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CN120399912A - 产生莨菪烷生物碱(ta)的非植物宿主细胞及其制备和使用方法 - Google Patents

产生莨菪烷生物碱(ta)的非植物宿主细胞及其制备和使用方法

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Publication number
CN120399912A
CN120399912A CN202510184507.5A CN202510184507A CN120399912A CN 120399912 A CN120399912 A CN 120399912A CN 202510184507 A CN202510184507 A CN 202510184507A CN 120399912 A CN120399912 A CN 120399912A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
enzymes
enzyme
scopolamine
engineered
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202510184507.5A
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English (en)
Inventor
克里斯蒂娜·D·斯默克
普拉桑特·斯里尼瓦桑
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Leland Stanford Junior University
Original Assignee
Leland Stanford Junior University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Leland Stanford Junior University filed Critical Leland Stanford Junior University
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Abstract

本文尤其提供了一种工程化的非植物细胞，其产生莨菪烷生物碱产物、莨菪烷生物碱产物的前体，或莨菪烷生物碱产物的衍生物。还描述了一种用于利用细胞产生莨菪烷生物碱、莨菪烷生物碱产物的前体或莨菪烷生物碱产物的衍生物的方法。

Description

产生莨菪烷生物碱(TA)的非植物宿主细胞及其制备和使用 方法
交叉引用
本申请是申请号为202080033469.9、申请日为2020年3月6日、发明名称为“产生莨菪烷生物碱(TA)的非植物宿主细胞及其制备和使用方法”的中国发明专利申请的分案申请，原申请为国际申请号为PCT/US2020/021577的国家阶段申请。
本申请要求2019年3月8日提交的美国临时申请序列号62/815,709、2019年5月15日提交的62/848,419以及2019年8月26日提交的62/891,771的权益，所述申请通过引用并入本文。
政府权利
本发明是在政府支持下根据美国国立卫生研究院授予的GM110699和AT007886合同完成的。美国政府享有本发明的一定权利。
背景技术
莨菪烷生物碱(TA)是由茄科(茄科(Solanaceae))植物产生的一类抗胆碱能次级代谢物。包括阿托品、莨菪碱和东莨菪碱在内的几种TA被世界卫生组织(World HealthOrganization)列为基本药物，以用于治疗各种神经系统病症，诸如有机磷和神经性毒剂中毒、胃肠痉挛和心律失常，以及控制帕金森病的症状。因此，充足且稳定地供应这些TA分子使得研究人员和医生可以使用它们是很有意义的。当前药用TA的供应链依赖于从不可持续且受地理限制的单一栽培植物中提取，其中TA仅占0.2-4％干重，并且所述植物容易受到害虫、土地用途变化和气候的影响。由于TA立体化学带来的困难，尚未证明由简单原料进行TA的总化学合成对于工业用途是足够经济的。此外，迄今为止，规模经济不佳和世代时间长已使得工程化具有提高的TA产量的转基因植物或植物培养物成为获取这些化合物的不可行策略。因此，用于制备TA的方法是令人感兴趣的。
发明内容
本发明包括被工程化以用于由前体和糖产生各种莨菪烷生物碱(TA)的非植物生物体。例如，本发明包括用于产生药用TA的工程化的微生物菌株，所述药用TA在此定义为在当前医疗实践中具有确定用途的天然存在的TA，包括莨菪碱、阿托品、山莨菪碱和东莨菪碱，以及其前体和衍生物。本发明还包括用于产生非药用TA的工程化的微生物菌株，所述非药用TA在此定义为在当前医疗实践中没有确定用途但可具有药用上感兴趣的生物活性的天然存在的TA，包括打碗花精(calystegine)、可卡因，以及其前体和衍生物。本发明还包括用于产生非天然TA的工程化的微生物菌株，所述非天然TA在此定义为不由未修饰的生物体产生的TA，诸如通过在天然存在的生物体中未酯化的酰基供体和酰基受体化合物的酯化产生的TA，包括药用TA的衍生物和非药用TA的衍生物。本发明中包括的方案的实例在图1-3中详述。
本发明包括使用被工程化以表达作为微生物催化剂的至少一种异源酶的微生物来产生假托品和衍生自假托品的生物碱(例如打碗花精)的方法。本发明还包括使用被工程化以表达作为微生物催化剂的至少一种异源酶的微生物来产生可以用作TA支架的生物合成的酰基供体的各种化合物的方法。本发明还包括使用被工程化以表达作为微生物催化剂的至少一种异源酶的微生物来酯化用于产生TA支架的酰基供体和受体的方法。本发明还包括修饰和培养工程化的微生物菌株以用于产生药用TA诸如莨菪碱和东莨菪碱、非药用TA诸如打碗花精，以及非天然TA诸如由托品与除3-苯乳酸(PLA)之外的酰基供体化合物的酯化衍生的那些的方法。
提供了被工程化以产生感兴趣的莨菪烷生物碱(TA)诸如莨菪碱和东莨菪碱的宿主细胞。感兴趣的TA可包括TA前体、TA，以及TA的修饰物(modifications)，包括TA的衍生物。宿主细胞可具有选自以下的一种或多种修饰：酶基因中的反馈抑制缓解突变；生物合成酶基因的转录调节修饰；酶中的失活突变；以及异源编码序列。还提供了使用宿主细胞产生感兴趣的TA的方法以及可用于本发明的方法中的组合物，例如试剂盒、系统等。
本发明的一个方面提供了一种用于形成具有莨菪烷生物碱(TA)产物的产物流的方法。所述方法包括向分批反应器中提供工程化的非植物细胞和包括营养物质和水的原料，所述工程化的非植物细胞具有选自由以下组成的组的至少一种修饰：细胞固有的生物合成酶基因中的反馈抑制缓解突变；细胞固有的生物合成酶基因的转录调节修饰；以及细胞固有的酶中的失活突变。此外，所述方法包括在分批反应器中通过将工程化的非植物细胞孵育至少约5分钟的时间段来使工程化的非植物细胞进行发酵，以产生包含TA产物和细胞材料的溶液。所述方法还包括使用至少一个分离单元将TA产物与细胞材料分离，以提供包含TA产物的所述产物流。
在另一方面，本发明提供一种用于形成具有TA产物的产物流的方法。所述方法包括向反应器中提供工程化的非植物细胞和包括营养物质和水的原料。所述方法还包括，在反应器中，通过将工程化的酵母细胞孵育至少约5分钟(例如，5分钟或更长时间)的时间段来使工程化的非植物细胞进行发酵，以产生包括细胞材料和TA产物的溶液。此外，所述方法包括使用至少一个分离单元将TA产物与细胞材料分离，以提供包含TA产物的产物流。
本发明的另一方面提供了一种产生莨菪烷生物碱(TA)产物的工程化的非植物细胞，所述工程化的非植物细胞具有选自由以下组成的组的至少一种修饰：细胞固有的生物合成酶基因中的反馈抑制缓解突变；细胞固有的生物合成酶基因的转录调节修饰；以及细胞固有的酶中的失活突变。工程化的非植物细胞包含编码至少一种酶的至少一个异源编码序列，所述酶选自下组：精氨酸脱羧酶、胍丁胺脲水解酶、胍丁胺酶、腐胺N-甲基转移酶、N-甲基腐胺氧化酶、吡咯烷酮合酶(pyrrolidine ketide synthase)、托品酮合酶、细胞色素P450还原酶、托品酮还原酶、苯丙酮酸还原酶、3-苯基乳酸UDP-葡糖基转移酶84A27、利托林(littorine)合酶、利托林变位酶、莨菪碱脱氢酶、莨菪碱6β-羟化酶/双加氧酶以及可卡因合酶。在一些实例中，工程化的非植物细胞包含编码酶的多个异源编码序列，所述酶选自下组：精氨酸脱羧酶、胍丁胺脲水解酶、胍丁胺酶、腐胺N-甲基转移酶、N-甲基腐胺氧化酶、吡咯烷酮合酶、托品酮合酶、细胞色素P450还原酶、托品酮还原酶、苯丙酮酸还原酶、3-苯基乳酸UDP-葡糖基转移酶84A27、利托林合酶、利托林变位酶、莨菪碱脱氢酶、莨菪碱6β-羟化酶/双加氧酶以及可卡因合酶。在一些实例中，异源编码序列可以可操作地连接。可操作地连接的异源编码序列可处于产生特定莨菪烷生物碱产物的相同途径内。在一些实例中，工程化的非植物细胞包含对细胞内区室化的一种或多种改良，其选自包括但不限于以下的组：酶的改良的细胞内运输、酶的改良的细胞内定位以及代谢物的改良的细胞内转运。
在本发明的另一方面，提供了一种治疗剂。所述治疗剂包括莨菪烷生物碱产物。
附图说明
当结合附图阅读时，可以根据以下详细描述最好地理解本发明。应强调的是，根据惯例，附图的各种特征不是按比例绘制的。相反，为了清楚起见，各种特征的尺寸被任意扩大或缩小。附图包括以下图解。
图1示出用于将L-精氨酸转化为非药用TA的示例性生物合成方案。ADC，精氨酸脱羧酶；ARG，精氨酸酶；AUH，胍丁胺脲水解酶；ODC，鸟氨酸脱羧酶；PAO，多胺氧化酶；PMT，腐胺N-甲基转移酶；MPO，N-甲基腐胺氧化酶；spont.，自发(非酶促)步骤；PYKS，吡咯烷酮合酶；CYP82M3，托品酮合酶；CPR，细胞色素P450-NADP+还原酶；TR2，托品酮还原酶2；P450，细胞色素P450。精氨酸、鸟氨酸、精胺、亚精胺和腐胺在酵母中天然合成。所示出的所有其他代谢物都不是在酵母中天然产生的。方框内部指出的最终产物是非药用TA的实例。
图2示出示例性的生物合成途径，通过所述途径可以将氨基酸转化为感兴趣的药用TA分子及其前体分子。此实例示出L-精氨酸和L-苯丙氨酸向药用TA的转化。ADC，精氨酸脱羧酶；ARG，精氨酸酶；AUH，胍丁胺脲水解酶；ODC，鸟氨酸脱羧酶；PAO，多胺氧化酶；PMT，腐胺N-甲基转移酶；MPO，N-甲基腐胺氧化酶；spont.，自发(非酶促)步骤；PYKS，吡咯烷酮合酶；CYP82M3，托品酮合酶；CPR，细胞色素P450-NADP+还原酶；TR1，托品酮还原酶1；ArAT，芳香族氨基转移酶；PPR，苯丙酮酸还原酶；UGT84A27，3-苯基乳酸UDP-葡糖基转移酶；LS，利托林合酶；CYP80F1，利托林变位酶；HDH，(S)-莨菪碱脱氢酶；H6H，(S)-莨菪碱6β-羟化酶/双加氧酶。精氨酸、鸟氨酸、精胺、亚精胺、腐胺、苯丙氨酸、3-苯基丙酮酸和痕量的3-苯基乳酸在酵母中天然合成。所示出的所有其他代谢物都不是在酵母中天然产生的。方框内部指出的最终产物是药用TA的实例。
图3示出示例性的生物合成途径，通过所述途径可以将氨基酸转化为非药用TA及其前体分子。在此实例中，L-精氨酸和L-苯丙氨酸转化为非天然TA。ADC，精氨酸脱羧酶；ARG，精氨酸酶；AUH，胍丁胺脲水解酶；ODC，鸟氨酸脱羧酶；PAO，多胺氧化酶；PMT，腐胺N-甲基转移酶；MPO，N-甲基腐胺氧化酶；spont.，自发(非酶促)步骤；PYKS，吡咯烷酮合酶；CYP82M3，托品酮合酶；CPR，细胞色素P450-NADP+还原酶；TR1，托品酮还原酶1；PAL，苯丙氨酸解氨酶；4CL，4-香豆酸-CoA连接酶；CS，可卡因合酶。精氨酸、鸟氨酸、精胺、亚精胺、腐胺和苯丙氨酸在酵母中天然合成。所示出的所有其他代谢物都不是在酵母中天然产生的。方框内部指出的最终产物是非天然TA的实例。
图4示出用于由氨基酸和其他多胺分子产生腐胺的示例性生物合成途径。该图示出可以如何使用内源酵母和异源生物合成途径由中央代谢物制备腐胺。
图5示出被工程化以过表达参与精氨酸和多胺代谢的内源生物合成酶的酵母菌株可以在液体培养物中产生腐胺。在野生型酵母(CEN.PK2)中由低拷贝质粒表达天然基因的另外拷贝。在LC-MS/MS分析之前，将转化菌株在具有2％右旋糖的选择性培养基中于30℃下培养48h。所有数据代表至少三个生物学重复的平均值，并且误差条显示标准偏差。学生双尾t检验：*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。除非另外指出，否则示出相对于相应对照(即，CEN.PK2)的统计显著性。
图6示出被工程化以异源表达参与精氨酸和多胺代谢的来自除酵母之外的生物体的生物合成酶的酵母菌株可以在液体培养物中产生腐胺。在此实例中，酵母菌株被工程化，以表达来自植物和细菌的异源生物合成途径。在野生型酵母中由低拷贝质粒表达异源酶。在LC-MS/MS分析之前，将转化菌株在具有2％右旋糖的选择性培养基中于30℃下培养48h。所有数据代表至少三个生物学重复的平均值，并且误差条显示标准偏差。学生双尾t检验：*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。除非另外指出，否则示出相对于相应对照(即，CEN.PK2)的统计显著性。
图7示出被工程化以异源表达参与精氨酸和多胺代谢的来自除酵母之外的生物体的生物合成酶的酵母菌株可以在液体培养物中产生TA前体和中间体胍丁胺、N-氨基甲酰腐胺和腐胺。该图示出胍丁胺/腐胺生物合成途径基因在酵母中的功能验证。将野生型酵母菌株CEN.PK2用三种低拷贝质粒转化，以在零(阴性对照)与三种指定生物合成基因之间共表达。表达蓝色荧光蛋白(BFP)的质粒用作三种营养缺陷型选择标志物URA3、TRP1和LEU2中的每一种的阴性对照。在对代谢物产量进行LC-MS/MS分析之前，将转化菌株在具有2％右旋糖的选择性培养基中于30℃下培养48h。所有数据均示出相对于阴性对照(CEN.PK2)通过LC-MS/MS峰面积测量的滴度。数据代表三个生物学重复的平均值，并且误差条显示标准偏差。
图8示出在正常酵母生长过程中严格控制细胞内腐胺水平的内源性调控途径。
图9示出酵母菌株中腐胺产生的热图，其中内源性多胺生物合成调控机制被破坏。对于天然或异源腐胺途径的过表达，在野生型酵母(WT)或各个单破坏菌株中由低拷贝质粒表达指定基因。在LC-MS/MS分析之前，将菌株在具有2％右旋糖的选择性(YNB-DO)培养基中于30℃下培养72h。所有数据代表至少三个生物学重复的平均值。该图显示，具有多胺代谢基因的单破坏和过表达的内源性或异源性腐胺生物合成途径的酵母菌株可以在液体培养物中产生腐胺。
图10提供了用于提高酵母中的腐胺产量的工程化努力的汇总。‘+’符号指示来自该途径的至少一种基因的表达，而‘–’指示没有来自该途径的基因表达。在LC-MS/MS分析之前，将菌株在具有2％右旋糖的选择性培养基中于30℃下培养48h。所有数据代表至少三个生物学重复的平均值，并且误差条显示标准偏差。学生双尾t检验：*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。除非另外指出，否则示出相对于相应对照(即，CEN.PK2)的统计显著性。
