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CN1748032B - 稻启动子 - Google Patents

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CN1748032B CN2004800035289A CN200480003528A CN1748032B CN 1748032 B CN1748032 B CN 1748032B CN 2004800035289 A CN2004800035289 A CN 2004800035289A CN 200480003528 A CN200480003528 A CN 200480003528A CN 1748032 B CN1748032 B CN 1748032B
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Abstract

本发明提供了从稻分离的若干启动子，其能在植物中驱动和/或调节有效连接的核酸的表达。已在稻中研究了本发明启动子的表达模式且一些启动子在植物特定的细胞、组织或器官中显示特异的活性，而其它的在基本上整个植物中呈现组成型表达。一些启动子显示弱表达，而其它的具有强活性。

Description

稻启动子
本发明涉及植物分子生物学领域，更具体地涉及驱动和/或调节植物中有效连接的核酸表达的核酸序列。公开了该核酸序列从稻的分离，以及其在驱动和/或调节有效连接的核酸表达中的用途。本发明因此涉及启动子、杂合启动子、遗传构建体、表达盒、转化载体、表达载体、宿主细胞和包含根据本发明的分离核酸的转基因植物。本发明还涉及用于驱动和/或调节核酸表达的方法以及用于转基因植物生产的方法。
基因表达取决于转录起始，其通过转录起始复合物介导。基因表达还取决于转录的调节，其确定多强、何时以及在何处基因得到表达。所述基因表达的调节可通过转录调控元件介导，其通常嵌入核酸序列5′-侧或表达基因的上游。上游核酸区域因为其启动转录起始复合物的结合、形成和/或活化而通常称为“启动子”，并且因此能够驱动和/或调节其3’下游核酸序列的表达。
为获得有用的植物表型的植物遗传工程通常包括异源基因的表达，其一般通过能驱动和/或调节有效连接的异源核酸表达的启动子介导。宿主植物的表型不仅取决于异源核酸的贡献，还取决于确定如何、在何处以及何时异源核酸得到表达的所选启动子特异表达模式的贡献。因此，具有合适表达模式的启动子的选择对于获得合适的表型是至关重要的。本领域技术人员将需要有效的不同启动子，以确定针对特定核酸的最优启动子。对于许多不同的宿主植物，该有效性是相当有限的而因此还是需要提供具有各种表达特点的新启动子。
SEQ ID NO 1至22表示的核酸从稻(Oryza Sativa)分离且已发现能驱动和调节有效连接的核酸的表达；其表达模式也已被表征。因此本发明提供许多尚未知的分离核酸，其可用作启动子。
据此，本发明提供能驱动和/或调节表达的分离启动子，包括：
(a)SEQ ID NO 1至22任一所示的分离核酸或与SEQ ID NO 1至22任一互补的分离核酸；或
(b)与SEQ ID NO 1至22任一所示的DNA序列具有至少90％序列同一性的分离核酸；或
(c)与SEQ ID NO 1至22任一所示的DNA序列在严谨条件下特异性杂交的分离核酸；或
(d)(a)至(c)中任一项定义的分离核酸，其通过插入序列而间隔；或
(e)(a)至(d)中定义的任一核酸的片段，其能驱动和/或调节表达。
如此处使用的术语“分离的”指从其原始来源中移出。优选地，“分离的”启动子不含那些启动子来源的生物体基因组DNA中天然位于启动子侧翼的序列(如蛋白质编码序列或位于3’末端的其他序列)。更优选地，“分离的”启动子也不含那些天然侧接于其5’末端的序列。更优选地，“分离的”启动子包括启动子来源的生物体基因组DNA中与该启动子天然在一起的少于5kb、4kb、3kb、2kb、1.5kb、1.2kb、1kb、0.8kb、0.5kb或0.1kb的核苷酸序列。
本发明并不限于由SEQ ID NO 1至22表示的核酸。本领域技术人员将认识到可以存在维持同样功能的核酸的变体或片段。这些变体或片段可以是人工的(例如，通过遗传工程)或甚至可以是自然界存在的。因此本发明涉及SEQ ID NO 1至22任一的变体核酸及片段，其在本发明方法中是有用的。上述变体及片段包含：
(a)SEQ ID NO 1至22中任一所示的分离核酸或与SEQ ID NO 1至22任一互补的分离核酸；或
(b)与SEQ ID NO 1至22任一所示的DNA序列具有至少90％序列同一性的分离核酸；或
(c)与SEQ ID NO 1至22任一所示的DNA序列在严谨条件下特异性杂交的分离核酸；或
(d)(a)至(c)任一中定义的分离核酸，其通过插入序列而间断；或
(e)(a)至(d)中定义的任一核酸的片段，其能驱动和/或调节表达。
SEQ ID NO 1至22任一的合适变体包含与SEQ ID NO 1至22所示任一核酸具有递增的优选至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的同源物。
同一性的百分比可用比对程序计算。优选可使用成对的全序列对比程序，其执行Needleman-Wunsch的算法(J.Mo l.Bio l.48：443-453，1970)。该算法最大化匹配数目而最小化缺口数目。所述程序有例如GAP、Needle(EMBOSS程序包)、stretcher(EMBOSS程序包)或AlignX(Vector NTI suite 5.5)且可使用标准参数(例如缺口开放罚分15和缺口延伸罚分6.66)。做为选择，可使用执行Smith-Waterman(Advances in Applied Mathematics 2，482-489(1981))算法的局部比对程序。所述程序有例如Water(EMBOSS程序包)或matcher(EMBOSS程序包)。如此处使用的“序列同一性”优选对整个SEQ IDNO 1至22任一所示的启动子全长进行计算。这些启动子的长度列于表2中。
同源核酸的检索和鉴定在本领域技术人员熟知的范围内。该方法，包括用本发明提供的序列筛选序列数据库，序列例如SEQ ID NO 1至22的任意一个，优选以计算机可读的形式。有用的序列数据库包括但不限于Genbank(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/web/Genbank)，欧洲分子生物学实验室核酸数据库(EMBL)(http：/w.ebi.ac.uk/ebi-docs/embl-db.html)或其不同版本，或MIPS数据库(http：//mips.gsf.de/)。用于序列比对和比较的不同检索算法和软件在本领域众所周知。所述软件包括，例如GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。优选使用BLAST软件，其计算序列同一性百分比且进行序列间相似性的统计分析。称为BLAST程序的程序组具有5个不同的执行程序：三个设计用于核苷酸序列查询(BLASTN、BLASTX和TBLASTX)而两个设计用于蛋白质序列查询(BLASTP和TBLASTN)(Coulson，Trends in Biotechnology：76-80，1994；Birren等，Genome Analysis，1：543，1997)。进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(NCBI)公开得到。
鼠耳芥(Arabidopsis thaliana)基因组和稻基因组序列可在公共数据库如Genbank中获得。其他基因组目前正在测序中。因此，由于可获得更多的其他植物基因组序列，预计可通过与SEQ ID NO 1至SEQ ID NO 22任一进行序列比对而鉴定同源启动子。技术人员将很容易得到来自其他植物种类的同源启动子，例如来自其他农作物植物，如玉米。来自其他农作物植物的同源启动子对在农作物植物中实施本发明的方法尤其有用。
具有与SEQ ID NO 1至22的任一至少90％序列同一性同源物的一种实例为SEQ ID NO 1至22的任一等位变体。等位变体为同一种类的两个不同个体中的同一基因中发生的变体并且通常等位变体由于微小的序列变化而不同。等位变体可包含单核苷酸多态性(SNP)以及小插入/缺失多态性(INDEL)。INDEL的大小通常小于100bp。SNP和INDEL在大多数生物体的天然发生多态性品系中形成最大一组序列变体。
适合用于本发明方法中的同源物可很容易通过PCR或杂交从其来源生物体分离。其驱动和/或调节表达的能力可很容易确定，例如，通过下列实施例部分描述的方法，用同源物简单替代用于实际实施例中的序列。
