CN1748144A - 用于对基本球形代谢粒子的个体代谢率的非侵入的测量装置及方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于对基本球形代谢粒子如胚胎的代谢速率的非侵入及非干扰的测量方法及装置，及涉及在该胚胎水平上控制氧分压的方法和装置。此外，本发明涉及用于调节向基本球形代谢粒子供应代谢物的方法，及用于选择有预定品质的基本球形代谢粒子的方法。本发明在一个装置中实施，该装置能够在装置中的隔室内的基本球形代谢粒子和隔室外的环境之间建立代谢物扩散梯度。基于代谢物扩散梯度的信息而确定代谢速率。

Description

用于对基本球形代谢粒子的个体代谢率的非侵入的测量装置及方法

技术领域

本发明涉及用于对基本球形代谢粒子的代谢率的非侵入及非干扰测量装置及方法，以及用于在该粒子的水平上控制代谢物的浓度的方法及装置。

背景技术

使用胚胎移植(ET)技术，如IVF(试管受精)及相关技术，涉及在重新植入被选胚胎前，在试管内培养一段时间要培育的胚胎。即使在理想的生长条件下，也需要作为工具的选择标准来选择用于重新植入的最能生存的胚胎。为了决定适于转移的胚胎，胚胎的存活能力是一个重要的参数。目前，没有在实际水平上可应用的客观手段，其适于评价随着操作的胚胎的存活能力。在实践中，胚胎的评估被限制在基于形态标准的多少有些主观的评分上。

胚胎的呼吸速率可能证明是客观存活能力指标的好的候选者。以前已经证明，牛、鼠和人的胚胎的呼吸速率(以氧消耗表示)是胚胎存活能力的有效指标(看Shiko等人2001  “通过电化学显微扫描检测的单一牛胚胎的氧消耗”，分析化学73：3751-3758；或Trimarchi等人2000年“个体的植入前鼠胚胎的依赖及独立于氧消耗的氧化磷酸化”，繁殖生物学62：1866-1874；或Overstrom EW等人1992“牛胚泡的存活能力及氧化代谢”，“动物生殖学”37(1)：269；或Magnusson C等人1986“试管内生长的人卵母细胞及胚泡的氧消耗”，人类繁殖1：183-184)。这些研究显示，特定的(高的)呼吸速率和改善的发育如改善的试管内发育(以提高的胚泡频率表示)或提高的妊娠频率有关。

已知许多用于确定胚胎呼吸的方法。Mills和Brinster(看Mills和Brinster1967“重新植入前鼠胚胎的氧消耗”，Exp.Cell.Res.47：337-344)描述了一种对一组鼠胚胎使用笛卡儿潜水员(diver)技术的方法，该方法测量了与胚胎培养基直接接触的氧气泡的体积的改变。

Magnusson等人1986(在试管中培育的人的卵母细胞和胚球的氧消耗，人类繁殖1：183-184)及后来Houghton等人1996(“早期鼠胚胎的氧消耗及能量代谢”，细胞繁殖及生长，44：476-485)描述了使用灵敏的显微分光技术而能够测量个体胚胎的氧消耗的方法，其中胚胎放置在小的密封室里并以氧气分压的下降估计氧消耗，以其光学吸收对氧存在敏感的物质的吸收的改变监测氧消耗。由于大量将胚胎搬进和搬出密封室，测量耗费时间又打扰胚胎。

已经描述另一技术，其中胚胎固定在薄毛细管上而用非常精确定位的振荡氧微电极在假定是球形扩散下测量氧浓度梯度(看Shiko等人2001“通过扫描电化学显微方法检测单个牛胚胎的氧消耗”，分析化学73：3751-3758，或Trimarchi JR等人2000“个体的植入前鼠胚胎的依赖及独立于氧消耗的氧化磷酸化”，繁殖生物学62：1866-1874；)。这些技术的特征是苛求操作的比较复杂的实验设计，并导致对胚胎的显著的干扰。此外，完成测量较耗费时间并且需要满足对该方法的假定。

大体上，测量个体胚胎呼吸的上面提到的研究及相关研究遭受复杂、干扰胚胎及耗费时间的损害，因此不太可能这样的方法会被常规应用到用于监测在试管内培养基中的胚胎的个体呼吸速率。因此仍然存在对用于测量作为胚胎存活率的量度的个体胚胎呼吸速率的，快速、简单及无干扰的方法和装置的需要。涉及胚胎的试管培育的研究人员及专业人员普遍表达了这种需要。Overstom 1996(看Overstrm EW 1996“胚胎存活率的试管中评估”，动物生殖学45：3-16)在一个文献的回顾中汇集了对简单及客观的用于确定作为胚胎存活率的表现的个体胚胎呼吸的方法的要求。当试管胚胎技术成为高度复杂，包括ICSI(细胞质内精子注入)，克隆及冷冻周期，预计这一要求会变得更显著。在人类不育治疗中，专注于单胚胎移植以避免不想要的其是多胚胎移植的结果的多胞胎怀孕已经变得必要。然而，为了能够选择选择最好的胚胎并因此提高成功怀孕的可能性，单胚胎移植要求严格的存活能力评估，其再次强调对在常规水平上可应用的简单及客观存活指标的需要。新的方法应最好包括下面的如Overstrm 1996年概括的(看“胚胎存活能力的试管中评估”，动物生殖学45：3-16 1996)的关键要素。

-对多个个体胚胎的进行同时的客观测量的能力。

-测量个体胚胎的灵敏度和分辨率。

-快速的评估(～30分钟或更少)。

-存活能力测试必须非扰乱并理想地非侵入的。

-技术上简单及使用者易使用的。

-能承担得起的。

除了表达出来的对用于在常规水平上可应用的呼吸测量的方法和装置的需求，胚胎的试管内培育遭受如在培育胚胎中经历的氧分压控制不足的损害。胚胎的试管内培育经常是在有规定大气(温度、相对湿度及气体组成)的孵育器中进行。大气空气包括21％氧气(210hPa分压)，但在试管内(输卵管和子宫)氧压力被认为是约5-10％氧(50-100hPa)饱和。因此并不奇怪，一般来说，胚胎发育在5-10％大气下比在空气下更好。Lim等人和Thompson等人(看：Lim等人1999“在5％CO₂的空气中或5％O₂、5％CO₂及90％N₂中的牛胚胎试管内的发育”，人的生殖7(4)：558-562；或Thompson JGE等人1990“氧浓度对植入前羊及牛胚胎的试管内发育的影响”，J.Reprod.Fert 89，573-578)和其他人先前展示了在哺乳动物胚胎发育中减小氧分压的积极效果。因此在一些情况中胚胎是在减小氧的大气中例如5％饱和中培育的。然而，通过单独控制在培养基上的大气来控制胚胎对氧的暴露是不充分的。当开始试管内培育时培养基典型地是氧饱和的(21％)，而在培养基和覆盖气体大气之间的平衡周期时间，依赖于该试管内培育系统，可以长达12-24小时，以致胚胎会在试管内培育的相当时间中经受明显超过目前认为是最优(5-10％)的氧分压。然而由于稳定状态氧分压梯度从大块的培养基向胚胎，作为胚胎呼吸的结果而上升，在胚胎表面的最后的稳定状态氧分压会低于在上述大气例如5％中的。

因此仍然存在对调节如在试管内培育期间培育胚胎时经历的氧分压的，简单及快速(＜1h)的方法的需要。

在本申请中引用的所有专利及非专利的参考资料，此处也在其整体上并入参考。

发明内容

本发明涉及适于用于对基本球形代谢粒子的代谢速率的容易且快速地测量的装置。因此，本发明涉及对基本球形代谢粒子的个体代谢速率的非侵入测量的装置，该装置包括

a)至少一个隔室，所述隔室由扩散隔障确定并能够包括有基本球形代谢粒子的培养基，所述扩散隔障允许代谢物经由扩散向及/或从基本球形代谢粒子迁移，由此使得能建立从基本球形代谢粒子并贯穿培养基的代谢物扩散梯度，

b)至少一个用于测量在隔室内的代谢物的浓度的检测器。

该装置适于既用于测量代谢粒子的代谢速率，也用于监测粒子及选择指定情形的粒子。因而，本发明还涉及用于测定基本球形代谢粒子的代谢速率的非侵入方法，包括

a)提供至少一个如上面定义的装置，

b)在一个隔室的培养基中设置基本球形代谢粒子，

c)测量在隔室中的代谢物浓度得到代谢物浓度的量，及

d)将所述代谢物浓度的量与所述基本球形代谢粒子的代谢速率联系起来。

以及本发明还涉及一种用于在培育期间调节对基本球形代谢粒子的代谢物供应的方法，包括

a)提供至少一个包括具有培养基的隔室的装置，

b)在一个隔室的培养基中培育基本球形代谢粒子，并任选地

c)测量在隔室中的代谢物浓度得到代谢物浓度的量，并任选地

d)将所述代谢物浓度的量与所述基本球形代谢粒子的代谢速率联系起来并任选地

e)依赖于代谢物浓度的量及/或所述基本球形代谢粒子的代谢速率调节代谢物供应。

在另一方面本发明涉及用于选择有存活力的胚胎，包括，

a)在培育中至少一次测定出该胚胎的代谢速率，及

b)选择具有最优代谢速率的胚胎。

本发明尤其适于用于确定在与环境连通的开放系统中的粒子的代谢速率。然而，根据本发明的装置也可用于在封闭系统中的代谢速率。

因此，在又一方面本发明涉及用于测定代谢粒子的代谢速率的非侵入方法，包括

a)提供至少一个如上面定义的装置，

b)在一个隔室的培养基中培育代谢粒子，

c)在培育的至少部分期间中减少对培养基的代谢物供应，

d)在减少了代谢物供应后测量在隔室中的代谢物浓度得到代谢物浓度的量，及

e)将所述代谢物浓度的量与所述基本球形代谢粒子的代谢速率联系起来。

此外，本发明涉及最优化的培育装置，所述装置包括至少一个隔室，所述隔室由扩散隔障确定并能包括具有基本球形代谢粒子的培养基，所述扩散隔障允许经由扩散的向及/或从基本球形代谢物的迁移，由此使得能建立从基本球形代谢粒子并贯穿培养基的代谢物扩散梯度。

在再一方面本发明涉及用于培育如这里定义的粒子的方法，包括

a)提供至少一个包括具有培养基的隔室的装置，

b)在一个隔室的培养基中培育基本球形代谢粒子，并任选地

c)调节向及/或从所述基本球形代谢粒子的代谢物供应。

附图说明

对在附图上的附图标记的解释：每个附图标记包括以x.x形式的两个数字，其中第一个数字指附图号而第二个数字指在每个附图上的说明，如这样：

x.1指：代谢粒子

x.2指：周围培养基

x.3指：检测器

x.4指：代谢物可渗透扩散隔障

x.5指：代谢物基本无法渗透的隔室壁

x.6指：能支持代谢粒子的代谢物可渗透层

x.7指：隔室朝向隔室外面周围的开口

x.8指：理论代谢物浓度梯度

x.9指：根据图1的在实施例中的插入物

x.10指：隔室的可调节底部

x.11指：浓度梯度等高线

x.12指：CCD照相机

x.13指：覆盖培养基以防止蒸发及湍流的粘性层

x.14指：插入端口(仅图7)

x.15指：间隔物(仅图9和10)

x.16指：支撑结构

x.17指：可调节顶部(仅图16)

x.18指：线

图1是根据本发明，在底部具有氧检测器的扩散隔室的第一实施例的横截面；理论上的稳定态氧梯度在旁边的图中示出。在此情形中的可渗透扩散隔障是培养基的停滞体。

图2是在根据图1的实施例的具有插入物的隔室的横截面，该插入物调节第一实施例的内部的横向尺寸。

图3是本发明包括具有可调节底部的扩散隔室的另一实施例的横截面。

图4是在圆筒形扩散隔室中测量的稳定态氧梯度的例子，其中在底部培育胚胎。在图4中的梯度的直线部分对应在图1中的理论图示的线的实线的一段。x轴的单位是hPa而y轴单位是μm。关于梯度的隔室的开口(X.7)的位置用垂直线标记。

图5是所述扩散隔室的另一个实施例，其中该扩散隔室完全打开而在胚胎周围二维记录氧梯度。5B示出在胚胎水平面处底部的横截面。5C示出如从CCD照相机处看到的假想图像(顶视图或底视图)，其中期望的在每个个体胚胎周围的发光体的发光强度为灰度色调显现。

图6A是如图5显示的对朝向胚胎沿平的打开的隔室的底部的稳定态氧梯度的测量的例子。图6B是示出实际梯度与理论上的理想球形梯度配合情况的图表。如果该图示是直的，则满足球形扩散系统的假定。

图7(设计范例)设计使横向部分形成的象吸液管，用它从转移容器中拾取被研究的代谢粒子。吸液管柱塞的特殊之处在于它具有气体检测器。在已经拾取呼吸粒子后，吸液管转动使尖头向上并通过端口插入到中介容器的底部。该中介容器随后被注满培养基。吸液管的管筒作为隔室的侧壁。

图8(设计范例)对横向部分的设计为，代谢粒子被放置在一个平板的浅井中。该井具有一个可渗透代谢物的有变动厚度因而具有变动代谢物传输能力的盖，通过水平位移该盖可用不同部分覆盖该井。因而通过放置盖的不同部分在井的直接上方可调节在培养基和环境之间的扩散隔障。在此图中，在井外面的培养基是小滴的形式，但也可以是更大块的形式。

图9(设计范例)对横向部分的设计为，代谢粒子被放置在一个不渗透盘下靠近检测器。该盘包括基本不渗透的隔室壁的上部，由间隔物支撑以保持与基本不渗透的隔室壁的下部的一个已定好的距离。用阴影线示出该间隔物以显示出它们仅占盘下的一小部分并不会对扩散构成明显的阻碍。其中放置代谢粒子的浅井在盘下中心定位。通过改变支撑基本不渗透隔室壁的上壁(盖)的间隔物的高度可调节可渗透扩散隔障的渗透性。

图10(设计范例)对横向部分的设计为，呼吸粒子放置在不渗透板的锥形模槽中。检测器设置在靠近锥形的尖端处，且一个锥形的不渗透盖放置在该模槽。间隔物确保在该盖和模槽之间保持定好的距离。

图11(设计范例)对横向部分的设计为，隔室包括穿过放置在不渗透板(11.5)的不渗透材料块(11.5)的空腔(11.4)。该空腔基本是圆筒形(或多面体)并充满培养基，但在靠近面向板的端部可以是空的以形成对代谢粒子(11.1)的容器。发光体(11.3)放置在延伸的空腔中靠近底板(11.5)。

