而不是KDR，被滋养层细胞高表达，有助于胎盘形成。胎盘生长因子(P1GF)为VEGF家族成员，也参与胎盘发育。P1GF被细胞滋养层和合胞体滋养层表达，能够诱导内皮细胞的增生、迁移和活化。P1GF作为同型二聚体与Flt-1受体结合，但是不与KDR受体结合。P1GF和VEGF两者都有助于分裂素活性和血管生成，分裂素活性和血管生成对发育中的胎盘是必不可少的。
Flt-1受体(sFlt-1)的可溶形式最近在人脐静脉内皮细胞的培养介质中被鉴定出来，随后在胎盘组织中证明其体内表达。sFlt-1是Flt-1受体的剪切变种，其没有跨膜和细胞质功能域。sFlt-1与VEGF高亲和性结合，但不刺激内皮细胞的分裂，sFlt-1被认为以“生理接受器”起作用，下调VEGF信号通路。因此sFlt-1水平的调节能调节VEGF和VEGF信号通路。对VEGF和P1GF信号通路的仔细调节对在发育的胎盘中被滋养层细胞保持适当的增生、迁移和血管生成是必不可少的。对准确诊断主体处于先兆子痫的危险中或患有先兆子痫的方法存在需求，特别是对在最严重症状发作前的准确诊断方法。对治疗也是需要的。
发明概述
我们已经发现诊断和有效治疗先兆子痫和子痫的方法。
使用基因表达分析，我们已经发现在来自患有先兆子痫的怀孕妇女胎盘组织样品中sFlt-1的水平显著地升高。已知sFlt-1通过作为“生理接受器”而拮抗VEGF和P1GF，在患有先兆子痫或子痫的妇女中，sFlt-1可以耗尽必需量的胎盘中这些必不可少的血管生成和分裂素因子。
过量的sFlt-1还可以通过分解保持血脑屏障的内皮细胞和/或大脑脉络丛内层的内皮细胞导致子痫，由此导致在子痫中可见的脑肿胀和惊厥发作。在本发明中，将增加VEGF和P1GF水平的化合物施用给主体通过对抗升高的sFlt-1的影响以治疗或预防先兆子痫或子痫。而且，靶向sFlt-1的抗体被用于竞争性地抑制VEGF或P1GF与sFlt-1的结合，因此增加游离VEGF和P1GF的水平。RNA干预和反义核苷碱基寡聚物还用于降低sFlt-1的水平。本发明还提供监测sFlt-1、VEGF、和P1GF作为早期诊断检测工具，以及控制先兆子痫或子痫，或其易患病的体质，或心血管病症，或其易患病的体质的用途。
我们还发现P1GF在尿中的水平可以被用作检测先兆子痫或子痫或其易患病的体质的诊断工具。P1GF的游离形式具有平均分子量约30kDa，小到足以被肾滤过并释放到尿中。当P1GF与sFlt-1络合时，具有更大的分子量，因此不能被释放到尿中。当sFlt-1的水平增加时，sF1t-1能与P1GF络合，因此减少了游离P1GF被释放到尿中的水平。所以，对尿中游离P1GF水平的分析可以被用于诊断先兆子痫或子痫或处于此危险中的患者。
因此，在一方面，本发明提供对主体治疗或预防先兆子痫或子痫的方法，通过对主体施用能够与sFlt-1结合的化合物，其中所述施用为经过一定时间并且用量足以对主体治疗或预防先兆子痫或子痫。在优选的实施方案中，化合物为纯化的sFlt-1抗体或其抗原结合片段。
在相关的方面，本发明提供对主体治疗或预防先兆子痫或子痫的方法，通过对主体施用增加生长因子水平的化合物(例如烟碱、茶碱、腺苷，硝苯地平、米诺地尔或硫酸镁)，所述生长因子能够与sFlt-1结合，其中所述施用为经过一定时间并且用量足以对主体治疗或预防先兆子痫或子痫。
在另一个相关的方面，本发明提供对主体治疗或预防先兆子痫或子痫的方法，通过对主体施用与至少一部分sFlt-1核酸序列互补的反义核苷碱基寡聚物，其中所述施用足以对主体治疗或预防先兆子痫或子痫。在一个实施方案中，反义核苷碱基寡聚物为8至30个核苷长度。
在另一个相关的方面，本发明提供对主体治疗或预防先兆子痫或子痫的方法，通过对主体施用含有至少部分sFlt-1核酸序列的双链RNA(dsRNA)，其中所述施用足以对主体治疗或预防先兆子痫或子痫。在一个实施方案中，所述双链RNA被处理成小的干涉RNAs(siRNAs)，长度为19至25个核苷。
在上述方面的各种实施方案中，候选化合物为生长因子例如血管内皮生长因子(VEGF)，包括所有的同功型例如VEGF189、VEGF121或VEGF165；胎盘生长因子(P1GF)，包括所有的同功型；或其片段和VEGF或P1GF的修饰形式。在优选的实施方案中，候选化合物是与sFlt-1结合的抗体。在上述方面的其它实施方案中，该方法进一步包括对主体施用抗高血压化合物。还是在上述方面的其它实施方案中，主体为怀孕的人、产后的人或非人类(例如牛、马、绵羊、猪、山羊、狗或猫)。
在另一方面，本发明提供治疗或预防先兆子痫或子痫的方法，通过对有此治疗需要的主体施用有效量的包含VEGF或P1GF多肽的药物组合物。在一个实施方案中，组合物含有VEGF多肽。在另一个实施方案中，组合物含有P1GF多肽。
在相关的方面，本发明提供治疗或预防先兆子痫或子痫的方法，通过对有此治疗需要的主体施用有效量的包含编码VEGF或P1GF的核酸分子的药物组合物。在一个实施方案中，组合物含有VEGF核酸分子。在另一个实施方案中，组合物含有P1GF核酸分子。
在另一个相关的方面，本发明提供对主体治疗或预防先兆子痫或子痫的方法。该方法包括对主体施用化合物(例如化学化合物、多肽、肽、抗体或其片段)的步骤，所述化合物抑制与sFlt-1多肽结合的生长因子，所述施用足以对主体治疗或预防先兆子痫或子痫。在一个实施方案中，化合物与sFlt-1结合并阻断生长因子结合。
在上述方面的各种实施方案中，该方法进一步包括对主体施用抗高血压化合物(例如腺苷、硝苯地平、米诺地尔和硫酸镁)的步骤。在上述方面的其它实施方案中，主体为怀孕的人、产后的人或非人类(例如牛、马、绵羊、猪、山羊、狗或猫)。
在另一方面，本发明的特征为诊断主体患有先兆子痫或子痫或具有发展先兆子痫或子痫倾向的方法，包括测定来自主体的尿样品中游离P1GF的水平。该方法可以被用于确定游离P1GF的绝对水平，其在一定阀值水平下，为先兆子痫或子痫，或发展先兆子痫或子痫倾向的诊断方法。在怀孕中期尿中P1GF的正常的尿浓度为约400-800pg/ml。在优选的实施方案中，游离P1GF的水平小于400pg/ml，优选小于300、200、100、50或10pg/ml可诊断为先兆子痫或子痫或发展先兆子痫或子痫倾向。该方法还可以被用于确定游离P1GF与参照样品比较的相对水平，其中游离P1GF的水平与正常的参照样品相比降低(例如，10％，20％，25％，50％，75％，90％或更多)可诊断为先兆子痫或子痫或发展先兆子痫或子痫倾向。在这种情况下，正常的参照样品可以为来自相同主体的以前的样品或来自相匹配的主体(例如孕龄的相匹配)，所述相匹配的主体是怀孕的但是没有患有先兆子痫或子痫或发展先兆子痫或子痫倾向。在另外的优选实施方案中，参照样品为来自这样正常的参照样品的标准水平或数目。参考标准或水平还可以为来自正常的主体的值，所述正常主体与样品主体在至少有下列标准之一是相匹配的：胎儿的孕龄、母亲的年龄、怀孕前的血压、怀孕期间的血压、母亲的BMI、胎儿的重量、先兆子痫或子痫的以前诊断和先兆子痫或子痫的家族史。在优选的实施方案中，使用免疫学检验例如ELISA优选夹心ELISA或荧光免疫检验完成测定。
在优选的实施方案中，方法还包括以下步骤：(a)测定来自主体的样品中sFlt-1、P1GF和VEGF多肽中至少一种的水平，其中所述样品为选自以下的身体流体：尿、血、羊水、血清、血浆或脑脊髓的流体，和(b)将来自主体的sFlt-1、P1GF和VEGF至少一种的水平与在参照样品中的相同多肽的水平比较，其中来自主体样品与参照样品相比sFlt-1的水平的升高或VEGF或P1GF多肽水平的降低是先兆子痫或子痫，或发展先兆子痫或子痫倾向的诊断指示。在优选的实施方案中，测定来自主体的血清样品的sFlt-1或sFlt-1和P1GF，所述主体通过尿P1GF检验被鉴定处于发展先兆子痫或子痫的危险中。理想地，该方法进一步包括使用度量计算来自上述步骤(a)的sFlt-1、VEGF和P1GF至少之一水平间的相互关系，其中主体样品相对于参照样品中的度量的改变诊断为先兆子痫或子痫或发展先兆子痫或子痫倾向。优选，度量为PAAI(如上文所述)，PAAI值大于20为先兆子痫或子痫的诊断指示。在优选的实施方案中，sFlt-1为游离的、结合的或总的sFlt-1，和P1GF和VEGF为游离的P1GF和游离的VEGF。
在另一方面，本发明特征在于诊断主体患有先兆子痫或子痫或具有发展先兆子痫或子痫倾向的方法，包括下列步骤：
(a)从主体获取尿的样品；
(b)将样品与固体载体接触，其中所述固体载体包括固定的第一P1GF结合物质，保持一段时间足以使第一P1GF结合物质与在样品中存在的游离P1GF结合；
(c)在步骤(b)之后使固体载体接触第二标记的P1GF结合物质制剂，保持一段时间足以使第二标记的P1GF结合物质与和第一固定的P1GF结合物质结合的游离P1GF的结合；
(d)观察第二标记的P1GF结合物质与和游离P1GF在被固定的P1GF结合物质位置处结合的固定的P1GF结合物质的结合情况；和
(e)将在步骤(d)中观察到的结合与使用参照样品观察到的结合进行比较，其中参照样品中P1GF为已知浓度的；并且在步骤(d)中观察到的结合与使用参照样品观察到的结合比较的降低为先兆子痫或子痫或发展先兆子痫或子痫倾向的诊断指示。
在另一个相关的方面，本发明特征在于诊断主体患有先兆子痫或子痫或具有发展先兆子痫或子痫倾向的方法，包括下列步骤：
(a)获取来自主体的尿样品；
(b)将尿样品与固体载体接触，其中所述固体载体包含脱水的标记的P1GF结合物质和与P1GF结合物质结合的固定的第二物质，保持一段时间足以使样品将标记的P1GF结合物质再次水合，并使在样品中的游离P1GF与标记的P1GF结合物质结合，其中与标记的P1GF结合物质结合的游离P1GF可以移动(例如通过毛细管移动)至固定的第二物质；
(c)通过检测在第二物质被固定的位置标记的存在，观察游离P1GF-P1GF结合物质复合物与固定的第二物质的结合；和
(d)比较在步骤(c)中观察到的结合与使用参照样品观察到的结合，在参照样品中P1GF的已知浓度范围为10pg/ml-1ng/ml。
在上述两个方面的优选实施方案中，标记为比色的标记(例如胶体金)。在另外的优选实施方案中，结合P1GF的物质是抗体，或其纯化的片段，或肽。理想地，抗体或其纯化的片段特异性地结合游离P1GF。理想地结合P1GF物质的物质为抗免疫球蛋白抗体或其片段、蛋白A或蛋白G。在一个实施方案中，参照样品为已知正常浓度的P1GF样品，与参照样品比较的主体样品中游离P1GF的降低诊断为先兆子痫或子痫或发展先兆子痫或子痫倾向。
在另一方面，本发明特征在于诊断主体患有先兆子痫或子痫或具有发展先兆子痫或子痫倾向的方法，包括下列步骤：
(a)获取来自主体的尿样品；
(b)将样品与具有固定P1GF结合物质的固体载体接触，所述固定P1GF结合物质被以可检测的方式标记，以致标记能够区分与游离P1GF结合的P1GF和不与游离P1GF结合的P1GF。优选的标记包括荧光标记。将膜暴露于取自主体的尿样品保持一段时间足以使P1GF结合物质与在样品中存在的游离P1GF的结合。然后测定与游离P1GF结合的标记的P1GF结合物质。这样的检验可以被用于确定P1GF的相对水平(例如与来自参照样品或标准或水平的水平比较)或如上文所述确定P1GF的绝对浓度。测定结合的优选检验包括荧光免疫检验。
在另一方面本发明特征在于诊断主体患有先兆子痫或子痫或具有发展先兆子痫或子痫倾向的方法，包括下列步骤：
(a)获取来自主体的尿样品；
(b)将样品与固体载体接触，其中所述固体载体包含固定的第一P1GF结合物质，保持一段时间足以使第一P1GF结合物质与在样品中存在的游离P1GF结合；
(c)在步骤(b)后将所述固体载体与偶合到酶上的第二P1GF结合物质接触，保持一段时间足以使第二P1GF结合物质与第一固定的P1GF结合物质结合的P1GF结合；和
(d)加入步骤(c)中所述酶底物的制剂，保持一段时间和以一定的量足以使所述酶转化所述底物为可检测的底物；
(e)观察可检测底物的水平；和
(f)比较在步骤(e)中观察到的水平与使用参照样品观察到的结合，其中参照样品中P1GF为已知的浓度，其中与参照样品比较在步骤(e)中观察到的水平的改变为先兆子痫或子痫或发展先兆子痫或子痫倾向的诊断指示。
在一个实施方案中，参照样品为处于已知正常浓度的P1GF样品，与参照样品比较在主体样品中游离P1GF浓度的降低诊断为先兆子痫或子痫或发展先兆子痫或子痫倾向。
在上述方法的优选实施方案中，底物是被通过分光光度法或化学发光法可视检测的。在另外的优选实施方案中，所述酶为辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶或碱性磷酸酶，所述底物为TMB(四甲基联苯胺)、Xgal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖吡喃苷酶)或1，2-二氧杂环丁烷。在另外的优选实施方案中，参照样品为具有正常纯化P1GF浓度的样品，与参照样品比较主体样品显示降低(10％、25％、50％、75％、90％或更高)。在这种方法的优选实施方案中，P1GF结合物质为纯化的抗P1GF抗体或其片段，或肽。理想地，纯化的抗P1GF抗体或其片段特异性地结合游离P1GF。
在任何上述诊断方法的优选实施方案中，固体载体为膜，所述膜可以被支撑在浸渍片结构或侧流格式上，其例子在美国专利6,660、534中描述。在另外的优选实施方案中，主体为非怀孕的人、怀孕的人或产后的人。在上述方面的其它实施方案中，主体为非人类(例如牛、马、绵羊、猪、山羊、狗或猫)。在一个实施方案中，主体为非怀孕的人，该方法用于诊断发展先兆子痫或子痫倾向。在另一个实施方案中，主体为患有先兆子痫历史的人(怀孕的或非怀孕的)，该方法用于诊断在随后的怀孕中发展先兆子痫或子痫倾向。理想地，水平测定在两次或更多次时机完成，多次测定之间水平的变化为先兆子痫或子痫的诊断指示。
在另外的优选实施方案中，这些用来检测来自主体尿样品中的P1GF水平方法可以与任何如下描述的用于测定sFlt-1、P1GF或VEGF核酸或多肽水平的诊断方法联合使用。
在另一方面，本发明提供诊断主体患有先兆子痫或子痫或具有发展先兆子痫或子痫倾向的方法，该方法包括测定来自主体的样品中sFlt-1、VEGF或P1GF多肽水平。
在相关的方面，本发明提供诊断主体患有先兆子痫或子痫或具有发展先兆子痫或子痫倾向的方法，通过测定来自主体的样品中sFlt-1、VEGF或P1GF多肽中至少两种的水平，使用度量计算sFlt-1、VEGF或P1GF水平之间的相互关系，其中相对于参考的主体样品中的改变诊断为主体患先兆子痫或子痫。在优选的实施方案中，该方法还包括确定体重指数(BMI)、胎儿孕龄(GA)或两者，包括BMI或GA或两者都为度量的。在一个实施方案中，度量为先兆子痫抗血管生成指数(PAAI)：[sFlt-1/VEGF+P1GF]，其中PAAI用作抗血管生成活性的指示。在一个实施方案中，PAAI大于10，更优选大于20，指示为先兆子痫或子痫。在另一个实施方案中，sFlt-1、VEGF或P1GF多肽的水平通过免疫学检验例如ELISA测定。
在上述方面的各种实施方案中，样品为身体流体，例如血清或尿。在一个实施方案中，sFlt-1的水平大于2ng/ml指示为先兆子痫或子痫。在上述方面的优选实施方案中，测定的sFlt-1多肽的水平为游离的、结合的或总sFlt-1多肽的水平。在另外的实施方案中，sFlt-1多肽还可以包括由降解或酶催化裂解sFlt-1得到的sFlt-1片段或多肽副产物。在上述方面的其它优选实施方案中，VEGF或P1GF的水平为游离的VEGF或P1GF水平。
在另一方面，本发明提供诊断主体患有先兆子痫或子痫或具有发展先兆子痫或子痫倾向的方法，包括测定来自主体的样品中sFlt-1、VEGF或P1GF核酸分子的水平，将其同参照样品进行比较，在水平中的改变诊断为主体患先兆子痫或子痫，或诊断为有发展先兆子痫或子痫倾向。
在另一方面，本发明提供诊断主体患有先兆子痫或子痫或具有发展先兆子痫或子痫倾向的方法，通过测定主体sFlt-1、VEGF或P1GF基因的核酸序列，并将其同参考序列进行比较，引起主体基因产物水平或生物活性变化的主体核酸序列的改变诊断为主体患有先兆子痫或子痫，或有发展先兆子痫或子痫倾向。在一个实施方案中，所述改变为核酸序列多态性。
在任何上述方面的各种实施方案中，样品为sFlt-1、VEGF或P1GF正常可检测的主体的身体流体(例如尿、羊水、血清、血浆或脑脊髓的流体)。在另外的实施方案中，样品为组织或细胞。非限制性例子包括胎盘组织或胎盘细胞、内皮细胞、白细胞和单细胞。在上述方面的其它实施方案中，主体为非怀孕的人、怀孕的人或产后的人。在上述方面的其它实施方案中，主体为非人类(例如牛、马、绵羊、猪、山羊、狗或猫)。在一个实施方案中，主体为非怀孕的人，该方法用于诊断发展先兆子痫或子痫倾向。在上述方面的其它实施方案中，至少测定的水平之一为sFlt-1的水平(游离的、结合的或总的)。在另外的实施方案中，测定的sFlt-1的水平包括sFlt-1降解产物或酶催化裂解产物的水平。在上述方面的其它实施方案中，当VEGF的水平被测定时，则sFlt-1或P1GF的水平也被测定。在另外的实施方案中，BMI或GA或两者也被测定。在上述方面的各种实施方案中，sFlt-1核酸或多肽水平相对于参考的增加为先兆子痫或子痫的诊断指示。在上述方面的其它实施方案中，游离VEGF多肽或VEGF核酸水平相对于参考的降低为先兆子痫或子痫的诊断指示。在上述方面的其它实施方案中，游离P1GF多肽或P1GF核酸水平相对于参考的降低为先兆子痫或子痫的诊断指示。
在上述方面的另外实施方案中，水平是在两次或更多次时机测定的，多次测定之间水平的变化为先兆子痫或子痫的诊断指示。在一个优选的实施方案中，sFlt-1的水平从第一测定至下一次测定增加。在另一个优选的实施方案中，VEGF或P1GF的水平从第一测定至下一次测定降低。
在相关的方面，本发明提供用于对主体诊断先兆子痫或子痫的试剂盒，包含用于检测sFlt-1、VEGF或P1GF多肽或其任何组合的成分。在一个实施方案中，成分为选自下列的检验：免疫学检验、酶学检验和比色检验。在上述方面的其它实施方案中，所述试剂盒诊断怀孕的或非怀孕的主体发展先兆子痫或子痫倾向。在上述方面的优选实施方案中，所述试剂盒检测VEGF、sFlt-1或P1GF。在上述方面的其它优选实施方案中，当所述试剂盒检测VEGF时，则也检测sFlt-1或P1GF。在另外的优选实施方案中，所述试剂盒用于检测VEGF、sFlt-1和P1GF，并测定样品的PAAI。
在另一方面，本发明提供用于诊断主体先兆子痫或子痫的诊断试剂盒，包括核酸序列或其片段，选自sFlt-1、VEGF和P1GF核酸分子或其互补序列，或其任何组合。在优选的实施方案中，所述试剂盒包含至少两个用于检测sFlt-1、VEGF或P1GF核酸分子的探针。
本发明还提供用于诊断主体先兆子痫或子痫的试剂盒，包括用于检测尿样品中游离P1GF的P1GF结合物质，和将其用于诊断主体先兆子痫或子痫或发展先兆子痫或子痫倾向的说明书。所述试剂盒还可以包括用于选自下列检验的成分：免疫学检验(例如ELISA)、酶学检验或比色检验。理想地，所述试剂盒包括完成任何上述诊断方法所需的任何成分。例如所述试剂盒理想地包括膜，其中将P1GF结合物质或结合P1GF结合物质的物质固定在膜上。所述膜可以被支持在浸渍片结构上，其中通过将浸渍片结构放到样品中使样品沉积在膜上，或者所述膜可以被支持在侧流盒子中，通过盒子的开孔使样品沉积在膜上。
在上述任何诊断试剂盒的优选实施方案中，诊断试剂盒包括用于所述试剂盒成分和用于建立标准曲线的参照样品或纯化的蛋白的标签或说明书。在一个实施方案中，诊断试剂盒被标记，或包括用于在诊断主体先兆子痫或子痫或发展先兆子痫或子痫倾向中使用的说明书。在另一个实施方案中，诊断试剂盒被标记，或包括用于在诊断心血管病症或发展心血管病症的倾向中使用的说明书。在另一个实施方案中，诊断试剂盒被标记，或包括用于治疗性监测或治疗剂量确定使用的说明书。在优选的实施方案中，诊断试剂盒包括用于在测定主体样品中PAAI和将测定的PAAI与参照样品值比较中使用的标记或说明书。应当理解参照样品值取决于所述试剂盒的使用目的。例如样品可以与正常的PAAI参考值或正常的P1GF值比较，其中PAAI的增加或P1GF值的降低指示为先兆子痫或子痫，或发展先兆子痫或子痫倾向。在另一个实施例中，用于治疗性监测的试剂盒可以具有参考PAAI值或P1GF值，其指示为先兆子痫或子痫，其中相对于参照样品主体样品中PAAI值的降低或P1GF值的增加可以被用于显示治疗效果或治疗化合物有效剂量。
本文所述的任何方法和试剂盒可以被用于对以前怀孕的妇女或患有先兆子痫历史的妇女诊断先兆子痫或子痫，或预测随后先兆子痫。
本文所述的任何诊断方法还可以用于监测主体的先兆子痫或子痫。在优选的实施方案中，诊断方法用于在主体治疗期间监测或用于确定有效的治疗剂量。在一个实施方案中，治疗期间或在施用治疗后测定的sFlt-1多肽或核酸的水平相对于治疗前的值的降低显示先兆子痫或子痫的好转。在优选的实施方案中，sFlt-1多肽水平小于2ng/ml显示先兆子痫或子痫的好转。在另一个实施方案中，以一定剂量施用治疗化合物以致Flt-1多肽的水平小于2ng/ml。在另一个实施方案中，治疗期间或在施用治疗后测定的VEGF或P1GF多肽或核酸的水平相对于治疗前的值的增加显示先兆子痫或子痫的好转。在另一个实施方案中，主体PAAI值的降低显示先兆子痫或子痫的好转。在优选的实施方案中，PAAI小于20，更优选小于10。PAAI的降低还指示治疗化合物的有效剂量。在一个实施例中，以一定剂量施用治疗化合物以致PAAI小于20。在另一个实施例中，以一定剂量施用治疗化合物以致PAAI小于10。在优选的实施方案中，sFlt-1、P1GF或VEGF水平的测定在两次或更多次时机完成，多次测定之间水平的变化用于监测治疗或确定化合物的治疗剂量。
上述诊断方法包括尿样品中游离P1GF的测定，可以用于在治疗期间监测主体或用于确定有效的治疗剂量。例如如上文所述用于P1GF水平的尿测试可以被用于治疗期间监测主体的定期基础(例如每月、每周、每隔一日、每日或每小时)。在一个实施方案中，以一定剂量施用治疗化合物以致P1GF浓度大于200pg/ml、300pg/ml、400pg/ml、500pg/ml、600pg/ml、700pg/ml或800pg/ml。对于使用P1GF的监测检验，参照样品将为指示先兆子痫的P1GF浓度(小于400pg/ml)，与参照样品比较P1GF浓度的增加显示为治疗化合物的有效剂量。
在相关的方面，本发明特征在于用于诊断主体患有先兆子痫或子痫或具有发展先兆子痫或子痫倾向的设备，包括用于比较相对于参照样品来自主体样品的sFlt-1、VEGF和P1GF多肽至少之一的水平的成分，其中sFlt-1、VEGF和P1GF至少一种水平的改变诊断为主体患先兆子痫或子痫，或具有发展先兆子痫或子痫倾向。在优选的实施方案中，所述设备包括用于使用度量比较sFlt-1、VEGF和P1GF多肽中至少两者水平的成分。
在相关的方面，本发明特征在于用于诊断主体患有先兆子痫或子痫或具有发展先兆子痫或子痫倾向的设备，包括用于比较来自主体样品的sFlt-1、VEGF和P1GF核酸分子至少之一水平相对于参照样品的成分，其中sFlt-1、VEGF和P1GF至少一种水平的改变诊断为主体患先兆子痫或子痫，或具有发展先兆子痫或子痫倾向。在优选的实施方案中，所述设备包括用于使用度量比较sFlt-1、VEGF和P1GF核酸分子中至少两者水平的成分。
在另一方面，本发明提供鉴定改善先兆子痫或子痫的化合物的方法，通过将表达sFlt-1、VEGF或P1GF核酸分子的细胞与候选化合物接触，将在被候选化合物接触的细胞中核酸分子的表达水平与在没有被候选化合物接触的对照细胞中核酸分子的表达水平比较，其中sFlt-1、VEGF或P1GF核酸分子表达的改变鉴定候选化合物为改善先兆子痫或子痫的化合物。
在一个实施方案中，改变为sFlt-1水平的降低。在其它实施方案中，改变是VEGF或P1GF水平的增加。在其它实施方案中，改变是在转录中或在翻译中。在另一个实施方案中，当该方法鉴定出候选化合物增加VEGF的表达时，该候选化合物也增加P1GF的表达或减少sFlt-1的表达。
在另一方面，本发明提供配制在可药用载体中的包括VEGF或P1GF多肽或其部分的药物组合物。
在相关的方面，本发明提供配制在可药用载体中的包括P1GF核酸分子或其部分的药物组合物。在一个实施方案中，组合物进一步含有VEGF核酸分子或其部分。
在另一方面，本发明提供包含与sFlt-1特异性结合的纯化的抗体或其抗原结合片段的组合物。在一个优选的实施方案中，抗体阻止生长因子与sFlt-1的结合。在其它实施方案中，抗体为单克隆抗体。在其它优选的实施方案中，抗体或其抗原结合片段为人或人化抗体。在其它实施方案中，抗体没有Fc部分。其它实施方案中，抗体是F(ab′)2、Fab或Fv结构。在其它实施方案中，抗体或其抗原结合片段存在于可药用载体中。
在另一方面，本发明提供改善先兆子痫或子痫的化合物的鉴定方法，包括将表达sFlt-1、VEGF或P1GF多肽的细胞与候选化合物接触，并比较在与候选化合物接触细胞中的多肽表达水平与在没有接触候选化合物的对照细胞中多肽表达水平，其中在sFlt-1、VEGF或P1GF多肽的表达中的改变鉴定出候选化合物为改善先兆子痫或子痫的化合物。在一个实施方案中，使用免疫学检验、酶学检验、或免疫检验来分析在表达上的改变。在一个实施方案中，表达上的改变为sFlt-1水平的降低。在另一个实施方案中，表达上的改变为VEGF或P1GF的水平的增加。
在另一方面，本发明提供改善先兆子痫或子痫的化合物的鉴定方法，包括将表达sFlt-1、VEGF或P1GF多肽的细胞与候选化合物接触，并比较在与候选化合物接触细胞中的多肽的生物活性水平与在没有接触候选化合物的对照细胞中多肽的生物活性水平，其中sFlt-1、VEGF或P1GF多肽的生物活性的增加鉴定出候选化合物为改善先兆子痫或子痫的化合物。在一个实施方案中，使用免疫学检验、酶学检验、或免疫检验来分析生物活性的增加。在一个实施方案中，表达的改变为sFlt-1活性的降低。在另一个实施方案中，表达的改变为VEGF或P1GF活性的增加。