本发明包含的其他SEQ ID NO 1至22任一的合适变体为在严谨条件下与SEQ ID NO 1至22任一的核酸特异地杂交的核酸。术语“杂交”指在杂交过程中与基本上同源的互补的核苷酸序列的退火。依赖所述杂交过程的分子生物学工具包括聚合酶链式反应(PCR；和所有基于此的方法)、消减杂交、随机引物延伸、核酸酶S1作图、引物延伸、反转录、cDNA合成、RNA差异显示和DNA序列测定、Northern印迹法(RNA印迹法)、Southern印迹法(DNA印迹法)。杂交过程还可与固定至基质如磁珠、琼脂糖凝胶磁珠或任何其他树脂的互补核酸发生。依赖该过程的分子生物学工具包括poly(A+)mRNA的分离。杂交过程还可与固定至固相支持物如硝酸纤维素或尼龙膜或通过例如光刻法固定至例如硅质玻璃支持物的互补核酸发生(后者称为核酸阵列或微阵列或称为核酸芯片)。依赖上述过程的分子生物学工具包括RNA和DNA凝胶印迹分析、菌落杂交、噬斑杂交、原位杂交和微阵列杂交。为了能够进行杂交，通常通过热或化学方法使核酸分子变性，从而使双链熔解成两条单链和/或由单链核酸消除发夹或其它二级结构。杂交严谨度受到如温度、盐浓度和杂交缓冲液组成等条件的影响。在例如Sambrook(2001)Molecular Cloning：a laboratory manual，3rdEdition Cold Spring Harbor Laboratory Press，CSH，NewYork中描述了常规的杂交条件，但熟练的技术人员将领会可根据已知的或预期的同源性和/或核酸序列的长度而设计多种不同的杂交条件。高严谨度的杂交条件包括高温和/或低钠/盐浓度(盐包括钠，实例为NaCl和柠檬酸三钠)和/或在杂交缓冲液中包含甲酰胺和/或降低杂交缓冲液中如SDS(十二烷基磺酸钠去污剂)等化合物的浓度和/或由杂交缓冲液中排除如硫酸葡聚糖或聚乙二醇(促进分子拥挤)等化合物。严谨条件下的特异杂交意味着序列非常相似。严谨条件下的特异杂交优选在温度60℃随后用0.1至1×SSC、0.1×SDS和1×SSC、0.1×SDS洗涤下进行。
本发明还涉及与本发明的任意核酸特异性杂交的至少有15个核苷酸长度的核酸分子。本发明还涉及通过聚合酶链式反应特异性扩增本发明核酸的至少15个核苷酸长度的核酸分子。
本发明包含的SEQ ID NO 1至22任一的另外的变体为与上述sEQID NO 1至22的任一或其变体对应的核酸，其通过插入序列而间断。例如，SEQ ID NO 1至22所示的任意核酸可通过插入序列而间断。“插入序列”表示任意核酸或核苷酸，其使另一序列中断。插入序列的实例包括内含子、核酸标签、T-DNA和可移动的核酸序列如转座子或那些可通过重组而移动的核酸。具体转座子的实例包括Ac(激活剂)、Ds(解离)、Spm(抑制剂-突变基因)或En。目前广泛应用内含子导入启动子。本发明的方法还可使用含有内含子的SEQ ID NO 1至22任一核酸序列而实施。若插入序列是内含子，则将出现本发明核酸的可变剪切变体。如此处使用的术语“可变剪切变体”包含核酸序列变体，其中插入的内含子已被切除、替换或加入。所述剪切变体可在自然界中找到或是人工的。制备具有内含子的上述启动子或制备相应剪切变体的方法是本领域所熟知的。
适合用于本发明方法的通过插入序列间断的变体可很容易例如通过下列实施例部分所述的方法用变体简单替代用于现有实施例中的序列而确定。
上文所述的变体核酸可在自然界中得到(例如等位变体或剪切变体)。另外和/或做为选择，上文所述的SEQ ID NO 1至22任一的变体可通过本领域熟知的技术包括例如突变、替代、插入、缺失或衍生而人工制得。本发明还包含上述变体，以及其在本发明方法中的用途。
核酸的“突变变体”可使用重组DNA操作技术或核苷酸合成很容易地制得。上述技术的实例包含通过M13诱变的定点诱变、T7-Gen体外诱变(USB，Cleveland，OH)、快速变换的定点诱变(Stratagene，San Diego，CA)、PCR-介导的定点诱变或其他定点诱变方案。或者，本发明的核酸可随机突变。
“替代变体”指那些核酸序列中至少一个残基被除去且在其位置插入一不同残基的变体。核酸替代一般为单残基，但可以是取决于位于核酸序列的功能性限制的簇；插入通常为约1至约10个核酸残基的顺序，而缺失可以在约1至约20个残基的范围。
核酸的“插入变体”为其中一个或多个核酸残基被导入核酸预定位点的变体。插入可包括5’-末端和/或3’-末端的融合以及单个或多个核苷酸的内部-序列插入。通常，核酸序列内的插入小于5’-或3’-末端的融合，为约1至约10个残基的顺序。5’-或3’-末端融合的实例包含用于酵母双-杂交系统或酵母单-杂交系统的转录激活因子活化作用结构域或结合结构域，或噬菌体包被蛋白、6组氨酸标签、谷胱甘肽S-转移酶标签、A蛋白、麦芽糖结合蛋白、二氢叶酸还原酶、标签·100表位、c-myc表位、FLAG
Figure 200480003528910000210003_0
-表位、lacZ、CMP(钙调蛋白-结合多肽)、HA表位、蛋白C表位和VSV表位的编码序列。
术语核酸的“衍生物”可包括与天然核酸相比天然的和非-天然存在的核酸残基的替代，和/或缺失和/或添加。衍生物可例如包括甲基化核苷酸，或人工核苷酸。
本发明还包括启动子，其包括上文所述SEQ ID NO 1至22任一所示的任意核酸或其变体的片段。如此处使用的“片段”指核酸序列的一部分。用于本发明方法的合适片段为功能性片段，其至少保持启动子的功能性部分，由此仍然能驱动和/或调节表达。启动子功能性片段的实例包含最小启动子、上游调控元件或其任意的组合。
合适的片段可在至少约20个碱基对或约50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1000个碱基对，直至本发明的全长序列的范围。该碱基对一般紧邻转录起始位点的上游，但做为选择，可以在启动子序列的任何地方。
用于本发明方法的合适片段可通过技术人员熟知的标准技术，或通过以下实施例部分描述的方法测试其驱动和/或调节表达的能力。
SEQ ID NO 1至22的任一公开的启动子作为来自特定的稻编码序列(CDS)上游区域约1.2kb的核酸而分离。核酸可包含启动子的一般元件，其在图1中显示。通常，启动子可包括从编码序列至上游方向：(i)前-信使RNA的5’UTR，(ii)包括转录起始元件(INR)和更上游的TATA框的最小启动子，以及(iii)可包含决定启动子特定表达模式的调控元件。
如此处使用的术语“启动子”应用于整个上下文并且指能作用(驱动和/或调节)与其有效连接的序列表达的调控核酸序列。“启动子”包含源于典型基因组基因的转录调控序列。通常启动子包括TATA框，其能将转录起始复合物引导至适当的转录起始开始位点。然而，一些启动子不具有TATA框(无TATA框启动子)，但仍然有驱动和/或调节表达的完整功能。启动子可另外包括CCAAT框序列和另外的调控元件(即上游激活序列或顺式-元件如增强子和沉默子)。“启动子”还可包括典型原核类基因的转录调控序列，在这样情况下其可包括-35框序列和/或-10框转录调控序列。
如此处使用的“驱动表达”指启动(promote)核酸的转录。
如此处使用的“调节表达”指影响核酸转录的水平、时间或位置。本发明的启动子可因此用来增强、降低或改变核酸转录的时间和/或位置。例如，其可用来将转录限至某些细胞类型、组织或器官，或在某段时间内，或响应某些环境条件。
启动子优选植物-可表达的启动子。术语“植物-可表达的”指能在植物、植物细胞、植物组织和/或植物器官中调节表达。因此，本发明包含如上述的分离核酸，能调节有效连接的核酸在植物或植物的一种或多种特定细胞、组织或器官中的转录。
详细研究本发明启动子的表达模式，发现其中许多是组织特异性的。因此，本发明提供“组织特异性的”启动子。术语“组织特异性的”将被用于表明表达主要在特定组织、组织-类型、器官或生物体的任何其他部分中，虽然不一定是专门在所述组织、组织-类型、器官或其他部分中。因此，本发明包含如上述的分离核酸，能以组织特异性方式驱动和/或调节表达(有效连接的核酸的)。表达可在种子、胚、盾片、糊粉、胚乳、叶片、花、愈伤组织、分生组织、芽分生组织、分化中心(discriminating centre)、芽、芽分生组织和根中得到驱动和/或调节。禾本科植物中芽分生组织位于所谓的分化中心(discrimination zone)，从中芽和叶片发生。
组织特异性启动子是所谓的“受调控的启动子”的一种实例。这些启动子通过内源信号如某些转录因子、代谢物、植物生长素的存在或外源信号如变老、应激或营养状况而得到调控。这些调控可影响一个或多个不同水平的上述时空特异性。本发明中包含的为上文所述的核酸，其为“受调控的启动子”。受调控的启动子的实例有细胞-特异性启动子、组织特异性启动子、器官-特异性启动子、细胞周期-特异性启动子、诱导型启动子或早期的组织特异性启动子。
做为选择和/或另外，本发明的一些启动子显示组成型表达的模式。因此，本发明提供上文所述的启动子，其为组成型启动子。术语“组成型的”指没有或几乎没有时空的调节。如此处使用的术语“组成型表达”指基本在生物体的所有组织中基本上连续的表达。熟练技术人员将理解“组成型启动子”为在生物体生长发育几乎但未必所有的时期以及遍及生物体几乎但未必所有的部分中都有活性的启动子。