图12(设计范例)具有部分敞开盖(可调节)的凹陷部。检测器形态为在代谢粒子下的平面，例如发光体片。

图13(设计范例)具有中央孔(不可调节的)的凹陷部。

图14(设计范例)立方体，其中代谢粒子落入该立方体中并通过转动立方体让代谢粒子经由重力落出而取回代谢粒子。具有两个开口使得可施加水流穿过立方体而将呼吸粒子冲出。

图15(设计范例)端部有漏斗的弯曲毛细管。检测器形态为在毛细管内的两个圆形区域，例如一层发光体。通过改变在支撑物上的毛细管的位置可以调节呼吸粒子的位置及因而，扩散隔障的长度，由于该位置会决定在毛细管中代谢粒子在重力下能移动到的最低点的位置。

图16(设计范例)在转盘机构中的可调节底部。该特殊实施例提供又一容量可调节的隔室，使得通过改变该层的厚度而因此改变渗透系数，能调节可渗透扩散隔障的渗透性，该扩散隔障在此例中为培养基的停滞部分。通过顺时针转动16.17，由此经由线16.18使16.17移向包含周围培养基16.2的大井的底部，可减小可渗透层的厚度。由于隔室的底部相对于大井的底部固定，这引起隔室容量的下降并因此可渗透层的厚度的下降，而因此增大的渗透性。检测器从隔室的底部向包含周围培养基的大井的底部延伸，在那里它可与记录单元达到接触。

图17(设计范例)具有凹陷的板。该实施例包括一个板，其具有几个例如500-3000μm深的适宜角为30(例如15-60度)的锥形凹陷，其放置在另一个具有亲水表面的凹陷中。板表面的剩余部分是亲水的。具有适当体积10-20μl的一滴17.2填充两个凹陷并形成可渗透扩散隔障。一层在该滴上的合适的油防止该滴蒸发及该滴内部的对流，使得用于实际目的培养基的主体保持为停滞。可选择的，在锥形凹陷外的体积构成周围培养基并且不是被特定地包括在可渗透扩散隔障中，除非它用于其他目的而保持停滞。通过应用不同角度或深度的锥形凹陷(隔室)可以调节扩散隔障的渗透性，并且根据例4中的等式可以计算特别是锥形的隔室的渗透性。

图18：用于测量在图11中示出的及例6(Skorstens范例)中描述的机构中的鼠胚胎的呼吸速率。原始荧光数据。分别使用360nm和550nm的激发光及在Tecan Spectraflour荧光板读出器中记录650nm的发射光，记录下从氧可熄灭卟啉荧光团(在聚苯乙烯中的铂(II)-8乙基卟啉)，与孵育室中的培养基接触的荧光强度。激发后从0-500μs记录荧光。

图19：用于测量在图11中示出的及例6(Skorstens范例)中描述的机构中的鼠胚胎的呼吸速率。测得的氧浓度的已校正数据。使用修正的Stern-Volmer方程将荧光强度转变为氧分压，该方程根据Klimant等人1995(“纤维光学氧微传感器，一种在水生生物学中的新工具”，湖泊学及海洋学40：1159-1165)充分描述了大多数optrode的反应。

图20：使用如例7中描述的使用图17中的设计的氧微传感器完成测量用于鼠胚胎的呼吸速率。

定义

测量电流的氧传感器：克拉克型电化学传感器，具有针对着内部基准极化的金阴极，氧在阴极表面上被还原。电流计将引起的电流转变为信号。

隔室的底部：在当前的上下文中名词“隔室的底部”意味着隔室的该部分比起基本球形代谢粒子设置在更远离任何代谢物可渗透的开口。“底”并不必然指在基本球形代谢粒子下方的垂直位置，而可以是隔室与开口相反的一侧。

大块培养基：在隔室外面周围或与代谢粒子离开一段距离的培养基以致粒子的代谢不影响大块培养基的代谢物浓度。

扩散：由此液体、气体或固体粒子作为由热扰动引起的随机分子运动的结果而混合的过程，导致溶解的物质从较高浓度区域向较低浓度区域的净转移。

扩散隔障：在当前的上下文中名词“扩散隔障”既指的是限制代谢物向代谢粒子的扩散流动的不可渗透材料，也是通过其粒子接受的代谢物经过分子扩散可通过的可渗透材料。在一些情形中它也可能指可渗透材料和不可渗透材料拥有的体积和特定几何形状。在一个优选实施例中扩散隔障包括由不可渗透壁限制的一个或更多充满培养基的开口，但它也可以包含其他可渗透材料如硅树脂或其他聚合物(请看上文)。如果代谢物采用的从大块培养基到代谢粒子的扩散路径经过一个受限制的区域，该区域具有减小的横截面及/或减小的渗透性如2中的插入物或图8中的盖，那么这一区域是专门限制该面积的积分流量。它因而包括最大和最急剧的代谢物浓度梯度而该装置的这一部分因此经常被提作“扩散隔障”。

扩散隔室：具有朝向外部环境的确定开口的有确定内部尺寸的空间或隔室。在扩散隔室内的液基材料是停滞的，主要由于在液体与隔室壁之间的摩擦力。在本发明的装置和方法中扩散隔室也被称作“隔室”。

不可渗透材料：在当前的上下文中名词“不可渗透材料”或“基本不可渗透材料”指一种和水相比对讨论的代谢物具有显著减少的渗透性的材料，优选的和水相比对讨论的代谢物的渗透性减少到＜1％，更优选的和水相比对讨论的代谢物的渗透性减少到＜0.2％或＜0.05％，使得通过此材料到代谢物体的面积积分流量比通过可渗透材料(例如开口、可渗透的膜及/或扩散隔障)的流量要低很多。通过不可渗透或基本不可渗透材料的面积积分流量应为到代谢粒子的总面积积分流量的＜10％，优选为＜1％或最优选＜0.01％。

发光：光线的产生。在本发明的上下文中由于发光体吸收光线并随后在发射较长波长的光线后返回基态而出现发光。依赖于衰变的类型和寿命这一过程经常被提作荧光或磷光。

培养基：用于胚胎的液体生长物质，如一种液体生长物质，优选为液体生长物质。

薄膜入口质谱分析法(MIMS)：一种用于测量氧及其他溶解的气体的技术，基于装备有可透过气体膜的管，连接到质谱仪的入口。由于管内的真空(由质谱仪施加的)，气体通过可透过气体膜进入质谱仪。随后质谱仪确定所选择的气体的浓度。

代谢物：在当前上下文中名词“代谢物”指或者是被代谢粒子吸收或者是被代谢粒子释放的化合物。代谢物的例子包括氧、二氧化碳、氨基酸、葡萄糖、离子象Ca⁺⁺离子和H₃O⁺离子。

代谢速率：代谢粒子消耗或释放讨论的代谢物的速率。该代谢速率既依赖于讨论的代谢物也依赖于生物体的活动水平。

新陈代谢：在当前上下文中名词“新陈代谢”指吸收和释放代谢物的过程。优选的新陈代谢的代谢物是通过呼吸吸入和消耗的氧。

代谢物可渗透开口：在当前上下文中在隔室中的“代谢物可渗透开口”可以是既可用作标示开放开口(即只包含培养基)也表示被遮盖的开口。后者是这样的情况即开口被可渗透材料如膜(例如硅树脂层)覆盖而构成扩散隔障，该扩散隔障比隔室的其他壁有更强的渗透性。

代谢粒子：在当前上下文中名词“代谢粒子”指在一段时间内吸收或释放代谢物的粒子。代谢粒子的优选类型是呼吸粒子其通过呼吸消耗氧。该代谢粒子优选是一个细胞或一组细胞，然而代谢粒子也可以是消耗氧的合成粒子。

显微分光技术：一种基于对在435nm处的吸收的增大或减小而测量氧的技术，反映归因于氧分压中的下降或增高的氧基血红素的离解。可以使用具有其他吸收特性的其他氧结合分子。

非侵入方法：一种方法，其无任何破坏性的干扰，或不需要穿过皮肤或身体洞口插入器械或设备而能够测量关于相关身体的参数。

光学氧检测：一种测量原理，基于氧作为发光体的动态发光熄灭剂的能力。发光体被定义波长激发，而发光指示剂发出作为氧浓度的函数的光。这一过程经常被提作荧光或磷光。由于熄灭作用发光的亮度和衰减时间在氧存在下以可预测的方式下降。二维的光学氧检测可基于发光寿命成像，其在一些场合中优于发光亮度成像。

氧分压：氧作为单独成分会施加的压力。总的气体压力是单独气体压力的和。在正常大气环境下总的实际气体压力接近一个标准大气压(atm)或1000hPa。空气氧分压近似为21％或210hPa。氧浓度C等于氧分压P乘以氧溶解度S，(C＝PS)，其中溶解度S是温度、盐度及总气压的函数。

呼吸速率：大多数活的生物体，包括发育中的胚胎，通过称作呼吸的过程，在它们的能量代谢中消耗氧。一个呼吸生物体的氧消耗速率也被叫做呼吸速率。先前已确定人的胚胎的呼吸速率在0.34-0.53nl O₂/每胚胎*小时的范围，但胚胎呼吸速率在从卵母细胞经过桑椹胚到胚泡阶段期间可以相当大地变化(看MagnussonC等人1986，“试管中培育的人卵母细胞及胚泡的氧消耗”，人类生殖1：183-184)。牛胚胎典型具有在1-8nl O₂/每胚胎*小时范围中的呼吸速率。

响应时间：从开始测量到获得足够用于测量的响应或信号的时间，并可以认为该测量是成功的。

停滞液体：没有任何流动、扰动或移动的液体。溶解物质的传输主要通过扩散发生。

稳定态：一种情形其中消耗和传输在平衡中使得气体分压或溶解物质的浓度梯度是稳定的并随着时间的过去不发生分压或浓度的改变。

基本球形代谢粒子：在当前上下文中名词“基本球形粒子”指一个代谢粒子或一组代谢粒子，其中该组排列为形成大体为球形或椭圆体或方形物体，象一组细胞，例如多细胞胚胎。

具体实施方式

本发明涉及确定基本球形代谢粒子的代谢速率。为了不打扰粒子，优选的非侵入地确定代谢速率。本发明基于发现即可能通过测量在小体积的该粒子的环境中的预定代谢物的浓度而快速而非侵入地确定代谢速率，如果该环境构建为仅允许所述代谢物扩散到粒子或从粒子扩散。通过这样的结构在环境中逐渐出现预定代谢物的扩散梯度并通过测量在扩散梯度的仅一个位置处的预定代谢物的浓度，知道在环境外的浓度，可能计算出在粒子位置的代谢物浓度并由此确定粒子的代谢速率。

本发明涉及基本球形代谢粒子。该相关于本发明的代谢粒子包括原核或真核细胞或一组这样的细胞，然而代谢粒子也可以是消耗氧的合成粒子。粒子的一种优选类型是胚胎、细胞团例如癌细胞、干细胞、胚胎干细胞、处于生命阶段具有适当尺寸和代谢速率的小的多细胞生物体(即卵、胚胎或一些更大生物体的组织样品)，例如Caenorhabditis elegans(克氏病原)、Dictyostelium discoideum(网柱原虫)、Drosophila melanogaster(黑腹果蝇)、Xenopus laevis(有爪蟾蜍)、Arabidopsis thaliana(阿布属…)、Danio reri(鲤科鱼…)、Chlamydomonas reinhardtii(短杆菌肽)、Aplysia californica(锎发育不全)。最优选的粒子包括哺乳动物胚胎，如人、牛或鼠的胚胎。

被这种粒子吸收或被它们释放的代谢物通过如例4中概括的分子扩散而补充或去除。本发明的该装置包括具有其中放置基本球形代谢粒子的隔室的装置。该隔室包括安排在代谢粒子周围以限制和减少到和从该粒子的代谢物的扩散流量的可渗透和不可渗透材料。如果基本球形代谢粒子设置在其中代谢物的补充和去除是不受阻碍的通过具有适度代谢速率的有效的球形扩散进行的环境中，那么仅对接近呼吸粒子的很小的体积这些代谢物的浓度被轻微影响。然而如果该粒子放置在限制代谢物的扩散再供应或去除的隔室中，可以检测到在隔室内这些代谢物的浓度的可测量的改变。该包括本发明的装置通过不可渗透(或基本不可渗透)表面通过限制代谢物通过分子扩散而通过的量能完成这一点。这些表面(或壁)不是完全包围该代谢粒子，而是留出一个可渗透开口，经由该开口代谢物通过扩散而通过。可渗透开口可以充满培养基或另一种可渗透材料。可渗透和不可渗透材料在代谢粒子周围的空间安排构成扩散隔障。它用于三个目的：1)限制代谢物的流量使得可以用检测器测量与大块浓度间的局部偏差。2)它使得基于该偏差的数量能够确定代谢粒子的代谢速率。3)它限制或消除了代谢物通过紊流向代谢粒子的传输。扩散隔障的后面的目的实现通常是通过限制培养基在表面之间，其安置的如此相互接近使得液体不能被表面之间的紊流混合。在例5中展示了对装置和扩散隔障的许多不同的可能的设计的例子。在例4中展示了不同设计所导致的理论浓度梯度。在例1和例6中展示了源自具有圆柱形凹陷的隔室的实验数据，而在例7或例3中展示了有胚胎放置在不可渗透表面有或没有凹陷的情形的实验数据。

扩散理论在例4中提出，基于下面的文献：Crank J 1997，“扩散数学”牛津大学出版社。

如果由基本球形代谢粒子的新陈代谢导致的隔室中的梯度特性，不能被充分描述，或者隔室的内部尺寸没有被确定好，可以使用已知代谢物的摄取及/或释放的人造基本球形代谢粒子校准该装置。用于校准的人造基本球形代谢粒子可以是具有相关基本球形代谢粒子的直径的小球形粒子，例如由氧消耗材料(抗氧化剂)制成的尺寸50-200μm的人造胚胎，象维生素C、E、A、类胡萝卜素、硒、钛氯化物、连二亚硫酸盐、硫化铁，其嵌入到稳定的辅助化合物如淀粉中，或涂覆在惰性球形体象玻璃珠上。

在隔室内的代谢物浓度梯度未处于稳定态并仍在逐渐显现的情况下，该情况可以是在基本球形代谢粒子刚被放置在隔室中后不久的情况，可以仍然通过检测在隔室内每时间单位中代谢物浓度梯度的改变确定代谢速率。换句话说稳定态梯度是从一系列随时间过去的非稳定态梯度的数学模型化的。

代谢物

根据本发明测量的代谢物可以是任何相关的代谢物，其或者被基本球形代谢粒子吸收或被从所述粒子中释放。代谢物的例子如上面描述的在定义中的。在一个实施例中代谢物是气体，例如氧，其可被通过下面描述的集中方法监测，或该代谢物是二氧化碳，其检测方法也在下面描述。

