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CN120957611A - 酶组合物和啤酒酿造方法 - Google Patents

酶组合物和啤酒酿造方法

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CN120957611A
CN120957611A CN202480021721.2A CN202480021721A CN120957611A CN 120957611 A CN120957611 A CN 120957611A CN 202480021721 A CN202480021721 A CN 202480021721A CN 120957611 A CN120957611 A CN 120957611A
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CN
China
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specific
prolyl
enzyme component
cellulase
less
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Application number
CN202480021721.2A
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English (en)
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彼得吕斯·雅各布斯·西奥多瑞斯·蒂克尔
皮埃尔-拉姆伯特·弗朗索瓦·玛丽-约瑟夫·斯莫尔
芮妮·马赛尔·德·钟
迈克尔·丹尼斯·泰贝林
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DSM IP Assets BV
Original Assignee
DSM IP Assets BV
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Publication date
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Abstract

一种组合物，其包含以下物质或由以下物质组成：‑第一酶组分，其包含以下物质或由以下物质组成：谷氨酰胺特异性蛋白酶和/或脯氨酰特异性蛋白酶，优选地谷氨酰胺特异性内切蛋白酶和/或脯氨酰特异性内切蛋白酶，最优选地脯氨酰特异性内切蛋白酶；以及‑第二酶组分，其包含纤维素分解酶、优选地纤维素酶，或由纤维素分解酶、优选地纤维素酶组成，其中优选地，第二酶组分衍生自里氏木霉和/或由里氏木霉产生。

Description

酶组合物和啤酒酿造方法
技术领域
本发明涉及一种新型酶组合物及新型啤酒酿造方法。
背景技术
传统的啤酒生产方法包括第一水解阶段和第二单独的发酵阶段，在第一水解阶段中淀粉被水解成糖类，在第二单独的发酵阶段中这些糖类随后被发酵成酒精。发酵在传统上是用酵母细胞进行的。
例如，WO2013/167573描述了一种制备具有高水平的游离氨基酸的麦芽汁的方法，所述方法包括以下步骤：a)在包括α淀粉酶、β葡聚糖酶、普鲁兰酶(pullulanase)、木聚糖酶和脂肪酶的外源酶的存在下淀粉糖化(mashing)包含大麦的组合物；并且b)在淀粉糖化过程中或淀粉糖化完成后，向所述组合物中添加至少两种不同的外源蛋白酶，其中一种蛋白酶具有内切蛋白酶活性，并且另一种蛋白酶具有外肽酶活性。内切蛋白酶可以是金属蛋白酶、脯氨酸内切蛋白酶或谷氨酰胺内切蛋白酶。在实施例2中，在淀粉糖化步骤中加入OndeaPro(可从Novozymes商购获得)、金属蛋白酶和外肽酶。根据WO2013/167573，淀粉糖化是将来自碾磨的大麦麦芽和固体助剂的淀粉转化为可发酵的糖和不可发酵的糖以产生所期望组合物的麦芽汁的过程。淀粉糖化后，当所有淀粉都被分解时，有必要将液体提取物(麦芽汁)与残留固体(酒糟)分离并将其煮沸。由此，许多物质(包括若干蛋白质)变性。冷却并除去沉淀物后，将麦芽汁充气并发酵以生产啤酒。由于煮沸，在发酵过程中不存在活的酶。
然而，最近家庭酿酒商也开始使用所谓的“SSF”(同时糖化和发酵)方法。在该方法中，水解步骤(也称为糖化步骤)和发酵步骤同时进行。
Baltaci等人在其题为“The simultaneous saccharification andfermentation of malt dust and use in the acidification of mash”的文章中描述了这种同时糖化和发酵过程的示例，该文章于2019年2月26日在线DOI 10.1002/jib.554发表。他们描述了SSF方法如何将使用纤维素分解酶的纤维素材料的糖化(产生糖)和消耗糖的发酵进行结合。该方法也是优选的，因为它降低了反应体积和处理时间。Baltaci等人讨论了在该方法中麦芽粉尘和醪液(mash)酸化的问题。
此外，一些特殊的酒精饮料(例如清酒)可以在其中糖化和发酵在同一酿造罐内同时发生的过程中生产。
浑浊(haze)是在啤酒行业中一种众所周知的现象。在啤酒酿造过程中，浑浊形成可以在不同阶段发生。在由T.Nagodawithana和G.Reed编辑的“Enzymes in foodprocessing”，第3版，Academic pressInc.，San Diego，第五章，第448-449页中，已经提出啤酒中的浑浊是啤酒蛋白和多酚原花青素之间相互作用的结果。
WO2002046381描述了一种用于预防或减少饮料中浑浊的方法，其中将脯氨酰特异性内切蛋白酶(prolyl-specific endoprotease)(也称为“PEP”)添加到饮料中。WO2002046381解释了脯氨酰特异性内切蛋白酶的活性取决于pH。例如，它描述了将内切蛋白酶添加到饮料中，所述饮料在对应于其所加入的饮料的pH的pH下具有最大脯氨酰比活性。由于浑浊形成经常发生在酸性饮料(例如啤酒、葡萄酒和果汁)中，因此优选地使用在低于7的pH值下具有脯氨酰比活性的脯氨酰特异性内切蛋白酶。WO2002046381随后提供了几种特定的脯氨酰特异性内切蛋白酶，其此后在降低饮料中的浑浊方面非常成功。
WO2002046381中描述的方法为传统啤酒酿造方法中的浑浊提供了一种良好的解决方案。
然而，在上文所描述的SSF方法中，啤酒中的“浑浊”可以具有不同的组成，并且可以由各组分的混合物引起。浑浊不仅可以包括啤酒蛋白和多酚原花青素之间的上述相互作用，还可以包括由原料产生的细颗粒物质和/或多糖。多糖在浑浊形成中的作用尚不清楚，但研究表明多糖对这种浑浊形成有影响。
提供具有以下性质的酶组合物和/或方法将会是本领域的进步，所述酶组合物和/或方法允许人们加速或以其他方式改进SSF方法；和/或加速或以其它方式改进发酵液和/或发酵罐中细颗粒物质的去除；和/或改善酒精饮料产品的味道。
发明内容
现在已经发现了一种新的酶组合物、应用这种新的酶的新方法和用于生产这种新的酶组合物的新方法，其允许人们加速或以其他方式改进SSF方法和/或加速或以其他方式改进发酵液和/或发酵罐中的细颗粒物质的去除和/或改善酒精饮料产品的味道。
因此，在第一方面，本发明提供了一种组合物(本文中也称为“酶组合物”)，其优选地用于添加到生产供人消费的酒精饮料的方法中，其包含以下物质或由以下物质组成：
-第一酶组分，其以下物质或由以下物质组成：谷氨酰胺特异性蛋白酶和/或脯氨酰特异性蛋白酶，优选地谷氨酰胺特异性内切蛋白酶和/或脯氨酰特异性内切蛋白酶，最优选地脯氨酰特异性内切蛋白酶；以及
-第二酶组分，其包含纤维素分解酶、优选地纤维素酶，或由纤维素分解酶、优选地纤维素酶组成。
优选地，所述第二酶组分衍生自里氏木霉(Trichoderma reesei)和/或由里氏木霉产生。更优选地，纤维素分解酶、优选地纤维素酶衍生自里氏木霉和/或由里氏木霉产生。如实施例所示，衍生自里氏木霉和/或由里氏木霉产生的纤维素分解酶、合适地纤维素酶产生最好的结果。更优选地，第一酶组分和第二酶组分均衍生自相同的微生物、优选地里氏木霉或由相同的微生物、优选地里氏木霉产生，这提供了高效生产的益处。
因此，优选地，第一方面提供了一种组合物，其包含以下物质或由以下物质组成：
-第一酶组分，其包含脯氨酰特异性蛋白酶、优选地脯氨酰特异性内切蛋白酶，或由脯氨酰特异性蛋白酶、优选地脯氨酰特异性内切蛋白酶组成；以及
-第二酶组分，其包含纤维素分解酶、优选地纤维素酶，或由纤维素分解酶、优选地纤维素酶组成，
其中优选地，第二酶组分衍生自里氏木霉和/或由里氏木霉产生。
在第二方面，本发明提供了制备方法，包括使用上述新的酶组合物。
在第三方面，本发明提供了用于生产上述新的酶组合物的方法。