在另一方面，本发明提供改善先兆子痫或子痫的化合物的鉴定方法，包括在候选化合物存在下检测sFlt-1多肽和生长因子的结合，其中相对于候选化合物不存在时sFlt-1多肽和生长因子的结合，所述结合上的降低鉴定出候选化合物为改善先兆子痫或子痫的化合物。在一个实施方案中，生长因子为VEGF。在另一个实施方案中，生长因子为P1GF。
在另一方面，本发明提供鉴定阻止sFlt-1多肽和生长因子结合的多肽或其片段的方法。该方法包括在候选多肽存在下检测sFlt-1多肽和生长因子之间的结合，其中相对于候选多肽不存在时sFlt-1多肽和生长因子的结合，所述结合上的降低鉴定出候选多肽为阻止sFlt-1多肽和生长因子结合的多肽。在一个实施方案中，生长因子为VEGF。在另一个实施方案中，生长因子为P1GF。
在另一方面，本发明提供改善先兆子痫或子痫的化合物的鉴定方法，包括检测sFlt-1多肽和候选化合物的结合，其中与sFlt-1多肽结合的化合物改善先兆子痫或子痫。
在相关的方面，本发明提供根据上述方面鉴定化合物，其中化合物为与sFlt-1多肽特异性地结合的多肽，阻止sFlt-1多肽与VEGF或P1GF的结合。在一个优选的实施方案中，多肽是抗体。在另一个优选的实施方案中，多肽为sFlt-1、VEGF或P1GF的片段。
在上述方面的优选实施方案中，改善先兆子痫或子痫的化合物减小sFlt-1的表达水平或生物活性。在上述方面的优选实施方案中，改善先兆子痫或子痫的化合物增加VEGF或P1GF的表达水平或生物活性。
在另一个方面，本发明特征在于诊断主体患有心血管病症或具有发展心血管病症倾向的方法。这种方法包括测定来自主体样品中sFlt-1多肽的水平，并将其与参照样品比较，其中主体样品水平的改变诊断主体为心血管病症或具有发展心血管病症倾向。在优选的实施方案中，使用免疫学检验例如ELISA完成测定。
在相关的方面，本发明特征在于诊断主体患有心血管病症或具有发展心血管病症倾向的方法。这种方法包括测定来自主体样品中sFlt-1核酸分子的水平，并将其与参照样品比较，其中水平的改变诊断主体患心血管病症或具有发展心血管病症倾向。
在上述方面的优选实施方案中，主体为怀孕的或曾经怀孕的雌性。在另外的优选实施方案中，雌性主体有先兆子痫或子痫的历史。在另外的优选实施方案中，参照样品选自不具有先兆子痫或子痫历史的雌性。
在相关的方面，本发明特征在于诊断主体患有心血管病症或具有发展心血管病症倾向的方法。这种方法包括确定来自主体样品中的sFlt-1、VEGF或P1GF基因的核酸序列，并将其与参考序列比较，其中在主体核酸序列中的改变，该改变导致主体基因产物表达水平或生物活性的变化，诊断为主体患心血管病症或具有发展心血管病症倾向。
在上述方面的优选实施方案中，样品为其中sFlt-1正常可检测的细胞、组织或身体流体。优选的样品包括尿、羊水、血清、血浆，脑脊髓的流体和胎盘细胞或组织。在上述方面的优选实施方案中，心血管病症选自下列：动脉粥样硬化、原发性心肌梗塞、继发性心肌梗塞、心绞痛、充血性心力衰竭、突发性心死亡、脑梗塞、再狭窄、晕厥、局部缺血、再灌注损伤、血管闭塞、颈动脉梗阻病和瞬时缺血发作。
为本发明的目的，下列缩写和术语定义如下。
“改变”意指通过标准技术例如上述那些的已知方法检测到的基因或多肽在表达水平的变化(增加或降低)。本文中所用的改变包括在表达水平上10％的变化，优选25％的变化，更优选40％的变化和最优选在表达水平上50％或更大的变化。“改变”还可以显示本发明任何多肽(例如sFlt-1、VEGF或P1GF)在生物活性上的变化(增加或降低)。P1GF或VEGF生物活性的实施例包括与受体结合的生物活性，通过免疫检验、配体结合试验或Scatchhard作图分析测定，以及诱导细胞增生或迁移的生物活性，通过BrdU标记、细胞计数试验或DNA合成的定量分析例如3H-胸苷结合测定。对sFlt-1生物活性的实施例包括与P1GF和VEGF结合的生物活性，通过免疫检验、配体结合试验或Scatchhard作图分析测定。对每个多肽用于生物活性检验的另外的实施例如本文所述。本文中所用的改变包括在生物活性上10％的变化，优选25％的变化，更优选40％的变化和最优选在生物活性上50％的或更大的变化。
“反义核苷碱基寡聚物”意指核苷碱基寡聚物，不管长度，其与sFlt-1基因的编码链或mRNA互补。“核苷碱基寡聚物”意指包括至少8个核苷碱基、优选至少12个和最优选至少16个碱基的被链连接组连接的化合物。此定义包括天然和非天然寡聚核苷，修饰的或未修饰的两者，以及寡聚核苷模拟物例如蛋白核酸、锁定的核酸和阿拉伯核酸。许多核苷碱基和连接组可以在本发明核苷碱基寡聚物中被采用，包括那些在美国专利申请20030114412和20030114407中描述的，在此引入作为参考。核苷碱基寡聚物还可以靶向翻译起始和停止位点。优选反义核苷碱基寡聚物包含约8至30个核苷。反义核苷碱基寡聚物还可以含有至少40、60、85、120或更多连续的核苷，其与sFlt-1mRNA或DNA互补，可以与全长mRNA或基因一样长。
“体重指数”意指由高度和重量测定衍生的数，给出体重是否在健康范围之内的一般性指示。一般用于确定体重指数的式子是以千克计人的体重除以以平方米计人的身高或重量(kg)/(身高(m))2。
“心血管病症”意指心血管系统的活动或病症。心血管病症的非限制性例子包括动脉粥样硬化、原发性心肌梗塞、继发性心肌梗塞、心绞痛(包括稳定和不稳定绞痛两者)、充血性心力衰竭、突发性心死亡、脑梗塞、再狭窄、晕厥、局部缺血、再灌注损伤、血管闭塞、颈动脉梗阻病，瞬时缺血发作等等。
“化合物”意指任何小分子化学化合物、抗体、核酸分子或多肽或其片段。
“嵌合抗体”意指包含与另一个蛋白(典型地为免疫球蛋白恒定域)的至少一部分连接的抗体分子的至少抗原-结合部分的多肽。
“双链RNA(dsRNA)”意指包含有义链和反义链两者的核糖核酸分子。dsRNA典型地用于介导RNA干预。
“表达”意指通过标准技术的已知方法检测基因或多肽。例如多肽表达通常通过蛋白印迹检测，DNA表达通常通过DNA印迹或聚合酶链反应(PCR)检测，RNA表达通常通过RNA印迹、PCR或RNAse保护检验检测。
“片段”意指多肽或核酸分子的部分。所述部分优选含有参考核酸分子或多肽全部长度的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。片段可以含有10、20、30、40、50、60、70、80、90或100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000个核苷或氨基酸。
“孕龄”意指胎儿年龄的参考值，从母亲最后一次月经周期的第一天计算，通常以周提及。
“先兆子痫或子痫历史”意指在主体她们本人或相关的家族成员中以前诊断有先兆子痫或子痫，或怀孕诱发的高血压。
“同源”意指任何基因或蛋白序列与已知的基因或蛋白序列在比较序列长度上具有至少30％同源性，更优选40％、50％、60％、70％、80％和最优选90％或更高的同源性。“同源”蛋白还可以具有比较蛋白的至少一种生物活性。对于多肽，比较序列的长度一般至少为16个氨基酸，优选至少为20个氨基酸，更优选至少为25个氨基酸，和最优选35个氨基酸或更多。对于核酸，比较序列的长度一般至少为50个核苷，优选至少60个核苷，更优选至少75个核苷，和最优选至少110个核苷。“同源性”还可以意指用于产生抗体的抗原决定部位与抗体导向的蛋白或其片段之间基本上相似。在这种情况下，同源性意指相似性足以引起抗体的产生，产生的抗体可以特异性地识别在组织中的蛋白。
“人化抗体”意指免疫球蛋白氨基酸序列变种或其片段，能够结合预先确定的抗原。通常，抗体将含有轻链以及重链的至少可变的功能域两者。抗体还可以包括重链的CH1、铰合部、CH2、CH3或CH4区域。人化抗体包含基本上具有人免疫球蛋白氨基酸序列的框架区(FR)，和基本上具有非人类免疫球蛋白(“引入”序列)氨基酸序列的互补确定区(CDR)。
一般说来，人化抗体具有一个或多个由非人类来源引入的氨基酸残基。通常，人化抗体将包含基本上所有的至少一种，和典型地两种可变的功能域(Fab、Fab′、F(ab′)2、Fabc、Fv)，其中所有的或基本上所有的CDR区相应于那些非人类免疫球蛋白，所有的或基本上所有的FR区为那些人的免疫球蛋白的一致序列。人化抗体任选将包含至少部分的免疫球蛋白不变区(Fc)，典型地为人免疫球蛋白的。“互补确定区(CDR)”意指在免疫球蛋白轻链和重链的每个之内的可变区域中三个高度可变的序列。“框架区(FR)”意指位于免疫球蛋白轻链和重链的三个高度可变的序列(CDR)中任一面的氨基酸序列。
人化抗体的FR和CDR区不需要精确对应于母体序列，例如引入的CDR或一致的FR可以通过替代、插入或缺失至少一种残基，以致CDR或FR残基在那一位点与一致的或引入的抗体都不相对应。但是这样的突变不可广泛地存在。通常，人化抗体残基中至少75％、优选90％和最优选至少95％与那些母体FR和CDR序列相对应。
“杂化”意指在各种严紧条件下在互补多核苷序列或其部分之间成对形成双链分子。(参见例如Wahl和Berger(1987)methodsEnzymol.152：399；Kimmel，methods Enzymol.152：507，1987)。例如严紧(Strigent)盐浓度通常为小于约750mM NaCl和75mM柠檬酸三钠盐，优选小于约500mM NaCl和50mM柠檬酸三钠盐和最优选小于约250mM NaCl和25mM柠檬酸三钠盐。在不存在有机溶剂例如甲酰胺情况下可以获得低度严紧杂化，然而在至少约35％甲酰胺，最优选至少约50％甲酰胺的存在下可以获得高严紧杂化。严紧温度条件通常包括温度至少约30℃，更优选至少约37℃，最优选至少约42℃。各种另外的参数例如杂化时间、清洁剂例如十二烷基硫酸钠(SDS)的浓度和载体DNA的包含和排除对本领域的那些技术人员是众所周知的。通过组合各种所需的条件获得各种水平的严紧。在优选的实施方案中，杂化在30℃在750mM NaCl、75mM柠檬酸三钠盐和1％SDS下发生。在更优选的实施方案中，杂化在37℃在500mM NaCl、50mM柠檬酸三钠盐、1％SDS、35％甲酰胺和100μg/ml变性鲑鱼精子DNA(ssDNA)下发生。在最优选的实施方案中，杂化将在42℃在250mM NaCl、25mM柠檬酸三钠盐、1％SDS、50％甲酰胺和200μg/ml ssDNA下发生。在这些条件上有用的变化对本领域那些技术人员是容易明白的。
对于大部分的应用，杂化后的洗涤步骤也是在严紧度上变化的。通过盐浓度和温度可以定义洗涤条件。如上所述，洗涤严紧度可以通过降低盐浓度或升高温度而增加。例如用于洗涤步骤的严紧盐浓度优选小于约30mM NaCl和3mM柠檬酸三钠盐，最优选小于约15mMNaCl和1.5mM柠檬酸三钠盐。用于洗涤步骤的严紧温度条件通常包括温度为至少约25℃，更优选至少约42℃，最优选至少约68℃。在优选的实施方案中，洗涤步骤在25℃在30mM NaCl、3mM柠檬酸三钠盐和0.1％SDS下发生。在更优选的实施方案中，洗涤步骤在42℃在15mM NaCl、1.5mM柠檬酸三钠盐和0.1％SDS下发生。在最优选的实施方案中，洗涤步骤在68℃在15mM NaCl、1.5mM柠檬酸三钠盐和0.1％SDS下发生。在这些中的另外的变化对本领域那些技术人员是容易明白的。对于本领域那些技术人员杂化技术是众所周知的，例如记载在Benton和Davis(Science 196：180，1977)；Grunstein和Hogness(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 72：3961，1975)；Ausubel等(CurrentProtocols in Molecular Biology，Wiley Interscience，New York，2001)；Berger和Kimmel(Guide to Molecular Cloning Techniques，1987，Academic Press，New York)；和Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NewYork。
“子宫内生长延迟(IUGR)”意指导致出生体重小于该孕龄胎儿预测胎儿重的10％的综合征。当前世界卫生组织对低出生体重的标准是体重小于2,500gm(5lbs.8oz.)或低于根据美国以人种、经产状况和婴儿性别对于孕龄分列的出生体重表的孕龄的第10个百分位数(Zhang和Bowes，Obstet.Gynecol.86：200-208，1995)。这些低出生体重婴儿还被称为“小于胎龄儿(SGA)”。先兆子痫是已知与IUGR或SGA相关的病症。
“度量”意指一类测定。度量可以用于例如比较目标多肽或核酸分子的水平。示范的度量包括但不限于数学式或运算法则，例如比率。度量用于将患有先兆子痫或子痫的主体与正常对照主体的sFlt-1、VEGF或P1GF的水平进行最好的区分。取决于使用的度量，子痫或先兆子痫的诊断指示可以显著在某一参考值(例如来自不患有先兆子痫或子痫的对照主体的)之上或之下。
通过测定游离的、结合的(即与生长因子结合的)或总的sFlt-1(结合+游离)的测定确定sFlt-1的水平。通过测定游离P1GF或游离VEGF(即没有与sFlt-1结合的)的量确定VEGF或P1GF的水平。一种示范性的度量为[sFlt-1/(VEGF+P1GF)]，也称为先兆子痫抗血管生成指数(PAAI)。
“可操作地连接的”意指基因和一个或多个调节序列是以这样的方式连接的，当适当的分子(例如转录活化蛋白)与一个或多个调节序列结合时允许基因的表达。
“可药用载体”意指对被治疗的哺乳动物生理学上可接受的载体，同时保持施用化合物的治疗性质。一种示范性的可药用载体物质为生理盐水。其它生理学可接受的载体和它们的剂型对本领域技术人员是已知的，例如在Remington′s Pharmaceutical Sciences，(第20版)，A.Gennaro编辑，2000，Lippincott，Williams & Wilkins，Philadelphia，PA.中描述的。
“胎盘生长因子(P1GF)”意指哺乳动物的生长因子，其与GenBank编号P49763所定义的蛋白是同源的，具有P1GF的生物活性。P1GF为糖基化的同型二聚体，属于VEGF家族，通过选择性剪接机制发现其存在两个不同的同功型。P1GF通过在胎盘中细胞-和合胞体滋养层表达，P1GF生物活性包括诱导增生、迁移和活化内皮细胞，特别是滋养层细胞。
“多形态”意指在sFlt-1、P1GF或VEGF核酸分子中基因的变种、突变、缺失或添加，其是发展病症的易患病体质的指示。这样的多形态对技术人员是已知的，Parry等(Eur.J Immuogenet.26：321-3，1999)进行了描述。多形态可以存在于启动子序列、开放阅读框架、基因内序列或sFlt-1基因的未翻译3′区域中。
“先兆子痫”意指由于怀孕或最近怀孕影响所致的多系统病症，特征在于伴随蛋白尿或肿胀或两者均有的高血压、肾小球功能障碍、大脑肿胀、肝肿胀或凝血异常。先兆子痫一般发生在妊娠第20周后。先兆子痫一般定义为下列症状的一些组合：(1)在妊娠20周后(一般在两个时机测定，分开4-168小时)心脏收缩期血压(BP)＞140mmHg和心脏舒张期BP＞90mmHg，(2)新近发作的蛋白尿(1+通过尿分析用浸渍片，在24小时收集的尿中蛋白＞300mg或单次随机尿样品中具有的蛋白/肌酸酐比率＞0.3)，和(3)产后12周高血压和蛋白尿消除。严重的先兆子痫一般定义为(1)心脏舒张期BP＞110mmHg(一般在两个时机测定，分开4-168小时)或(2)蛋白尿鉴定：在24小时收集的尿中测定有3.5g或更多的蛋白，或者通过浸渍片测定在两次随机尿样品中至少有3+蛋白。在先兆子痫中，高血压和蛋白尿一般在彼此相隔几天之内发生。在严重的先兆子痫中，严重高血压、严重蛋白尿、和HELLP综合征(溶血、升高的肝酶、低血小板)或子痫可以同时发生或在一段时间只发生一种症状。有时，严重的先兆子痫可以导致惊厥发作的发展。该综合征的严重形式被称作“子痫”。子痫还可以包括几种器官或组织例如肝(例如肝细胞损伤、门静脉周的坏死)和中枢神经系统(例如脑肿胀和脑出血)的功能障碍或损伤。惊厥发作的病因被认为是在脑肿胀和肾小血管病灶痉挛发展的继发。
“先兆子痫抗血管生成指数(PAAI)”意指sFlt-1/VEGF+P1GF的比率，被用作抗血管生成活性的指示。PAAI大于10、更优选大于20被认为是先兆子痫或先兆子痫危险的指示。
“蛋白”或“多肽”或“多肽片段”意指任何超过两个氨基酸的链，不管翻译后的修饰(例如糖基化或磷酸化)，构成所有或部分天然发生的多肽或肽，或构成非天然发生的多肽或肽。
“降低或抑制”意指通过前述检验(参见“表达”)的检测，导致蛋白或核酸的水平全面降低优选20％或更大、更优选50％或更大和最优选75％或更大的能力。在相关实施方案中，使用反义核苷碱基寡聚物或RNA干预以降低或抑制蛋白或核酸的水平，通过比较在被治疗样品中的水平与没有用反义核苷碱基寡聚物或dsRNA治疗的样品中的水平确定降低或抑制百分率。
“参照样品”意指选自在测试样品时间之前的主体的样品、不患有先兆子痫或子痫的怀孕主体、怀孕的主体但是选出样品在怀孕早期(例如第一个或第二个三个月或在检测先兆子痫或子痫之前)、怀孕的主体但是不患有先兆子痫或子痫且无先兆子痫或子痫的历史、或没有怀孕的主体。参照样品还可以为在一定浓度的纯化的多肽(例如P1GF、VEGF或sFlt-1)，该浓度已知为不诊断为先兆子痫或子痫的正常浓度。例如尿中P1GF浓度在正常怀孕期间范围为400-800pg/ml，然而患有活动性先兆子痫的那些在妊娠中期可以在200pg/ml以下。尿中P1GF的水平在400pg/ml以下或在200pg/ml以下为先兆子痫或倾向于发展先兆子痫指示。“参照样品”还可以为参考标准或水平。“参考标准或水平”意指来自参照样品的值或数。参考标准或水平还可以为来自正常主体的值或数，所述正常主体与样品主体与下列标准至少之一是相匹配的：胎儿的孕龄、母亲年龄、母亲怀孕前的血压、怀孕期间母亲血压、母亲BMI、胎儿的重量、以前诊断为先兆子痫或子痫和先兆子痫或子痫的家族史。参考值还可以基于在参照样品中的特定多肽的值确定使用。
“小干预RNAs(siRNAs)”意指分离的dsRNA分子，优选长度大于10个核苷，更优选长度大于15个核苷，最优选长度大于19个核苷，用于鉴定待降解的靶标基因或mRNA。19-25个范围的核苷是siRNAs最优选的大小。siRNA还可以包括短发夹RNA，其中siRNA的双链的两条链都包括在单个RNA分子之内。siRNA包括任何形式的dsRNA(较大dsRNA蛋白水解的裂解产物、部分纯化的RNA、基本纯化的RNA、合成RNA、重组产生的RNA)以及被改变的RNA，其由于添加、缺失、替代、和/或改变一个或多个核苷与天然发生的RNA不同。这样的改变可以包括非核苷原料的加入，例如加入21至23ntRNA的末端或内部(在RNA的一个或多个核苷处)。在优选的实施方案中，RNA分子含有3′羟基基因。在本发明RNA分子中的核苷还可以包含非标准核苷，包括非天然发生的核苷或脱氧核糖核苷。总之，所有的这样的改变的RNAs都被称作RNA类似物。本发明的siRNA仅仅需要与天然RNA足够地类似，具有介导RNA干预(RNAi)的能力。本文中所用的RNAi意指通过将小干预RNA或dsRNA引入到细胞或器官中使特异性mRNA分子被ATP-依赖的靶向裂解和降解。本文中所用的“调节RNAi”意指区分或鉴别那个RNAs被降解的能力。
“可溶的Flt-1(sFlt-1)”(也称作sVEGF-Rl)意指Flt-1受体的可溶形式，其与GenBank编号U01134定义的蛋白是同源的，具有sFlt-1的生物活性。sFlt-1多肽的生物活性可以使用任何标准方法进行检验，例如通过检验Flt-1与VEGF的结合。sFlt-1没有跨膜功能域和Flt-1受体的细胞质酪氨酸激酶功能域。sFlt-1可以与VEGF和P1GF高亲和性地结合，但是它不诱导增生或血管生成，因此其功能与Flt-1和KDR受体不同。sFlt-1最初是从人脐带内皮细胞中纯化的，后来表明在体内被滋养层细胞产生。本文中所用的sFlt-1包括任何sFlt-1家族成员或同功型。在另外的实施方案中，sFlt-1还可以为由Flt-1受体的酶催化裂解得到的降解产物或片段，并保持sFlt-1的生物活性。在一个实施例中，从胎盘释放的特异性金属蛋白酶可以裂解Flt-1受体的细胞外功能域，将Flt-1的N-端部分释放到循环中。
“特异性地结合”意指识别和结合本发明多肽的化合物或抗体，但是基本上不识别和结合样品例如生物样品(天然地包括本发明的多肽)中的其它分子。在一个实施例中，特异性地结合sFlt-1的抗体不结合Flt-1。
“主体”意指哺乳动物包括但不限于人或非人类哺乳动物例如牛、马、犬、绵羊或猫。此定义包括怀孕的、产后的和非怀孕的哺乳动物。
“基本上一致的”意指不同处只是被保守氨基酸替代的氨基酸序列，例如用同一类中一个氨基酸替代另一个氨基酸(例如用缬氨酸替代甘氨酸、用精氨酸替代赖氨酸等)，或者在不破坏所述蛋白功能的氨基酸序列位置被一个或多个非保守氨基酸替代、缺失或插入。优选所述氨基酸序列与另一个氨基酸序列有至少70％、更优选至少约80％和最优选至少约90％同源性。确定一致性的方法在公共可获得计算机程序中可以得到。确定两个序列一致性的计算机程序方法包括但不限于GCG程序包(Devereux等，Nucleic Acids Research 12：387，1984)，BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul等，J.mol.Biol.215：403(1990)。众所周知的Smith Waterman算法也可以用于确定一致性。BLAST程序从NCBI和其它来源处是公共可获得的(BLAST Manual，Altschul等，NCBI NLM NIH，Be the sda，mD 20894；BLAST 2.0在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)。通过对各种的替代、缺失和其它修饰指定同源性程度这些软件程序将类似的序列匹配。保守的替代典型地包括在下列组内的替代：甘氨酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺酸、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、精氨酸；和苯丙氨酸、酪氨酸。
“先兆子痫的症状”意指下列任何症状：(1)在妊娠20周后心脏收缩期血压(BP)＞140mmHg和心脏舒张期BP＞90mmHg，(2)新近发作的蛋白尿(1+通过尿分析用浸渍片，在24小时收集的尿中蛋白＞300mg或单次随机尿样品中具有的蛋白/肌酸酐比率＞0.3)，和(3)产后12周高血压和蛋白尿消除。先兆子痫的症状还可包括肾功能障碍和肾小球内皮增生或肥大。“子痫的症状”意指由于怀孕或最近怀孕的影响任何下列症状的发展：惊厥发作、昏迷、血小板减少症、肝肿胀、肺肿胀和脑肿胀。
“治疗量”意指当施用给患有先兆子痫或子痫的患者时，足以导致本文所述的先兆子痫或子痫症状的定性或定量的减轻。“治疗量”还可以意指当施用给患有先兆子痫或子痫的患者时，足以导致通过本文所述的检验Flt-1表达水平的减少或VEGF或P1GF表达水平的增加。
“治疗”意指为预防的和/或治疗目的施用化合物或药物组合物。对于“治疗疾病”或用于“治疗性治疗”意指对已经患有疾病的主体施用治疗以改善主体的状况。优选所述主体被诊断为患有先兆子痫或子痫，基于如下所述任何特征症状或使用本文所述的诊断方法。对于“预防疾病”意指对于还没有患病，但是其易于患有或处于发展特定疾病危险中的主体的预防性的治疗。优选使用本文所述的诊断方法确定主体处于发展先兆子痫或子痫的危险中。因此，在权利要求和实施方案中，治疗是为治疗或预防的目的给哺乳动物施用。
“滋养层”意指覆盖胚泡的中外胚层细胞层，其侵蚀子宫粘膜，并通过它胚胎儿从母亲那接受营养；这些细胞有助于胎盘的形成。
“血管内皮生长因子(VEGF)”意指哺乳动物的生长因子，与在美国专利5,332,671；5,240,848；5,194,596；和Chamock-J ones等(Biol.Reproduction，48：1120-1128，1993)中定义的生长因子同源，并具有VEGF生物活性。VEGF作为糖基化的同型二聚体存在，包括至少四种不同的选择性剪接同功型。天然VEGF的生物活性包括促进血管内皮细胞或脐带静脉内皮细胞的选择性生长和诱导血管生成。本文中所用的VEGF包括任何VEGF家族成员或同功型(例如VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、VEGF189、VEGF165或VEGF121)。优选的VEGF为VEGF121或VEGF165同功型(Tischer等，J.Biol..Chem.266，11947-11954，1991；Neufed等Cancermetastasis15：153-158，1996)，其在美国专利6,447,768；5,219,739和5,194,596中描述，在此引入作为参考。还包括VEGF的突变形式例如KDR-选择性VEGF和在Gille等(J.Biol..Chem.276：3222-3230，2001)中描述的Flt-选择性VEGF。本文中所用的VEGF还包括任何修饰形式的VEGF例如那些在LeCouter等(Science 299：890-893，2003)中描述的。尽管优选人的VEGF，本发明不限制人形式的，可以包括其它动物形式的VEGF(例如小鼠、大鼠、狗或鸡)。
“载体”意指DNA分子，通常来自质粒或噬菌体，DNA片段可以被嵌入或克隆进入其中。重组载体将含有一个或多个独特限制位点，可以能够在限定的宿主或媒介组织中自动复制使得克隆序列可复制。载体含有启动子可操作地与基因或编码区连接，以致一旦转染入接受者细胞中则表达RNA。
