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CN120535635A - 基于流式细胞术检测白细胞共同抗原的抗cd45抗体及其应用 - Google Patents

基于流式细胞术检测白细胞共同抗原的抗cd45抗体及其应用

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CN120535635A
CN120535635A CN202511049829.5A CN202511049829A CN120535635A CN 120535635 A CN120535635 A CN 120535635A CN 202511049829 A CN202511049829 A CN 202511049829A CN 120535635 A CN120535635 A CN 120535635A
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Abstract

本发明涉及抗体技术领域，本发明提出了一种基于流式细胞术检测白细胞共同抗原的抗CD45抗体及其应用，所述抗体包括选自下列至少之一的CDR：重链可变区CDR：SEQ ID NO:1~3或其保守修饰形式的氨基酸序列；轻链可变区CDR：SEQ ID NO:4~6或其保守修饰形式的氨基酸序列。所述抗体或其抗原结合片段能够高效并特异性的识别CD45，可以有效对CD45进行检测。

Description

基于流式细胞术检测白细胞共同抗原的抗CD45抗体及其应用
技术领域
本发明涉及抗体技术领域，具体地，涉及一种基于流式细胞术检测白细胞共同抗原的抗CD45抗体及其应用。
背景技术
CD45（白细胞共同抗原，Leukocyte Common Antigen）是免疫系统中至关重要的跨膜蛋白酪氨酸磷酸酶，广泛表达于所有有核白细胞表面，包括T细胞、B细胞、自然杀伤细胞（NK细胞）、巨噬细胞和树突状细胞等。作为免疫细胞信号传导的核心调控分子，CD45介导淋巴细胞的免疫应答，在免疫细胞发育、活化、分化和耐受中发挥关键作用。其结构多样性、功能复杂性及与疾病的关联使其成为免疫学研究和临床转化的重要靶点。
CD45由一段重糖基化的胞外结构域、单次跨膜结构域胞内结构域组成。N端胞外结构域通过第4、5、6号外显子选择性剪切形成多种异构体（如CD45RA、CD45RO等），这些变体在胞外域长度和糖基化模式上存在差异，影响免疫细胞的定位、迁移及信号传导特性。此外胞外结构域还由三个膜近端的类纤连蛋白 II 型结构域、一个富含半胱氨酸的结构域构成，而胞内域包含两个串联的酪氨酸磷酸酶结构域，其中仅第一个结构域具有催化活性。
目前，商业化CD45抗体存在显著局限性，主流产品依赖传统小鼠杂交瘤技术，生产工艺受限于动物源性体系（如腹水制备），存在批次间差异大、动物伦理争议及潜在免疫原性等风险；且国内市场中兔源单抗等高性能抗体品种稀缺，且部分跨国企业垄断关键原料供应。因此，亟需通过创新开发策略（如非动物源重组技术、单B细胞测序技术）突破技术壁垒，缩短研发时间，筛选高亲和力、高特异性及低批间差异的CD45抗体。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。
因此，在本发明的第一方面，本发明提出了一种抗体或其抗原结合片段。根据本发明的实施方案，所述抗体或其抗原结合片段包括选自下列至少之一的CDR：重链可变区CDR：SEQ ID NO:1~3或其保守修饰形式的氨基酸序列；轻链可变区CDR：SEQ ID NO:4~6或其保守修饰形式的氨基酸序列。根据本发明实施方案的抗体或其抗原结合片段能够高效并特异性的识别CD45，可以有效检测CD45，并诊断与CD45异常表达有相关性的疾病。
在本发明的第二方面，本发明提出了一种核酸分子。根据本发明的实施方案，所述核酸分子编码前述的抗体或其抗原结合片段。根据本发明实施方案的核酸分子所编码的抗体或其抗原结合片段能够高效并特异性的识别CD45，可以有效检测CD45，并诊断与CD45异常表达有相关性的疾病。
在本发明的第三方面，本发明提出了一种表达载体。根据本发明的实施方案，表达载体携带前述的核酸分子。由此，有效实现前述的抗体或其抗原结合片段的表达，进而实现抗体或其抗原结合片段的体外大量获得。
在本发明的第四方面，本发明提出了一种重组细胞。根据本发明的实施方案，所述重组细胞包括：携带前述的核酸分子或表达载体或表达前述的抗体或其抗原结合片段。利用该重组细胞在适合条件下，能够在细胞内有效地表达前述的抗体或其抗原结合片段。
在本发明的第五方面，本发明提出了一种制备第一方面所述的抗体或其抗原结合片段的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括培养第四方面所述的重组细胞。
在本发明的第六方面，本发明提出了一种偶联物。根据本发明的实施方案，所述偶联物包含：前述的抗体或其抗原结合片段；以及与其偶联的偶联部分，所述偶联部分与所述抗体或其抗原结合片段相连。本发明的偶联物可特异性的识别CD45，能够有效检测CD45，并诊断与CD45异常表达有相关性的疾病。
在本发明的第七方面，本发明提出了一种试剂或试剂盒。根据本发明的实施方案，所述试剂或试剂盒包括：前述的抗体或其抗原结合片段或前述的抗体偶联物。本发明的试剂盒能够与CD45进行特异性结合，可有效检测CD45。
在本发明的第八方面，本发明提出了前述的抗体或其抗原结合片段、前述的抗体偶联物或试剂或试剂盒在检测CD45、制备检测CD45的产品或诊断CD45相关疾病的产品中的用途。
在本发明的第九方面，本发明提出了一种检测测试样品中CD45的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括将前面所述的抗体或其抗原结合片段、抗体偶联物或试剂或试剂盒与待检测样本中的CD45抗原接触，形成免疫复合物。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为根据本发明实施例的蛋白纯化和鉴定结果图，其中：
图1中的A为细胞上清经Strep柱亲和层析纯化后的结果图，SDS-PAGE鉴定结果表明CD45重组蛋白大小在140KD左右，
图1中的B为初纯后的蛋白经过凝胶过滤层析的精纯结果图，SDS-PAGE鉴定结果表明红框为目的蛋白，部分聚集蛋白被去除；
图2为根据本发明实施例的动物免疫方案以及三次免疫后的血清效价检测结果图，其中：
图2中的A为动物免疫方案流程，
