JP2001330582A - 細胞呼吸活性評価方法及びその装置 - Google Patents
細胞呼吸活性評価方法及びその装置Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 試料溶液近傍の局所酸素濃度変化を計測する
ことにより、細胞など生体試料の含まれる試料溶液内の
代謝活性つまり呼吸活性や光合成活性を評価することが
できる細胞呼吸活性評価方法及びその装置を提供する。 【解決手段】 試料溶液Ａをキャピラリ管１にセット
し、このキャピラリ管口には酸素透過性膜２を配置し、
測定溶液Ｂに浸すとともに、前記キャピラリ管口の近傍
に微小電極６を設け、この微小電極６に対応する参照極
７および対極８とを配置し、前記微小電極６を作用極と
し、前記参照極７および対極８間で電位制御および電流
検出を行い、微小体積の試料溶液Ａを調製するとととも
に、前記キャピラリ管１の３次元位置制御を行い、試料
の酸素濃度を選択的に還元電流により評価する。
ことにより、細胞など生体試料の含まれる試料溶液内の
代謝活性つまり呼吸活性や光合成活性を評価することが
できる細胞呼吸活性評価方法及びその装置を提供する。 【解決手段】 試料溶液Ａをキャピラリ管１にセット
し、このキャピラリ管口には酸素透過性膜２を配置し、
測定溶液Ｂに浸すとともに、前記キャピラリ管口の近傍
に微小電極６を設け、この微小電極６に対応する参照極
７および対極８とを配置し、前記微小電極６を作用極と
し、前記参照極７および対極８間で電位制御および電流
検出を行い、微小体積の試料溶液Ａを調製するとととも
に、前記キャピラリ管１の３次元位置制御を行い、試料
の酸素濃度を選択的に還元電流により評価する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、試料溶液近傍の局
所酸素濃度変化を計測する細胞呼吸活性評価方法及びそ
の装置に関するものである。
所酸素濃度変化を計測する細胞呼吸活性評価方法及びそ
の装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】近年ライフサイエンス技術の進歩に伴
い、動植物細胞の細胞分裂及び細胞分化機構が分子・細
胞レベルで解明できるようになった。しかし、多くの場
合、従来の測定技術では、多数の細胞を必要とするか、
測定前の処理や操作により細胞を変性ないしは死滅させ
ることが避けられなかった。
い、動植物細胞の細胞分裂及び細胞分化機構が分子・細
胞レベルで解明できるようになった。しかし、多くの場
合、従来の測定技術では、多数の細胞を必要とするか、
測定前の処理や操作により細胞を変性ないしは死滅させ
ることが避けられなかった。
【０００３】従って、単一細胞レベルで、しかも、細胞
を生存させたまま細胞生存能や細胞分化能を測定するこ
とが可能な技術の開発が求められている。
を生存させたまま細胞生存能や細胞分化能を測定するこ
とが可能な技術の開発が求められている。
【０００４】具体的には、細胞の代謝活性を正確に測定
することにより、受精卵（胚）、プロトプラストを含め
た動植物細胞の（１）生存性及び品質評価法としての応
用、（２）分化機能や生理活性物質産生の測定技術とし
ての活用、（３）遺伝子導入細胞の選択技術としての応
用などが考えられる。
することにより、受精卵（胚）、プロトプラストを含め
た動植物細胞の（１）生存性及び品質評価法としての応
用、（２）分化機能や生理活性物質産生の測定技術とし
ての活用、（３）遺伝子導入細胞の選択技術としての応
用などが考えられる。
【０００５】細胞などの生体試料の代謝活性、特に呼吸
活性に由来する酸素濃度変化の計測は、生体試料の機能
を評価する上で最も基本的、かつ、簡便な指標の１つで
ある。酸素濃度計測においては、既にクラーク型酸素電
極が従来技術として存在し、酸素還元電流による酸素濃
度評価が行われている。クラーク型酸素電極は、酸素透
過性膜、電解液及び電極で構成され、細胞懸濁液に限ら
ず酸素濃度変化の期待される試料溶液に広く適用可能で
ある。クラーク型電極を生体試料溶液の酸素濃度計測に
適用する場合の大きな利点は、酸素の選択的透過と、酸
素以外の電極活性物質・電極汚染物質の浸入防止という
２つに集約され、信頼性の高い良質の分析手法としての
地位を確立してきた。
活性に由来する酸素濃度変化の計測は、生体試料の機能
を評価する上で最も基本的、かつ、簡便な指標の１つで
ある。酸素濃度計測においては、既にクラーク型酸素電
極が従来技術として存在し、酸素還元電流による酸素濃
度評価が行われている。クラーク型酸素電極は、酸素透
過性膜、電解液及び電極で構成され、細胞懸濁液に限ら
ず酸素濃度変化の期待される試料溶液に広く適用可能で
ある。クラーク型電極を生体試料溶液の酸素濃度計測に
適用する場合の大きな利点は、酸素の選択的透過と、酸
素以外の電極活性物質・電極汚染物質の浸入防止という
２つに集約され、信頼性の高い良質の分析手法としての
地位を確立してきた。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、空間分