因而，在一个优选实施例中本发明涉及通过测量氧及/或二氧化碳的气体分压确定基本球形代谢粒子的呼吸速率。

隔室

如上所述本发明是基于确定要测量的代谢物的扩散梯度，即在基本球形代谢粒子周围的物理条件允许确定扩散梯度，至少在测量代谢速率的相关时间段内。

基本球形代谢粒子被放置及/或培育在具有预定尺寸的隔室中。隔室优选包括包含基本球形代谢粒子的相关代谢物的培养基。此外，最好隔室与隔室外面连通而允许代谢物经由扩散进入隔室及培养基。由此有可能在较长时间内使用该隔室培育基本球形代谢粒子，而在确定代谢速率时不必移动基本球形代谢粒子。然而，当确定代谢速率时将基本球形代谢粒子移到隔室而随后再移出隔室，是在本发明的范围内。

为了确定能够确定扩散梯度的条件，隔室可被扩散隔障定义并可以包括培养基，所述扩散隔障允许代谢物通过扩散到及/或从基本球形代谢粒子的传输，由此使得能够确定从基本球形代谢粒子并贯穿培养基的代谢物扩散梯度。

隔室为基本球形代谢粒子建立了一个本地环境，允许仅通过扩散至少一种代谢物被传输到及/或从基本球形代谢粒子。

在隔室内围绕基本球形代谢粒子的培养基应优选为保持停滞，使得溶解在培养基中的物质传输仅通过扩散发生。在隔室外的大块培养基不是必须是停滞的。停滞如上面所定义。

此外，隔室应被设计为使得内部的培养基保持停滞，并另外使得相关于要确定代谢速率的基本球形代谢粒子，控制预定代谢物向隔室的传输。

停滞

相关于胚胎的呼吸速率可以解释停滞的培养基的重要性：当胚胎在隔室内的停滞的培养基中，邻近胚胎的氧分压由于胚胎对氧的消耗，比起隔室外面的氧分压会减小。在稳定态情形中，氧的供应等于消耗而朝向胚胎的氧分压梯度是稳定的。从扩散空间的开口或与胚胎离一定距离，朝向胚胎的梯度的陡度因而是胚胎氧消耗(呼吸)的量度。通过确定在隔室内一个位置的氧分压或者浓度可测量胚胎的呼吸速率。一次测量足以用于确定在上述情况下的呼吸速率。

隔室设计及材料

可以以几种方式设计隔室，下面讨论其范例。

以下讨论隔室的两种不同原则，然而任何类型的隔室其能够允许确定扩散梯度的都落入本发明范围内。

该两个不同原则是：

●由围绕空间的壁制成隔室

●制作隔室并填充粘性材料使得至少一种代谢物可受控扩散。

这样，关于第一个原则隔室可由至少一个构成隔室外边界的壁确定并能够保存培养基和基本球形代谢粒子。该壁优选对要测量的粒子为不可渗透的。在选择聚合物或共聚物来构成提供基本不可渗透扩散隔障的材料的情形中，它应该具有相对于填充在隔室中的培养基更低的渗透性的特征。如果壁是可渗透的，壁材料具有相对于填充在隔室中的培养基更低的渗透性的特征就有很大的重要性。

当象这样的壁是对要测量的代谢物基本不可渗透的，该壁必须具有包括至少一个允许所述代谢物到基本球形代谢粒子的传输的开口。这样的开口可以是对周围环境完全开放的或者它可以是被膜部分或全部覆盖的，其中所述膜允许代谢物到及/或从隔室内的传输。

围绕代谢物体的扩散范围的隔障材料(不可渗透部分)应拥有限制代谢物或物质大体上穿过它们的边界的通行的能力。因而，隔室壁可以由任何建议限制所述代谢物经由其边界通过的合适的材料制成。塑料、复合材料、涂料、层压材料、织物、金属、玻璃、陶瓷、聚合物如缩醛树脂、丙烯酸树脂、纤维素塑料、氟塑料、离聚物、聚对二甲苯基、聚酰胺、聚酰胺纳米合成物、聚碳酸酯、聚酯、聚酰亚胺、聚烯烃、硫化聚苯、聚砜、聚苯乙烯树脂、乙烯树脂、可塑合金、多组分聚合物、环氧树脂、石蜡热塑弹性体、聚醚嵌段氨化物、聚丁二烯热塑弹性体、苯乙烯热塑弹性体、乙烯热塑弹性体、橡胶材料如丁二烯橡胶、丁基橡胶、溴丁基橡胶、氯丁基橡胶、聚异丁烯橡胶、氯硫化聚乙烯橡胶、环氧氯丙烷橡胶、乙烯-丙稀橡胶、氟橡胶、天然橡胶、氯丁橡胶、丁腈橡胶、聚硫橡胶、聚氨酯橡胶、硅橡胶、苯乙烯-丁二烯橡胶、是可用于获得基本不可渗透隔障层的例子。

材料的渗透性是在对渗透剂越过隔障的质量传输的一般方程中的比例常数。

$Q=\frac{\mathrm{\Δmgas}}{\mathrm{\Δt}}=P\frac{\mathrm{A\Δp}}{\mathrm{\λ}}$

其中，P是材料/隔障的渗透性，Q＝Δmgas/Δt面积积分流量即传输速率，A是面积，I是厚度而Δp是跨越隔障的分压差。P具有尺寸

[P]＝(渗透剂的量*隔障厚度)(面积*时间*压力梯度)

如上面定义的名词渗透性最经常用在气体上，而对其他溶解代谢物所最经常用的名词是扩散性(看例4)。在这种情况中

$Q=J\·F=D\frac{\mathrm{A\ΔC}}{\mathrm{\λ}}$

气体的扩散传输可以被任一组方程描述，因为渗透性P是扩散系数D和溶解度S的乘积(即P＝S*D)，其中溶解度定义为浓度和分压的比(即S＝C/p)。扩散系数的常见单位是cm²/s。

渗透性和扩散系数两者都被温度影响。作为第一级近似两者都约略地遵循经典的阿列纽斯关系随温度增长。

停滞的水性培养基在37℃具有对氧的近似6700cm³mm/(m²天大气压)的渗透性。

在代谢物氧的情况下，可渗透材料可以定义为一种材料其具有最多40cm³mm/(m²天大气压)23℃的渗透性，例如最多35cm³mm/(m²天大气压)23℃的渗透性，例如最多30cm³mm/(m²天大气压)23℃的渗透性，例如最多25cm³mm/(m²天大气压)23℃的渗透性，例如最多20cm³mm/(m²天大气压)23℃的渗透性，例如最多15cm³mm/(m²天大气压)23℃的渗透性，例如最多10cm³mm/(m²天大气压)23℃的渗透性，例如最多5cm³mm/(m²天大气压)23℃的渗透性，例如最多2cm³mm/(m²天大气压)23℃的渗透性，例如最多1cm³mm/(m²天大气压)23℃的渗透性。

选择塑料/聚合物的氧渗透性的例子是：

苯乙烯-丙烯腈共聚物SAN(P＝15-40cm³mm/(m²天大气压)24℃)

丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物ABS(P＝39.3cm³mm/(m²天大气压)25℃)

聚氯乙烯

聚丁烯对酞酸盐PBT(P＝15.5cm³mm/(m²天大气压))

聚苯硫醚PPS(P＝11.8cm³mm/(m²天大气压))

聚酰亚胺(P＝10cm³mm/(m²天大气压))

聚环己烯二亚甲基(poly cyclo hexylene dimethylene)乙烯对酞酸盐PETG(P＝9.97cm³mm/(m²天大气压)22.8℃)

聚偏二氟乙烯PVDF(P＝1.96cm³mm/(m²天大气压))

聚对苯二甲酸乙二醇酯PET(P＝2.4cm³mm/(m²天大气压))

聚乙烯萘二甲酸酯PEN(P＝0.525cm³mm/(m²天大气压))

尼龙/聚酰胺(P＝0.4-1.5cm³mm/(m²天大气压)

液晶聚合物LCP(P＝0.037cm³mm/(m²天大气压)23℃)

乙烯-乙烯醇共聚物EVOH隔障层(即Capran Oxyshield OB P＝0.0021-24cm³mm/(m²天大气压))

丙烯腈-甲基丙烯酸酯共聚物AMA(P＝0.08-0.64cm³mm/(m²天大气压)25℃)

在隔室中的开口可以被由代谢物可渗透的材料制成的膜覆盖，由此该膜构成可控扩散隔障(看例5中设计L，图8)。

在另一个实施例中，整个隔室的壁可由代谢物可渗透的材料制成，该壁材料唯一规定的特征是具有相对于填充在隔室中的培养基更低的渗透性。由此隔室构成可控扩散隔障。

可渗透膜和不可渗透壁两者都可以具有膜或象膜一样的结构或另外的结构，允许代谢物的可控的显著的传输，如氧到及/或从代谢粒子。在代谢物氧的情况下，可渗透材料使能得到可控扩散隔障，该渗透性优选为至少50cm³mm/(m²天大气压)23℃，例如至少60cm³mm/(m²天大气压)23℃，例如至少750cm³mm/(m²天大气压)23℃，例如至少80cm³mm/(m²天大气压)23℃，例如至少90cm³mm/(m²天大气压)23℃。

对氧可渗透材料的合适材料的例子是：

聚砜(P＝90.5cm³mm/(m²天大气压)23℃)

聚丙烯PP(P＝59-102cm³mm/(m²天大气压)23℃)

环石蜡共聚物COC(P＝71cm³mm/(m²天大气压))

聚碳酸酯(P＝90-120cm³mm/(m²天大气压))

聚苯乙烯PS(P＝117-157cm³mm/(m²天大气压))

聚乙烯PE(P(ULDPE)＝280，P(LDPE)＝102-188，P(HDPE)＝35-110，P(LLDPE)＝98-274cm³mm/(m²天大气压))

乙烯-丙烯酸共聚物EAA(P＝178-550cm³mm/(m²天大气压))

聚四氟乙烯PTFE特氟纶(P＝223cm³mm/(m²天大气压)25℃)

乙烯-醋酸乙烯共聚物EVA(P＝177-210cm³mm/(m²天大气压))

一个渗透性非常高的聚合物的例子

硅树脂(P＝17280cm³mm/(m²天大气压))

这些提到的材料仅构成例子而可以选择具有适当的渗透性和特性的其他材料以获得在所述呼吸粒子周围的扩散隔障的恰当组合。在Liesl K.Massey：“塑料及弹性体的渗透性特性”，包装及包装材料指南第二版P57-507附有渗透系数地列出了更多相关聚合物的例子。在Brandrup & Immergut，聚合物手册第四版中还列出了更多的例子。

在一个特定实施例中，隔室由具有至少一个气体可渗透开口的气体不可渗透材料制成。所述开口由气体可渗透材料覆盖。在一个特定实施例中侧壁和底部由气体不可渗透材料制成。隔室包括基本球形代谢粒子在合适的培养基中，隔室直接通过开口或隔室外的更大体积的培养基与已知气体组成并温度和湿度受控的大气开放连通。氧及其他溶解物质直接从大气或由与大气在平衡下的更大体积培养基，通过确定的扩散隔室经由穿过隔室内的停滞培养基的扩散，供应到基本球形代谢粒子。在两种情况中均要知道在隔室外的氧分压。或者知道大气的组成或者大块培养基要与已知组成的大气处于平衡。

在另一实施例中隔室或者由高粘性的培养基确定或者被更高粘性及/或极性的培养基包围。

市售培养基(从例如Sigma，Medicult，“试管内生命”Nidacon)通常具有近似象同样盐度的水的扩散系数。这样的培养基可以通过或者在培养基中悬浮不可渗透粒子或物体或者增大培养基的粘性来改变。

为了减小孔隙率及因而扩散系数D，可以通过悬浮不可渗透粒子或物体改变培养基。当气体或其他代谢物在液体和不可渗透粒子的混合物中扩散时，D_混合物＝D_液体*孔隙率。

培养基也可通过增大粘性来改变，以获得具有更高粘性和显著减小的扩散系数的培养基。这样的培养基可以通过加入基本惰性的有机溶质如葡萄聚糖、甘油、糖、碳水化合物、蛋白质、有机聚合物或无机盐来形成。

通过加入有机聚合物如淀粉、琼脂糖或其他凝胶反应物也可以不明显影响扩散系数来改变粘性。这可能对减少在大的自由液体空间中的扰动混合是重要的。

此外，培养基可以被例如覆层油如石蜡油或硅油或其他医用油包围，该油构成与相同培养基量相比相似或不同的扩散隔障。溶解度和对紊流和扩散流动的传输系数在油和水之间可以是不同。

隔室形状

隔室在原则上可呈每一种合适的用于确定讨论的代谢物的扩散梯度的形状。然而，隔室的形状应优选为也便于处理基本球形代谢粒子，尤其是关于基本球形代谢粒子的插入和取出。在当前上下文中形状指隔室的内部尺寸。隔室的外部尺寸可以是任何实用的形状。

因此，隔室的形状可以从圆柱形、多面体形、圆锥形、半球形或者其结合的一组之中选出。在优选实施例中形状是圆柱形、圆锥形、两个圆柱形的结合或圆锥形和圆柱形的结合。在附图中示出实例。更优选的，形状是圆柱形。

隔室尺寸

隔室尺寸要形成为能够象上面讨论的确定扩散梯度。从这方面来说，关于基本球形代谢粒子的代谢物的吸收及/或释放的隔室的尺寸是重要的。由于指定基本球形代谢粒子的代谢物的吸收及/或释放经常依赖于基本球形代谢粒子的尺寸，涉及基本球形代谢粒子的尺寸的隔室的尺寸是有关联的。

下面讨论的尺寸涉及大体为圆柱形的隔室及具有哺乳动物胚胎的尺寸即依赖于发育阶段和物种大约是直径在30-400微米之间的基本球形代谢粒子。对于其他基本球形代谢粒子本领域技术人员可相应计算合适的尺寸。

典型地，隔室的横向尺寸小于2.5mm，特别是小于1.5mm，尤其是小于500微米，例如小于250微米。

隔室的纵向尺寸在一个实施例中是在2到25mm之间，特别是在3到15mm之间。纵向尺寸通常是构成扩散隔障的培养基的垂直高度。概括来说它是从代谢粒子到大块培养基的与扩散梯度垂直的距离。

该尺寸可以是象这样的隔室的尺寸，或者该尺寸的提供可以是通过在一个标准隔室中插入一个或更多插入物由此便于使用相同类型的隔室测量几个不同类型的基本球形代谢粒子的代谢速率。

在一个实施例中隔室具有至少一个用于调节隔室横向尺寸的插入物。在一个优选实施例中圆柱形插入物的内横向尺寸如上定义，例如小于2.5mm，特别是小于1.5mm，尤其是小于500微米，例如小于300微米。