图2中的B为对实验动物进行三次免疫后的血清效价检测结果图；
图3为根据本发明实施例的流式分选B细胞的结果图，其中，P1表示通过前向散射光（FSC-A）和侧向散射光（SSC-A）选定了主细胞群，去除了细胞碎片，P2和P3表示再通过FSC与SSC的面积area（A）和高度height（H）去除粘连细胞，P4表示选择FITC通道阳性的lgG+细胞，P6表示选择APC通道阳性的Ag+lgG+细胞；
图4为根据本发明实施例的CD45-P2-91蛋白纯度鉴定结果图，其中，M表示蛋白marker，+DTT表示蛋白的上样缓冲液中含有还原剂DTT，-DTT表示蛋白的上样缓冲液中不含有还原剂DTT；
图5为根据本发明实施例的结合抗体亲和力测定结果图，其中，横坐标代表时间（s），纵坐标代表相对位移高度height（nm）；
图6为根据本发明实施例的兔重组单抗CD45-P2-91在Daudi细胞及Jurkat细胞中的流式测试结果图；
图7为根据本发明实施例的兔重组单抗CD45-P2-91结合PBMC细胞染色的结果图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
在本文中，术语“包含”或“包括”为开放式表达，即包括本发明所指明的内容，但并不排除其他方面的内容。
在本文中，术语“任选地”、“任选的”或“任选”通常是指随后所述的事件或状况可以但未必发生，并且该描述包括其中发生该事件或状况的情况，以及其中未发生该事件或状况的情况。
在本文中，术语“片段”是指目标蛋白或多肽，以及具有N-末端（N端）或C-末端（C端）截短、和/或内部删除的目标蛋白或多肽。
在本文中，术语“同一性”、“同源性”或“相似性”均用于描述相对于参考序列的氨基酸序列或核酸序列时，采用通过常规的方法进行确定两个氨基酸序列或核酸序列之间的相同氨基酸或核苷酸的百分比，例如参见，Ausubel等，编著(1995)，Current Protocols inMolecular Biology，第19章(Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York)；和 ALIGN程序 (Dayhoff(1978)，Atlas of Protein Sequence and Structure 5：Suppl.3(National Biomedical Research Foundation，Washington，D.C.)。关于比对序列和测定序列同一性有很多算法，包括，Needleman等(1970)J.Mol.Biol.48：443的同源性比对算法；Smith等(1981)Adv.Appl.Math.2：482的局部同源性算法；Pearson等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85：2444的相似性搜索方法；Smith-Waterman 算法(Meth.Mol.Biol.70：173-187(1997)；和 BLASTP，BLASTN，和BLASTX算法(参见Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-410)。利用这些算法的计算机程序也是可获得的，并且包括但不限于：ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件，或者 WU-BLAST-2(Altschul 等，Meth.Enzym.，266：460-480(1996))；或者 GAP，BESTFIT，BLAST Altschul等，上文，FASTA，和TFASTA，在Genetics Computing Group(GCG)包，8版，Madison，Wisconsin，USA中可获得；和Intelligenetics，Mountain View，California提供的PC/Gene程序中的CLUSTAL。
在本文中，术语“至少80%同一性”指与各参考序列至少为80%，可为80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.9%的同一性。
在本文中，术语“表达载体”通常是指能够插入在合适的宿主中自我复制的核酸分子，其将插入的核酸分子转移到宿主细胞中和/或宿主细胞之间。所述表达载体可包括主要用于将DNA或RNA插入细胞中的载体、主要用于复制DNA或RNA的载体，以及主要用于DNA或RNA的转录和/或翻译的表达的载体。所述表达载体还包括具有多种上述功能的载体。所述表达载体可以是当引入合适的宿主细胞时能够转录并翻译成多肽的多核苷酸。通常，通过培养包含所述表达载体的合适的宿主细胞，所述表达载体可以产生期望的表达产物。
在本文中，术语“重组细胞”通常是指采用基因工程技术或细胞融合技术对宿主细胞的遗传物质进行修饰改造或重组，获得具有稳定遗传的独特性状的细胞。其中，术语“宿主细胞”是指可导入重组表达载体的原核细胞或真核细胞。本文所用术语“转化的”或“转染的”是指通过本领域已知的各种技术将核酸（例如载体）引入细胞。合适的宿主细胞可以用本发明的DNA序列转化或转染，并且可以用于靶蛋白的表达和/或分泌。可用于本发明的合适宿主细胞的例子包括永生化杂交瘤细胞、NS/0骨髓瘤细胞、293细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、Cap细胞（人羊水来源的细胞）和CoS细胞。
在本文中，术语“药学上可接受的辅料”均可包括任何溶剂、固体赋形剂、稀释剂或其他液体赋形剂等等，适合于特有的目标剂型。除了任何常规的辅料与本发明的化合物不相容的范围，例如所产生的任何不良的生物效应或与药学上可接受的组合物的任何其他组分以有害的方式产生的相互作用，它们的用途也是本发明所考虑的范围。
一种抗体或其抗原结合片段
在一些实施方案中，本发明提出了一种抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括选自下列至少之一的CDR：重链可变区CDR：SEQ ID NO:1~3或其保守修饰形式的氨基酸序列；轻链可变区CDR：SEQ ID NO:4~6或其保守修饰形式的氨基酸序列。根据本发明的一些具体的实施方案的抗体或其抗原结合片段能够高效并特异性的识别CD45，可以有效检测CD45，并诊断与CD45异常表达有相关性的疾病。