图11示出LC-MS/MS色谱图，其示出根据本发明的实施方案，在工程化酵母中，腐胺通过中间体NMP和4MAB逐步转化为TA中间体NMPy和副产物4MAB酸。示出通过内源性酵母酶(ALD)的活性形成4MAB酸副产物的建议机制。示出沿该途径的每种代谢物和使用每种代谢物的最高前体离子/产物离子转变的真正标准品(authentic standards)的提取离子色谱图MRM迹线。对照代表在低拷贝质粒上表达SPE1、AsADC和speB的菌株CSY1235(参见实施例1.5)。色谱图迹线代表三个生物学重复。酶符号：PMT，腐胺N-甲基转移酶；MPO，N-甲基腐胺氧化酶；ALD，醛脱氢酶。
图12示出LC-MS/MS色谱图，其示出根据本发明的实施方案，表达AbPMT1和MPO酶的工程化酵母的液体培养物中TA前体(A)腐胺、(B)NMP、(C、E)4MAB和(D、F)NMPy的相对产量。(A)含有pCS4239以过量产生腐胺的CSY1235的腐胺(m/z+89→72)的MRM色谱图。(B)含有pCS4239并由低拷贝质粒表达AbPMT1的CSY1235的NMP(m/z+103→72)的MRM色谱图。(C、D)含有pCS4239并由低拷贝质粒表达AbPMT1和NtMPO1的CSY1235的4MAB(m/z+102→71)和NMPy(m/z+84→57)的相应MRM色谱图。(E、F)含有pCS4239并由低拷贝质粒表达AbPMT1和DmMPO1ΔC-PTS1的CSY1235的4MAB(m/z+102→71)和NMPy(m/z+84→57)的相应MRM色谱图。迹线的Y轴是原始MRM离子计数。在具有2％右旋糖的选择性培养基中于30℃下生长48小时后，通过细胞外介质的LC-MS/MS分析生成所有色谱图。迹线代表至少三个生物学重复。
图13示出MEU1破坏对通过AbPMT1进行的SAM依赖性腐胺N-甲基化的影响。将野生型菌株CEN.PK2或meu1破坏菌株CSY1229用表达SPE1、AsADC以及speB和AbPMT1的低拷贝质粒共转化。数据指出相对于CEN.PK2对照的平均NMP滴度，如在具有2％右旋糖的选择性培养基中在30℃下生长48小时后通过3个生物学重复的LC-MS/MS峰面积所定量。误差条显示标准偏差。学生双尾t检验：*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。
图14示出使用SherLoc2网络服务器对植物和酵母/真菌细胞中NMPy生物合成基因的亚细胞定位进行的计算机模拟预测。值和涂色表示定位到以下每个区室的概率分数(0至1)：CYT，胞质溶胶；NUC，细胞核；VAC，液泡；CHL，叶绿体；MIT，线粒体；POX，过氧化物酶体。
图15示出根据本发明的实施方案(A)带有N端和C端GFP标签的NtMPO1与PEX3过氧化物酶体标志物的共定位，以及(B)NtMPO1的N端和C端GFP标签化对工程化酵母的液体培养物中TA前体4MAB和NMPy的产量的影响。该图示出NtMPO1亚细胞定位的实验验证。(A)在野生型酵母(CEN.PK2)中与过氧化物酶体标志物mCherry-PEX3共表达的NtMPO1N端和C端GFP融合体的荧光显微镜检查。白色箭头指示带有GFP标签的NtMPO1与过氧化物酶体的共定位。比例尺，10μm。(B)NtMPO1的强制胞质溶胶定位对4MAB或NMPy产量的影响。将野生型酵母(CEN.PK2)用表达野生型NtMPO1或N端或C端GFP融合体的低拷贝质粒以及表达SPE1、AsADC以及speB和AbPMT1的低拷贝质粒共转化。在具有2％右旋糖的选择性培养基中在30℃下生长48小时后进行LC-MS/MS分析。数据代表三个生物学重复的平均值；误差条显示标准偏差。最可能的亚细胞区室是基于(a)中的显微镜检查数据指出的。
图16提供描绘AbPMT1和NtMPO1当在酵母中异源表达时的亚细胞定位的荧光显微镜检查数据。对由低拷贝质粒表达带有N端或C端GFP标签的AbPMT1或NtMPO1的野生型酵母进行显微镜检查。比例尺，10μm。
图17示出根据本发明的实施方案(A)NtMPO1和从植物转录组数据鉴定的推定的MPO酶AbMPO1和DmMPO1的序列比对(从上到下：SEQ ID NO:27-29)，(B)表达NtMPO1、AbMPO1或DmMPO1的工程化的酵母菌株的液体培养物中TA前体4MAB和NMPy的产量的比较，以及(C)由同源性建模确定的NtMPO1、AbMPO1和DmMPO1的预测三维结构的比较。(A)查询NtMPO1序列与来自1000Plants Project数据库的AbMPO1和DmMPO1候选物的比对。蓝色指示氨基酸结构的保守；红色指示不匹配。(B)MPO直系同源物的相对活性的比较。将过量产生腐胺的菌株(Putrescine overproducing strain)CSY1235(参见实施例1.5)用表达SPE1、AsADC和speB、AbPMT1以及三种MPO变体中的一种的低拷贝质粒共转化。在选择性培养基中，在30℃下生长48小时后进行LC-MS/MS分析。数据代表三个生物学重复的平均值；误差条显示标准偏差。(C)使用RaptorX网络服务器，基于豌豆(Pisum sativum)含铜氨基氧化酶的晶体结构(PDB：1KSI，蓝色)构建的MPO酶(粉色)的同源性模型。顶部：NtMPO1；中心：AbMPO1；底部：DmMPO1。
图18示出过量产生腐胺并表达AbPMT1以及NtMPO1和DmMPO1的N端和C端截短物的工程化的酵母菌株的液体培养物中的4MAB产量。该图示出甲基腐胺氧化酶的N端和C端截短物对工程化酵母中的4MAB产量的影响。在过量产生腐胺的菌株CSY1235中由低拷贝质粒表达野生型(WT)酶和所指示的截短物(参见实施例1.5)。在LC-MS/MS分析之前，将菌株在具有2％右旋糖的选择性培养基中于30℃下培养48h。所有数据代表至少三个生物学重复的平均值，并且误差条显示标准偏差。学生双尾t检验：*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。
图19示出含有四种天然醛脱氢酶基因中的一种的单破坏的工程化酵母菌株的液体培养物中TA前体4MAB和NMPy以及副产物4MAB酸的产量。该图示出破坏单个醛脱氢酶对4MAB酸积累的影响。将过量产生腐胺的菌株CSY1235(对照)或具有hfd1、ald4、ald5或ald6的无义突变破坏的子菌株用表达SPE1、AsADC以及speB、AbPMT1和DmMPO1ΔC-PTS1的低拷贝质粒转化。条柱指示相对4MAB酸滴度，如通过在选择性培养基中在30℃下生长48小时后针对CSY1235(无ALD破坏)归一化的LC-MS/MS峰面积所测量的。数据代表三个生物学重复的平均值，并且误差条显示标准偏差。学生双尾t检验：*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。
图20示出含有天然醛脱氢酶的一种或多种破坏的工程化酵母菌株的液体培养物中(A)4MAB酸副产物以及(B)TA前体4MAB和NMPy的产量。该图示出醛脱氢酶基因破坏对工程化酵母中的(A)4MAB酸副产物以及(B)4MAB和NMPy的产量的影响。‘+’和‘–’符号分别指示功能酶的存在或不存在。在LC-MS/MS分析之前，将菌株在具有2％右旋糖的选择性(YNB-DO)培养基中于30℃培养48h。所有数据代表至少三个生物学重复的平均值，并且误差条显示标准偏差。学生双尾t检验：*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。除非另外指出，否则示出相对于相应对照(CSY1235)的统计显著性。
图21示出根据本发明的实施方案，在腐胺过量产生基因AbPMT1和DmMPO1截短物的基于低拷贝质粒的表达或基因组表达的情况下，工程化酵母菌株的液体培养物中的TA前体NMPy的产量的比较。该图提供了在NMPy生物合成基因的基于质粒的表达(CSY1241)和基因组表达(CSY1243)的情况下，4MAB和NMPy产量的比较。将菌株CSY1241用表达腐胺过量产生基因(SPE1、AsADC、speB)、AbPMT1和DmMPO1ΔC-PTS1的低拷贝质粒转化。菌株CSY1243由基因组整合的拷贝表达所有上述基因。在选择性(CSY1241)或非选择性(CSY1243)培养基中在30℃下生长48h后，通过LC-MS/MS对NMPy水平定量。数据代表至少两个生物学重复的平均值，并且误差条指示标准偏差。
图22示出根据本发明的实施方案由NMPy和MPOB产生副产物古豆碱的生物合成途径。酵母中推定的主要和次要副反应分别用粗体和虚线箭头指示。
图23示出表达基于低拷贝质粒的AbPYKS、AbCYP82M3、DsTR1和四种不同CPR中的一种的工程化酵母菌株的液体培养物中TA前体托品酮和托品以及副产物古豆碱的产量的比较。该图示出在工程化酵母中表达AbPYKS、AbCYP82M3和DsTR1的情况下托品和相关中间体的产量。指定基因在CSY1246中由低拷贝质粒表达；‘+’和‘–’符号指示酶的存在或不存在。在LC-MS/MS分析之前，将菌株在具有2％右旋糖的选择性培养基中于30℃培养48h。数据代表三个生物学重复的平均值，并且误差条显示标准偏差。学生双尾t检验：*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。
图24示出(A)LC-MS/MS色谱图，其示出在工程化的酵母菌株的液体培养物中产生的TA前体MPOB的特征三重峰，以及(B)被工程化以由质粒表达AbPYKS、AbCYP82M3和四种CPR中的一种的酵母菌株的液体培养物中的TA前体NMPy和MPOB的产量。该图示出NMPy和MPOB在表达AbPYKS的工程化菌株的培养基中的积累。(A)代表性LC-MS/MS多反应监测(MRM)色谱图，其用于检测由低拷贝质粒仅表达AbPYKS的CSY1246的细胞外介质中的MPOB。三个特征性MPOB同种型峰用(I)、(II)和(III)标记。在选择性培养基中于30℃下生长48h后进行LC-MS/MS分析。(B)在选择性培养基中于30℃下生长48h后，由低拷贝质粒表达AbPYKS、AbCYP82M3和四种CPR中的一种的CSY1246的细胞外介质中的NMPy和MPOB的相对丰度(所有3个峰)。‘+’和‘–’符号指示基因的存在或不存在。数据代表三个生物学重复的平均值；误差条指示标准偏差。
图25示出生长温度对工程化酵母的液体培养物中TA前体托品和副产物古豆碱的产量的影响。该图示出生长温度对产托品的酵母菌株(CSY1248)中的自发古豆碱产量的影响。相对选择性代表相对托品滴度与相对古豆碱滴度的比率。在LC-MS/MS分析之前，将菌株在具有2％右旋糖的非选择性培养基中于30℃或25℃培养48h。数据代表三个生物学重复的平均值，并且误差条显示标准偏差。学生双尾t检验：*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。
图26示出根据本发明的实施方案(A)ALD4和ALD6重构对产托品的工程化酵母菌株在补充或不补充乙酸盐的培养基上的生长的影响，以及(B)消除乙酸盐营养缺陷型对产托品的工程化酵母菌株的液体培养物中副产物4MAB酸和古豆碱的产量的影响。该图示出在工程化的产托品酵母菌株中消除乙酸盐营养缺陷型的效果。(A)在补充和不补充乙酸盐的情况下，重构功能性ALD4或ALD6基因对产NMPy的酵母菌株(CSY1246)的生长的影响。ALD4和ALD6由低拷贝质粒表达。‘WT’指示具有对照(BFP)质粒的CSY1246。相邻列示出十倍稀释液。(B)在工程化酵母中通过重构的乙酸盐代谢获得的4MAB酸和古豆碱副产物的产量。‘+’和‘–’符号指示存在或不存在补料代谢物(乙酸盐)或由低拷贝质粒表达的ALD4和ALD6基因。在LC-MS/MS分析之前，将菌株在具有2％右旋糖的选择性(YNB-DO)培养基中于30℃培养48h。数据代表三个生物学重复的平均值，并且误差条显示标准偏差。学生双尾t检验：*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。
图27示出根据本发明的实施方案(A)乙酸盐营养缺陷型对被工程化以产生托品的酵母菌株的液体培养物中NMPy与托品酮之间的TA前体的积累的影响，以及(B)在具有和不具有乙酸盐营养缺陷型的被工程化以产生托品的酵母菌株的液体培养物中产生的TA前体MPOB的代表性LC-MS/MS色谱图。该图示出重构ALD6活性对工程化酵母中通过NMPy朝向托品的代谢物通量的影响。(A)具有和不具有功能性Ald6p的工程化菌株中NMPy与托品酮之间的中间体的产量。中间体丰度是通过LC-MS/MS MRM在持续48h在25℃下生长于补充有0.1％w/v乙酸钾(灰色)的非选择性培养基中的产托品的整合菌株(CSY1248)或持续48h在25℃下生长于未补充乙酸盐(粉色)的非选择性培养基中的具有重构的ALD6的产托品菌株(CSY1249)的细胞外介质中测量的。数据代表三个生物学重复的平均值；误差条指示标准偏差。学生双尾t检验：*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。(B)来自如(a)中所述进行培养的CSY1248(灰色)和CSY1249(红色)的MPOB产量的代表性MRM色谱图。
图28示出对工程化酵母菌株的液体培养物中的TA前体托品和副产物古豆碱的产量的改善的进展。该图提供被工程化以增加酵母中的托品产量的菌株的汇总。‘-’符号指示不存在基因；‘p’和‘i’分别指示来自低拷贝质粒或基因组整合的基因表达。在LC-MS/MS分析之前，将菌株在具有2％右旋糖的选择性或非选择性培养基中于30℃或25℃培养48h。数据代表三个生物学重复的平均值，并且误差条显示标准偏差。学生双尾t检验：*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。
图29示出根据本发明的实施方案，表达异源生物合成酶PMT、MPO、PYKS和CYP82M3的另外拷贝对工程化酵母的液体培养物中腐胺与托品之间的每种TA前体的产量的影响。该图鉴定了经优化的产托品菌株(CSY1249)中的代谢瓶颈。用表达BFP(“无过表达”)的对照质粒或表达AbPMT1、DmMPO1ΔC-PTS1、AbPYKS或AbCYP82M3的另外拷贝的低拷贝质粒转化菌株CSY1249。在选择性培养基中在25℃下生长48h后，通过LC-MS/MS对细胞外介质中的中间体水平进行定量。数据指示三个生物学重复的平均值，并且误差条显示标准偏差。
图30示出瓶颈酶PMT和PYKS的另外拷贝对工程化酵母中的托品产量的影响。该图示出通过PMT和PYKS酶的另外拷贝的基因组整合来缓解代谢瓶颈。在对生长培养基进行LC-MS/MS分析之前，将产托品菌株CSY1249和CSY1251在非选择性培养基中于25℃培养48h。数据代表三个生物学重复的平均值，并且误差条显示标准偏差。学生双尾t检验：*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。
图31示出表达异源乳酸脱氢酶和苯丙酮酸还原酶的工程化酵母菌株的液体培养物中TA前体酰基供体化合物PLA的产量。该图示出被工程化以将L-苯丙氨酸转化为3-苯基乳酸的酵母菌株的LC-MS/MS分析。酵母菌株被工程化成具有低拷贝CEN/ARS质粒，所述质粒含有LEU2选择标志物、TDH3启动子以及以下各项的编码序列：作为阴性对照的BFP；来自凝结芽孢杆菌(B.coagulans)(BcLLDH)、干酪乳杆菌(L.casei)(LcLLDH)、植物乳杆菌(L.plantarum)(LpLLDH)的LDH变体；或来自颠茄(A.belladonna)(AbPPR)、植物乳杆菌(LpPPR)、大肠杆菌(Escherichia coli)(hcxB)或荧光威克酵母(W.fluorescens)(WfPPR)的PPR变体。使来自新鲜转化的菌落的酵母在96孔深孔微量滴定板中的300μL选择性培养基(-Leu)中生长。在25℃和460rpm下在振荡培养箱中生长72小时后，将酵母沉淀并通过LC-MS/MS分析培养基上清液。数据示出基于提取离子色谱图(铵加合物，EIC m/z+＝184)针对阴性对照中存在的痕量水平归一化的相对3-苯基乳酸滴度。数据代表三个生物学重复的平均值，并且误差条显示标准偏差。学生双尾t检验：*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。