在另一实施例中，也可通过向隔室提供可调节底部来调节尺寸，例如其中隔室形成有象活塞的底部。由此隔室的尺寸既可以增加也可以减小。

在特定的合适的情况下可调节底部可以与一个或更多插入物结合使用。

隔室的功能尺寸也可通过改变隔室中的培养基的体积来改变。通过增加或减少培养基的定义的量可以以可控的方式改变隔室中的培养基水平。这个的功能原理涉及代谢物氧必须扩散穿过停滞培养基的距离的增加或下降，相应于有效扩散隔室的尺寸的改变并因而控制代谢物从固定成分的隔室外面向基本球形代谢粒子的传输。有了调节培养基水平及因此在任何代谢速率时基本球形代谢粒子经受的代谢物浓度到想要的水平的选项，可以确定基本球形代谢粒子的代谢速率。

代谢物可渗透层

在一个实施例中基本球形代谢粒子设置在隔室中在一层代谢物可渗透层上。由此从所有侧面向基本球形代谢粒子供应代谢物而产生更优的环境。代谢物可渗透膜的另一个优点是它可便于如下讨论的对代谢物浓度的测量。代谢物可渗透层最好设置在所述至少一个隔室的底部，其中底部如上所述定义。

代谢物可渗透层可由任何对讨论的代谢物为可渗透的材料制造，如上面讨论的代谢物可渗透膜。代谢物可渗透层尤其可由包括硅树脂、特氟纶含氟聚合物、可塑化合物例如聚乙烯、聚丙烯或氯丁橡胶的材料制造。

在另一个实施例中代谢物可渗透层由包括可渗透充填物或多孔材料如玻璃、陶瓷、矿物质、玻璃或矿物纤维、或贵金属如金或铂的材料制造。

在又一实施例中代谢物可渗透层由包括硅树脂的材料制造。

代谢物可渗透层的厚度被形成用于如上所述其应适于的目的的尺寸。在优选实施例中代谢物可渗透层的厚度优选为至少是基本球形代谢粒子的直径的两倍，如至少100微米、特别是至少300微米，及尤其是至少900微米。

检测方法

优选用非侵入方法测量在隔室内的代谢物浓度。应依赖于讨论的代谢物适当选择该方法。

在一个实施例中代谢物是被基本球形代谢粒子消耗的氧。氧检测可基于具有不动的发光体的光学检测(看定义)、具有溶解在培养基中的发光体的光学检测、显微分光技术、电化学地基于包括Clack型氧传感器的氧传感器、MIMS技术(薄膜入口质谱分析法)或任何其他的可被本领域技术人员想到的检测手段。在本发明一个单独实施例中使用不动的发光体层及用发光读出器或相机如CCD相机或光电倍增管记录该发光来确定氧分压或浓度。

光学氧传感器主要基于发光熄灭的原理。氧浓度越低，熄灭变得越弱而观测到增大的发光。基于修正的Stern-Volmer方程得到下面等式

$C=\frac{I_0-I}{K_{\mathrm{SV}}\left(I{-I}_0\mathrm{\α}\right)}---\left(1\right)$

其中α是发光的不可熄灭部分，I₀是没有氧时的发光强度，而K_SV是表达不动发光体的熄灭效率的常数(Stern和Volmer 1919，Klimant等人1995)。浓度可基于简单的三点测定来计算。

对具有长的磷光寿命的发光体已经发展一种可供选择的光学检测原理。当氧浓度在发光体周围的环境中下降时，磷光寿命(在一次闪光之后)以系统的方式延长。

对于这种类型传感器的磷光的氧依赖被Stern-Volmer关系描述

τ₀/τ＝1+K_q·τ₀·P_O2

其中，τ0和τ分别是无氧和氧分压为P_O2时的磷光寿命，而K_q(熄灭常数)是二次项速度常数其涉及在氧和卟啉的被激发三重态之间的碰撞频率及当碰撞发生时能量转移的概率。为计算氧分压P_O2，必须测量熄灭常数和在无氧时的寿命。

与更经常使用的基于强度的系统相对比，发光寿命的测量提供某些优点，如对光致漂白、染料的不均匀分布或流失、或被激发光的强度的改变不敏感。这便于使用简单的光学系统或光纤。已经提出了一种新的一类氧敏染料，卟啉酮，其展示了良好的光谱特性和十和百毫秒量级的衰减时间。这允许使用简单的光电子电路和低成本的电子处理组件。

近来，发展了基于将用于氧的平面光学传感器薄片与成像技术结合使用的用于高的空间分辨率研究的新方法。此处，该传感器薄片可以安装在透明的样品容器的内部，并通过用电荷耦合装置(CCD)相机从外面监测该传感器薄片，在传感器薄片的氧依赖发光中的改变可被监测并用于测量在样品中的氧的二维分布。这些薄片可既用于基于强度的测量也用于基于寿命的测量。它们可被用作在本文中描述的新型装置中的内部检测器。氧发光体的例子是金属有机物染料，如钌(II)聚吡啶络合物、钌(II)联吡啶络合物、钌(II)二亚胺络合物、卟啉络合物、二(组氨酸合)钴(II)，铂1，2，烯二硫醇盐(enedithiolate)。优选由在聚苯乙烯基质中固定不动的钌(II)-三(tris)-4，7-联苯-1，10-菲咯啉高氯酸盐(Rudpp)、钌(II)-三-1，7-联苯-1，10-菲咯啉氯化物、钌(II)-三(联吡啶)络合物、三(2，2’-联吡啶二氯-钌)六水合物、Ru(bpy)、在聚苯乙烯中的铂(II)-八-乙基-卟啉、在聚(甲基丙烯酸甲酯)中的铂(II)-八-乙基-卟啉、在聚苯乙烯中的铂(II)-八-乙基-酮-卟啉、铂(II)-八-乙基-酮-卟啉、在聚苯乙烯中的钯(II)-八-乙基-卟啉制成氧发光体。

关于使用光学氧传感器和用于其他代谢物如葡萄糖、pH和二氧化碳的传感器的更多信息可在下面列出的文献中找到。

因而，在一个实施例中氧检测器可以是电化学的或其他氧检测原理的。

在一个特定实施例中在隔室的底部完成氧浓度的确定，而在另一个实施例中用于确定氧的装置放置在隔室的底部在代谢物可渗透层下面并至少一个基本球形代谢粒子放置在该气体可渗透层上，使得代谢物可渗透层处于基本球形代谢粒子和代谢物检测器之间。

在一个实施例中氧分压由具有尖头直径不超过隔室的横向直径的Clark型电化学氧微传感器确定，其放置在隔室的底部，传感器尖头穿透隔室的氧不可渗透底壁。氧可渗透层将传感器尖头与基本球形代谢粒子分开。氧传感器应为这样的设计即传感器的被分析物(氧)消耗不应超过基本球形代谢粒子的呼吸速率的可忽略部分如1％，这样在隔室内的氧分压梯度不会被所述传感器的测量活动干扰。

在另一个实施例中Clark型氧传感器被穿透隔室的氧不可渗透底部的MIMS光纤代替。一个气体可渗透层将MIMS光纤尖头与胚胎分开。该MIMS光纤应为这样的设计即传感器的被分析物(任何可穿过MIMS光纤膜并可在质谱仪上检测的气体)消耗不应超过基本球形代谢粒子的消耗或产生速率的可忽略部分如1％，这样在隔室内的特定气体的分压梯度不会被所述MIMS光纤的测量活动干扰。

在又一实施例中，通过加入氧血红蛋白或另一种具有氧依赖吸收特性的分子到培养基，并通过隔室的透明侧壁测量在435nm或另一合适波长的吸收梯度，即由此去定在隔室中的氧分布，而确定在隔室内的氧分压梯度。

其他代谢物可以通过使用用于这些代谢粒子的发光指示剂来测量，如用于二氧化碳的、Ca²⁺、及葡萄糖的发光指示剂。

此外，在隔室中指定的位置可以测量显示在隔室中的代谢物的浓度的pH。

装置

根据本发明的装置包括至少一个如上所述的隔室。在优选实施例中该装置包括一个以上隔室，例如至少两个隔室，例如至少4个隔室，例如至少6个隔室，例如至少8个隔室，例如至少12个隔室，例如至少24个隔室，例如至少48个隔室，例如至少96个隔室。由此，每个隔室包括一个基本球形代谢粒子，可以容易地确定一个以上的基本球形代谢粒子的代谢速率。

优选地，隔室适于培育基本球形代谢粒子。在一个实施例中该装置是常规的用于细胞培育的48或96井装置。然而，当测量基本球形代谢粒子时，常规的井具有的开口对允许确定梯度来说是太大了。因此，该井可以设置如上所述的插入物。可以是在整个培育期间都设置该插入物，或仅在确定代谢物梯度和测量代谢物浓度期间设置。

培育装置

本发明还设计一个最优的用于培育如上定义的代谢粒子的装置，其中，所示装置包括至少一个如上所述的隔室。因此，本发明设计一种用于培育代谢粒子的装置，该装置包括至少一个隔室，所述隔室由扩散隔障确定并能包括具有代谢粒子的培养基，所述扩散隔障允许代谢物经由扩散到及/或从代谢粒子的传输，由此允许建立从代谢粒子并贯穿培养基的代谢物扩散梯度。

隔室优选为如上所述，除了在培育装置中不是必须包括检测器以外。因此该装置可包括一个以上隔室，例如至少两个隔室，例如至少4个隔室，例如至少6个隔室，例如至少8个隔室，例如至少12个隔室，例如至少24个隔室，例如至少48个隔室，例如至少96个隔室。

由于能如上所述容易地监测并最优化围绕细胞和生物体的微环境，该装置为细胞和生物体的培育提供了最优的条件。

因此，本发明还涉及用于培育粒子的方法，所述方法包括

a)提供至少一个如此处定义的装置，

b)在隔室培养基中安排代谢粒子，及

c)培育代谢粒子。

将该培育方法和任何如此处所述的其他方法结合是在本发明的范围中。

确定代谢速率的方法

在另一方面本发明涉及用于确定基本球形代谢粒子的代谢速率的非侵入方法。所述方法包括

a)提供至少一个如此处定义的装置，

b)在隔室培养基中安排代谢粒子，

c)测量在隔室中的代谢物浓度获得代谢物浓度的量，及

d)将所述代谢物浓度的量与所述基本球形代谢粒子的代谢速率联系起来，由此确定基本球形代谢粒子的代谢速率

代谢物可以是如上所述的。该代谢物可以经由扩散穿过培养基被供应到或从基本球形代谢粒子除去，例如氧经由扩散穿过培养基被供应到基本球形代谢粒子。在后者的情形中，代谢物浓度可以是气体分压，例如氧或二氧化碳的气体分压。

优选地，基本球形代谢粒子在隔室中培育，使得不会发生由于确定代谢速率引起的对基本球形代谢粒子的不必要的干扰。

代谢物的浓度可以在比隔室的体积及/或培养基的体积更小的体积中测量。优选地，所述基本球形代谢粒子的代谢速率通过基于测量的代谢物浓度确定在隔室中的代谢物扩散梯度，及将所述代谢物扩散梯度与所示基本球形代谢粒子的代谢速率联系起来而确定。

代谢速率可以通过完成代谢物浓度的一次测量或几次测量如至少两次测量来确定。此外，在培育期间到监测基本球形代谢粒子的状态期间可以一次以上地确定代谢速率。

如上所述，当代谢物是气体，如氧，该气体可以直接从大气或从与大气处于平衡的较大体积的培养基，经由扩散穿过在隔室中的停滞的培养基被供应到基本球形代谢粒子。

封闭呼吸计量法

根据本发明的装置还可用于通过封闭呼吸计量法测量粒子如基本球形代谢粒子的呼吸速率。封闭呼吸计量法是对在封闭呼吸运动细胞即其中至少暂时停止氧的供应的细胞的呼吸速率的测量。本装置通过应用对代谢物如氧不可渗透材料的盖在装置的隔室中的任何开口上，可转变为封闭呼吸运动细胞。该盖可由上面提到的任何不可渗透材料制成。

因此，本发明还涉及一种用于确定代谢粒子的代谢速率的非侵入方法，包括：

a)提供至少一个如上面定义的装置，

b)在隔室培养基中培育代谢粒子，

c)至少在部分培育期间减少对培养基的代谢物的供应

d)在已经减少了代谢物以后，测量在隔室中的代谢物浓度获得代谢物浓度的量，及

e)将所述代谢物浓度的量与所述基本球形代谢粒子的代谢速率联系起来。

关于封闭呼吸计量法，代谢物经常是氧而代谢速率是呼吸速率。在该方法中氧的供应优选为减少到零。

优选地，在减少供应期间已经得到代谢物浓度的量。

代谢物供应的调节

在另一方面本发明涉及用于调节对在隔室中的粒子如基本球形代谢粒子的代谢物供应的方法。

因此，本发明还涉及用于调节对基本球形代谢粒子在培育期间的代谢物供应的方法，包括

a)提供至少一个包括具有培养基的隔室的装置，

b)在隔室培养基中培育基本球形代谢粒子，

c)测量在隔室中的代谢物浓度获得代谢物浓度的量，并可选的

d)将所述代谢物浓度的量与所述基本球形代谢粒子的代谢速率联系起来

e)依赖于代谢物浓度的量及/或所述基本球形代谢粒子的代谢速率调节代谢物供应。

该方法特别涉及其中代谢物是气体如氧以及代谢过程是呼吸的测量。

该隔室优选为如此处定义的适于允许建立代谢物扩散梯度的隔室。

可以用任何适当的方式实施对代谢物供应的调节。在一个实施例中是通过改变在隔室外的代谢物浓度实施该调节。

在另一实施例中通过改变隔室的尺寸实施调节。如上所述，可以用几种方式改变体积。此处的一个例子是其中通过插入插入物调节尺寸，例如其中通过插入一个插入物来调节隔室的横向尺寸。通过移动隔室的可调节底部的位置也可以调节纵向尺寸。