解能を有さず１本の電極で一度に複数サンプルを評価す
ることは不可能である。また、微細加工技術を駆使した
電極の微小化ではめざましい成果が挙がっているにもか
かわらず、計測するサンプルの体積を微小化する工夫は
十分であるとは言い難い。従って、試料として通常１０
5 〜１０7 個という大量の細胞を必要とする。
解能を有さず１本の電極で一度に複数サンプルを評価す
ることは不可能である。また、微細加工技術を駆使した
電極の微小化ではめざましい成果が挙がっているにもか
かわらず、計測するサンプルの体積を微小化する工夫は
十分であるとは言い難い。従って、試料として通常１０
5 〜１０7 個という大量の細胞を必要とする。
【０００７】微小電極を探針とし、探針の位置を精密に
制御しながら試料表面に近接させ走査させることによ
り、特定化学種の分布を画像化する計測技術として電気
化学顕微鏡（ＳＥＣＭ）がある〔Ａ．Ｊ．Ｂａｒｄ ｅ
ｔ ａｌ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６１，１３２−１３８
（１９８９）；Ｒ．Ｃ．Ｅｎｇｓｔｒｏｍ ｅｔ ａ
ｌ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．５８，８４４−８４８（１９
８６）〕。
制御しながら試料表面に近接させ走査させることによ
り、特定化学種の分布を画像化する計測技術として電気
化学顕微鏡（ＳＥＣＭ）がある〔Ａ．Ｊ．Ｂａｒｄ ｅ
ｔ ａｌ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６１，１３２−１３８
（１９８９）；Ｒ．Ｃ．Ｅｎｇｓｔｒｏｍ ｅｔ ａ
ｌ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．５８，８４４−８４８（１９
８６）〕。
【０００８】本来電極表面の特性評価用に開発された技
術であるが、既に生体試料の機能評価、酸素濃度の計測
にも応用されている。本発明も計測原理は電気化学顕微
鏡に類似のものであると言える。しかしながら、酸素選
択性を高める特別な工夫を施した研究例は報告されてい
ない。即ち、今まで報告のある電気化学顕微鏡による酸
素濃度計測においては、測定溶液中において、酸素還元
の起こる電位領域で電極反応する物質が予め除外されて
いる。同時に、測定溶液中において、探針電極の表面を
汚染するタンパク質等の物質は予め除外されている。つ
まり現状では、試料の細胞や生体組織は、それらが生育
する上で理想的な環境というべき培養溶液とは異なる組
成の測定溶液中においてのみ酸素濃度計測が可能であ
る。
術であるが、既に生体試料の機能評価、酸素濃度の計測
にも応用されている。本発明も計測原理は電気化学顕微
鏡に類似のものであると言える。しかしながら、酸素選
択性を高める特別な工夫を施した研究例は報告されてい
ない。即ち、今まで報告のある電気化学顕微鏡による酸
素濃度計測においては、測定溶液中において、酸素還元
の起こる電位領域で電極反応する物質が予め除外されて
いる。同時に、測定溶液中において、探針電極の表面を
汚染するタンパク質等の物質は予め除外されている。つ
まり現状では、試料の細胞や生体組織は、それらが生育
する上で理想的な環境というべき培養溶液とは異なる組
成の測定溶液中においてのみ酸素濃度計測が可能であ
る。
【０００９】また、電気化学顕微鏡の探針である微小電
極による酸素濃度計測の研究例においては、電気化学顕
微鏡の項目で挙げたような未修飾の電極をそのまま用い
た研究例の他に、電極を修飾し機能を加えることによ
り、酸素選択性及び電極表面汚染防止能の向上を意図し
た研究例もある〔Ｙ．Ｙ．Ｌａｕ ｅｔ ａｌ．Ａｎａ
ｌ．Ｃｈｅｍ．６４，１７０２−１７０５（１９９
２）；Ｒ．Ｔ．Ｋｅｎｎｅｄｙ ｅｔ ａｌ．Ａｎａ
ｌ．Ｃｈｅｍ．７１，３６４２−３６４９（１９９
９）〕。しかし、微小電極表面の修飾は極めて高等な手
技を要する上に再現性にも問題がある。
極による酸素濃度計測の研究例においては、電気化学顕
微鏡の項目で挙げたような未修飾の電極をそのまま用い
た研究例の他に、電極を修飾し機能を加えることによ
り、酸素選択性及び電極表面汚染防止能の向上を意図し
た研究例もある〔Ｙ．Ｙ．Ｌａｕ ｅｔ ａｌ．Ａｎａ
ｌ．Ｃｈｅｍ．６４，１７０２−１７０５（１９９
２）；Ｒ．Ｔ．Ｋｅｎｎｅｄｙ ｅｔ ａｌ．Ａｎａ
ｌ．Ｃｈｅｍ．７１，３６４２−３６４９（１９９
９）〕。しかし、微小電極表面の修飾は極めて高等な手
技を要する上に再現性にも問題がある。
【００１０】本発明は、かかる状況に鑑みて、以下のよ
うな細胞呼吸活性評価方法及びその装置を提供すること
を目的とする。
うな細胞呼吸活性評価方法及びその装置を提供すること
を目的とする。
【００１１】（１）微小電極により、細胞が放出／吸収
する物質を計測する際には、電極を細胞に最近接させ
る。しかし、この測定原理では、微小電極で検出できる
物質の量は、実際に細胞が放出／吸収した物質の総量と
比較してごく僅かである。つまり、検出感度／効率の観
点から、従来の微小電極法を単一細胞由来の代謝関連物