根据下列优选实施方案和权利要求的描述，本发明的其它特征和优势会显而易见。
附图简述
图1是描述在先兆子痫中的sFlt-1mRNA和蛋白表达水平的放射自显影照片。图1A显示通过RNA印迹分析确定的来自三个患有先兆子痫(P1，P2，P3)的患者和三个血压正常分娩期的怀孕妇女(N1，N2，N3)胎盘sFlt-1mRNA的表达。较高的带(7.5kb)为全长flt-1mRNA，而较低更大量的带(3.4kb)为可择性剪接的sFlt-1mRNA。包括GAPDH作为对照，箭头显示为28S RNA。患者P1和P2患有严重先兆子痫，然而患者P3患有轻微的先兆子痫。图1B为显示在来自患有轻微的先兆子痫(轻微的PE)的患者、患有严重先兆子痫(严重PE)的患者和血压正常处于分娩期的怀孕妇女(正常)的血清中sFlt-1水平的图。通过ELISA测定sFlt-1的水平，使用商购获得的试剂盒(R&DSystems，minneapolis，MN)完成对sFlt-1的ELISA。包括由于其它原因早产分娩(早产)的患者作为另外的对照以消除孕龄特定的变化。受试的患者数显示于X轴的圆括号中。在分娩前(t＝0)和分娩48小时后(t＝48)收集样品。图1C为显示在分娩时间(t＝0)的抗血管生成指数比率(PAAI＝sFlt-1/(VEGF+P1GF))的图，通过ELISA测定在图1B中描述的所有的患者。
图2A-2F显示在先兆子痫中过量sFlt-1抗血管生成影响的显微照片。使用来自4个正常怀孕的对照和4个患有先兆子痫的患者的血清完成内皮管检验。显示了一个正常对照和一个患有先兆子痫的患者代表性试验。图2A、2B和2C显示使用来自正常患者的血清完成的检验，而图2D、2E和2F显示使用来自患有先兆子痫的患者的血清完成的检验。在图2A中，t＝0(来自正常处于分娩期的怀孕妇女的10％血清)；在图2B中，t＝48(来自正常怀孕妇女在分娩48小时后的10％血清)；在在图2C中，t＝0+外源性的sFlt-1(10ng/ml)；在图2D中，t＝0(来自分娩以前的患先兆子痫妇女的10％血清)；在图2E中，t＝48(来自患先兆子痫妇女在分娩48小时后10％血清)；和在图2F中，t＝0+外源性的VEGF(10ng/ml)+P1GF(10ng/ml)。对管检验定量，并将平均管长度+/-SEM显示在每版块底部的单元中。
图3A和3B为显示抑制VEGF和P1GF通过sFlt-1诱导肾小管血管舒张的图。图3A显示在三个不同的剂量下测定的大鼠肾细动脉对sFlt-1(S)、VEGF(V)、P1GF(P)松弛响应的增加。V+和P+表示在100ng/ml sFlt-1存在下单个的试剂的松弛响应。所有的试验在6个不同的分割大鼠肾小管上完成，数据显示为平均+/-SEM。*表示与单个的试剂单独比较统计学显著性，p＜0.01。图3B显示在生理剂量下松弛响应的增加：VEGF 100pg/ml(V)、P1GF500pg/ml(P)、sFlt-1 10ng/ml(S)、VEGF(100pg/ml)+P1GF 500pg/ml(V+P)或VEGF(100pg/ml)+P1GF 500pg/ml+sFlt-1 10ng/ml(V+P+S)。所有的试验在6个不同的分割大鼠肾微管上完成，数据显示为平均+/-SEM。*表示与V+P比较的统计学显著性，p＜0.05。
图4A和4B为显示肾小球内皮增生的sFlt-1诱导的图像。图4A为显示与对照比较在sFlt-1治疗的伴随扩大的血管小球和肿胀的胞浆的动物中毛细血管闭塞的苏木精和曙红(H&E)染色的显微照片。在sFlt-1治疗的动物中高碘酸希夫(PAS)染色显示伴随鼓泡胞浆的“肾小球内皮增生”。所有的浅色显微镜图片以60X拍摄，原始放大倍数。图4B为sFlt-1处理的血管小球的电子显微镜图，证明内皮毛细血管细胞细胞质的膨胀。对于纤维蛋白的免疫荧光(IF)图片在40X拍摄，EM图片在2400X拍摄，原始放大倍数。所有的图在相同的放大倍数复制。
图5A-5C为显示在先兆子痫发作前和之后测定的sFlt-1水平对孕龄的曲线图。图5A为显示对于血压正常的对照(带有开口三角形的轻浅的线)、先兆子痫前的病例(实心圆圈)和先兆子痫后的病例“终点”样品(实心方块)在分娩前4-5周孕龄窗口之内的以pg/ml计的平均血清浓度的曲线图。括号显示平均标准误差。星号显示在对数转换后在相同孕龄窗口之内相对于对照样品的显著差异：*p＜0.05、**p＜0.01、***p＜0.001。图5B为显示在先兆子痫前几周时间间隔之内对于在先兆子痫发作前和之后的病例以pg/ml计sFlt1平均血清浓度的曲线图。PE表示43个终点样品的算术平均值(在先兆子痫发作时或发作之后获取)。平均孕龄(天)在每个时间间隔下面的圆括号中显示。水平线显示在终点样品中的水平。垂直线划分先兆子痫之前≤5周的时期界线。图5C为显示在排除先兆子痫发作5周之内获取的样品后，对于血压正常的对照和先兆子痫之前病例以pg/ml计sFlt1平均血清浓度对孕龄窗口的曲线图。不存在显著差异。
图6A-6C为显示在先兆子痫之前和之后P1GF水平对孕龄的曲线图。图6A为显示在分娩前获取的所有样品中P1GF水平的曲线图。括号显示平均标准误差。星号显示在对数转换后在相同时间间隔之内相对于对照样品的显著差异：**p＜0.01、***p＜0.001。图6B为显示对于在先兆子痫前几周时间间隔之内在先兆子痫发作前和之后的病例以pg/ml计P1GF平均血清浓度的曲线图。PE表示43个终点样品的算术平均值(在先兆子痫发作时或发作之后获取)。平均孕龄(天)在每个时间间隔下面的圆括号中显示。水平线显示在终点样品中的水平。垂直线划分先兆子痫之前≤5周的时期界线。图6C为显示对于血压正常的对照和先兆子痫发作的病例以pg/ml计P1GF平均血清浓度对孕龄窗口的曲线图。
图7A和7B为显示sFlt-1和P1GF水平对先兆子痫状况和严重性的图。图7A为显示在对照和患有轻微先兆子痫、严重先兆子痫、发作＜37周的先兆子痫、带有小孕龄(SGA)婴儿的先兆子痫和发作＜34周的先兆子痫的病例(临床的疾病发作前)中在妊娠23-32周sFlt-1(黑色条)和P1GF(白色条)血清浓度算术平均值的图。样品数目被记录每个柱对之下。对孕龄和体重指数的调节导致小的变化，对显著性水平没有影响。图7B为显示在对照和患有轻微先兆子痫、严重先兆子痫、发作＜37周的先兆子痫和带有SGA婴儿的先兆子痫的病例(临床的疾病发作前)中在妊娠33-41周sFlt-1(黑色条)和P1GF(白色条)血清浓度算术平均值的图。样品数目记录在每个柱对之下。对孕龄和体重指数的调节导致小的变化。
图8是显示在从正常的和先兆子痫患者分离的PBMC中的flt、sFlt-1和相关变种或片段表达的放射自显影照片。使用识别Flt-1蛋白N-端的抗体通过蛋白印迹法分析蛋白裂解物。
图9A至9D为显示尿中P1GF浓度对孕龄时间间隔的图。图9A为显示根据孕龄在临床先兆子痫发作前和之后平均P1GF浓度的图。I条表示标准误差。图9B为显示在临床先兆子痫发作前和之后每mg肌酸酐表达的平均P1GF pg数的图。I条表示标准误差。图9C为显示只使用第一早晨尿样品在临床先兆子痫发作前和之后平均P1GF浓度的图。I条表示标准误差。图9D为显示只使用随机尿样品在临床先兆子痫发作前和之后平均P1GF浓度的图。I条表示标准误差。
图10为显示根据先兆子痫状况和严重性在肌酸酐正常化之前和之后的P1GF平均浓度的图。在对照和后来患有临床先兆子痫(PE)的妇女中，根据其患有轻微的先兆子痫、严重先兆子痫、在小于37周妊娠发作的先兆子痫、先兆子痫和小于胎龄婴儿(SGA)或在小于34周妊娠发作的先兆子痫，在妊娠21-32周，显示P1GF浓度和每mg肌酸酐的pg数。样品来自在临床的疾病发作前获取发展先兆子痫的妇女。给出的P值用于与来自对照的样品比较。I条表示SE。
图11为显示在单个的妇女内胎盘生长因子浓度对孕龄的纵向图。
图12A和12B为显示在21-32周血清中尿中P1GF浓度和sFlt-1对P1GF的比率对妊娠天数的分散图。数值是从成对的尿和血清样品中获取的，样品来自20个在小于37周妊娠先兆子痫发展之前的妇女和69个血压正常的对照。图12A显示尿中P1GF浓度。图12B显示sFlt1对P1GF的血清比率。
图13为显示在有婴儿但是不是小于胎龄(SGA)出生的血压正常的妇女、有SGA婴儿的血压正常的妇女、患有妊娠高血压的妇女和在妊娠37周之前发展先兆子痫的妇女中胎盘生长因子(P1GF)法平均尿浓度的图。在其婴儿不是小于胎龄出生的血压正常的妇女(NT-SGA)、有SGA婴儿的血压正常的妇女(NT+SGA)、随后发展的妊娠高血压的妇女(GH)和在妊娠37周之前随后发展先兆子痫的妇女(PE＜37wks)中在妊娠21-32周时显示以pg/ml计的尿中P1GF浓度和每mg肌酸酐的pg数。来自妊娠高血压或先兆子痫发展妇女的样品在临床的疾病发作前获取。在收集的样品中平均孕龄与所有组中的类似。N表示样品数。给出的P值用于与来自对照(NT-SGA)的样品比较。I条表示SE。
详细描述
我们已经发现在来自先兆子痫妇女的血清样品中sFlt-1水平是升高的。sFlt-1与VEGF和P1GF高亲和性地结合，并且阻断这些生长因子的分裂素的和血管生成活性。因此，sFlt-1是对先兆子痫极好的诊断标志物，且VEGF和P1GF可以用于治疗先兆子痫。我们还发现尿中的P1GF水平可以被用作诊断工具以检测先兆子痫或子痫，或其易患病的体质。游离形式的P1GF具有平均分子量约30kDa，小得足以从肾中滤过，释放到尿中。P1GF，当与sFlt-1复合时，具有更大的分子量，因此不能被释放到尿中。当sFlt-1的水平增加时，sFlt-1可以与P1GF复合，因此减少释放到尿中的游离P1GF的水平。结果，对游离P1GF水平的尿分析可以被用于诊断先兆子痫或子痫或具有患该疾病的危险的患者。
而且，我们已经发现干涉sFlt-1与纯化的VEGF或P1GF结合的治疗剂，或增加VEGF或P1GF生物活性水平的物质，可以被用于治疗或预防主体的先兆子痫或子痫。这样的物质包括但不限于sFlt-1抗体、降低sFlt-1水平的反义寡核苷或RNAi、增加VEGF或P1GF水平的化合物、和与Flt-1结合并阻断生长因子结合位点的小分子。本发明特征还在于用于测定生长因子水平的方法；该方法可以被用作先兆子痫或增加发展先兆子痫或子痫危险的早期检测的诊断工具。
尽管本文提出的详细描述特定地提及sFlt-1、VEGF或P1GF，对本领域技术人员清楚地是详细描述还可以应用于sFlt-1、VEGF或P1GF家族成员、同功型和/或变种，以及应用于显示与sFlt-1结合的生长因子。下列实施例目的是举例说明本发明，不应解释为限制。
实施例1.在患有先兆子痫的怀孕妇女中sFlt-1mRNA和蛋白水平的增加
在尝试鉴定新的在先兆子痫中发挥病理学作用的分泌因子的过程中，我们使用Affymetrix U95A微分析芯片完成来自患有和没有先兆子痫的妇女胎盘组织的基因表达分布图。我们发现患有先兆子痫妇女的sFlt-1基因被正调节。
为了确证在先兆子痫中sFlt-1的正调节，我们在先兆子痫怀孕妇女中完成RNA印迹以分析胎盘sFlt-1mRNA水平(图1A)，以及ELISA检验以测定血清Flt-1蛋白的水平(图1B)，与血压正常的怀孕妇女进行比较。先兆子痫定义为：(1)在妊娠20周后心脏收缩期血压(BP)＞140mmHg和心脏舒张期BP＞90mmHg，(2)新近发作的蛋白尿(1+通过尿分析用浸渍片，在24小时收集的尿中蛋白＞300mg或随机尿样品中具有的蛋白/肌酸酐比率＞0.3)，和(3)产后12周高血压和蛋白尿消除。排除患有潜伏高血压、蛋白尿或肾疾病的患者。基于存在或不存在肾病范围的蛋白尿(24小时收集的尿中蛋白＞3g或尿中蛋白/肌酸酐比率大于3.0)将患者分为轻微的和严重先兆子痫。在轻微的先兆子痫组平均尿蛋白/肌酸酐比率为0.94+/-0.2，在严重先兆子痫组为7.8+/-2.1。各种组的平均孕龄如下：正常的38.8+/-0.2周、轻微的先兆子痫34+/-1.2周、严重先兆子痫31.3+/-0.6周和早产的29.5+/-2.0周。在分娩后立刻获取胎盘样品。从每个胎盘中获取4个随机样品，稳定溶液后放置在RNA中(Ambion，Austin，TX)中，在-70℃保存。使用Qiagen RNAeasy Maxi K it(Qiagen，Valencia，CA)完成RNA的分离。
我们检测了在先兆子痫怀孕妇女中胎盘sFlt-1mRNA和母亲血清sFlt-1蛋白的增加，与血压正常的怀孕妇女进行了比较。与正常的对照怀孕妇女比较，在严重先兆子痫患者中sFlt-1的平均血清水平几乎高出4倍。为排除这个由于先兆子痫病例的较早孕龄引起的可能性，我们还测定了由于其它原因(孕龄23-36周)早产分娩的妊娠相匹配的血压正常的妇女sFlt-1的水平，我们发现在这组中与血压正常的条件怀孕比较没有显著差异。用于RNA印迹的探针通过PCR获得，包括在来自pUC 118人flt-1 cDNA和GAPDH cDNA(用作标准化对照)的编码区中的500bp的片段。
在正常的怀孕中，在由胎盘分泌的前-血管生成因子和抗-血管生成因子之间存在平衡，其对于胎盘充分发育是必需的。我们假定在先兆子痫中，sFlt-1的生成增加和VEGF和P1GF生成降低使平衡迁移有利于抗血管生成。为说明净的抗血管生成活性，我们测定了VEGF和P1GF血清水平，发现与正常的对照患者比较患有先兆子痫的患者P1GF和VEGF血清水平较低(平均P1GF，235.3+/-45.3pg/ml对464+/-116.6pg/ml)，其已经在(Tidwell等人.，Ain.J.Obstet.Gynecol.，184：1267-1272，2001)中描述。当我们将sFlt-1、VEGF和P1GF水平整合成抗血管生成指数或PAAI时，其为净的抗血管生成活性的指示，我们发现我们可以清楚地将正常患者与先兆子痫患者分开，且PAAI似乎与先兆子痫的严重性相关(图1C)。这个PAAI可以被用作诊断工具用于在怀孕妇女中检测先兆子痫。
实施例2.来自患有先兆子痫的妇女血清在体外内皮管检验中抑制血管生成
我们假定在患有先兆子痫的患者中过量的循环sFlt-1会导致内皮功能障碍和导致抗血管生成状态。为说明此点，我们使用内皮管检验作为血管生成的体外模型。将生长因子减少的Matrigel(7mg/mL，Collaborative Bio medical Products，Bedford，MA)放入预先冷却的48-孔细胞培养板的孔(100μl/孔)中，在37℃培养25-30分钟使其聚合。将在3-5个通道中的人脐静脉内皮细胞(30,000+300μl不含血清的内皮基础介质，Clonetics，Walkersville，MD)用10％患者血清处理，放入Matrigel覆盖的孔中，在37℃培养12-16小时。然后通过反相对比显微镜4X(Nikon Corporation，Tokyo，Japan)评价管的形成，使用Simple PCI图像分析软件定量分析(管面积和总长度)。
调节管形成检验的条件使得正常的人脐静脉内皮细胞只有在外源性的生长因子例如VEGF存在下形成管。在这些条件下，我们发现尽管来自血压正常的妇女血清诱导内皮细胞形成规则的类管结构，来自患有先兆子痫妇女的血清抑制管的形成(图2)。显著地，在产后48小时这种抗血管生成影响消失，表示来自先兆子痫患者血清的所述管抑制可能归因于胎盘释放的循环因子。当将sFlt-1以与患有先兆子痫患者发现的类似的剂量加入到血压正常的血清中时，不发生管形成，模拟了来自先兆子痫妇女血清的影响。当将外源性的VEGF和P1GF加入到使用先兆子痫血清的检验中时，管形成恢复(图2)。重组人VEGF、人P1GF和人Flt-1Fc用于这些检验。从这些结果表示先兆子痫血清的抗血管生成性质是由于内源性的sFlt-1对抗VEGF和P1GF。从这些结果还表示加入纯化的VEGF和/或P1GF可以反转或减轻先兆子痫病况，可以被用于治疗。
实施例3.sFIt-1抑制VEGF和PIGF诱导的肾小管血管舒张
使用体外微血管活性试验确定sFlt-1在血管收缩中的原因性作用。使用大鼠肾微血管完成前面所述的微血管活性试验(Sato等.，J.Surg.Res.，90：138-143，2000)。使用10x至60x解剖显微镜(OlympusOptical，Tokyo，Japan)将肾动脉微血管(70-170μm内径)从大鼠肾分割。将微血管放入分离的微血管小室，插入测定直径30-60μm的双重玻璃微吸管，用10-0尼龙单丝缝合线(Ethicon，Somerville，NJ)固定。将升温至37℃充氧的(95％氧和5％二氧化碳)Krebs缓冲溶液连续循环通过管小室，储液池中含有总共100ml溶液。使用填充有Krebs缓冲溶液的滴管压力计在无流动状态将管加压至40mmHg。使用连接于摄像机的反转显微镜(40x至200x；Olympus CK2，OlympusOptical)，将管的图像投射到黑白色电视监视器上。电子尺度分析仪(Living System Instrumentation，Burlington，VT)用于测定内腔直径。用条带图记录器(Graphtec，Irvine，CA)记录测定。在任何干涉以前将血管在微血管小室浸泡至少30分钟。在所有的试验组，在扩张压力40mmHg下使用U46619(凝血烷激动剂)将微血管预先收缩至其基准直径的40-60％，之后检查肾微血管的松弛响应。一旦达到稳定状态，检查对各种试剂例如VEGF、P1GF和sFlt-1的响应。重组大鼠VEGF、小鼠P1GF和小鼠Flt-lFc用于这些检验。所有药物都在腔外应用。当响应稳定(通常在施用药物后2-3分钟)后完成测定。对每个血管完成1至4个干涉。将血管用Krebs缓冲溶液洗涤，在各次干涉之间允许其在无药物Krebs缓冲溶液中平衡20-30分钟。
我们发现sFlt-1单独不导致显著的血管收缩，但是在被VEGF或P1GF诱导的血管舒张中(图3A)阻断剂量响应性的增加。而且，我们发现VEGF和P1GF，在怀孕中可见的生理学水平下，诱导显著的剂量依赖性小动脉松弛，通过加入10ng/ml sFlt-1这种影响被阻断，该浓度为在患有严重先兆子痫的妇女中观察到的浓度(图3B)。从这种结果表示在患有先兆子痫患者循环中的sFlt-1可能对抗血管舒张，因此促进了高血压。这个结果支持如下结论：sFlt-1对先兆子痫的许多临床的和病理的症状包括高血压负责。通过使用靶向抗体抑制sFlt-1例如能够反转在先兆子痫妇女中蛋白的影响，因此sFlt-1抑制剂可以潜在用作治疗剂。
实施例4.sFlt-1在先兆子痫动物模型中的作用
基于上述结果，我们假定在动物模型中加入外源性的sFlt-1会产生高血压和蛋白尿。表达sF1t-1的腺病毒已经被证明产生持续的全身Flt-1水平，伴随有显著的抗肿瘤活性(Kuo等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，98：4605-4610，2001)。将这种重组腺病毒编码鼠科sFlt-1注射到怀孕8-9天的Sprague-Dawley大鼠尾静脉中。使用相等剂量的腺病毒编码鼠科动物的Fc和sFlkl-Fc(小鼠VEGF受体1Flkl外功能域和Fc蛋白的融合蛋白)作为对照。Flkl已经被证明结合VEGF，但是不结合P1GF。因此，选择sFlk-1Fc作为对照以帮助区分sFlt1的抗VEGF和抗P1GF活性。
对怀孕的和非怀孕的Sprague-Dawley大鼠两者都通过尾静脉注射1×109pfu的Ad Fc、Ad sFlt-1或Ad sFlk-lFc。这些腺病毒以前曾被描述过(Kuo等，如上)，由Harvard Vector Core Laboratory产生。对怀孕的大鼠在怀孕8-9天(第二个三个月早期)注射腺病毒，在怀孕16-17天(第三个三个月早期)测定血压。在非怀孕的动物中，在腺病毒注射8天后测定BP。在用戊巴比妥钠(60mg/kg，腹腔内注射)麻醉后测定大鼠BP。分离颈动脉，插入3-Fr高精度微尖导管，与压力转换器(Millar Instruments，Houston，TX)连接。将Millar Mikro-Tip导管插进动脉以记录血压。平均间隔10分钟通过条带图记录器(model56-1X 40-006158，Gould Instrument Systems，Cleveland，OH)记录血压和心率。然后在安乐死之前获取血、组织和尿样品。通过标准浸渍片测定尿的白蛋白，通过竞争性酶联免疫检验(ELISA)定量，如同在别处所描述的(Cohen等，KidneyIntl.，45：1673-1679，1994)。通过苦味酸比色法试剂盒(Sigma，St.Louis，MO)测定尿的肌酸酐。我们在怀孕第三个三个月早期测定动脉内血压以模拟先兆子痫的天然病理学。这些试验还在非怀孕的雌性Sprague-Dawley大鼠中完成以确定sFlt-1的影响是直接或是间接通过它对胎盘的影响。对各种的sFlt-1治疗动物在BP测定当天，Flt-1的本身水平通过蛋白印迹分析血压测定当天范围为25-350ng/mL。在不同的试验组的血压和蛋白尿显示于表1。
表1.大鼠的血压和蛋白尿
    N     MAP(mmHg)    U alb∶cr比率
Fc(P)sFlt-1(P)sFlk-1Fc(P)     544     75.6±11.1109.0±19.3*72.8±14.7    62±216923±658*50±32
Fc(NP)sFlt-1(NP)sFlk-1Fc(NP)     564     89.3±5.7117.9±12.9*137.3±2.3*     138±7812947±2776*2269±669*
对怀孕的(P)和非怀孕的(NP)大鼠施用腺病毒表达的Fc(对照)、sFlt-1或sFlk-1Fc蛋白。平均动脉血压(MAP＝心脏舒张期+1/3以mmHg计的脉冲压力)±S.E.M和尿白蛋白：Cr比率(每g肌酸酐mg白蛋白)±S.E.M在8天后测定，对应于怀孕的大鼠是第三个三个月早期。N＝每个试验组的动物数。*表示与对照组(Fc)比较统计学显著性，p＜0.01。
与Fc对照比较，用sFlt-1治疗的怀孕大鼠有显著的高血压和肾病范围的白蛋白。施用sFlt1的非怀孕大鼠也发展高血压和蛋白尿。显著地。sFlk-Fc治疗的非怀孕大鼠发展高血压和蛋白尿，sFlk-Fc治疗的怀 孕大鼠却没有。因此，在怀孕中单独对VEGF的对抗不足以产生先兆子痫，可能由于存在高水平的P1GF。在非怀孕的状态，其中P1GF事实上不存在，单独对抗VEGF足以破坏促/抗血管生成的平衡，产生与先兆子痫相关类似的那些肾病理学。各种染色技术用于检查在所有sFlt-1治疗的大鼠(图4)中观察到的肾损伤。将从大鼠上切割下来的肾固定在Bouin溶液中、分割并用H&E和PAS染色。为了电子显微照相，将肾组织固定在戊二醛中，包埋在合成树脂-环氧树脂的混合物中，切割极薄的肾切片(1μm)，用甲苯蓝染色，使用Zeiss EM 10在各种的放大倍数评价。对于在肾小球之内的纤维蛋白沉淀物的免疫荧光法使用多克隆抗纤维蛋白抗体(ICN，Switzerland)完成。在sFlt-1治疗的大鼠中球形的和分散的肾小球内皮增生是普遍观察到的肾损伤。我们检测了由于内皮毛细血管细胞膨胀和肥大，伴随毛细血管回路阻塞的肾小球扩大。在肾小球上皮细胞中看到许多明显的蛋白再吸收小滴。没有观察到部分肾小球硬化症。看到在肾小球内的分离的“双轮廓线”和纤维蛋白的病灶沉淀物。这种在不存在显著的肾小球膜的插入下纤维蛋白沉淀物的发现与曾经描述的典型的人疾病临产前阶段类似(Kincaid-Smith，Am.J.Kidley Dis.，17：144-148，1991)。对于纤维蛋白的免疫荧光显示纤维蛋白沉淀物的病灶在sFlt-1治疗动物而不是Fc治疗动物的肾小球之内。SFlk1治疗非怀孕的大鼠发展相同损伤。事实上，当sFlk1以与sFlt-1相同的水平使用时，肾损伤在非怀孕的大鼠中更严重，因为有更少的循环促血管生成分子要sFlt-1去拮抗。从这些结果表示sFlt-1的水平升高可以对先兆子痫相关的肾小球内皮增生负责，但是这种影响不依赖胎盘，因为肾小球变化在非怀孕的以及怀孕的大鼠中都被检测到。从这些结果还表示在先兆子痫的病理学中对抗VEGF和P1GF两者的重要性，由于高血压和蛋白尿发生在sFlk-1治疗的非怀孕小鼠，而不是sFlk-1治疗的怀孕小鼠，其中P1GF水平高。
本文创造的动物模型可以被用作试验模型，以测试新的治疗化合物。使用这种动物模型可以研究潜在治疗化合物的疗效以及药理和毒性。
实施例5.sFlt-1在子痫动物模型的效果
对怀孕的大鼠在它们怀孕的第二个三个月早期注射外源性的sFlt-1。然后它们的第三个三个月早期对这些大鼠监测和测试子痫的发展。用于检测子痫的测试可以包括大鼠大脑发展肿胀的MRI、大鼠大脑发展惊厥发作的EEG和大鼠大脑的组织学以使用特定的内皮标志物确定沿着血脑屏障和脉络丛的内皮损伤的发生。
本文创造的动物模型可以被用作试验模型以测试新的治疗化合物。使用这种动物模型可以研究潜在治疗化合物的疗效以及药理和毒性。
实施例6：在尿中PIGF/肌酸酐比率是先兆子痫的诊断指标
从10个在妊娠16周的妇女中获取尿样品(5个正常的、4个轻微的先兆子痫和一个严重先兆子痫)。这些样品由Dr.Ravi Thadhani在Massachusetts General Hospital提供。对于正常的怀孕妇女平均尿中游离PIGF/肌酸酐比率(每mg肌酸酐pg P1GF)为78+/-10.7，对于4个轻微的先兆子痫患者为33+/-5.0，对于一个严重先兆子痫患者为17。因此，在尿中P1GF对肌酸酐比率的改变是有用的，可作为患者先兆子痫的诊断指示。
实施例7：在对照和先兆子痫怀孕妇女中尿中P1GF水平测定
使用存档的尿样品测定在对照怀孕妇女和先兆子痫妇女的尿中P1GF，存档的尿样品来自与在NIH的Dr.Ric hard Levine合作的(表2)的CPEP试验(参见实施例8)。下表显示在怀孕中期(22-30周)和怀孕晚期(＞30周)期间发展先兆子痫的患者尿中P1GF显著降低，但是怀孕早期(＜20周)的没有。所有的尿样品在先兆子痫临床症状出现以前获取。