不希望受任何类型的理论束缚，相信纤维素酶可以有助于在SSF方法中转化原料的小残余物，并且上述发明因此可以有助于改进以加速或以其它方式改进家庭酿造的SSF方法和/或加速或以其它方式改进发酵液和/或发酵罐中的细颗粒物质的去除和/或改善(自制)啤酒的味道将是本领域的进步。
通过实施例举例说明本发明。
上述新的酶组合物可以有利地用于生产供人消费的酒精饮料、优选地啤酒的方法中。因此，有利地提供了使用上述新的酶组合物来生产供人消费的酒精饮料的新的方法，优选地啤酒酿造的新的方法。
因此，在第四方面，本发明提供了一种用于生产供人消费的酒精饮料的方法，优选地啤酒酿造方法，其包括添加如上文所描述的组合物或添加如下文所描述的细菌或真菌菌株，优选地里氏木霉菌株。
更优选地，本发明提供了一种用于生产供人消费的酒精饮料的方法，优选地啤酒酿造方法，其包括添加如上文所描述的组合物，其中所述组合物包含以下物质或由以下物质组成：
-第一酶组分，其包含以下物质或由以下物质组成：谷氨酰胺特异性蛋白酶和/或脯氨酰特异性蛋白酶，优选地谷氨酰胺特异性内切蛋白酶和/或脯氨酰特异性内切蛋白酶，最优选地脯氨酰特异性内切蛋白酶；以及
-第二酶组分，其包含纤维素分解酶、优选地纤维素酶，或由纤维素分解酶、优选地纤维素酶组成。
此外，在第五方面，本发明提供了通过上述方法获得或能够获得的供人消费的酒精饮料。
附图说明
用以下附图来举例说明本发明。
图1描绘了在不同啤酒样品中颗粒的去除-过滤性能。
序列表简要说明
本申请包含计算机可读形式的序列表，其通过引用并入本文。下表提供了序列的概述。
表：序列表的概述：
优选地，本发明中的内切蛋白酶是具有与上述SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8、最优选SEQID NO:1的氨基酸序列具有等于或大于40％、更优选等于或大于60％、还更优选等于或大于70％、甚至更优选等于或大于80％、还甚至更优选等于或大于90％、又甚至更优选等于或大于95％、最优选等于或大于99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列的多肽。
发明详述
定义
除非另有定义或上下文明确指出，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。
在整个说明书和所附权利要求书中，词语“包含”和“包括”以及变体(诸如“含有”)应被解释为包括性的。也就是说，在上下文允许的情况下，这些词语旨在表达可能包括未具体叙述的其他元素或整数。
在本文中使用时，冠词“一个”和“一种”或不使用数量词的情形是指冠词的一个或多于一个(即一个或至少一个)的语法对象。举例来说，“要素”可以意指一个元件或多于一个要素。当以单数提及名词(例如化合物、添加剂等)时，意味着包括复数。因此，当提及特定部分(例如“菌株”)时，这意味着该菌株的“至少一种”，例如“至少一种菌株”，除非另有说明。
当提及存在几种异构体(例如，D和L对映异构体)的化合物时，该化合物原则上包括可用于本发明具体方面的该化合物的所有对映异构体、非对映异构体和顺式/反式异构体；特别是当提及该化合物时，其包括天然异构体。
除非另外明确指出，否则本文所述的本发明的各种实施方式可以交叉组合。
术语“肽”和“寡肽”被认为是同义的(如通常所认识的那样)，并且每个术语可以在上下文需要时互换使用，以指示通过肽基连接键偶联的至少两个氨基酸的链。在本文中使用时，术语“多肽”用于含有多于七个氨基酸残基的链。本文中的所有寡肽和多肽式或序列都是从左到右并在从氨基末端到羧基末端的方向上书写的。本文中提及的氨基酸名称是指Jeremy M.Berg、John L.Tymoczko和Lubert Stryer在由W.H.Freeman and Company,NewYork,USA于2007年出版的题为Biochemistry的第6版手册第2章中所描述的氨基酸。本文使用的氨基酸的单字母代码在本领域中是公知的，例如可以在Jeremy M.Berg、JohnL.Tymoczko和Lubert Stryer在由W.H.Freeman and Company,New York,USA于2007年出版的题为Biochemistry的第6版手册第2章表2.2中找到。
核酸序列(即多核苷酸)或蛋白质(即多肽)对于宿主细胞的基因组来说可以是原生的或异源的。
就宿主细胞而言，“原生的”、“同源的”或“内源的”是指核酸序列确实天然存在于宿主细胞的基因组中或蛋白质由该细胞天然产生。术语“原生的”、“同源的”或“内源的”在本文中可互换使用。
在本文中使用时，就宿主细胞而言，“异源的”可以指不以该方式天然存在于宿主细胞的基因组中的多核苷酸或不以该方式由该细胞天然产生的多肽或蛋白质。异源蛋白表达涉及在宿主细胞中不以该方式天然表达的蛋白质的表达。术语“异源表达”是指异源核酸在宿主细胞中的表达。
在本文中使用时，“启动子”是指导(结构)基因或其它(部分的)核酸序列转录的DNA序列。合适地，启动子位于基因的5'区，靠近(结构)基因的转录起始位点。启动子序列可以是组成型的、诱导型的或抑制型的。在一个实施方式中，不需要(外部)诱导剂。
第一酶组分
根据本发明的组合物合适地包含第一酶组分，其包含以下物质或者由以下物质组成：谷氨酰胺特异性蛋白酶和/或脯氨酰特异性蛋白酶，优选地谷氨酰胺特异性内切蛋白酶和/或脯氨酰特异性内切蛋白酶，最优选地脯氨酰特异性内切蛋白酶。
术语“蛋白酶”(“protease”)、“蛋白酵素”(“protease enzyme”)、“具有蛋白酶活性的酶”、“具有蛋白酶活性的蛋白质”和“具有蛋白酶活性的多肽”、“肽酶”(“peptidase”)、“肽酵素”(“peptidase enzyme”)、“具有肽酶活性的酶”、“具有肽酶活性的蛋白质”和“具有肽酶活性的多肽”在本文中可互换使用。
此外，术语“内切蛋白酶”(“endoprotease”)、“内切蛋白酵素”(“endoproteaseenzyme”)、“具有内切蛋白酶活性的酶”、“具有内切蛋白酶活性的蛋白质”和“具有内切蛋白酶活性的多肽”、“内切肽酶”(“endopeptidase”)、“内切肽酵素”(“endopeptidaseenzyme”)、“具有内切肽酶活性的酶”、“具有内切肽酶活性的蛋白质”和“具有内切肽酶活性的多肽”在本文中可互换使用。
此外，术语“脯氨酰特异性”和“脯氨酸特异性”在本文中可互换使用。最优选地，第一酶组分包含脯氨酰特异性内切蛋白酶或由脯氨酰特异性内切蛋白酶组成。
谷氨酰胺特异性蛋白酶和/或脯氨酸特异性蛋白酶以及相应的谷氨酰胺特异性内切蛋白酶和/或脯氨酸特异性内切蛋白酶可以以分离的或纯化的形式在本发明中使用。“分离的”或“纯化的”是指从其原生环境中取出的脯氨酸特异性蛋白酶。例如，为了本发明的目的，在宿主细胞中表达的重组产生的脯氨酸特异性蛋白酶被认为是分离的，与通过任何合适的技术已被基本上纯化的原生或重组多肽一样，所述合适的技术例如Smith和Johnson，Gene 67：31-40(1988)中公开的单步纯化方法。
适合在本发明中使用的脯氨酸特异性蛋白酶可以通过本领域技术人员熟知的方法从重组细胞培养物中回收，所述方法包括例如硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取和色谱方法(诸如高效液相色谱(HPLC))。
适用于本发明的脯氨酸特异性蛋白酶可以是天然纯化的产物、产物或化学合成的产物、通过重组技术从原核或真核宿主产生的产物，包括例如细菌、酵母、真菌、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞。
优选地，第一酶组分衍生自微生物和/或由微生物产生，所述微生物优选地是细菌或真菌，最优选地里氏木霉。换言之，优选地，脯氨酸特异性蛋白酶、脯氨酸特异性内切蛋白酶分别衍生自微生物和/或由微生物产生，所述微生物优选地是真菌，最优选地里氏木霉。
但是应当理解，蛋白酶可以与载体或稀释剂混合，所述载体或稀释剂不会干扰酶的预期目的，并且仍然被认为是分离的。适合在本发明中使用的脯氨酸特异性蛋白酶也可以是更基本上纯化的形式。因此，脯氨酸特异性蛋白酶可以包含在制剂中，其中在所述制剂中存在的任何蛋白酶的超过70％(例如超过80％、90％、95％、98％或99％)是脯氨酸特异性蛋白酶。最优选地，脯氨酸特异性蛋白酶可以是不含或基本上不含任何其它蛋白酶的形式。
适合在本发明中使用的脯氨酸特异性蛋白酶可以以固定形式使用，从而可以处理大量含蛋白质的液体。在文献中，例如在“酶和细胞的固定化”(“Immobilization ofEnzymes and Cells”)(Gordon F.Bickerstaff编辑；ISBN 0-89603-386-4)中，已经广泛地描述了选择合适的载体材料和合适的固定化方法的途径。