在本文中，术语“抗体”在最广义上使用，其可以包括全长单克隆抗体、多特异性抗体、以及嵌合抗体，具体结构不受限制，只要它们展示所需的生物学活性。其通常包括分子量较轻的轻链和分子量较重的重链，重链（H链）和轻链（L链）由二硫键连接形成抗体分子。其中，肽链的氨基端（N端）氨基酸序列变化很大，称为可变区（V区）；羧基端（C端）相对稳定，变化很小，称为恒定区（C区）。L链和H链的V区分别称为VL和VH。如本文所用，术语“互补性决定区”、“CDR”或“CDRs”是指免疫球蛋白的重链和轻链的高度可变区，指包含一种或多种或者甚至全部的对抗体或其功能性片段与其识别的抗原或表位的结合亲和力起作用的主要氨基酸残基的区域。在本公开具体实施方式中，CDRs是指所述抗体的重链和轻链的高度可变区。
在本文中，术语“抗原结合片段”是包含抗体的一部分或全部的片段，其缺乏至少一些存在于全长链中的氨基酸但仍能够特异性结合抗原的性能活性，例如，该片段可包含抗体CDR的一部分或全部。此类片段具有生物活性，因为其结合至抗原，且可与其他抗原结合分子(包括完整抗体)竞争结合至给定表位。此类片段选自Fab、Fv、scFv或单域抗体。此类片段可通过重组核酸技术产生，或可通过抗原结合分子(包括完整抗体)的酶裂解或化学裂解产生。
在本文中，“保守修饰形式的氨基酸序列”指这样的氨基酸修饰，它不显著影响或改变包含该氨基酸序列的抗体的结合特性，该修饰包括氨基酸置换、增加和缺失。修饰可通过例如定点诱变和PCR介导的诱变等标准技术引入本发明的抗体中。保守氨基酸置换系其中的氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替换的置换。在本领域中已经确定具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，具有酸性侧链的氨基酸(如天冬氨酸、谷氨酸)，具有不带电的极性侧链的氨基酸(如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)，具有非极性侧链的氨基酸(如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)，具有β-支化侧链的氨基酸(如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)、和具有芳香侧链的氨基酸(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，本发明的抗体的CDR区中的一个或多个氨基酸残基可以被来自相同侧链家族的其他氨基酸残基替代，并且使用此处说明的功能测定方法对经改变的抗体的保留功能进行测试。优选的是，保守修饰在数目上不超过1个或2个。
根据本发明的一些具体实施方案，上述抗体或其抗原结合片段还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的一些具体实施方案，所述抗体或其抗原结合片段包括：
具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或其保守修饰形式的氨基酸序列的重链可变区CDR1；
具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或其保守修饰形式的氨基酸序列的重链可变区CDR2；
具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列或其保守修饰形式的氨基酸序列的重链可变区CDR3；
具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列或其保守修饰形式的氨基酸序列的轻链可变区CDR1；
具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列或其保守修饰形式的氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和
具有SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列或其保守修饰形式的氨基酸序列的轻链可变区CDR3。
根据本发明的一些具体实施方案，所述重链可变区CDR1、CDR2、CDR3和轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3由Kabat、Chothia、IMGT或AbM任意一种系统进行定义。本领域常用的CDR编号方案包括：Kabat编号、Chothia编号、IMGT编号、Martin编号和AHo编号。CDR定义方案包括：Kabat定义、Chothia定义、IMGT定义和AbM定义。如本文所述，“Kabat编号”和“Kabat定义”是指Kabat等，U.S.Dept.of Health and Human Services，“Sequence of Proteins ofImmunological Interest”(1983)所述的编号和定义系统。“Chothia定义”参见Chothia等，J Mol Biol 196：901-917(1987)。在给定抗体的可变区氨基酸序列的情况下，本领域技术人员可以常规地确定哪些残基包含特定CDR。
根据本发明的一些具体实施方案，所述抗体或其抗原结合片段包括重链框架区和/或轻链框架区。
根据本发明的一些具体实施方案，所述重链框架区和/或轻链框架区的至少一部分来自于兔源抗体、鼠源抗体、人源抗体、灵长目源抗体、羊源抗体、狗源抗体、猫源抗体和羊驼源抗体和其突变体中的至少之一。
根据本发明的一些具体实施方案，所述重链框架区和/或轻链框架区的至少一部分来自于兔源抗体。
根据本发明的一些具体实施方案，所述重链框架区和/或轻链框架区包括选自下列至少之一的FR：
重链可变区FR：SEQ ID NO:7~10或其保守修饰形式的氨基酸序列；
轻链可变区FR：SEQ ID NO:11~14或其保守修饰形式的氨基酸序列。
根据本发明的一些具体实施方案，所述抗体或其抗原结合片段包括：
具有SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列或其保守修饰形式的氨基酸序列的重链可变区FR1；
具有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列或其保守修饰形式的氨基酸序列的重链可变区FR2；
具有SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列或其保守修饰形式的氨基酸序列的重链可变区FR3；
具有SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列或其保守修饰形式的氨基酸序列的重链可变区FR4；