启动子的“表达模式”不仅受时空方面的影响，还受表达水平的影响。表达水平通过所谓的启动子的“强度”确定。基于所得到的表达水平，此处可在“弱”或“强”启动子间作出区分。通常，“弱启动子”指启动子驱动有效连接的核酸以约1/10000转录本至约1/100000转录本至约1/500000转录本的水平表达。通常，“强启动子”指启动子驱动有效连接的核酸以约1/10转录本或至约1/100或至约1/1000转录本的水平表达。
根据一具体的实施方案，本发明提供上文提及的分离启动子，其为杂合启动子。如此处使用的术语“杂合启动子”指例如通过遗传工程合成制得的嵌合启动子。本发明优选的杂合启动子包括本发明一种启动子的一部分，优选功能部分以及其他启动子的至少另一部分，优选功能部分。后面的部分，可以是任何启动子的部分，包括本发明的启动子及其他启动子的任何一个。杂合启动子的实例包括与另一启动子的最小启动子组合的本发明启动子的调控元件。杂合启动子的另一个实例为包括另外的调控元件以进一步增强其活性和/或改变其时空表达模式的启动子。
本发明还提供用于改变启动子表达模式的SEQ ID NO 1至22任一的或其变体的功能性片段的用途。在所述方法中，本发明任意核酸的至少一部分与另外的启动子的至少一个片段组合。
此外，本发明提供遗传构建体，包含：
(a)如上定义的分离的启动子
(b)与(a)的分离启动子有效连接的异源核酸序列，和任选的
(c)3’转录终止子
如此处使用的术语“遗传构建体”指通过遗传工程制得的核酸。
如此处使用的术语“有效连接”至启动子指转录通过该启动子驱动和/或调节。本领域技术人员将理解与启动子有效连接优选指启动子位于该有效连接的核酸的上游(即在5′-末端)。只要本发明的启动子能够驱动和/或调节该有效连接的核酸的转录，与有效连接的核酸的距离是可变的。例如，在启动子和该有效连接的核酸间，可能有克隆位点、接头、转录或翻译增强子。
该有效连接的核酸可以是任何编码或非编码的核酸。该有效连接的核酸可以是有义或反义方向的。一般在宿主细胞的遗传工程情况下，该有效连接的核酸被导入宿主细胞且用来改变宿主细胞的表型。或者，该有效连接的核酸为来自宿主细胞的内源核酸。
如此处使用的术语“异源的”指“与本发明启动子异源的”。与本发明的启动子异源的核酸当在其生物基因组环境中时并不天然存在于本发明启动子侧翼的核酸序列中。虽然该核酸可以是与本发明的启动子异源的，其可以是与植物宿主细胞同源的或天然的或异源的或外源的。该异源的有效连接的核酸可以是任何核酸(例如编码任何蛋白质)，条件是其包括或其至少与一种正常情况下不位于本发明启动子侧翼的核酸侧接。
(c)中使用的术语“转录终止子”指其给出转录终止信号的转录单元末端的DNA序列。终止子为通常包含聚腺苷酸化信号的3′-非翻译DNA序列，其促进聚腺苷酸序列加至初级转录本的3′-末端。在和/或分离自病毒、酵母、霉菌、细菌、昆虫、禽类、哺乳动物和植物中有活性的终止子是已知的且已在文献中描述过。适用于本发明遗传构建体的终止子的实例包含根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)胭脂碱合酶(NOS)基因终止子、根癌土壤杆菌章鱼碱合酶(OCS)基因终止子序列、花椰菜花叶病毒(CaMV)35s基因终止子序列、稻ADP-葡萄糖焦磷酸化酶终止子序列(t3′Bt2)、玉米的玉米蛋白基因终止子序列、rbcs-1A基因终止子和rbcs-3A基因终止子序列等等。
本发明还提供包含如上所述遗传构建体的表达盒、转化载体或植物表达载体。
此处“表达盒”指核酸表达所需的最小遗传构建体。一般的表达盒包括启动子-基因-终止子组合。表达盒可另外包括克隆位点，例如Gateway TM重组位点或限制性内切酶识别位点以方便有效连接的核酸的克隆或方便表达盒转入载体。表达盒可进一步包括5’非翻译区、3’非翻译区、筛选标记、转录增强子或翻译增强子。
“转化载体”指遗传构建体，其可通过转化导入生物体且可在所述生物体中稳定维持。一些载体可在例如大肠杆菌、A.tumefaciens、酿酒酵母或粟酒裂殖糖酵母中维持，而其它的如噬粒和粘粒载体可在细菌和/或病毒中维持。转化载体可在其宿主细胞中增殖且可再次从中分离而转化至另一宿主细胞。载体序列通常包括一组限制性内切酶识别的唯一位点、多克隆位点(MCS)，其中可插入一个或多个非载体序列。载体序列可进一步包括一复制起点，其为在特定宿主细胞中维持和/或复制所必需的。复制起点的实例包含但不限于，f1-ori和colE1。
“表达载体”构成转化载体的亚群，其由于包含适当的调节序列，能启动插入的非载体序列的表达。已记载适于在细菌(例如大肠杆菌)、真菌(例如啤酒酵母、粟酒裂殖糖酵母、巴斯德毕赤氏酵母)、昆虫细胞(例如杆状病毒表达载体)、动物细胞(例如COS或CHO细胞)和植物细胞中表达的表达载体。本发明的一种合适的表达载体为植物表达载体，用于植物细胞的转化、植物基因组中的稳定整合、植物细胞内的维持和植物细胞中非载体序列的表达。
一般地，本发明的植物表达载体包括上文所述的SEQ ID NO 1至22任一核酸或其变体，其任意与另外的核酸有效连接。一般地，本发明的植物可表达的载体进一步包括用于稳定整合入植物基因组的T-DNA区域(例如Ti质粒的左侧边界和右侧边界区域)。
本发明的遗传构建体可进一步包括“筛选标记”。如此处使用的，术语″筛选标记″包含任何基因，其赋予细胞表型，在其中得到表达以便于转染的或转化的细胞的鉴定和/或选择。合适的标记可选自赋予抗生素或除草剂抗性的标记。包含该遗传构建体的细胞因此将在杀死未转化细胞的抗生素或除草剂浓度下存活。筛选标记基因的实例包含赋予抗生素抗性的基因(如编码能磷酸化新霉素和卡那霉素的新霉素磷酸转移酶的nptII，或编码能磷酸化潮霉素的潮霉素磷酸转移酶的hpt)、赋予除草剂抗性的基因(例如bar，其提供Basta的抗性；提供草甘膦抗性的aroA或gox)，或提供代谢作用特性的基因(如允许植物利用甘露糖作为单独碳源的manA)。可见的标记基因引起颜色的生成(例如β-葡糖醛酸酶，GUS)、发光(如萤光素酶)或产生荧光(绿色荧光蛋白，GFP和其衍生物)。合适筛选标记基因进一步的实例包括氨苄青霉素抗性(Ampr)、四环素抗性基因(Tcr)、细菌卡那霉素抗性基因(Kanr)、膦丝菌素抗性基因和氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因，等等。
此外，本发明包括包含本发明上文所述的分离的启动子，或遗传构建体，或表达盒，或转化载体或表达载体的宿主细胞。在本发明的具体实施方案中，宿主细胞选自细菌、藻类、真菌、酵母、植物、昆虫或动物宿主细胞。
在一个具体的实施方案中，本发明提供包含本发明的分离的启动子，或本发明上述的分离的核酸，或遗传构建体，或表达盒，或转化载体或表达载体的转基因植物细胞。上述植物细胞优选为双子叶植物植物细胞或单子叶植物植物细胞，更优选此处提及的任何植物的细胞。优选地，在本发明的转基因植物细胞中，本发明的启动子或遗传构建体稳定整合入该植物细胞的基因组中。
本发明还提供用于转基因植物生产的方法，包括：
(a)将分离的启动子导入植物细胞，例如根据本发明的以及上文所述的SEQ ID NO 1至SEQ ID NO 22的任意一个，或其变体或片段，或遗传构建体，或表达盒，或转化载体或表达载体，和
(b)在促进植物生长的条件下培养上述植物细胞。
优选通过转化完成“导入”上述分离的启动子，或遗传构建体，或表达盒，或转化载体或表达载体至宿主细胞中(例如植物细胞)。如此处使用的术语“转化”包含外源多核苷酸转入宿主细胞中，而不考虑用于转入的方法。尤其对于能无性繁殖的植物、组织，无论通过器官发生或胚胎发生，都适于用本发明的遗传构建体转化且可从中再生完整的植株。所选的特定组织将随对转化的特定植物品种有效的且适合其的无性繁殖系统而不同。典型的靶组织包括叶盘、花粉、胚、子叶、下胚轴、雌配子体、愈伤组织、存在的分生组织(例如，顶端分生组织、腋芽和根分生组织)和可诱导的分生组织(例如，子叶分+生组织和下胚轴分生组织)。该多核苷酸可瞬时或稳定地导入植物细胞以及可以非整合地维持，例如以质粒的形式。或者，其可以整合入植物基因组。
植物品种的转化目前是相当常规的技术。方便地，一些转化方法中任何一个都可用来将本发明的核酸导入合适的祖细胞(ancestorcell)。转化方法包括利用脂质体、电穿孔法、增强游离DNA摄取的化学试剂、DNA直接注射入植物、基因枪轰击、利用病毒或花粉的转化以及显微投影。方法可选自用于原生质体的钙/聚乙二醇方法(Krens，F.A.等，1882，Nature 296，72-74；Negrutiu I.等，June1987，Plant Mol.Biol.8，363-373)；原生质体的电穿孔(ShillitoR.D.等，1985 Bio/Technol 3，1099-1102)；微注射入植物材料(Crossway A.等，1986，Mol.Gen Genet 202，179-185)；DNA或RNA包被颗粒的轰击(Klein T.M.等，1987，Nature 327，70)；病毒的感染(非-整合的)等等。生产本发明转基因植物细胞的优选的转化方法为土壤杆菌介导的转化方法。