图32示出LC-MS/MS色谱图，其示出表达苯丙氨酸解氨酶的工程化酵母菌株的液体培养物中TA前体酰基供体化合物肉桂酸的产生。该图示出被工程化以将L-苯丙氨酸转化为肉桂酸的酵母菌株的LC-MS/MS分析。酵母菌株被工程化成具有低拷贝CEN/ARS质粒，所述质粒含有TRP1选择性标志物、TEF1启动子以及(i)BFP或(ii)拟南芥(A.thaliana)苯丙氨酸解氨酶(AtPAL1)的编码序列。使来自新鲜转化的菌落的酵母在96孔深孔微量滴定板中的300μL选择性培养基(-Trp)中生长。在30℃和460rpm下在振荡培养箱中生长48小时后，将酵母沉淀并通过LC-MS/MS分析培养基上清液。色谱图迹线基于肉桂酸的丰度最大的多反应监测(MRM)转变(m/z+149→131)示出由这些菌株产生的肉桂酸。每条迹线代表三个样品。
图33示出在工程化酵母中表达的来自产TA茄科植物的UDP-葡糖基转移酶84A27(UGT84A27)直系同源物的底物特异性。该图示出UGT84A27直系同源物对在工程化的酵母中表达的三种不同苯丙烷(phenylpropanoid)化合物的活性的比较。(A)在工程化的酵母中作为UGT84A27的葡萄糖(Glu)受体测试的苯丙烷。顶部，(D)-3-苯基乳酸(PLA)；中间，反式肉桂酸(CA)；底部，反式阿魏酸(FA)。(B)通过被工程化以表达UGT84A27的酵母实现的补料苯丙烷向葡糖苷的转化的百分比的热图。在CSY1251中由低拷贝质粒表达UGT84A27直系同源物或BFP阴性对照。在LC-MS/MS分析之前，将转化细胞在补充有500μM PLA、CA或FA的选择性培养基中培养72h。数据代表n＝3个生物学独立样品的平均值±标准偏差。
图34示出UGT84A27活性的色谱和质谱分析的实例。该图示出代表性LC-MS/MS迹线，其示出在如图33B中那样培养120h的CSY1251中通过AbUGT将PLA、CA和FA转化为同源葡糖苷，以实现更完全的葡糖基化。对于PLA，酸(每个小图中的顶部迹线)和葡糖苷(每个小图中的底部迹线)通过不同的NH4 +加合物母体质量(parent masses)以及不同的保留时间进行区分。对于CA和FA，快速碎片化(fragmentation)需要基于其苯丙烷碎片产生的较低保留峰来检测葡糖苷。
图35示出用以改变底物特异性的AbUGT的结构引导的活性位点工程化。该图示出AbUGT 3D结构的结构分析，以鉴定增加对PLA的活性的潜在突变。(A)基于具有结合的UDP的拟南芥水杨酸UDP-葡糖基转移酶UGT74F2的晶体结构(PDB：5V2K)构建的AbUGT84A27的同源性模型。基于对接模拟，PLA(橙色)以具有UDP-葡萄糖(粉色)的优选结合姿势示出。(B)具有对接的D-PLA和UDP-葡萄糖的AbUGT活性位点的放大视图。示出被鉴定改善PLA选择性(F130Y、L205F、I292Q)的潜在突变；虚线指示推定的极性/氢键相互作用。
图36示出AbUGT84A27活性位点突变体的底物特异性。此图示出通过被工程化以表达AbUGT突变体的酵母实现的补料苯丙烷向葡糖苷的转化的百分比的热图。在CSY1251中由低拷贝质粒表达AbUGT野生型、活性位点突变体或BFP阴性对照。在LC-MS/MS分析之前，将转化细胞在补充有500μM PLA、CA或FA的选择性培养基中培养72h。数据代表n＝3个生物学独立样品的平均值±标准偏差。
图37示出LC-MS/MS色谱图，其验证了PLA葡糖苷在被工程化以产生托品的酵母中的逐步生物合成。该图示出来自被工程化以逐步重构PLA葡糖苷的酵母菌株的培养基的多反应监测(MRM)和提取离子色谱图(EIC)迹线。在培养物上清液的LC-MS/MS分析之前，使菌株在非选择性培养基中生长72h。色谱图迹线代表三个生物学重复。
图38示出酵母中葡萄糖的双重代谢命运的生物合成途径示意图。此图示出柠檬酸盐通过抑制糖酵解对葡糖苷产生的影响。缩写：HXK，己糖激酶；GPI，葡萄糖-6-磷酸异构酶；PFK，磷酸果糖激酶；PGM，磷酸葡萄糖变位酶；UGP，UDP-葡萄糖焦磷酸化酶。
图39示出补充柠檬酸盐对工程化酵母中的异源葡糖苷产生的影响。此图示出补充2％柠檬酸盐对通过被工程化表达AbUGT的酵母实现的苯丙烷酸向葡糖苷的转化的影响。将菌株CSY1288在具有或不具有2％柠檬酸盐且没有另外补充(以评估内源性产生的PLA的葡糖基化)或补充了500μM反式肉桂酸(CA)或反式阿魏酸(FA)的非选择性培养基中培养。在LC-MS/MS分析之前，使培养物生长72h。数据代表n＝3个生物学独立样品的平均值(空心圆圈)并且误差条显示标准偏差。学生双尾t检验：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
图40示出被工程化以过表达UDP-葡萄糖生物合成酶的酵母菌株中的相对PLA葡糖苷产量。此图示出过表达参与葡糖苷前体UDP-葡萄糖的生物合成的天然酶对工程化酵母中的PLA葡糖苷的产量的影响。在菌株CSY1288中由低拷贝质粒表达酶或阴性对照(BFP)。在培养物上清液中的代谢物的LC-MS/MS分析之前，将菌株在选择性培养基中培养72h。数据代表n＝3个生物学独立样品的平均值(空心圆圈)并且误差条显示标准偏差。学生双尾t检验：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。相对于相应的对照示出统计显著性。
图41示出具有内源葡糖苷酶的破坏的CSY1288中的相对PLA葡糖苷产量。此图示出破坏三种天然葡糖苷酶基因中的每一种对工程化的酵母中的PLA葡糖苷积累的影响。在培养物上清液的LC-MS/MS分析之前，将菌株在非选择性培养基中培养72h。数据代表n＝3个生物学独立样品的平均值(空心圆圈)并且误差条显示标准偏差。学生双尾t检验：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。相对于相应的对照示出统计显著性。
图42示出LC-MS/MS色谱图，其示出在表达AbCYP80F1的工程化酵母细胞的液体培养物中由利托林产生药用TA前体莨菪醛。此图示出被工程化以将(R)-利托林转化为莨菪醛的酵母菌株的LC-MS/MS分析。酵母菌株被工程化成具有低拷贝CEN/ARS质粒，所述质粒含有LEU2选择性标志物、TDH3启动子以及来自颠茄的利托林变位酶CYP80F1(AbCYP80F1)的编码序列。菌株还具有第二低拷贝质粒，所述质粒含有TRP1选择标志物、TDH3启动子以及以下各项的编码序列：(i)作为阴性对照的BFP，(ii)酿酒酵母CPR(NCP1)，或(iii)拟南芥CPR(AtATR1)。使来自新鲜转化的菌落的酵母在96孔深孔微量滴定板中的补充有1mM利托林的300μL选择性培养基(-Leu–-Trp)中生长。在30℃和460rpm下在振荡培养箱中生长48小时后，将酵母沉淀并通过LC-MS/MS分析培养基上清液。色谱图迹线基于丰度最大的MRM转变(m/z+288→124)示出由这些菌株产生的莨菪醛。箭头指示推定的莨菪醛峰。每条迹线代表三个样品。
图43示出在表达莨菪碱6β-羟化酶/双加氧酶(H6H)的直系同源物的工程化酵母细胞的液体培养物中由药用TA莨菪碱产生药用TA东莨菪碱。此图示出通过表达H6H直系同源物的工程化酵母菌株将(S)-莨菪碱转化为(S)-东莨菪碱。酵母菌株被工程化成具有低拷贝CEN/ARS质粒，所述质粒含有LEU2选择标志物、TDH3启动子和作为阴性对照的BFP或者来自大花曼陀罗(D.stramonium)(DsH6H)、三分三(A.acutangulus)(AaH6H)、木本曼陀罗(B.arborea)(BaH6H)或洋金花(D.metel)(DmH6H)的H6H变体的编码序列。使来自新鲜转化的菌落的酵母在96孔深孔微量滴定板中的补充有1mM莨菪碱的300μL选择性培养基(-Leu)中生长。在30℃和460rpm下在振荡培养箱中生长48小时后，将酵母沉淀并通过LC-MS/MS分析培养基上清液。数据代表三个生物学重复的平均值，并针对补料莨菪碱中东莨菪碱污染物的量进行归一化。误差条代表标准偏差。基于m/z+304→138MRM转变的峰面积对相对东莨菪碱滴度进行定量。
图44示出培养基中辅因子的可用性和补充对表达DsH6H的工程化酵母细胞的液体培养物中莨菪碱向东莨菪碱的转化的影响。此图示出补充辅因子对工程化的酵母中(S)-莨菪碱向(S)-东莨菪碱的转化的影响。酵母菌株被工程化成具有低拷贝CEN/ARS质粒，所述质粒含有LEU2选择标志物、TDH3启动子以及以下各项的编码序列：(i)作为阴性对照的BFP，或(iii)来自大花曼陀罗的莨菪碱6β-羟化酶/双加氧酶(DsH6H)。使来自新鲜转化的菌落的酵母在96孔深孔微量滴定板中的补充有指定底物和/或辅因子的300μL选择性培养基(-Leu)中生长。在30℃和460rpm下在振荡培养箱中生长48小时后，将酵母沉淀并通过LC-MS/MS分析培养基上清液。相对(S)-东莨菪碱滴度基于m/z+304→138MRM转变的积分峰面积定量，并针对表达DsH6H并且具有所有所补充的辅因子和底物的菌株进行归一化。数据代表三个生物学重复的平均值，并且误差条指示标准偏差。Hyo，(S)-莨菪碱；2-OG，2-氧戊二酸；L-AA，L-抗坏血酸。
图45示出通过组织共表达数据的分析从颠茄转录组中鉴定的莨菪碱脱氢酶基因候选物的分层聚类热图。此图示出颠茄转录组中的转录本的组织特异性表达谱的聚类，所述转录本可能编码具有莨菪碱脱氢酶活性的酶。每个候选物的转录本表达使用正态分布以行按比例缩放。树状图指示通过组织特异性表达谱获得的候选物的分层聚类。已知的TA途径基因按名称标识；推定的HDH候选物用基因座ID指示。黑色三角形指示针对活性筛选的候选物；双黑色三角形指示具有经实验验证的HDH活性的候选物。
图46示出在表达莨菪碱脱氢酶(HDH)候选物的工程化的酵母细胞的液体培养物中由利托林产生药用TA东莨菪碱。此图示出工程化的酵母中从颠茄转录组中鉴定的HDH候选物的针对活性的实验筛选。酵母菌株被工程化，以由整合到基因组中的表达盒内的组成型启动子表达颠茄利托林变位酶(AbCYP80F1)和大花曼陀罗莨菪碱6β-羟化酶/双加氧酶(DsH6H)，以及由含有TRP1选择标志物和TDH3启动子的低拷贝CEN/ARS质粒表达13个HDH候选物中的每一个。使来自新鲜转化的菌落的酵母在96孔深孔微量滴定板中的补充有1mM利托林的300μL选择性培养基(-Trp)中生长。在30℃和460rpm下在振荡培养箱中生长72小时后，将酵母沉淀并通过LC-MS/MS分析培养基上清液。相对莨菪醛滴度基于m/z+288→124MRM转变的积分峰面积定量，并针对表达BFP而不是HDH候选物的工程化菌株进行归一化。(S)-东莨菪碱滴度基于m/z+304→138MRM转变的积分峰面积和真正的东莨菪碱标准品的标准曲线进行定量。数据代表三个生物学重复的平均值，并且误差条指示标准偏差。
图47示出来自颠茄的莨菪碱脱氢酶的三维结构。此图示出AbHDH的结构的卡通表示，其为基于颤杨(Populus tremuloides)芥子醇脱氢酶(PtSAD；PDB：1YQD)的晶体结构作为模板构建的同源性模型。NADPH和Zn2+示出在活性位点中。插图框示出具有NADPH和对接的莨菪醛的AbHDH活性位点的放大视图。虚线指示对催化很重要的相互作用。
图48示出三个已鉴定的HDH直系同源物(AbHDH、DiHDH、DsHDH)以及UniProt/SwissProt数据库中的最接近的蛋白质命中的系统发生树。此图示出基于UniProt/SwissProt数据库的BLAST搜索，三个已鉴定的HDH酶直系同源物与密切相关的蛋白质序列的聚类。所示出的序列包括基于E值的前50个BLASTp命中，以及从接下来的100个排序中选择的10个另外的命中。系统发生关系是在ClustalX2中使用n＝1000个试验通过bootstrap邻位相连(bootstrap neighbor-joining)推导得到的，并且使用FigTree软件将所得的树可视化。缩写：ADH，醇脱氢酶；CADH，肉桂醇脱氢酶；MTDH，甘露醇脱氢酶；DPAS，dehydroprecondylocarpine乙酸酯合酶(dehydroprecondylocarpine acetatesynthase)；8HGDH，8-羟基香叶醇脱氢酶；GDH，香叶醇脱氢酶；GS，缝籽嗪(geissoschizine)合酶；REDX，未指定的氧化还原蛋白。
图49示出在表达莨菪碱脱氢酶直系同源物的工程化酵母细胞的液体培养物中由利托林产生药用TA东莨菪碱。此图示出在工程化的酵母中表达的经鉴定的HDH酶直系同源物之间的活性比较。酵母菌株被工程化，以由整合到基因组中的表达盒内的组成型启动子表达颠茄利托林变位酶(AbCYP80F1)和大花曼陀罗莨菪碱6β-羟化酶/双加氧酶(DsH6H)，由含有TRP1选择标志物和TDH3启动子的低拷贝CEN/ARS质粒表达3个HDH直系同源物(AbHDH、DiHDH、DsHDH)中的每一个，并且由含有LEU2选择标志物和TDH3启动子的低拷贝CEN/ARS质粒表达DsH6H的另外拷贝。使来自新鲜转化的菌落的酵母在96孔深孔微量滴定板中的补充有1mM利托林的300μL选择性培养基(-Leu-Trp)中生长。在30℃和460rpm下在振荡培养箱中生长72小时后，将酵母沉淀并通过LC-MS/MS分析培养基上清液。相对莨菪醛滴度基于m/z+288→124MRM转变的积分峰面积定量，并针对表达AbHDH和BFP而不是DsH6H的工程化菌株进行归一化。(S)-东莨菪碱滴度基于m/z+304→138MRM转变的积分峰面积和真正的东莨菪碱标准品的标准曲线进行定量。数据代表三个生物学重复的平均值，并且误差条指示标准偏差。
图50示出通过被工程化以表达CYP80F1、HDH和H6H的酵母将补料利托林转化为东莨菪碱的实验验证。此图示出来自被工程化以将利托林转化为东莨菪碱的酵母菌株的培养基的多反应监测(MRM)LC-MS/MS迹线。在对培养物上清液中的代谢物进行LC-MS/MS分析之前，将菌株在补充有1mM利托林的非选择性培养基中培养72h。右下图中的深色迹线(CSY1294，东莨菪碱)代表125nM(38μg/L)的东莨菪碱标准品。色谱图迹线代表三个生物学重复。
图51示出SCPL酰基转移酶(SCPL-AT)的经典植物ER到液泡运输和成熟途径。此图示出植物中典型的ER到液泡蛋白运输途径然后是SCPL-AT的示意图，其中示出颠茄利托林合酶(AbLS)作为实例。带圆圈的数字指示SCPL-AT表达和活性中的主要步骤，包括在(1)ER腔和(2)高尔基体中成熟，(3)运输至液泡，以及液泡(4)底物内向转运和(5)产物外向转运。
图52示出在工程化的酵母中表达的来自颠茄的野生型利托林合酶的共定位。此图示出被工程化以表达带有N端GFP标签的AbLS(GFP-AbLS)并用液泡膜染色剂FM4-64染色的酵母的落射荧光显微镜检查。对由低拷贝质粒表达GFP-AbLS的CSY1294进行显微镜检查。比例尺，5μm。