質の計測に適用可能な場合は非常に限られている。これ
に対し、本発明は、計測対象物質の希釈／拡散を防ぎ、
物質を効率良く検出するために、試料溶液の微小体積化
を実現する方法を提供するものである。試料体積の微小
化は、試料溶液中に含まれる細胞数を大幅に減ずる役割
も果たし、１個の細胞を試料容器の中に閉じこめること
も可能にする。
する物質を計測する際には、電極を細胞に最近接させ
る。しかし、この測定原理では、微小電極で検出できる
物質の量は、実際に細胞が放出／吸収した物質の総量と
比較してごく僅かである。つまり、検出感度／効率の観
点から、従来の微小電極法を単一細胞由来の代謝関連物
質の計測に適用可能な場合は非常に限られている。これ
に対し、本発明は、計測対象物質の希釈／拡散を防ぎ、
物質を効率良く検出するために、試料溶液の微小体積化
を実現する方法を提供するものである。試料体積の微小
化は、試料溶液中に含まれる細胞数を大幅に減ずる役割
も果たし、１個の細胞を試料容器の中に閉じこめること
も可能にする。
【００１２】（２）次に、本発明は、試料溶液と測定溶
液を分離し、両溶液間で移動可能な物質を計測対象物質
に限定する方法を提供する。本発明により、試料溶液側
に含まれ、電気化学検出に悪影響を及ぼすタンパク質や
電気化学的活性種が測定溶液側へ浸入することを防止
し、同時に、測定溶液側に含まれる細胞毒性を有する物
質が試料溶液側へ浸入することを回避することができ
る。本発明を適用することにより、微小電極自体は機能
化する必要がなく、未修飾の微小電極をそのまま使用す
ることができる。
液を分離し、両溶液間で移動可能な物質を計測対象物質
に限定する方法を提供する。本発明により、試料溶液側
に含まれ、電気化学検出に悪影響を及ぼすタンパク質や
電気化学的活性種が測定溶液側へ浸入することを防止
し、同時に、測定溶液側に含まれる細胞毒性を有する物
質が試料溶液側へ浸入することを回避することができ
る。本発明を適用することにより、微小電極自体は機能
化する必要がなく、未修飾の微小電極をそのまま使用す
ることができる。
【００１３】本発明は、上記（１）、（２）を踏まえ
て、試料溶液近傍の局所酸素濃度変化を計測することに
より、細胞など生体試料の含まれる試料溶液内の代謝活
性つまり呼吸活性や光合成活性を評価することができる
細胞呼吸活性評価方法及びその装置を提供する電極を直
接試料溶液内に挿入することなしに試料溶液の計測対象
物質濃度を評価する方法を提供することを目的とする。
て、試料溶液近傍の局所酸素濃度変化を計測することに
より、細胞など生体試料の含まれる試料溶液内の代謝活
性つまり呼吸活性や光合成活性を評価することができる
細胞呼吸活性評価方法及びその装置を提供する電極を直
接試料溶液内に挿入することなしに試料溶液の計測対象
物質濃度を評価する方法を提供することを目的とする。
【００１４】
【課題を解決するための手段】本発明は、上記目的を達
成するために、 〔１〕細胞呼吸活性評価方法において、試料溶液をキャ
ピラリ管にセットし、このキャピラリ管口には酸素透過
性膜を配置し、測定溶液に浸すとともに、前記キャピラ
リ管口の近傍に微小電極を設け、この微小電極に対応す
る参照極及び対極を配置し、前記微小電極を作用極と
し、前記参照極及び対極間で電位制御及び電流検出を行
い、微小体積の試料溶液を調製するととともに、前記キ
ャピラリ管の３次元位置制御を行い、試料の酸素濃度を
選択的に還元電流により評価することを特徴とする。
成するために、 〔１〕細胞呼吸活性評価方法において、試料溶液をキャ
ピラリ管にセットし、このキャピラリ管口には酸素透過
性膜を配置し、測定溶液に浸すとともに、前記キャピラ
リ管口の近傍に微小電極を設け、この微小電極に対応す
る参照極及び対極を配置し、前記微小電極を作用極と
し、前記参照極及び対極間で電位制御及び電流検出を行
い、微小体積の試料溶液を調製するととともに、前記キ
ャピラリ管の３次元位置制御を行い、試料の酸素濃度を
選択的に還元電流により評価することを特徴とする。
【００１５】〔２〕上記〔１〕記載の細胞呼吸活性評価
方法において、前記還元電流の空間的分布を記録し画像
として出力することを特徴とする。
方法において、前記還元電流の空間的分布を記録し画像
として出力することを特徴とする。
【００１６】〔３〕細胞呼吸活性評価装置において、試
料溶液がセットされるキャピラリ管と、このキャピラリ
管口に配置される酸素透過性膜と、測定溶液に浸される
とともに、前記キャピラリ管口の近傍に設けられる微小
電極と、この微小電極に対応する参照極及び対極を備
え、前記微小電極を作用極とし、前記参照極、対極との
間で電位制御及び電流検出を行うポテンショスタット
と、前記キャピラリ管の３次元位置制御を行う精密位置
決め装置とを具備することを特徴とする。
料溶液がセットされるキャピラリ管と、このキャピラリ
管口に配置される酸素透過性膜と、測定溶液に浸される
とともに、前記キャピラリ管口の近傍に設けられる微小
電極と、この微小電極に対応する参照極及び対極を備
え、前記微小電極を作用極とし、前記参照極、対極との