包括本发明任一启动子的转基因稻植物优选利用任何熟知的稻转化的方法通过土壤杆菌-介导的转化而产生，如以下所述的任何方法：公开的欧洲专利申请EP1198985A1，Aldemita和Hodges(Planta，199，612-617，1996)；Chan等.(Plant Mol.Biol.22(3)491-506，1993)；Hiei等.(Plant J.6(2)271-282，1994)；其公开的内容就如充分陈述一样此处引入作为参考。至于玉米的转化，优选的方法如Ishida等.(Nat.Biotechnol.1996Jun；14(6)：745-50)或Frame等.(Plant Physiol.2002May；129(1)：13-22)所述，其公开的内容就如充分陈述一样此处引入作为参考。
通常在转化后，选择具有一个或多个标记的植物细胞或细胞团，其由用目的基因共转染的植物可表达的基因编码(其可受本发明任何启动子控制)，随之在促进植物生长的条件下培养被转化的材料。
得到的转化植物细胞随后可用于以本领域技术人员已知的方式再生转化植株。因此，上文所述的生产转基因植物的方法可进一步包括从上述(a)的植物细胞再生植株。
本发明进一步提供包括上文所述植物细胞的植物。该植物可生长，或甚至达到成熟包括例如果实产生、种子形成、种子成熟和结籽。
此外，可从这些种子生产子代，其子代是可育的。做为选择或另外，转化的和再生的植物也可以通过无性繁殖如克隆、嫁接产生子代。产生的转化植物可通过多种方式繁殖，如通过无性繁殖或传统的育种技术。例如，第一代(或T1)转化的植物可自花授精以得到纯合的第二代(或T2)转化体，而T2植株进一步通过传统的育种技术繁殖。
产生的转化生物体可有多种形式。例如，其可以是转化细胞和非转化细胞的嵌合体；无性转化体(例如，所有细胞被转化以包含表达盒)；转化和未转化组织的嫁接物(例如，在植株中，转化的根茎嫁接至未转化的接穗)。
随着DNA的转入和转化的细胞生长，可利用例如Southern分析对推定的转化植物细胞或植物进行目的基因存在、拷贝数和/或基因组结构的评估。做为选择或另外，新近导入的DNA的表达水平或表达模式可利用Northern和/或Western分析进行，两种技术均为本领域普通技术人员所熟知。
本发明显然涉及通过本发明的任何方法可获得的植物，其含有任何本发明分离的启动子或构建体。本发明显然涉及上述植物的任何植株部分和繁殖体。本发明进一步包含通过任何上述方法产生的原始转化细胞、组织、器官或整株植物的子代，唯一条件是子代表现出与通过本发明方法在亲代中产生的相同的基因型和/或表型特征。本发明还涉及植物可收获的部分，如但不限于种子、叶片、果实、花、茎干培养物、茎、根状茎、根、块茎、鳞茎和棉纤维。
如此处使用的术语“植物”包括整株植物、植物的原代和子代以及植物部分，包括种子、芽、茎、根(包括块茎)和植物细胞、组织和器官。因此术语“植物”还包含悬浮培养物、胚、分生组织区、愈伤组织、配子体、孢子体、花粉和小孢子。在本发明方法中特别有用的植物包括属于绿色植物(Viridiplantae)总科的所有植物，尤其是单子叶植物和双子叶植物，包括饲料或草料豆科、观赏植物、粮食作物、树木、或灌木，选自：金合欢属(Acacia spp.)、槭属(Acer spp.)、猕猴桃属(Actinidia spp.)、七叶树属(Aesculus spp.)、新西兰贝壳杉(Agathis australis)、Albizia amara、Alsophila tricolor、须芒草属(Andropogon spp.)、落花生属(Arachis spp.)、槟榔(Areca catechu)、Astelia fragrans、Astragalus cicer、Baikiaeaplurijuga、桦木属(Betula spp.)、芸苔属(Brassica spp.)、木榄(Bruguiera gymnorrhiza)、Burkea africana、Butea frondosa、Cadaba farinosa、朱缨花属(Calliandra spp、)、茶(Camelliasinensis)、美人蕉(Canna indica)、辣椒属(Capsicum spp.)、决明属(Cassia spp.)、Centroema pubescens、木瓜属(Chaenomelesspp.)、肉桂(Cinnamomum cassia)、小果咖啡(Coffea arabica)、Colophospermum mopane、绣球小冠花(Coronilillia varia)、Cotoneaster serotina、山楂属(Crataegus spp.)、香瓜属(Cucumisspp.)、柏木属(Cupressus spp.)、Cyathea dealbata、榅椁(Cydoniaoblonga)、日本柳杉(Cryptomeria japonica)、香茅属(Cymbopogonspp.)、Cynthea dealbata、榅椁(Cydonia oblonga)、Dalbergiamonetaria、Davallia divaricata、山蚂蝗属(Desmodium spp.)、Dicksonia squarosa、Diheteropogon amplectens、Dioclea spp、镰扁豆属(Dolichos spp.)、Dorycnium rectum、EchinochloaPyramidalis、Ehrartia spp.、
Figure 200480003528910000210003_1
(Eleusinecora cana)、Eragrestisspp.、刺桐属(Erythrina spp.)、桉属(Eucalyptus spp.)、Eucleaschimperi、Eulalia villosa、荞麦属(Fagopyrum spp.)、南美稔(Feijoa sellowiana)、草莓属(Fragaria spp.)、千斤拔属(Flemingia spp)、Freycinetia banksii、Geranium thunbergii、银杏(Ginkgo biloba)、Glycine javanica、Gliricidia spp、陆地棉(Gossypium hirsutum)、银桦属(Grevillea spp.)、Guibourtiacoleosperma、岩黄芪属(Hedysarum spp.)、牛鞭草(Hemarthiaaltissima)、扭黄茅(Heteropogon contortus)、大麦(Hordeumvulgare)、红苞茅(Hyparrhenia rufa)、小连翘(Hypericum erectum)、Hyperthelia dissoluta、Indigo incamata、鸢尾属(Iris spp.)、Leptarrhena Pyrolifolia、胡枝子属(Lespediza spp.)、Lettucaspp.、银合欢(Leucaena leucocephala)、Loudetiasimplex、Lotonusbainesii、百脉根属(Lotus spp.)、Macrotyloma axillare、苹果属(Malus spp.)、木薯(Manihot esculenta)、紫苜蓿(Medicagosativa)、水杉(Metasequoia glyptostroboides)、大蕉(Musasapientum)、烟草属(Nicotianum spp.)、驴食草属(Onobrychisspp.)、Ornithopus spp.、稻属(Oryza spp.)、Peltophorum africanum、狼尾草属(Pennisetum spp.)、Perseag ratissima、碧冬茄属(Petuniaspp.)、菜豆属(Phaseolus spp.)、Phoenix canariensis、Phormiumcookianum、石楠属(Photinia spp.)、Picea glauca、松属(Pinusspp.)、豌豆(Pisum sativum)、新西兰罗汉松(Podocarpus totara)、Pogonarthria fleckii、Pogonarthrias quarrosa、杨属(Populusspp.)、瓜叶牧豆树(Prosopis cineraria)、花旗松(Pseudotsugamenziesii)、Pterolobium stellatum、西洋梨(Pyrus communis)、栎属(Quercus spp.)、Rhaphiolepsis umbellata、Rhopalostylissapida、Rhus natalensis、欧洲醋栗(Ribes grossularia)、荼蔗子属(Ribes spp.)、刺槐(Robinia pseudoacacia)、蔷薇属(Rosaspp.)、悬钩子属(Rubus spp.)、柳属(Salix spp.)