图53示出用于通过信号序列替换将利托林合酶强制定位至不同的酵母亚细胞区室的策略。此图示出用于改良AbLS的亚细胞定位以解决在不同区室中对底物可用性的潜在限制的蛋白质工程化方法。(A)用于通过信号序列交换定位AbLS的酵母亚细胞区室的示意图。指示了每个区室的信号序列源蛋白。(B)被选择用于AbLS信号序列替换的末端和残基。基于UniProt/SwissProt数据库中的结构注释选择包含每个信号序列结构域的残基。
图54示出在烟草中表达并用去糖基化酶处理的野生型AbLS的蛋白质印迹。此图示出在植物中表达的AbLS的糖基化修饰类型的鉴定。带有C端HA标签的AbLS通过农杆菌浸润在本氏烟草(N.benthamiana)叶片中瞬时表达。粗叶片提取物未处理(泳道1：‘--’)，或用肽N-糖苷酶F(PNG酶F；泳道2：‘N’)或O-糖苷酶(泳道3：‘O’)处理，以分别去除N-或O-连接的糖基化。通过在NuPAGE 4-12％ Bis-Tris凝胶上电泳分离粗提取物，并且接着转移到硝酸纤维素膜上，以使用嵌合的兔IgGκ抗HAHRP缀合抗体进行免疫检测。所有电泳和印迹步骤均在二硫化物还原条件下进行(参见在线方法(Online Methods))。泳道‘L’，Bio-RadPrecision Plus Dual Color蛋白阶梯。
图55示出在酵母和烟草中表达的AbLS糖基化位点突变体的蛋白质印迹。此图示出对于在酵母和烟草中表达的AbLS存在的N-糖基化模式的比较。带有C端HA标签的野生型AbLS、单糖基化位点点突变体(N→Q)或四重突变体通过农杆菌浸润在本氏烟草(‘Nb’)(A)或由低拷贝质粒在CSY1294(‘酵母’)(B)中瞬时表达。在变性的二硫化物还原条件下进行烟草和酵母粗提取物的制备(参见在线方法)。通过在NuPAGE 4-12％ Bis-Tris凝胶上电泳分离粗提取物，并且接着转移到硝酸纤维素膜上，以使用嵌合的兔IgGκ抗HAHRP缀合抗体进行免疫检测。所有电泳和印迹步骤均在二硫化物还原条件下进行(参见在线方法)。对于(A)和(B)，包括相应的酵母和烟草表达的对照以用于比较。泳道‘L’，Bio-Rad Precision PlusDual Color蛋白阶梯。
图56示出利托林合酶中的推定的内蛋白水解前肽去除的系统发生鉴定。此图示出AbLS与已知具有(AtSCT、AsSCPL1、TaCBP2)或缺乏(AtSMT、yPRC1)通过蛋白水解方式去除的内部前肽接头(粗体、灰色)的所表征的丝氨酸羧肽酶和SCPL酰基转移酶的序列比对。推定的N端信号肽以粗体(黑色)表示；二硫键表示为连接线。AtSCT，拟南芥芥子酰葡萄糖:胆碱芥子酰转移酶；AtSMT，拟南芥芥子酰葡萄糖:苹果酸芥子酰转移酶；AbLS，颠茄利托林合酶；AsSCPL1，糙伏毛燕麦(Avena strigosa)燕麦素合酶；TaCBP2，普通小麦(Triticumaestivum)羧肽酶2；yPRC1，酵母羧肽酶Y。从上到下：SEQ ID NO:30-35。
图57示出利托林合酶中推定的内蛋白水解前肽去除的结构鉴定。此图示出两种SCPL-AT的三维结构的比较，已知其中一种含有通过蛋白水解方式去除的内部前肽序列。左侧：(顶部)卡通和(底部)表面表示形式的TaCBP2的晶体结构(PDB：1WHT)，其示出二硫键和内部前肽去除位点。右侧：(顶部)卡通和(底部)表面表示形式的基于TaCBP2的晶体结构的AbLS的同源性模型，其示出N端信号肽、二硫键以及似乎阻断活性位点进入的推定的内部前肽。
图58示出酵母中AbLS分裂对照和推定的前肽交换变体的蛋白水解切割模式的分析。此图示出由在工程化酵母中表达的AbLS分裂对照和前肽变体产生的蛋白质片段大小的蛋白质印迹分析。带有C端HA标签的AbLS变体在CSY1294中由低拷贝质粒表达(泳道1-6)；在本氏烟草(Nb)中表达的带有HA标签的野生型AbLS作为另一对照示出(泳道7)。在二硫化物还原条件下进行凝胶电泳和印迹，并且使用抗HA抗体进行检测(参见在线方法)。泳道符号：L，蛋白质分子量阶梯；WT，野生型AbLS；SPL，在推定的前肽处分裂的AbLS，其在两个片段上都具有信号肽；SPL-T，在推定的前肽处分裂的AbLS，其在任一片段上不具有信号肽；GS，野生型前肽交换为柔性Gly-Ser接头的AbLS变体；SCT，野生型前肽交换为AtSCT前肽序列的AbLS变体；CUT，野生型前肽交换为由Kex2p蛋白酶识别和切割的合成聚精氨酸位点的AbLS变体。
图59示出被工程化以表达AbLS N端融合体的酵母菌株中的从头莨菪碱和东莨菪碱产量。此图示出表达AbLS的酵母菌株中的从头莨菪碱和东莨菪碱产量的比较，所述AbLS具有融合至N端的不同可溶性蛋白结构域。在CSY1294中由低拷贝质粒表达野生型(对照)或AbLS融合体。在对培养物上清液中的代谢物进行LC-MS/MS分析之前，将转化菌株在选择性培养基中培养96h。数据代表n＝3个生物学独立样品的平均值(空心圆圈)并且误差条显示标准偏差。学生双尾t检验：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
图60示出在CSY1296中表达以缓解液泡TA转运限制的烟草生物碱转运蛋白的荧光显微镜检查。此图示出表达在其C端与GFP融合从而能够鉴定其亚细胞定位的烟草生物碱转运蛋白的工程化酵母的荧光显微镜检查图像。(A)NtJAT1和(B)NtMATE2的C端GFP融合体在CSY1296中由低拷贝质粒表达。比例尺，5μm。
图61示出被工程化以表达异源生物碱转运蛋白的CSY1296中托品、莨菪碱和东莨菪碱的产量。此图示出在针对TA产生而工程化的酵母中，不同植物生物碱转运蛋白在缓解细胞内底物转运限制方面的实用性。普通烟草茉莉酸酯可诱导的生物碱转运蛋白1(NtJAT1)、多药和毒素外排(MATE)转运蛋白1或2，或阴性对照(BFP)在CSY1296中由低拷贝质粒表达。在对培养物上清液中的代谢物进行LC-MS/MS分析之前，将转化菌株在选择性培养基中培养96h。数据代表n＝3个生物学独立样品的平均值(空心圆圈)并且误差条显示标准偏差。学生双尾t检验：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
图62示出(A)产物离子模式和(B)多反应监测模式下的LC-MS/MS色谱图，其示出工程化酵母中非天然TA肉桂酰托品的从头产生。此图示出产生非天然TA肉桂酰托品的工程化酵母菌株的LC-MS/MS分析。(A)以下各项的细胞外介质的串联MS/MS谱图：(i)产托品菌株CSY1251；(ii)表达苯丙氨酸解氨酶(AtPAL1)、4-香豆酸-CoA连接酶5(At4CL5)和可卡因合酶(EcCS)的CSY1251，表示为CSY1282；或(iii)母体质量为m/z+＝272的真正的肉桂酰托品标准品。蓝色菱形表示母体化合物峰。(B)通过底物补料验证EcCS酰基转移酶在肉桂酸和α-托品上的活性。用表达AtPAL1(低拷贝质粒pCS4252)和/或At4CL5和EcCS(高拷贝质粒pCS4207)的质粒组合转化菌株，然后在具有如下不同补充底物的培养基中培养：(i)CEN.PK2+At4CL5+EcCS+0.1mM反式肉桂酸；(ii)CEN.PK2+At4CL5+EcCS+0.5mMα-托品；(iii)CEN.PK2+AtPAL1+At4CL5+EcCS；(iv)CEN.PK2+AtPAL1+At4CL5+EcCS+0.5mMα-托品；(v)CSY1251+At4CL5+EcCS；(vi)CSY1251+At4CL5+EcCS+0.2mM反式肉桂酸；(vii)CSY1251+AtPAL1+At4CL5+EcCS；(viii)25nM肉桂酰托品标准品。对于(A)和(B)，在LC-MS/MS分析之前，将酵母菌株在选择性培养基(YNB-DO+2％右旋糖+5％甘油)中在25℃下培养72h。
图63示出(A)单独或(B)与右旋糖一起补料的不同碳源对工程化酵母的液体培养物中托品和相关TA前体的产量的影响。此图示出优化碳源以提高工程化酵母中的托品产量。使产托品菌株CSY1249(参见实施例3.3.4)的过夜培养物在非选择性富集培养基(YPD)中生长。将过夜培养物沉淀并重悬于非选择性的限定培养基(YNB-SC)中，所述培养基具有所有氨基酸和(A)2％的每种碳源或(B)2％的右旋糖和2％的每种另外的碳源，包括右旋糖。在通过LC-MS/MS分析生长培养基之前，使培养物在25℃下生长48h。数据示出针对(A)2％右旋糖或(B)2％+2％右旋糖归一化的每种代谢物的相对滴度。数据代表三个生物学重复的平均值，并且误差条指示标准偏差。
图64示出产东莨菪碱菌株CSY1296的代谢瓶颈分析。此图示出表达通量限制酶的另外拷贝对工程化酵母中TA和TA前体的产量的影响。托品与东莨菪碱之间的每种生物合成酶的另外拷贝在菌株CSY1296中由以下低拷贝质粒表达：(A)WfPPR，pCS4436；(B)AbUGT，pCS4440；(C)DsRed-AbLS，pCS4526；(D)AbCYP80F1，pCS4438；(E)DsHDH，pCS4478；(F)DsH6H，pCS4439；或BFP对照(pCS4208、pCS4212或pCS4213)，对应于与各生物合成基因质粒相同的营养缺陷型标志物。在通过LC-MS/MS对生长培养基中的代谢物进行定量之前，将转化菌株在适当的选择性培养基中于25℃培养96小时。数据表示n＝3个生物学独立样品的平均值(空心圆圈)并且误差条显示标准偏差。学生双尾t检验：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
图65示出缓解通量和转运限制对工程化酵母中的莨菪碱和东莨菪碱产量的影响。此图示出酵母菌株CSY1296和CSY1297中的从头莨菪碱和东莨菪碱产生的比较，其中后者具有通量限制酶(WfPPR和DsH6H)的另外基因组拷贝以及烟草液泡生物碱内向转运蛋白(NtJAT1)。在对培养物上清液中的代谢物进行LC-MS/MS分析之前，将菌株在非选择性培养基中培养96h。数据代表n＝3个生物学独立样品的平均值(空心圆圈)并且误差条显示标准偏差。学生双尾t检验：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
定义
在更详细地描述示例性实施方案之前，阐述以下定义以说明和定义说明书中使用的术语的含义和范围。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域中的普通技术人员通常所理解的相同含义。Singleton等人,DICTIONARY OF MICROBIOLOGYAND MOLECULAR BIOLOGY,第2版,John Wiley和Sons,New York(1994)，以及Hale&Markham,THE HARPER COLLINSDICTIONARY OF BIOLOGY,Harper Perennial,N.Y.(1991)向技术人员提供本文使用的许多术语的一般含义。尽管如此，为了清楚和便于参考，下面定义了某些术语。
应当指出的是，除非上下文另外清楚地指明，如本文中以及在所附权利要求书中所使用的，单数形式“一个”、“一种”以及“所述”包含复数指代物。举例来说，术语“引物”是指一种或多种引物，即单一引物和多种引物。还应注意，权利要求书可经起草而排除任何任选的要素。因此，所述陈述旨在用作前置基础，用于结合权利要求要素的叙述使用诸如“单独地”、“仅”等排他性术语或使用“负面”限制。
如本文所用，术语“确定”、“测量”、“评估”和“测定”可互换使用并包括定量和定性确定。
如本文所用，术语“多肽”是指任何长度的氨基酸的聚合形式，包括长度在2-50个氨基酸范围内的肽和长度大于50个氨基酸的多肽。术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用。术语“多肽”包括编码和非编码氨基酸的聚合物、化学或生物化学修饰或衍生的氨基酸，以及具有修饰的肽骨架的多肽，其中常规骨架已被非天然存在或合成的骨架替代。多肽可具有任何便利的长度，例如2个或更多个氨基酸，诸如4个或更多个氨基酸、10个或更多个氨基酸、20个或更多个氨基酸、50个或更多个氨基酸、100个或更多个氨基酸、300个或更多个氨基酸，诸如最多至500个或1000个或更多个氨基酸。“肽”可以是2个或更多个氨基酸，诸如4个或更多个氨基酸、10个或更多个氨基酸、20个或更多个氨基酸，诸如最多至50个氨基酸。在一些实施方案中，肽的长度介于5个与30个氨基酸之间。
如本文所用，术语“分离的”是指感兴趣的部分至少60％不含、至少75％不含、至少90％不含、至少95％不含、至少98％不含并且甚至至少99％不含在纯化之前与所述部分相关联的其他组分。
如本文所用，术语“由……编码”是指编码多肽序列的核酸序列，其中多肽序列或其部分含有3个或更多个氨基酸的氨基酸序列，诸如5个或更多个、8个或更多个、10个或更多个、15个或更多个或20个或更多个来自由核酸序列编码的多肽的氨基酸。所述术语还涵盖使用由所述序列编码的多肽在免疫学上可鉴定的多肽序列。
“载体”能够将基因序列转移至靶细胞。如本文所用，术语“载体构建体”、“表达载体”和“基因转移载体”可互换使用，意指能够指导感兴趣的基因的表达的任何核酸构建体，并且其可将基因序列转移至靶细胞，这是通过载体的全部或一部分的基因组整合，或载体作为染色体外元件的瞬时或可遗传维持实现的。因此，所述术语包括克隆和表达媒介物以及整合载体。
“表达盒”包括能够指导与表达盒的启动子可操作地连接的感兴趣的基因/编码序列的表达的任何核酸构建体。这样的盒被构建成“载体”、“载体构建体”、“表达载体”或“基因转移载体”，以便将表达盒转移到靶细胞中。因此，所述术语包括克隆和表达媒介物以及病毒载体。
“多个”包含至少2个成员。在某些情况下，多个可具有10个或更多个，诸如100个或更多个、1000个或更多个、10,000个或更多个、100,000个或更多个、106个或更多个、107个或更多个、108个或更多个，或109个或更多个成员。在任何实施方案中，多个可以具有2-20个成员。
术语“莨菪烷生物碱产物”旨在指其骨架含有8-氮杂双环[3.2.1]辛烷核心基团的任何分子，所述核心基团包含环庚烷环和连接碳原子1和5的氮桥，其中8-氮杂双环[3.2.1]辛基通过3位的酯键与酰基共价键合，和/或其中8-氮杂双环[3.2.1]辛基在3位被羟基官能化，并且在2、4、5、6和/或7位被一个或多个羟基官能化。莨菪烷生物碱产物包括但不限于利托林、莨菪碱、阿托品、山莨菪碱、东莨菪碱、可卡因以及任何其他类似的托品/假托品+酰基天然或非天然莨菪烷生物碱(例如，打碗花精)。
术语“莨菪烷生物碱产物的前体”旨在指可以通过生物体由碳源和氮源生物合成并且可以在一个或多个(例如，一个或两个)生物合成步骤中转化为莨菪烷生物碱产物的任何分子；其中碳源为碳水化合物、非碳水化合物糖、糖醇、脂质、脂肪酸或通过代谢途径转化为上述碳源中的一种或多种的底物；并且其中氮源是氨、脲、硝酸盐、亚硝酸盐、除谷氨酸、精氨酸、鸟氨酸和瓜氨酸之外的任何氨基酸、肽、蛋白质，或通过代谢途径转化为上述氮源中的一种或多种的任何底物。
术语“莨菪烷生物碱产物的衍生物”旨在指不是通过未修饰生物体天然产生的任何分子，其中所述分子的骨架包含莨菪烷生物碱产物并且与所述莨菪烷生物碱产物的区别在于官能团的连接，而没有骨架本身的修饰。如本文所用，官能团的连接包括但不限于羟基化、烷基化和N-烷基化、乙酰化和N-乙酰化、酰化和N-酰化以及卤化。
数字范围包括限定该范围的数字。
本文所述的方法包括多个步骤。根据需要，可在步骤之间经过预定量的时间之后执行每个步骤。因此，执行每个步骤之间的时间可以是1秒或更多、10秒或更多、30秒或更多、60秒或更多、5分钟或更多、10分钟或更多、60分钟或更多，并且包括5小时或更多。在某些实施方案中，每个后续步骤在前一步骤完成后立即执行。在其他实施方案中，步骤可在完成前一步骤后的孵育或等待时间(例如，几分钟至过夜等待时间)之后执行。