間で電位制御及び電流検出を行うポテンショスタット
と、前記キャピラリ管の３次元位置制御を行う精密位置
決め装置とを具備することを特徴とする。
【００１７】
【発明の実施の形態】以下、本発明の実施例を図面を参
照しながら詳細に説明する。
照しながら詳細に説明する。
【００１８】図１に本発明の実施例を示す測定対象物の
電気化学的検出装置の構成図である。
電気化学的検出装置の構成図である。
【００１９】この図に示すように、試料には細胞懸濁液
が培養溶液ベースのまま使用され、内径０．５５ｍｍの
ガラスキャピラリ管１の中に充填されている。キャピラ
リ管１内の試料溶液高さが４０ｍｍの場合、試料体積は
１０μＬと見積もられる。キャピラリ管１の口の片側は
酸素透過性膜２で覆われており、試料溶液Ａ側と測定溶
液Ｂ側を往来し得る物質を、計測対象物である酸素のみ
に限定する役割を果たしている。
が培養溶液ベースのまま使用され、内径０．５５ｍｍの
ガラスキャピラリ管１の中に充填されている。キャピラ
リ管１内の試料溶液高さが４０ｍｍの場合、試料体積は
１０μＬと見積もられる。キャピラリ管１の口の片側は
酸素透過性膜２で覆われており、試料溶液Ａ側と測定溶
液Ｂ側を往来し得る物質を、計測対象物である酸素のみ
に限定する役割を果たしている。
【００２０】キャピラリ管１の位置をＸＹＺステージ、
３軸ステッピングモーター及びステージコントローラー
からなる精密位置決め装置３で制御した。位置決め精度
は０．１μｍである。液槽９内には測定溶液（リン酸バ
ッファー）Ｂが浸され、探針には白金微小電極（電極半
径２．０μｍ、ガラスシール部６Ａを含めた全体半径１
５μｍ）６を用い、測定溶液Ｂ内に電極面が上向きにな
るよう固定してある。電気化学計測は、微小電極６を作
用極、銀塩化銀電極７を参照極、白金線を対極８とし、
電位制御及び電流検出はポテンショスタット５により行
った。
３軸ステッピングモーター及びステージコントローラー
からなる精密位置決め装置３で制御した。位置決め精度
は０．１μｍである。液槽９内には測定溶液（リン酸バ
ッファー）Ｂが浸され、探針には白金微小電極（電極半
径２．０μｍ、ガラスシール部６Ａを含めた全体半径１
５μｍ）６を用い、測定溶液Ｂ内に電極面が上向きにな
るよう固定してある。電気化学計測は、微小電極６を作
用極、銀塩化銀電極７を参照極、白金線を対極８とし、
電位制御及び電流検出はポテンショスタット５により行
った。
【００２１】微小電極６は参照極７である銀塩化銀電極
に対し−０．６Ｖに電位を固定し、酸素の還元電流を計
測した。酸素透過性膜２を固定した側のキャピラリ管１
の口の位置を微小電極６の近傍１００μｍに近接させ水
平方向に走査させることにより、キャピラリ管１の口近
傍の酸素濃度分布を計測し試料溶液Ａ内の酸素濃度を評
価できる。コンピューター（ＰＣ）４により、電気化学
計測系、キャピラリ駆動系を同時に制御するとともに計
測結果を記録した。
に対し−０．６Ｖに電位を固定し、酸素の還元電流を計
測した。酸素透過性膜２を固定した側のキャピラリ管１
の口の位置を微小電極６の近傍１００μｍに近接させ水
平方向に走査させることにより、キャピラリ管１の口近
傍の酸素濃度分布を計測し試料溶液Ａ内の酸素濃度を評
価できる。コンピューター（ＰＣ）４により、電気化学
計測系、キャピラリ駆動系を同時に制御するとともに計
測結果を記録した。
【００２２】試料として動物細胞（ＨｅＬａ−Ｓ３細
胞）を用いた。ＨｅＬａ−Ｓ３細胞は、ＲＩＴＣ８０−
７（旭テクノグラス社製）培地に５％胎児牛血清（ＩＣ
Ｎ Ｂｉｏ ｍｅｄｉｃａｌ社製）を添加して使用し、
Ｔ−２５フラスコ（コーニング社製）で４〜５日間培養
し、ほぼ飽和状態とした。この細胞を０．０５％トリプ
シン溶液（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製）で細胞分散し、単
一細胞浮遊液とした。
胞）を用いた。ＨｅＬａ−Ｓ３細胞は、ＲＩＴＣ８０−
７（旭テクノグラス社製）培地に５％胎児牛血清（ＩＣ
Ｎ Ｂｉｏ ｍｅｄｉｃａｌ社製）を添加して使用し、
Ｔ−２５フラスコ（コーニング社製）で４〜５日間培養
し、ほぼ飽和状態とした。この細胞を０．０５％トリプ
シン溶液（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製）で細胞分散し、単
一細胞浮遊液とした。
【００２３】細胞数は血球計算盤で計測し、呼吸活性測
定直前にトリパンブルー染色により生存細胞数比率９５
％以上の細胞懸濁液について実験を行った。細胞濃度
１．４×１０6 および２．０×１０5 ｃｅｌｌｓ／ｍＬ
の懸濁液をキャピラリ管１に充填した。
定直前にトリパンブルー染色により生存細胞数比率９５
％以上の細胞懸濁液について実験を行った。細胞濃度
１．４×１０6 および２．０×１０5 ｃｅｌｌｓ／ｍＬ
の懸濁液をキャピラリ管１に充填した。
【００２４】図２は本発明の実施例を示す試料近傍の酸
素還元電流の２次元分布を画像表示した図であり、白色
から黒色に移るに従い酸素濃度の低下を示している。
素還元電流の２次元分布を画像表示した図であり、白色