、Schyzachyriumsanguineum、金松(Sciadopitys verticillata)、北美红杉(Sequoiasempervirens)、巨杉(Sequoiadendron giganteum)、高粱(Sorghumbicolor)、菠菜属(spinacia spp.)、sporobolus fimbriatus、Stiburus alopecuroides、Stylosanthos humilis、葫芦茶属(Tadehagi spp)、落羽杉(Taxodium distichum)、阿拉伯黄背草(Themeda triandra)、车轴草属(Trifolium spp.)、小麦属(Triticumspp.)、异叶铁杉(Tsuga heterophylla)、越桔属(Vaccinium spp.)、野豌豆属(Vicia spp.)、葡萄(Vitis vinifera)、Watsoniapyramidata、马蹄莲(Zantedesc hia aethiopica)、玉蜀黍(Zea mays)、苋属(amaranth)、朝鲜蓟、芦笋、茎椰菜、抱子甘蓝、甘蓝、芸苔、胡萝卜、花椰菜、芹菜、羽衣甘蓝绿叶菜、亚麻、散叶甘蓝、小扁豆、含油种子油菜、秋葵、洋葱、马铃薯、稻、大豆、稻草、糖用甜菜、糖甘蔗、向日葵、番茄、南瓜和茶、树木和藻等等。按照本发明的优选特征，植物为农作物植物如大豆、向日葵、芸苔、紫花苜蓿、油菜籽、棉花、番茄、马铃薯、烟草、南瓜、番木瓜、白杨、豆科、亚麻、羽扇豆属或高粱。按照本发明的另一个优选方案，植物为单子叶植物，如甘蔗，进一步优选谷类如稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦或燕麦。
本发明进一步提供在植物或植物细胞中驱动和/或调节核酸表达的方法，包括：
(a)将核酸有效连接至上文所述的本发明的分离核酸，如连接至SEQ ID NO 1至22的任意一个或其变体或片段，和
(b)将得到的遗传构建体导入植物或植物细胞中。
优选(a)的有效连接的核酸与本发明核酸是异源的。
该方法可进一步包括在促进生长、促进再生和/或促进成熟的条件下培养转化的植物或植物细胞。
此外，该有效连接的核酸的表达可以在植物特定的细胞、组织或器官中得到驱动和/或调节。因此，本发明提供如上所述的方法，其中表达是组成型表达或组织特异性表达。对于这些实施方案，参见实施例部分，其中描述本发明启动子特定表达模式且详述了组织特异性表达的不同类型。
本发明进一步包含上文定义的分离核酸驱动和/或调节有效连接的核酸表达的用途。
本领域技术人员将意识到序列SEQ ID NO 1至22的提供使得很容易获得分离相关启动子的工具，其具有与任意SEQ ID NO 1至22基本序列同一性。另外，序列SEQ ID NO 23至44(对应于本发明启动子的CDS，参见表1)的提供使得很容易获得分离相关启动子的有效工具，其中该相关CDS具有与任意SEQ ID NO 23至44基本序列同一性。因此本发明还包含分离能驱动和/或调节有效连接的核酸表达的核酸的方法，包括筛选核酸序列数据库以找到任意SEQ ID NO 1至22或SEQID NO 23至44所示序列的同源物。随后这些同源物用来筛选基因组DNA文库，其文库例如从上述同源物来源的生物体制得。筛选过程可例如包括杂交。随后，分析与该同源物匹配的基因组DNA以鉴定与同源物对应的基因的转录起始位点和翻译起始位点。最后，设计针对位于上述翻译起始位点上游区域(在5’末端)的核酸扩增的特异引物。
本发明涉及调节蛋白的鉴定，其涉及本发明启动子活性的调节。所述鉴定可利用酵母单-杂交系统完成。在所述酵母单-杂交系统中，SEQ ID NO 1至22的任意一个序列与GAL转录激活子有效连接且转化至酵母细胞培养物。酵母细胞培养物用编码候选调节因子的构建体文库再次转化。
现在将参照以下图例描述本发明，其中：
图1显示启动子的一般图示。调控元件为那些例如决定启动子活性的专一和/或时序调节的序列。最小启动子为必需和足以启动表达的最小序列。包括TATA框，其为正确引导核糖核酸聚合酶II至转录起始位点所必需的。转录起始元件(INR)包括转录起始开始位点。5’非翻译区(5’UTR)指转录进入前-信使RNA以及最终进入mRNA，但不翻译为蛋白质的区域。翻译起始密码子由起始密码子ATG表示。
图2为用于在β-葡糖醛酸酶(GUS)基因受本发明任一启动子控制下的植物中表达的载体p4581的图谱。该双元载体包括Gateway重组盒，适于本发明任意启动子在大肠杆菌β-葡糖醛酸酶(GUS)基因前的重组克隆。该盒包含氯霉素抗性基因(CamR)和用于非-重组质粒反向选择的ccdB自杀基因。该GUS表达盒进一步包括双终止子序列T-zein和T-rbcS-deltaGA。该表达盒位于胭脂碱Ti质粒的左侧边界内(LB重复，LB Ti C58)和右侧边界内(RB重复，RB Ti C58)。克隆在该边界内的还有在组成型启动子和终止子序列的控制下的可选择标记和可筛选标记基因。该载体还包含细菌复制的复制起点(pBR322)和细菌可选择的细菌筛选标记(Spe/SmeR)。
下图显示用携带与报告基因GUS有效连接的本发明启动子的报告载体p4581转化的植物或植物部分的GUS染色结果。标志为“C植株”的植物是长至约5cm的转基因植物；标志为“B植株”的植物是长至约10cm的；而标志为″A植株″的植物是长至成熟的。这些A植株用来收集来自老叶、新叶和种子的不同组织样品。
图3显示PRO0110(RCc3，SEQ ID NO 1)的表达模式。在根中可见GUS染色。
图4显示PRO0005(推定的β-淀粉酶，SEQ ID NO 2)的表达模式。在种子中可见GUS染色，更准确地是在胚或胚的盾片中。
图5显示PRO0009(推定的纤维素合成酶，SEQ ID NO 3)的表达模式。在根中可见GUS染色。
图6显示PRO0058(蛋白酶抑制因子Rgpi9，SEQ ID NO 4)的表达模式。在种子中可见GUS染色。
图7显示PRO0061(β棒曲霉素EXPB9，SEQ ID NO 5)的表达模式。在A植株(A)的早期花和在B植株(B)以及C植株(C)其他早期增殖的组织中可见GUS染色。
图8显示PRO0063(推定的结构蛋白质，SEQ ID NO 6)的表达模式。在早期组织中可见GUS染色，例如在“A植株”的愈伤组织(A)或老叶、新叶和种子(B)中。
图9显示PRO0081(推定的咖啡酰辅酶A3-O-甲基转移酶，SEQ IDNO 7)的表达模式。在早期组织，尤其是芽中可见GUS染色。
图10显示PRO0091(醇溶谷蛋白RP5，SEQ ID NO 8)的表达模式。在种子(A)，尤其在胚乳，和分生组织(B)中可见GUS染色。
图11显示PRO0095(推定的氨肽酶，SEQ ID NO 9)的表达模式。在种子，更具体在胚中可见GUS染色。
图12显示PRO0111(uclacyanin3-样蛋白质，SEQ ID NO 10)的表达模式。在根和分生组织中可见GUS染色。
图13显示PRO0116(26S蛋白酶体调控粒子非-ATPase亚单位11，SEQ ID NO 11)的表达模式。在整个植株(弱组成型)中微弱可见GUS染色且在分生组织中尤其明显。
图14显示PRO0117(推定的40S核糖体蛋白，SEQ ID NO 12)的表达模式。在种子，更具体在胚乳中可见GUS染色。
图15显示PRO0122(叶绿素a/b-结合蛋白前体(Cab27)，SEQ IDNO 13)的表达模式。在芽中可见GUS染色。
图16显示PRO0123(推定的原叶绿素酸酯还原酶，SEQ ID NO 14)的表达模式。在芽(地上组织)中可见GUS染色。
图17显示PRO0133(壳多糖酶Cht-3，SEQ ID NO 15)的表达模式。在根茎和分生组织中可见GUS染色。
图18显示PRO0151(WSI18，SEQ ID NO 16)的表达模式。在胼胝体和上部的植株部分(A)以及糊粉层和胚(B)中可见GUS染色。
图19显示PRO0169(水通道蛋白，SEQ ID NO 17)的表达模式。在整个植株(组成型表达)中可见GUS染色。
图20显示PRO0170(高迁移率组蛋白，SEQ ID NO 18)的表达模式。在由“B植株”(A)例解的整个植株，和各种组织如老叶、新叶和种子(B)以及愈伤组织(C)(组成型表达)中强烈可见GUS染色。
图21显示PRO0171(可逆糖基化蛋白RGP1，SEQ ID NO19)的表达模式。在所有植株部分(组成型表达)可见GUS染色。
图22显示PRO0173(胞质MDH，SEQ ID NO 20)的表达模式。在所有植株部分且尤其在芽(地上组织)和种子中可见GUS染色。
图23显示PRO0175(RAB21，SEQ ID NO 21)的表达模式。在愈伤组织(A)、分生组织和新叶中微弱可见GUS染色，而在正发育和成熟的种子(B)中，更具体在胚中强烈可见GUS染色。
图24显示PRO0177(Cdc2-1，SEQ ID NO 22)的表达模式。在分生组织和叶片中微弱可见GUS染色。
实施例