术语的其它定义可出现在整个说明书中。
具体实施方式
提供了被工程化以产生感兴趣的莨菪烷生物碱(TA)(诸如莨菪碱和东莨菪碱)的宿主细胞。宿主细胞可具有选自以下的一种或多种工程化修饰：酶基因中的反馈抑制缓解突变；生物合成酶基因的转录调节修饰；酶中的失活突变；以及异源编码序列。还提供了使用宿主细胞产生感兴趣的TA的方法以及可用于本发明的方法中的组合物，例如试剂盒、系统等。
在更详细地描述本发明之前，应当理解，本发明不限于所描述的具体实施方案，因为这种可改变。还应了解，本文所使用的术语仅用于描述具体实施方案的目的，并且不打算为限制性的，因为本发明的范围将仅受所附权利要求书的限制。
在提供了值范围的情况下，应当理解的是，介于该范围的上限与下限之间的每个中间值(到下限的单位的十分之一，除非上下文另外明确说明)以及所述范围中的任何其它所陈述或中间值均涵盖于本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包含在更小的范围中，并且也涵盖在本发明内，这受制于所陈述的范围中的任何具体排除的极限。当规定范围包括一个或两个限值时，排除了那些所包括的限值中的任一个或两个的范围也包括在本发明中。
某些范围在本文中以前面有术语“约(about)”的数值呈现。术语“约”在本文中用于为其后面的准确数字以及接近或近似于所述术语后面的数字的数字提供字面支持。在确定一个数字是否接近或近似一个具体列举的数字时，接近或近似的未列举的数字可以是在其出现的上下文中提供该具体列举的数字的实质等同物的数字。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。尽管与本文中描述的方法和材料类似或相当的任何方法和材料也可用于实践或测试本发明，但是现在对代表性的例示性方法和材料进行描述。
本说明书中引用的所有出版物和专利均通过引用的方式并入本文中，如同具体地和单独地指示每个单独的出版物或专利通过引用的方式并入，并且通过引用的方式并入本文中，以公开和描述与所引用的出版物相关的方法和/或材料。任何出版物的引用是为了其在申请日之前的公开，并且不应被解释为承认本发明由于在先发明而无权先于这种出版物。此外，提供的出版日期可能与实际出版日期不同，可能需要独立确认。
正如对于本领域的技术人员而言在阅读本公开后将显而易见的，本文描述和展示的每个单独实施方案具有分立的组分和特征，这些组分和特征在不脱离本发明的范围或精神的前提下，可以容易地与任何其他几个实施方案的特征分离或组合。任何所叙述的方法均以所叙述事件的顺序或以逻辑上可能的任何其它顺序来进行。
在进一步描述本发明时，首先更详细地描述感兴趣的TA前体、TA和TA的修饰物，包括TA的衍生物，然后描述用于产生它们的宿主细胞。接下来，对可以使用宿主细胞的感兴趣的方法进行综述。还描述了可用于实践本发明的方法的试剂盒。
莨菪烷生物碱(TA)前体
如上所述，提供了产生莨菪烷生物碱前体(TA前体)的宿主细胞。TA前体可以是导致产生感兴趣的TA(例如，如本文所述)的合成途径(例如，如本文所述)中的任何中间体或前体化合物。在一些情况下，TA前体具有可表征为TA或其衍生物的结构。在某些情况下，TA前体具有可表征为TA的片段的结构。在一些情况下，TA前体是早期TA。如本文所用，“早期TA”是指在细胞中合成感兴趣的TA时的早期中间体，其中早期TA通过宿主细胞由宿主细胞原料或简单的起始化合物产生。在一些情况下，早期TA是通过主题宿主细胞仅由宿主细胞原料(例如，碳和营养源)产生的TA中间体，而不需要向细胞中添加起始化合物。术语早期TA可指感兴趣的TA终产物的前体，无论早期TA本身是否可表征为莨菪烷生物碱。
在一些情况下，TA前体是早期TA，诸如前托品莨菪烷生物碱或前利托林莨菪烷生物碱。因此，提供了产生前托品莨菪烷生物碱(前托品TA)和前利托林莨菪烷生物碱(前利托林TA)的宿主细胞。托品是通过细胞工程化努力产生终产物诸如衍生自利托林的药用TA产物的下游TA合成中的感兴趣的主要分支点中间体(图2)。主题宿主细胞可由简单且廉价的起始材料产生TA前体，所述起始材料可用于产生托品、利托林和下游TA终产物。
如本文所用，术语“预酯化莨菪烷生物碱”、“预酯化TA”和“预酯化TA前体”可互换使用并且是指利托林、肉桂酰托品，或酰基供体和酰基受体酯化的其他产物的生物合成前体，无论酯化前体本身的结构是否表征为莨菪烷生物碱。术语预酯化TA意在包括可产生酯化产物诸如利托林的宿主细胞生物合成途径的任何便利成员的生物合成前体、中间体及其代谢物。在一些情况下，预酯化TA包括莨菪烷生物碱片段，诸如托品片段、苯丙烷片段或其前体或衍生物。在某些情况下，预酯化TA具有可表征为莨菪烷生物碱或其衍生物的结构。
感兴趣的TA前体包括但不限于托品和苯基乳酸(PLA)，以及托品和PLA前体，诸如精氨酸、鸟氨酸、胍丁胺、N-氨基甲酰腐胺(NCP)、腐胺、N-甲基腐胺(NMP)、4-甲基氨基丁醛、N-甲基吡咯啉鎓(NMPy)、4-(1-甲基-2-吡咯烷基)-3-氧代丁酸(MPOB)、托品酮、苯丙氨酸、预苯酸和苯丙酮酸(PPA)。在一些实施方案中，一种或多种TA前体是托品和PLA。在某些情况下，一种或多种TA前体是托品和除PLA之外的苯丙烷羧酸，诸如肉桂酸。图1、2和3分别示出由各种TA和非TA前体分子生物合成非药用、药用和非天然TA。
TA前体的合成途径可在宿主细胞中产生，并且可从任何便利的起始化合物或材料开始。图1-4示出从氨基酸开始的TA前体的感兴趣的合成途径。起始材料可以是非天然存在的，或起始材料可以是宿主细胞中天然存在的。基于宿主细胞中存在的合成途径，任何便利的化合物和材料都可用作起始材料。起始材料的来源可来自宿主细胞本身，例如精氨酸或苯丙氨酸，或起始材料可从外部来源添加或补充到宿主细胞中。因此，在一些情况下，起始化合物是指细胞合成途径中的化合物，其从不是生长原料或细胞生长培养基的一部分的外部来源添加到宿主细胞中。感兴趣的起始化合物包括但不限于N-甲基腐胺、4-甲基氨基丁醛、托品酮、托品、PLA、肉桂酸，以及图1-4中所示的任何化合物。例如，如果使宿主细胞在液体培养基中生长，则可向细胞培养基中补充起始材料，所述起始材料被转运到细胞中并被细胞转化为期望产物。感兴趣的起始材料包括但不限于廉价的原料和简单的前体分子。在一些情况下，宿主细胞利用包括简单碳源的原料作为起始材料，宿主细胞利用所述原料产生细胞的合成途径的化合物。宿主细胞生长原料可包括一种或多种组分，诸如碳源诸如纤维素、淀粉、游离糖和氮源，诸如铵盐或廉价氨基酸。在一些情况下，可用作起始材料的生长原料可来源于可持续来源，诸如在边际土地上生长的生物质，包括柳枝稷和藻类，或来自其他工业或农业活动的生物质废产物。
莨菪烷生物碱(TA)
如上所述，提供了产生感兴趣的莨菪烷生物碱(TA)的宿主细胞。在一些实施方案中，本发明的工程化菌株将提供用于产生感兴趣的莨菪烷生物碱及其跨几个类别的修饰物的平台，包括但不限于药用TA，诸如衍生自托品和PLA的那些；非药用TA，诸如衍生自托品酮、假托品或去甲假托品的那些；以及非天然TA，诸如来源于TA前体(例如，酰基供体和酰基受体化合物)而不是托品和PLA的酯化的那些。这些类别中的每一个旨在包括可产生该类别的成员的宿主细胞生物合成途径的任何便利的成员的生物合成前体、中间体及其代谢物。下面针对这些类别中的每一个给出化合物的非限制性实例。在一些实施方案中，给定实例的结构本身可以或可以不表征为莨菪烷生物碱。本发明的化学实体意在包括所有可能的异构体，包括单一对映异构体、外消旋混合物、光学纯形式、非对映异构体的混合物以及中间体混合物。
药用TA可包括但不限于由植物天然产生的利托林、莨菪碱、阿托品、山莨菪碱、东莨菪碱及其衍生物。
非药用TA可包括但不限于由植物天然产生的打碗花精、可卡因及其衍生物。
非天然TA可包括但不限于肉桂酰托品、肉桂酰-3β-托品、香豆酰托品、香豆酰-3β-托品、苯甲酰托品、苯甲酰-3β-托品、咖啡酰托品、咖啡酰-3β-托品、阿魏酰托品以及阿魏酰-3β-托品。
包括衍生物在内的TA的修饰物
如上所述，提供了产生感兴趣的莨菪烷生物碱(TA)的经修饰衍生物的宿主细胞。在一些实施方案中，本发明的工程化菌株将提供用于衍生化感兴趣的TA的平台，包括衍生化由工程化宿主细胞产生的或补料至生长培养基中的工程化宿主细胞的TA前体、药用TA、非药用TA和非天然TA。
如本文所用，术语“衍生化”、“官能化”、“通过衍生化进行修饰”和“通过官能化进行修饰”是指通过官能团的连接对TA或TA前体进行修饰，而不对TA骨架本身进行修饰。如本文所用，官能团的连接包括但不限于羟基化、烷基化和N-烷基化、乙酰化和N-乙酰化、酰化和N-酰化以及卤化。
在本发明的一些实施方案中，感兴趣的TA的衍生化可通过将预官能化的TA前体(例如卤化或烷基化的氨基酸)补料至被工程化以摄取补料的TA前体并接着将其转化为感兴趣的TA的宿主细胞来以酶促方式实现。在本发明的其他实施方案中，除了产生未修饰的TA所需的酶和细胞修饰之外，还可通过工程化宿主细胞以表达具有将官能团连接至靶标TA的期望活性的酶来以酶促方式实现感兴趣的TA的衍生化。在本发明的其他实施方案中，可通过用能够连接期望官能团的纯化酶或用被工程化以表达具有期望衍生化活性的酶的宿主细胞的粗裂解物处理工程化宿主细胞产生的未修饰TA来以酶促方式实现感兴趣的TA的衍生化。在本发明的其他实施方案中，感兴趣的TA的衍生化可通过用具有期望官能团的化学剂处理工程化宿主细胞产生的未修饰TA来以非酶促方式实现。
TA的经修饰衍生物包括但不限于对羟基阿托品、对羟基莨菪碱、对氟莨菪碱、对氯莨菪碱、对溴莨菪碱、对氟东莨菪碱、对氯东莨菪碱、对溴东莨菪碱、N-甲基莨菪碱、N-丁基莨菪碱、N-甲基东莨菪碱、N-丁基东莨菪碱、N-乙酰基莨菪碱和N-乙酰基东莨菪碱。
宿主细胞
如上所述，本发明的一个方面是一种产生一种或多种感兴趣的TA的宿主细胞。任何便利的细胞可用于主题宿主细胞和方法中。在一些情况下，宿主细胞是非植物细胞。在一些情况下，宿主细胞可表征为微生物细胞。在某些情况下，宿主细胞是昆虫细胞、哺乳动物细胞、细菌细胞或真菌细胞。任何便利类型的宿主细胞可用于产生主题产TA细胞，参见，例如，现在作为美国专利号8,975,063公布的US2008/0176754、US2014/0273109和WO2014/143744)；其公开内容通过引用整体并入。感兴趣的宿主细胞包括但不限于细菌细胞，诸如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、大肠杆菌、链霉菌属(Streptomyces)、鱼腥藻属(Anabaena)、节杆菌属(Arthrobacter)、醋杆菌属(Acetobacter)、醋酸杆菌属(Acetobacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、短状杆菌属(Brachybacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)、肉杆菌属(Carnobacterium)、梭菌属(Clostridium)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、肠杆菌属(Enterobacter)、埃希氏菌属(Escherichia)、葡糖酸醋酸杆菌属(Gluconacetobacter)、葡糖杆菌属(Gluconobacter)、哈夫尼菌属(Hafnia)、嗜盐单胞菌属(Halomonas)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、考克氏菌属(Kocuria)、乳杆菌属(Lactobacillus)、明串珠菌属(Leucononstoc)、巨大球菌属(Macrococcus)、甲基单胞菌属(Methylomonas)、甲基细菌属(Methylobacter)、甲基细胞菌属(Methylocella)、甲基球菌属(Methylococcus)、微杆菌属(Microbacterium)、微球菌属(Micrococcus)、微囊菌属(Microcystis)、穆尔氏菌属(Moorella)、酒球菌属(Oenococcus)、片球菌属(Pediococcus)、原绿球藻属(Prochlorococcus)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、变形杆菌属(Proteus)、假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)、假单胞菌属(Pseudomonas)、嗜冷菌属(Psychrobacter)、红细菌属(Rhodobacter)、红球菌属(Rhodococcus)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)、沙雷氏菌属(Serratia)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、聚球藻菌属(Synechococcus)、集胞藻属(Synechocystis)、四联球菌属(Tetragenococcus)、魏斯氏菌属(Weissella)、发酵单胞菌属(Zymomonas)以及鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimuium)细胞，昆虫细胞诸如黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)S2和草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)Sf9细胞，以及酵母细胞诸如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、毕赤酵母(Pichiapastoris)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、白色假丝酵母(Candida albicans)、曲霉属物种(Aspergillus spp.)、根霉属物种(Rhizopus spp.)、青霉属物种(Penicilliumspp.)以及里氏木霉(Trichoderma reesei)细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是酵母细胞或大肠杆菌细胞。在一些情况下，宿主细胞是酵母细胞。在一些情况下，宿主细胞来自被工程化以产生感兴趣的TA的酵母菌株。现已作为美国专利号8,975,063公布的US2008/0176754、US2014/0273109和WO2014/143744中描述的任何宿主细胞可适用于主题细胞和方法中。在某些实施方案中，酵母细胞可属于酿酒酵母(S.cerevisiae)物种。在某些实施方案中，酵母细胞可属于粟酒裂殖酵母物种。在某些实施方案中，酵母细胞可属于毕赤酵母物种。酵母作为宿主细胞很受关注，因为参与一些感兴趣的生物合成途径的细胞色素P450蛋白能够正确折叠到内质网膜中，从而保持其活性。