在第三实施例中，通过改变隔室的扩散隔障实施该调节。这可以通过改变隔室壁的厚度或改变在隔室壁中的至少一个开口的尺寸来实施。

对基本球形代谢粒子的监测

本发明还涉及对基本球形代谢粒子的监测及选择在如被代谢速率量度的存活能力方面具有高品质的基本球形代谢粒子。

在优选实施例中，本发明涉及对可存活胚胎的选择，例如一种用于选择可存活胚胎的方法包括，

a)在培育期间至少一次确定胚胎的代谢速率，

b)选择具有最优代谢速率的胚胎。

确定代谢速率优选为在如本发明所定义的装置中实施及使用此处描述的方法。此外，胚胎优选为在所述装置的隔室中培育。

由此便于实施确定代谢速率而不引起胚胎经历的成长环境的任何改变。

附图的详细描述

下面将参照附图描述本发明的许多不同的实施例，但可以理解的是这些实施例仅构成一般性的发明概念的示例，而本领域技术人员可以想出其他的实施例。

在图1中示出的用于测量胚胎呼吸的本发明的实施例说明了一端为开放的纵向隔室1.4。隔室的底部，其可以是圆柱形的，包括在透明氧敏发光体1.3之上的气体可渗透物质1.6。扩散隔室的底壁1.5由透明材料制成其允许对胚胎的放大视觉检察。底壁1.5由象玻璃或塑料这样的气体不可渗透材料制成，使得唯一的氧供应是通过隔室1.7的开口。在隔室底部发光体层1.3中的氧分压，其测量是借助于外部的发光读出器通过透过透明底壁1.5记录从在隔室底部的氧发光体1.3来的发光。在一个实施例中可以是大块培养基的周围部分1.2与已知或未知气体组成的大气处于平衡中。该装置容纳一个或几个放置在气体可渗透物质1.6上的胚胎1.1，在一个实施例中该物质是硅树脂，在透明氧敏发光体1.3之上。气体可渗透物质1.6可以是硅树脂化合物、特氟龙含氟聚合物、塑料化合物象聚乙烯、聚丙烯或氯丁橡胶、可渗透基体或基于另一种化学上惰性材料象玻璃、陶瓷或矿物、玻璃纤维或矿物纤维或象金或铂的贵金属的多孔材料。

本发明的功能原理是胚胎的氧消耗与在大块培养基/周围部分1.2的氧分压相比，其减小在氧检测器(发光体)1.3的氧分压。只要胚胎的氧消耗是不变的，氧分压梯度1.8会处于稳态，为稳定的并不经受变化。在包括纵向圆柱形扩散隔室的本实施例中，氧分压梯度是如图1中示出的线性的。在图4中示出真实的实验数据。因此可用在所述扩散隔室1.4的底部1.3和开口1.7的氧分压之间的差值，使用Ficks 1扩散定律(方程1)，确定胚胎的氧消耗，

$J=-D\frac{\mathrm{dC}}{\mathrm{dx}}---\left(1\right)$

假定从开口向在底部的胚胎的氧线性下降(看理论图线1.8)，其中J是氧的流量其在稳态中等于胚胎的消耗，D是已知的培养基的扩散系数而dC/dx是氧梯度。梯度dC/dx是在隔室的开口1.7处的确定的大气或培养基的的氧分压和底部在胚胎1.1水平面上的氧分压之间的差值。在本发明中使用光学氧发光体1.3覆盖隔室1.4的底部，会综合在整个底部区域的氧信号。从与胚胎相关的不均匀分布的氧消耗产生的，在胚胎水平面的水平氧梯度会被平均化，就好像该消耗是均匀分布在底部区域上一样，使得胚胎的确切位置变得与呼吸估算无关。

因而通过单独的氧分压的测量其通过在隔室内的不动的氧检测器从扩散隔室外面进行而不打扰胚胎，可确定个体胚胎的呼吸速率。该测量可在几秒中完成而不对胚胎有任何打扰。依赖于检测器手段，该测量可以在是例如培育箱或温暖房间的培育室中完成，或者该测量可以在培育室外面在非常短的时间内完成，这样不会明显影响胚胎经受的生长环境。

通过使用本发明隔室阵列，可同时扫描多个胚胎的单独的呼吸速率。在一个实施例中至少一个隔室包括至少5个隔室，特别是至少10个隔室，更特别是至少24个隔室，及尤其是至少96个隔室。

在另一实施例中个体胚胎在分开的隔室中生长而在又一个实施例中每个隔室包括一个以上胚胎。

图2示出在第一实施例中的插入物10，其用作调节纵向隔室2.4的横向尺寸A。通过变窄或增大横向尺寸扩散隔室的通过扩散传输溶解物质的能力可以被增大或减小。扩散隔室的传输能力决定在胚胎位置的稳态氧分压。

在本发明一个实施例中在胚胎位置的氧分压是通过调节隔室2.4的尺寸来控制。这一点可通过几种方式做到，例如通过调节可调节底部3.10的位置(看图3)、通过降低或提高在隔室内的培养基的水平面、或通过引入插入物2.9(看图2)到隔室中，该插入物会减小横向尺寸A。

在一个实施例中气体可渗透层2.6的厚度是至少100微米，特别是至少300微米，及尤其是至少900微米。气体可渗透层的厚度应优选为胚胎的直径的两倍或更大，对哺乳动物胚胎其典型是30-400微米之间，依赖于物种和发育阶段。

图3示出本发明的另一个实施例。与在图1中示出的第一实施例的元件相同的元件以如图1上相同的附图标记标示(看附图图例)。该实施例包括隔室3.4，例如圆柱形的隔室，在一端具有开口3.7，而具有可移动或可调节的底部3.10，该底部具有在氧敏发光体3.3之上的气体可渗透层3.6。底壁3.10对隔室壁3.5密封使得该密封是气体不可渗透的。

在本发明第二实施例中的隔室的尺寸由于可移动底部3.10可以以可控的方式，或者增加或者减少从隔室3.7的开口到胚胎3.1的氧的扩散长度来改变。通过增加或减小隔室3.4的长度，在胚胎3.1水平面处的稳态氧分压可以或者被减少或者被增加以达到想要的氧分压，并不影响完成呼吸估计的可能性。以这种方式确定胚胎的呼吸速率可以有在任何呼吸速率调节胚胎经受的氧分压到想要的水平的选择权。

图5是本发明又一实施例其中在生长盘中的全部体积的培育培养基确定隔室5.4，其因而比在本发明其他实施例中的要大的多。生长盘的底部5.5是透明的并覆盖有发光体5.3，在该发光体上放置了一个或几个相互离开一距离的胚胎5.1，其足够大典型为大于2毫米以避免在胚胎之间的分压梯度的重叠。本实施例的功能原理是如在图5B中所示氧从与在胚胎上隔室外的大气接触的周围培养基供应到胚胎。当隔室相对胚胎为非常大，最后得到的朝向胚胎的氧梯度会如在图5B中的氧分压等高线5.11所示那样是球形的，而图6是真实数据。构成扩散隔室的生长盘放置在CCD相机5.12上，该相机通过光学氧传感在二维上解析在发光体5.3中的氧的水平分布。从CCD相机5.12来的对应每个胚胎5.1周围区域的信号因而会成为个体胚胎呼吸的量度。该效果在图5C中示出，图5C示出如从CCD相机看到的图像，其中以灰阶显现在每个个体胚胎周外的发光体的发光强度。通过将记录的胚胎周围的氧分压梯度与假定理想球形扩散的理论模型相对照，估计胚胎的呼吸。理论上可描述在自由扩散空间的朝向氧消耗体的氧梯度：如果已知在a的浓度(C1)和在b的浓度(C2)，可以描述在a和b(a＜r＜b)的空心球中的指定点r的浓度C(Crank 1997)。在a和b之间没有氧消耗。

$C\left(r\right)=\frac{a{C}_1(b-r)+b{C}_2(r-a)}{r(b-a)}$ (方程II)

给出扩散穿过球形壁的氧的流量J

$J=4\mathrm{\πD}\frac{\mathrm{ab}}{b-a}(C_2-C_1)$ (方程III)

其中D是氧在培养基中的扩散系数。

该梯度围绕该氧消耗体对称并可被任一穿过该体中心的平面镜像。因此可以认为一个氧消耗体在此例中为胚胎，其放置在大的隔室(直径大于1厘米而高度大于2毫米)的底部的平的表面，作为球的中心，仅是从半球供应被胚胎消耗的氧。当将记录的梯度与理论模型对照，计算出的呼吸速率(穿过球形壁的氧流量)应因此除以二。在扩散隔室中的梯度的自然状态，其由胚胎的呼吸引起，不能被完全的描述，可通过使用具有已知氧消耗的人造胚胎来校准该装置。该实施例也适于用于用氧分布的2D记录在相同隔室底部培育的胚胎之间进行呼吸速率的相对比较。

范例

例1

放置牛胚胎在直径1毫米及深4毫米的圆柱形隔室的底部，并在氧分压为55hPA的大气下培育。从隔室的开口朝向胚胎以100微米的间隔测量在隔室内的稳态氧分压梯度。在达到稳态前的时间t(秒)可通过下面的公式近似得出，

$t=\frac{0.45l^2}{D}$ (从J.Crank 1995，扩散数学)

其中l是扩散隔室的深度单位厘米而D是培养基的扩散系数。因此直径1毫米及深4毫米的隔室中的稳态在大约35分钟后达到，假定D为3.5×10⁵。使用具有尺寸10微米的尖头的Clarck型氧微传感器，其被用微型机械手定位。如在图4中示出的数据示出穿过隔室的线性梯度。因而足够知道在隔室的上部和底部的氧分压以确定该梯度。此外从图4可明显看出可通过从开口朝向胚胎，在隔室内的线性梯度的任一点上测量氧分压来确定梯度。

为了实际目的，以及当使用发光体层时，将用于氧检测的装置放置在隔室的底部是更便利的。

例2

在胚胎处理后，通过吸液管将每个个体胚胎转移到隔室中(试管内培育、克隆、解冻或另一技术，看例如：“试管内受精”，KayElder，BrianDale 2001修订第二版剑桥大学出版社，对胚胎处理技术有大体的描述)。隔室被包括在具有几个隔室的更大的机架中，这样从一个或几个人或动物的一组或几组胚胎，可以被容纳在具有多个隔室或多组隔室的单一机架内。然后在预期的条件中孵育该机架，该条件对人胚胎来说典型是37℃，在氮气中5-21％O₂及5％CO₂，100％湿度，在市售培养基(例如从斯堪的纳维亚IVF科学AB来的IVF-50，Gteborg Sweden)中生长。培养基的选择依赖于可接受质量控制和可得到的培养基而非任何特定的类型。可以使用用于胚胎培育的相对简单的平衡盐溶液。Earle、Tyrode和Hepes的培养基已被成功引进。这些市售培养基作为单一浓度或浓缩溶液。通过将机架放置在特别设计的发光读出器中完成该呼吸测量，该读出器产生从在每个个体隔室底部的发光体来的发光信号。在测量后该机架被立刻放回到培育室中。用关于每个个体隔室尺寸的信息计算实际呼吸速率。如果在胚胎的位置的氧分压不在指定的最优间隔内，例如5-10％，可调节隔室的尺寸及从而氧分压，例如用适当的插入物。

在试管内培育期间尽所要求的经常完成呼吸测量。然后使用胚胎呼吸速率，典型地与形态学评估结合，作为选择用于转移到受体的胚胎的基础。

试管内形态评估基于胚胎的几个特征。这样的评估方法是主观的并非常依赖经验。胚胎是球形的并由被似胶的壳包围的细胞(卵裂球)、叫做膜环pellucida的非细胞母体组成。膜环pellucida完成多种功能直到胚胎孵化，并是胚胎评估的良好标记。膜环是球形的及半透明的，并应是与细胞残骸可清楚辨别的。在对胚胎的形态评估的重要原则是(1)胚胎的形状；(2)膜环pellucida的存在；(3)尺寸；(4)颜色；(5)与其发育阶段有关的胚胎的年龄的知识；及(6)卵裂球膜的完整性。在胚胎发育期间，卵裂球数目几何增长(1-2-4-8-16-等等)。同步细胞分裂大体维持到胚胎的16细胞阶段。在这以后，细胞分裂变得不同步并最后各个细胞有它们自己的细胞周期。作为球形细胞在16细胞阶段之前，组成胚胎的细胞应可容易地识别出来。在32细胞阶段(桑椹胚阶段)之后，胚胎经历致密。结果是，难以在此阶段后评估在胚胎中的各个细胞。在不育治疗中产生的人胚胎通常在桑椹胚阶段前转移到受体，然而其他哺乳动物的胚胎在转移到受体或排除之前经常被实验培育到更远的发育阶段(膨胀胚泡)。

例3

模型化的半球扩散：图6A示出向放置在较大隔室的平的底部的牛胚胎的氧轮廓。图6B显示出在C(r)对a/r的相同的数据，其中a是从球形中心(胚胎的中心)到氧轮廓的选定的端点(朝向胚胎)的距离。在轮廓在胚胎表面开始的情况中，a是胚胎的半径(a也可以被选在远离胚胎的一点)。对非常大的b值(当C2是这是大块浓度)，如果C(r)对a/r是线性的，则满足关于球形扩散的假定。

通过球面且在点a的氧流量可如前面描述的来计算。如6B示出在此特定例子中因为该线不是完全线性的，没有完全满足完美球形扩散的假定。因此对a的选择会影响消耗的评估，其不是完美配合的情况。

例4扩散理论

1.向恒定消耗源的扩散

在具有消耗一化合物的代谢粒子或物体的扩散系统中，通过扩散将该化合物传向消耗源。通过Fick第一定律可描述扩散的量-流量：

$J=-D\frac{\mathrm{dC}}{\mathrm{dx}},$ (4.1.1)(Crank，1997)

其中D是扩散系数，C是浓度，而x是轴沿该轴考虑流量。

在稳态，在系统中在任何位置朝向消耗源的面积分扩散流量是不变的。面积分流量定义为扩散系统垂直于对称轴的横截面，F。假设是正的假定，Q可表达为：

-J·F＝Q，

其代入方程4.1.1得

$D\frac{\mathrm{dC}}{\mathrm{dx}}\·F=Q$ (4.1.2)

下面会将这些方程应用到一套几何形状中(侧面平行多面体、圆柱形、球形)，可认为这些形状代表本发明的不同的实施例。例如计算悬在扩散系数为3.45·10^-5cm² s^-1(在38℃)的水中的氧呼吸粒子。

2.一维系统(平行多面体或圆柱形)

如果扩散化合物浓度及物理边界仅在一维上变化，扩散系统被定义为一维的。一维系统的一个例子是无限大的平的薄片。如果可忽略边界效应，在底部有消耗源的侧面平行井被认为是一维扩散系统。

在稳态，数学上可描述一维扩散为：

$\frac{d^{2}C}{{\mathrm{dx}}^2}=0$ (Crank，1997)

积分后得到

$\frac{\mathrm{dC}}{\mathrm{dx}}=A,$ (4.2.1)

再积分得到

C＝Ax+B，(4.2.2)

其中A和B是积分常数。

考虑长度为h的一维系统，其在x＝h处有固定浓度C_w，及在x＝0处有固定的源点浓度Q。在一维扩散系统中，横截面面积F作为x的函数是常数。

将方程式4.2.1应用到方程式4.1.2得到

D·A·F＝Q        (4.2.3)

在x＝h处的浓度等于C_w，根据方程式4.2.2得到：

C(h)＝Ah+B＝C_w    (4.2.4)