表2.在先兆子痫患者相对于对照怀孕的患者中以pg/ml计尿中P1GF水平
    对照(n＝118)   PE(n＝120)
怀孕早期     39.80   42.28
怀孕中期     193.11   98.66(P＜0.0001)
怀孕晚期     107.82   62.05(P＝0.0213)
实施例8：sFlt-1和PIGF蛋白水平作为妇女先兆子痫和子痫的诊断指示
对于这项研究，我们与在NIH的Dr.Ric hard Levine合作，使用来自Calcium的用于先兆子痫预防试验的存档样品，以便分析在血压正常的和先兆子痫怀孕中循环的sFlt-1、游离P1GF和游离VEGF的妊娠模式。为了先兆子痫预防的Calcium或CPEP为在1992-1995年期间进行的随机、双盲的临床试验，以评价每天补充2克元素钙或安慰剂对先兆子痫的发病率和严重性的影响(Levine等人，N.Engl.J.Med.337：69-76，1997；Levine等人，Control Clin.Trials 17：442-469，1996)。在五个参与的美国医疗中心，登记健康的未经产的单胎妊娠的孕龄13至21周的妇女，使用共同的方案和相同的数据采集表格追踪直至产后24小时。在登记人员中，所有CPEP参与者具有血压＜135/85mmHg，没有肾功能障碍或蛋白尿。孕龄通过超声检查确定。在登记前、在试验中(13-21周)、在26-29周、在36周获取来自参与者的血清样品，如果此时仍然怀孕，此时注明高血压或蛋白尿。“终点样品”(活性PE)为在先兆子痫症状和症兆发生时或在之后获取的样品，但是在生产和分娩之前，如同在别处所述(Levine等，1996，如上)。来自CPEP试验的存档的血液样品通过与在NIH的Dr.Ric hardLevine合作获取。
参与者
我们选择有完整结果信息、在＜22周获取的血清样品和活胎儿产的男婴的主体。在4,589个CPEP参与者中，我们排除253个失去联系的，21个怀孕在20周以前终止的，13个丢失母亲或围产期结果数据的，4个没有抽烟历史的，9个高血压没有被计划评述小组确证的，32个死产的，剩下4,257个具有足够的信息和活胎儿产的妇女。在这些人中2,156个生育男婴。在排除一个婴儿染色体异常的妇女后，381个患有妊娠高血压，43个没有基础血清样品，剩余1,731个妇女。在这些人中，175个发展先兆子痫和1,556个在整个怀孕期间保持为血压正常的。
由于补钙对先兆子痫的危险和严重性没有影响，且与促和抗血管生成分子的浓度无关，病例和对照的选择没有考虑CPEP治疗。对于每个先兆子痫病例选择一个血压正常的对照，匹配登记人员位置、在第一次血清样品采集时(在一周内)的孕龄在-70℃冷冻储存时间(在12月之内)。从分娩(如下表3)前获取的所有657个血清样品中随机选择120个匹配的对(“病例”和“对照”)用于分析。在第一次血清样品的收集中对于病例组和对照组的平均孕龄分别为112.8和113.6天；平均冷冻储存时间为9.35年和9.39年。
表3.在CPEP登记人员和她们新生婴儿中的病例和对照的特征
特征   病例(n＝120)     对照(n＝118)
年龄(年)   20.8±4.5     20.0±3.4
体重指数   27.3±6.8     25.0±6.1**
心脏收缩期血压(mmHg)   109.0±9.0     106.0±9.0
心脏舒张期血压(mmHg)   62.0±8.0     59.0±7.0
分娩时的孕龄(周)   38.1±2.6     38.9±2.5*
当前的吸烟者[n(％)]   9(7.5)     13(11.0)
曾经结婚[n(％)]   25(20.8)     22(18.6)
人种/民族*
白色，非西班牙的[n(％)]   24(20.0)     33(28.0)
白色，西班牙的[n(％)]   21(17.5)     14(11.9)
非洲美国人[n(％)]   69(57.5)     68(57.6)
其它，未知[n(％)]   6(5.0)     3(2.5)
出生体重(g)   3100±796     3247 596
分娩＜37周[n(％)]   26(21.7)     9(7.6)§
小于胎龄儿(＜第10个百分位数)[n(％)]   18(15.0)     4(3.4)§
——
平均±标准偏差，除非另外指明。
P＝0.03  **P＝0.007  P＝0.001  P＝0.006  §P＝0.002
·人种或民族为自我报告的。
对于这项研究，高血压定义为在分开4-168小时的两个时机的心脏舒张期血压至少90mmHg。严重高血压定义为在分开4-168小时的两个时机的心脏舒张期血压至少110mmHg，或者在一个时机，如果该妇女接受过抗高血压治疗。蛋白尿定义为在24小时收集的尿中含300mg或更多蛋白，在分开4-168小时的两个随机尿样品中通过浸渍片测定含有至少1+蛋白，单次尿样品中蛋白/肌酸酐比率至少0.35，或通过浸渍片测定单次随机尿样品含有至少2+蛋白。严重蛋白尿诊断为24-小时收集的尿样品含有至少3.5g蛋白或两个随机尿样品通过浸渍片测定至少3+蛋白。先兆子痫定义为高血压和蛋白尿彼此在7天之内发生；严重先兆子痫定义为伴随严重高血压、严重蛋白尿、HELLP综合征(溶血、肝酶升高、低血小板)的先兆子痫或子痫。先兆子痫的起始为导致诊断为先兆子痫的检测到第一次升高的血压或在尿样品中的蛋白尿的时间。
小于胎龄(SGA)定义为出生体重低于根据美国以人种、经产状况和婴儿性别对于孕龄分列的出生体重表的孕龄的第10个百分位数(Zhang和Bowes 1995，如上)。
方法
检验在Beth Israel Deaconess Medical Center由实验室人员完成，该实验室人员对患者的诊断和其它相关临床信息均不知情。为了分析将样品随机排序。按照用户说明书使用从R&D Systems(Minneapolis，MN)购买的试剂盒，完成对于人sFlt-1、游离P1GF和游离VEGF酶联免疫吸附分析(ELISA)。将保存在-70℃的等份血清样品解冻至室温，用BSA/Tris-缓冲盐水稀释，在用导向对抗sFlt-1、P1GF或VEGF的捕获抗体预先覆盖的96-孔板中培养2小时。然后将孔洗涤3次，与含有过氧化氢和四甲基联苯胺的底物溶液培养20分钟，用2N硫酸淬灭反应。在450nm(波长校正550nm)测定确定光密度。所有的检验重复进行。使用来自各自重组蛋白已知浓度的标准曲线计算蛋白浓度。如果在重复测定之间的差异超过25％，则将重复检验，弃去最初结果。检验对sFlt1、P1GF和VEGF的敏感性分别为5、7和5pg/ml，变量的相互检验系数和内检验系数对sFlt1为7.6％和3.3％，对P1GF为11.2％和5.4％，对VEGF为7.3％和5.4％。
统计学分析
在母亲或婴儿特征分析中使用卡方检验和t检验以分别比较绝对或连续变量。尽管在文本和图中给出了浓度的算术平均值值，除非另外指明，否则在对数转换后进行统计学检验。对对数转化浓度使用逻辑回归完成调整。
结果
在120个病例中，80个发展了轻微的先兆子痫，40个发展了严重的先兆子痫，包括3个HELLP综合征和3个子痫。病例患者比对照患者更矮，具有更高的体重指数和更高的基础血压(表2)。另外，大部分的病例患者的怀孕并发了早产分娩或小于胎龄(SGA)婴儿。病例患者对研究平均贡献2.9个血清样品；对照为2.6个样品。
我们首先确证与来自CPEP研究组的妊娠上匹配的对照比较，患有先兆子痫的患者在疾病活性时间sFlt-1、P1GF和VEGF被改变。在23对孕龄相匹配的病例和对照中，在确立临床先兆子痫的时间抽取的样品(终点样品)与孕龄的对照比较，具有显著升高的sFlt-1水平、降低的P1GF水平和降低的VEGF水平(4382对1643pg/ml sFlt1、P＜0.0001；137对669pg/ml P1GF，p＜0.0001；和6.41对13.86pg/mlVEGF，p＝0.06)，与以前发表的报导类似(Maynard等，J.Clin.Invest.111：649-658，2003)。
为了评价sFlt-1、P1GF和VEGF水平的妊娠模式，我们测定了在各种孕龄窗口获取的病例患者和对照患者的血清样品中sFlt-1、P1GF和VEGF的循环浓度。对于120个先兆子痫和120个对照妇女sFlt-1蛋白的妊娠模式在图5A中显示。在对照患者中sFlt-1的水平直至33-36周保持不变，直到分娩每周升高约145pg/ml。在病例患者中出现临床症状之前，在21-24周sFlt-1开始升高，检验在29-32周检验(图5A)。总之，在妊娠中期病例和对照患者之间在临床症状开始出现之前测定的差异为17％(p＜0.05)。与患病前抽取的样品比较终点样品显著升高。为了评价在临床疾病发作以前sFlt-1升高的机制，我们绘制了所有的先兆子痫患者sFlt-1浓度对先兆子痫发作以前周数的图(图5B)。来自病例患者的平均sFlt-1浓度对先兆子痫发作以前完整周数绘图。在先兆子痫前5周开始，sFlt-1浓度基本上升高直至疾病发作以前1周，此时它们达到在终点样品中观察到的浓度。在先兆子痫发生之前的4、3、2和1周sFlt-1的增加在平均孕龄中有很小变化，不能用第三个三个月晚期伴随孕龄的增加而增加来解释。在先兆子痫之前的8-6至5周sFlt-1增加962pg/ml，同时平均孕龄升高31天。大约三分之一这种sFlt-1的增加不能归结为孕龄增加。在去除先兆子痫发作前＜5周获取的样品后，当sFlt-1对在对照和病例中的孕龄绘图时，没有观察到实质上的差异(图5C)。从这些数据表示在先兆子痫发作以前病例患者中sFlt-1浓度更高是由于在临床疾病发作前5周之内sFlt-1的急性升高。
然后我们绘制了在相同患者组中P1GF蛋白的妊娠模式，在图6A中显示。在第一个两个三个月期间对照P1GF蛋白浓度升高，峰值在29-32周，在妊娠晚期降低。在病例患者中，先兆子痫之前，P1GF蛋白遵循类似的妊娠模式，但是比来自13-16周的对照显著更低。总之，在妊娠中期在临床症状发作前测定的病例患者和对照之间P1GF的差异为35％(p＜0.0001)。描述了在先兆子痫发作以前病例的P1GF水平对先兆子痫之前的周数的图(图6B)，以及描述了去除先兆子痫之前＜5周样品后对孕龄的图(图6C)。在先兆子痫发作以前1周，浓度达到先兆子痫发作之后观察到的值(图6B)。与对照比较，来自病例患者的P1GF水平在离分娩远期时中等程度减少，在分娩之前5和3周基本上更多的减少。来自对照患者的浓度从分娩之前的17-15周的3周保持高浓度，然后显著降低。排除先兆子痫之前≤5周获取的样品后显示P1GF水平的图表明在妊娠29-32周病例相对于对照降低更小，且在获取自33-36周所有的病例患者样品中没有降低(图6C)。由此表示在疾病以前数周中P1GF浓度的降低是造成在疾病发作时(或在图6A显示的终点样品)标出的P1GF显著低水平的原因。
整个怀孕期间VEGF浓度非常低，在先兆子痫之前对照和病例是类似的，除了在37-41周病例患者的显著降低。排除先兆子痫之前5周获取的样品在23-32周在病例中平均VEGF浓度与对照没有显著的不同(11.6对12.8pg/ml)，然而在包括分娩之前≤5周的样品情况下在病例中的浓度有显著的不同(5.1对12.8pg/ml、P＜0.01)。在33-41周病例在先兆子痫之前＞5或≤5周VEGF浓度比对照分别更高或更低(11.2pg/ml和8.3对9.7pg/ml)，尽管这些差异的不显著的。
图7描述在23-32周(图7A)和33-41周(图7B)的sFlt-1和P1GF对先兆子痫状况和严重性。该图显示先兆子痫发作前sFlt-1的增加和P1GF降低与疾病严重性、发作时间和出现SGA婴儿相关。在23-32周，先兆子痫发作前在具有SGA婴儿的病例患者中的sFlt-1和P1GF，分别比在具有SGA婴儿的对照患者中相应的浓度显著更高或更低。而且，与早产分娩的对照患者比较，早产分娩的病例患者具有更高的sFlt-1和显著更低的P1GF。
为了确定在先兆子痫的临床症兆以前sFlt-1或P1GF的浓度是否与该病症的危险性相关，我们计算了对于sFlt-1和P1GF对照值的每个四分位数先兆子痫的优势比，分别与最低或最高四分位数比较(表4)。我们还按照如下所述检查了对于所有其它的四分位数，极端四分位数的先兆子痫危险。对于在第二个和第三个三个月早期获取的样品，P1GF的最低四分位数与增加的早产(＜37周妊娠)先兆子痫(对于13-20周样品OR 7.4，95％CI 1.8至30.2；对于21-32周样品OR7.9，95％CI2.9至21.5)危险相关。但是，在最低四分位数中的P1GF水平不是正常分娩(≥37周)先兆子痫的显著的预测指示物。对于sFlt-1仅仅在较接近疾病的发作时观察到与先兆子痫相关。在妊娠21至32周之间(但不是更早)在最高的四分位数中sFlt-1水平可预测早产先兆子痫(OR 5.1，95％CI 2.0至13.0)，在33至41周之间(但不是更早)在最高的四分位数中的sFlt-1水平可预测正常分娩先兆子痫(OR 6.0、95％CI 2.9至12.5)。这与图5B是一致的，其表明sFlt-1的升高主要发生在临床疾病发作5周之内。VEGF的最低四分位数不预测先兆子痫。
表4.在临床症兆之前在13-20、21-32和33-41周妊娠对照中对于总sFlt-1和游离P1GF的四分位数的在<37和>37周先兆子痫的优势比(OR)
sFlt-1(pg/ml)     对照N       PE＜37周         PE≥37周  P1GF(pg/ml)     对照N        PE＜37周        PE≥37周
  N   OR*   N   OR*   N  OR* N  OR*
13-20周
Q4：＞1047     25   6   1.3(0.4-5.0)   20   1.5(0.6-3.7)   Q4：＞307     25   4  1.0参考 4  1.0参考
Q3：＞698-1047     25   8   2.2(0.6-7.8)   23   1.9(0.8-4.5)   Q3：＞160-307     25   2  0.6(0.1-3.5) 22  5.6(1.7-19.0)
Q2：＞531-698     25   4   0.5(0.1-2.3)   16   1.1(0.4-2.7)   Q2：＞87-160     25   6  1.9(0.4-8.2) 26  6.4(1.9-22.1)
Q1：≤531     25   6   1.0参考   16   1.0参考   Q1：≤87     25   12  9.6(1.6-57.6) 23  6.7(1.6-27.5)
21-32周
Q4：＞1131     25  16   4.7(1.3-16.6)   18   1.7(0.7-4.4)   Q4：＞1021     25   1  1.0参考 14  1.0参考
Q3：＞743-1131     26   5   1.4(0.3-6.0)   21   1.7(0.7-4.2)   Q3：＞677-1021     26   1  1.1(0.1-18.2) 19  1.2(0.5-3.1)
Q2：＞512-743     25     1   0.3(0.0-2.8)   21   1.9(0.8-4.7)   Q2：＞363-677     25   5  5.3(0.6-49.3) 20  1.3(0.5-3.2)
Q1：≤512     26   4   1.0参考   14   1.0参考   Q1：≤363     26   19  19.6(23-163.8) 21  1.2(0.5-3.1)
表4.(续)
  sFlt-1(pg/ml)     对照N    PE＜37周   PE≥37周   P1GF(pg/ml)     对照N     PE＜37周   PE≥37周
  33-41周
  Q4：＞2191     22   44  7.5(2.6-21.8)   Q4：＞948     22   6   1.0参考
  Q3：＞1633-2191     22   12  1.7(0.5-5.5)   Q3：＞377-948     22   18   2.7(0.9-8.3)
  Q2：＞1287-1633     22   7  1.0(0.3-3.3)   Q2：＞175-377     22   19   2.8(0.9-8.5)
  Q1：≤1287     23   8  1.0参考   Q1：≤175     23   28   4.1(1.4-12.2)
*对孕龄和体重指数(95％CI)调整的优势比。95％CI＞1.0的OR为黑体字，病例样品在先兆子痫症兆之前获取。
这些结果证明在先兆子痫症状发作前约5周sFlt-1水平开始显著升高。与sFlt-1升高相比，游离P1GF和游离VEGF水平降低，表示P1GF和VEGF的降低可能至少部分地由于sFlt-1的对抗，不是由于P1GF和VEGF在胎盘产生的减少。三个先兆子痫亚组：严重先兆子痫、疾病早期发作和SGA婴儿，在23-32周和33-41周与对照或轻微先兆子痫的妇女相比，具有更高的sFlt-1和更低的P1GF浓度。我们还证明在最终要发展先兆子痫的妇女中在第二个三个月开始早期游离P1GF有小的但是显著的降低。这些结果证明P1GF水平的降低可能是先兆子痫早期发作的有用预测指示物。
我们在本文第一次描述sFlt-1在正常怀孕中的妊娠模式，在整个妊娠期间观察到相对稳定的水平，随后在33-36周开始稳定的增加。这种升高相应于其他人报导的在正常怀孕中观察到的在晚期妊娠中P1GF的降低(Torry等人，J.Soe.Gynecol.Invest.10：178-188，1998；Taylor等人，Am.J.Obstet.Gynecol.188：177-182，2003)，结果在本文描述。从临时的联系，加上sFlt-1干预P1GF ELISA测定(Maynard等，如上)的知识表示在晚期妊娠期间游离P1GF水平的降低可能由于sFlt-1水平的升高在第一和第二个三个月期间，此时胎盘的生长需要跟上胎儿增长的要求，P1GF浓度是高的且sFlt-1浓度是低的，产生相对促血管生成的状态。在妊娠晚期，此时胎盘血管生长可能需要调节和停止，存在抗血管生成sFlt-1的升高，并导致P1GF的降低。在患有先兆子痫的妇女中，sFlt-1升高开始于妊娠较早期，约在症状发作前5周，平均约29-32周妊娠。因此，在先兆子痫中，抗血管生成“刹车”可能被应用的太快和太强，导致正常生理的夸大，其阻止了胎盘生长。似乎清楚的是胎盘病理学变化特征在于先兆子痫发生在妊娠早期(10-14周)，在sFlt-1显著升高之前。导致的胎盘局部缺血本身可能增强sFlt-1的生成，最终引发sFlt-1的大量出现。
除了在临床症状发展以前5周可见的大量的差异，最终发展先兆子痫的妇女早在妊娠13-16周具有小的但是统计学显著的游离P1GF的降低。这种P1GF的降低一般不伴随sFlt-1水平相应的增长。但是，在病例中在第一个三个月期间存在轻微更高sFlt-1水平的倾向，尽管它统计学的不显著的(例如在17-20周窗口，在病例中平均sFlt-1水平为865.77pg/ml对在对照中的795.25)。这种在妊娠早期P1GF水平的降低可能反映了在怀孕中P1GF胎盘生产较少，被病症例如先兆子痫或SGA所危害。重要的是，在患有并发SGA的先兆子痫患者中，我们发现在疾病出现前Flt-1升高和P1GF降低两者都出现统计学显著的增加。还可能是在先兆子痫中P1GF的胎盘生产没有变化，在胎盘中sFlt-1局部水平的升高造成循环中游离的P1GF的降低。下列的发现支持这一点：通过免疫组织化学测定胎盘P1GF在先兆子痫是不改变的(Zhou等，Am.J.Pathol.160：1405-1423，2002)。
总之，我们已经指出在先兆子痫中在临床疾病发作前至少5周sFlt-1开始升高，其伴随着循环中的游离P1GF和游离VEGF的降低。在第一个三个月期间降低的P1GF可以用作先兆子痫的预测指示物，升高的sFlt-1可以用作接近临床疾病的预测指示物。这个数据与如上所述的动物工作联合证明在啮齿动物中sFlt-1单独诱导类似先兆子痫的症状，表示在先兆子痫的发病机理中sFlt-1可能的病因学的作用。从我们有限的关于SGA婴儿和对照的早产分娩数据，与病例患者的比较，表示在具有SGA婴儿的先兆子痫怀孕中观察到的蛋白水平增加的改变，与仅仅因为子宫内生长限制或在不存在先兆子痫中早产分娩造成的差异相比是更加充实的。
实施例9.在来自正常和先兆子痫患者的单细胞中检测的sFlt-1蛋白和蛋白片段
从正常和先兆子痫患者中分离到外周血单核细胞、富集单细胞，用于测定sFlt-1和sFlt-1片段的水平。从PBMCs制备蛋白提取物，使用识别Flt-1蛋白N-端(两个蛋白共同的区域)的抗体通过蛋白质印迹分析Flt-1/sFlt-1水平。这个试验的结果表明在来自先兆子痫患者的单细胞中Flt-1和sFlt-1水平增加(图8)。在另外的几个带中检测到有比全长sFlt-1更快的迁移。这些较快迁移的带可能是降解产物，选择性剪接的同功型、酶催化裂解产物或sFlt-1的其它形式。
实施例10.sFlt-1蛋白水平在患有先兆子痫历史的妇女中作为心血管病症的诊断指示
患有先兆子痫历史的妇女已经被表明具有发展心血管病症的倾向(参见例如Kestenbaum等，Am.J.Kidney Dis.42：982-989，2003)。已知我们发现使用s-Flt-1作为诊断先兆子痫或子痫，或易患先兆子痫或子痫的体质的指示，完成了确定sFlt-1是否还能够在有先兆子痫历史的妇女中用作发展心血管病症或活动倾向的诊断指示的研究。结果在表5中显示。
在麻省理工学院(Massachusetts Institute of Technology)的全面临床研究中心(General Clinical Research Centers)与麻省总医院(Massachussetts General Hospital)的Ravi Thadhani博士合作，我们检查了29个血压正常的有先兆子痫历史的妇女和32个以前正常怀孕在产后18.0±9.7月的血压正常的妇女。由于先兆子痫时常在接近临产出现，其它病症可以导致早产分娩，为防止对怀孕结果的错误分类，所有血压正常的妇女都曾经在分娩期(＞38周)生育。当前怀孕的妇女，排除患糖尿病或妊娠糖尿病史、慢性高血压、白尿或血清肌酸酐＞1.0mg/dL。在提供书面告知的同意后，对主体进行历史和身体检查和尿怀孕测试。在过夜禁食后于早晨收集血液用于游离VEGF和sFlt-1的测定。立刻处理样品，保存在-80℃不超过18个月，将其解冻只用于当前研究。商业检验用ELISA试剂盒用于sFlt-1和游离VEGF(R&Dsystems，Minnesota USA)。对于sFlt-1和VEGF的变量(CV)内-和相互检验系数分别为3.5和5.6以及8.1和10.9。所有的样品由不知道怀孕结果的技术人员重复测定。
在怀孕结果组之间的单变量的比较视需要使用二样品t检验、Wilcoxon秩和检验和Fisher准确性检验。逻辑回归用于计算以前先兆子痫对给出产后标志物水平的优势比，并调整潜在的混淆处。
表5：根据怀孕结果的产后sFlt-1数据。
  先兆子痫N＝29     血压正常的N＝32   P
年龄(岁)人种(％白种人)产后月数体重指数(kg/m2)心脏收缩期血压(mmHg)心脏舒张期血压(mmHg)平均动脉血压(mmHg)*口服或皮下避孕(％)空腹葡萄糖(mg/dL)可溶性fms类似的酪氨酸激酶(pg/ml)   33.7±5.88618.0±1029.2±7.8111±1073±1086±103181±741.6±6.7     30.7±7.18418.0±1025.0±5.8105±868±781±73480±630.4±10.2   0.080.61.00.020.010.040.010.80.5＜0.01
各种变量以平均值±标准偏差或中值(在四分位数内的范围)报告都是适当的。
这些结果显示患有先兆子痫历史的妇女在怀孕期间，在怀孕后长期时间内表现出升高的sFlt-1的水平。鉴于统计学分析已经表明患有先兆子痫或子痫历史的妇女有发展心血管病症的易患病体质，这些结果对使用sFlt-1产后的水平作为心血管病症或发展心血管病症倾向的诊断指示提供了支持。
实施例11.尿中P1GF水平作为先兆子痫的诊断指示
在获取VEGF、sFLT-1和P1GF的测定血清的情况不是最佳的情况下，可选的和更小侵入性的筛选方法可为测定在尿中的这些蛋白。sFlt1分子太大(110kDa)在没有蛋白尿时不能过滤到尿中，然而P1GF和VEGF是更小的蛋白(分别～30kDa和45kDa)，容易被滤过。不像尿中的P1GF，其全部来自循环中的血，尿中的VEGF的主要来源是肾细胞本身：肾小球伪足血细胞和管状细胞。因此，尿中的VEGF不可能反映循环中的血管生成状态。我们使用存档的尿样品验证这个假说：在高血压和蛋白尿发作前尿中的P1GF显著降低，并可预测先兆子痫。
参与者和样品
血清和尿样品从试验之前登记的，在妊娠26-29周，如果还在怀孕的话在36周，和在高血压或蛋白尿被报告时的CPEP临床试验的参与者(参见实施例8)中得到。请求得到第一早晨的和24-小时的尿样品两者；如果两者都得不到，收集随机或“现场”尿样品。从怀疑先兆子痫的患者请求得到24-小时尿样。“终点样品”意指在先兆子痫症兆出现时或之后(定义如下)但是在分娩之前获取的样品。
对于本研究，我们选择有完全结果信息的、在小于22周妊娠获取的血清样品和活胎儿出生男性婴儿的妇女。这样的组以前被选择用于胎儿DNA和先兆子痫研究，其中胎儿和母亲DNA通过Y染色体基因扩增分化。以前工作分析显示根据婴儿性别的母亲血清sFlt1或PLGF浓度没有显著差异。