から黒色に移るに従い酸素濃度の低下を示している。
【００２５】この図においては、試料に動物細胞（Ｈｅ
Ｌａ−Ｓ３）懸濁液を用いた際のキャピラリ管口付近の
酸素還元電流分布（１０２０μｍ×１０２０μｍ）を示
し、酸素還元電流の増減はカラーバーで示す通り。懸濁
液の細胞濃度は１４０００ｃｅｌｌｓ／１０μＬ〔（図
２（ａ）参照〕および２０００ｃｅｌｌｓ／１０μＬ
〔（図２（ｂ）参照〕。図２（ａ）と図２（ｂ）とも細
胞の呼吸に由来する酸素濃度の低下により、キャピラリ
管１内で酸素還元電流の減少領域が観測される。細胞数
が大きい方が呼吸による酸素消費量も多く、酸素還元電
流の減少量も多くなっている。
Ｌａ−Ｓ３）懸濁液を用いた際のキャピラリ管口付近の
酸素還元電流分布（１０２０μｍ×１０２０μｍ）を示
し、酸素還元電流の増減はカラーバーで示す通り。懸濁
液の細胞濃度は１４０００ｃｅｌｌｓ／１０μＬ〔（図
２（ａ）参照〕および２０００ｃｅｌｌｓ／１０μＬ
〔（図２（ｂ）参照〕。図２（ａ）と図２（ｂ）とも細
胞の呼吸に由来する酸素濃度の低下により、キャピラリ
管１内で酸素還元電流の減少領域が観測される。細胞数
が大きい方が呼吸による酸素消費量も多く、酸素還元電
流の減少量も多くなっている。
【００２６】すなわち、キャピラリ内の動物細胞の呼吸
に由来する、酸素還元電流値の顕著な減少が認められ
た。電流減少の程度は明らかに試料懸濁液の細胞濃度の
違いを反映しており、試料の酸素消費量を定量的に比較
することも可能である。試料体積は１０μＬと極めて微
小であるため、細胞濃度１．４×１０6 および２．０×
１０5 ｃｅｌｌｓ／ｍＬの場合、総細胞数は各々１４０
００および２０００個であり、非常に少ない数の細胞の
代謝に由来する酸素濃度計測が可能であった。
に由来する、酸素還元電流値の顕著な減少が認められ
た。電流減少の程度は明らかに試料懸濁液の細胞濃度の
違いを反映しており、試料の酸素消費量を定量的に比較
することも可能である。試料体積は１０μＬと極めて微
小であるため、細胞濃度１．４×１０6 および２．０×
１０5 ｃｅｌｌｓ／ｍＬの場合、総細胞数は各々１４０
００および２０００個であり、非常に少ない数の細胞の
代謝に由来する酸素濃度計測が可能であった。
【００２７】このようにトータルの細胞数が少ない系で
微小な酸素濃度変化を計測できる理由は、本発明におい
て、試料体積が微小で、かつ、酸素濃度変化が１箇所
（キャピラリの片端）に集約されていることに起因して
いる。先端を細く引いたキャピラリを試料溶液の容器と
して用いてさらなる試料体積の微小化を図ることによ
り、その効果はさらに顕著に現れることが期待できる。
微小な酸素濃度変化を計測できる理由は、本発明におい
て、試料体積が微小で、かつ、酸素濃度変化が１箇所
（キャピラリの片端）に集約されていることに起因して
いる。先端を細く引いたキャピラリを試料溶液の容器と
して用いてさらなる試料体積の微小化を図ることによ
り、その効果はさらに顕著に現れることが期待できる。
【００２８】試料内の総細胞数は懸濁液の濃度により制
御可能で、単一細胞由来の酸素濃度変化を計測すること
も可能である。試料としてハネモ（Ｂｒｙｏｐｓｉｓ
ｐｌｕｍｏｓａ）のプロトプラストを用いた。ハネモは
１９７２年７月に宮城県桃生郡鳴瀬町宮戸島室浜で採集
され、１．３ｋｌｘ白色蛍光灯連続照射下で継代培養を
行っている。ハネモを先端部から１ｃｍ切断し、小片か
ら細胞質を絞り出した。海水中に２０〜３０分放置する
と、細胞質は球状に集合しプロトプラストを形成する。
キャピラリ内に充填されたプロトプラストの大きさ、数
は光学顕微鏡で直接観測した。
御可能で、単一細胞由来の酸素濃度変化を計測すること
も可能である。試料としてハネモ（Ｂｒｙｏｐｓｉｓ
ｐｌｕｍｏｓａ）のプロトプラストを用いた。ハネモは
１９７２年７月に宮城県桃生郡鳴瀬町宮戸島室浜で採集
され、１．３ｋｌｘ白色蛍光灯連続照射下で継代培養を
行っている。ハネモを先端部から１ｃｍ切断し、小片か
ら細胞質を絞り出した。海水中に２０〜３０分放置する
と、細胞質は球状に集合しプロトプラストを形成する。
キャピラリ内に充填されたプロトプラストの大きさ、数
は光学顕微鏡で直接観測した。
【００２９】図３は本発明の実施例を示す試料として直
径２００μｍのハネモのプロトプラスト１個を用い、本
発明の計測方法により試料近傍の酸素濃度分布を画像化
した結果である。つまり、試料に植物細胞ハネモのプロ
トプラスト１個を用いた際のキャピラリ管１の口付近の
酸素還元電流分布（１０２０μｍ×５１０μｍ）を示す
図であり、図３（ａ）は光照射下、図３（ｂ）は非照射
下を示している。
径２００μｍのハネモのプロトプラスト１個を用い、本
発明の計測方法により試料近傍の酸素濃度分布を画像化
した結果である。つまり、試料に植物細胞ハネモのプロ
トプラスト１個を用いた際のキャピラリ管１の口付近の
酸素還元電流分布（１０２０μｍ×５１０μｍ）を示す
図であり、図３（ａ）は光照射下、図３（ｂ）は非照射
下を示している。
【００３０】図３（ａ）に示すように、非照射下では、
植物細胞は光合成により酸素を発生するため、キャピラ