通过联合方程式(4.2.3)和(4.2.4)来求解A和B，方程式(4.2.2)可以写为：

$C\left(x\right)=C_W+\frac{Q}{F\·D}(x-h)$ (4.2.5)

考虑到在x＝0处浓度为C₀，方程式4.2.5可被重新整理而得到：

$Q=\frac{(C_W-C_0)F\·D}{h}\·\left(\mathrm{4.2.6}\right)$

因而，如果已知F、D、h和C_w，使用方程式4.2.6通过测量C₀可计算消耗速率。

在例6完成的测量中应用此方法，在例6中扩散系统是以直径0.5毫米的侧面平行圆柱形井的形式，相应产生0.00196cm²的表面积F，深度h为4毫米，比起在井的顶部的21％的氧(对应210μM)在井的底部测得的氧浓度为17％(对应169μM)，其可转化为对应于0.546毫微升/小时的6.7710^-6nmol/s的消耗率。

3.基本上是二维的圆柱形系统(盘形)

在圆柱形扩散系统中，扩散的发生沿圆柱体的半径，而沿圆柱形系统的纵轴没有变化。如果可忽略边缘效应，可以将由盘形本体及在其中心的扩散源组成的扩散系统认为是圆柱形系统。

在稳态，数学上可描述圆柱形扩散为：

$\frac{d}{\mathrm{dr}}\left(r\frac{\mathrm{dC}}{\mathrm{dr}}\right)=0$ (Crank，1997)，

积分后得到

$r\frac{\mathrm{dC}}{\mathrm{dr}}=A,$ (4.3.1)

再积分得到

C＝A+Blnr，(4.3.2)

其中A和B是积分常数。

考虑长度为l及半径为r₁的圆柱形系统，其在r＝r₁处具有恒定浓度C_w，并具有在r＝0处恒定浓度Q的源点。

将方程式4.3.1应用到方程式4.1.2得到

$D\·\frac{A}{r}\·F=Q$ (4.3.3)

在r＝r₁处浓度等于C_w，根据方程式4.3.2得到：

C(r₁)＝A+Blnr₁＝C_w    (4.3.4)。

在圆柱形扩散系统中，横截面面积F是r的函数：

F＝2π·r·l         (4.3.5)

通过联合方程式4.3.3、4.3.4和4.3.5来求解A和B，方程式(4.3.2)可写为：

$C\left(r\right)=C_W+\frac{Q}{2\mathrm{\π}\·l\·D}\ln (r/r_1)$ (4.3.6)，

考虑在另一点r₀处浓度为C₀，在扩散系统中，方程式4.3.6可被重新整理而得到：

$Q=\frac{(C_W-C_0)\·2\mathrm{\π}\·l\·D}{\ln (r_1/r_0)}.$ (4.3.7)

这样，如果已知l、D、r₀、r₁及C_w，可使用方程式4.3.7通过对C₀的测量计算出消耗速率。

如果圆柱形扩散系统构建为将直径10mm的圆形不可渗透盘放置在不可渗透表面上50μm并放置直径100μm的氧呼吸粒子且在盘的中心的下面的氧呼吸速率为1nl氧/小时，根据方程式4.3.6最后得到的在粒子表面处的稳态浓度将是157μM。

4.球形系统(锥形-半球形)三维系统

在球形扩散系统中，扩散的发生是沿球的半径或球的扇区。如果可忽略边缘效应，可以将由锥形本体和在其尖端的消耗源组成的扩散系统认为是球形系统。

在稳态，数学上可描述球形扩散为：

$\frac{d}{\mathrm{dr}}\left(r^2\frac{\mathrm{dC}}{\mathrm{dr}}\right)=0$ (Frank，1997)，

积分得到

$r^2\frac{\mathrm{dC}}{\mathrm{dr}}=A,$ (4.4.1)

再积分得到

$C=B+\frac{A}{r},$ (4.4.2)

其中A和B是积分常数。

考虑半径为r₁的球形系统，其在r＝r₁处具有恒定浓度C_w，并具有在r＝0处恒定浓度Q的源点。

将方程式4.4.1应用到方程式1.2得到

$D\·\frac{A}{r^2}\·F=Q$ (4.4.3)

在r＝r₁处的浓度等于C_w，根据方程式4.4.2得到

$C\left(r_1\right)=B+\frac{A}{r_1}=C_W$ (4.4.4)。

在圆柱形扩散系统中，横截面面积F是半径r的函数，如果系统是锥形，F可被描述为：

$F=2\mathrm{\π}\·r^2\·(1-\cos \frac{\mathrm{\θ}}{2})$ (4.4.5)，

其中θ是锥形的顶角。通过联合方程式4.4.3、4.4.4及4.4.5来求解A和B，方程式(4.4.2)可被重新写为：

$C\left(r\right)=C_W-\frac{Q}{2\mathrm{\π}\·D\·(1-\cos \frac{\mathrm{\θ}}{2})}(\frac{1}{r}-\frac{1}{r_1})\left(\mathrm{4.4.6}\right),$

考虑在另一点r₀处浓度为C₀，在扩散系统中，方程式x4.6可被重新整理而得到：

$Q=(C_W-C_0)\·2\mathrm{\π}\·D(1-\cos \frac{\mathrm{\θ}}{2}){(\frac{1}{r_0}-\frac{1}{r_1})}^{-1}\left(\mathrm{4.4.7}\right).$

这样，如果已知D、r₀、r₁、θ及C_w，可使用方程式4.4.7通过对C₀的测量计算出消耗速率。

在例7完成的测量中应用此方法，在例7中在r₀＝0.015cm(胚胎表面)处发现C₀＝206μM，而D＝3.45·10^-5·cm²·s^-1，r₁＝0.04cm，θ＝60°，C_w＝210μM，得到呼吸速率为0.11nl/小时。

文献：Crank，J.1997。扩散数学。牛津大学出版部印刷所。

例5本发明所述的新型装置的示例

本专利申请的附图中示出了用于此处描述的新型装置的15个不同的设计。这些变化中的许多是功能相当的设计以便于操作代谢粒子及/或调节扩散隔障来保证对代谢粒子的最优化孵育条件。根据在培养基内并非常接近隔室产生的代谢物浓度梯度的类型可将它们编组为几个种类。该四个种类是：

1.具有线性代谢物浓度梯度的一维系统

2.具有对数代谢物浓度梯度的二维系统

3.具有双曲线形代谢物浓度梯度的三维系统(锥形-半球形)

4.不规则系统，其为上述的组合并且其需要更复杂的模型来描述浓度梯度

在前面的例子(例4)中详细描述了与该三个种类的每一个相关的扩散理论。使用导出的方程式，我们展示一个例子，其为怎样设计及形成每一类装置的示例的尺寸以对具有给定呼吸速率的代谢粒子得到想要的传感器信号。我们的标准示例涉及向悬在水性培养基中的呼吸胚胎的氧扩散。我们会用到下面的标准参数：

消耗速率，Q＝1.0毫微升/小时(＝1.24·10^-5nmol·s^-1)，

氧扩散系数D＝3.45·10^-5cm² s^-1(在38℃)。

在培养基中的氧浓度，C_w＝210μM，在38℃

想要的传感器信号比大块培养基低30％(即C₀＝147μM，在38℃)

具有线性代谢物浓度梯度的一维系统

在例4中的第二部分描述了与这样一种系统相关的扩散方程式。如果我们假定圆柱形的高h为3毫米，那么假设 $F=\mathrm{\π}(d/2)\⇔d=2\sqrt{F/\mathrm{\π}}$ 我们可以使用方程式4.2.6来计算圆柱形的直径d，

$d=\sqrt{\frac{4\·Q\·h}{\mathrm{\π}\·D\·(C_W-C_0)}}---\left(5.1\right)$

给定上面的标准参数我们发现圆柱形的直径必须减小到约470μm以对具有预期氧呼吸速率的目标给出想要的信号。

设计A，在图1中示出，在不可渗透材料中的开孔。此设计是在不可渗透材料(1.5)中的简单的圆柱形开孔。它也可以是具有类似尺寸的矩形或多面体形孔洞。代谢粒子(1.1)放置在底部检测器(1.3)(其可以是，但不限于是一层可从上方或透过透明底部(1.5)观测的发光体)上方的一层可渗透材料1.6上面。可渗透层(1.6)的目的是使在非常接近代谢粒子(1.1)处提供的水平代谢物浓度梯度变均匀。因而从检测器(1.3)观测到的信号实际上是均匀地穿过它的表面。在非常接近代谢粒子处的浓度梯度会稍微偏离理想的线性曲线，但如果开孔的高宽比较高(即h＞＞d)那么这些轻微的扭曲是无关紧要的。在开口(1.7)外面，我们预期半球形的梯度其浓度快速地呈现出大块流体的浓度。为了所有实际的目的我们因而将该系统认为是具有上面方程式描述的特性的一维系统，其中流量受开孔的高宽比控制。应将开孔的直径保持在较小从而在代谢粒子上方的培养基柱中不发生剧烈地混合。此设计的优点是它的简单性。它已被成功地用于在例1中描述的氧微电极实验中。此设计的两个缺点是：1)难以取回沉置在深且狭窄开孔中的代谢粒子，2)无法根据代谢粒子的代谢速率调整扩散隔障

设计B，在图11中示出，具有可更换的顶部的开孔。此设计与前面讨论的简单开孔(设计A)非常相似。它包括两个不可渗透件。在由不可渗透材料(例如玻璃)制成的容器中充满培养基(11.5)。在此容器上放置一小块不可渗透材料(11.5)其具有穿过其中心的圆柱形(或多面体形)孔(11.4)。在孔面对容器表面的一端该孔被挖空(挖洞)以形成放置呼吸粒子(11.1)的小孔。该孔的顶壁覆盖有代谢物检测器(11.3)。只要放置代谢粒子的孔“室”较小而孔的高宽比较大，那么此设计等价于上面讨论的简单开孔。由玻璃件制成的具有氧敏发光体的此设计的原型已被成功用于如例6中所述的对鼠胚胎的呼吸速率的测量。此装置比起上面描述的中央开孔其优点是通过分开两个不可渗透件(即移除顶部“烟囱”)可以从装置中去除代谢粒子。也可以更换顶部以提供具有不同直径或长度的中心孔的不同的扩散隔障。然而，其主要的缺点是难以将两个不可渗透件平稳地安装，以使在它们之间的界面处没有在其中代谢物可沿界面横向扩散的水平间隙。

设计C，在图2中示出，具有插入物的开孔。此设计与设计A(图1)相同。唯一的差别是在开口(2.9)中的不可渗透插入物，其将开孔的横截面从图1中的A减少到图2中的B。横截面被减小会增大扩散阻隔并因而减小在隔室中在插入物(2.4)下面的代谢物浓度。此设计的主要优点是通过在有不同的开孔直径的插入物之间的换用能够调节扩散隔障。如果先移除插入物以增大开孔的直径，则也更易于移除代谢粒子，及便于接近代谢粒子。缺点是插入物和开孔要求的尺寸使它们非常难以操作，因为它们非常小并必须安装得非常好以避免在插入物和开口之间的代谢物可能通过其扩散的间隙。

设计D，在图15中示出，弯曲毛细管。此设计在功能上与设计A等同。它包括一个弯曲的不可渗透毛细管(15.5)其具有一个封闭端(或非常远的开口从而可忽略从后端的代谢物的扩散传输)，及在另一端有一个漏斗。代谢粒子放置在漏斗端(15.7)并允许通过重力停留在毛细管的最低点(15.1)，该毛细管放置在浸没在容纳培养基(15.2)的容器中的两个保持架(标记为15.4的黑色三角形)上。对代谢物敏感的检测器放置在两个嵌条(15.3)中以检测代谢物浓度梯度。如果有两个嵌条那么最外面的嵌条可作为参照，且只要嵌条比呼吸粒子更接近开口就不需要知道从开口(15.7)到代谢粒子(15.1)的距离。如果一个嵌条相比代谢粒子(15.1)在离开开口(15.7)更远的距离上那么必须知道前者和后者之间的距离。毛细管的直径必须是足够小以防止湍流。此设计的一个优点是能够通过在保持架上倾斜毛细管调节扩散隔障，从而重力使代谢粒子(15.1)朝向或远离开口(15.7)移动(滚动)因而改变代谢物必须通过扩散穿过的距离。此装置的最大的问题是使代谢粒子进入毛细管。漏斗会起作用但会使这样的装置更难于建造。

设计E，在图3中示出，具有可调节底部的开孔。此设计与设计A相同，圆柱形(多面体形)开孔(3.4)在具有放置在底部可渗透层(3.6)上在代谢物敏感检测器之上的代谢物(3.1)的不可渗透材料(3.5)中。然而此设计使用活塞(3.10)来得到扩散隔障的可调节的高度h，它因此可以调节开孔的高宽比及因此在开孔底部的代谢物浓度。此处通过移动有固定壁的底部来实现高度的可调节，然而相同的效果可通过保持底部静止而向后移动该壁(如下面的设计G)来达到同样的效果。可调节底部(3.10)有两个目的：1)通过改变扩散隔障调节向呼吸粒子的代谢物供应，及2)便于从装置中移除代谢粒子。主要的缺点是要求开孔直径微小及导致的活塞的小尺寸。作为进一步复杂化，它们必须安装得非常好以避免在活塞和开孔之间代谢物可通过其扩散的间隙。从底部即通过活塞(3.10)测量从代谢物敏感检测器(3.3)也可能较为困难。

设计F，在图7中示出，具有检测器活塞的吸液管。此设计是一个怎样实现上述设计E的例子。它示出了特定的实施例，其中可调节底部形成有吸液管，用它从转移容器中拾取要研究的代谢粒子。吸液管(7.10)的柱塞的特殊之处在于它包括代谢物检测器(7.3)。在已经拾取呼吸粒子(7.1)以后，转动吸液管使尖头朝上并通过端口(7.14)插入到培养基容器的底部中。随后将培养基容器充满培养基(7.2)。吸液管的管筒作为隔室的侧壁(7.5)。