具有SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列或其保守修饰形式的氨基酸序列的轻链可变区FR1；
具有SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列或其保守修饰形式的氨基酸序列的轻链可变区FR2；
具有SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列或其保守修饰形式的氨基酸序列的轻链可变区FR3；和
具有SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列或其保守修饰形式的氨基酸序列的轻链可变区FR4。
根据本发明的一些具体实施方案，所述重链可变区FR1、FR2、FR3、FR4和轻链可变区FR1、FR2、FR3、FR4由Kabat、Chothia、IMGT或AbM任意一种系统进行定义。
同样得，本领域技术人员可以理解，在给定抗体的可变区氨基酸序列的情况下，本领域技术人员可以常规地确定哪些残基包含特定FR。
根据本发明的一些具体实施方案，所述抗体或其抗原结合片段包括如SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列或与其具有至少80%同一性的氨基酸序列的重链可变区；和/或如SEQID NO:16所示的氨基酸序列或与其具有至少80%同一性的氨基酸序列的轻链可变区。
根据本发明的一些具体实施方案，所述抗体或其抗原结合片段进一步包括恒定区。
根据本发明的一些具体实施方案，所述恒定区包括重链恒定区和/或轻链恒定区。
根据本发明的一些具体实施方案，所述重链恒定区和/或轻链恒定区的至少一部分来自于兔源抗体、鼠源抗体、人源抗体、灵长目源抗体、羊源抗体、狗源抗体、猫源抗体和羊驼源抗体和其突变体中的至少之一。
根据本发明的一些具体实施方案，所述重链恒定区和/或轻链恒定区的至少一部分来自于兔源抗体、鼠源抗体、人源抗体和灵长目源抗体中的至少之一。
根据本发明的一些具体实施方案，所述重链恒定区包括选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE或IgD的重链恒定区；或者所述轻链恒定区包括选自κ型或λ型的轻链恒定区。
根据本发明的一些具体实施方案，所述重链恒定区和/或轻链恒定区来自于兔源抗体或其突变体。
根据本发明的一些具体实施方案，所述重链恒定区的N端与所述重链可变区的C端相连；和/或所述轻链恒定区的N端与所述轻链可变区的N端相连。
根据本发明的一些具体实施方案，所述抗体包括选自全长单抗、Fab抗体、Fab’抗体、F（ab’）2抗体、Fv抗体、单链抗体、单域抗体以及最小识别单位中的至少之一；或者，所述抗原结合片段包括选自F(ab’)2片段、Fab’ 片段、Fab片段、F(ab)2片段、Fv片段、scFv片段、scFv-Fc融合蛋白、scFv-Fv融合蛋白和最小识别单位中的至少之一。
在本文中，术语“全长抗体”、“全长单抗”或“全长单克隆抗体”均是由至少两条相同的轻链和至少两条相同的重链通过链间二硫键连接而成，如免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白M（IgM）、免疫球蛋白D（IgD）或免疫球蛋白E（IgE）。
在本文中，术语“单域抗体”、“纳米抗体”和“VHH抗体”可互换使用，其最初被描述为“重链抗体”(即“缺乏轻链的抗体”)的抗原结合免疫球蛋白(可变)域(Hamers-CastermanC ,AtarhouchT ,Muyldermans S ,Robinson G ,Hamers C ,Songa EB,Bendahman N ,Hamers R .:“Naturallyoccurring antibodies devoid of light chains”；Nature 363,446-448(1993))，包含重链可变区（VH）和常规的CH2与CH3区，其通过重链可变区与抗原蛋白（例如CD45）特异性结合。
在本文中，术语“Fab抗体”或“Fab片段”通常是指仅含Fab分子的抗体或片段，其由重链的VH和CH1以及完整的轻链构成，轻链和重链之间通过一个二硫键连接。
在本文中，术语“F(ab’)2抗体”或“F(ab’)2片段”具有通过二硫键连接在一起的两个抗原结合 F(ab’) 部分。
在本文中，术语“Fv抗体”或“Fv片段”通常是指仅由轻链可变区（VL）和重链可变区（VH）通过非共价键连接而成的抗体或片段，是抗体分子留完整抗原结合部位的最小功能片段。
在本文中，术语“单链抗体”、“scFv片段”是由抗体重链可变区和轻链可变区通过短肽连接而成的抗体或片段。
在本文中，术语“最小识别单位”和“MRU”均是指仅由一个CDR组成的抗体或片段，其分子量十分小仅占完全抗体的1%左右。
核酸分子、表达载体和重组细胞
在一些实施方案中，本发明提出了一种核酸分子。根据本发明的实施方案，所述核酸分子编码前述的抗体或其抗原结合片段。根据本发明实施方案的核酸分子所编码的抗体或其抗原结合片段能够高效并特异性的识别CD45，可以有效检测CD45并诊断与CD45异常表达有相关性的疾病。
根据本发明的一些具体实施方案，所述核酸分子为DNA。
需要说明的是，对于本文中所提及的核酸分子，本领域技术人员应当理解，实际包括互补双链的任意一条，或者两条。为了方便，在本说明书和权利要求书中，虽然多数情况下只给出了一条链，但实际上也公开了与之互补的另一条链。另外，本申请中的核酸序列包括DNA形式或RNA形式，公开其中一种，意味着另一种也被公开。
在一些实施方案中，本发明提出了一种表达载体。根据本发明的实施方案，表达载体携带前述的核酸分子。在将上述核酸分子连接到载体上时，可以将所述核酸分子与载体上的控制元件直接或者间接相连，只要这些控制元件能够控制所述核酸分子的翻译和表达等即可。当然这些控制元件可以直接来自于载体本身，也可以是外源性的，即并非来自于载体本身。当然，所述核酸分子与控制元件进行可操作地连接即可。本文中“可操作地连接”是指将外源基因连接到载体上，使得载体内的控制元件，例如转录控制序列和翻译控制序列等等，能够发挥其预期的调节外源基因的转录和翻译的功能。常用的载体例如可以为质粒、噬菌体等等。根据本发明的一些具体实施例的表达载体导入合适的受体细胞后，可在调控系统的介导下，有效实现前述的抗体或其抗原结合片段的表达，进而实现抗体或其抗原结合片段的体外大量获得。