可用于本发明的感兴趣的酵母菌株包括但不限于CEN.PK(基因型：MATa/αura3-52/ura3-52trp1-289/trp1-289leu2-3_112/leu2-3_112his3Δ1/his3Δ1MAL2-8C/MAL2-8C SUC2/SUC2)、S288C、W303、D273-10B、X2180、A364A、∑1278B、AB972、SK1和FL100。在某些情况下，酵母菌株是以下中的任一种：S288C(MATα；SUC2 mal mel gal2 CUP1 flo1 flo8-1hap1)、BY4741(MATα；his3Δ1；leu2Δ0；met15Δ0；ura3Δ0)、BY4742(MATα；his3Δ1；leu2Δ0；lys2Δ0；ura3Δ0)、BY4743(MATa/MATα；his3Δ1/his3Δ1；leu2Δ0/leu2Δ0；met15Δ0/MET15；LYS2/lys2Δ0；ura3Δ0/ura3Δ0)以及WAT11或W(R)、W303-B菌株的衍生物(MATa；ade2-1；his3-11、-15；leu2-3、-112；ura3-1；canR；cyr+)，其分别表达拟南芥NADPH-P450还原酶ATR1和酵母NADPH-P450还原酶CPR1。在另一个实施方案中，酵母细胞是W303α(MATα；his3-11、15trp1-1 leu2-3 ura3-1 ade2-1)。其他感兴趣的酵母菌株的身份和基因型可见于EUROSCARF(web.uni-frankfurt.de/fb15/mikro/euroscarf/col_index.html)。
在一些情况下，宿主细胞是真菌细胞。在某些实施方案中，真菌细胞可属于曲霉属物种并且菌株包括黑曲霉(Aspergillus niger)(ATCC 1015、ATCC 9029、CBS 513.88)、米曲霉(Aspergillus oryzae)(ATCC 56747、RIB40)、土曲霉(Aspergillus terreus)(NIH2624、ATCC 20542)以及构巢曲霉(Aspergillus nidulans)(FGSC A4)。
在某些实施方案中，异源编码序列可针对在曲霉属物种中表达进行密码子优化并由适当的启动子表达。在某些实施方案中，启动子可选自磷酸甘油酸激酶启动子(PGK)、MbfA启动子、细胞色素c氧化酶亚基启动子(CoxA)、SrpB启动子、TvdA启动子、苹果酸脱氢酶启动子(MdhA)、β-甘露糖苷酶启动子(ManB)。在某些实施方案中，终止子可选自葡糖淀粉酶终止子(GlaA)或TrpC终止子。在某些实施方案中，由启动子、异源编码序列和终止子组成的表达盒可由质粒表达或整合到宿主的基因组中。在某些实施方案中，可通过抗生素选择诸如潮霉素或氮源利用诸如使用乙酰胺作为唯一氮源来进行维持质粒或整合盒的细胞的选择。在某些实施方案中，可使用已建立的转化方法诸如原生质体转化、乙酸锂或电穿孔将DNA构建体引入宿主细胞中。在某些实施方案中，细胞可在选择或不选择的情况下在液体ME或固体MEA(3％麦芽提取物、0.5％蛋白胨和±1.5％琼脂)或在Vogel基本培养基中培养。
在一些情况下，宿主细胞是细菌细胞。细菌细胞可选自任何细菌种属。细菌细胞可来自的种属的实例包括鱼腥藻属、节杆菌属、醋杆菌属、醋酸杆菌属、芽孢杆菌属、双歧杆菌属、短状杆菌属、短杆菌属、肉杆菌属、梭菌属、棒状杆菌属、肠杆菌属、埃希氏菌属、葡糖酸醋酸杆菌属、葡糖杆菌属、哈夫尼菌属、嗜盐单胞菌属、克雷伯氏菌属、考克氏菌属、乳杆菌属、明串珠菌属、巨大球菌属、甲基单胞菌属、甲基细菌属、甲基细胞菌属、甲基球菌属、微杆菌属、微球菌属、微囊菌属、穆尔氏菌属、酒球菌属、片球菌属、原绿球藻属、丙酸杆菌属、变形杆菌属、假交替单胞菌属、假单胞菌属、嗜冷菌属、红细菌属、红球菌属、红假单胞菌属、沙雷氏菌属、葡萄球菌属、链球菌属、链霉菌属、聚球藻菌属、集胞藻属、四联球菌属、魏斯氏菌属以及发酵单胞菌属。可与本公开的方法一起使用的细菌物种的实例包括烟草节杆菌(Arthrobacter nicotianae)、纹膜醋酸杆菌(Acetobacter aceti)、阿氏节杆菌(Arthrobacter arilaitensis)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)、奶酪发酵小短杆菌(Brachybacteriumtyrofermentans)、扩展短杆菌(Brevibacterium linens)、广布肉毒杆菌(Carnobacteriumdivergens)、微黄棒状杆菌(Corynebacterium flavescens)、屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、欧洲葡糖酸醋酸杆菌(Gluconacetobacter europaeus)、约氏葡糖酸醋酸杆菌(Gluconacetobacter johannae)、氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)、蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)、伸长嗜盐单胞菌(Halomonas elongata)、嗜根考克氏菌(Kocuriarhizophila)、酸面乳杆菌(Lactobacillus acidifarinae)、詹氏乳杆菌(Lactobacillusjensenii)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、山梨乳杆菌(Lactobacillusyamanashiensis)、柠檬明串珠菌(Leuconostoc citreum)、溶酪大球菌(Macrococcuscaseolyticus)、小叶微杆菌(Microbacterium foliorum)、里拉微球菌(Micrococcuslylae)、酒类酒球菌(Oenococcus oeni)、乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)、产丙酸丙酸杆菌(Propionibacterium acidipropionici)、普通变形杆菌(Proteus vulgaris)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、速生嗜冷杆菌(Psychrobacter celer)、香料葡萄球菌(Staphylococcus condimenti)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)、嗜盐四联球菌(Tetragenococcus halophilus)、食窦魏斯氏菌(Weissella cibaria)、高丽魏斯氏菌(Weissella koreensis)、运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)、比菲德氏/短/长双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum/breve/longum)、变铅青链霉菌(Streptomyceslividans)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、沙克乳杆菌(Lactobacillus sakei)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、柠檬假交替单胞菌(Pseudoalteromonas citrea)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、杨氏/醋酸/丙酮丁醇/拜氏/丁酸梭菌(Clostridium ljungdahlii/aceticum/acetobutylicum/beijerinckii/butyricum)以及嗜热纤维/热乙酸穆尔氏菌(Moorellathemocellum/thermoacetica)。
在某些实施方案中，细菌细胞可属于大肠杆菌菌株。在某些实施方案中，大肠杆菌菌株可选自BL21、DH5α、XL1-Blue、HB101、BL21和K12。在某些实施方案中，异源编码序列可针对在大肠杆菌中表达进行密码子优化并由适当的启动子表达。在某些实施方案中，启动子可选自T7启动子、tac启动子、trc启动子、四环素诱导型启动子(tet)、lac操纵子启动子(lac)、lacO1启动子。在某些实施方案中，由启动子、异源编码序列和终止子组成的表达盒可由质粒表达或整合到基因组中。在某些实施方案中，质粒选自pUC19或pBAD。在某些实施方案中，维持质粒或整合盒的细胞的选择可通过抗生素选择进行，诸如卡那霉素、氯霉素、链霉素、壮观霉素、庆大霉素、红霉素或氨苄青霉素。在某些实施方案中，可使用已建立的转化方法诸如缀合、热休克化学转化或电穿孔将DNA构建体引入宿主细胞中。在某些实施方案中，细胞可在液体Luria-Bertani(LB)培养基中在约37℃下培养，使用或不使用抗生素。
在某些实施方案中，细菌细胞可以是枯草芽孢杆菌的菌株。在某些实施方案中，枯草芽孢杆菌的菌株可选自1779、GP25、RO-NN-1、168、BSn5、BEST195、1A382和62178。在某些实施方案中，异源编码序列可针对在芽孢杆菌属物种中表达进行密码子优化并由适当的启动子表达。在某些实施方案中，启动子可选自grac启动子、p43启动子或trnQ启动子。在某些实施方案中，由启动子、异源编码序列和终止子组成的表达盒可由质粒表达或整合到基因组中。在某些实施方案中，质粒选自pHP13 pE194、pC194、pHT01或pHT43。在某些实施方案中，整合载体诸如pDG364或pDG1730可用于将表达盒整合到基因组中。在某些实施方案中，维持质粒或整合盒的细胞的选择可通过抗生素选择进行，诸如红霉素、卡那霉素、四环素和壮观霉素。在某些实施方案中，可使用已建立的转化方法诸如自然感受(naturalcompetence)、热休克或化学转化将DNA构建体引入宿主细胞中。在某些实施方案中，细胞可在液体Luria-Bertani(LB)培养基中在37℃下培养或在外加葡萄糖和色氨酸的M9培养基中培养。
宿主细胞的遗传修饰
宿主细胞可被工程化成包括一种或多种修饰(诸如两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种，或甚至更多种修饰)，所述修饰提供感兴趣的TA的产生。在一些情况下，修饰是指遗传修饰，诸如基因或其片段的突变、添加或缺失，或者基因或其片段的转录调控。在一些情况下，一种或多种(诸如两种或更多种、三种或更多种，或四种或更多种)修饰选自：细胞固有的生物合成酶基因中的反馈抑制缓解突变；细胞固有的生物合成酶基因的转录调节修饰；细胞固有的酶中的失活突变；编码酶的异源编码序列；以及编码改良酶或代谢物的亚细胞运输和/或定位的蛋白质的异源编码序列。包括一种或多种修饰的细胞可被称为经修饰的细胞。
经修饰的细胞可过量产生一种或多种前体TA、TA，或经修饰的TA分子。过量产生是指相对于对照细胞(例如，未修饰的细胞)而言，所述细胞具有改善或增加的感兴趣的TA分子的产生。改善或增加的产生是指在对照没有TA前体产生时产生一定量的感兴趣的TA，以及在对照具有一些感兴趣的TA产生的情况下增加约10％或更多，诸如约20％或更多、约30％或更多、约40％或更多、约50％或更多、约60％或更多、约80％或更多、约100％或更多，诸如2倍或更多，诸如5倍或更多，包括10倍或更多。
在一些情况下，相对于缺乏一种或多种修饰(例如，如本文所述)的对照宿主细胞，所述宿主细胞能够产生增加的量的腐胺。在某些情况下，增加的量的腐胺为相对于对照宿主细胞增加约10％或更多，诸如相对于对照宿主细胞增加约20％或更多、约30％或更多、约40％或更多、约50％或更多、约60％或更多、约80％或更多、约100％或更多、2倍或更多、5倍或更多，或甚至10倍或更多。
在一些情况下，相对于缺乏一种或多种修饰(例如，如本文所述)的对照宿主细胞，所述宿主细胞能够产生增加的量的N-甲基吡咯啉鎓。在某些情况下，增加的量的N-甲基吡咯啉鎓为相对于对照宿主细胞增加约10％或更多，诸如相对于对照宿主细胞增加约20％或更多、约30％或更多、约40％或更多、约50％或更多、约60％或更多、约80％或更多、约100％或更多、2倍或更多、5倍或更多，或甚至10倍或更多。
在一些情况下，相对于缺乏一种或多种修饰(例如，如本文所述)的对照宿主细胞，所述宿主细胞能够产生增加的量的托品。在某些情况下，增加的量的托品为相对于对照宿主细胞增加约10％或更多，诸如相对于对照宿主细胞增加约20％或更多、约30％或更多、约40％或更多、约50％或更多、约60％或更多、约80％或更多、约100％或更多、2倍或更多、5倍或更多，或甚至10倍或更多。
在一些情况下，相对于缺乏一种或多种修饰(例如，如本文所述)的对照宿主细胞，所述宿主细胞能够产生增加的量的苯丙酮酸。在某些情况下，增加的量的苯丙酮酸为相对于对照宿主细胞增加约10％或更多，诸如相对于对照宿主细胞增加约20％或更多、约30％或更多、约40％或更多、约50％或更多、约60％或更多、约80％或更多、约100％或更多、2倍或更多、5倍或更多，或甚至10倍或更多。
在一些情况下，相对于缺乏一种或多种修饰(例如，如本文所述)的对照宿主细胞，所述宿主细胞能够产生增加的量的苯基乳酸。在某些情况下，增加的量的苯基乳酸为相对于对照宿主细胞增加约10％或更多，诸如相对于对照宿主细胞增加约20％或更多、约30％或更多、约40％或更多、约50％或更多、约60％或更多、约80％或更多、约100％或更多、2倍或更多、5倍或更多，或甚至10倍或更多。
在一些情况下，相对于缺乏一种或多种修饰(例如，如本文所述)的对照宿主细胞，所述宿主细胞能够产生增加的量的利托林。在某些情况下，增加的量的利托林为相对于对照宿主细胞增加约10％或更多，诸如相对于对照宿主细胞增加约20％或更多、约30％或更多、约40％或更多、约50％或更多、约60％或更多、约80％或更多、约100％或更多、2倍或更多、5倍或更多，或甚至10倍或更多。
在一些情况下，相对于缺乏一种或多种修饰(例如，如本文所述)的对照宿主细胞，所述宿主细胞能够产生增加的量的莨菪碱。在某些情况下，增加的量的莨菪碱为相对于对照宿主细胞增加约10％或更多，诸如相对于对照宿主细胞增加约20％或更多、约30％或更多、约40％或更多、约50％或更多、约60％或更多、约80％或更多、约100％或更多、2倍或更多、5倍或更多，或甚至10倍或更多。
在一些情况下，相对于缺乏一种或多种修饰(例如，如本文所述)的对照宿主细胞，所述宿主细胞能够产生增加的量的东莨菪碱。在某些情况下，增加的量的东莨菪碱为相对于对照宿主细胞增加约10％或更多，诸如相对于对照宿主细胞增加约20％或更多、约30％或更多、约40％或更多、约50％或更多、约60％或更多、约80％或更多、约100％或更多、2倍或更多、5倍或更多，或甚至10倍或更多。
在一些实施方案中，宿主细胞能够由起始化合物诸如精氨酸产生10％或更高收率的的托品，诸如由起始化合物产生20％或更高、30％或更高、40％或更高、50％或更高、60％或更高、70％或更高、80％或更高，或甚至90％或更高收率的托品。
在一些实施方案中，宿主细胞能够由起始化合物诸如苯丙氨酸产生10％或更高收率的的苯基乳酸，诸如由起始化合物产生20％或更高、30％或更高、40％或更高、50％或更高、60％或更高、70％或更高、80％或更高，或甚至90％或更高收率的苯基乳酸。
在一些实施方案中，宿主细胞能够由起始化合物诸如精氨酸或苯丙氨酸产生10％或更高收率的的莨菪碱，诸如由起始化合物产生20％或更高、30％或更高、40％或更高、50％或更高、60％或更高、70％或更高、80％或更高，或甚至90％或更高收率的莨菪碱。