リ内で酸素濃度が上昇し酸素還元電流の増大領域が観測
されるのに対し、図３（ｂ）に示すように、非照射下で
は、呼吸に由来する酸素消費により酸素還元電流の減少
領域が観測される。
植物細胞は光合成により酸素を発生するため、キャピラ
リ内で酸素濃度が上昇し酸素還元電流の増大領域が観測
されるのに対し、図３（ｂ）に示すように、非照射下で
は、呼吸に由来する酸素消費により酸素還元電流の減少
領域が観測される。
【００３１】これにより光照射下では光合成による酸素
濃度の増加、光非照射下では呼吸による酸素濃度の減少
が画像化できた。
濃度の増加、光非照射下では呼吸による酸素濃度の減少
が画像化できた。
【００３２】上記したように、本発明は、細胞などの生
体試料の代謝に伴う酸素濃度変化を微小試料体積でかつ
高選択的に計測することができる。そして、 （１）微小体積の試料を取り扱うためにキャピラリ管を
使用する。本発明により１０μＬ程度の試料溶液を、蒸
発など殆ど無視できる信頼性でハンドリングできる。
体試料の代謝に伴う酸素濃度変化を微小試料体積でかつ
高選択的に計測することができる。そして、 （１）微小体積の試料を取り扱うためにキャピラリ管を
使用する。本発明により１０μＬ程度の試料溶液を、蒸
発など殆ど無視できる信頼性でハンドリングできる。
【００３３】（２）キャピラリ管の片端に酸素透過性膜
を固定する。これにより、試料溶液と測定溶液を隔離
し、試料溶液−測定溶液間を往来し得る物質を酸素のみ
に限定することができる。
を固定する。これにより、試料溶液と測定溶液を隔離
し、試料溶液−測定溶液間を往来し得る物質を酸素のみ
に限定することができる。
【００３４】（３）微小電極を、測定溶液と試料溶液の
境界にある酸素透過性膜に向かって、測定溶液側から近
接させ、酸素透過性膜に平行に走査させることにより両
溶液の境界における酸素の濃度分布を計測する。試料溶
液−測定溶液間を移動する酸素の収支を、微小電極で酸
素還元電流を計測することにより評価する。探針−試料
間の空間的配置は精密位置決め装置により制御する。
境界にある酸素透過性膜に向かって、測定溶液側から近
接させ、酸素透過性膜に平行に走査させることにより両
溶液の境界における酸素の濃度分布を計測する。試料溶
液−測定溶液間を移動する酸素の収支を、微小電極で酸
素還元電流を計測することにより評価する。探針−試料
間の空間的配置は精密位置決め装置により制御する。
【００３５】なお、本発明では探針側を固定し試料側を
走査しているけれども、逆（試料固定／探針走査）でも
同様に探針−試料間の空間的配置を制御し得る。本発明
は、空間分解能を有するため複数試料の評価が可能であ
る。
走査しているけれども、逆（試料固定／探針走査）でも
同様に探針−試料間の空間的配置を制御し得る。本発明
は、空間分解能を有するため複数試料の評価が可能であ
る。
【００３６】なお、本発明は、原理上計測対象は生体試
料に限らず、酸素濃度変化の期待される溶液試料の評価
に広く適用可能である。酸素透過性膜の代わりに、特定
分子種を選択的に透過する膜を用いることにより、酸素
以外の計測も可能である。
料に限らず、酸素濃度変化の期待される溶液試料の評価
に広く適用可能である。酸素透過性膜の代わりに、特定
分子種を選択的に透過する膜を用いることにより、酸素
以外の計測も可能である。
【００３７】また、細胞レベルの代謝活性を指標とした
薬物診断のような技術は、現行の動物実験に代わるスク
リーニング法として注目されており、本発明のように微
小なサンプル量で多数の検体を効率よく簡便に計測可能
なシステムは、新たな細胞の機能評価法、診断法の開発
を望む生化学、臨床医学などの分野の進歩に貢献できる
ものと期待される。
薬物診断のような技術は、現行の動物実験に代わるスク
リーニング法として注目されており、本発明のように微
小なサンプル量で多数の検体を効率よく簡便に計測可能
なシステムは、新たな細胞の機能評価法、診断法の開発
を望む生化学、臨床医学などの分野の進歩に貢献できる
ものと期待される。
【００３８】なお、本発明は上記実施例に限定されるも
のではなく、本発明の趣旨に基づいて種々の変形が可能
であり、これらを本発明の範囲から除外するものではな
い。
のではなく、本発明の趣旨に基づいて種々の変形が可能
であり、これらを本発明の範囲から除外するものではな
い。
【００３９】
【発明の効果】以上、詳細に説明したように、本発明に
よれば、以下のような効果を奏することができる。
よれば、以下のような効果を奏することができる。
【００４０】（Ａ）試料溶液近傍の局所酸素濃度変化を
計測することにより、細胞など生体試料の含まれる試料
溶液内の代謝活性つまり呼吸活性や光合成活性を評価す
ることを可能とする。試料として微小体積の溶液による
計測・少数の細胞或いは細胞１個に起因する酸素濃度変
化の計測が望まれる分野としては、動植物の中で組織標
本として大量に得ることのできない部位の細胞、例えば
生殖細胞の活性評価への応用が期待される。
計測することにより、細胞など生体試料の含まれる試料
溶液内の代謝活性つまり呼吸活性や光合成活性を評価す