由于补钙对先兆子痫的危险或严重性(Levine等，如上)或对在血清(Levine等，N.Engl.J.med.350：672-683，2004)或尿中的血管生成因子浓度没有影响，妇女的选择没有考虑其是否接受补钙或安慰剂。对于每个患有先兆子痫的妇女，选择一个血压正常的对照，根据登记人员位置、在第一次血清样品收集时的孕龄和样品在-70℃保存时间进行匹配。从所有分娩之前获取的血清和尿样品中随机选择总共120个相匹配的对。如果某个妇女有超过一个在同一天获取的尿样品，我们选择一个样品，优选第一天早晨随机尿和随机选择24-小时的尿。我们从120个先兆子痫病例中鉴定了348个尿样品，来自118个血压正常的对照中的318个。两个来自血清研究的血压正常的对照不符合条件的尿样品，被从进一步分析中排除。
我们独立地检查了在妊娠21-32周获取的来自对照和病例的尿样品，所述病例在分娩期之前(＜37周)先兆子痫发作，在3天之内收集来自相同妇女的血清样品。从20个早产先兆子痫病例和69个血压正常的对照中总共得到89个尿-血清样品对。
先兆子痫定义的如上文所述。先兆子痫发作的时间(终点)定义为第一次升高血压的时间或尿蛋白测定导致诊断为先兆子痫的时间。小于胎龄婴儿定义为婴儿的出生重量低于根据美国以人种、经产状况和婴儿性别对于孕龄分列的出生体重表的孕龄的第10个百分位数。
方法
检验由不了解怀孕结果的人员完成。为了分析对样品随机排序。对于sFlt、游离P1GF和游离VEGF的酶联免疫吸收检验(ELISA)按如上所述使用商业试剂盒(R&D Systems，MN)重复完成。在试验中对于sFlt1、P1GF和VEGF的最小可检测的剂量分别为每毫升5、7和5pg，变量的相互检验和内检验系数对于sFlt1分别为7.6和3.3％；对于P1GF分别为10.9和5.6％；对于VEGF分别为7.3和5.4％。使用商购获得的苦味酸比色检验(Metra肌酸酐检验试剂盒，Quidel Corp.，CA)测定尿中的肌酸酐。
统计学分析
卡方检验用于比较绝对变量；和t-检验用于比较连续变量。尽管在文本和图中报导了算术平均值浓度，在对数转换后进行了统计学检验，在粗略分析中使用SAS/PROC GENMOD方法(SAS v8.0，Cary，NC)，调整分析用于说明不同数量样品的主体。使用逻辑回归分析调节优势的。
结果
在120个患有先兆子痫的妇女中，80个患有轻微的疾病和40个患有严重疾病。与对照比较，患有先兆子痫的妇女有更大体重指数、在CPEP试验登记人员中有更高的血压和当前怀孕中有更大的比例并发早产分娩或导致小于胎龄婴儿的情况。患者和婴儿的特征已经在以前描述，在表3中简要地总结。
在先兆子痫发作后尿中PIGF的差异
我们首先确定在临床先兆子痫发展后的妇女尿中P1GF的水平是改变的。在22对患有先兆子痫妇女和孕龄匹配的对照中，终点样品比来自对照的样品具有更低的P1GF水平(平均PLGF水平，32对234pg/ml、P＜0.001；和每mg肌酸酐中50对227pg，P＜0.001)。
尿中的PIGF的妊娠变化
为评价妊娠模式，我们完成了尿样的截面分析，尿样在4至5周孕龄间隔内获取，P1GF水平表示为浓度(图9A)或每mg肌酸酐pg(图9B)。在图9A中P值用于在对数转换后与来自在相同孕龄间隔期间获取的对照样品比较，说明具有不同数量样品的主体。在对数转换后，在已经患有临床先兆子痫的妇女中在29-36周获取的样品与从较晚发展先兆子痫的妇女在29-36周获取的那些样品之间的差异也是显著的(对于在29-32周的比较P＜0.001，对于在33-36周的比较P＜0.001，对于在37-42周的比较P＝0.003)。要说明的是在先兆子痫发作前P1GF浓度不包括在出现高血压或蛋白尿后获取的终点样品。图9A还显示在排除了先兆子痫发作前(断开的红色线)5周内获取的样品后，随后发展先兆子痫的妇女的P1GF平均血清浓度。在图9B的图显示在对数转换后，来自已经患有临床先兆子痫的妇女在29-36周获取的样品与从较晚发展先兆子痫的妇女在29-36周获取的那些样品之间的差异也是显著的(对于在29-32周的比较P＝0.004，对于在33-36周的比较P＜0.001，对于在37-42周的比较P＝0.02)。
在对照中P1GF水平在第一个两个三个月期间增加，在21-24周后更快速增加，在29-32周达到峰值，此后降低。在随后发展先兆子痫的妇女中的水平遵循类似的模式，在25-28、29-32和33-36周显著更低。当排除先兆子痫发作前5周内获取的样品后，在前面的孕龄时间间隔中对照与后来患有先兆子痫的妇女之间的差异不那么显著。在相同孕龄间隔中获取样品的妇女中，已经患有临床先兆子痫的那些与后来发展先兆子痫的那些相比在29-32、33-36和37-42周具有显著更低的浓度。当将样品限制在对第一次早晨(图9C)或随机(图9D)尿样的分析时，观察到在对照和临床先兆子痫发作前和之后的病例中有类似的孕龄模式。
尿中的P1GF与先兆子痫严重性的相互关系
在先兆子痫发作前，在对照尿中P1GF水平与后来患有先兆子痫在37周前发作的或患有先兆子痫和小于胎龄婴儿的妇女的那些之间存在特别大的差异。图10显示在妊娠21-32周之间P1GF浓度和以每mg肌酸酐pg表示的P1GF。
在分娩期之前(＜37周妊娠)随后发展先兆子痫的妇女的尿中P1GF水平，与在分娩期(≥37周)先兆子痫发作的妇女的尿中P1GF水平相比，改变也是显著的(在21-32周：在分娩期前患有先兆子痫的妇女中P1GF浓度，87pg/ml对在处于分娩期患有先兆子痫的妇女中的223pg/ml、P＜0.001；在33-42周：在分娩期前患有先兆子痫的妇女中P1GF浓度，22pg/ml对在处于分娩期患有先兆子痫的妇女中的118pg/ml、P＜0.001)。当使用P1GF表示为每mg肌酸酐pg时或在将P1GF浓度对肌酸酐、在样品收集时的孕龄、保存时间、体重指数和母亲年龄进行调整后结果是类似的。而且，在先兆子痫发作前从后来患有先兆子痫和小于胎龄婴儿的妇女获取的样品中P1GF水平，比后来患有先兆子痫但是其婴儿不是小于胎龄的的妇女的样品中P1GF水平更低(在21-32周：P1GF浓度，62对205pg/ml、P＝0.002；在33-42周：P1GF浓度，42对123pg/ml、P＝0.06)。
与尿中PIGF相关的先兆子痫优势比
为了根据在临床症兆发作前获取的尿样品中的P1GF确定先兆子痫的危险，我们将P1GF的值基于在对照中的分布分成四分位数，计算每个四分位数对于先兆子痫调节的优势比，与最高的四分位数(表6)或所有其它的四分位数(如下所述)比较。
表6：根据尿中PIGF的四分位数*在小于37周妊娠和在37周或更长的妊娠中对于先兆子痫的优势比
P1GF  对照样品号        PE＜37周         PE≥37周
样品号   OR(95％C.I.)** 样品号 OR(95％C.I.)**
13-20周
Q1：≤29pg/ml  25   6   0.6(0.2-2.4) 19 0.9(0.3-2.3)
Q2：29-59pg/ml  24  12   1.3(0.4-4.3) 25 1.4(0.6-3.3)
Q3：59-88pg/ml  24   5   0.7(0.2-2.7) 19 1.1(0.5-2.8)
Q4：＞88pg/ml  24   6   1.0 17 1.0
21-32周
Q1：≤118pg/ml  29  30   31.3(5.6-174.7) 33 2.2(1.0-5.1)
Q2：118-230pg/ml  29   4   2.6(0.4-16.8) 21 1.3(0.6-3.0)
Q3：230-309pg/ml  29     1   0.6(0.1-7.6) 11 0.7(0.3-1.7)
Q4：＞309pg/ml  29   2   1.0 18 1.0
33-41周
Q1：≤55pg/ml  25   2   N/A 31 4.2(1.4-12.5)
Q2：55-113pg/ml  25   0   N/A 21 2.5(0.8-7.7)
Q3：113-318pg/ml  25   0   N/A 17 2.1(0.7-6.5)
Q4：＞318pg/ml  24   0   N/A 6 1.0
pg PIGF/mg肌酸酐
13-20周
Q1：≤26pg/mg  25   8   0.5(0.1-2.2) 21 0.9(0.3-2.5)
Q2：26-52pg/mg  24   9   0.7(0.2-3.0) 25 1.3(0.5-3.2)
Q3：52-78pg/mg  24   5   0.4(0.1-1.8) 15 0.8(0.3-2.2)
Q4：＞78pg/mg  24   7   1.0 19 1.0
21-32周
Q1：≤120pg/mg  29  29   15.4(3.7-64.3) 33 2.6(1.1-6.3)
Q2：120-180pg/mg  29   2   0.9(0.1-6.1) 13 1.0(0.4-2.6)
Q3：180-323pg/mg  29   3   0.9(0.2-5.1) 22 1.7(0.7-4.0)
Q4：＞323pg/mg  29   3   1.0 15 1.0
33-41周
Q1：≤69pg/mg  24   2   N/A  34  2.6(1.0-6.6)
Q2：69-153pg/mg  25   0   N/A  23  1.7(0.6-4.5)
Q3：153-268pg/mg  25   0   N/A   8  0.6(0.2-1.8)
Q4：＞268pg/mg  24   0   N/A  10  1.0
·四分位数在对照样品的基础上确定。
·优势比对于样品采集时的孕龄、样品保存时间、母亲年龄和体重指数(具有95％置信区间)调整。参考种类为最高的四分位数Q4。
·来自病例的样品全部在先兆子痫临床症兆发作前获取。
在妊娠21-32周获取的样品中，P1GF的最低四分位数与早产先兆子痫危险的大量增加和分娩期先兆子痫危险较小增加相关。对于早产先兆子痫，在调整了样品采集时的孕龄、保存时间、体重指数和年龄后，使用P1GF浓度对于最低四分位数相对其它的四分位数的优势比为22.5，95％置信区间，7.4-67.8；以及使用每mg肌酸酐pg P1GF的优势比为16.4，95％置信区间5.9-45.5。在限制样品为第一次早晨尿时，调整后的优势比对于P1GF浓度和每mg肌酸酐pg P1GF分别为39.5，95％置信区间，6.5-240.8；和20.4，95％置信区间，4.5-92.3。使用随机尿样品，调整后的优势比分别为13.5，95％置信区间，2.3-79.8；和11.1，95％置信区间，2.0-61.3。对于分娩期先兆子痫，在对上述因子调整之后，使用所有尿样品，优势比分别为2.2，95％置信区间，1.2-4.3；和2.1，95％置信区间，1.1-4.1。对于在妊娠13至20周获取的样品，P1GF的最低四分位数既与早产危险的增加无关，又与分娩期先兆子痫无关。但是，P1GF的最低四分位数与分娩期先兆子痫与在妊娠33-42周获取的样品中所有其它四分位数相比较增加的危险相关。调整的优势比为2.3，95％置信区间，1.2-4.5，对于每mg肌酸酐pg P1GF。
当我们对发展先兆子痫且并发小于胎龄的婴儿的妇女在妊娠21-32周获取的样品完成同样的分析时，我们发现这种估计是不稳定的(调后的OR405，95％置信区间，27-5983，对于每mg肌酸酐pg P1GF)。这是因为仅仅有20个这样的妇女，她们尿中P1GF全部在最低(N＝19)或接近最低(N＝1)四分位数。然而，数据显示低的尿中P1GF与具有小于胎龄婴儿先兆子痫危险基本上的增加相关。
在个别妇女中尿中PIGF的妊娠变化
图11纵向描述在13个患有早产先兆子痫(先兆子痫＜37周)的患者和13个孕龄匹配的对照样品之内P1GF浓度的变化。选择所有的13个在妊娠37周之前发展先兆子痫的妇女，其至少有一个基础尿、在妊娠21-32周获取的尿和终点尿，其还可以用作21-32周的样品。每个病例匹配在类似的孕龄中获取的有相同或更大数量样品的对照。在整个怀孕期间，一个对照具有每mg肌酸酐非常低的尿P1GF：在116、177和248天妊娠分别为17、5和0pg/ml。这个妇女具有单次1+的蛋白尿和在妊娠266天分娩前心脏舒张期血压90mmHg记录2小时。患有早产先兆子痫的患者通常在整个妊娠期间具有较低的P1GF水平，然而对照倾向于具有随着妊娠前进和接近分娩期增长的水平。
尿中PIGF与先兆子痫接近的相互关系
在妊娠21-32周和在先兆子痫发作前5周获取的样品中尿中P1GF浓度(43pg/ml)，与在临床疾病前超过5周获取的样品中的该值相比更低(196pg/ml、P＜0.001)。在妊娠33-42周获取的样品中的浓度分别为110pg/ml对187pg/ml(P＝0.05)。当将P1GF对肌酸酐归一化时存在极小的差异。
图12A为来自69个对照和20个随后在分娩期之前(＜37周)发展先兆子痫的病例在21-32周尿中P1GF浓度的分散绘图。在分娩期之前发展先兆子痫的妇女比血压正常的对照具有更低的尿中P1GF浓度。在临床疾病发作前5周之内获取的样品浓度是最低的(即小于150pg/ml)。但是，许多对照样品也具有低的尿P1GF。为了将这些样品与先兆子痫前5周之内获取样品区分，我们检查了血清中sFlt1对P1GF的比率。该比率说明了在先兆子痫发作前观察到的sFlt1的增加和P1GF的降低。在图12B给出在成对血清中sFlt1对P1GF浓度比率的分散绘图。在所有先兆子痫发作前5周内获取的样品中比率是升高的(＞5)，并且超过几乎所有的对照值。
在先兆子痫中尿的sFlt1和尿的VEGF
我们随机选择22个病例和22个对照用于分析先兆子痫发作前妊娠21-32周内尿的sFlt1和VEGF。在22个病例样品中16个(73％)和在22个对照样品中19个(86％)尿的sFlt1是不可检测的。相反，在所有的样品中检测到尿的VEGF，但是在高血压和蛋白尿发作之前或之后的病例中没有显著的改变(之前：在22个随机选择的病例和对照组分别为272对248pg/ml、P＝0.56；之后：在22个孕龄相匹配的病例和对照中分别为167对103pg/ml、P＝0.61)。
结论
在这项120个患有先兆子痫的妇女和118个血压正常的对照的研究中，尿中P1GF的浓度在随后发展先兆子痫的妇女中在妊娠25-28周的开始是显著地更低的。在29-36周两个组之间的差异变得更显著。我们以前指出在妊娠13-16周的开始在病例中血清游离P1GF比在对照中更低，在妊娠25周后甚至更低。如同血清测定一样，在本研究中在那些37周前发展先兆子痫或并发小于胎龄婴儿以及在临床症兆发作5周内的在妊娠21-32周尿中P1GF显著降低。而且，在妊娠21-32周尿P1GF浓度的最低四分位数(＜118pg/ml)的妇女中，在妊娠37周前发展先兆子痫或并发小于胎龄婴儿的危险显著地升高。不考虑对尿的肌酸酐浓度的调整，该危险是高的，甚至在随机尿也是明显的。然而这个关系用第一次早晨样品会更强，可能是它更浓。因此，尿中P1GF特别可用于鉴定患者，其从早期诊断中会得到最大的益处。我们还证明在尿P1GF测定后，紧接着在选择的患者中进行血浆sFlt1和P1GF的测定可以使尿检验的假阳性最小化。
最近报导与32个没有并发症的怀孕妇女比较，在37个患有严重先兆子痫的妇女中尿的VEGF浓度适当地升高。我们发现在先兆子痫发作之前和之后尿的VEGF不显著的升高，与我们的假说尿的VEGF主要反映局部肾中VEGF的生成一致。由于尿的VEGF几乎全部从肾伪足血细胞和管状细胞中产生，其不暴露于循环中的sFlt1，sFlt1分子太大不能从完整的肾小球中自由滤过。因此，尽管在患有先兆子痫的妇女中尿中P1GF降低可能反映了降低的循环中游离的P1GF，与过量循环中的sFlt1结合的结果是尿的VEGF水平不反映血液中的血管生成不平衡。
对看来似乎介导母亲的先兆子痫综合征的血管生成蛋白的鉴定，可能给出治疗干预的特异性靶标以恢复适当的血管生成平衡(Maynard等，如上)。对于患有先兆子痫早期发作或并发小于胎龄婴儿的先兆子痫的妇女特别需要预防和治疗。但是，这样的妇女必须首先在临床疾病发作之前被鉴定出来。这些数据证明可靠的和有效的浸渍片检验可以开发，并用于筛选所有具有尿中P1GF浓度低的妇女。作为对于被鉴定具有低的尿P1GF的那些妇女随访，然后将sFlt1和P1GF的系列血清测定可用于更准确地鉴定高度危险的个体。
实施例12.辅助研究证明在妊娠中期尿中P1GF是先兆子痫的特异性预测指示物
我们完成了辅助研究，以确证在妊娠21-32周在生育男性婴儿或女性婴儿之间尿中P1GF是否可能不同，以及确定在患有妊娠高血压的妇女和怀孕期间保持血压正常的但是分娩了小于胎龄(SGA)婴儿的妇女中尿中P1GF的浓度是否比正常更低。在CPEP试验中4256个有充分数据分娩了活胎出生婴儿未知有染色体异常的妇女中，我们排除了239了分娩期先兆子痫(＞37周)的。在剩余的4017个妇女中，3303个有在分娩前的妊娠21-32周内和在先兆子痫或妊娠高血压发作前获取的至少一个尿样品。在这些妇女中，我们随机选择了120个怀孕时血压正常且其婴儿不是SGA的，60个怀孕时血压正常分娩了SGA婴儿的，60个患有妊娠高血压的，和59个患有早产(＜37周)先兆子痫的。除了早产先兆子痫的组，在每个组中我们选择一半分娩了男性婴儿的妇女，和一半分娩了女性婴儿的妇女。在早产先兆子痫的组中，我们选择30个分娩了男性婴儿的妇女，但是只找到29个分娩了女性婴儿的妇女。分析在妊娠21-32周获取的所有的尿样品中的P1GF。
先兆子痫、妊娠高血压、小于胎龄和研究院评述管理委员会
先兆子痫定义为新近升高的心脏舒张期血压至少90mmHg和浸渍片测试蛋白尿至少1+(30mg每分升)，每个都在4至168小时的两个时机测定。严重先兆子痫定义为HELLP综合征(溶血、升高的肝酶水平和低血小板计数)、子痫或伴随严重高血压(心脏舒张期血压≥110mmHg)或严重蛋白尿(尿的蛋白排泄每24小时≥3.5g或浸渍片测试结果≥3+[300mg每分升])的先兆子痫。妊娠高血压为如上文所定义不存在蛋白尿的高血压。详细的定义已经发表(Levine等，N.Engl.J.Med.337：69-76(1997)和Levine等，Control Clin.Trials 17：442-469(1996))。先兆子痫发作的时间定义为第一次升高血压或尿蛋白测定导致诊断为先兆子痫的时间。类似地妊娠高血压发作的时间为导致这个诊断的第一次血压升高的时间。小于胎龄婴儿为出生体重低于根据美国以人种、经产状况和婴儿性别对于孕龄分列的出生体重表的孕龄的第10个百分位数(Zhang等，Obstet.Gynecol.86：200-208，1995)的婴儿。因为该研究使用的数据和样品不能与可指明身份的妇女相联系，国立卫生研究院的人类主体研究办公室(the office of HumanSubjects Research of the National Institutes of Health)准予免除对由研究院评述管理委员会评述和批准的要求。
方法
检验由不了解怀孕结果的人员完成。为了分析将样品随机排序。对sFlt1、游离P1GF和游离VEGF的酶联免疫吸收检验(ELISA)按照以前描述重复完成，使用商业试剂盒(R&D Systems，MN)(Maynard等，如上)。在检验中对sFlt1、P1GF和VEGF的最小可检测的剂量分别为每毫升5、7和5pg，对sFlt1变种的相互检验和内检验系数分别为7.6和3.3％；对P1GF分别为10.9和5.6％；对VEGF分别为7.3和5.4％。对sFlt1、VEGF和P1GF的ELISA试剂盒在尿样品使用中被验证，来自难应付的(spiked)尿样品的恢复率分别为96％、98％和99％。使用商购获得苦味酸比色检验(Metra肌酸酐检验试剂盒，QuidelCorp.，CA)测定尿中的肌酸酐。
统计学分析
卡方检验用于比较绝对变量；和t-检验用于比较连续变量。尽管在文本和图中报导了算术平均值浓度，在对数转换后在每个单个的时间间隔内进行了统计学检验，在粗略分析和调整分析中使用通用化的估算方程方法(GEE)(SAS/PROC GENMOD procedure，SAS v8.0，Cary，NC)以说明具有各种数量样品的主体。使用逻辑回归分析调整优势比。因为在全部研究的人群中只有最早期的血清样品匹配是完整的，在统计学分析中对匹配没有说明。
结果
为了测试进一步的假说，即对于早期先兆子痫的发作尿中P1GF的降低是特异性的，我们完成第二个研究，我们分析了来自患有类似发病机理的其它产科病症的妇女在21-32周获取的尿样品。我们将患有妊娠高血压的妇女和在怀孕期间保持血压正常但是分娩了SGA婴儿的妇女，与血压正常其婴儿不是SGA(对照)的妇女以及与37周前患有先兆子痫的妇女进行了比较。在这项研究中的妇女和她们的新生婴儿的在临床特征表7中总结。患有先兆子痫的妇女和她们的婴儿的特征与在这样的妇女在主要的研究中报告的那些是类似的。
表7：在CPEP登记人员和她们的新生婴儿的辅助研究中妇女的特征
特征     血压正常没有SGA(n＝120)     血压正常有SGA(n＝60)   妊娠高血压(n＝60) PE＜37周(n＝59)
年龄(岁)体重指数心脏收缩期血压(mmHg)心脏舒张期血压(mmHg)分娩时孕龄(周)当前的吸烟者[n(％)]曾经结婚[n(％)]人种/民族φ白种人，非西班牙人[n(％)]白种人，西班牙人[n(％)]非洲-美国人[n(％)]其它，未知[n(％)]     21.8±4.625.8±6.1106±960±739.0±1.815(12.5)34(28.3)46(38.3)16(13.3)55(45.8)3(2.5)血压正常没有SGA     21.3±4.922.8±3.6***106±860±838.7±1.413(21.7)16(26.7)20(33.3)16(26.7)24(40.0)0(0.0)血压正常有SGA   22.2±5.328.3±7.4*108±962±939.6±1.73(5.0)15(25.4)20(33.3)6(10.0)33(55.0)1(1.7)妊娠高血压     21.1±4.727.6±6.9111±865±7***34.6±2.3***4(6.8)16(27.1)16(27.1)10(17.0)30(50.9)3(5.1)PE＜37周
  特征     (n＝120)   (n＝60)   (n＝60)     (n＝59)
  出生体重(g)分娩＜37周[n(％)]小于胎龄儿(＜第10个百分点)[n(％)]     3273±45613(10.8)0(0.0)   2538±278***6(10.0)60(100.0)***   3437±559**3(5.0)2(3.3)     2193±726***50(84.8)***18(30.5)***
平均值±标准偏差、除非另外指明
对与“血压正常没有SGA”的差异的P值：        *P＝0.02**P＝0.04***P＜0.001
Figure A20058001210800671
P＝0.001
φ人种或民族为自我报告的。
与血压正常且婴儿不是SGA的妇女比较，患有妊娠高血压的妇女有更大的体重指数和更大出生重量的婴儿；并且有SGA婴儿的血压正常的妇女有更低的体重指数和更低出生重量的婴儿。有SGA婴儿的血压正常的妇女最多可能在怀孕期间吸烟，患有妊娠高血压的妇女最少可能在怀孕期间吸烟。
图13描述在妊娠21-32周表示为浓度(pg/ml)和每mg肌酸酐pg的尿中P1GF。在怀孕期间保持血压正常但是分娩了SGA婴儿的妇女中P1GF水平，与血压正常婴儿出生不是SGA的对照的那些值没有不同。类似地，在患有妊娠高血压的主体中的水平，与血压正常的对照的那些值没有不同。但是，在妊娠37周前发展先兆子痫的患者在临床疾病前平均42天收集的尿中P1GF的水平比对照显著更低(77对206pg/ml、P＜0.0001)。在每个组之内，在分娩了男性或女性婴儿的妇女中P1GF浓度没有显著不同。
结论
在37周前发展先兆子痫的妇女在妊娠21-32周尿中的P1GF，比在发展了妊娠高血压或分娩了小于胎龄婴儿(两个与先兆子痫类似的产科病症)的妇女中的该值显著更低。因此，在怀孕的这个阶段低的尿中的P1GF浓度很可能将先兆子痫与妊娠高血压和子宫内生长延迟区别开。
实施例13
为了确定在动物模型中VEGF121对先兆子痫治疗的疗效，完成了与来自Scios的Steve Pollitt博士和Ute Schellenberger博士合作的试验。使用平均重量250克的雌性大鼠。对所有动物在0天注射2×109pfu的表达sFlt-1的腺病毒。治疗的目标是获得sFlt-1浓度约10-20ng/ml，以模拟我们发现的与人先兆子痫相关的浓度。将动物分作两组。动物59-64被注射PBS，用作对照。动物65-70从第3天至第7天每天两次被皮下注射浓度25μg/只大鼠(约100μg/kg体重)的VEGF121。
在第7天下午在最后一次给药VEGF后约4至5小时将动物处死。获取血压，结果在下表7中总结。还得到血浆、尿和肾组织，通过ELISA测定血浆sFlt-1水平和游离VEGF水平。这些数据也在表7中总结。
尽管在循环中的sFlt-1水平有变化，平均来说，接受VEGF121治疗的动物证明血压和蛋白尿降低。从这些结果表示VEGF121作为有效治疗sFlt-1诱导的高血压和蛋白尿的潜力。
表7.VEGF12l治疗的体内结果
大鼠 动物编号 血压   尿mgAlb/mg肌酸酐 sFlt-1ng/ml     游离VEGFpg/ml 抽血(小时)*
    123456平均值789101112平均值p-值   Flt59Flt60Flt61Flt62Flt63Flt64Flt65Flt66Flt67Flt68Flt69Flt70   168/118160/120175/114180/120130/92122/90156/109104/60144/86116/82102/80128/65116/86118/770.01   1460.653440.323271.521478.31574.8755.92199701690.04235.320354.951465.46240.03   4.6112.89122.590.0917.011.95581.82122.391.765.2252.39100.7647     0000000319.260189.3447.60093   33449956677887