在本发明的上下文中，“脯氨酰特异性”或“脯氨酸特异性”蛋白酶或内切蛋白酶分别被定义为在蛋白质或肽在其链中含有脯氨酸残基的位置处切割蛋白质或肽的蛋白酶或内切蛋白酶。术语“脯氨酰特异性”和“脯氨酸特异性”在本文中可互换使用。优选地，“脯氨酰特异性”或“脯氨酸特异性”蛋白酶是在蛋白质或肽含有脯氨酸残基的位置处“切割”(水解)蛋白质或肽的内切蛋白酶。在根据本发明的方法中，优选地使用脯氨酸特异性内切蛋白酶，其水解在脯氨酸残基的羧基末端处的肽键。此类酶的实例是脯氨酰寡肽酶(EC3.4.21.26)以及在J.Agic Food Chem，第53卷(20)，7950-7957，2005中报道的黑曲霉(Aspergillus niger)衍生的脯氨酰内切蛋白酶以及脯氨酸特异性二肽基肽酶，例如DPPIV(EC 3.4.14.5)。在其NH2-末端处切割脯氨酸残基的脯氨酸特异性内切蛋白酶例如描述于1998年1月15日出版的Nature，Vol.391，p.301-304中。
在本发明的上下文中，“谷氨酰胺特异性”蛋白酶是在蛋白质或肽在其链中含有谷氨酰胺残基的位置处切割蛋白质或肽的蛋白酶。优选地，谷氨酰胺特异性蛋白酶是在蛋白质或肽含有谷氨酰胺残基的位置处“切割”(水解)蛋白质或肽的谷氨酰胺特异性内切蛋白酶。
在一个特别优选的实施方式中，第一酶组分包含蛋白酶、优选地内切蛋白酶或由其组成，其既是谷氨酰胺特异性的也是脯氨酸特异性的。
因此，在另一方面，本发明还提供了一种组合物，其包含以下物质或由以下物质组成：
-第一酶组分，其包含蛋白酶、优选地内切蛋白酶，或由蛋白酶、优选地内切蛋白酶组成；以及
-第二酶组分，其包含纤维素分解酶、优选地纤维素酶，或由纤维素分解酶、优选地纤维素酶组成，
其中优选地，蛋白酶或内切蛋白酶是：
-能够在一个或多个谷氨酰胺残基处水解底物蛋白质或肽；和/或
-能够在一个或多个脯氨酸残基处水解底物蛋白质或肽。
这种组合物以及第一酶组分和第二酶组分的优选方式进一步如上文和下文所述。
这种既具有谷氨酰胺特异性作用又具有脯氨酸特异性作用的酶的实例是如WO2022/266456中所描述的酶。第一酶组分的蛋白酶或内切蛋白酶也可以是如所述的在一个或多个谷氨酰胺残基处水解底物蛋白或肽的“前体”。
在第一优选实施方式中，第一酶组分包括一种或多种酶，其具有与如WO2022/266456中所描述的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和/或SEQ IDNO:16中的一个或多个具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列或其内切蛋白酶活性片段，例如成熟蛋白。WO2022/266456提供的这些酶的序列表通过引用并入本文。这些酶可以如WO2022/266456中所描述地产生。
在第二优选实施方式中，第一酶组分包括一种或多种酶，其具有与如WO2020/025704中所描述的SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8中的一个或多个具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列或其内切蛋白酶活性片段，例如成熟蛋白。WO2020/025704提供的这些酶的序列表通过引用并入本文。这些酶可以如WO2020/025704中所描述地产生。
优选的示例还包括描述于以下中的脯氨酸特异性蛋白酶：
-Miyazono等人2022年2月5日发表在Biochemical and Biophysical ResearchCommunications第591卷第76-81页的题为“Crystal structure and substraterecognition mechanism of the prolyl endoprotease PEP from Aspergillus niger”的文章；和
-在Edens等人发表于J.Agric.Food Chem.2005,53,7950-7957的题为“Extracellular Prolyl Endoprotease from Aspergillus niger and Its Use in theDebittering of Protein Hydrolysates”的文章中；和
-在Montserrat等人发表于Biochemical and Biophysical ResearchCommunications 591(2022)第76-81页的题为“Influence of dietary components onAspergillus niger prolyl endoprotease mediated gluten degradation”的文章中，
每个文献均通过引用并入本文。
优选地，组合物包含第一酶组分，其中该第一酶组分在等于或大于pH 1.0，更优选地等于或大于pH 1.2至等于或小于pH 6.0，更优选地至等于或小于pH 5.5，还更优选地至等于或小于pH 5.0，甚至更优选地至等于或小于pH 4.5，并且最优选地至等于或小于pH4.0的范围内的pH下具有其最佳活性。
因此，优选地，内切蛋白酶、优选地谷氨酰胺特异性和/或脯氨酸特异性内切蛋白酶的活性取决于pH。优选地，内切蛋白酶、谷氨酰胺特异性内切蛋白酶和/或脯氨酸特异性内切蛋白酶是具有酸性pH最适值(即pH最适值低于pH 7.0)的内切蛋白酶、谷氨酰胺特异性内切蛋白酶和/或脯氨酸特异性内切蛋白酶。更优选地，内切蛋白酶、谷氨酰胺特异性内切蛋白酶和/或脯氨酸特异性内切蛋白酶是在等于或大于pH 1.0，更优选地等于或大于pH1.2至等于或小于pH 6.0，更优选地至等于或小于pH 5.0，还更优选地至等于或小于pH4.0，甚至更优选地至等于或小于pH 3.0，并且最优选地至等于或小于pH2.5的范围内的pH下具有其最佳活性的内切蛋白酶、谷氨酰胺特异性内切蛋白酶和/或脯氨酸特异性内切蛋白酶。优选地，内切蛋白酶、优选地脯氨酸特异性内切蛋白酶是在pH 1.0至pH 5.0的范围内、甚至更优选地pH 1.2至pH 4.5的范围内的pH下具有其最佳活性的内切蛋白酶或脯氨酸特异性内切蛋白酶。
最优选地，内切蛋白酶、优选地谷氨酰胺特异性内切蛋白酶和/或脯氨酸特异性内切蛋白酶是内切蛋白酶，更优选地脯氨酰特异性内切蛋白酶，最优选地如EP-A-1326957、WO2005027953、WO2002046381或WO2022/266456中所述，其通过引用并入本文。
优选地，内切蛋白酶、优选地谷氨酰胺特异性内切蛋白酶和/或脯氨酸特异性内切蛋白酶、最优选地脯氨酰特异性内切蛋白酶选自以下组成的组：
(a)具有与上述SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5的氨基酸序列或其片段具有等于或大于40％、更优选等于或大于60％、还更优选等于或大于70％、甚至更优选等于或大于80％、还甚至更优选等于或大于90％、又甚至更优选等于或大于95％、最优选等于或大于99％氨基酸序列同一性的氨基酸序列的多肽，每个如WO2002046381中所描述；
(b)由与以下杂交的多核苷酸编码的多肽：
(i)SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6的核酸序列或其片段，其在60个、优选地在100个核苷酸上至少80％或90％相同，更优选在200个核苷酸上至少90％相同，每个如WO2002046381中所描述，或
(ii)与(i)的核酸序列互补的核酸序列。
在酶内的所谓活性位点是酶中负责与底物相互作用的那些部分。该相互作用可以例如包括在底物中反应的催化和/或结合。这种所谓的活性位点的形成和存在可以取决于酶的一级结构、二级结构和/或三级结构。活性位点的示例包括催化三联体和/或氧阴离子空穴。
优选地，内切蛋白酶、谷氨酰胺特异性内切蛋白酶和/或脯氨酸特异性内切蛋白酶是包含催化三联体和/或氧阴离子空穴的内切蛋白酶、谷氨酰胺特异性内切蛋白酶和/或脯氨酸特异性内切蛋白酶、最优选地脯氨酰特异性内切蛋白酶。更优选地，内切蛋白酶、谷氨酰胺特异性内切蛋白酶和/或脯氨酸特异性内切蛋白酶是包含催化三联体和氧阴离子空穴的内切蛋白酶、谷氨酰胺特异性内切蛋白酶和/或脯氨酸特异性内切蛋白酶。
优选地，催化三联体包含含有丝氨酸、组氨酸和天冬氨酸或由其组成的氨基酸序列。这种催化三联体在本文中也称为Ser/Asp/His催化三联体。在本发明的一个优选实施方式中，上述催化三联体中组氨酸氨基酸侧链的ND1或Nd1氮原子被质子化，并且组氨酸氨基酸侧链的NE2或Ne2氮原子(pKa 6.0)未被质子化。在本发明的另一个优选实施方式中，上述催化三联体中的组氨酸氨基酸被去质子化。去质子化的组氨酸在本文中优选地被理解为已经失去在其侧链NE2或Ne2氮原子上的质子(H+离子)的组氨酸氨基酸。
氧阴离子空穴可以理解为在催化期间稳定带负电荷的过渡态的某些水解酶的活性位点中发现的结构特征，例如在酯酶、脂肪酶和肽酶中。合适地，氧阴离子空穴可以稳定在去质子化的氧或醇盐上的过渡态负电荷。稳定该过渡态可以有利地降低反应所需的活化能，因此可以促进催化。水解酶中的氧阴离子空穴典型地由极性或碱性氨基酸侧链的氢键供体基团(如Tyr、Trp、Arg、Lys、Asn、Gln、Ser、Thr)构成或也通常由与带负电荷的过渡态的氧原子形成氢键的两种骨架酰胺构成。