根据本发明的一些具体实施方案，所述表达载体为真核表达载体或者原核表达载体。
根据本发明的一些具体实施方案，所述表达载体为质粒表达载体。
在一些实施方案中，本发明提出了一种重组细胞。根据本发明的实施方案，所述重组细胞包括：携带前述的核酸分子或表达载体或表达前述的抗体或其抗原结合片段。利用该重组细胞在适合条件下，能够在细胞内有效地表达前述的抗体或其抗原结合片段。
需要说明的是，本申请说明书中所述的“适合条件”，是指适合本发明所述抗体或其抗原结合片段表达的条件。本领域技术人员容易理解的是，适合所述抗体或其抗原结合片段表达的条件包括但不限于合适的转化或转染方式、合适的转化或转染条件、健康的宿主细胞状态、合适的宿主细胞密度、适宜的细胞培养环境、适宜的细胞培养时间。“适合条件”不受特别限制，本领域技术人员可根据实验室的具体环境，优化最适的所述抗体或其抗原结合片段表达的条件。
根据本发明的一些具体实施方案，所述重组细胞为真核细胞
根据本发明的一些具体实施方案，所述重组细胞为哺乳动物细胞。
偶联物和试剂盒
在一些实施方案中，本发明提出了一种偶联物。根据本发明的实施方案，所述偶联物包含：前述的抗体或其抗原结合片段；以及与其偶联的偶联部分。本发明的偶联物可特异性的识别CD45，能够有效检测CD45并诊断与CD45异常表达有相关性的疾病。
根据本发明的一些具体实施方案，所述偶联部分选自纯化标签或标记。
根据本发明的一些具体实施方案，所述偶联部分包括选自胶体金、放射性标记、磷光化学剂、化学发光剂、荧光素、酶、天然毒素、核酸和亲和标记物中的至少之一。
根据本发明的一些具体实施方案，所述偶联部分包括放射性同位素。
根据本发明的一些具体实施方案，所述偶联部分包括选自藻红蛋白、荧光团、罗丹明、荧光素酶、异硫氰酸荧光素、绿色荧光蛋白质、蓝色荧光蛋白、红色荧光蛋白质中的至少之一。
根据本发明的一些具体实施方案，所述偶联部分包括选自辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖类氧化酶、葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶中的至少之一。
根据本发明的一些具体实施方案，所述偶联部分包括选自生物素和抗生物素蛋白中的至少之一。
根据本发明的一些具体实施方案，所述偶联部分包括选自磁珠、磁性微球、塑料微球、塑胶微粒、微孔板、尼龙和硝酸纤维素膜中的至少之一。
在本文中，所述偶联部分可以为能够在液相中悬浊或分散的物质(例如，粒子、磁珠等固相载体)，或者为能够收容或搭载液相的固相(例如，板、膜、试管等支持体，以及孔板、微流路、玻璃毛细管、纳米柱、整体柱等的容器)；也可以为用于对抗体或其抗原结合片段进行标记的标记载体，例如酶(例如，过氧化物酶、碱性磷酸酶、虫萤光素酶(luciferin)、β-半乳糖苷酶)、亲和性物质(例如，链霉亲和素和生物素中的一者，相互互补的正义链和反义链的核酸中的一者)、荧光物质(例如，藻红蛋白、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、绿色荧光蛋白质、蓝色荧光蛋白、红色荧光蛋白质)、发光物质(例如，虫萤光素、水母发光蛋白(Aequorin)、吖啶酯、三(2 ,2 '-联吡啶)钌、鲁米诺)、放射性同位素(例如，3H、14C、32P、35S、125I)以及金胶体等。
根据本发明的一些具体实施方案，所述偶联部分可以为蛋白标签，所述蛋白标签包括但不限His标签、Flag标签、GST标签、MBP标签、SUMO标签和C-Myc标签等。
需要说明的是，偶联部分和抗体或其抗原结合片段的结合方法，可以使用本领域公知的方法。例如，可以举出物理吸附法、共价结合法、利用亲和性物质(例如，生物素、链霉亲和素)的方法及离子结合法。
在一些实施方案中，本发明提出了一种试剂或试剂盒。根据本发明的实施方案，所述试剂或试剂盒包括：前述的抗体或其抗原结合片段、前述的核酸分子、前述的表达载体、前述的重组细胞或偶联物。由前可知，前述抗体或其抗原结合片段可特异性结合CD45，此外，在合适条件下，所述核酸分子、表达载体或重组细胞均能够表达所述抗体或其抗原结合片段，进一步地，包含上述物质的试剂或试剂盒能够与CD45进行有效结合，可用于有效检测CD45。所述试剂盒可用于科学研究，如定性或定量检测生物样本中的CD45，也可以用于对对象状态进行判断，如获得所述对象的CD45水平后，判断其CD45水平是否过高于或低于正常水平，所述生物样本可以为细胞、组织、血液等。
用途
在一些实施方案中，本发明提出了前述的抗体或其抗原结合片段、前述的抗体偶联物或试剂或试剂盒在检测CD45、制备检测CD45的产品或诊断CD45相关疾病的产品中的用途。
方法
在一些实施方案中，本发明提出了一种检测测试样品中CD45的方法，所述方法包括：采用前述的抗体或其抗原结合片段或前述的试剂盒与待检测样品进行接触，形成免疫复合物。
根据本发明的一些具体实施方案，基于所述免疫复合物的信号，确定所述待检测样本中是否含有CD45或所述CD45的含量。
根据本发明的一些具体实施方案，所述测试样品包括细胞、组织、血液等。
根据本发明的一些具体实施方案，所述免疫复合物还包括第二抗体，所述第二抗体与所述抗体或其功能性片段结合。
根据本发明的一些具体实施方案，所述免疫复合物还包括第二抗体，所述第二抗体与CD45结合。
本申请涉及的核酸和氨基酸序列如表1所示。
表1
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
除非另外指明，否则实践本公开将采用细胞生物学、分子生物学(包含重组技术)、微生物学、生物化学和免疫学的常规技术，所述常规技术在本领域技术人员的能力范围内。文献中充分解释了这种技术，如《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)》，第二版(Sambrook等人，1989)；《寡核苷酸合成(OligonucleotideSynthesis)》(M.J.Gait编，1984)；《动物细胞培养(Animal Cell Culture)》(R.I.Freshney编，1987)；《酶学方法(Methods in Enzymology)》(学术出版社有限公司(Academic Press，Inc.)；《实验免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology)》(D.M.Weir和C.C.Blackwell编)；《哺乳动物细胞用基因转移载体(Gene Transfer Vectors forMammalian Cells)》(J.M.Miller和M.P.Calos编，1987)；《当代分子生物学方法(CurrentProtocols inMolecular Biology)》(F.M.Ausubel等人编，1987)；《PCR:聚合酶链反应(PCR:The Polymerase Chain Reaction)》(Mullis等人编，1994)；以及《当代免疫学方法(Current Protocols in Immunology)》(J.E.Coligan等人编，2011)，所述文献中的每个文献均通过引用明确并入本文中。