*在VEGF最后一次给药后抽血
诊断
本发明特征在于检测先兆子痫、子痫或发展这样病症倾向的诊断检验。测定在主体样品中的VEGF、P1GF或sFlt-1的水平，游离的或总的水平，用作先兆子痫、子痫或发展这样病症倾向的指示。
在一个实施方案中，度量用于确定在所述蛋白中的至少两个水平之间的相互关系是否为先兆子痫或子痫的指示。可以使用标准方法测定在任何身体流体包括但不限于尿、血清、血浆、唾液、羊水或脑脊髓的流体中VEGF、P1GF或sFlt-1多肽的水平。这样的方法包括免疫检验、ELISA、“夹心检验”、采用导向VEGF、P1GF或sFlt-1的抗体的蛋白质印迹、免疫扩散检验、凝集检验、荧光免疫检验、蛋白A或G免疫检验和免疫毛细管电泳检验和定量酶免疫检验技术，例如那些在Ong等(Obstet.Gynecol.98：608-611，2001)和Su等(Obstet.Gynecol.97：898-904，2001)中描述的。ELISA检验是VEGF、P1GF或sFlt-1水平测定优选的方法。因为容易和检测的简化以及其定量的性质，特别优选的是夹心或双抗体检验，其中存在多个变量，所有的这些都是本发明所设想的。例如，在典型的夹心检验中，识别抗原(即sFlt-1、P1GF或VEGF多肽)的未标记的抗体是固定在固相例如微滴定板上的，加入受试样品。在培养一定时间使其形成抗体-抗原复合物后，加入用能够诱导可检测信号的报告分子标记的第二抗体，继续培养使有足够的时间与抗原在不同的位点结合，导致抗体-抗原-标记的抗体复合物形成。通过观察信号确定抗原的存在，所述信号可以通过与含有已知量抗原的对照样品比较而定量。
sFlt-1血清水平的升高被认为是先兆子痫的阳性指示。sFlt-1的这个值可以优选为2ng/ml或更多。另外相对于正常的水平，sFlt-1、VEGF或P1GF水平可检测的改变是子痫、先兆子痫或发展这样病症倾向的指示。
优选，测定sFlt-1，更优选VEGF和P1GF的测定与这种测定组合，最优选测定所有3个蛋白(或指示蛋白水平的mRNA水平)。在另外的优选实施方案中，还测定体重指数(BMI)和胎儿的孕龄，包括诊断度量。
在另一个实施方案中，PAAI(sFlt-1/VEGF+P1GF)用作抗血管生成指数，其是先兆子痫、子痫或发展这样病症倾向的诊断指示。如果PAAI大于10，更优选大于20，那么所述主体被认为患有先兆子痫、子痫或在近期有发展同样病症的危险。PAAI(sFlt-1/VEGF+P1GF)比率仅仅是可以使用为诊断指示的有用度量的一个例子。其无意于限制本发明。实际上检测主体中sFlt-1、P1GF或VEGF任一中水平相对于正常对照改变的任何度量都可以被用作诊断指示。
特定核酸或多肽的表达水平可以与特定疾病状态(例如先兆子痫或子痫)相关，因此可以用于诊断。来自sFlt-1、P1GF或VEGF核酸序列的寡核苷或更长片段可以用作探针，不仅监测表达，还可以鉴定出在sFlt-1、P1GF或VEGF核酸分子中具有基因改变、突变或多形态的主体，其可以作为发展所述病症易患病体质的指示。这样的多形态对于技术人员是已知的，例如被Parry等(Eur.J.Immunogenet.26：321-3，1999)所描述。对GenBank数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov)的调查揭示在Flt-1/sFlt-1基因和启动子区域至少有330个已知的多形态。这些多形态可以影响Flt-1核酸或多肽表达水平或生物活性。相对于正常参照样品基因的改变、突变或多形态可以作为先兆子痫、子痫或发展先兆子痫或子痫倾向的诊断指示。
这样的基因改变可以存在于启动子序列、开放阅读框架、基因内序列或sFlt-1基因未翻译的3′区域。与基因改变相关的信息可以被用于诊断主体患有先兆子痫、子痫或发展这样病症的倾向。如全文中所提到的，在sFlt-1、VEGF和/或P1GF生物活性水平特定的改变可以与先兆子痫或子痫或易患所述病体质的可能性相关。结果，一个本领域的技术人员，在检测到所述的突变后，然后可以检验所述蛋白生物活性的一个或多个度量以确定该突变是否导致或增加先兆子痫或子痫的可能性。
在一个实施方案中，患有先兆子痫、子痫或发展这样病症倾向的主体将会显示编码sFlt-1核酸表达的增加或P1GF或VEGF水平的改变。检测这样改变的方法本领域是标准的，在Ausubel等如上的文献中描述。在一个实施例中，RNA印迹或实时PCR用于检测sFlt-1、P1GF或VEGF mRNA水平。
在另一个实施方案中，用PCR探针可以用于杂化来自患有先兆子痫或子痫或在发展这样病症危险中的主体的核酸序列，所述探针能够检测sFlt-1核酸分子，包括基因组序列或紧密相关的分子。不管探针是由高度特异的区域例如5′调节区得到的，还是由较小特异性的区域例如保守基序得到的，探针的特异性、杂化或扩大的严紧度(最大、高、中或低)决定着探针对天然发生的序列、等位基因变种或其它相关的序列杂交。杂交技术可以用于鉴定指示在sFlt-1核酸分子中先兆子痫或子痫的突变，或可以用于监测编码sFlt-1多肽的基因的表达水平(例如通过Northern analysis，Ausubel等，如上)。
在另一个实施方案中，通过直接分析sFlt-1、VEGF或P1GF核酸分子序列可以诊断人发展先兆子痫或子痫倾向。
患有先兆子痫、子痫或发展这样病症倾向的主体将显示sFlt-1多肽表达的增加。sFlt-1多肽可以包括全长sFlt-1、sFlt-1的降解产物、可选择性剪接的同功型、sFlt-1的酶催化裂解产物等等。特异性地结合sFlt-1多肽的抗体可以用于诊断先兆子痫或子痫或鉴定主体处于发展这样的病症危险中。测定这样多肽表达的改变的多种方案是已知的，包括免疫学方法(例如ELISA和RIA)，提供诊断先兆子痫或子痫或处于发展这样的病症危险中的基础。此外，sFlt-1多肽水平的增加是主体患有先兆子痫、子痫或发展这样病症的倾向的诊断指示。
在一个实施方案中，sFlt-1、VEGF或P1GF多肽或核酸或其任何组合的水平，是在至少两个不同的时间测定的，经历一定时间与正常参考水平比较所述水平的改变用作先兆子痫、子痫或发展这样病症的倾向的指示。在另一个实施方案中，sFlt-1、VEGF或P1GF多肽或核酸或其任何组合的水平与参照样品的水平比较。
sFlt-1、VEGF或P1GF多肽的水平还可以与标准曲线比较以确定它是否落入在多肽水平的“正常范围”之内。在这个实施方案中，对每个多肽建立标准曲线，使用纯化的或重组形式的(例如大于80％、90％、95％、99％或100％纯化的)多肽用于比较。产生了标准曲线，多肽的浓度通过与由相同多肽建立的标准曲线比较确定。例如，可以对sFlt-1建立标准曲线，当主体的样品与标准曲线比较时，得到sFlt-1浓度大于2ng/mL被认为是先兆子痫、子痫或发展这样病症的倾向的指示。
在患有先兆子痫、子痫或发展这样病症倾向的主体身体流体中sFlt-1、VEGF或P1GF的水平，相对于在正常中对照sFlt-1、VEGF或P1GF的水平，可以改变(增加或降低)小如10％、20％、30％或40％，或大如50％、60％、70％、80％或90％或更多。在患有先兆子痫、子痫或发展这样病症倾向的主体身体流体中sFlt-1的水平，相对于在正常对照主体的水平，可以增加1.5倍、2倍、3倍、4倍或甚至多至10倍。
在一个实施方案中，主体的身体流体样品(例如尿、血浆，血清、羊水或脑脊髓的流体)在先兆子痫症状发作前在怀孕早期收集。在另一个实施例中，样品可以为在先兆子痫症状发作前在怀孕早期收集组织或细胞。非限制性例子包括胎盘组织、胎盘细胞、内皮细胞和白细胞例如单细胞。在人中，例如母亲血清样品在怀孕的第一、第二或第三个三个月的期间怀孕妇女的肘前静脉收集。优选，检验在第一个三个月期间例如在4、6、8、10或12周完成，或下第二个三个月期间例如在14、16、18、20、22或24周完成。这样的检验还可以在第二个三个月末或第三个三个月，例如在26、28、30、32、34、36、37、38、39或40周完成。优选sFlt-1、VEGF或P1GF的水平在此期间测定两次。对于产后先兆子痫或子痫的诊断可以在产后进行sFlt-1、VEGF或P1GF的检验。
在一个特定的实施例中，系列血液样品可以在怀孕期间收集，通过ELISA确定可溶sFlt-1的水平。在一个使用这种技术的研究中，编码sFlt-1的可择性剪接的mRNA被滋养层细胞高度表达，在怀孕妇女的血浆中该蛋白易于检测的。观察到在妊娠20至36周sFlt-1的水平增加约3倍。在随后继续发展先兆子痫的高危险妇女中观察到的水平显著更高(Charnock Jones等，J.Soc.Gynecol.Investig 10(2)：230，2003)。
在一个优选的实施方案中，在身体流体样品优选尿中测定P1GF多肽水平，并用作先兆子痫、子痫或发展同样病症倾向的诊断指示。在尿中P1GF多肽水平的测定还可以用作先兆子痫或子痫潜在危险的最初评价，通过P1GF测定被确定“在危险中的”妇女，然后可以进行另外的诊断检验，例如本文所述的或在本领域已知的。在一个实施例中，通过尿样品中P1GF多肽测定被诊断为处于发展先兆子痫或子痫危险中的妇女，通过如上文所述的VEGF、sFlt-1和/或P1GF水平的血清分析被进一步监测。在另一个实施例中，使用这些多肽的每个血清测定值确定PAAI。通过P1GF尿分析被鉴定为处于发展先兆子痫或子痫危险中的妇女，可以在怀孕前、整个怀孕过程中(例如每月、每三周、每两周、每周、每三天、每隔一天或每天)或怀孕后有规律地监测。
游离形式的P1GF具有平均分子量约30kDa，足够小到被肾过滤并释放到尿中。P1GF，当与sFlt-1复合时，具有更大的分子量，因此不被释放到尿中。尽管不希望被理论所束缚，发明者已经发现在先兆子痫期间，当sFlt-1的水平增加时，sFlt-1可以与P1GF复合，因此减少释放到尿中的游离P1GF的水平。结果，对游离P1GF水平的尿分析可以被用于诊断先兆子痫或子痫或患者处于相同病症危险中。为了检测游离P1GF，优选在这些检验中使用特异性地识别游离P1GF的抗体。这样的抗体可以识别例如P1GF的sFlt-1结合功能域。这样特定抗体的例子包括用在人P1GF ELISA试剂盒中的捕获抗体(目录号#DGG00，R & D Systems，Minneapolis，MN)、单克隆抗胎盘生长因子(克隆37203.111，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)。这些抗体识别人P1GF蛋白N-端区域特定的序列。sFlt1对P1GF的结合区域在P1GF蛋白的39-105氨基酸，取决于P1GF的同功型，P1GF总长度从149至221氨基酸变化。另外的优选抗体包括识别N-端区域(优选P1GF的39-105之间氨基酸)的任何抗体，其将特异性地与游离P1GF结合，而不与和sFlt-1结合的P1GF结合。上升至C-端的抗体不具有这种性质。
与本发明任何诊断检验一样，可以将主体样品中P1GF水平与参照样品比较以确定相对水平。参照样品可以为来自患有先兆子痫患者的尿样品(一般说来具有游离P1GF水平小于400pg/ml，优选小于200pg/ml)或来自正常的尿样品(具有P1GF浓度范围200pg/ml至800pg/ml)，取决于所需的诊断检验的用途。P1GF水平还可以与参考值或标准比较以确定绝对水平。参考值或标准可以用基于纯化的或重组形式用于比较的P1GF(例如大于80％、90％、95％、99％或100％纯化的)建立的标准曲线确定。P1GF值小于400pg/ml，优选小于200pg/ml和最优选小于100pg/ml，或PIGF/肌酸酐值小于200pg/mg肌酸酐和优选小于100pg/mg肌酸酐被认为是先兆子痫或子痫或患者处于相同病症危险中的诊断指示。
对于标准曲线，可以使用10pg/ml至1ng/ml范围的重组P1GF。其它可以用于产生标准曲线的重组蛋白的例子包括P1GF氨基端的特定的肽，优选P1GF蛋白的39-105氨基酸(P1GF的与sFlt-1结合的区域)。或者还可以使用重组P1GF/VEGF杂二聚体(可商购获得，目录号#297-VP，R&D Systems，MN)。后者的优点是这个蛋白还可以用于产生用于游离VEGF测定中的VEGF标准曲线。
ELISA检验是测定游离P1GF水平的优选方法。特别优选的是其中存在许多个变量的夹心或双抗体ELISA检验，由于它检测容易和简便以及它定量的性质，其是本发明所设想的。例如在典型的夹心检验中，将识别P1GF多肽的未标记的抗体固定在固体相例如微滴定板上，加入受试样品。在培养一定时间使抗体-抗原复合物形成后，加入用能够诱导可检测信号的报告分子标记的第二抗体，继续培养使有足够的时间与抗原在不同的位点结合，导致抗体-抗原-标记的抗体复合物的形成。通过观察信号确定抗原的存在，所述信号可以通过与含有已知量抗原的对照样品比较而定量。
在定量夹心ELISA的实施例中，用抗P1GF结合物质(例如原来的抗体)将固体载体(例如微滴定板或膜)预先覆盖。将标准或样品加入到底物和P1GF中，如果存在，将与抗体结合。然后将还可识别P1GF的酶轭合抗体的标准制剂加入到“夹心”中，P1GF限制被固定到板上。加入底物，使酶和底物在短的培养时间期间反应。终止酶-底物反应，通过已知的方法测定变化(例如通过眼、使用分光光度计或测定化学发光法)。这样的检验可以用于确定P1GF的相对水平(例如与参照样品、标准或水平的水平比较)或用于确定P1GF的绝对浓度。如果希望如此，使用一组在不同浓度的纯化P1GF的校正标准确定P1GF的浓度。校正标准在与样品相同时间内检验，通过例如光密度对P1GF浓度测定用于产生标准曲线。然后通过比较例如样品对标准曲线的光密度确定P1GF在样品中的浓度。在正常的怀孕期间在中期妊娠和晚期妊娠P1GF浓度范围为200-800pg/ml，取决于母亲怀孕年龄。尿中P1GF小于400pg/ml的任何值，优选小于200pg/ml的任何值，或者尿中P1GF的值小于200pg/mg肌酸酐将诊断为先兆子痫。通常，在ELISA试剂盒上的标准曲线包括P1GF浓度范围为10pg/ml-1ng/ml的重组或纯化的P1GF。
在另一个实施例中，用于检测尿样品中P1GF的检验方法包括具有固定化P1GF结合物质的膜，P1GF结合物质是以可检测方式标记的，能够区分与游离P1GF结合时的P1GF，和不与游离P1GF结合时的P1GF。优选的标记包括荧光标记。将膜暴露于样品保持一段时间足以使P1GF结合物质与在样品中存在的游离P1GF结合。然后测定与游离P1GF结合的标记的P1GF结合物质。这样的检验可以被用于确定P1GF相对水平(例如与参照样品、标准或水平的水平比较)，或如上文所述确定P1GF绝对浓度。优选的用于测定结合的检验包括荧光免疫检验。
在另一个实施例中，在尿样品中检测P1GF的检验包括具有脱水标记的(例如用于比色检测)P1GF结合物质(第一物质)的膜和固定的抗P1GF结合物质(第二物质)。将膜暴露于样品。样品使标记的P1GF结合物质再水合，如果在样品中存在P1GF，它将与P1GF结合物质结合。PIGF-初始物质复合物通过毛细管运动将从膜上向下移动，并会与固定的第二物质相互作用。这种相互作用将会在第二物质被固定的位置由比色标记产生可见的线。
在另一个实施例中，在尿样品中检测P1GF的检验包括具有脱水标记的(例如用于比色检测)P1GF结合物质(第一物质)的膜和固定的抗P1GF结合物质(第二物质)。膜还包括也固定在膜上的在阀值浓度的纯化的P1GF。在这个实施例中，将膜暴露于尿样品。样品将标记的第一物质再水合，如果P1GF在样品中存在的浓度大于阀值浓度，它将与P1GF结合物质结合。P1GF-标记的第一物质复合物通过毛细管运动将从膜上向下移动。由于第一物质已经与来自样品的P1GF结合，它将不会与固定的纯化P1GF结合，在这个“测试”位置将没有可见的线出现。PIGF-第一物质复合物将连续从膜上向下，与固定的第二物质相互作用。这种相互作用将在抗P1GF结合物质固定的“对照”位置由比色标记产生可见的线。在这个实施例中，仅仅出现一条可见的线，指示P1GF浓度在阀值浓度之上。如果P1GF浓度低于阀值浓度，标记的第一物质将与固定的P1GF结合，在这个“试验”位置以及“对照”位置将出现可见的线。该试验检验还可以包括旨在检测在样品中的几种P1GF浓度的多条试验线。这样的分级检验在美国专利6,660,534中描述。
在另一个实施例中，使用基于检验的类似的膜，但是是基于标准夹心ELISA方法的。在这个实施例中，所述膜包括具有与酶轭合的固定的第一P1GF结合物质的反应区；具有另一个固定的P1GF结合物质的试验区，所述结合物质与没有被第一P1GF结合物质结合的P1GF的区域结合，以及具有识别第一P1GF结合物质的固定物质的对照区。在试验区和对照区两者中，包括对与第一固定的P1GF结合物质轭合的酶的可检测的底物。将所述膜暴露于样品，通过毛细管作用样品移动至反应区。如果在样品中存在P1GF，它和与酶轭合的第一固定的P1GF结合物质结合，形成复合物，然后被毛细血管流带到试验区。与酶复合物轭合的P1GF-固定的P1GF结合物质然后与第二P1GF结合物质结合，在固定的第二P1GF轭合物质(“试验”区)的位置形成可见的线。剩余的第一P1GF结合物质被毛细血管流带动，将与识别或与第一结合物质结合的固定物质结合，在该位置(“对照”区)产生可见的线。如果在样品中不存在P1GF，在对照区将仅仅出现第二条线。在优选的实施方案中，第一和第二P1GF结合物质为抗体，识别或与第一结合物质结合的物质为第二抗免疫球蛋白抗体，可特异性地识别第一抗体的免疫球蛋白。在试验区线的强度可以与使用标准量纯化的P1GF蛋白的检验比较，确定样品含有的P1GF是在阀值浓度之上还是之下。
在本文所述的任何检验中，正常怀孕的血清可以被用作另外的对照，可以测定P1GF的活性，并且从正常怀孕的血清测定且定量为P1GF活性百分率。
对于本文所述的任何检验，样品可以为任何身体流体。尿样品优选用于基于PIGF的诊断检验。膜可以为标准浸渍片类型的格式或侧流格式。检验的浸渍片类型在本领域是已知的，例如怀孕检测检验(测定病例的激素水平)或在肾疾病的诊断中肌酸酐或白蛋白的尿的检测。各种格式的浸渍片类型检验的例子在美国专利6,660,534中描述，在此引入作为参考。
任何上述P1GF检测检验可以被单独使用或与本文所述的或在本领域的另外的诊断检验联合使用。在优选的实施方案中，P1GF诊断检验用作最初筛选，随后检验测定本文所述的血清sFlt-1、P1GF和/或VEGF水平。在这种方式中，“处于危险中”的患者可以被鉴定、小心地监测或进一步进行更大诊断准确度的筛选。
任何上述的基于PIGF诊断检验的优选实施方案中，P1GF结合物质优选为第一抗体，所述抗体可识别P1GF或识别与P1GF相互作用的蛋白或肽。第二抗P1GF结合物质优选为识别第一抗体的第二抗体，或与第一抗体结合的蛋白(例如蛋白A或蛋白G)，或特异性与和P1GF相互作用的肽结合的抗体。在实施方案中，其中P1GF结合物质为用酶标记的，使用的酶优选催化比色反应，所述比色反应能被眼检测或用分光光度法测定。优选的酶/底物组合的非限制性例子为辣根过氧化物酶/TMB、β-半乳糖苷酶/XGAL和碱/磷酸酯酶/1，2-二氧杂环丁烷。对于包括标记的P1GF结合物质的实施方案，优选的标记包括比色的(例如胶体金)、化学发光的或荧光的标记。
在兽医实践中，检验可以在怀孕期间的任何时间完成，但是优选在怀孕早期在先兆子痫症状发作前完成。考虑到怀孕的分娩期在物种之间变化很大，检验的时间由兽医确定，但是一般对应于人怀孕期间检验的时间。
本文所述的诊断方法可以单个使用，或与任何其它本文所述的诊断方法联合使用，以更准确地诊断先兆子痫或子痫的存在、严重性、或估计发作时间。而且，本文所述的诊断方法可以与任何其它诊断方法联合使用，所述其它诊断方法被确定用于准确诊断先兆子痫或子痫的存在、严重性、或估计发作时间。
本文所述的诊断方法还可以用于监测和控制主体的先兆子痫或子痫。在一个实施例中，如果确定主体具有血清sFlt-1蛋白水平10ng/mL和血清游离P1GF水平100pg/mL，那么可以施用VEGF直至血清P1GF水平升高至约400pg/mL。在这个实施方案中，对sFlt-1、P1GF和VEGF，或这些的任何和所有的水平的重复测定不仅作为诊断疾病的方法，而且作为先兆子痫和子痫治疗和控制的监测方法。如上文所述，在正常的怀孕中在妊娠20周后，尿中P1GF的水平范围200-800pg/ml或200-800pg/mg肌酸酐。在尿样品中P1GF值小于400pg/ml，优选小于200pg/ml或200pg/mg肌酸酐被考虑诊断为先兆子痫或发展先兆子痫倾向。
本发明特征还在于用于检测心血管病症或发展心血管病症倾向的诊断检验。在优选的实施方案中，在具有先兆子痫或子痫历史的妇女中测定sFlt-1水平，并与来自参照样品的sFlt-1水平比较。参照样品优选包括从以前怀孕且没有先兆子痫或子痫历史的妇女获取的样品。与参照样品比较sFlt-1多肽或核酸水平的改变可以被用于诊断心血管病症或预测发展心血管病症倾向。与参考序列比较，在sFlt-1、P1GF或VEGF核酸序列中的改变还可以用于诊断心血管病症或预测发展心血管病症倾向。上述的任何诊断方法和度量可以用于监测有先兆子痫历史的或产后子痫的妇女，或用于诊断心血管病症或预测发展心血管病症倾向。可以在定期基础(例如每月一次、每六个月一次、每年一次、每隔一年一次或更小的频率)上完成产后的监测，以辅助诊断、预测或预防未来的心血管的活动或病症。
诊断试剂盒
本发明还提供诊断测试试剂盒，包括上述完成任一诊断检验必须的成分，和先兆子痫或子痫或发展先兆子痫或子痫倾向诊断成分使用的说明书。例如诊断测试试剂盒可以包括sFlt-1、VEGF或P1GF的抗体，和用于检测，更优选用于评价所述抗体与sFlt-1、VEGF或P1GF多肽之间的结合的成分。对于检测，或者所述抗体或者sFlt-1、VEGF或P1GF多肽是标记的，或者所述抗体或者sFlt-1、VEGF或P1GF多肽是底物结合的，这样sFlt-1、VEGF或P1GF多肽-抗体相互作用可以在抗体与sFlt-1、VEGF或P1GF多肽之间结合后通过测定吸附到底物上标记的量确定。在一个实施例中，所述试剂盒包括P1GF结合物质和用于检测P1GF存在的成分。常规的ELISA或夹心ELSIA是本领域通用的已知的方法，用于检测抗体-底物相互作用，可以由本发明所述试剂盒提供。sFlt-1、VEGF或P1GF多肽事实上可以在任何身体流体包括但不限于尿、血清、血浆、唾液、羊水或脑脊髓的流体中检测。确定sFlt-1、VEGF或P1GF多肽的水平相对于参考例如存在于正常对照中水平改变的试剂盒，可用作本发明方法的诊断试剂盒。试剂盒还可以包括在检验中用作标准的纯化的蛋白，用于检测sFlt-1、VEGF或P1GF的水平。理想地，所述试剂盒将含有用于试剂盒使用的说明书。在一个实施例中，试剂盒含有用于诊断先兆子痫、子痫或发展先兆子痫或子痫倾向的试剂盒使用的说明书。在另一个实施例中，含有用于诊断心血管病症或发展心血管病症倾向的试剂盒使用说明书。在另一个实施例中，试剂盒含有监测治疗处理或剂量方案的试剂盒使用的说明书。
在本发明的一个实施方案中，这样的试剂盒包括用第一物质(例如抗体或识别抗原的蛋白)覆盖的固体载体(例如膜或微滴定板)、用于制备标准曲线的纯化蛋白的标准溶液、用于分析运行质量测试的身体流体(例如血清或尿)对照、与标记或酶(例如辣根过氧化物酶或其它标记)轭合的第二物质(例如对被检测抗原的第二抗原决定部位有活性的第二抗体，或识别第一抗体的抗体或蛋白)、底物溶液、停止溶液、洗涤缓冲液和说明手册。
筛选检验
如上述讨论，Flt-1核酸或多肽的表达在患有先兆子痫、子痫或发展这样病症倾向的主体中增加。基于这些发现，本发明组合物用于候选化合物的高产量低成本筛选，以鉴定可调节sFlt-1、VEGF或P1GF多肽或核酸分子(其表达在患有先兆子痫或子痫的主体中改变)表达的那些化合物。
可以得到许多的用于完成筛选检验的方法，以鉴定改变sFlt-1、VEGF或P1GF核酸分子表达的新候选化合物。在一个有效的实施例中，将候选化合物以各种浓度加入到表达sFlt-1、VEGF或P1GF核酸序列的培养细胞的培养介质中。然后测定基因表达，例如通过微检验分析、RNA印迹分析(Ausubel等，如上)或RT-PCR，使用以核酸分子制备的任何适当的片段作为杂交探针。将在候选化合物存在下基因表达水平与在不存在候选化合物的对照培养介质中测定的水平比较。促进产生某种改变的化合物在本发明中被认为是有用的化合物，所述改变例如在VEGF或P1GF的基因、核酸分子或多肽表达中的增加，或在sFlt-1基因、核酸分子或多肽或其功能等价物表达中的降低；这样的分子可以被用于例如作为治疗剂治疗主体的先兆子痫或子痫。
在另一个有效的实施例中，候选化合物的影响可以在多肽生成的水平被测定，使用相同通用方法和标准免疫学技术例如蛋白质印迹或对sFlt-1、VEGF或P1GF多肽抗体特异性的免疫沉淀。例如免疫检验可以被用于检测或监测在生物中本发明所述多肽中至少一个的表达。能够结合这样多肽的多克隆或单克隆抗体(如上文所述产生的)可以被用在任何标准免疫检验(例如ELISA、蛋白质印迹或RIA检验)模式中，以测定多肽的水平。在一些实施方案中，促进某种改变的化合物被认为特别有用，所述改变例如VEGF或P1GF多肽的表达或生物活性的增加，或sFlt-1多肽表达或生物活性的降低。此外，这样的分子可以被用作例如治疗剂，以延迟、改善或治疗主体的先兆子痫或子痫或先兆子痫或子痫的症状。
在另一个有效的实施例中，可以筛选特异性地与sFlt-1、VEGF或P1GF多肽结合的那些候选化合物。这样候选化合物的效果取决于它与这样的多肽或其功能等价物相互作用的能力。使用许多标准结合技术和功能检验(例如那些Ausubel等描述的，如上)能方便地检验这样的相互作用。在一个实施方案中，候选化合物可以被体外试验其特异性地结合本发明多肽的能力。在另一个实施方案中，候选化合物被试验其通过降低sFlt-1多肽和生长因子例如VEGF或P1GF的结合，降低sFlt-1多肽生物活性的能力。