然而，在根据本发明的组合物中，酶组分优选地包含含有氧阴离子空穴的内切蛋白酶、优选地脯氨酰特异性内切蛋白酶或由其组成，所述氧阴离子空穴包含酸性氨基酸的质子化侧链。更优选地，该氧阴离子空穴包含谷氨酸氨基酸，优选地处于其质子化状态的谷氨酸氨基酸(Glu-H)。
脯氨酸特异性蛋白酶优选地在微生物中产生或衍生自微生物，微生物优选地为细菌或真菌。脯氨酸特异性蛋白酶可以是天然存在的、重组的或化学修饰的脯氨酸特异性蛋白酶。脯氨酸特异性蛋白酶例如已在Aspergillus(EP 0 522 428)、Flavobacterium(EP 0967285)和Aeromonas(J.Biochem.113,790-796)、Xanthomonas和Bacteroides物种中鉴定。本发明的脯氨酸特异性蛋白酶可以分离自上文提到的微生物物种之一，特别是分离自曲霉属(Aspergillus)或者木霉属(Trichoderma)。优选地，脯氨酸特异性内切蛋白酶分离自黑曲霉或里氏木霉。更优选地，脯氨酸特异性内切蛋白酶分离自被工程化以过表达编码脯氨酸特异性内切蛋白酶的基因的黑曲霉或里氏木霉宿主。
其他宿主(例如大肠杆菌)也是可用的。例如，克隆和过度生产Flavobacterium衍生的脯氨酸特异性内切蛋白酶(尤其在大肠杆菌中)已经使得某些脯氨酸特异性内切蛋白酶可以以纯形式获得。在World Journal of Microbiology&Biotechnology第11卷第209-212页中提供了这种过量生产构建体的示例。
酶可以是对于宿主细胞来说天然的或异源的。在一个优选的实施方式中，酶可以是曲霉属物种天然的并且在这样的曲霉属物种中产生，优选地黑曲霉。在另一个优选的实施方式中，酶可以衍生自曲霉属物种，并且酶可以在另一宿主细胞(例如里氏木霉)中异源地产生。
优选的谷氨酰胺特异性内切蛋白酶和/或脯氨酰特异性内切蛋白酶包括衍生自黑曲霉、Aspergillus transmontanensis、Aspergillus homomorphus、Aspergilluspseudocaelatus、Aspergillus neoauricomus、Aspergillus albertensis、Aspergillusalbertensis、Aspergillus wentii、Aspergillus brasiliensis、Aspergillussclerotioniger、Aspergillus bertholletius、Aspergillus awamori、Aspergillustubegensis、Aspergillus accretis、Aspergillus foretidus、Aspergillus nidulans、Aspergillus japonica的谷氨酰胺特异性内切蛋白酶和/或脯氨酰特异性内切蛋白酶。其它包括Oryzae和Aspergillus ficuum以及里氏木霉、Fusarium graminearum、Penicilliumchrysogenum、Acremonium alabrames,Myserio Photora Thermophil(Thermophilum)。
优选地，本文中所描述的组合物是这样的组合物，其中第一酶组分衍生自微生物和/或由微生物产生，所述微生物优选地是细菌或真菌，最优选地里氏木霉。
本文特别优选的是衍生自曲霉属物种但在木霉属物种(优选地里氏木霉)中异源产生的谷氨酰胺特异性内切蛋白酶和/或脯氨酰特异性内切蛋白酶。
在另一优选实施方式中，黑曲霉宿主或黑曲霉或者里氏木霉宿主优选地用于利用A.niger启动子驱动编码A.niger脯氨酸特异性内切蛋白酶的基因表达来产生非重组自构建体。也就是说，优选地，内切蛋白酶、优选地脯氨酸特异性内切蛋白酶分别是非重组内切蛋白酶或非重组脯氨酸特异性内切蛋白酶。
第二酶组分
组合物进一步包含第二酶组分，第二酶组分包含纤维素分解酶、优选地纤维素酶，或由纤维素分解酶、优选地纤维素酶组成。
优选地，第二酶组分衍生自微生物和/或由微生物产生，所述微生物优选地是细菌或真菌，最优选地里氏木霉。
本文使用时，纤维素分解酶是能够部分地或完全地降解纤维素的酶。该酶促过程也称为纤维素分解。纤维素是包含β-1,4-连接的D-葡萄糖单体单元链的多糖。合适地，纤维素多糖可以包含等于或大于20个、更优选地等于或大于50个、还更优选地等于或大于100个、甚至更优选地等于或大于1000个至合适地等于或小于1000000个、优选地等于或小于100000个单体单元。纤维素中的β-1,4-连接键很难断裂，但可以被纤维素分解酶断裂。优选的纤维素分解酶是纤维素酶。
本文中使用时，纤维素酶是具有纤维素酶活性的任何多肽。纤维素酶可以适当地是能够水解纤维素中的β-1,4-D-糖苷连接键的任何酶。这种水解有利地允许纤维素的部分或完全降解。能够降解纤维素的多肽是能够催化将纤维素分解成更小单元(例如部分地分解成纤维糊精，或完全地分解成葡萄糖单体)的过程的多肽。根据本发明的纤维素酶可以产生纤维糊精和葡萄糖单体的混合群体。这种降解典型地通过水解反应发生。
术语“具有纤维素酶活性的多肽”、“纤维素酵素”或简称“纤维素酶”在本文中可互换使用。如上文所指，有利地，这样的纤维素酶可以水解纤维素中的β-1,4-D-糖苷连接键，从而部分地或完全地降解纤维素。纤维素酶可以是“外切纤维素酶”、“内切纤维素酶”或“纤维二糖酶”。优选地，纤维素酶是“内切纤维素酶”或“纤维二糖酶”，最优选地纤维素酶是“内切纤维素酶”。
组合物可以包含一种、两种、三种、四种、五种、六种或更多种(类型的)纤维素酶。组合物可以包含任何纤维素酶，例如裂解多糖单加氧酶(例如GH61)、纤维二糖水解酶、内切-β-1,4-葡聚糖酶、β-葡糖苷酶或β-(1,3)(1,4)-葡聚糖酶。
本文中使用时，纤维二糖水解酶(EC 3.2.1.91)是能够催化纤维素或纤维四糖中的1,4-β-D-葡萄糖苷连接键的水解，从而从链末端释放纤维二糖的任何多肽。这种酶也可以称为纤维素酶1,4-β-纤维二糖苷酶、1,4-β-纤维二糖水解酶、1,4-β-D-葡聚糖纤维二糖水解酶、微晶纤维素酶(avicelase)、外切-1,4-β-D-葡聚糖酶、外切纤维二糖水解酶或外切葡聚糖酶。优选地，纤维素酶是包含一种或多种葡聚糖酶、更优选一种或多种β-葡聚糖酶的纤维素酶的混合物。
本文中使用时，内切-β-1,4-葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)是优选的，并且是能够催化纤维素、地衣素或谷物β-D-葡聚糖中的1,4-β-D-糖苷连接键的内切水解的任何多肽。这种多肽也可以能够水解还含有1,3-连接键的β-D-葡聚糖中的1,4-连接键。这种酶也可以称为纤维素酶、微晶纤维素酶、β-1,4-内切葡聚糖水解酶、β-1,4-葡聚糖酶、羧甲基纤维素酶、纤维素糊精酶、内切-1,4-β-D-葡聚糖酶、内切-1,4-β-D-葡聚糖水解酶、内切-1,4-β-葡聚糖酶或内切葡聚糖酶。
本文中使用时，β-葡糖苷酶(EC 3.2.1.21)也是优选的，并且是能够催化末端非还原性β-D-葡萄糖残基水解并释放β-D-葡萄糖的任何多肽。这种多肽可以对β-D-葡糖苷具有广泛的特异性，并且还可以水解下列中的一种或多种：β-D-半乳糖苷、α-L-阿拉伯糖苷、β-D-木糖苷或β-D-岩藻糖苷。这种酶也可以称为苦杏仁酶(amygdalase)、β-D-葡糖苷葡糖水解酶、纤维二糖酶或龙胆二糖酶(gentobiase)。
本文中使用时，β-(1,3)(1,4)-葡聚糖酶(EC 3.2.1.73)也是优选的，并且是能够催化含有1,3-和1,4-键的β-D-葡聚糖中的1,4-β-D-糖苷连接键的水解的任何多肽。此类多肽可以作用于地衣素和谷物β-D-葡聚糖，但不作用于仅含有1,3-或1,4-键的β-D-葡聚糖。这种酶也可以称为地衣聚糖酶(licheninase)、1,3-1,4-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶、β-葡聚糖酶、内切-β-1,3-1,4葡聚糖酶、地衣多糖酶(lichenase)或混合连接键β-葡聚糖酶。这种类型的酶的一种替代物是EC 3.2.1.6，其被描述为内切-1,3(4)-β-葡聚糖酶。当其还原基团包含在待水解的连接键中的葡萄糖残基本身在C-3处被取代时，这种类型的酶水解β-D-葡聚糖中的1,3-或1,4-连接键。替代性的名称包括内切-1,3-β-葡聚糖酶、昆布多糖酶(laminarinase)、1,3-(1,3；1,4)-β-D-葡聚糖3(4)葡聚糖水解酶。底物包括昆布多糖、地衣多糖和谷物β-D-葡聚糖。β-(1,3)(1,4)-葡聚糖酶(EC 3.2.1.73)或内切-1,3(4)-β-葡聚糖酶[EC 3.2.1.6]作为第二酶组分是优选的。
鉴于上述，第二酶组分优选地包含葡聚糖酶或由其组成，所述葡聚糖酶更优选地是β-葡聚糖酶(也称为“beta-葡聚糖酶”)，最优选地是衍生自里氏木霉的β-葡聚糖酶。
合适的纤维素酶可以来源于(或衍生自)植物、动物或微生物。优选地，纤维素酶来源于微生物，例如真菌或细菌。优选的纤维素酶是来源于细菌或真菌的那些。最优选的是里氏木霉衍生的纤维素酶。