本发明的启动子作为来自各种稻基因翻译起始密码子(即第一个ATG，其密码子被排除)上游跨度约1.2kb序列的DNA区域而被分离。为了测定其核酸序列和表达模式，进行以下程序：首先对基因组稻序列进行in silico研究。然而，基于自动化预测程序以定位启动子-样核酸序列的程序是非常容易出错的，即使是对最易-鉴定的启动子调控元件的定位，如TATA框和转录起始元件(INR)。还有，表达模式的in silico测定是极其投机性的。因此，为获得有关启动子核酸序列和表达模式的明确数据，进行体内试验，包含(i)启动子核酸序列的分离；(ii)将报告基因有效连接至该启动子且将得到的遗传构建体导入宿主生物体；(iii)在允许报告基因表达的条件下培养转化的宿主细胞，和(iv)测定宿主生物体的不同组织中报告基因的活性。这些方法将更详细地得到描述。
实施例1.启动子的鉴定和分离
稻EST的鉴定，对应的基因和其在稻基因组中的定位
对包括稻序列的序列数据库检索稻表达序列标签(EST)。随后进行“in silico”的Northern-blot以鉴定强烈表达或对特定器官特异的EST家族。该分析包括从不同植物器官分离的EST数目的标准化。选择在源cDNA文库中具有目的分布状态的EST家族用于进一步的分析和序列同源性检索。在序列同源性检索结合搜索科研数据后，对应于EST家族的基因从序列数据库中得到鉴定并且给出功能(推定的)和相应的基因名称(参见表1)。随后，相应启动子区域通过以下方法分离。在第一个步骤中，检索TIGR数据库以得到对应EST家族的假定的重叠群。利用标准计算机程序得到序列同源性，如使用标准参数(一般，开放缺口的G值＝5，延伸缺口的E值＝2，在运行的blast部分错配的q罚分＝-3，在运行的blast部分匹配的r奖分＝1，e期望值＝10.0，W字符长度＝11，v一行描述的数目＝100，b显示序列比对的数目＝100，矩阵＝BLOSUM62)的Blast N。TIGR数据库(基因组研究机构)提供了假定的重叠群(TC)，其为基于构建自所有已知EST、所有已知cDNA和改造的mRNA重叠群的序列预测。用来鉴定本发明启动子的TC在表1中表示。在第二个步骤中，TC用来将相应基因定位至基因组序列上，其基因包括编码区以及启动子区域。通常，基因组序列为BAC克隆，此处通过其Genbank登录号(参见表1)表示。从这些BAC克隆可确定启动子区域的序列同一性。
表1：本发明的稻启动子列表。启动子序列在此通过其SEQ ID NO以及启动子编号(PRO)表示。由本发明启动子天然驱动的编码序列(CDS)通过其名称、通过SEQ ID NO以及通过TIGR数据库的假定重叠群(TC)的登录号表示。包含本发明启动子区域的基因组序列(BAC克隆或基因)通过其Genbank登录号表示。
  启动子SEQID NO   启动子编号   CDS名称   CDS SEQID NO   CDS TC   BAC克隆(*或基因)
  1   PRO0110   RCc3   23   TC89946   AC037426
  2   PRO0005   推定的β-淀粉酶   24   TC90358   AC022457
  3   PRO0009   推定的纤维素合酶   25   TC83635   AC022457
  4   PRO0058   蛋白酶抑制因子Rgpi9   26   TC83117   AF044059
  5   PRO0061   β棒曲霉素EXPB9   27   TC89913   AC020666
  6   PRO0063   结构蛋白质   28   TC89985   AP001278
  7   PRO0081   推定的咖啡酰-辅酶A3-O-甲基转移酶   29   TC89891   AP000364
  8   PRO0091   醇溶谷蛋白RP5   30   TC89670   AF156714*
  9   PRO0095   推定的甲硫氨酸氨肽酶   31   TC89883   AC027133
  10   PRO0111   uclacyanin3-样蛋白质   32   TC90434   AJ307662
  11   PRO0116   26s蛋白酶体调控粒子非-ATPase亚单位11   33   TC83072   AP000969
  12   PRO0117   推定的40s核糖体蛋白   34   TC90038   AC090871
  13   PRO0122   叶绿素a/b-结合蛋白前体(Cab27)   35   TC82936   AP004700
  14   PRO0123   推定的原叶绿素酸酯还原酶   36   TC89839   AL606456
  15   PRO0133   壳多糖酶Cht-3   37   TC85888   D16223*
  16   PRO0151   WSI18   38   TC84300   AP003023
  17   PRO0169   水通道蛋白   39   TC89687   AP005108
  18   PRO0170   高迁移率组蛋白   40   TC89846   AP004004
  19   PRO0171   可逆糖基化蛋白RGP1   41   TC82935   AC090874
  20   PRO0173   胞质MDH   42   TC82977   AC037425
  21   PRO0175   RAB21   43   TC83646   Y00842*
  22   PRO0177   Cdc2-1   44   TC90619   AP004765
稻基因启动子区域的鉴定和分离
根据基因的序列情况以及其在稻基因组中的定位，基因的启动子区域作为翻译起始密码子(即第一个ATG，其密码子被排除)上游跨度约1.2kb的DNA区域而被分离。当在基因的5’非翻译区存在插入序列如内含子时，该分离的DNA区域视为跨度约1.2kb加上插入序列长度的区域。通过利用特异引物的PCR从日本稻(Oryza SativaJaponica)或偶尔从印度稻(Oryza Sativa Indica)的基因组DNA中分离启动子区域。这些特异引物包括AttB重组位点，适于分离的启动子区域的重组克隆。这些特异引物在此以SEQ ID NO 45至88表示且列于表2中。PCR条件如下：94℃2分钟的1个循环，94℃1分钟，58℃1分钟和68℃2分钟的35个循环，以及68℃5分钟的1个循环。预期的PCR片段长度也显示在表2中。相应的PCR片段通过凝胶电泳以及随后用Zymoclean Gel DNA Recovery Kit(Zymo Research，Orange，California)的纯化从PCR反应混合物中纯化。
表2：用于分离本发明稻启动子的引物和稻启动子区域长度的概述。
  启动子SEQ ID NO   启动子编号   启动子长度   正向引物SEQ ID NO   正向引物   反向引物SEQ ID NO   反向引物
  1   PRO0110   1264   45   prm3780   67   prm3781
  2   PRO0005   1215   46   prm2768   68   prm2769
  3   PRO0009   1038   47   prm2420   69   prm2421
  4   PRO0058   1301   48   prm2853   70   prm2854
  5   PRO0061   1243   49   prm2426   71   prm2427
  6   PRO0063   1019   50   prm2855   72   prm2856
  7   PRO0081   1212   51   prm3025   73   prm3026
  8   PRO0091   1052   52   prm3029   74   prm3030
  9   PRO0095   1216   53   prm3061   75   prm3062
  10   PRO0111   1237   54   prm3031   76   prm3032
  11   PRO0116   1100   55   prm3051   77   prm3052
  12   PRO0117   1216   56   prm3592   78   prm3049
  13   PRO0122   1210   57   prm5131   79   prm2195
  14   PRO0123   123   58   prm3782   80   prm2197
  15   PRO0133   1808   59   prm2844   81   prm2845
  16   PRO0151   1828   60   prm2973   82   prm2974
  17   PRO0169   1267   61   prm3770   83   prm3771