设计G，在图16中示出，具有带螺纹的可调节底部的开孔。此设计在功能上与前面两个相当，但其调节是以略微不同的方式实现的。它包括具有可调节尺寸的中央开孔(16.4)及同样通过转动可调节顶部(16.17)可调节周围的壁(16.5)相对固定底部(16.10)的高度。通过逆时针转动(l6.17)，可减小扩散隔障的厚度即液体层(16.4)的厚度，由此(16.17)通过螺纹(16.18)被移向包含周围培养基(16.2)的较大井的底部。由于隔室(16.10)的底部相对较大的井的底部固定，这导致隔室容积的下降及因此可渗透层(16.4)的厚度的下降及因此可渗透性的增大。检测器(16.3)从隔室的底部向包含周围培养基的较大的井的底部延伸，在那里它与记录单元接触。因为除了检测器表面(16.10)在代谢粒子(16.1)下面，检测器材料(16.3)嵌入在不可渗透井材料中，同一代谢物浓度应当在所有的检测器材料中观测到。因而可以将检测器延伸到在代谢粒子下面的水平盘。该盘可作为物理信号放大器，用于使用嵌入不可渗透材料中的对代谢物敏感的发光体但从下方观测的光学检测原理。因为整个检测器体积作为代谢物的储室其必须处于平衡以获得稳态信号，这种类型的信号放大或导致检测器的反应较慢。尽管这样在其他设计中这种类型的被动信号放大也可是有用的。该提出的设计的主要优点是当顶部被一路旋转下来时，对扩散隔障的渐进调整及对代谢粒子的容易的操作。主要的缺点是要求开孔直径微小及导致活塞小尺寸。进一步的复杂化是，它们必须安装得非常好以避免在活塞和开孔之间代谢物可通过其扩散的间隙。

具有对数代谢物浓度梯度的二维系统

在这个种类的设计中代谢粒子安置在两个不可渗透的平坦表面之间使得可渗透材料(即培养基)构成盘。在盘形圆筒中我们有基本上是放射状的扩散。在圆柱形扩散系统中，扩散沿圆柱形的半径发生，而沿圆柱形系统的纵轴没有改变。如果可忽略边缘效应，则形成由盘构成的扩散系统。在例4中的第三部分描述了关于这样的系统的扩散方程。如果我们假定在代谢粒子下面的检测器盘的半径是r₀＝0.5mm，而布置在代谢粒子上面的平坦表面的外径是r₁＝5mm。那么我们可以使用方程式4.3.7来计算在不可渗透平坦表面之间的距离l以获得想要的检测器信号

$l=\frac{Q\·\ln (r_1/r_0)}{2\mathrm{\π}\·D\·(C_W-C_0)}.$

给出上面的标准参数我们发现对有预期氧呼吸速率的物体要给出想要的信号，平坦表面之间的距离必须是20.1μm。

设计H，在图9中示出，在不可渗透板之间的扩散盘。这是一个其中代谢粒子(9.1)放置在靠近检测器(9.3)在不可渗透盘(9.5)下面的设计。该盘，其构成基本不可渗透的隔室的壁的上部，被间隔物(9.15)支撑以保持到基本不可渗透的隔室的壁(9.5)的下部的定好的距离。代谢粒子(9.1)放置在板中的一个浅井中。以阴影线示出间隔物(9.15)以示它们仅占据盘下一小部分区域并不构成对扩散的显著阻隔。通过改变支撑基本不可渗透隔室壁的上壁(盖)的间隔物的高度可调节扩散隔障。主要的缺点是需要高度平坦的表面使得在板之间的距离保持不变。在相对较大的10mm的直径上对平面度的偏离必须仅为几μm，以避免危及在不可渗透表面之间的间隙的均匀性。另一个问题是放置和移除紧密配合的盖要不太明显地打扰代谢粒子。

设计I，在图10中示出，以包起来的扩散盘作为锥形体的表面。这是一个与前面的设计功能上相当的设计，同样是可用于代谢物的扩散传输的可渗透空间限制在两个不可渗透表面之间。然而，在这个例子不可渗透表面不是平坦的而是由一个不可渗透锥形盖(10.5)插入到在不可渗透板(10.5)的锥形空腔中。代谢粒子(10.3)放置在充满培养基(10.2)的锥形空腔，在那里通过重力它到达停留在空腔的底部尖端。检测器(10.3)设置在靠近代谢粒子在空腔的尖端，锥形不可渗透盖放置在空腔中。间隔物(10.15)保证在盖和空腔之间保持定好的距离。此设计对比前面设计的优点是代谢粒子的密度使它下沉到在空腔的底部的检测器的位置。仍然必须以非常小的容差小心地控制在两个不可渗透件之间的间隔，这是较不易完成的。

具有双曲线浓度梯度的三维系统(圆锥-半球)

在这个种类的设计中代谢粒子放置在平坦的不可渗透表面或在这样的表面的圆锥形凹陷处中。这两种情况都是球形扩散系统的例子，其中不可渗透材料限制了代谢物能够接近代谢粒子的角度。如果我们将观测到的流动表达为锥形凹陷处的角度的函数，那么代谢粒子在不可渗透表面的半球形扩散图案可以由角度θ＝180°的同一组方程式来描述。在例4的第四个部分中描述了关于这样的系统的扩散方程式。如果我们假定锥形在代谢粒子的位置处的半径是r₀＝0.5mm，而锥形凹陷处的外径是r₁＝3mm。那么我们可以使用方程式4.4.7来计算在锥形的尖端的圆锥顶角θ以获得想要的检测器信号

$\mathrm{\θ}=2\·{\cos }^{-1}[1-\frac{Q(\frac{1}{r_0}-\frac{1}{r_1})}{2\mathrm{\π}\·D\·(C_W-C_0)}]---\left(5.3\right)$

给出上面的标准参数我们发现对具有预期氧呼吸速率的物体要给出想要的信号锥形的顶角必须是20°。这对应于深2.5mm的锥形孔，其具有1.05mm的开口和170μm宽的底部。在例7中举出了一个朝向呼吸粒子的代谢物浓度梯度的例子，在此例中鼠胚泡在锥形孔中。

设计J，在图5A中示出，在检测器板上的代谢粒子。此设计是某种扩散隔室中可能实现的最简单的，该种扩散隔室是完全敞开的且由嵌入到代谢粒子(5.1)被放置的表面中的检测器(5.3)在二维上记录代谢物梯度。5B示出显示代谢物的浓度等高线(5.11)的在代谢粒子的水平上的底部的横截面。5C示出如同从CCD相机(5.12)中看到的假设的图像(顶视图或底视图)，其中在每个个体代谢粒子周围的预期的检测器信号以灰阶显示。在这种类型的结构中已经测量了靠近牛胚胎的微电极的轮廓。在例3中介绍了该实验。此设计的优点是简单，主要的缺点是在确定非常靠近代谢粒子的局部代谢物浓度时必须的精确度。因为球形扩散在短距离上是非常有效的空间分辨率是至关紧要的。

设计K，在图17中示出，具有锥形凹陷处的板。此设计包括具有500-3000μm深的有适当角度30(例如15到60度)锥形凹陷处的不可渗透板(17.5)，其放置在又一个具有亲水表面的轻微的凹陷处。该板表面的剩余部分是憎水的。有适当体积10-20μl的一滴(17.2)充满了该两个凹陷处并构成可渗透扩散隔障(17.4)。代谢粒子(17.1)放置在锥形凹陷处(17.4)的底部从而它嵌入到不可渗透材料(17.3)中的检测器材料(17.3)盘接触。如上面对设计G所描述的，检测器延伸成为在代谢粒子下面的水平盘使得它能够充当对光学检测原理的物理信号放大器。一层在该滴上面的适当的油防止从该滴的蒸发并消除在该滴(容器内粗阴影线的液体)内的对流从而用于实际目的的该滴培养基(17.2)被保持为停滞。可选的，在锥形凹陷处(17.4)外的量是周围培养基的一部分并因而不特别包括在可渗透扩散隔障中，除非因为其他原因它保持停滞。通过移动代谢粒子到具有不同角度及/或深度的其他锥形凹陷处(隔室)中，可调节扩散隔障的可渗透性，如在例4及上面的方程式中所解释的，可计算特定的锥形隔室的可渗透性。

在例7中介绍了这样的设计的实验结果。此设计的主要优点是简单，然而需要获得在相当深且狭窄的锥形凹陷处的在代谢物浓度上的可测量的差异，因而接近上述的简单开孔。因而并不肯定当与如A类型装置描述的简单开孔相比，是否锥形凹陷处在操作(特别是关于从装置中取出呼吸物体)上产生可察觉的进步。

由上述设计的组合构成的不规则系统，其中需要更复杂的模型来描述浓度梯度

设计L，在图8中示出，具有厚度可调节的盖子的隔室。此设计使用盖子(8.4)作为非液态扩散隔障，组成其的材料对代谢物的渗透性小于培养基但仍大于隔室的不可渗透壁(8.5)的渗透性。代谢粒子(8.1)放置在不可渗透板中的一个浅井中。检测器(8.3)放置在该井的底部。该井具有具有变动厚度(8.4)的代谢物可渗透盖子。通过水平方向上简单地移动盖子而用盖子的具有不同厚度的不同部分覆盖该井，这样我们能够调节扩散隔障。在此图中，井和盖子被一小滴培养基(8.2)覆盖，该滴培养基浸没在油的盖层(8.13)下面以防止蒸发，也可以用培养基充满容器而没有油。此设计的主要优点是简单、在比较浅的井中易于处理代谢粒子，及具有盖子的可调节的“紧凑”扩散隔障。主要的缺点是要保证在盖子和基板之间的紧密配合。如果该配合不充分，代谢粒子可能水平扩散到隔室中。

设计M，在图12中示出，具有部分敞开的盖子的隔室。此设计几乎与前面的相同，除了它使用不可渗透盖子(12.5)，该盖子部分覆盖井，留下一个小的开口(12.7)作为代谢物的扩散隔障。此设计的主要优点是简单及调节扩散隔障的可调节盖子，然而缺点是因为没有在每次测量中保持对盖子的精确位置的细致的追踪，在校准这样的不规则系统中可预见的困难。

设计N，在图13中示出，具有带腹孔的不可渗透盖子的隔室。此设计在功能上与前一设计相同，除了它使用在不可渗透盖子(13.5)中的中央孔(13.7)作为不可调节的扩散隔障。要改变扩散隔障可以将该盖子更换为另一个具有更大尺寸的孔的盖子。与前一设计相比，它非常简单并可能更易于校准及使用。主要的缺点是要保证在盖子和基板之间的紧密配合。如果配合不充分，代谢物可能水平扩散到隔室中。

设计O，在图14中示出，具有代谢粒子入口及出口的立方体。该设计是浸没在培养基(14.2)中的不可渗透立方体(14.5)，它包含两个连接到中央隔室的开孔(14.4)。每个开孔具有一个漏斗形的入口(14.7)。开始代谢粒子(14.1)滴入垂直定向的漏斗并通过重力使其停留在检测器(14.3)上，由于通过两个孔补充代谢物最终得到的代谢物浓度梯度较复杂。然而给出装置的正确尺寸，数学模型可以预测预期的梯度。一旦设计完成可以使用已知代谢速率的代谢粒子来校准它。一个明显的优点是通过转动立方体使粒子通过重力落下来可以取回代谢粒子。通过转动立方体也可以将代谢粒子沉置在隔室具有不同检测器的其他侧面上。如果必须放出代谢粒子可以施加穿过立方体的对流流动。缺点是设计更复杂及代谢粒子可能卡在隔室内。

例6在具有鼠胚胎的圆柱形隔室中的氧的光学测量

在根据图11的特定实施例中评估总体的测量原理。根据下面的描述测量在胚泡阶段的鼠胚胎的呼吸活动。

装置

看在例5中的详细描述，B样式，在图11中示出。

它由两个由玻璃制成的不可渗透件组成。一个玻璃板形成底部(11.5)。在该板上放置高h为4mm的小的玻璃圆柱体(11.5)。直径d为0.5mm的圆柱形孔(11.4)穿过该玻璃圆柱的中心。在该孔面向容器表面的一端，用钻头将该孔挖空(“挖洞”)以形成放置呼吸粒子(11.1)的小的圆锥形空腔。圆柱形空腔的上壁覆盖有氧可熄灭卟啉荧光团(在聚苯乙烯中的铂(II)-8乙基卟啉)。用齿蜡将玻璃圆柱粘附并密封在玻璃板上，以避免氧在两个玻璃件之间的界面上的水平传输。

胚胎：

在第0日用61.U.PMSG(Folligonvet，Intervet，丹麦)i.p处理三到四周大的发育不成熟的雌性B6D2F1鼠(雄性DBA/2J与雌性C57BL/6L之间的F1杂交后代)。两天后(第3日)用61.U.SuigonanVet.(Suigonan，Intervet，丹麦4001.E.血清促性腺激素2001.E.绒毛膜促性腺激素)处理它们。在同一天使雌性与成熟(已测生育能力)雄性B6D2F1鼠交配。在交配两天后(第5日)使用培养基M2(西格马化学，圣路易斯.美国)从输卵管中冲洗出两细胞胚胎。在冲出后，将胚胎转移到M16(西格马化学，圣路易斯.美国)培养基中并在37℃在5％CO₂的空气大气下培养。动物被关在Macrolon II型笼(Techniplast，意大利)中，可随意得到食物(Altromin #1314，Brogaarden丹麦)和水。

根据图11(在例5中的类型B设计)的装置放置在以微滴定量格式(NuncA/S，Roskilde丹麦)的Nunc 12井盘，充满M2培养基，并留置60分钟以在孵卵器中达到平衡。通过从转移吸液管将胚胎在中央孔(11.7)的口部喷出并让它下沉到底部通过重力到该室中(11.1)，在胚泡阶段(交配后5天)的胚胎被转移到装置中。通过反转显微镜方法使得从下面直接视觉检察该室，来核实胚胎到达室中。分别使用360nm和550nm的激发光及在TecanSpectraflour荧光板读出器中记录650nm的发射光，记录下从氧可熄灭卟啉荧光团(在聚苯乙烯中的铂(II)-8乙基卟啉)来的，与孵育室(11.3)中的培养基接触的荧光强度。激发后从0-500μs记录荧光。使用修正的Stern-Volmer方程将荧光强度转变为氧分压，该方程根据Klimant等人1995(“纤维光学氧微传感器，一种在水生生物学中的新工具”，湖泊学及海洋学40：1159-1165)充分描述了大多数optrode的反应：

$I=I_0[\mathrm{\α}+(1-\mathrm{\α})\left(\frac{1}{1+K_{\mathrm{SV}}C}\right)]$

其中α是包括散射的杂散光的荧光非熄灭部分，I₀是在将胚胎放置在装置中后没有时的荧光强度，氧分压从21％(大气浓度)下降到接近17％在装置的垂直圆柱形空腔(图11中11.4)的高度(4mm)上产生4％的氧的梯度(或19％的大气饱和度)。在38℃(孵育温度)氧的溶解度是210μM产生100μM cm^-1的梯度(dC/dX)。在38℃的培养基中的扩散系数是近似3.45*10^-5cm² s^-1，其产生3.45*10^-12mol cm^-2s^-1的流量。由于管具有0.00196cm²的横截面面积，这给出胚胎的明确的呼吸速率微0.677*10^-14mol每胚胎每秒，或0.546*10^-9l每胚胎每小时(0.546nl O₂h^-1)。