换言之，优选地，第二酶组分、优选地纤维素酶、更优选地β-葡聚糖酶衍生自微生物和/或由微生物产生，所述微生物优选地是真菌，最优选地里氏木霉。
优选地，纤维素酶的活性取决于pH。
优选地，组合物包含第二酶组分，其中该第二酶组分在等于或大于pH 1.0，更优选地等于或大于pH 1.2至等于或小于pH 6.0，更优选地至等于或小于pH 5.5，还更优选地至等于或小于pH 5.0，甚至更优选地至等于或小于pH 4.5，并且最优选地至等于或小于pH4.0的范围内的pH下具有其最佳活性。
因此，优选地，纤维素酶是具有酸性pH最适值(即低于pH 7.0的pH最适值)的纤维素酶。更优选地，纤维素酶是在等于或大于pH 1.0，更优选地等于或大于pH 1.2至等于或小于pH 6.0，更优选地至等于或小于pH 5.0，还更优选地至等于或小于pH 4.0，甚至更优选地至等于或小于pH 3.0，并且最优选地至等于或小于pH 2.5的范围内的pH下具有其最佳活性的纤维素酶。优选地，纤维素酶是在pH 1.0至pH 5.0的范围中、甚至更优选地pH 1.2至pH4.5的范围中的pH下具有其最佳活性的纤维素酶。
纤维素分解酶(优选地纤维素酶)优选地在微生物中产生或衍生自微生物，微生物优选地为细菌或真菌。纤维素分解酶、优选地纤维素酶可以是天然存在的、重组的或化学修饰的纤维素分解酶或纤维素酶。合适的纤维素酶的示例包括在genera Bacillus、Pseudomonas、Streptomyces、Trichoderma、Humicola、Fusarium、Thielavia和Acremonium中产生或从中衍生的纤维素酶，以及在Humicola insolens、Myceliophthora thermophila或Fusarium oxysporum中产生或从中衍生的纤维素酶。优选的是在木霉属中产生或衍生自木霉属的纤维素酶。
纤维素分解酶或纤维素酶可以在异源表达系统(例如微生物或真菌异源表达系统)中重组产生。合适的异源表达系统的示例包括细菌(例如大肠杆菌、芽孢杆菌属)和真核系统。真核系统可以采用酵母(例如Pichia sp.、Saccharomyces sp.)或真菌(例如Trichoderma sp.，例如T.reesei、Aspergillus物种，诸如A.niger)表达系统。在这些真菌表达系统中，特别优选的是里氏木霉。例如，纤维素酶可以方便地生产，例如美国专利号4435307、5776757和7604974中所描述，其通过引用并入本文。
纤维素酶的合适示例描述于美国专利号4435307、5648263、5691178、5776757、6562612和7604974中，并通过引用并入本文。
优选的纤维素酶是美国专利4689297、5814501、5324649和国际专利申请公开号WO92/06221和WO 92/0616中所公开的纤维素酶，其也通过引用并入本文。
可用于本发明的示例性商业纤维素酶包括和(Novozymes A/S)；和
HA(杜邦工业生物科学公司)，(IFF Bioscience)和(花王公司)。
酶组合物
优选地，根据本发明的组合物是包含以下物质或由以下物质组成的组合物：
-第一酶组分，其包含脯氨酰特异性蛋白酶、优选地脯氨酰特异性内切蛋白酶，或由脯氨酰特异性蛋白酶、优选地脯氨酰特异性内切蛋白酶组成；以及
-第二酶组分，其包含纤维素分解酶、优选地纤维素酶，或由纤维素分解酶、优选地纤维素酶组成，
其中纤维素分解酶(优选地纤维素酶)摩尔数与脯氨酰特异性蛋白酶(优选地脯氨酰特异性内切蛋白酶)摩尔数的摩尔比等于或小于1:1，更优选等于或小于0.5:1，甚至更优选等于或小于0.1:1，还更优选等于或小于0.05:1，最优选等于或小于0.01:1。
最优选地，根据本发明的组合物是包含以下物质或由以下物质组成的组合物：
-第一酶组分，其包含脯氨酰特异性蛋白酶、优选地脯氨酰特异性内切蛋白酶，或由脯氨酰特异性蛋白酶、优选地脯氨酰特异性内切蛋白酶组成；以及
-第二酶组分，其包含纤维素分解酶、优选地纤维素酶，或由纤维素分解酶、优选地纤维素酶组成，
其中第一酶组分(优选地脯氨酰特异性蛋白酶、优选地脯氨酰特异性内切蛋白酶)的重量与第二酶组分(优选地纤维素酶、更优选地β-葡聚糖酶)的重量的重量比为：
-等于或大于0.1:1，更优选地等于或大于0.5:1，更优选地等于或大于1:1，甚至更优选地等于或大于2:1，还更优选地等于或大于3:1；和/或
-等于或小于1000:1，更优选地等于或小于100:1，甚至更优选地等于或小于50:1，还更优选地等于或小于20:1。
在一个特别优选的实施方式中，第一酶组分(优选地脯氨酰特异性蛋白酶、优选地脯氨酰特异性内切蛋白酶)的重量与第二酶组分(优选地纤维素酶、更优选地β-葡聚糖酶)的重量的重量比为约4:1。
优选地，基于脯氨酰特异性蛋白酶(优选地脯氨酰特异性内切蛋白酶)的总重量，纤维素分解酶(优选地纤维素酶)的存在量等于或大于0.001％w/w，更优选等于或大于0.005％w/w，还更优选等于或大于0.01％w/w，最优选等于或大于0.05％w/w。
优选地，基于脯氨酰特异性蛋白酶(优选地脯氨酰特异性内切蛋白酶)的总重量，纤维素分解酶(优选地纤维素酶)的存在量等于或小于100％w/w，更优选等于或小于50％w/w，还更优选等于或小于10％/w，最优选等于或小于5％/w。考虑到在浑浊方面多糖和其它组分的存在差异，这些比例是有利的。
根据本发明的组合物优选地是这样的组合物，其中第一酶组分和第二酶组分衍生自相同的微生物或由相同的微生物产生，所述相同的微生物是优选地相同的细菌或真菌，最优选地相同的里氏木霉。
优选地，酶组合物是液体组合物。优选地，酶组合物还包含溶剂。
优选地，溶剂包含水或由水组成。除了水之外，可以存在或不存在一种或多种共溶剂。优选地，组合物包含水和任选的一种或多种共溶剂。如果存在共溶剂，则溶剂可以包含水和一种或多种共溶剂。优选的共溶剂包括三丙二醇甲醚、二丙二醇甲醚、丙二醇甲醚、二乙二醇丁醚、二丙二醇、亚甲基二醇、1,2-丙二醇、N-乙基-2-吡咯二酮、异丙醇、乙醇、乳酸乙酯、1,3-丙二醇和/或其任意组合。
溶剂可以包含或可以不包含甘油。优选地，基于溶剂的总体积，溶剂包含小于50％v/v，更优选小于40％v/v，还更优选小于30％v/v，甚至更优选小于20％v/v，并且最优选小于10％v/v的甘油。最优选地，溶剂不包含甘油。最近，甘油经历了很大的价格波动，因此不太受欢迎。如本文所描述的溶液稳定剂和/或渗透剂的使用有利地允许减少溶剂中甘油的量，同时仍然获得良好的稳定性和/或活性和/或避免沉淀。
优选地，组合物具有等于或大于pH 1.0，更优选地等于或大于pH 1.2至等于或小于pH 6.0，更优选地至等于或小于pH 5.5，还更优选地至等于或小于pH 5.0，甚至更优选地至等于或小于pH 4.5，并且最优选地至等于或小于pH 4.0的范围内的pH值。
更优选地，组合物是具有在等于或大于pH 1.0，更优选地等于或大于pH 1.2至等于或小于pH 6.0，更优选地至等于或小于pH 5.0，还更优选地至等于或小于pH 4.0，甚至更优选地至等于或小于pH 3.0，并且最优选地至等于或小于pH 2.5的范围内的pH的液体组合物。更优选地，组合物是具有在pH 1.0至pH 5.0的范围内、甚至更优选地pH 1.2至pH 4.5的范围内的pH的液体组合物。
在一个替代实施方式中，酶组合物可以以冷冻或冻干形式提供，并且在施用前通过在预处理期间添加如上文所描述的溶剂来重构。
此外，酶组合物可以包含一种或多种额外的组分，优选地选自以下组成的组的额外的组分：
-盐，优选地选自氯化钠、氯化钾和硫酸铵组成的组；
-羧酸，优选地具有在等于或大于1至等于或小于10个范围内的碳原子，优选地在等于或大于1至等于或小于7个范围内的碳原子，和/或其任何酯和/或任何盐，更优选地甲酸、乙酸、二乙酸、抗坏血酸、乳酸、柠檬酸、丙酸、草酸、苹果酸和/或富马酸和/或其任何酯和/或其任何盐；
-单乙酸甘油酯、二乙酸甘油酯、三乙酸甘油酯、单丙酸甘油酯、二丙酸甘油酯、三丙酸甘油酯、单丁酸甘油酯、二丁酸甘油酯、三丁酸甘油酯、单乳酸甘油酯、二乳酸甘油酯、三乳酸甘油酯；
-单糖、二糖和/或此类单糖或二糖的醇衍生物或氯化物衍生物；
-山梨糖醇、甘露醇、肌醇、海藻糖、蔗糖、甘露糖和/或三氯蔗糖真菌，最优选地山梨糖醇；
-麦芽糖糊精、木聚糖、甘露聚糖、岩藻多糖、半乳甘露聚糖、壳聚糖、棉子糖、水苏糖、果胶、菊粉、果聚糖、禾草苷(graminan)、支链淀粉及其混合物。
如上文所指出，组合物可以包含或可以不包含甘油。
此外，组合物可以包含或可以不包含苯甲酸或其衍生物。
除了内切蛋白酶之外，组合物还可以包含或可以不包含一种或多种额外的酶，例如乙酰乳酸脱羧酶(ALDC)、氨肽酶或海藻糖酶、葡糖淀粉酶、木聚糖酶、产麦芽糖α-淀粉酶、支链淀粉酶、过氧化氢酶或转葡糖苷酶。在一个优选的实施方式中，组合物包含一种或多种额外的酶，优选地乙酰乳酸脱羧酶(ALDC)、葡糖淀粉酶和/或木聚糖酶。在一个更优选的实施方式中，组合物包含第一酶组分、第二酶组分和木聚糖酶或由其组成。在第二更优选的实施方式中，组合物包含第一酶组分、第二酶组分和乙酰乳酸脱羧酸酶(ALDC)或由其组成。在第三更优选的实施方式中，组合物包含第一酶组分、第二酶组分和葡糖淀粉酶或由其组成。