在本发明实施例中，制备表达载体用到的核苷酸序列可根据其氨基酸序列采用常规方法或常规的软件（例如在线程序Vectorbuilder、GeneOptimizer在线程序等）得到。
实施例1：基因合成与蛋白表达
本实施例制备CD45重组蛋白（其序列编号为uniprot P08575）作为免疫原，由此，基于所述CD45重组蛋白的编码核酸构建了CD45_ pcDNA3.4表达载体（基因合成由华大常州新一产生命科技有限公司合成平台进行），表达载体中CD45蛋白(G25-S576)编码区的3’端带有Twin-Strep-Tag标签，按照Homo sapiens物种密码子偏好性进行密码子优化，并通过XbaI和HindIII限制性酶切位点克隆到pcDNA3.4表达载体中。质粒CD45_ pcDNA3.4转化到大肠杆菌DH5α（购自TIANGEN）后进行质粒的大量提取，然后将质粒通过PEI（购自POLYSCIENCE）转染到Expi293FTM细胞(购自Thermo)中进行蛋白表达。转染的第5天后收获含有目的蛋白CD45重组蛋白的细胞上清，结果如图1所示，图1中的A为细胞上清经Strep柱亲和层析纯化后的结果图（横坐标依次为0、5、10、15、20、25、30、35、40 ml，纵坐标单位为mAU），SDS-PAGE鉴定表明CD45重组蛋白大小在140KD左右，图1中的B为初纯后的蛋白经过凝胶过滤层析的精纯结果图（横坐标依次为0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22 ml，纵坐标单位为mAU），SDS-PAGE鉴定结果表明红框为目的蛋白，部分聚集蛋白被去除，即细胞上清经Strep柱亲和层析（Strep-Tactin XT柱子，IBA）和凝胶过滤层析（SuperoseTM 6 Increase10/300GL，GE）纯化后，获得较纯的目的蛋白。
实施例2：动物免疫
本实施例中采用实施例1获得的免疫原CD45重组蛋白进行动物免疫，具体操作如下：
将免疫原CD45重组蛋白与佐剂混合，将其注射到新西兰大白兔中进行免疫，其中，首免用弗式完全佐剂（弗式完全佐剂：sigma，cat F5881），后续免疫用弗式不完全佐剂（sigma，cat F5506），混合比例为免疫原和佐剂1：1混合。兔子经过多轮免疫后，从耳部采血，分离血清，通过ELISA进行血清中抗体效价检测，血清效价合格后进行B细胞分选，具体实验结果如图2所示，其中，图2中的B中第一行数据代表血清稀释的11个稀释度的倒数，第二行和第三行数据代表免血清的两个平行稀释复孔在OD450波长下的吸光光度值，结果表明三免血清效价达到78W以上，同样稀释度下的血清样本OD小于0.1，不影响实验结果。
实施例3：免疫兔的B细胞分选
采集实施例2所述免疫合格的兔全血10mL，用于分离PBMCs。首先用biotin-T-lymphocyte抗体（购自Bio-Rad）、biotin-IgM抗体（购自BD Pharmingen）、biotin-CD11b抗体（购自STEMCELL Technologies）标记PBMC，然后加入链霉亲和素磁珠（购自MiltenyiBiotec），冰上孵育15 min，最后通过磁力柱进行负式分选得到B细胞。
取1x10^6个B细胞，加入CD45重组蛋白后于冰上孵育30 min，孵育结束后用PBS清洗细胞3次，再加入AF488 Donkey Anti-Rabbit IgG H&L（购自Biolegend）、StrepMAB-ImmoDY-649（购自IBA）抗体，冰上孵育30 min后用PBS清洗3次，最后通过流式分选仪FACSAriaTMII分选CD45+IgG+的B细胞到15mL离心管中，用于后续的单细胞测序，具体结果如图3所示，首先通过前向散射光（FSC-A）和侧向散射光（SSC-A）选定了主细胞群，去除了细胞碎片（P1），然后分别通过FSC与SSC的面积area（A）和高度height（H）去除粘连细胞（P2和P3），之后选择FITC通道阳性的lgG+细胞（P4），最后进一步选择APC通道阳性的Ag+lgG+细胞(P6)。
实施例4：单B细胞测序和抗体表达载体构建
将分选到的单B细胞进行单细胞测序，该单细胞测序平台基于华大自主研发的C4单细胞测序平台（DNBelab C系列高通量单细胞RNA文库制备试剂盒套装）。首先将分选后的细胞300g离心10min，重悬后计数，与逆转录反应的相关试剂混匀作为细胞相，然后将含有标签信息的大磁珠Cell Beads和小磁珠Index Carrier作为磁珠相，通过基于负压的液滴微流控系统，将细胞相和磁珠相用油滴包裹，进而生成含有单个细胞的油包水液滴。然后，在液滴中完成细胞裂解、mRNA捕获以及cDNA逆转录反应。之后破乳回收cDNA中间产物和Oligo产物，分别进行cDNA文库、Oligo文库和BCR文库的构建，最后将上述制备好的文库产物通过MGIEasy环化试剂盒进行DNB环化（BGI），通过MGISEQ-2000RS高通量测序试剂（PE150）进行测序，测序数据进行生信分析。
获得转录组数据后进行免疫组库BCR分析获取抗体序列，选取轻重链配对的抗体序列送到华大常州新一产生命科技有限公司合成抗体表达载体质粒。
实施例5：重组抗体的表达及纯化
重组抗体表达：将抗体序列（SEQ ID NO:15、16）合成到pCDNA3.4(+)表达载体中，大量提取含有实施例3得到的特定抗体轻、重链编码基因的表达质粒，然后将含有轻重链可变区的载体按照摩尔比3：2的比例共转染293F。质粒与PEI（POLYSCIENCE）的混合比例为1：3，混合后室温静置半小时，逐滴加入细胞中，转染后的24h和72h加入SMS293-SUPI加料液（Sino Biological）补料，5天后收集细胞上清。