在一些实施方案中，宿主细胞能够由起始化合物诸如精氨酸或苯丙氨酸产生10％或更高收率的的东莨菪碱，诸如由起始化合物产生20％或更高、30％或更高、40％或更高、50％或更高、60％或更高、70％或更高、80％或更高，或甚至90％或更高收率的东莨菪碱。
在一些实施方案中，宿主细胞过量产生一种或多种选自由以下组成的组的感兴趣的TA分子：精氨酸、鸟氨酸、胍丁胺、腐胺、N-甲基腐胺、4-甲基氨基丁醛、N-甲基吡咯啉鎓、4-(1-甲基-2-吡咯烷基)-3-氧代丁酸、托品酮、托品、苯丙氨酸、预苯酸、苯丙酮酸、苯基乳酸、葡萄糖-1-O-苯基乳酸酯、利托林、莨菪醛、莨菪碱、山莨菪碱以及东莨菪碱。
一种或多种修饰的任何便利的组合可包括在主题宿主细胞中。在一些情况下，包括两种或更多种(诸如两种或更多种、三种或更多种，或四种或更多种)不同类型的修饰。在某些情况下，主题细胞中包括相同修饰类型的两个或更多个(诸如三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个，或甚至更多个)不同的修饰。
在宿主细胞的一些实施方案中，当细胞包括编码一种或多种酶的一个或多个异源编码序列时，它包括至少一种选自由以下组成的组的另外的修饰：细胞固有的生物合成酶基因中的反馈抑制缓解突变；细胞固有的生物合成酶基因的转录调节修饰；以及细胞固有的酶中的失活突变。在宿主细胞的某些实施方案中，当细胞包括细胞固有的一种或多种生物合成酶基因中的一个或多个反馈抑制缓解突变时，它包括至少一种选自由以下组成的组的另外的修饰：细胞固有的生物合成酶基因的转录调节修饰；细胞固有的酶中的失活突变；以及编码酶的异源编码序列。在宿主细胞的一些实施方案中，当细胞包括细胞固有的一种或多种生物合成酶基因的一个或多个转录调节修饰时，它包括至少一种选自由以下组成的组的另外的修饰：细胞固有的生物合成酶基因中的反馈抑制缓解突变；细胞固有的酶中的失活突变；编码酶的异源编码序列；以及编码改良酶或代谢物的亚细胞运输和/或定位的蛋白质的异源编码序列。在宿主细胞的某些情况下，当细胞包括细胞固有的一种或多种酶中的一个或多个失活突变时，它包括至少一种选自由以下组成的组的另外的修饰：细胞固有的生物合成酶基因中的反馈抑制缓解突变；细胞固有的生物合成酶基因的转录调节修饰；编码酶的异源编码序列；以及编码改良酶或代谢物的亚细胞运输和/或定位的蛋白质的异源编码序列。
在宿主细胞的某些实施方案中，细胞包括细胞固有的一种或多种生物合成酶基因中的一个或多个反馈抑制缓解突变；以及细胞固有的一种或多种生物合成酶基因的一个或多个转录调节修饰。在宿主细胞的某些实施方案中，细胞包括细胞固有的一种或多种生物合成酶基因中的一个或多个反馈抑制缓解突变；以及细胞固有的酶中的一个或多个失活突变。在宿主细胞的某些实施方案中，细胞包括细胞固有的一种或多种生物合成酶基因中的一个或多个反馈抑制缓解突变；以及一个或多个异源编码序列。在一些实施方案中，宿主细胞包括一种或多种修饰(例如，如本文所述)，其包括表1中描述的一种或多种感兴趣的基因。
反馈抑制缓解突变
在一些情况下，宿主细胞是在细胞的一种或多种生物合成酶基因中包括一个或多个反馈抑制缓解突变(诸如两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个，或甚至更多个)的细胞。在一些情况下，一种或多种生物合成酶基因是细胞固有的(例如，存在于未修饰的细胞中)。如本文所用，术语“反馈抑制缓解突变”是指缓解宿主细胞的反馈抑制控制机制的突变。反馈抑制是细胞的控制机制，其中受调控化合物的合成途径中的酶在所述化合物积累到一定水平时受到抑制，从而平衡细胞中所述化合物的量。在一些情况下，一种或多种反馈抑制缓解突变处于图1-4的生物合成途径或图8的示意图中描述的酶中。缓解反馈抑制的突变相对于对照细胞降低感兴趣的细胞中受调控的酶的抑制，并提供增大水平的受调控化合物或其下游生物合成产物。在一些情况下，缓解受调控酶的抑制是指抑制的IC50增加2倍或更多，诸如3倍或更多、5倍或更多、10倍或更多、30倍或更多、100倍或更多、300倍或更多、1000倍或更多，或甚至更多。增大的水平是指对照细胞中的受调控化合物或其下游产物的水平的110％或更多的水平，诸如宿主细胞中的受调控化合物或其下游产物的120％或更多、130％或更多、140％或更多、150％或更多、160％或更多、170％或更多、180％或更多、190％或更多，或200％或更多，诸如至少3倍或更多、至少5倍或更多、至少10倍或更多，或甚至更多。
旨在调控TA前体的水平的宿主细胞固有的多种反馈抑制控制机制和生物合成酶可在宿主细胞中被靶向以用于缓解。宿主细胞可包括细胞固有的一种或多种生物合成酶基因中的一个或多个反馈抑制缓解突变。突变可位于其中生物合成酶受到调控控制的宿主细胞固有的任何便利的生物合成酶基因中。在一些实施方案中，一种或多种生物合成酶基因编码选自以下的一种或多种酶：鸟氨酸脱羧酶(ODC)、鸟氨酸脱羧酶抗酶(antizyme)和腐胺N-甲基转移酶。在一些实施方案中，一种或多种生物合成酶基因编码鸟氨酸脱羧酶。在一些情况下，一种或多种生物合成酶基因编码鸟氨酸脱羧酶抗酶。在一些实施方案中，一种或多种生物合成酶基因编码腐胺N-甲基转移酶。在某些情况下，一个或多个反馈抑制缓解突变存在于选自SPE1、OAZ1和PMT的生物合成酶基因中。在某些情况下，一个或多个反馈抑制缓解突变存在于为SPE1的生物合成酶基因中。在某些情况下，一个或多个反馈抑制缓解突变存在于为OAZ1的生物合成酶基因中。在某些情况下，一个或多个反馈抑制缓解突变存在于为PMT的生物合成酶基因中。在一些实施方案中，宿主细胞包括一种或多种生物合成酶基因(诸如表1所述的那些基因中的一种)中的一个或多个反馈抑制缓解突变。
可利用任何便利数量和类型的突变来缓解反馈抑制控制机制。如本文所用，术语“突变”是指一个或多个氨基酸残基或一个或多个核苷酸残基相对于参考序列或基序的缺失、插入或取代。突变可作为对原始基因座处的天然基因的定向突变并入。在一些情况下，突变可作为基因(作为单独基因座处的遗传整合引入)的另外拷贝，或作为附加型载体(诸如2μ或着丝粒质粒)上的另外拷贝并入。在某些情况下，酶的反馈抑制拷贝处于天然细胞转录调控下。在一些情况下，通过将其置于合成启动子的控制下，酶的反馈抑制拷贝被引入，具有蛋白质表达的工程化的组成型或动态调控。
在某些实施方案中，本发明的宿主细胞可在宿主细胞固有的一种或多种生物合成酶基因中包括1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、13个或更多个、14个或更多个，或甚至15个或更多个反馈抑制缓解突变，诸如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个反馈抑制缓解突变。
转录调节修饰
宿主细胞可包括细胞的一种或多种生物合成酶基因的一个或多个转录调节修饰(诸如两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个，或甚至更多个修饰)。在一些情况下，一种或多种生物合成酶基因是细胞固有的。细胞的任何便利的生物合成酶基因都可被靶向以用于转录调节。转录调节是指相对于对照细胞(例如，未修饰的细胞)，调节感兴趣的基因在经修饰细胞中的表达，例如，增加或减少、增强或阻抑。在一些情况下，感兴趣的基因的转录调节包括增加或增强表达。增加或增强表达是指与对照(即，在未修饰的相同细胞中的表达)相比，感兴趣的基因的表达水平增加2倍或更多，诸如5倍或更多，并且有时增加25、50或100倍或更多，并且在某些实施方案中300倍或更多或更高(例如，通过使用任何便利的基因表达测定)。可替代地，在细胞中的感兴趣的基因的表达低到不可检测的情况下，如果表达增加至可易于检测的水平，则认为感兴趣的基因的表达水平增加。在某些情况下，感兴趣的基因的转录调节包括降低或阻抑表达。降低或阻抑表达是指与对照相比，感兴趣的基因的表达水平降低2倍或更多，诸如5倍或更多，并且有时降低25、50或100倍或更多，并且在某些实施方案中300倍或更多或更高。在一些情况下，表达降低至不可检测的水平。可适用于主题宿主细胞的感兴趣的宿主细胞过程的改良描述于Smolke等人的美国公布号20140273109(14/211,611)中，其公布内容通过引用整体并入本文。
任何便利的生物合成酶基因都可被转录调节，并且包括但不限于图1-3中描述的那些生物合成酶，诸如ARG2、CAR1、SPE1、FMS1、PHA2、ARO8、ARO9和UGP1。在一些情况下，一种或多种生物合成酶基因选自ARG2、CAR1、SPE1和FMS1。在一些情况下，一种或多种生物合成酶基因是ARG2。在某些情况下，一种或多种生物合成酶基因是CAR1。在一些实施方案中，一种或多种生物合成酶基因是SPE1。在一些实施方案中，一种或多种生物合成酶基因是FMS1。在一些实施方案中，宿主细胞包括对一种或多种基因(诸如表1中描述的那些基因中的一种)的一个或多个转录调节修饰。在一些实施方案中，宿主细胞包括对一种或多种基因(诸如图1-4中的一个的生物合成途径或图8的示意图中描述的那些基因中的一种)的一个或多个转录调节修饰。
在一些实施方案中，转录调节修饰包括用强启动子取代一种或多种生物合成酶基因的天然启动子或在强启动子的控制下表达一种或多种基因的一个或多个另外的拷贝。驱动感兴趣的基因表达的启动子可以是组成型启动子或诱导型启动子，前提是所述启动子在宿主细胞中可具有活性。感兴趣的基因可由其天然启动子表达，或可使用非天然启动子。尽管不是必需的，但此类启动子在使用它们的宿主中应具有中等强度至高强度。启动子可以是受调控的或组成型的。在一些实施方案中，使用不受葡萄糖阻抑或因培养基中葡萄糖的存在仅轻度阻抑的启动子。存在许多合适的启动子，其实例包括糖酵解基因的启动子，诸如枯草芽孢杆菌tsr基因的启动子(编码果糖二磷酸醛缩酶)或来自酿酒酵母的GAPDH启动子(编码甘油醛-磷酸脱氢酶)(Bitter G.A.,Meth.Enzymol.152:673 684(1987))。其他感兴趣的强启动子包括但不限于烘焙酵母(baker's yeast)的ADHI启动子(Ruohonen L.等人,J.Biotechnol.39:193 203(1995))、磷酸盐饥饿诱导启动子诸如酵母的PHO5启动子(Hinnen,A.等人,在Yeast Genetic Engineering中,Barr,P.J.等人编辑,Butterworths(1989)、来自地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)的碱性磷酸酶启动子(Lee.J.W.K.等人,J.Gen.Microbiol.137:1127 1133(1991))、GPD1和TEF1。感兴趣的酵母启动子包括但不限于诱导型启动子，诸如Gal1-10、Gal1、GalL、GalS，阻抑型启动子Met25、tetO，以及组成型启动子，诸如甘油醛3-磷酸脱氢酶启动子(GPD)、醇脱氢酶启动子(ADH)、翻译延伸因子1-α启动子(TEF)、细胞色素c-氧化酶启动子(CYC1)、MRP7启动子、磷酸甘油酸激酶(PGK)、磷酸丙糖异构酶(TPI)等。在一些情况下，强启动子是GPD1。在某些情况下，强启动子是TEF1。包含诸如糖皮质激素、类固醇和甲状腺激素的激素可诱导的启动子的自主复制酵母表达载体也是已知的并且包括但不限于糖皮质激素反应元件(GRE)和甲状腺激素反应元件(TRE)，参见例如，美国专利号7,045,290中描述的那些启动子。可使用含有组成型或诱导型启动子诸如α因子、醇氧化酶和PGH的载体。此外，任何启动子/增强子组合(根据真核启动子数据库(Eukaryotic Promoter Data Base，EPDB))也可用于驱动感兴趣的基因的表达。应当理解，可选择对宿主细胞(例如大肠杆菌)具有特异性的任何便利的启动子。在一些情况下，启动子选择可用于优化转录，并且因此优化酶水平，以使产量最大化，同时使能源资源最小化。
失活突变
宿主细胞可包括细胞的酶的一个或多个失活突变(诸如两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个，或甚至更多个)。包括一个或多个失活突变可改良宿主细胞的合成途径的通量，以增加感兴趣的TA或产生所述TA的期望的酶或前体的水平。在一些情况下，一个或多个失活突变是针对细胞固有的酶。图8示出酵母中作用于多胺生产途径的天然调控机制，并且图9示出对这些天然调控系统的破坏对腐胺产量的影响。如本文所用，“失活突变”是指细胞的基因或调控DNA序列的一个或多个突变，其中一个或多个突变使所述感兴趣的基因表达的蛋白质的生物活性失活。在一些情况下，所述基因是细胞固有的。在一些情况下，所述基因编码酶，所述酶是失活的并且是宿主细胞产生的感兴趣的TA的合成途径的一部分或与其相连。在一些情况下，失活突变位于控制感兴趣的基因的调控DNA序列中。在某些情况下，失活突变是针对基因的启动子。任何便利的突变(例如，如本文所述)可用于使感兴趣的基因或调控DNA序列失活。“失活的”或“使......失活”是指相对于由非突变对照基因表达的对照蛋白，由突变基因表达的蛋白质的生物活性降低10％或更多，诸如20％或更多、30％或更多、40％或更多、50％或更多、60％或更多、70％或更多、80％或更多、90％或更多、95％或更多、97％或更多，或99％或更多。在一些情况下，蛋白质是酶并且失活突变降低酶的活性。
在一些实施方案中，细胞在细胞固有的酶中包括失活突变。任何便利的酶都可被靶向以失活。感兴趣的酶包括但不限于图1-4、8、11、22和41中描述的那些酶，其在宿主细胞的生物合成途径中的作用倾向于降低感兴趣的TA的水平。在一些情况下，所述酶具有甲硫腺苷磷酸化酶活性。在某些实施方案中，包括失活突变的酶是MEU1(参见例如，图8、9和13)。在一些情况下，所述酶具有鸟氨酸脱羧酶抗酶活性。在某些实施方案中，包括失活突变的酶是OAZ1。在一些情况下，所述酶具有亚精胺合酶活性。在某些实施方案中，包括失活突变的酶是SPE3。在一些情况下，所述酶具有精胺合酶活性。在一些实施方案中，包括失活突变的酶是SPE4。在一些情况下，所述酶是具有多胺外向转运活性(export activity)的膜转运蛋白。在某些实施方案中，包括失活突变的酶或蛋白质是TPO5。在一些情况下，所述酶具有苯丙烯酸脱羧酶活性。在某些实施方案中，包括失活突变的酶是PAD1。在一些情况下，所述酶具有醇脱氢酶活性。在一些实施方案中，包括失活突变的酶选自ADH2、ADH3、ADH4、ADH5、ADH6、ADH7和SFA1。在某些实施方案中，包括一个或多个失活突变的酶是ADH2。在某些实施方案中，包括一个或多个失活突变的酶是ADH3。在某些实施方案中，包括一个或多个失活突变的酶是ADH4。在某些实施方案中，包括一个或多个失活突变的酶是ADH5。在某些实施方案中，包括一个或多个失活突变的酶是ADH6。在某些实施方案中，包括一个或多个失活突变的酶是ADH7。在某些情况下，所述酶具有醛氧化还原酶活性。在某些实施方案中，包括失活突变的酶选自HFD1、ALD2、ALD3、ALD4、ALD5和ALD6。在某些实施方案中，包括一个或多个失活突变的酶是HFD1。在某些实施方案中，包括一个或多个失活突变的酶是ALD2。在某些实施方案中，包括一个或多个失活突变的酶是ALD3。在某些实施方案中，包括一个或多个失活突变的酶是ALD4。在某些实施方案中，包括一个或多个失活突变的酶是ALD5。在某些实施方案中，包括一个或多个失活突变的酶是ALD6。在一些情况下，所述酶具有葡糖苷酶活性。在某些实施方案中，包括失活突变的酶选自EXG1、SPR1和EGH1。在某些实施方案中，包括一个或多个失活突变的酶是EXG1。在某些实施方案中，包括一个或多个失活突变的酶是SPR1。在某些实施方案中，包括一个或多个失活突变的酶是EGH1。在一些实施方案中，宿主细胞包括对表1中描述的一种或多种基因的一个或多个失活突变。