其它实施方式
本发明还提供细菌或真菌菌株，优选地里氏木霉菌株，其功能性地表达：
-编码第一酶组分的第一核酸序列，所述第一酶组分包含脯氨酰特异性蛋白酶、优选地脯氨酰特异性内切蛋白酶，或由脯氨酰特异性蛋白酶、优选地脯氨酰特异性内切蛋白酶组成；以及
-编码第二酶组分的第二核酸序列，所述第二酶组分包含纤维素分解酶、优选地纤维素酶，或由纤维素分解酶、优选地纤维素酶组成。
在这样的细菌或真菌菌株中，优选地里氏木霉菌株，优选地第一核酸序列：
-可操作地连接至启动子；或者
-以2、3、4、5、6个或更多个拷贝存在。
因此，本发明还提供细菌或真菌菌株，优选地里氏木霉菌株，其功能性地表达：
-编码第一酶组分的第一核酸序列，所述第一酶组分包含脯氨酰特异性蛋白酶、优选地脯氨酰特异性内切蛋白酶，或由脯氨酰特异性蛋白酶、优选地脯氨酰特异性内切蛋白酶组成；以及
-编码第二酶组分的第二核酸序列，所述第二酶组分包含纤维素分解酶、优选地纤维素酶，或由纤维素分解酶、优选地纤维素酶组成，
其中所述第一核酸序列：
-可操作地连接至启动子；或者
-以2、3、4、5、6个或更多个拷贝存在。
本发明还提供细菌或真菌菌株，优选地里氏木霉菌株，其功能性地表达：
-编码重组第一酶组分的第一核酸序列，所述重组第一酶组分包含脯氨酰特异性蛋白酶、优选地脯氨酰特异性内切蛋白酶，或由脯氨酰特异性蛋白酶、优选地脯氨酰特异性内切蛋白酶组成；以及
-编码天然存在的第二酶组分的第二核酸序列，所述天然存在的第二酶组分包含纤维素分解酶、优选地纤维素酶，或由纤维素分解酶、优选地纤维素酶组成。
在这样的细菌或真菌菌株中，优选地里氏木霉菌株，优选地第一核酸序列：
-可操作地连接至启动子；或者
-以2、3、4、5、6个或更多个拷贝存在。
上述可以有利地导致细菌或真菌菌株(优选地里氏木霉菌株)以高于第二酶组分的量产生第一酶组分。
优选地，第一核酸序列是异源核酸序列，并且第一酶组分是异源表达的。优选地，第二核酸序列是内源性核酸序列，并且第二酶组分是内源性表达的。
方法
本发明还提供了制备酒精饮料、优选地啤酒的方法，包括使用上述新的酶组合物。
本发明还提供了一种用于生产供人消费的酒精饮料的方法，其包括添加根据本发明的组合物或添加根据本发明的细菌菌株。优选地，这种方法是同时糖化和发酵方法(“SSF”)。
更优选地，提供了用于生产供人消费的酒精饮料的方法，其包括添加如上文所描述的组合物或添加如上文所描述的细菌或真菌菌株、优选地里氏木霉菌株。
世界上使用了各种各样的啤酒酿造方法。然而，每个啤酒酿造方法典型地包括糖化和发酵。在糖化过程中，原料(例如淀粉)可以转化为糖类。在发酵过程中，此类糖类可以转化为乙醇(酒精)。根据糖化的效率，根据本发明，可能有益的是在发酵期间存在第二酶组分，优选地纤维素酶。因此，本发明还提供了啤酒酿造方法，其包括添加根据本发明的组合物或添加根据本发明的细菌菌株，优选地在糖化或发酵步骤期间添加。
最优选地，该方法是啤酒酿造方法，其中在发酵之前或发酵期间、更优选地在发酵之前，添加根据本发明的组合物，最优选地添加到麦芽汁中。
在一个尤其优选的实施方式中，这种啤酒酿造方法是同时糖化和发酵方法(“SSF”)。最优选地，在同时糖化和发酵期间，在这样的方法中加入组合物。
因此，根据本发明的组合物优选地是可以添加到用于生产供人消费的酒精饮料的方法中的组合物，更优选地是可以添加到啤酒酿造方法中的组合物，该组合物包含以下物质或由以下物质组成：
-第一酶组分，其包含以下物质或由以下物质组成：谷氨酰胺特异性蛋白酶和/或脯氨酰特异性蛋白酶，优选地谷氨酰胺特异性内切蛋白酶和/或脯氨酰特异性内切蛋白酶；以及
-第二酶组分，其包含纤维素分解酶、优选地纤维素酶，或由纤维素分解酶、优选地纤维素酶组成。
优选地，第一酶组分以等于或大于0.05克/百升(gr/hl)、更优选等于或大于0.1gr/hl、还更优选等于或大于0.5gr/hl且最优选等于或大于1.0gr/hl和/或优选地等于或小于100gr/hl、更优选地等于或小于50gr/hl、最优选地等于或小于10gr/hl的剂量添加到如本文所描述的方法中。优选地，在啤酒酿造过程中，在发酵之前或发酵期间，优选地在发酵之前，将第一酶组分添加到麦芽汁中。
优选地，第二酶组分以等于或大于0.001克/百升(gr/hl)、更优选等于或大于0.01gr/hl、还更优选等于或大于0.05gr/hl且最优选等于或大于0.1gr/hl和/或优选地等于或小于50gr/hl、更优选地等于或小于10gr/hl、甚至更优选地等于或小于5gr/hl、最优选地等于或小于1gr/hl的剂量添加到如本文所描述的方法中。
最优选地，第一酶组分和第二酶组分以这样的重量比添加，其中第一酶组分(优选地脯氨酰特异性蛋白酶、优选地脯氨酰特异性内切蛋白酶)的重量与第二酶组分(优选地纤维素酶、更优选地β-葡聚糖酶)的重量的重量比为：
-等于或大于0.1:1，更优选地等于或大于0.5:1，更优选地等于或大于1:1，甚至更优选地等于或大于2:1，还更优选地等于或大于3:1；和/或
-等于或小于1000:1，更优选地等于或小于100:1，甚至更优选地等于或小于50:1，还更优选地等于或小于20:1。
以这种重量比添加第一酶组分和第二酶组分在用于生产供人消费的酒精饮料的方法中，更优选在啤酒酿造方法中是特别有利的。最优选地，第一酶组分和第二酶组分在发酵之前或发酵期间以这样的比例添加，例如添加到麦芽汁中。
在用于生产供人消费的酒精饮料的方法、特别是啤酒酿造方法中，添加所述酶组合物可以通过增加具有甜味并增强果味风味的单糖、二糖和三糖的量来正面地影响所生产的饮料(例如啤酒)的味道。因此，优选的是，在用于生产供人消费的酒精饮料的方法、特别是啤酒酿造方法中添加酶组合物，增加所生产的酒精饮料(例如啤酒)中的单糖、二糖和/或三糖的量。
如实验部分所示，在用于生产供人消费的酒精饮料的方法、特别是啤酒酿造方法中添加酶组合物，特别是包含脯氨酰特异性内切蛋白酶和来自里氏木霉的纤维素酶二者的组合物，可以进一步改善细颗粒物质的去除。在啤酒发酵期间添加组合了脯氨酰内切蛋白酶和纤维素酶的组合物可以减少啤酒过滤期间膜的结垢，并且过滤可以有利地在增加的压力和速度下操作，从而获得经济优势。
酒精饮料
本发明还提供了通过这种方法获得或能够获得的供人消费的酒精饮料。
更优选地，本发明提供一种酒精饮料，其包含(优选地至少部分地失活的)：
-谷氨酰胺特异性蛋白酶和/或脯氨酸特异性蛋白酶，优选地谷氨酰胺特异性内切蛋白酶和/或脯氨酸特异性内切蛋白酶，优选地如上文所描述；和
-纤维素酶，优选地如上文所描述。
实施例
材料和方法
材料
在实施例中，使用以下材料：
-Brewers Clarex是DSM Food Specialties的产品，并且含有源自选定的自克隆黑曲霉菌株的脯氨酰特异性内切蛋白酶。
-Brewers Clarex XF是DSM Food Specialties的产品，并且含有源自选定的自克隆黑曲霉菌株的脯氨酰特异性内切蛋白酶。
-Filtrase NL-Fast是DSM Food Specialties的产品，并且含有衍生自选定的Talaromyces emersonii菌株的真菌纤维素酶，更具体地是内切-1,3(4)-β-葡聚糖酶(β-葡聚糖酶)。
-Laminex BG3是IFF的产物，并且含有来自里氏木霉的真菌纤维素酶(β-葡聚糖酶)。
-Filtrase Br-XL是DSM Food Specialties的产品，并且含有衍生自选定的Talaromyces emersonii菌株的真菌纤维素酶，更具体地是内切-1,3(4)-β-葡聚糖酶(β-葡聚糖酶)和衍生自选定的Disporotrichum dimorphosporum菌株的半纤维素，更具体地是内切-1,4-β-木聚糖酶(木聚糖酶)。
-Glucanex 100G是Novozymes的产品，并且含有来自Trichoderma harzianum的真菌纤维素酶，更具体地是β-葡聚糖酶。
-Saflager S023：来自Lasaffre(Fermentis)的底部发酵干酵母(Saccharomycespastorianus)，其适合于直接投种(pitching)。
-喜力(Heineken)拉格(lager)啤酒：由喜力生产的5％ ABV拉格啤酒
-麦芽：EBC第21届EBC(欧洲酿酒大会)标准麦芽。
-大麦：IFBM(法国啤酒和麦芽饮料研究所)2RsBarley-rgt planet crop 2020。
分析方法
过滤
成熟后，将样品在11,600g(Sorvall RC6 Plus，转子F10S-6*500Y)和4℃下离心10分钟。倒出上清液并在室温下通过磁力搅拌脱气1小时。通过添加类似脱气的喜力拉格啤酒来将回收的啤酒按重量稀释五倍。在过滤之前，将稀释的样品和EDF-14-2Seitz过滤系统的不锈钢过滤室在冰水中冷却。