  18   PRO0170   1130   62   prm3772   84   prm3773
  19   PRO0171   1230   63   prm3774   85   prm 3775
  20   PRO0173   1234   64   prm3776   86   prm3777
  21   PRO0175   1553   65   prm3800   87   prm3801
  22   PRO0177   1087   66   prm5135   88   prm5136
实施例2.用于植物转化的启动子-GUS报告载体的克隆
对应于本发明启动子区域的实施例1中纯化的PCR片段利用“BP重组反应”克隆入GatewayTM系统(Life Technologies)的pDONR201进入质粒中。克隆插入物的特性和碱基对组成通过测序证实，另外，得到的质粒通过限制性内切酶酶切消化检测。
为了将本发明启动子克隆在报告基因之前，实施例1的每个进入克隆随后利用目的载体p4581用于“LR重组反应”(GatewayTM)中。通过GUS基因前Gateway重组盒的替代而将目的载体设计成能将本发明的每个启动子有效连接至大肠杆菌β-葡糖醛酸酶(GUS)基因。此外，该目的载体适于植物的转化且包括在T-DNA左右边界内的所得到的启动子-GUS盒和筛选标记以及可筛选的标记盒(参见图2)。得到的包括与GUS有效连接的本发明启动子的报告载体随后利用标准的转化方法转化入土壤杆菌品系LBA4044且随后转化进入稻植物。
实施例3.植物中启动子-GUS报告盒的表达模式
各阶段(C植株、B植株和A植株)转基因植物或植株部分的生长和收获
对于每个启动子-GUS报告构建体，从转化的细胞产生3个T0转基因稻植物。植物生长在常规条件下进行。第一个转基因植物当其达到约5cm大小时用于GUS染色，在此植物命名为“C植株”。第二个转基因植物当其达到约10cm大小时用于GUS染色，在此植物命名为“B植株”。第三个转基因植物留作种子的产生且在此命名为“A植株”。GUS染色在完整的C和B植株上进行。对A植株，GUS染色在各发育阶段的叶片、花和种子部分上进行。A植株可以结籽，种子收获后用于在T1植株中表达模式的证实。
GUS染色
选出的植株或植株部分用90％冰预冷的丙酮覆盖且4℃温育30分钟。在用Tris缓冲液[1Lbidi中15.76g Trizma HCl(SigmaT3253)+2.922gNaCl，用NaOH调节pH至7.0]3次5分钟洗涤后，材料用Tris/铁氰酸盐/X-Gluc溶液[9.8mlTris缓冲液+0.2ml铁氰酸盐母液(10ml Tris缓冲液中0.33g铁氰酸钾(Sigma P3667))+0.2mlX-Gluc母液(500μl DMSO中26.1mgX-Gluc(Europa Bioproducts ML113A))]覆盖。进行15至30分钟的真空渗透。植株或植株部分37℃温育至16小时直到可见蓝色显影。样品用Tris缓冲液5分钟洗涤3次。在乙醇梯度50％、70％和90％中提取叶绿素(每次30分钟)。
本发明启动子的表达模式
本发明稻启动子的表达模式概括在表3中。
表3：本发明稻启动子的表达模式
 启动子SEQID NO   启动子编号   启动子名称  表达模式
  1   PRO0110   RCc3  根中强烈的
  2   PRO0005   推定的β-淀粉酶  胚(盾片)
  3   PRO0009   推定的纤维素合酶  根中微弱的
  4   PRO0058   蛋白酶抑制因子Rgpi9  种子
  5   PRO0061   β棒曲霉素EXPB9  早期组织中微弱的
  6   PRO0063   结构蛋白质  早期组织+愈伤组织+胚
  7   PRO0081   推定的咖啡酰-辅酶A3-O-甲基转移酶  芽
  8   PRO0091   醇溶谷蛋白RP5  分生组织+胚乳中强烈的
  9   PRO0095   推定的甲硫氨酸氨肽酶  胚
  10   PRO0111   uclacyanin3-样蛋白质  分生组织中微弱的
  11   PRO0116   26s蛋白酶体调控粒子非-ATPa se亚单位11  分生组织中微弱的
  12   PRO0117   推定的40s核糖体蛋白  胚乳中微弱的
  13   PRO0122   叶绿素a/b-结合蛋白前体(Cab27)  芽中微弱的
  14   PRO0123   推定的原叶绿素酸酯还原酶  强烈的芽特异性的
  15   PRO0133   壳多糖酶Cht-3  微弱的分生组织特异性的
  16   PRO0151   WSI18  愈伤组织+芽+胚中强烈的
  17   PRO0169   水通道蛋白  培养基组成型的
  18   PRO0170   高迁移率组蛋白  强烈的组成型的
  19   PRO0171   可逆糖基化蛋白RGP1  微弱的组成型的
  20   PRO0173   胞质MDH  芽和种子
  21   PRO0175   RAB21  胚
  22   PRO0177   Cdc2-1  分生组织中微弱的+种子中强烈的
以下段落更详细地描述了观察到的本发明启动子的表达模式。在上述GUS染色组织的肉眼观察基础上观测。可以理解的是一些启动子的表达可能是微弱的且在某些组织中的表达可能只有用很敏感检测方法才可见到。
PRO0110-SEQ ID NO 1-RCc3
研究构建体(OS 1432)，其为如实施例2所述的包含PRO0110的报告载体。分析25个愈伤组织、14个C、21个B植株和21个A植株。在愈伤组织中没有见到表达，但在C植株(93％)和B植株(81％)的根中观察到强表达。在A植株的芽中没有观察到表达。因此RCc3启动子PRO0110适于在根中的强表达。
PRO0005-SEQ ID NO 2-推定的β-淀粉酶
研究构建体(OS1365)。分析28个愈伤组织、24个B植株和22个A植株。观察到在愈伤组织中(7％)偶尔的表达以及在B植株的根(4％)和芽(12％)中偶尔的弱表达、在A植株胚的盾片中(43％)的表达和A植株叶片(5％)中偶尔的表达。该启动子因此适于在胚中，更优选在胚的盾片中表达。该胚区域也称为胚的传递层。该启动子可能具有在其他组织中的一些渗漏(leakiness)。
PRO0009-SEQ ID NO 3-推定的纤维素合酶
研究构建体(OS1461)。分析20个愈伤组织、20个C、20个B植株和20个A植株。观察到在愈伤组织中(20％)偶尔的表达以及在C植株的根中(55％)的弱表达、在C植株的新叶中(10％)偶尔的表达和在B植株的根中(25％)的弱表达。在A或B植株的叶片中没有观察到表达。因此该启动子适于在根中表达。该启动子可能在叶片中呈现一些渗漏。
PRO0058-SEQ ID NO 4-蛋白酶抑制因子Rgpi9
研究构建体(OS1370)。分析13个B植株和12个A植株。在B植株中没有观察到表达。在A植株中，叶片中没有观察到表达，但在胚乳和胚(58-42％)中有强表达。因此该启动子PRO0058适于在种子中表达。
PRO00061-SEQ ID NO 5-β棒曲霉素EXPB9
研究2个构建体(OS1441和OS1460)。分析20个愈伤组织、32个C、32个B植株和32个A植株。在C和B植株的叶片中观察到弱表达。在A植株花(44％)中，更具体是在早期小穗lemma中观察到表达。结论是启动子PRO0061适于在早期组织，更优选在早期的、正发育的或正增殖(expanding)的组织中，更优选在绿色组织中表达。
PRO0063-SEQ ID NO 6-推定的结构蛋白质
研究构建体(OS1446)。分析13个愈伤组织、13个C、13个B植株和12个A植株。在愈伤组织中检测到弱表达(92％)。C植株中，根中无表达而在一些叶片中有弱表达(46％)。B植株中，根中无表达而在早期分蘖(78％)或新叶(54％)中有弱表达，但在老叶中无表达。A植株中，新叶中有偶尔的表达(17％)而在胚和盾片(42％)中有表达。因此，可得出该启动子在地上组织，如叶片、茎和种子中是有活性的。这些数据证实该启动子适于在愈伤组织和在芽中表达，以及适于在早期组织和种子中表达。
PRO0081-SEQ ID NO 7-推定的咖啡酰-辅酶A3-O-甲基转移酶
研究构建体(OS1419)。分析20个愈伤组织、20个C、20个B植株和20个A植株。在愈伤组织中没有观察到表达。在C植株中观察到表达，更具体在齿根圆柱(40％)和新叶(80％)以及老叶中有弱表达。在B植株中也观察到表达，更具体在根中(25％)和新叶(80％)中有弱表达。还在A植株的新叶(50％)中观察到表达。结论是启动子PRO0081适于在地上的组织，优选在芽中表达。该启动子可能在根中有一些渗漏。
PRO0091-SEQ ID NO 8-醇溶谷蛋白RP5
研究构建体(OS1558)。分析12个C、12个B植株和12个A植株。在C植株的分化中心(50％)和B植株的分化中心(58％)观察到弱表达。在A植株的胚乳(55％)中观察到强表达。该启动子被认为可用于在胚乳中强表达，同时在分生组织中有渗漏，优选在芽分生组织或分化中心中。