在另一个有效的实施例中，sFlt-1、VEGF或P1GF核酸表达为与可检测的报道基因转录或翻译的融合，以及在异种的启动子例如可诱导启动子的控制下在分离细胞(例如哺乳动物或昆虫细胞)中表达。然后将表达融合蛋白的细胞与候选化合物接触，将可检测受体在那个细胞中的表达与可检测受体在未处理对照细胞中的表达比较。降低sFlt-1可检测报道基因表达的，或增加VEGF或P1GF可检测报道基因表达的候选化合物为用于治疗先兆子痫或子痫的化合物。在优选的实施方案中，候选化合物改变与核酸融合的报道基因或核酸的表达。
在一个特别有效的实施例中，使用基于色谱法的技术可以鉴定与sFlt-1多肽结合的候选化合物。例如本发明的重组多肽可以通过标准技术从工程化细胞纯化以表达所述多肽(例如上述那些)，并可以被固定在柱子上。然后将候选化合物的溶液通过所述柱子，对sFlt-1多肽具有特异性的化合物以其结合该多肽的能力为基础被鉴定并被固定在柱子上。为了分离该化合物，将柱子洗涤以除去非特异性结合的分子，然后从柱子上释放目标化合物并收集。类似的方法可以用于分离与多肽微分析结合的化合物。通过这种方法(或任何其它适当的方法)分离的化合物可以，如果希望，被进一步纯化(例如被高效液相色谱法)。此外，这些候选化合物可以被试验它们降低sFlt-1多肽活性或增加VEGF信号通路活性的能力(例如本文所述的)。通过这种方法分离的化合物还可以被用于，例如作为治疗剂治疗人类主体的先兆子痫或子痫。被鉴定与本发明多肽结合的化合物具有亲和常数小于或等于10mM的被认为在本发明中特别有用。或者，任何体内蛋白相互作用检测系统，例如，任何二杂化检验可以被用于鉴定化合物或与本发明多肽结合的蛋白。
潜在拮抗剂包括与sFlt-1核酸序列或sFlt-1多肽结合的有机分子、肽、肽模拟物、多肽、核酸和抗体。
sFlt-1 DNA序列还可以被用于发现和开发用于治疗先兆子痫或子痫的治疗化合物。编码的蛋白，依据表达，可以被用作筛选药物的靶标。此外，编码蛋白氨基端的编码DNA序列，或Shine-Delgarno或其它相应mRNA翻译促进序列，可以被用于构建降低sFlt-1编码序列表达的序列。这样的序列可以通过标准技术被分离(Ausubel等，如上)。
任选地，在任何上述检验中鉴定的化合物，可以被确证化合物在以下的检验中有用：降低sFlt-1的生物活性或增加VEGF信号通路的活性。
本发明的小分子优选具有分子量低于2,000道尔顿，更优选在300-1000道尔顿之间，最优选在400-700道尔顿。优选这些小分子为有机分子。
靶向VEGF信号通路的治疗剂
VEGF为有效的内皮细胞专一性的分裂素，刺激血管生成、血管超常渗透性和血管舒张。已经鉴定三个对于VEGF的酪氨酸-激酶信号受体。VEGF-受体结合引发信号级联，结果磷脂酶Cγ1d酪氨酸磷酸化，导致肌醇1，4，5-三磷酸细胞内水平增加，和细胞内钙的增加，激活一氧化氮合成酶产生一氧化氮(NO)。NO形成激活血管平滑肌细胞和内皮细胞中的鸟苷酸环化酶，导致cGMP产生。这种NO/cGMP级联被认为介导了VEGF的舒张活性作用。另一个似乎涉及介导VEGF的舒张活性作用是环前列腺素释放通路。VEGF诱导PGI2产生，通过磷脂酶A2活化，结果引发MAPK级联。
增加的VEGF水平用于治疗先兆子痫和子痫。靶向VEGF信号通路或VEGF信号通路成分，以及增强VEGF信号通路活性的治疗化合物也用于治疗先兆子痫和子痫。这样的化合物包括西地那非、环前列腺素类似物例如依前列醇，Remodulin和波生坦。
试验化合物和提取物
通常，能够降低sFlt-1多肽活性或增加VEGF或P1GF活性的化合物是根据本领域已知的方法从下列的化合物库中鉴定出来的：大型天然产物或合成(或半合成)提取物库、或化学库、或多肽或核酸库。药物发现和开发领域的技术人员了解试验提取物或化合物的准确来源对本发明的筛选方法不是最关键的。用于筛选的化合物可以包括已知化合物(例如已知用于其它疾病或病症的治疗剂)。或者，事实上许多未知的化学提取物或化合物可以使用本文所述的方法被筛选。这样的提取物或化合物的例子包括但不限于基于植物-、真菌-、原核-或动物-的提取物、发酵培养基和合成化合物以及现有化合物的修饰物。许多方法还可获得用于产生许多化学化合物的随机或定向合成(例如半合成或全合成)，包括但不限于基于糖类-、脂肪-、肽-和核酸-化合物。合成化合物库为从Brandon Associates(Merrimack，NH)和AldrichChemical(Milwaukee，WI)商购获得的。或者，以细菌、真菌、植物和动物提取物形式的天然化合物库从许多来源商购获得，所述来源包括Bio tics(Sussex，UK)、Xenova(Slough，UK)、Harbor BranchOceangraphics Institute(Ft.Pierce，FL)和PharmaMar，U.S.A.(Cambridge，MA)。此外，如果需要，根据本领域已知的方法例如标准萃取和分级分离方法制备天然和合成的库。而且，如果需要，使用标准化学的、物理学的或生物化学的方法，任何库或化合物方便被修饰。
此外，在药物发现和开发领域的那些技术人员容易理解，无论何时只要可能就应当采用去除复制(例如分类学消除复制、生物学消除复制、化学消除复制或其任何组合)或消除复制或重复的物质的方法，该物质的molt-disrupting活性已知。
当粗品提取物被发现降低sFlt-1多肽活性或与sFlt-1多肽结合时，进一步分级分离阳性引导的提取物，需要分离对观察到的效应负责的化学成分。因此，提取、分级分离和纯化方法的目标是在粗提取物中仔细表征和鉴定可降低sFlt-1多肽活性的化学实体。这样不同种类提取物的分级分离和纯化方法在本领域是已知的。如果需要，表现出可用作治疗人先兆子痫或子痫的治疗剂的化合物为根据本领域已知的方法被化学修饰的。
治疗剂
本发明特征在于治疗或预防主体先兆子痫或子痫的方法。优选地，治疗剂在怀孕期间施用，以治疗或预防先兆子痫或子痫，或在怀孕后施用，以治疗产后的先兆子痫或子痫。施用的技术和剂量取决于化合物类型(例如化学的化合物、抗体、反义或核酸载体)而变化，这对于本领域技术人员是众所周知的，或容易被确定。
本发明的治疗化合物可以以单位剂量形式与可药用稀释剂、载体或赋形剂一起施用。施用可以为胃肠外、静脉内、皮下、口服或局部被直接注射进入羊水。通过连续输液静脉内输送是施用本发明治疗化合物的优选方法。
组合物用于口服施用的可以为丸剂、片剂、胶囊、液体或持续释放的片剂；或用于静脉内、皮下或胃肠外施用的液体；或用于局部施用的聚合物或其它持续释放介质。
在本领域众所周知的形成剂型的方法可在例如“Remington：TheScience and Practice of Pharmacy”第20版，A.R.Gennaro AR.编辑，2000，Lippincott Williams & Wilkins，Philadelphia，PA)中找到。用于胃肠外施用的剂型例如含有赋形剂、灭菌水、盐水、聚亚烷基乙二醇例如聚乙二醇、植物来源的油或氢化萘。生物适合的、生物可降解的交酯聚合物、交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物可以用于控制化合物的释放。纳米颗粒剂型(例如生物可降解的纳米颗粒、固体脂肪纳米颗粒、脂质体)可以控制化合物的生物分布。其它潜在有用的胃肠外传输系统包括乙烯-乙酸乙烯酯共聚物微粒、等渗泵、可植入输注系统和脂质体。化合物在剂型中的浓度依据许多因素而变化，包括施用的药物剂量和施用途径。
化合物可以任选作为可药用盐施用，例如通常用于药物产业的无毒酸加成盐或金属复合物。酸加成盐的例子包括有机酸例如乙酸、乳酸、双羟萘酸、马来酸、柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸、琥珀酸、苯甲酸、棕榈酸、辛二酸、水杨酸、酒石酸、甲烷磺酸、甲苯磺酸或三氟乙酸等等；多元酸例如鞣酸、羧甲基纤维素等等；和无机酸例如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸等等。金属复合物包括锌、铁等等。
口服使用的剂型包括含有一种或多种活性成分与无毒可药用赋形剂混合的片剂。这些赋形剂可以为例如惰性的稀释剂或填料(例如蔗糖和山梨糖醇)、润滑剂、助流剂和抗粘合物质(例如硬脂酸镁、硬脂酸锌、硬脂酸、硅胶、氢化植物油或滑石粉)。
口服使用的剂型还可以提供为可咀嚼片剂或硬明胶胶囊，其中活性成分与惰性的固体稀释剂混合，或为软明胶胶囊，其中活性成分与水或油介质混合。
施用化合物的剂量和时间选择取决于各种临床因素，包括主体的整体健康状况和先兆子痫症状的严重性。通常，一旦检测到先兆子痫或发展先兆子痫倾向，则连续输注纯化的蛋白用于治疗或预防病症进一步发展。治疗可以连续一段时间，范围1-100天，更优选1-60天和最优选1-20天，或直至怀孕完成。剂量的变化取决于每个化合物和病症的严重性，用滴定法测量得到稳定状态血清浓度范围1-500ng/mLVEGF或P1GF或两者，优选1-100ng/mL，更优选5-50ng/mL和最优选5-10ng/mL VEGF或P1GF或两者。
本文所述的诊断方法还可以用于监测治疗期间的先兆子痫或子痫，或确定治疗化合物的剂量。在一个实施例中，施用治疗化合物，在治疗过程中测定PAAI。如果PAAI小于10，优选小于20，则治疗剂量被认为是有效剂量。
增加VEGF或PIGF蛋白表达的方法
本发明特征在于增加被诊断患有先兆子痫或子痫的主体VEGF和P1GF水平的方法。VEGF或P1GF水平的增加可以使用几种不同的方法获得，除了别的方法以外，所述方法的描述如下。
纯化的蛋白
在本发明优选的实施方案中，为了治疗或预防先兆子痫或子痫，将纯化形式的VEGF或P1GF或两者施用给主体。
纯化的VEGF或VEGF类似的蛋白包括氨基酸序列与VEGF或任何VEGF家族成员的氨基酸序列是同源的，更理想地基本上相同的任何蛋白，其可以诱导血管生成，或能够促进血管内皮细胞或脐带静脉内皮细胞的选择性生长。纯化的VEGF化合物的一个例子是来自Genentech，Inc.(San Francisco，CA)的人重组VEGF-165。另一个例子是来自Scios，Inc(Fremont，CA)的人重组VEGF-121。
纯化的P1GF或PIGF类似的蛋白包括具有的氨基酸序列与P1GF或任何P1GF家族成员的氨基酸序列同源，更理想地基本上相同的任何蛋白，其可以诱导血管生成或能够促进血管内皮细胞或脐带静脉内皮细胞的选择性生长。商购获得纯化的P1GF的例子是来自R&DSystems(目录编号264-PG，R&D Systems，Minneapolis，MN)的人重组P1GF。ThromboGenics Ltd也发展了纯化形式的P1GF用于治疗缺血性发作；推测这种形式的P1GF可以有效用于本发明描述的申请。
增加VEGF或P1GF活性的治疗化合物
本发明提供已知的刺激或增加VEGF或P1GF血清水平或这些多肽生物活性的任何化合物，用于治疗或预防主体的先兆子痫的用途。这些化合物可以被单独使用，或与上述纯化的蛋白或任何其它本文所述的用于增加VEGF或P1GF蛋白水平方法联合使用。
显示出刺激VEGF生成的化合物一个的例子为烟碱。尽管吸烟造成怀孕妇女和发育中胎儿的整体健康的许多危险，烟碱本身被认为比香烟更安全，可以被用于高危主体的短期治疗。例子包括尼古清(尼古丁香糖)，其是SmithKline Beecham制备的非处方烟碱凝胶产品，和NicoDerm CQ，其是Hoechst Marion Roussel Inc.(曾经的MarionMerrell Dow)制备的非处方烟碱贴剂。从烟草中带来的烟碱被特别从本发明方法中排除，其中患者也还没有被本发明方法诊断出来。
在诊断先兆子痫或子痫后，使用贴剂或胶质施用烟碱。剂量变化取决于病症的严重性和主体的整体健康。通常，按照生产者的说明书得到血清烟碱水平范围5-500ng/mL，更优选5-100ng/mL和最优选50-100ng/mL。
茶碱是另外化合物的另一个例子，可以被用于治疗或预防先兆子痫或子痫。茶碱为支气管扩张药，经常用于治疗哮喘，可以以许多商标名(例如Aerolate Sr、Asmalix、Elxophyllin等)或通用名得到。施用方法和剂量随着每个生产者而变化，并基于主体的整体健康和病症的严重性选择。通常。日剂量范围1-500mg，更优选100-400mg和最优选250-350mg，每天给药两次以得到茶碱的血清水平5-50μg/mL。
腺苷是另外化合物的另一个例子，可以被用于治疗或预防先兆子痫或子痫。腺苷(Fujisawa Pharmaceutical Co.)通常被用作抗高血压药物。施用方法和剂量随着每个生产者而变化，并基于主体的整体健康和病症的严重性选择。通常日剂量50mg/kg，典型地对于腺苷每天给药两次。
硝苯地平是另外化合物的另一个例子，可以被用于治疗或预防先兆子痫或子痫。硝苯地平(Bayer Pharmaceuticals)是通常使用的抗高血压的药物。施用方法和剂量随着每个生产者而变化，并基于主体的整体健康和病症的严重性选择。通常日剂量1-2mg/kg，典型地对于硝苯地平每天两次口服或皮下给药。
米诺地尔为另外化合物的另一个例子，可以被用于治疗或预防先兆子痫或子痫。米诺地尔是通常使用的抗高血压的药物。施用方法和剂量随着每个生产者而变化，并基于主体的整体健康和病症的严重性选择。通常日剂量0.25-1.0mg/kg，对于米诺地尔，典型地每天两次口服或皮下给药。
硫酸镁是另外化合物的另一个实施例，可以被用于治疗或预防先兆子痫或子痫。硫酸镁是普通药，典型地用作抗高血压药物。施用方法和剂量随着每个生产者而变化，并基于主体的整体健康和病症的严重性选择。对于硫酸镁的典型剂量通常为日剂量1-2g，静脉内每隔4小时给药。
除化合物能增加血清VEGF或P1GF水平外，本发明提供任何慢性高血压药物与任何VEGF或P1GF导向的化合物联合使用。用于在怀孕期间治疗高血压的药物包括甲基多巴、肼苯哒嗪盐酸盐或拉贝洛尔。对于这些药物中的每一个，施用方式和剂量由临床医生根据生产者的说明书确定。
治疗核酸
最近的工作已经表明将能够表达内皮细胞分裂素例如VEGF的核酸(DNA或RNA)输送到血管损伤的位点将诱导增生和受伤血管再内皮化。尽管本发明不涉及血管损伤，在这些研究中使用的输送编码内皮细胞分裂素例如VEGF和P1GF的核酸的技术也可以在本发明采用。这些技术在美国专利5,830,879和6,258,787中描述，在此引入作为参考。
在本发明中核酸可以为任何核酸(DNA或RNA)，包括编码VEGF或P1GF或任何VEGF或P1GF家族成员的染色体组的DNA、cDNA、和mRNA。所述核酸还可以包括编码显示出与sFlt-1受体结合的蛋白的任何核酸。编码所需蛋白的核酸可以使用本领域常规方法获得，例如重组DNA、PCR扩增。
抑制sFlt-1表达的治疗核酸
本发明特征还在于使用反义核苷碱基寡聚物直接向下调节sFlt-1mRNA的表达。通过与互补核酸序列(有义链或编码链)结合，通过RNA-se H酶催化裂解RNA链，推测反义核苷碱基寡聚物能够抑制蛋白表达。优选的反义核苷碱基寡聚物为能够在sFlt-1水平过量表达的细胞中降低sFlt-1蛋白表达的。相对于用对照寡核苷治疗的细胞，优选sFlt-1蛋白表达降低至少10％，更优选25％和最优选50％或更大。选择和制备反义核苷碱基寡聚物的方法在本领域是众所周知的。使用反义核苷碱基寡聚物向下调节VEGF表达的例子参见美国专利6,410,322，在此引入作为参考。检验蛋白表达水平的方法也是众所周知的，包括蛋白质印迹、免疫沉淀和ELISA。
本发明特征还在于使用RNA干预(RNAi)抑制sFlt-1的表达。RNA干预(RNAi)是最近发现的转录后基因静息(PTGS)的机制，其中将相应于目标基因或mRNA的双链RNA(dsRNA)引入到生物中，导致相应mRNA的降解。在RNAi反应中，dsRNA分子的有义链和反义链两者都被处理为小RNA片段或碎片，长度范围21至23核苷(nt)，具有2-核苷3′尾。或者，合成dsRNAs，其在长度上21至23nt且具有2-核苷3′尾，可以被合成、纯化和在反应中使用。这些21至23nt的dsRNA被称作“引导RNA”或“短干预RNA”(siRNA)。
然后siRNA双链体与包含靶标蛋白的核酸酶复合物结合，破坏在复合物内与siRNA有同源性的内源性mRNAs。尽管在复合物内蛋白的身份仍然是不清楚的，复合物的功能是通过一条siRNA链与内源性的mRNA之间碱基对相互作用靶向同源的mRNA分子。然后mRNA被从siRNA的3′端裂解约12nt并被降解。在这种方式中，特定的基因可以被靶向和降解，因此导致来自靶标基因的蛋白表达降低。
dsRNA的特定要求和修饰在PCT出版物WO01/75164(在此引入作为参考)中描述。尽管dsRNA分子长度可以变化，最优选使用siRNA分子，其为21-至23-核苷的dsRNA，特征为2-至3-核苷3′悬垂端，典型地为(2′-脱氧)胸腺嘧啶核苷或尿嘧啶。siRNA典型地包含3′羟基。还可以使用单链siRNA以及钝头形式的dsRNA。为了进一步增强RNA稳定性，3′悬垂端可以被稳定化对抗降解。在一个这样的实施方案中，RNA为被包括嘌呤核苷例如腺苷或鸟苷稳定化的。或者，用修饰的类似物替代嘧啶核苷，例如用(2′-脱氧)胸苷替代尿苷2-核苷悬垂端是可以容忍的，不影响RNAi的作用。在组织培养介质中，2′羟基的缺乏显著增强悬垂端核酸酶耐受性。
或者siRNA可以使用在PCT出版物WO01/75164(在此引入作为参考)中阐明的任何方法或使用在Elbashir等(Genes & Dev.，15：188-200，2001)中描述的用于体外RNA和dsRNA退火转录操作的标准方法制备。siRNA还可以按照Elbashir等的描述通过dsRNA的培养获取，所述siRNA相应于来自在一定条件下的合胞体胚盘果蝇晶胚的无细胞果蝇裂解物中靶标基因序列，所述条件其中dsRNA被处理以产生约21至约23核苷的siRNA，然后使用本领域已知的那些技术将其分离。例如可以使用凝胶毛细管电泳分离21-23nt RNA，然后从凝胶切片洗脱出RNA。此外，色谱法(例如尺寸排阻色谱法)、甘油梯度离心法和用抗体的亲和性纯化可以被用于分离21至23nt RNAs。
在本发明中，dsRNA或siRNA是对sFlt-1mRNA的mRNA序列互补的，可以减少或抑制sFlt-1的表达。相对于用对照dsRNA或siRNA处理的细胞，优选sFlt-1蛋白的表达降低至少10％，更优选25％和最优选至少50％。检验蛋白表达水平方法在本领域也是众所周知的，包括蛋白质印迹、免疫沉淀和ELISA。
在本发明中，使用的核酸包括任何修饰，其以任何方式增强核酸的稳定性或功能。例子包括对磷酸骨架、核苷酸间键合或对糖部分的修饰。
为简化对编码sFlt-1结合蛋白的核酸操作和处理，优选将核酸嵌入盒子中，在其中可操作与启动子连接。所述启动子必须能够驱动sFlt-1结合蛋白在希望的靶标宿主细胞中表达。适当启动子的选择可以方便地完成。优选使用高表达启动子。合适的启动子的例子为763-碱基对的巨细胞病毒(CMV)启动子。还可以使用劳氏肉瘤病毒(Davis等，Hum.Gene Ther.4：151-159，1993)和小鼠乳腺癌病毒(MMTV)启动子。某些蛋白可以使用它们的天然启动子表达。还可以包括能增强表达的其它元素(例如导致转移活化基因(tat)和tar元素高水平表达的增强子或系统)。重组载体可以为质粒载体，例如pUC118、pBR322或其它已知的质粒载体，包括例如复制的大肠杆菌(E.coli)来源的(参见Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory press，1989)。质粒载体还可以包括可选择标志物，例如产生氨苄西林耐药性的内酰胺酶基因，条件是标志物多肽对被处理的生物代谢无不利的影响。盒子在合成传输系统中还可以与核酸结合部分结合，例如在PCT出版物WO95/22618中公开的系统。
通过适合载体采用的任何方式核酸可以被引入到细胞中。许多这样的方法在本领域是众所周知的(Sambrook等，如上和Watson等，“重组DNA”，第12章，第2版，Scientific American Books，1992)。通过许多方法重组载体可以被转移，所述方法例如磷酸钙沉淀、电穿孔、脂质体介导的转染、基因枪、显微注射、病毒衣壳介导的转移、聚凝胺介导的转移或原生质体融合。关于脂质体制备、靶向和内容输送方法的综述参见Mannino和Gould-Fogerite(Bio Techniques，6：682-690，1988)，Felgner和Holm，(Bethesda Res.Lab.Focus，11：21，1989)和Maurer(Bethesda Res.Lab.Focus，11：25，1989)。
通过直接注射到羊水中或静脉内输送，可以完成重组载体(质粒载体或病毒载体)的转移。
基因输送还可以使用腺病毒载体或腺体相关的载体(AAV)。腺病毒存在于许多动物种类，不是非常致病的，在分隔(dividing)细胞和静止细胞中都可以复制的很好。作为通用规则，用于基因输送的腺病毒缺少一个或多个病毒复制要求的基因。复制缺陷重组腺病毒载体用于输送VEGF、P1GF或任何sFlt-1结合蛋白，可以根据本领域已知的技术制备(参见Quantin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：2581-2584，1992；Stratford-Perricadet等，J.Clin.Invest.，90：626-630，1992；和Rosenfeld等，Cell，68：143-155，1992)。在子宫内使用基因治疗的例子参见美国专利6,399,585。
对于将dsRNA或寡核苷转染或引入哺乳动物细胞有多种方法可以获得。例如存在几种可商购获得的转染试剂包括但不限于TransIT-TKOTM(Mirus，目录号MIR 2150)，TransmessengerTM(Qiagen，目录号301525)和OligofectamineTM(Invitrogen，目录号MIR12252-011)。每个转染试剂的使用方案从生产者处得到。
一旦转移，核酸在损伤位点被细胞表达一段时间足以增加血清中VEGF、P1GF或任何其它sFlt-1结合蛋白的水平。因为含有核酸的载体不正常地引入到细胞的染色体组中，目标蛋白的表达仅仅在有限的时间进行。典型地，蛋白在治疗水平表达约两天至几周，优选约一至二周。DNA的再利用(Re-application)可以被用于提供治疗蛋白另外的表达时期。使用VEGF治疗哺乳动物血管疾病基因治疗的最近例子可以在Deodato等(Gene ther.，9：777-785，2002)；Isner等(HumanGene Ther.，12：1593-1594，2001)；Lai等(Gene Ther.，9：804-813，2002)；和在Freedman和Isner(Ann.Intern.Med.，136：54-71，2002)和Isner JM(Nature，415：234-239，2002)的综述中发现。
基因和蛋白表达的检验
下列方法可以用于评价蛋白或基因表达，以及确定如上提到的增加VEGF、P1GF或任何其它sFlt-1结合蛋白水平或降低sFlt-1蛋白水平的任何方法的效果。
测定来自主体的血清中VEGF、P1GF或任何已知与sFlt-1结合蛋白配体的水平。用于测定血清蛋白水平的方法包括ELISA、蛋白质印迹或使用特定抗体的免疫检验。此外，使用体外血管生成检验可以确定生物活性，以确定主体的血是否已经从抗血管生成状态转化为致血管生成状态。这样的检验在上述实施例2中描述。
来自主体的血清样品还可以VEGF、P1GF或sFlt-1核酸水平测量。有几种本领域已知的方法用于检验基因表达。一些例子包括来自主体血液样品RNA的制剂和将RNA用于RNA印迹、基于PCR的扩增或RNAse保护检验。
用于治疗性治疗抗体的使用
在来自患有先兆子痫的怀孕妇女血清样品中发现sFlt-1水平的升高，表示sFlt-1发挥着“生理接受器”的作用，其结合和耗尽滋养层细胞和母亲内皮细胞中有功能的VEGF和P1GF。结合sFlt-1并阻断VEGF或P1GF结合的化合物例如抗体的使用，通过引起游离VEGF或P1GF的增加可以帮助预防或治疗先兆子痫或子痫。这样的增加为胎盘发育和胎儿营养要求的滋养层增生、迁移和血管生成的增加以及全身的母亲内皮细胞健康做好了准备。
本发明提供与sFlt-1配体结合功能域特异性地结合的抗体。抗体被用于抑制sFlt-1，最有效的机制认为是通过直接阻断VEGF或P1GF的结合位点，但是不能排除其它机制。用于治疗目的抗体的制备和使用方法在几个专利包括美国专利6,054,297；5,821,337；6,365,157；和6,165,464中描述，所述专利在此引入作为参考。抗体可以为多克隆或单克隆的；优选单克隆抗体。
单克隆抗体，特别地那些来自啮齿动物包括小鼠，已经被用于治疗各种的疾病；但是它们的使用存在局限性包括诱导人抗小鼠免疫球蛋白响应，其导致快速清除和降低治疗效果。例如啮齿动物单克隆抗体临床使用的主要局限性是治疗期间的抗球蛋白响应(Miller等，Blood，62：988-995，1983；Schroff等，Cancer Res.，45：879-885，1985)。
本领域技术已经通过构建其中动物抗原结合的可变功能域与人常数功能域偶合的“嵌合”抗体尝试克服这种困难(美国专利4,816,567；Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6851-6855，1984；Boulianne等，Nature，312：643-646，1984；Neuberger等，Nature，314：268-270，1985)。这样的嵌合抗体的制备和使用描述如下。
竞争性抑制与sFlt-1结合的配体用于预防或治疗先兆子痫或子痫。导向sFlt-1的抗体能阻断VEGF或P1GF与sFlt-1的结合，导致VEGF或P1GF水平的增加。这样的增加可以导致对内皮功能障碍的救助，致血管生成/抗血管生成因子的平衡向血管生成迁移。