根据制造商的说明书，通过将过滤器外壳夹紧到底板来组装过滤器系统，底板由在内部处的穿孔盘和在外部处固定到三脚架的连接器(3/8英寸连接器-球阀-3/8英寸连接器和公鲁尔锁(Z514691-1EA，来自sigma)、不锈钢并缠有特氟龙)组成。将250mL体积的冷却样品倒入预冷却的过滤器室中。打开球阀以允许约10克样品通过重力流动穿过，之后关闭开关以确保连接器出口完全填充而没有任何气泡。将过滤器(Acrodisc PES 0.45μm 25mm，PN 4508；Pall Corporation)连接到一次性塑料注射器上，用5±1ml脱气的喜力拉格啤酒反冲洗。在将过滤器从注射器上拧下来的过程中，用剩余的啤酒缓慢冲洗过滤器，以防止过滤器和连接中的空气(气泡)。将过滤器连接到过滤单元出口处的公鲁尔锁。按照制造商的说明书将过滤系统的顶板夹紧到过滤器外壳上。关闭顶板处的排气阀，并且将过滤系统连接到压力阀，之后施加1巴的压强。在过滤系统下方放置精确度为0.1g的天平。将烧杯放在天平上。从重量0开始自动重量记录。此后，在自动记录的精确时间点打开阀，使得立即记录重量。每10秒记录一次重量，总共6-7分钟。
以任意单位(U)转移的滤液重量用于确定结垢。0.45μm过滤器的结垢(以小时-1*巴-1表示)是以M(百万)U/(m2*hr*bar)表示的通量相对于过滤器负载(单位为MU/m2)的应用线性关系(应用完全阻塞作为过滤模型)的所获得的斜率的倒数。
比重、柏拉图度(Plato)、ABV和ADF的测定
成熟后的麦芽汁和发酵样品的比重(SG)和酒精含量(酒精体积)使用数字密度计(Anton Paar；DMA58型)使用供应商说明书来进行测定。在20℃下测量比重。
根据表观发酵度(ADF)＝(原始提取物-表观提取物)/原始提取物*100，来计算表观发酵度(ADF)。
以柏拉图度(°P)表示的原始提取物通过下式计算：提取物＝-460,234+662,649x(SG)-202,414x(SG)2，其中SG是麦芽汁的比重(EBC方法8.3麦芽汁提取物-2004)。
以柏拉图度(°P)表示的表观提取物通过下式计算：提取物＝-460,234+662,649x(SG)-202,414x(SG)2，其中SG是发酵和成熟后样品的比重(EBC方法9.4啤酒的原始、真实和表观提取物和原始重力-2004)。
可发酵糖的分析
成熟后的发酵样品的分析在来自Thermo Fisher Scientific(Dionex)的联接了脉冲安培检测(HPAEC-PAD)的高效阴离子交换色谱系统上在CarboPac PA20柱上进行，该CarboPac PA20柱具有氨基捕集保护柱和硼酸盐捕集预柱。流动相是由3种溶液组成的梯度。用该系统分析可发酵糖的梯度设置如下表1所描绘。
表1：糖分析的梯度设置：
时间[分钟] ％A ％C ％D 曲线
-15 80 20 0 5
0 80 20 0 5
30 64 16 20 5
31 0 0 100 5
36 0 0 100 5
37 80 20 0 5
流动相A：MilliQ纯净水
流动相C：500mM NaOH
流动相D：100mM NaOH/1M NaOAc
使用参比葡萄糖、麦芽糖和麦芽三糖的校准曲线来定量样品中存在的可发酵糖(葡萄糖、麦芽糖和麦芽三糖)的峰面积。
啤酒浊度(浑浊)分析
用Haffman的VOS Rota 90/25双角浊度计测量成熟后的发酵样品的浑浊度。该装置测量由颗粒引起的散射光。小于1μm的颗粒主要引起散射光，并且是在90°角下测量的。大于1μm的颗粒主要引起前向散射光，并且是在25°角下测量的。在由所用装置的制造商在提供的比色皿中进行测量(EBC方法9.29啤酒中的浑浊度：浑浊度计的校准-2015)。
葡聚糖的分析
与纤维素酶(葡聚糖酶)反应后获得的产物是葡聚糖。根据制造商的说明书(方案06.04.2017)，通过来自R-Biopharm AG的Enzytec Color GlucaTest(EBC 4.16.3，MEBAK3.1.4.9.2)来测定成熟后麦芽汁和发酵样品中的葡聚糖水平。自2005年以来，该方法被接受并推荐纳入“分析-EBC”。
实施例1：脯氨酰内切蛋白酶和纤维素酶的组合在啤酒发酵过程中的用途
对于该实施例，用80克谷物进行淀粉糖化，该谷物由60重量％盘磨麦芽(EBC 21stEBC标准麦芽)和40重量％锤磨大麦(IFBM 2RSBarley-rgt planet crop 2020)组成，向其中加入200克自来水并混合。
将悬浮液放入在来自Lochner的LB Electronic中在48℃下预热的转化容器中。加入1mL体积的氯化钙(0.61M的液体储备液)，并在100rpm下混合的同时使用80％乳酸将pH校正至pH 5.4。此后，如表2所示，在LB Electronic中应用淀粉糖化曲线。同时，通过进行碘测试(Lugal溶液；来自Sigma的32922，根据Lugol)来检查糖化的完成。在淀粉糖化结束时，通过碘测试没有检测到淀粉。
表2：由60重量％麦芽和40重量％大麦组成的谷物的应用淀粉糖化曲线
在完成醪液方案后，用热自来水将醪液悬浮液的重量调节至450克。将悬浮液搅拌并倒入置于500mL Scott烧瓶上的玻璃漏斗中的折叠式过滤器(Macherey-Nagel；MN 614320mm Ref 527032)上，用于收集滤液。当折叠式过滤器中的过滤床因重力而变干时，停止过滤。收集第一个100mL滤液并将其进料回到过滤床的顶部。将全部收集的滤液(麦芽汁)冷却至室温。
所得麦芽汁溶液的重力为14.6°P，比重为1.059582g/cm3，并且可发酵糖含量为95.8g/L。
经由16个单独的麦芽汁产生的总麦芽汁在Scott烧瓶中分成300克的部分。将麦芽汁冷却至14℃，之后以100g/hl剂量加入酵母(Saflager S23，Fermentis)，并根据表3施用酶。此后，使用ANKOM气体发酵系统在14℃和100rpm下进行发酵8天。在发酵期间，使用ANKOMRF气体生产系统(Ankom Technology)记录累积压强和温度。
表3：商业酶相对于冷麦芽汁的剂量
在发酵结束时，通过在0℃下冷藏3天来进行啤酒成熟。成熟后，将样品在11,600g和4℃下离心10分钟以除去酵母。倒出上清液并在室温下通过磁力搅拌脱气1小时。将该澄清啤酒用于组成分析和物理分析。
结果
味道的改善
为了说明味道的改善，进行了组成分析。
所有样品的表观发酵度(ADF)在78-82％之间变化，并且酒精含量在6.20-6.45％之间变化。最终啤酒中可发酵糖的存在描述于表4中。
表4：样品中存在葡萄糖、麦芽糖和麦芽三糖。总可发酵糖是这些的总和。
葡萄糖 麦芽糖 麦芽三糖 可发酵糖
[g/l] [g/l] [g/l] [g/l]
实验1A 0.16 4.43 1.84 6.42
实验1B 0.24 6.18 2.51 8.92
实验1C 0.23 5.98 2.32 8.53
实验1D 0.16 4.70 1.95 6.81
对照1 0.15 4.32 1.85 6.32
实验2A 0.17 4.87 2.00 7.04
实验2B 0.22 5.29 2.09 7.60
实验2C 0.20 4.00 1.59 5.79
实验2D 0.15 3.96 1.58 5.69
对照2 0.14 3.75 1.62 5.51
对照0 0.15 4.27 1.68 6.10
最终啤酒的糖组成可以对味觉产生影响。单糖、二糖和三糖具有甜味，并且已知增强水果风味。因此，预期最终啤酒中可发酵糖存在的增加(如在用脯氨酰内切蛋白酶和纤维素酶处理的实验1B和2B中可以检测到的)将有利地影响啤酒的风味。
此外，可以在对照样品“0”、“1”和“2”中的每一个中清楚地检测到葡聚糖，其量范围为20至35mg/L。葡聚糖对于过滤可能是有问题的，并且可以在最终啤酒中产生浑浊/沉淀。
然而，在所有含有纤维素酶活性的实验样品中，葡聚糖均低于检测限。这表明所有纤维素酶在啤酒发酵期间都具有活性，以进一步将葡聚糖分解成葡萄糖。葡萄糖比葡聚糖更甜，并且还可以增强果味，如上文所解释。因此可以得出结论，在实验1A、1B、1C、1D和2A、2B、2C和2D的发酵期间，除了脯氨酰内切蛋白酶活性之外，还存在纤维素酶活性。这些的组合导致改善了葡聚糖分解为所期望的葡萄糖，以及改善的味道。
细颗粒物去除的改进
为了说明细颗粒物去除的改进，进行了物理分析。
为了测试酶处理对发酵中可能存在的细颗粒物质的影响并监测这种物质的去除速度，测试了成熟后发酵结束时的浑浊度和澄清啤酒的可过滤性。
a)测试细颗粒物的存在
在成熟后发酵结束时测量的浑浊度示于表5中。
表5：以90°或25°角测量的浑浊形成
H90 H25
实验1A 4.69 5.48
实验1B 8.18 13.34
实验1C 6.15 9.97
实验1D 4.30 5.31
对照1 5.29 6.81
实验2A 3.97 5.42
实验2B 5.46 7.94
实验2C 3.25 4.27
实验2D 3.16 2.86
对照2 4.52 4.86
对照0 超出范围 超出范围