PRO0095-SEQ ID NO 9-推定的甲硫氨酸氨肽酶
研究构建体(OS1423)。分析16个愈伤组织、14个C、14个B植株和16个A植株。在C植株根尖(36％)和A植株胚(38％)而不在A植株胚乳中观察一些表达。结论是PRO0095适于在胚中表达。
PRO0111-SEQ ID NO 10-uclacyanin3-样蛋白质
研究构建体(OS1421)。分析22个愈伤组织、21个C、22个B植株和21个A植株。在B植株的分化中心和分生组织中(77％)观察到弱表达。结论是启动子PRO0111适于在分生组织，优选在芽分生组织或分化中心中弱表达。
PRO0116-SEQ ID NO 11-26S蛋白酶体调控粒子非-ATPase亚单位11
研究构建体(OS1679)。分析13个C、14个B植株和A植株。在C植株(38％)和B植株(71％)的分生组织/分化中心以及C植株(77％)和B植株(21％)的新叶鞘中观察到弱表达。结论是启动子PRO0116适于在分生组织，优选在芽分生组织或分化中心中弱表达。
PRO0117-SEQ ID NO 12-推定的40S核糖体蛋白
研究构建体(OS1425)。分析9个愈伤组织、9个C、9个B植株和9个A植株。在C植株的根(22％)和嫩叶片(44％)中观察到偶尔的弱表达。主要在A植株的胚乳(37％)中观察到表达。因此，启动子PRO117被认为适于在胚乳中表达且可能在新叶中有一些渗漏。
PRO0122-SEQ ID NO 13-叶绿素a/b-结合蛋白前体(Cab27)
研究构建体(OS1675)。分析38个愈伤组织、38个C、38个B植株和15个A植株。在C植株的分化中心和嫩叶鞘中观察到非常弱的表达。结论是启动子PRO0122适于在芽中弱表达。
PRO0123-SEQ ID NO 14-推定的原叶绿素酸酯还原酶
研究构建体(OS1433)。分析21个愈伤组织、18个C、19个B植株和18个A植株。在C植株和B植株(63-79％)的芽中(33-68％)观察到强表达。在B植株根中还有偶尔的表达。A植株中，在新叶中(73％)再次观察到强表达，而在老叶中(39％)有偶尔的表达。结论是该启动子适于在芽，优选在叶片中强表达。
PRO0133-SEQ ID NO15-壳多糖酶Cht-3
研究构建体(OS1687)。分析15个愈伤组织、12个C、16个B植株和12个A植株。在愈伤组织(66％)和在B植株的分化中心/分生组织(50％)中观察到弱表达。结论是启动子PRO0133适于在分生组织，优选在芽分生组织或分化中心中弱表达。
PRO0151-SEQ ID NO 16-WSI18
研究构建体(OS 1458)。分析22个愈伤组织、16个C、16个B植株和13个A植株。在愈伤组织中(91％)观察到强表达而在C植株(62％)的芽中有弱表达。A植株中在糊粉层和胚中(46％)有很强的表达。结论是启动子PRO0151适于在愈伤组织和在种子，更具体在糊粉层和种子的胚中强表达。
PRO0169-SEQ ID NO 17-水通道蛋白
研究构建体(OS1911)。分析11个愈伤组织、10个C植株、B植株和A植株。在愈伤组织和C植株根中(30％)观察到一些表达(55％)。此外，在C植株的芽组织(80％)和B植株的新叶中观察到很好的表达。结论是该启动子适于组成型表达，优选在幼苗中的组成型的表达。
PRO170-SEQ ID NO 18-高迁移率组蛋白
研究构建体(OS1434)。分析23个愈伤组织、21个C、21个B植株和14个A植株。在愈伤组织(52％)和C植株根中(51％)观察到表达。此外，在C植株的新叶(81％)、B植株的根(86％)和B植株的新叶中(86％)观察到强表达。A植株中，在新叶(75％)、老叶(43％)、胚和糊粉中有强表达，但在胚乳中(82％)为较弱的表达。结论是启动子PRO170适于强组成型表达。
PRO0171-SEQ ID NO 19-可逆糖基化蛋白RGP1
研究构建体(OS1762)。分析18个愈伤组织、11个C植株和13个B植株。在愈伤组织(44％)和C植株所有组织中(27％)观察到强表达。在B植株(16％)的所有组织中，表达稍弱但在分化中心中(46％)最显著。结论是启动子PRO0171适于组成型表达。
PRO0173-SEQ ID NO 20-胞质MDH
研究构建体(OS1435)。分析17个愈伤组织、17个C、17个B植株和15个A植株。在愈伤组织中观察到偶尔的表达(12％)而在C植株的上面的部分(24-69％)以及B植株的新叶中(41％)观察到弱表达。A植株中，在叶片中(33％)观察到表达而在种子中(38％)有强表达，在根中无表达。结论是启动子PRO0173适于在地上的组织中表达，尤其适于在芽以及特别是在种子中组成型表达。
PRO0175-SEQ ID NO 21-RAB21
研究构建体(OS1436)。分析16个愈伤组织、12个C、15个B植株和15个A植株。在一些愈伤组织(31％)、C植株的分化中心(42％)和C植株和A植株(15％)的新叶中(25-58％)观察到表达。此外，在植株的糊粉和胚中(60％)观察到很强的表达。结论是启动子PRO0175适于在愈伤组织和在种子中，更具体在正发育/正成熟的种子中，更具体在糊粉层和种子的胚中强表达。
PRO0177-SEQ ID NO 22-Cdc2-1
研究构建体(OS1436)。分析16个愈伤组织、12个C、15个B植株和15个A植株。在一些愈伤组织(31％)、C植株的分化中心(42％)、C植株的新叶(25-58％)和A植株的偶尔的新叶中(15％)观察到表达。此外，在A植株种子的糊粉和胚中(60％)观察到很强的表达。结论是该启动子适于在种子中，更具体在正发育/正成熟的种子中特异表达。
实施例4.在进一步的世代中本发明启动子表达模式的稳定性
对来自转化组织的T0植物进行上述分析。原始T0植株的下一代或子代植株，所谓的T1和T2植株中启动子活性的稳定性评估如下。用实施例2的上述段落中提及的报告构建体转化的T0植株长至成熟(A植株)，收获其种子(T1种子)且播种以产生子代T1植株。这些植株如实施例3中所述进行分析且A T1植株允许达到成熟而结成T2种子。
在T0植株、T1种子、T1植株和T2种子以及实施例3中所述所有组织(包括种子和种子组织)中研究本发明启动子的表达模式。从T0和T1种子以及实施例3中所述的报道的特异表达模式在随后的T1代和T2种子中得到证实。结论是本发明启动子的表达模式在随后世代的植株中是稳定遗传的。
实施例5.在其他植物中本发明启动子表达模式的稳定性
在稻植物上进行以上植物分析。该选择是基于植物遗传工程对农作物植物非常有益的实际的考虑的。在其他农作物植物中，例如玉米中，导入包含本发明启动子的报告构建体且如上文所述评估转化的植物。本发明启动子的表达模式在植物中是保守的。因此，本发明的启动子还适于在单子叶植物，如玉米中驱动和/或调节有效连接的核酸的表达。
为了许多其他目的如研究和园艺，(小的)草本植物正进行遗传修饰，其包括启动子的利用。因此包含本发明启动子的报告构建体导入其他植物品种例如鼠耳芥中，且如上文所述评估转化的植株。本发明启动子的表达模式在植物中是保守的。因此，本发明的启动子还适于在其他植物品种例如双子叶植物，如鼠耳芥中驱动和/或调节有效连接的核酸的表达。

Claims (11)

1.能驱动和/或调节表达的分离的启动子，其由SEQ ID NO 18的分离核酸组成。
2.遗传构建体，包含：
(a)权利要求1中定义的分离的启动子；和
(b)与(a)的所述启动子有效连接的异源核酸序列；和任选的
(c)3’转录终止子。
3.包含权利要求2定义的遗传构建体的表达盒。
4.包含权利要求2定义的遗传构建体的转化载体。
5.包含权利要求2定义的遗传构建体的表达载体。
6.包含权利要求1定义的分离的启动子、或权利要求2定义的遗传构建体、或权利要求3定义的表达盒、或权利要求4定义的转化载体、或权利要求5定义的表达载体的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自细菌、藻类和真菌宿主细胞。
7.包含权利要求1定义的分离的启动子、或权利要求2定义的遗传构建体、或权利要求3定义的表达盒、或权利要求4定义的转化载体、或权利要求5定义的表达载体的宿主细胞，其中所述宿主细胞为酵母宿主细胞。
8.在植物或植物细胞中驱动和/或调节核酸表达的方法，包括：
(a)将所述核酸有效连接至权利要求1定义的分离的启动子，和
(b)将得到的遗传构建体导入植物或植物细胞。
9.权利要求8的方法，其中所述表达是组成型的或组织特异性的。
10.用于转基因植物生产的方法，包括：
(a)将权利要求1定义的分离的启动子、或权利要求2定义的遗传构建体、或权利要求3定义的表达盒、或权利要求4定义的转化载体、或权利要求5定义的表达载体导入植物细胞，和
(b)在促进植物生长的条件下培养所述植物细胞。
11.权利要求1定义的分离的启动子用于驱动和/或调节有效连接的核酸表达的用途。
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