重组抗体纯化：收集细胞上清加入Protein A填料（义翘神州）1 mL，室温孵育半小时，取出填料装入纯化柱空柱，加入PBS溶液冲洗20 mL，然后加入10 mL pH 3.0的100 mM的甘氨酸溶液进行洗脱，洗脱液加入中和液1M Tris（pH 9.0）溶液中和至pH 7.0。将中和后的洗脱液浓缩至1 mL，透析至PBS中，测定蛋白浓度并将部分代表性抗体跑SDS-PAGE进行纯度鉴定，结果如图4所示。
实施例6：BLI初筛结合抗体和鉴定抗体亲和力
通过生物膜干涉技术（BLI）对结合CD45重组蛋白的抗体进行初筛。生物膜干涉技术（BLI）可以实时监测分子间相互作用，分子变化反应以干涉光谱的相对位移强度（nm）显示。实验使用protein A探针捕获抗体（捕获量大于0.2nM），流动抗原，PBST（0.2% Tween）作为缓冲液。将抗体稀释至5μg/mL，抗原稀释至200nM，Gator Primer依次流动PBST、抗体、PBST、抗原和PBST进行结合和解离。每组实验添加PBST作为association的对照，用于扣除解离过程中干涉光谱相对位移的本底变化。利用分析软件的 1:1 Binding 模型进行动力学参数计算，确认抗体是否和抗原结合，并确定抗体的亲和力KD，实验结果如图5所示，本发明涉及的CD45-P2-91（SEQ ID NO:15、16）的亲和力K D(M)小于1.00E-12，亲和力达到皮摩尔(pM)级别。
实施例7：结合抗体进行细胞系的流式测试
细胞准备；本实施例中CD45全长序列（M1-S1306)经华大常州新一产生命科技有限公司后构建到pEGFP-N1载体中。大提质粒后通过PEI将CD45_ pEGFP-N1质粒转染至Expi293FTM细胞中，培养2天后获得293F-CD45过表达细胞，用于下一步流式测试；37℃水浴复苏daudi细胞（人Burkitt's淋巴瘤细胞，属于B淋巴母细胞系）和jurkat细胞（人急性T淋巴细胞白血病细胞，是一种永生化人T淋巴细胞系），扩增传代后用于下一步流式测试；
2. 细胞洗涤：CD45过表达细胞有明显的绿色荧光或者daudi细胞和jurkat细胞处于快速繁殖期的时候用于流式测试；将细胞收集到15 mL离心管中，300 g常温离心5 min，PBS重悬细胞，每个样本的细胞密度为1E6。
3. 兔抗染色：将兔抗配置成1μg/mL的工作浓度用于染色细胞，37℃避光孵育30min；
4. 细胞洗涤：300 g常温离心5 min，弃去上清，每个样本通过PBS洗涤细胞，重复上述操作两次；
5. 二抗染色：将anti-rabbit IgG/AF647（Biolegend）按照1:1000的比例染色细胞，37℃避光孵育30min；
6. 细胞洗涤：300 g常温离心5 min，弃去上清，每个样本通过200μL的PBS洗涤细胞，重复上述操作两次；
7. 上机：将洗涤好的细胞通过流式仪进行分析。
实验结果如图6所示，其中，293F-CD45过表达细胞系结果图中横坐标为FITC，数值为0、103、104、105、106、107，纵坐标为APC-A，数值为0、103、104、105、106，Daudi 细胞结果图中横坐标为APC-A，数值为0、103、104、105、106，纵坐标为FSC-A，数值为50K、100K、150K、200K，Jurkat细胞结果图中横坐标为APC-A，数值为0、103、104、105、106，纵坐标为FSC-A，数值为50K、100K、150K、200K，流式结果表明CD45-P2-91（SEQ ID NO:15、16）在293F-CD45过表达细胞系、B细胞系Daudi 和T细胞系Jurkat中表现出较高的细胞染色比例与较低的背景信号，表明CD45-P2-91可作为特异性流式抗体应用于流式实验中。
实施例8：结合抗体在人PBMC样品进行流式细胞术测试
细胞复苏：从液氮罐中取出PBMC细胞（澳能生物，PB005F-C），迅速放入37℃水浴中，并不时摇动，在1~2分钟内使其完全融化。用移液器吸取PBMC细胞至装有5 mL 1640培养基（含10% FBS）的15 mL离心管中，400 g离心10 min。弃去上清，加入5 mL PBS或抗体稀释液清洗细胞，400 g离心5 min。弃去上清，使用2 mL抗体稀释液复溶，按每孔100 μL（即细胞数5E5）加入96孔板中。
2、一抗用PBS buffer（含有3% BSA）稀释到工作浓度1 μg/mL，然后加入100 μL稀释好的一抗重悬96孔板中铺好的PBMC，4℃孵育1h。用500 μL冷PBS（含有2% FBS）洗涤细胞3次。
3、将anti-rabbit IgG/PE（Biolegend）按照1:3000的比例通过DPBS buffer（1%BSA/1 mM EDTA）稀释使用，商品抗体CD45-PC-APC按照1：100的比例通过DPBS buffer（1%BSA/1 mM EDTA）稀释使用，然后把稀释后的二抗按照100 μL加入到重悬洗涤后的细胞，在4℃避光孵育30 min。用500 μL冷PBS（含有2% FBS）洗涤细胞3次。
4、用200 μL PBS重悬细胞，上流式细胞仪进行分析测试。
实验结果如图7所示，blank指流式实验过程中一抗二抗都加PBS的对照，NC对照指流式实验过程中一抗加入PBS，二抗染色则加入同样比例的anti-rabbit IgG/PE。从流式结果可发现，本发明的CD45-P2-91结合PBMC细胞染色效果较好，表现出高染色比例与低背景信号，商品抗体CD45-PC-APC为Biolegend公司的APC anti-human CD45（Cat 982304；CloneHI30），是最经典的CD45鼠源流式抗体，该结果表明本发明抗体（SEQ ID NO:15、16）可在低浓度的比例下应用于真实样本，且染色比例为99.9%，与经典鼠CD45抗体一致。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、 “实施例”或“具体实施例”等的描述意指结合该实施例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例以及不同实施例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (16)

1.一种抗体或其抗原结合片段，其特征在于，包括：
具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或其保守修饰形式的氨基酸序列的重链可变区CDR1；
具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或其保守修饰形式的氨基酸序列的重链可变区CDR2；