该实验表明，添加脯氨酰内切蛋白酶对减少发酵结束时啤酒中的浑浊具有显著效果。在没有添加脯氨酰内切蛋白酶的对照0中，浑浊形成过高并且超出测量仪器的范围。而添加了脯氨酰内切蛋白酶的所有样品中的浑浊均可以在范围内测量。脯氨酰内切蛋白酶与纤维素酶的组合在一些情况下显示出浑浊的轻微增加或轻微进一步降低，这取决于纤维素酶的来源。然而，对于最终瓶装啤酒中的浑浊形成来说，在发酵结束时的任何浑浊形成可能不是显著的。这里的一个重要步骤是在过滤步骤中去除细颗粒物质，这是重要的。
也就是说，上述结果表明，在成熟后的发酵结束时，可能存在细颗粒物质，并且希望将其去除。
b)过滤
在常规啤酒生产中，在发酵和熟化之后通过过滤步骤除去细颗粒物质。为了测试酶处理对啤酒过滤的容量和通量的影响，首先用商业脱气的喜力拉格啤酒将样品稀释5倍。由于过滤器堵塞的时间增加，这种稀释允许更准确的评估。在过滤之前，将稀释的样品和EDF-14-2Seitz过滤系统的不锈钢过滤室在冰水中冷却。
及时跟踪滤液的量，并且结果如图1所示。所有含有纤维素酶与脯氨酰内切蛋白酶组合的样品在过滤器堵塞之前显示出滤液产率的改善。与未用纤维素酶处理的3个对照样品相比，过滤速度也得到改善。
根据数据计算结垢率，并描绘于表6中。显然，在啤酒发酵期间脯氨酰内切蛋白酶与纤维素酶组合的所有样品中，澄清啤酒过滤期间膜的污染减少。因此，过滤可以在与常规清啤酒过滤相比增加的速度(cq压强)下操作，获得工艺优势。令人惊讶的是，不同纤维素酶减少过滤器结垢的程度存在明显差异。在减少结垢方面最有效的看上去是里氏木霉的纤维素酶。这是令人惊讶的，因为在用里氏木霉的纤维素酶处理的样品中，过滤前的浑浊形成高于仅用脯氨酰内切蛋白酶的对照中的浑浊形成(参见表5)。
表6：用于澄清不同啤酒样品的过滤器的结垢率。
结垢(小时*巴)-1
实验1A 96.5
实验1B 36.6
实验1C 100.3
实验1D 139.9
对照1 179.4
实验2A 91.1
实验2B 37.4
实验2C 81.9
实验2D 137.5
对照2 187.4
对照0 215.5

Claims (20)

1.一种组合物，其包含以下物质或由以下物质组成：
-第一酶组分，其以下物质或由以下物质组成：谷氨酰胺特异性蛋白酶和/或脯氨酰特异性蛋白酶，优选地谷氨酰胺特异性内切蛋白酶和/或脯氨酰特异性内切蛋白酶，最优选地脯氨酰特异性内切蛋白酶；以及
-第二酶组分，其包含纤维素分解酶、优选地纤维素酶，或由纤维素分解酶、优选地纤维素酶组成，
其中优选地，所述第二酶组分衍生自里氏木霉和/或由里氏木霉产生。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述第一酶组分衍生自微生物和/或由微生物产生，所述微生物优选地是细菌或真菌，最优选地里氏木霉。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，
其中所述第一酶组分包含脯氨酰特异性内切蛋白酶或由脯氨酰特异性内切蛋白酶组成，并且其中基于所述脯氨酰特异性内切蛋白酶的总重量，所述纤维素分解酶、优选纤维素酶是以等于或小于50％w/w的量存在的。
4.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中
-所述第一酶组分由脯氨酰特异性内切蛋白酶组成；并且
-所述第二酶组分由纤维素分解酶、优选地纤维素酶组成，
其中所述第二酶组分衍生自里氏木霉和/或由里氏木霉产生，
其中所述组合物不包含一种或多种额外的酶。
5.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组合物用于在啤酒酿造过程的糖化和/或发酵步骤期间添加。
6.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组合物用于改善发酵液和/或发酵罐中细颗粒物质的去除和/或用于改善酒精饮料产品的味道。
7.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述第一酶组分和所述第二酶组分衍生自相同的微生物或由相同的微生物产生，所述相同的微生物是优选地相同的细菌或真菌，最优选地相同的里氏木霉。
8.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述第一酶组分在等于或大于pH1.0，更优选地等于或大于pH 1.2至等于或小于pH 6.0，更优选地至等于或小于pH 5.5，还更优选地至等于或小于pH 5.0，甚至更优选地至等于或小于pH 4.5，并且最优选地至等于或小于pH 4.0的范围内的pH下具有其最佳活性。
9.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述第二酶组分在等于或大于pH1.0，更优选地等于或大于pH 1.2至等于或小于pH 6.0，更优选地至等于或小于pH 5.5，还更优选地至等于或小于pH 5.0，甚至更优选地至等于或小于pH 4.5，并且最优选地至等于或小于pH 4.0的范围内的pH下具有其最佳活性。
10.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含水以及可选地一种或多种共溶剂。
11.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组合物具有等于或大于pH1.0，更优选地等于或大于pH 1.2至等于或小于pH 6.0，更优选地至等于或小于pH 5.5，还更优选地至等于或小于pH 5.0，甚至更优选地至等于或小于pH 4.5，并且最优选地至等于或小于pH 4.0的范围内的pH值。
12.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组合包含一种或多种额外组分，优选地所述额外组分选自以下组成的组：
-盐，优选地选自氯化钠、氯化钾和硫酸铵组成的组；
-羧酸，优选地具有在等于或大于1至等于或小于10个范围内的碳原子，优选地在等于或大于1至等于或小于7个范围内的碳原子，和/或其任何酯和/或任何盐，更优选地甲酸、乙酸、二乙酸、抗坏血酸、乳酸、柠檬酸、丙酸、草酸、苹果酸和/或富马酸和/或其任何酯和/或其任何盐；
-单乙酸甘油酯、二乙酸甘油酯、三乙酸甘油酯、单丙酸甘油酯、二丙酸甘油酯、三丙酸甘油酯、单丁酸甘油酯、二丁酸甘油酯、三丁酸甘油酯、单乳酸甘油酯、二乳酸甘油酯、三乳酸甘油酯；
-单糖、二糖和/或此类单糖或二糖的醇衍生物或氯化物衍生物；
-山梨糖醇、甘露醇、肌醇、海藻糖、蔗糖、甘露糖和/或三氯蔗糖；
-麦芽糖糊精、木聚糖、甘露聚糖、岩藻多糖、半乳甘露聚糖、壳聚糖、棉子糖、水苏糖、果胶、菊粉、果聚糖、禾草苷、支链淀粉及其混合物。
13.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含或不包含甘油。
14.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含或不包含苯甲酸或其衍生物。
15.细菌或真菌菌株，优选地里氏木霉菌株，其功能性地表达：
-编码第一酶组分的第一核酸序列，所述第一酶组分包含脯氨酰特异性蛋白酶、优选地脯氨酰特异性内切蛋白酶，或由脯氨酰特异性蛋白酶、优选地脯氨酰特异性内切蛋白酶组成；以及
-编码第二酶组分的第二核酸序列，所述第二酶组分包含纤维素分解酶、优选地纤维素酶，或由纤维素分解酶、优选地纤维素酶组成，其中优选地，所述第二酶组分衍生自里氏木霉。
16.根据权利要求15所述的细菌或真菌菌株，优选地里氏木霉菌株，其功能性地表达：
-编码第一酶组分的第一核酸序列，所述第一酶组分包含谷氨酰胺特异性蛋白酶和/或脯氨酰特异性蛋白酶、优选地谷氨酰胺特异性内切蛋白酶和/或脯氨酰特异性内切蛋白酶，或由谷氨酰胺特异性蛋白酶和/或脯氨酰特异性蛋白酶、优选地谷氨酰胺特异性内切蛋白酶和/或脯氨酰特异性内切蛋白酶组成；以及
-编码第二酶组分的第二核酸序列，所述第二酶组分包含纤维素分解酶、优选地纤维素酶，或由纤维素分解酶、优选地纤维素酶组成，
其中所述第一核酸序列：
-可操作地连接至启动子；或者
-以2、3、4、5、6个或更多个拷贝存在。
17.根据权利要求15或16所述的细菌或真菌菌株，优选地里氏木霉菌株，其中所述第一酶组分是以比所述第二酶组分更高的量产生的。
18.一种用于产生供人消费的酒精饮料的方法，包括：
添加根据权利要求1至14中任一项所述的组合物或添加根据权利要求15至16中任一项所述的细菌或真菌菌株，优选地里氏木霉菌株。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述方法是啤酒酿造方法，并且其中在发酵之前或发酵期间、更优选地在发酵之前，添加根据权利要求1至14中任一项所述的组合物，最优选地添加到麦芽汁中。
20.通过权利要求18或19的方法获得或能够获得的供人消费的酒精饮料。
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