例7在锥形凹陷中的微传感器测量

通过将60度尖角钢棒压入聚苯乙烯塑料板的的表面在2cm宽的井的底部制造一个0.04cm深的锥形凹陷处。用薄层齿蜡涂直径4mm的围绕该凹陷处的圆。用吸液管吸取大约20μl的培养基到凹陷处及在蜡圆中的区域内，在注入5ml石蜡油到井中以覆盖该滴培养基之前，将一个四天大直径约100μm的鼠胚胎放置在该凹陷处的底部。该盘放置到37℃的水浴室中，固定在马达驱动的微型机械手中的氧传感器的尖头定位于凹陷处的上方。编程一个既能控制微型机械手也能从微传感器放大器中获得信号的个人电脑软件来进行沿朝向胚胎的垂直线步长为5微米的氧测量。在图20中示出测得的浓度对微传感器到胚胎的距离。在胚胎表面，其位于大约离凹陷处尖端、底部0.015cm，浓度为206μM，使用公式4.4.7该浓度对应为0.11nl/小时的氧消耗率。从图中可以看到，测量了朝向胚胎的完整的浓度曲线，使用公式4.4.7来模拟这一曲线得到很好的配合，其证实该模型的正确性。

参考资料

Hongan MC。用于测量在孤立骨骼肌纤维内的细胞内PO2的磷光熄灭方法。

J应用生理学。1999二月；86(2)：720-4

Trettnak W，Kolle C，Reininger F，Dolezal C，O’Leary P，Binot RA。基于发光寿命的检测的光学氧传感器设备。

高级太空研究。1998；22(10)：1465-74

Gewehr PM，Delpy DT。光学氧传感器，基于磷光寿命熄灭及使用聚合物固定金属卟啉探针。部分1。原理及设备。医学生物Eng Comput。1993一月；31(1)：2-10。

Klimant，I.，Meyer，V.，Kühl，M。1995。纤维光学氧微传感器，一种在水生生物学中的新工具。湖泊学及海洋学，40(6)1159-1165)

Glud，R.N.，Ramsing，N.B.，Gundersen，J.K.，及Klimant，I。(1996)。平面optrodes，一种用于对在海底微生物群落中的氧的二维分布的精细测量。海洋生态进展。140卷：217-226。

RN Glud，JK Gundersen，NB Ramsing(2000)电化学及用于现场测定的光学氧微传感器。在水生系统的现场检测：化学分析和物种形成。JohnWiley&Sons Ltd(eds J Buffle&G Horvai)。第二章：19-73.

Claims (70)

1.一种对基本球形代谢粒子的个体代谢速率的非侵入测量的装置，该装置包括

a)至少一个隔室，所述隔室由扩散隔障确定并能够包括具有基本球形代谢粒子的培养基，所述扩散隔障允许代谢物经由扩散向及/或从基本球形代谢粒子传输，由此使得能建立从基本球形代谢粒子并贯穿培养基的代谢物扩散梯度，

b)至少一个用于测量在隔室内的代谢物的浓度的检测器。

2.如权利要求1所述的装置，其中该扩散隔障由具有至少一个代谢物可渗透的开口的隔室壁和培养基构成。

3.如权利要求2所述的装置，其中该隔室壁由代谢物基本不可渗透的材料制成。

4.如权利要求3所述的装置，其中基本不透过代谢物的材料具有小于在水中的代谢物扩散系数的1％的代谢物扩散系数，特别是小于0.2％，尤其是小于0.05％。

5.如权利要求2-4中任一所述的装置，其中穿过基本不透过代谢物的材料的隔室壁的代谢物流量在全部到隔室的代谢物流量中占小于10％，特别是小于1％，尤其是小于0.1％。

6.如权利要求3所述的装置，其中基本不透过气体的材料从塑料材料、聚合物材料、玻璃材料、金属材料，及陶瓷材料及它们的组合中选择。

7.如权利要求6所述的装置，其中聚合物材料从如缩醛树脂、丙烯酸树脂、纤维素塑料、氟塑料、离聚物、聚对二甲苯基、聚酰胺、聚酰胺纳米合成物、聚碳酸酯、聚酯、聚酰亚胺、聚烯烃、硫化聚苯、聚砜、聚苯乙烯树脂、乙烯树脂、可塑合金、多组分聚合物、环氧树脂、石蜡热塑弹性体、聚醚嵌段氨化物、聚丁二烯热塑弹性体、苯乙烯热塑弹性体、乙烯热塑弹性体、橡胶材料如丁二烯橡胶、丁基橡胶、溴丁基橡胶、氯丁基橡胶、聚异丁烯橡胶、氯硫化聚乙烯橡胶、环氧氯丙烷橡胶、乙烯-丙稀橡胶、氟橡胶、天然橡胶、氯丁橡胶、丁腈橡胶、聚硫橡胶、聚氨酯、硅橡胶、苯乙烯-丁二烯橡胶或其共聚物中选择。

8.如权利要求1所述的装置，其中该扩散隔障由高粘性培养基构成。

9.如权利要求8所述的装置，其中该高粘性培养基是归因于从葡萄聚糖、甘油、糖、碳水化合物、蛋白质及无机盐中选择的高浓度的有机溶质。

10.如前面权利要求中任一所述的装置，其中隔室的形状从圆柱形、多面体形、锥形、半球形或它们的组合中选择。

11.如权利要求10所述的装置，其中隔室的大体形状是圆柱形。

12.如前面权利要求中任一所述的装置包括用于调节隔室的横向尺寸的插入物。

13.如前面权利要求中任一所述的装置，为了改变尺寸及或者增加或者减少隔室体积，隔室具有可调节底部。

14.如前面权利要求中任一所述的装置，其中横向尺寸小于2.5mm，特别是小于1.5mm，尤其是小于500μm，例如小于250μm。

15.如权利要求12所述的装置，其中插入物的横向尺寸小于1.5mm，特别是小于1.0mm，尤其是小于500μm，特别尤其是小于300μm。

16.如前面权利要求中任一所述的装置，其中隔室的纵向尺寸在2mm到25mm之间，尤其是在3mm到15mm之间。

17.如权利要求2所述的装置，其中该代谢物可渗透的开口由代谢物可渗透膜构成。

18.如权利要求17所述的装置，其中该代谢物可渗透膜由包括硅树脂、特氟纶含氟聚合物、可塑化合物例如聚乙烯、聚丙烯或氯丁橡胶的材料制成。

19.如权利要求17所述的装置，其中代谢物可渗透膜由包括可渗透充填物或多孔材料如玻璃、陶瓷、矿物质、玻璃或矿物纤维、或贵金属如金或铂的材料制成。

20.如权利要求17所述的装置，其中代谢物可渗透膜由包括硅树脂的材料制成。

21.如前面权利要求中任一所述的装置，其中在至少一个隔室的底部设置代谢物可渗透膜。

22.如权利要求21所述的装置，其中该代谢物可渗透层由包括硅树脂、特氟纶含氟聚合物、可塑化合物例如聚乙烯、聚丙烯或氯丁橡胶的材料制成。

23.如权利要求21所述的装置，其中代谢物可渗透层由包括可渗透充填物或多孔材料如玻璃、陶瓷、矿物质、玻璃或矿物纤维、或贵金属如金或铂的材料制成。

24.如权利要求21所述的装置，其中代谢物可渗透层由包括硅树脂的材料制成。

25.如前面权利要求21-24中任一所述的装置，其中代谢物可渗透层的厚度为至少100μm，特别是至少300μm，尤其是至少900μm。

26.如前面权利要求中任一所述的装置，其中代谢物检测器放置在隔室的底部。

27.如权利要求21-26中任一所述的装置，其中代谢物可渗透层放置在基本球形代谢粒子和代谢物检测器之间。

28.如权利要求21-27中任一所述的装置，其中代谢物可渗透层的厚度至少为基本球形代谢粒子的直径的两倍。

29.如前面权利要求中任一所述的装置，其中该代谢物是气体。

30.如前面权利要求中任一所述的装置，其中代谢物是氧或二氧化碳。

31.如前面权利要求中任一所述的装置，其中该检测器是氧检测器。

32.如权利要求31所述的装置，其中用于测量氧浓度的检测器包括电流测量氧传感器、薄膜入口质谱分析法、显微分光技术或光学氧检测。

33.如权利要求32所述的装置，其中使用发光体，特别是放置在隔室内尤其是在底部的固定不动的发光体，以及发光检测器来完成光学氧检测。

34.如权利要求33所述的装置，其中该发光体包括

在聚苯乙烯填充物中固定的钌(II)-三-4，7-联苯-1，10-菲咯啉高氯酸盐(Rudpp)、钌(II)-三-1，7-联苯-1，10-菲咯啉氯化物、钌(II)-三(联吡啶)络合物、三(2，2’-联吡啶二氯-钌)六水合物、Ru(bpy)、在聚苯乙烯中的铂(II)-八-乙基-卟啉、在聚(甲基丙烯酸甲酯)中的铂(II)-八-乙基-卟啉、在聚苯乙烯中的铂(II)-八-乙基-酮-卟啉、铂(II)-八-乙基-酮-卟啉、在聚苯乙烯中的钯(II)-八-乙基-卟啉、铂-1，2烯-连二硫酸盐类的化合物。

35.如权利要求33所述的装置，其中该发光检测器是发光读出器、光电倍增管或CCD相机(12)。

36.一种用于测定基本球形代谢粒子的代谢速率的非侵入的方法，包括

a)提供至少一个如权利要求1到35中任一所定义的装置，

b)在一个隔室的培养基中设置基本球形代谢粒子，

c)测量在隔室中的代谢物浓度得到代谢物浓度的量，及

d)将所述代谢物浓度的量与所述基本球形代谢粒子的代谢速率联系起来。

37.如权利要求36所述的方法，其中该代谢物经由通过培养基的扩散被供应到基本球形代谢粒子。

38.如权利要求36-37中任一所述的方法，其中该基本球形代谢粒子是在隔室中培育。

39.如权利要求36-38中任一所述的方法，其中在一个比隔室的体积及/或培养基的体积小的体积中测量代谢物浓度。

40.如权利要求36-39中任一所述的方法，其中通过基于测得的代谢物浓度确定隔室中的代谢物扩散梯度，及将所述代谢物扩散梯度与所述基本球形代谢粒子的代谢速率联系起来而确定所述基本球形代谢粒子的代谢速率。

41.如权利要求36-40中任一所述的方法，其中至少完成对代谢物浓度的两次测量。

42.如权利要求36-41中任一所述的方法，其中该代谢物浓度是气体分压。

43.如权利要求42所述的方法，其中该气体分压是氧或二氧化碳的分压。

44.如权利要求36-43中任一所述的方法，其中气体通过穿过在隔室中的停滞的培养基的扩散被直接从大气或从与大气处于平衡的较大体积的培养基供应到基本球形代谢粒子。

45.如权利要求36-44中任一所述的方法，其中该基本球形代谢粒子从胚胎、细胞团例如癌细胞、干细胞、胚胎干细胞、C.elegans或其他小的多细胞生物体。

46.如权利要求45所述的方法，其中该基本球形代谢粒子是胚胎。

47.如权利要求36-46中任一所述的方法，其中在暂时切断从隔室外对隔室的扩散性的代谢物供应之后实施对代谢物浓度的测量。

48.一种用于在培育期间调节对基本球形代谢粒子的代谢物供应的方法，包括

a)提供至少一个包括具有培养基的隔室的装置，

b)在隔室的培养基中培育基本球形代谢粒子，

c)测量在隔室中的代谢物浓度得到代谢物浓度的量，并任选地

d)将所述代谢物浓度的量与所述基本球形代谢粒子的代谢速率联系起来并任选地

e)依赖于代谢物浓度的量及/或所述基本球形代谢粒子的代谢速率调节代谢物供应。

49.如权利要求48所述的方法，其中至少一个所述的装置是如同权利要求1-35中任一所定义的。

50.如权利要求48或49所述的方法，其中该代谢物是气体

51.如权利要求50所述的方法，其中该代谢物是氧而代谢过程是呼吸。

52.如权利要求48或49所述的方法，其中通过改变隔室外的代谢物浓度来实施所述调节。

53.如权利要求48或49所述的方法，其中通过改变隔室的尺寸来实施所述调节。

54.如权利要求53所述的方法，其中通过插入插入物来调节体积。

55.如权利要求53所述的方法，其中通过插入插入物来调节隔室的横向尺寸。

56.如权利要求53所述的方法，其中通过改变隔室的可调节底部的位置来调节体积。

57.如权利要求53所述的方法，其中通过改变隔室的扩散隔障来实施调节。

58.如权利要求53所述的方法，其中通过改变隔室壁的厚度来改变扩散隔障。

59.如权利要求53所述的方法，其中通过改变至少一个在隔室壁上的开口的尺寸来实施调节。

60.一种用于选择有存活力的胚胎的方法，包括，

a)在培育期间至少有一次测定该胚胎的代谢速率，及

b)选择具有最优代谢速率的胚胎。

61.如权利要求60所述的方法，其中不引起胚胎经受的生长环境的任何改变来实施对代谢速率的测定。

62.如权利要求60-61中任一所述的方法，其中在如权利要求1-35中任一所定义的装置中测量该代谢速率。

63.如权利要求60-61中任一所述的方法，其中用在权利要求36-47中任一所定义的方法测定该代谢速率。

64.一种用于测定代谢粒子的代谢速率的非侵入的方法，包括

a)提供至少一个如权利要求1-35所定义的装置，

b)在一个隔室的培养基中培育代谢粒子，

c)在培育的至少部分期间中减少对培养基的代谢物供应，

d)在减少了代谢物供应后测量在隔室中的代谢物浓度得到代谢物浓度的量，及

e)将所述代谢物浓度的量与所述基本球形代谢粒子的代谢速率联系起来。

65.如权利要求64所述的方法，其中该代谢物是氧而代谢速率是呼吸速率。

66.如权利要求64所述的方法，其中该氧供应被减小到零。

67.如权利要求64所述的方法，其中在减少氧供应期间已经获得在隔室中的气体分压的量。

68.一种用于培育代谢粒子的培育装置，该装置包括至少一个隔室，所述隔室由扩散隔障确定并能包括具有基本球形代谢粒子的培养基，所述扩散隔障允许代谢物经由扩散向及/或从代谢粒子传输，由此使得能建立从代谢粒子并贯穿培养基的代谢物扩散梯度。

69.如权利要求68所述的方法，其中所述装置具有一个或更多的如权利要求1-35中任一所定义的特征。

70.一种用于培育代谢粒子的方法，所述方法包括

a)提供至少一个如权利要求68-69中任一所定义的装置，

b)在隔室的培养基中设置代谢粒子，及

c)培育该代谢粒子。

Images