具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列或其保守修饰形式的氨基酸序列的重链可变区CDR3；
具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列或其保守修饰形式的氨基酸序列的轻链可变区CDR1；
具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列或其保守修饰形式的氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和
具有SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列或其保守修饰形式的氨基酸序列的轻链可变区CDR3。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，包括重链框架区和/或轻链框架区，所述重链框架区和/或轻链框架区的至少一部分来自于兔源抗体、鼠源抗体、人源抗体、灵长目源抗体、羊源抗体、狗源抗体、猫源抗体和羊驼源抗体中的至少之一。
3.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段包括：
具有SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列或其保守修饰形式的氨基酸序列的重链可变区FR1；
具有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列或其保守修饰形式的氨基酸序列的重链可变区FR2；
具有SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列或其保守修饰形式的氨基酸序列的重链可变区FR3；
具有SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列或其保守修饰形式的氨基酸序列的重链可变区FR4；
具有SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列或其保守修饰形式的氨基酸序列的轻链可变区FR1；
具有SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列或其保守修饰形式的氨基酸序列的轻链可变区FR2；
具有SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列或其保守修饰形式的氨基酸序列的轻链可变区FR3；和
具有SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列或其保守修饰形式的氨基酸序列的轻链可变区FR4。
4.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，包括：
如SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列或与其具有至少80%同一性的氨基酸序列的重链可变区；和/或
如SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列或与其具有至少80%同一性的氨基酸序列的轻链可变区。
5.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，包括重链恒定区和/或轻链恒定区，所述重链恒定区和/或轻链恒定区的至少一部分来自于兔源抗体、鼠源抗体、人源抗体、灵长目源抗体、羊源抗体、狗源抗体、猫源抗体和羊驼源抗体中的至少之一。
6.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体包括选自全长单抗、Fab抗体、Fab’抗体、F（ab’）2抗体、Fv抗体、单链抗体、单域抗体以及最小识别单位中的至少之一；或者，所述抗原结合片段包括选自F(ab’)2片段、Fab’ 片段、Fab片段、F(ab)2片段、Fv片段、scFv片段、scFv-Fc融合蛋白、scFv-Fv融合蛋白和最小识别单位中的至少之一。
7.一种抗体偶联物，其特征在于，所述抗体偶联物包含权利要求1~6任一项所述的抗体或其抗原结合片段以及与其偶联的偶联部分。
8.根据权利要求7所述的抗体偶联物，其特征在于，所述偶联部分选自纯化标签或标记。
9.根据权利要求7所述的抗体偶联物，其特征在于，所述偶联部分包括选自胶体金、放射性标记、磷光化学剂、化学发光剂、荧光素、酶、天然毒素、核酸、多肽和亲和标记物中的至少之一；和/或
所述偶联部分包括选自磁珠、磁性微球、塑料微球、塑胶微粒、微孔板、尼龙和硝酸纤维素膜中的至少之一。
10.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1~6任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
11.一种表达载体，其特征在于，包含权利要求10所述的核酸分子。
12.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞包含权利要求10所述的核酸分子，权利要求11所述的表达载体或者表达权利要求1~6任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
13.一种制备权利要求1~6任一项所述的抗体或其抗原结合片段的方法，其特征在于，所述方法包括培养权利要求12所述的重组细胞。
14.一种试剂或试剂盒，其特征在于，所述试剂或试剂盒包含权利要求1~6任一项所述的抗体或其抗原结合片段或权利要求7~9任一项所述的抗体偶联物。
15.权利要求1~6任一所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求7~9任一项所述的抗体偶联物或利要求14所述的试剂或试剂盒在检测CD45、制备检测CD45的产品或诊断CD45相关疾病的产品中的用途。
16.一种检测测试样品中CD45的方法，其特征在于，所述方法包括将权利要求1~6任一项所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求7~9任一项所述的抗体偶联物或权利要求14所述的试剂或试剂盒与待检测样品中的CD45抗原接触，形成免疫复合物。
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