ることを可能とする。試料として微小体積の溶液による
計測・少数の細胞或いは細胞１個に起因する酸素濃度変
化の計測が望まれる分野としては、動植物の中で組織標
本として大量に得ることのできない部位の細胞、例えば
生殖細胞の活性評価への応用が期待される。
【００４１】（Ｂ）さらに、本発明は、従来の微小電極
法では計測が困難であった運動性の高い細胞・微生物の
呼吸活性を評価する場合にも適用可能である。限定され
た体積内における全体の酸素濃度変化を評価できるた
め、試料が動き回っても計測に支障をきたさない。
法では計測が困難であった運動性の高い細胞・微生物の
呼吸活性を評価する場合にも適用可能である。限定され
た体積内における全体の酸素濃度変化を評価できるた
め、試料が動き回っても計測に支障をきたさない。
【００４２】（Ｃ）複数のサンプルの酸素濃度を評価す
る際にも、本発明の適用により、微小電極に代表される
計測系はそのままでキャピラリ管と酸素透過性膜だけ交
換してやるだけで、手早くたくさんの試料を評価するこ
とが期待される。さらに、１本のキャピラリ中に２つの
溶液スペースがあるもの（シータ管）やマルチバレルの
キャピラリ管を用いることにより、１画像内で複数サン
プルの酸素濃度を評価することも期待できる。
る際にも、本発明の適用により、微小電極に代表される
計測系はそのままでキャピラリ管と酸素透過性膜だけ交
換してやるだけで、手早くたくさんの試料を評価するこ
とが期待される。さらに、１本のキャピラリ中に２つの
溶液スペースがあるもの（シータ管）やマルチバレルの
キャピラリ管を用いることにより、１画像内で複数サン
プルの酸素濃度を評価することも期待できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施例を示す測定対象物の電気化学的
検出装置の構成図である。
検出装置の構成図である。
【図２】本発明の実施例を示す試料近傍の酸素還元電流
の２次元分布を画像表示した図である。
の２次元分布を画像表示した図である。
【図３】本発明の実施例を示す試料として直径２００μ
ｍのハネモのプロトプラスト１個を用い、本発明の計測
方法により試料近傍の酸素濃度分布を画像化した結果を
示す図である。
ｍのハネモのプロトプラスト１個を用い、本発明の計測
方法により試料近傍の酸素濃度分布を画像化した結果を
示す図である。
１ キャピラリ管 ２ 酸素透過性膜 ３ 精密位置決め装置 ４ コンピューター（ＰＣ） ５ ポテンショスタット ６ 微小電極（白金微小電極） ６Ａ ガラスシール部 ７ 参照極（銀塩化銀電極） ８ 対極 ９ 液槽 溶液Ａ 試料溶液（細胞懸濁液） 溶液Ｂ 測定溶液（リン酸バッファー）
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 27/46 ３０１Ｍ (72)発明者 阿部 宏之 山形県山形市篭田３−５−27 (72)発明者 星 宏良 山形県山形市城西町５−10−５−Ｃ102 Ｆターム(参考） 2G045 BB04 CB01 DB30 FA19 FB05 GC20 HA14 JA01 JA04 JA07 4B063 QA01 QQ20 QR72 QR73 QR77 QR78 QR82 QX05
Claims (3)
- 【請求項１】（ａ）試料溶液をキャピラリ管にセット
し、（ｂ）該キャピラリ管口には酸素透過性膜を配置
し、（ｃ）測定溶液に浸すとともに、前記キャピラリ管
口の近傍に微小電極を設け、（ｄ）該微小電極に対応す
る参照極及び対極を配置し、（ｅ）前記微小電極を作用
極とし、前記参照極及び対極間で電位制御及び電流検出
を行い、（ｆ）微小体積の試料溶液を調製するとととも
に、前記キャピラリ管の３次元位置制御を行い、試料の
酸素濃度を選択的に還元電流により評価することを特徴
とする細胞呼吸活性評価方法。 - 【請求項２】 請求項１記載の細胞呼吸活性評価方法に
おいて、前記還元電流の空間的分布を記録し画像として
出力することを特徴とする細胞呼吸活性評価方法。 - 【請求項３】（ａ）試料溶液がセットされるキャピラリ
管と、（ｂ）該キャピラリ管口に配置される酸素透過性
膜と、（ｃ）測定溶液に浸されるとともに、前記キャピ
ラリ管口の近傍に設けられる微小電極と、（ｄ）該微小
電極に対応する参照極及び対極を備え、（ｅ）前記微小
電極を作用極とし、前記参照極、対極との間で電位制御
及び電流検出を行うポテンショスタットと、（ｆ）前記
キャピラリ管の３次元位置制御を行う精密位置決め装置
とを具備することを特徴とする細胞呼吸活性評価装置。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000153013A JP2001330582A (ja) | 2000-05-24 | 2000-05-24 | 細胞呼吸活性評価方法及びその装置 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000153013A JP2001330582A (ja) | 2000-05-24 | 2000-05-24 | 細胞呼吸活性評価方法及びその装置 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001330582A true JP2001330582A (ja) | 2001-11-30 |