本发明单克隆抗体的鸡尾酒疗法可用作先兆子痫或子痫的有效治疗。鸡尾酒疗法包括少至二、三或四个不同抗体或多至六、八或十个不同抗体。此外，本发明的抗体可以与抗高血压药物(例如甲基多巴、肼苯哒嗪盐酸盐或拉贝洛尔)或任何其它用于治疗先兆子痫、子痫或先兆子痫或子痫伴随症状的药物联合使用。
抗体的制备
特异性地与sFlt-1受体结合的单克隆抗体可以通过本领域已知的方法产生。这些方法包括Kohler和Milstein(Nature，256：495-497，1975)和Campbell(“Monoclonal Antibody Technology，The Productionand Characterization of Rodent and Human Hybridornas”在Burdon等编辑，Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology，第13卷，Elsevier Science Publishers，Amsterdam，1985)描述的免疫学方法，以及Huse等(Science，246，1275-1281，1989)描述的重组DNA方法。
单克隆抗体可以从培养杂交瘤细胞的上清液中或从杂种细胞接种到小鼠腹膜内诱导的腹水中制备。最初由Kohler和Milstein描述(Easy.J.Imnzuhol，6，511-519，1976)的杂交瘤细胞技术已经广泛应用于制备杂种细胞系，杂种细胞系分泌对抗许多特定抗原的高水平单克隆抗体。
对宿主动物或来自动物培养产生抗体的细胞的免疫途径和时间表通常与确立的和常规的抗体刺激和生成技术一致。典型地小鼠用作试验模型，但是，任何哺乳动物主体包括人主体或来自人的抗体产生细胞能根据本发明的方法操作，用作哺乳动物包括人杂种细胞系制备的基础。
在免疫后，免疫淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合产生杂种细胞系，其可被培养并无限转种，以产生大量的单克隆抗体。用于本发明的目的，选择用于融合的免疫淋巴细胞为取自被免疫动物的淋巴节组织或脾组织的淋巴细胞和它们的正常分化后裔。优选使用脾细胞，由于它们提供对于小鼠系统更浓和更方便的产生抗体细胞的来源。骨髓瘤细胞提供用于融合杂种连续繁殖的基础。骨髓瘤细胞是来自血浆细胞的肿瘤细胞。鼠科动物骨髓瘤细胞系可以例如从美国典型培养库(AmericanType Culture Collection(ATCC；Manassas，VA))获得。人骨髓瘤和小鼠-人杂种骨髓瘤细胞系还曾经在(Kozbor等，J.Immunol.，133：3001-3005，1984；Brodeur等，Monoclonal Antibody ProductionTechniques and Applications，Marcel Dekker，Inc.，New York，51-63页1987)中描述。
杂种细胞系可以在体外细胞培养介质中保存。一旦杂种细胞细胞系建立起来，它可以保存在各种营养充分的介质例如次黄嘌呤-氨喋呤-胸腺嘧啶脱氧核苷(HAT)介质中。而且杂种细胞系可以以许多常规的方式保存和储藏，包括在液氮下冷冻和保存。冷冻细胞系可以复活和无限培养并重新合成和分泌单克隆抗体。分泌的抗体用常规的方法例如沉淀、离子交换色谱法、亲和色谱法等从组织培养上清液回收。
抗体可以在任何哺乳动物包括小鼠、大鼠、兔子、山羊和人中制备。抗体可以为下列免疫球蛋白种类成员之一：IgG、IgM、IgA、IgD或IgE和其亚类，优选为IgG抗体。
尽管优选产生单克隆抗体的动物为小鼠，本发明不这样限制；事实上，人抗体可以使用并被证明是优选的。这样的抗体可以通过使用人杂交瘤细胞获得(Cole等，″Monoclonal Antibodies and CancerTherapy″，Alan R.Liss Inc.，77-96页，1985)。在本发明中，发展用于制备嵌合抗体的技术可以使用，通过将来自小鼠的有适当抗原特异性的抗体分子的基因与来自人抗体分子的基因一起拼接(Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.81，6851-6855，1984；Neuberger等，Nature312，604-608，1984；Takeda等，Nature 314，452-454，1985)；这样的抗体在本发明范围之内，描述如下。
另一个可选的细胞融合技术，Epstien-Barr病毒(EBV)无限增殖化(immortalized)B细胞被用于产生本发明的单克隆抗体(CrawfordD等，J.of Gen.Virol.，64：697-700，1983；Kozbor和Roder，J.Immunol.，4：1275-1280，1981；Kozbor等，Methods in Enzymology，121：120-140，1986)。通常该方法包括从合适的来源一般在感染的细胞系中分离Epstein-Barr病毒，将靶标抗体分泌细胞暴露于含有病毒的上清液。洗涤细胞并在适当的细胞培养介质中培养。随后，存在于细胞培养中的病毒转化的细胞可以通过Epstein-Barr病毒核抗原的存在鉴定，转化的抗体分泌细胞可以使用本领域已知的标准方法鉴定。产生单克隆抗体的其它方法例如重组DNA也包括在本发明范围之内。
sFlt-1免疫原的制备
sFlt-1自身可以被用作免疫原，或可以附在载体蛋白或其它目标例如琼脂糖凝胶球上。sFlt-1可以从已知表达内源性蛋白的细胞例如人脐静脉内皮细胞中纯化得到(HUVEC；Kendall等，Biochem.Biophys.Res.Comm.，226：324-328，1996)。此外，使用标准重组DNA技术，编码sFlt-1或其部分的核酸分子可以嵌入用于在宿主细胞表达的已知载体中。sFlt-1表达的合适宿主细胞包括杆状病毒细胞(例如Sf9细胞)、细菌细胞(例如大肠杆菌(E.coli))和哺乳动物细胞(例如NIH3T3细胞)。
此外，肽可以被合成并用作免疫原。制备肽的抗体的方法在本领域是众所周知的，一般要求将肽与合适的载体分子例如血清白蛋白偶合。肽包括与sFlt-1氨基酸序列的任何部分基本上相同的任何氨基酸序列，sFlt-1氨基酸序列对应于GenBank编号U01134。肽可以为任何长度，优选10个氨基酸或更大，更优选25个氨基酸或更大，最优选的40、50、60、70、80或100个氨基酸或更大。优选所述氨基酸序列与U01134序列相同率至少60％，更优选85％，且最优选95％。肽可以为商购获取的，或使用本领域众所周知的技术制备，例如Merrifield固相方法(Science，232：341-347，1985)。该方法可以使用商购获得的合成仪例如Biosearth 9500自动化肽机器，使用氟化氢完成封闭氨基酸的裂解，通过制备HPLC使用Waters Delta Prep 3000仪器在15-20μmVydac C4 PrepPAK柱纯化肽。
抗体的功能等价物
本发明还包括在说明书中描述的抗体的功能等价物。功能等价物包括氨基酸序列与本发明抗体的可变或超变区域的氨基酸序列基本上相同的多肽。功能等价物具有与那些抗体可比的结合特征，包括例如嵌合的、人化的和单链抗体以及其片段。制备这样功能等价物的方法例如在PCT出版物WO93/21319；欧洲专利申请239,400；PCT出版物WO89/09622；欧洲专利申请338,745；欧洲专利申请332424和美国专利No.4,816,567中公开，其中每个均在此引入作为参考。
嵌合的抗体优选具有基本上或全部衍生自人抗体恒定域的恒定域和基本上或全部衍生自不是人类的其它哺乳动物可变的区域序列的可变区域。这样的人化抗体为嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(例如Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2或抗体的其它抗原结合亚序列)，其含有最少衍生自非人类免疫球蛋白的序列。人化非人类抗体的方法在本领域是众所周知的(综述参见Vaswani和Hamilton，Ann AllergyAsthma Immunol.，81：105-119，1998和Carter，Nature Reviews Cancer，1：118-129，2001)。一般说来，人化抗体具有从非人类来源引入它的一个或多个氨基酸残基。这些非人类氨基酸残基时常称作引入的残基，其典型地从可变的功能域引入。按照本领域已知的方法可以基本上完成人化(Jones等，Nature，321：522-525，1986；Riechmann等，Nature，332：323-329，1988；和Verhoeyen等，Science，239：1534-1536，1988)，通过将啮齿动物的CDR或其它CDR序列替换为人抗体相应的序列。因此这样的人化抗体为嵌合抗体，其中基本上小于完整人的可变功能域被来自非人类种属相应的序列取代(参见例如美国专利4,816,567)。实际上，人化抗体典型地为人的抗体，其中一些CDR残基和可能的一些FR残基被来自啮齿动物抗体类似位点的残基取代(Presta，Curer.Op.Struct.Biol.，2：593-596，1992)。
制备人化抗体另外的方法可以在美国专利5,821,337和6,054,297和Carter(如上)中发现，其全部在此引入作为参考。人化抗体选自任何类的免疫球蛋白包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE和任何同种型，包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在细胞毒活性不需要之处，例如在本发明，恒定域优选为IgG2类的。人化抗体可以包含来自超过一类或同种型的序列，选择特定恒定域以最优化所需的效应子功能在本领域普通技术人员技能之内。
还可以使用本领域已知的各种技术产生人抗体，包括噬菌体展示库(Marks等，J.Mol.Biol.，222：581-597，1991和Winter等，Annu.Rev.Immunol.，12：433-455，1994)。Cole等和Boerner等的技术也用于制备人单克隆抗体(Cole等，如上；Boerner等，J-Immunol.，147：86-95，1991)。
合适的非人哺乳动物包括单克隆抗体可以制备的任何哺乳动物。非人哺乳动物的例子包括例如兔子、大鼠、小鼠、马、山羊或灵长类；优选小鼠。
抗体的功能等价物还包括单链抗体片段，也称作单链抗体(scFvs)。单链抗体片段为典型地结合抗原或受体的重组多肽；这些片段含有抗体可变重链氨基酸序列(VH)的至少一个片段连接于抗体可变轻链序列(VL)的至少一个片段，带有或不带有一个或多个相互连接的连接基团。这样连接基团可选择短的柔性的肽，以确保VL和VH功能域合适的三维折叠在它们连接时发生，这样可以保持整个抗体的靶标分子结合特异性，所述抗体为单链抗体片段从中衍生的抗体。一般说来，VL或VH序列的羧基端通过这样的肽连接基团共价连接于互补VL和VH序列的氨基酸端。单链抗体片段通过分子克隆、抗体噬菌体展示库或类似的技术产生。这些蛋白可以在真核细胞或原核细胞包括细菌中产生。
单链抗体片段含有的氨基酸序列中具有在说明书中描述的整个抗体的至少一个可变的区域或CDR，但是缺乏那些抗体的一些或所有的恒定域。这些恒定域对于抗原结合不必是需的，但是组成整个抗体结构的大部分。因此单链抗体片段克服了含有部分或所有恒定域的抗体使用中伴随的一些问题。例如单链抗体片段倾向于避免生物分子和重链常数区间不良反应，或其它不需要的生物活性。此外，单链抗体片段比整个抗体显著更小，因此比整个抗体具有更大的毛细血管渗透性，使得单链抗体片段更有效地定位和与靶标抗原结合位点结合。而且，抗体片段在原核细胞可以相对大量地产生，因此促进了它们的生产。因此，单链抗体片段的相对小的大小使它们比整个抗体更小可能引起接受者的免疫响应。
功能等价物进一步包括具有与整个抗体相同的或可比的结合特征的抗体片段。这样的片段可以含有Fab片段或F(ab′)2片段中的一个或两个。优选抗体片段含有整个抗体所有的六个CDR，尽管含有少于所有这样的区域例如三个、四个或五个CDRs的片段也是有功能的。
而且，功能等价物可以为或者可以组合下列免疫球蛋白种类任何一个成员：IgG、IgM、IgA、IgD或IgE及其亚类。
抗体功能等价物的制备
抗体等价物通过本领域已知的方法制备。例如抗体片段可以从整个抗体酶催化制备。优选抗体等价物从编码这样等价物的DNA制备。编码抗体片段的DNA可以通过缺失除编码全长抗体的所需的DNA部分之外的所有来制备。
编码嵌合抗体的DNA可以通过基本上或全部编码人恒定域的DNA和基本上或全部来自非人哺乳动物可变区域序列编码可变区域的DNA重组制备。编码人化抗体的DNA可以通过将编码恒定域和不是CDR(基本上或全部来自相应的人抗体区域)的可变区域的DNA与编码基本上或全部来自非人哺乳动物的CDR的DNA重组。
编码抗体片段的DNA分子的合适来源包括细胞例如表达全长度抗体的杂交瘤细胞。片段可以被它们本身用作抗体等价物，或可以如上文所述重新组合为等价物。
在这部分描述的DNA缺失和重组可以通过已知的方法完成，例如那些如上所列的发表的专利申请中描述的。
抗体筛选和选择
使用本领域标准已知的方法分离和纯化单克隆抗体。例如，使用本领域标准已知的方法例如对抗sFlt-1肽抗原的ELISA或蛋白质印迹分析可以筛选抗体。这样技术的非限制实施例在美国专利6,365,157的实施例II和III中描述，本文将其引入作为参考。
抗体的治疗用途
当体内用于治疗或预防先兆子痫或子痫时，将本发明的抗体以治疗有效量施用给主体。优选抗体被肠外施用或静脉内连续输注。剂量和剂量方案取决于疾病的严重性和主体的整体健康。施用抗体的量典型地范围为约0.001至约10mg/kg主体重量，优选0.01至约5mg/kg主体重量。
对于胃肠外施用，抗体与可药用胃肠外介质结合被配制为单位剂量可注射的形式(溶液、混悬剂、乳剂)。这样的介质本身无毒和无治疗作用。这样介质的例子为水、盐水、Ringer溶液、葡萄糖溶液和5％人血清白蛋白。非水溶液介质还可以使用例如不易发挥的油和油酸乙酯。脂质体可以用作载体。介质可以含有少量的添加剂例如增强等张作用和化学稳定性的物质，例如缓冲剂和防腐剂。抗体典型地在这样的介质中配置为浓度约1mg/ml至10mg/ml。
抑制sFlt-1的治疗化合物
鉴于sFlt-1的水平在患有先兆子痫、子痫或具有发展这样病症的倾向的主体中是增加的，降低sFlt-1多肽或核酸分子表达的任何物质在本发明的方法是有用的。这样的物质包括可以破坏sFlt-1与VEGF或P1GF结合的小分子、反义核苷碱基寡聚物和用于介导RNA干预的dsRNA。
联合治疗
任选地，先兆子痫或子痫治疗可以与任何其它标准先兆子痫或子痫疗法联合施用；这样的方法对于技术人员是已知的并在本文描述。本发明先兆子痫或子痫治疗可以与增加VEGF通路活性的任何化合物联合施用。诱导内源性VEGF产生的物质的非限制性例子还包括烟碱、米诺地尔、nifidepine、腺苷、硫酸镁和茶碱。在一个实施方案中，P1GF蛋白可以与任何如上所列的诱导内源性VEGF产生的物质联合使用。
主体监测
有先兆子痫、子痫或倾向于发展这样的病症的主体的疾病状态或治疗可以使用本发明的方法和组合物监测。在一个实施方案中，存在于身体流体例如尿、血浆、羊水或CSF中的sFlt-1、VEGF或P1GF多肽表达被监测。这样的监测可以用于例如评价特定药物在主体中的疗效或评价疾病进展。降低sFlt-1核酸分子或多肽表达或增加VEGF或P1GF核酸分子或多肽表达的治疗剂在本发明中被认为特别有用。
其它实施方案
从上述的描述中，显然对本文所述的发明可以做出变化和修饰以使其适应于各种用途和条件。这样的实施方案也在下列权利要求范围之内。
所有在说明书中提及的出版物在此以同样的程度引入作为参考，如同每个独立的出版物或专利出版物是特定地和单独地被显示引入作为参考。此外，美国专利申请出版号2004-0126828和PCT出版物WO2004/008946A2在此以其全部内容引入作为参考。

Claims (66)

1.监测主体先兆子痫或子痫治疗的方法，包含测定在来自所述主体的样品中sFlt-1、VEGF或P1GF多肽的水平。
2.权利要求1的方法，其中所述水平的测定在两次或更多次时机完成，在所述测定之间所述水平的变化为先兆子痫或子痫的指示。
3.权利要求1的方法，进一步包含将所述水平与先兆子痫参照比较，其中sFlt-1水平相对于所述的先兆子痫参照的降低显示所述主体的所述先兆子痫或子痫的好转。
4.权利要求1的方法，进一步包含将所述水平与先兆子痫参照比较，其中VEGF或P1GF的水平相对于所述的先兆子痫参照的增加显示所述主体的所述先兆子痫或子痫的好转。
5.权利要求1的方法，其中所述的监测用于确定化合物的治疗剂量。
6.权利要求5的方法，其中所述化合物在一定剂量施用以使sFlt-1的水平在所述的主体中小于2ng/ml。
7.权利要求1的方法，其中所述的测定使用免疫学检验完成。
8.权利要求1的方法，其中sFlt-1的水平为游离、结合或总sFlt-1的水平。
9.权利要求1的方法，其中sFlt-1水平为被降解或酶催化裂解的sFlt-1多肽的多肽副产物的水平。
10.监测主体先兆子痫或子痫治疗的方法，包含测定来自所述主体的样品中sFlt-1、VEGF和P1GF多肽中至少两个的水平，并使用度量计算所述水平之间的相互关系。
11.权利要求10的方法，其中所述的度量为先兆子痫抗血管生成指数(PAAI)：[sFlt-1/VEGF+P1GF]。
12.权利要求11的方法，其中PAAI值小于20显示所述先兆子痫或子痫的好转。
13.权利要求12的方法，其中PAAI值小于10显示所述先兆子痫或子痫的好转。
14.权利要求11的方法，其中所述的PAAI用于确定治疗化合物的剂量.
15.权利要求14的方法，其中治疗化合物以一定剂量施用以使在施用所述化合物治疗后PAAI小于20。
16.权利要求15的方法，其中治疗化合物以一定剂量施用以使在施用所述化合物治疗后PAAI小于10。
17.权利要求10的方法，其中所述的测定使用免疫学检验完成。
18.权利要求10的方法，其中所述sFlt-1的水平为游离、结合或总sFlt-1的水平。
19.权利要求10的方法，其中所述sFlt-1水平为被降解或酶催化裂解的sFlt-1多肽的多肽副产物的水平。
20.权利要求10的方法，其中所述VEGF或P1GF的水平为游离VEGF或P1GF的水平。
21.权利要求10的方法，其中sFlt-1多肽水平相对于先兆子痫参照的降低显示所述先兆子痫或子痫的好转。
22.权利要求10的方法，其中游离VEGF多肽水平相对于先兆子痫参照的增加显示所述先兆子痫或子痫的好转。
23.权利要求10的方法，其中游离P1GF多肽水平相对于先兆子痫参照的增加显示所述先兆子痫或子痫的好转。
24.权利要求10的方法，其中所述水平的测定在两次或更多次时机完成，多次测定之间所述水平的变化为先兆子痫或子痫的诊断指示。
25.监测主体先兆子痫或子痫治疗的方法，包含测定在来自所述主体的样品中sFlt-1、VEGF或P1GF核酸分子的水平并与参照的所述水平比较，其中相对于所述的参照样品在所述水平中的改变诊断所述的主体患有先兆子痫或子痫。
26.权利要求25的方法，其中当VEGF的水平被测定时，则sFlt-1或P1GF的水平也被测定。
27.权利要求25的方法，其中sFlt-1核酸水平相对于先兆子痫参照的降低显示所述先兆子痫或子痫的好转。
28.权利要求25的方法，其中VEGF核酸水平相对于先兆子痫参照的增加显示所述先兆子痫或子痫的好转。
29.权利要求25的方法，其中P1GF核酸水平相对于先兆子痫参照的增加显示所述先兆子痫或子痫的好转。
30.权利要求25的方法，其中所述水平的测定在两次或更多次时机完成，多次测定之间所述水平的变化为先兆子痫或子痫的诊断指示。
31.诊断主体患有先兆子痫或子痫或具有发展先兆子痫或子痫倾向的方法，所述的方法包含测定来自所述主体的尿样品中游离P1GF的水平。
32.权利要求31的方法，其中在中期妊娠或晚期妊娠测定的所述尿样品中游离P1GF的水平小于400pg/ml为先兆子痫或子痫或发展先兆子痫或子痫倾向的诊断指示。
33.权利要求31的方法，其中在中期妊娠或晚期妊娠测定的所述尿样品中游离P1GF的水平小于200pg/mg肌酸酐为先兆子痫或子痫或发展先兆子痫或子痫倾向的诊断指示。
34.权利要求31的方法，进一步包含将来自所述主体的所述游离P1GF水平与来自参照样品的P1GF水平比较。
35.权利要求34的方法，其中所述的参照样品为取自所述主体以前的样品。
36.权利要求34的方法，其中所述的参照样品为取自怀孕但是不患有先兆子痫或子痫或发展先兆子痫或子痫倾向的主体的样品。
37.权利要求34的方法，其中来自所述主体的所述游离P1GF与所述的参照样品比较的降低为先兆子痫或子痫或发展先兆子痫或子痫倾向的诊断指示。
38.权利要求37的方法，其中所述的降低为来自所述主体的所述游离P1GF与所述的参照样品比较至少10％的降低。
39.权利要求31的方法，进一步包含：
(a)测定在来自所述主体样品中的sFlt-1、P1GF和VEGF多肽至少之一的水平，其中所述样品为选自下列的身体流体：尿、血、羊水、血清、血浆或脑脊髓的流体；和
(b)将来自所述主体的所述sFlt-1、P1GF或VEGF的水平与在参照样品中sFlt-1、P1GF或VEGF多肽的水平比较，其中在来自所述的主体样品与所述的参照样品比较中所述sFlt-1水平的增加或所述的VEGF或P1GF多肽水平的降低为先兆子痫或子痫或发展先兆子痫或子痫倾向的诊断指示。
40.权利要求39的方法，其中测定来自所述主体血清样品的sFlt-1水平。
41.权利要求39的方法，其中测定来自所述的主体血清样品中sFlt-1和P1GF的水平。
42.权利要求39的方法，进一步包含使用度量计算来自步骤(a)的sFlt-1、VEGF和P1GF中至少一种的所述的水平之间的关系，其中在主体样品中所述的水平之间的关系相对于参照样品的改变，诊断所述的主体患有先兆子痫或子痫或发展先兆子痫或子痫倾向。
43.权利要求42的方法，其中所述的度量为先兆子痫抗血管生成指数(PAAI)：[sFlt-1/VEGF+P1GF]。
44.权利要求43的方法，其中PAAI值大于20为先兆子痫或子痫的诊断指示。
45.权利要求31的方法，其中所述的测定使用免疫学检验完成。
46.权利要求45的方法，其中所述的免疫学检验是ELISA。
47.诊断主体患有先兆子痫或子痫或具有发展先兆子痫或子痫倾向的方法，所述的方法包含
(a)从所述的主体获取尿样品；
(b)用固体载体接触所述的样品，其中所述的固体载体包含固定的第一P1GF结合物质，保持一段时间足以使所述的第一P1GF结合物质与存在于所述的样品中的游离P1GF结合；
(c)在步骤(b)后用第二标记的P1GF结合物质接触所述的固体载体，保持一段时间足以使所述的第二标记的P1GF结合物质与所述的第一固定的P1GF结合物质结合的所述的游离P1GF结合；
(d)观察所述的第二标记的P1GF结合物质与结合游离P1GF的固定的P1GF结合物质在P1GF结合物质被固定的位置的结合；和
(e)比较在步骤(d)中观察到的结合与使用参照样品观察到的结合。
48.权利要求47的方法，其中所述的参照样品为浓度400至800pg/ml的重组P1GF，在步骤(d)中观察到的结合与在步骤(e)中使用参照样品观察到的结合比较的降低是先兆子痫或子痫或发展先兆子痫或子痫倾向的诊断指示。
49.权利要求47的方法，其中标记为比色的标记。
50.权利要求47的方法，其中所述结合P1GF的物质是抗体或其纯化的片段或肽。
51.权利要求50的方法，其中所述的抗体或其片段特异性地结合游离P1GF.
52.权利要求47的方法，其中所述的结合P1GF结合物质的物质选自下列：抗免疫球蛋白抗体、蛋白A和蛋白G.。
53.诊断主体患有先兆子痫或子痫或具有发展先兆子痫或子痫倾向的方法，所述的方法包含：
(a)从所述主体获取尿样品；
(b)用固体载体与所述样品接触，其中所述固体载体包含被可检测标记的固定的P1GF结合物质，其中所述的接触保持一段时间足以使所述的第一P1GF结合物质与所述的样品中的游离P1GF结合；和
(c)测定与所述的游离P1GF结合的所述标记的P1GF结合物质，其中所述的测定能够区分所述的结合和未结合的P1GF结合物质。
54.权利要求53的方法，其中所述的标记为荧光标记。
55.权利要求47或53的方法，其中所述的固体载体为膜。
56.权利要求47或53的方法，其中所述主体为非怀孕的人，所述方法诊断发展先兆子痫或子痫倾向。
57.权利要求47或53的方法，其中所述主体为怀孕的人。
58.权利要求47或53的方法，进一步包含在来自所述主体的身体流体样品中测定sFlt-1、P1GF或VEGF核酸或多肽的水平。
59.权利要求58的方法，其中所述的sFlt-1多肽的水平在来自所述主体的血清样品中测定。
60.权利要求47或53的方法，其中所述水平的测定在两次或更多次时机完成，在所述测定之间所述水平的变化为先兆子痫或子痫的指示。
61.诊断主体先兆子痫或子痫的试剂盒，包含用于检测游离P1GF多肽的P1GF结合物质及其使用说明书，用于诊断主体先兆子痫或子痫或发展先兆子痫或子痫倾向。
62.权利要求61的试剂盒，进一步包含用于免疫学检验、酶学检验、荧光极化检验或比色检验的成分。
63.权利要求61的试剂盒，其中所述的P1GF结合物质被固定在膜上。
64.权利要求63的试剂盒，其中所述的膜被支持在浸渍片结构上，通过将浸渍片结构放入样品中样品被沉积到膜上。
65.权利要求63的试剂盒，其中所述膜被支持在侧流盒子中，通过在盒子中的开口样品被沉积到膜上。
66.权利要求61的试剂盒，其中所述的试剂盒用于在治疗期间监测所述的主体。
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