Family
ID=18658349
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000153013A Withdrawn JP2001330582A (ja) | 2000-05-24 | 2000-05-24 | 細胞呼吸活性評価方法及びその装置 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2001330582A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006512925A (ja) * | 2002-12-23 | 2006-04-20 | ユニセンス・ファーティリテック・アンパルトセルスカブ | 実質的に球形の代謝粒子の個々の代謝速度の非−侵入的測定のためのデバイスおよび方法 |
| JP2010025716A (ja) * | 2008-07-18 | 2010-02-04 | Sharp Corp | 呼気センシング装置 |
| US8265357B2 (en) | 2005-10-14 | 2012-09-11 | Unisense Fertilitech A/S | Determination of a change in a cell population |
| US8633017B2 (en) | 2007-06-29 | 2014-01-21 | Unisense Fertilitech A/S | Device, a system and a method for monitoring and/or cultivation of microscopic objects |
| CN107515234A (zh) * | 2017-08-31 | 2017-12-26 | 鲁东大学 | 一种测定沉水植物光合作用强度的装置和方法 |
-
2000
- 2000-05-24 JP JP2000153013A patent/JP2001330582A/ja not_active Withdrawn
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006512925A (ja) * | 2002-12-23 | 2006-04-20 | ユニセンス・ファーティリテック・アンパルトセルスカブ | 実質的に球形の代謝粒子の個々の代謝速度の非−侵入的測定のためのデバイスおよび方法 |
| US8265357B2 (en) | 2005-10-14 | 2012-09-11 | Unisense Fertilitech A/S | Determination of a change in a cell population |
| US8633017B2 (en) | 2007-06-29 | 2014-01-21 | Unisense Fertilitech A/S | Device, a system and a method for monitoring and/or cultivation of microscopic objects |
| US9588104B2 (en) | 2007-06-29 | 2017-03-07 | Unisense Fertilitech A/S | Device, a system and a method for monitoring and/or culturing of microscopic objects |
| JP2010025716A (ja) * | 2008-07-18 | 2010-02-04 | Sharp Corp | 呼気センシング装置 |
| CN107515234A (zh) * | 2017-08-31 | 2017-12-26 | 鲁东大学 | 一种测定沉水植物光合作用强度的装置和方法 |
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Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A712 Effective date: 20031031 |
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| RD03 | Notification of appointment of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7423 Effective date: 20040129 |
|
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Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 20070807 |