在非植物宿主中使用酰基转移酶的功能表达进行TA酰基转移反应的方法
本文提供的一些方法、过程和系统描述了一种或多种包含酰基供体基团的TA前体与一种或多种包含酰基受体基团的TA前体在非植物细胞内协同反应，以产生一种或多种TA(下文称为TA酰基转移反应)。这些方法、过程和系统中的一些可包括工程化的宿主细胞。在一些实例中，TA酰基转移反应是将底物转化为多种生物碱的关键步骤。在一些实例中，TA酰基转移反应包括缩合反应。
在一些实例中，TA酰基转移可涉及至少一个缩合反应。在一些情况下，缩合反应中的至少一个在酶的存在下进行。在一些情况下，缩合反应中的至少一个由酶催化。在一些情况下，至少一种酶可用于催化缩合反应。
在本文所述的一些方法、过程和系统中，缩合反应可在酶的存在下进行。在一些实例中，酶可以是酰基转移酶。酰基转移酶可使用具有醇或羧酸酯官能团的TA作为底物。酰基转移酶可使用含有通过与糖(下文称为糖苷)的1-O-β糖苷键活化的羧酸酯基团的TA作为底物。酰基转移酶可将TA醇和羧酸酯/糖苷官能团转化为相应的酯衍生物。在本公开中适用于TA前体的缩合的酶的非限制性实例包括丝氨酸羧肽酶样酰基转移酶(SCPL-AT)。例如，利托林合酶(EC 2.3.1.-)可将托品和其他含有醇官能团的TA前体与1-O-β-苯基乳酰-葡萄糖和其他TA糖苷前体缩合为利托林和其它相应的酯产物。在一些实例中，包含前述实例中的任一个的SCPL-AT结构域的蛋白质可进行缩合。在一些实例中，SCPL-AT可催化宿主细胞(诸如工程化的宿主细胞)内的缩合反应，如本文所述。在其他实例中，SCPL-AT可催化宿主细胞(诸如工程化的宿主细胞)内部的亚细胞区室内的缩合反应，如本文所述。
在本发明的一些实施方案中，对用于进行TA酰基转移反应的酰基转移酶(诸如SCPL-AT酶)的氨基酸序列进行一种或多种改变酶的翻译后加工、运输、折叠、低聚化和/或亚细胞定位的修饰。由于一些酰基转移酶，包括SCPL-AT酶，从未被证明在活的非植物细胞中表现出催化活性，因此此类修饰可被证明对于在非植物宿主细胞中的活性是有用或可能是必要的。此类修饰的实例包括但不限于：添加、去除或替换N端信号肽序列；添加、去除或替换内部前肽序列；添加或去除天冬酰胺连接的N-糖基化位点；添加或去除丝氨酸连接的O-糖基化位点；以及蛋白质结构域与酰基转移酶结构域的N和/或C端的融合。
在本发明的一个实施方案中，SCPL-AT酶结构域通过可溶性蛋白结构域的融合在其N端被修饰。这种可溶性结构域遮蔽了酰基转移酶结构域中的任何内部信号序列，从而改良了融合的SCPL-AT结构域的运输和/或亚细胞定位。在一些实例中，N端融合的结构域诱导SCPL-AT结构域运输至亚细胞区室，包括但不限于ER膜、ER腔、顺式高尔基体、反式高尔基体、溶酶体、液泡膜和液泡腔。N端融合的可溶性结构域还可以将SCPL-AT结构域的低聚状态从其天然状态(单体)改变为任何状态，包括但不限于同源二聚体、异源二聚体、同源三聚体、异源三聚体、同源四聚体、异源四聚体、同源六聚体、异源六聚体、同源八聚体、异源八聚体或更高程度的低聚。
在一个实例中，N端融合的可溶性蛋白结构域是选自包括但不限于以下的组的荧光蛋白：来源于水母属(Aequoria)物种的荧光蛋白和来源于香菇珊瑚属(Discosoma)物种的荧光蛋白。在一个实例中，N端融合的可溶性蛋白结构域是来自香菇珊瑚属物种的红色荧光蛋白(DsRed)。在其他实例中，N端融合的可溶性蛋白结构域是TA生物合成途径中的另一种酶，包括但不限于鸟氨酸脱羧酶、腐胺N-甲基转移酶、吡咯烷酮合酶、托品酮还原酶、苯丙酮酸还原酶、苯基乳酸UDP-葡糖基转移酶84A以及莨菪碱脱氢酶。
可与SCPL-AT结构域(其接着可用于在非植物细胞内进行TA酰基转移反应)的N端融合的可溶性蛋白结构域的氨基酸序列的实例提供于表3中。包含融合的N端结构域并且用于非植物细胞中的TA酰基转移反应的SCPL-AT酶的氨基酸序列可与表3中列出的给定氨基酸序列具有50％或更多的同一性。例如，这种酰基转移酶的氨基酸序列可包含与如本文所提供的氨基酸序列具有至少50％或更多、55％或更多、60％或更多、65％或更多、70％或更多、75％或更多、80％或更多、81％或更多、82％或更多、83％或更多、84％或更多、85％或更多、86％或更多、87％或更多、88％或更多、89％或更多、90％或更多、91％或更多、92％或更多、93％或更多、94％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多，或99％或更多同一性的氨基酸序列。此外，在某些实施方案中，“相同的”氨基酸序列在氨基酸水平上与特定氨基酸序列包含至少80％-99％的同一性。在一些情况下，“相同的”氨基酸序列在氨基酸水平上包含至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％和更多，在某些情况下至少95％、96％、97％、98％和99％的同一性。在一些情况下，氨基酸序列可以是相同的，但是DNA序列被改变，诸如以优化例如宿主生物体的密码子使用。
可提供产生催化TA酰基转移反应的酰基转移酶的工程化的非植物宿主细胞，其中酰基转移酶包含氨基酸序列，其N端融合至选自由表3中的那些序列组成的组的可溶性蛋白结构域的氨基酸序列。工程化宿主细胞内产生的酰基转移酶可回收并纯化以形成生物催化剂。从产生酰基转移酶的工程化宿主细胞中回收的一种或多种酶可在用于进行TA酰基转移反应的过程中使用。所述过程可包括使具有醇和/或羧酸酯/糖苷官能团的TA前体与足以将醇和/或羧酸酯/糖苷基团转化为相应酯基团的量的酰基转移酶接触。在实例中，可使具有醇和/或羧酸酯/糖苷官能团的TA前体与足够量的一种或多种酶接触，使得至少5％的所述TA前体转化为相应的酯。在另外的实例中，可使具有醇和/或羧酸酯/糖苷官能团的TA与足够量的一种或多种酶接触，使得至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少82％、至少84％、至少86％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.7％，或100％的所述TA前体转化为相应的酯。
可用于进行TA酰基转移反应的一种或多种酶可在体外接触TA前体。另外或可替代地，可用于进行TA酰基转移反应的一种或多种酶可在体内接触TA前体。此外，可将可用于进行TA酰基转移反应的一种或多种酶提供给其中具有TA前体的细胞，或所述酶可在工程化的非植物宿主细胞内产生。
在一些实例中，所述方法提供产生生物碱产物的工程化的非植物宿主细胞，其中TA酰基转移反应可构成生物碱产物产生中的关键步骤。在一些实例中，所产生的生物碱是药用TA。在其他实施方案中，所产生的生物碱衍生自药用TA，包括例如非天然TA。在其他实施方案中，生物碱产物选自由药用TA、非药用TA和非天然TA组成的组。
在一些实例中，底物是选自由以下组成的组的TA前体：托品、假托品、芽子碱、甲基芽子碱、苯基乳酸、肉桂酸、阿魏酸、香豆酸以及所列化合物的糖苷。
在一些实例中，所述方法提供由托品和1-O-β-苯基乳酰葡萄糖产生生物碱产物的工程化的非植物宿主细胞。托品和1-O-β-苯基乳酰葡萄糖缩合为利托林可构成由前体产生各种生物碱产物的关键步骤。在一些实例中，前体是L-氨基酸或糖(例如，葡萄糖)。各种生物碱产物可以包括但不限于药用TA、非药用TA和非天然TA。
任何合适的碳源都可用作TA酰基转移反应的前体。合适的前体可以包括但不限于单糖(例如，葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖)、寡糖(例如，乳糖、蔗糖、棉子糖)、多糖(例如，淀粉、纤维素)或其组合。在一些实例中，可以使用来自可再生原料的未纯化混合物(例如，玉米浆、甜菜糖蜜、大麦芽、生物质水解物)。在其他实施方案中，碳前体可以是一碳化合物(例如，甲醇、二氧化碳)或二碳化合物(例如，乙醇)。在其他实施方案中，可以使用其他含碳化合物，例如甲胺、葡糖胺和氨基酸(例如，L-精氨酸和L-苯丙氨酸)。在一些实例中，TA或具有醇和/或羧酸酯/糖苷官能团的TA前体可直接添加到本发明的工程化宿主细胞中，包括，例如，托品、假托品、芽子碱、甲基芽子碱、苯基乳酸、肉桂酸、阿魏酸、香豆酸以及所列化合物的糖苷。
在一些实施方案中，用于进行液泡TA酰基转移反应的底物可包含一个或多个醇和/或羧酸酯/糖苷官能团，其中所述官能团中的仅一个与相应的酯缩合。
TA醇-醛相互转化
本文提供的一些方法、过程和系统描述了具有醛官能团的TA转化为具有醇(羟基)官能团的TA，以及具有醇官能团的TA转化为具有醛官能团的TA(下文称为TA醇-醛相互转化)。这些方法、过程和系统中的一些可包括工程化的宿主细胞。在一些实例中，TA醇-醛相互转化是将底物转化为多种生物碱的关键步骤。在一些实例中，TA醛基团向TA醇基团的转化包括还原反应。在一些情况下，将底物TA醛还原为醇可通过将醛底物还原为相应的四面体氧阴离子中间体，然后将此中间体质子化为羟基来进行，如图2中所提供并且如方案1中一般性地表示的。如方案1中所提供的，R1可以是H、CH3或更高级的烷基；R2和R3可以是H、OH或OCH3；R4可以是H；并且R5可以是H、OH、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、C1-C4酰基、F、Cl或Br。
在一些实例中，TA醇-醛相互转化可涉及至少一个氧化反应或至少一个还原反应。在一些情况下，氧化或还原反应中的至少一个在酶的存在下进行。在一些情况下，氧化或还原反应中的至少一个由酶催化。在一些情况下，氧化和还原反应均在至少一种酶的存在下进行。在一些情况下，至少一种酶可用于催化氧化和还原反应。氧化和还原反应可通过相同的酶催化。
在本文所述的一些方法、过程和系统中，氧化或还原反应可在酶的存在下进行。在一些实例中，酶可以是脱氢酶。脱氢酶可使用具有醇或醛官能团的TA作为底物。脱氢酶可将TA醇或醛官能团转化为相应的醛或醇衍生物。脱氢酶可称为莨菪碱脱氢酶(HDH)。在本公开中适用于TA的氧化和/或还原的酶的非限制性实例包括细胞色素P450氧化酶、2-氧戊二酸依赖性氧化酶、黄素蛋白氧化酶、短链脱氢酶-还原酶(SDR)、中等链脱氢酶-还原酶(MDR)、肉桂醇脱氢酶(CAD)以及醛-酮还原酶(AKR)。例如，托品酮还原酶1(EC 1.1.1.206)可将托品酮和具有酮官能团的其他TA前体氧化成托品(3α-托品醇)和其他相应的醇产物。在一些实例中，包含前述实例中的任一个的脱氢酶结构域的蛋白质可进行氧化或还原。在一些实例中，脱氢酶可催化宿主细胞(诸如工程化的宿主细胞)内的氧化和/或还原反应，如本文所述。
可用于进行TA醇-醛相互转化的脱氢酶的氨基酸序列的实例提供于表2中。用于TA醇-醛相互转化的脱氢酶的氨基酸序列可与如表2中列出的给定氨基酸序列具有50％或更多的同一性。例如，这种脱氢酶的氨基酸序列可包含与如本文所提供的氨基酸序列具有至少50％或更多、55％或更多、60％或更多、65％或更多、70％或更多、75％或更多、80％或更多、81％或更多、82％或更多、83％或更多、84％或更多、85％或更多、86％或更多、87％或更多、88％或更多、89％或更多、90％或更多、91％或更多、92％或更多、93％或更多、94％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多，或99％或更多同一性的氨基酸序列。此外，在某些实施方案中，“相同的”氨基酸序列在氨基酸水平上与特定氨基酸序列包含至少80％-99％的同一性。在一些情况下，“相同的”氨基酸序列在氨基酸水平上包含至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％和更多，在某些情况下至少95％、96％、97％、98％和99％的同一性。在一些情况下，氨基酸序列可以是相同的，但是DNA序列被改变，诸如以优化例如宿主生物体的密码子使用。
可提供一种工程化的宿主细胞，其产生催化TA醇-醛相互转化的脱氢酶，其中脱氢酶包含选自由表2中的那些序列组成的组的氨基酸序列。在工程化的宿主细胞内产生的脱氢酶可回收并纯化以形成生物催化剂。从产生脱氢酶的工程化宿主细胞中回收的一种或多种酶可在用于进行TA醇-醛相互转化的过程中使用。所述过程可包括使具有醇和/或醛官能团的TA与足以将TA的醇和/或醛基团转化为相应的醛和/或醇基团的量的脱氢酶接触。在实例中，可使具有醇和/或醛官能团的TA与足够量的一种或多种酶接触，使得至少5％的所述TA转化为其相应的醛和/或醇基团。在另外的实例中，可使具有醇和/或醛官能团的TA与足够量的一种或多种酶接触，使得至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少82％、至少84％、至少86％、至少88％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.7％，或100％的所述TA转化为其相应的醛和/或醇基团。
可用于进行TA醇-醛相互转化的一种或多种酶可在体外接触TA。另外或可替代地，可用于进行TA醇-醛相互转化的一种或多种酶可在体内接触TA。此外，可将可用于进行TA醇-醛相互转化的一种或多种酶提供给其中具有TA的细胞，或所述酶可在工程化的宿主细胞内产生。
在一些实例中，所述方法提供产生生物碱产物的工程化的宿主细胞，其中TA醇-醛相互转化可构成生物碱产物的产生中的关键步骤。在一些实例中，所产生的生物碱是药用TA。在其他实施方案中，所产生的生物碱衍生自药用TA，包括例如非天然TA。在另一个实施方案中，具有醇和/或醛官能团的TA是工程化的宿主细胞的产物的中间体。在其他实施方案中，生物碱产物选自由药用TA、非药用TA和非天然TA组成的组。
在一些实例中，底物是TA或TA的前体，其选自由以下组成的组：利托林、莨菪醛、莨菪碱、山莨菪碱和东莨菪碱。
在一些实例中，所述方法提供由莨菪醛产生生物碱产物的工程化的宿主细胞。将莨菪醛还原为莨菪碱可构成由前体产生各种生物碱产物的关键步骤。在一些实例中，前体是L-氨基酸或糖(例如，葡萄糖)。各种生物碱产物可以包括但不限于药用TA、非药用TA和非天然TA。
任何合适的碳源都可用作TA醇-醛相互转化的前体。合适的前体可以包括但不限于单糖(例如，葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖)、寡糖(例如，乳糖、蔗糖、棉子糖)、多糖(例如，淀粉、纤维素)或其组合。在一些实例中，可以使用来自可再生原料的未纯化混合物(例如，玉米浆、甜菜糖蜜、大麦芽、生物质水解物)。在其他实施方案中，碳前体可以是一碳化合物(例如，甲醇、二氧化碳)或二碳化合物(例如，乙醇)。在其他实施方案中，可以使用其他含碳化合物，例如甲胺、葡糖胺和氨基酸(例如，L-精氨酸和L-苯丙氨酸)。在一些实例中，可将TA或具有醇和/或醛官能团的的TA前体直接添加到本发明的工程化的宿主细胞中，包括，例如，托品、假托品、芽子碱、甲基芽子碱、利托林、莨菪醛、莨菪碱、山莨菪碱和东莨菪碱。
在一些实施方案中，用于进行TA醇-醛相互转化的底物可包含一个或多个醇和/或醛官能团，其中所述官能团中的仅一个被氧化或还原为相应的醛或醇基团。
用于增加细胞内和细胞外代谢物转运的方法
本文提供的一些方法、过程和系统描述了使用蛋白质(下文称为“转运蛋白”)使代谢物跨脂质膜易位(下文称为“跨膜转运”)。这些方法、过程和系统中的一些可包括工程化的宿主细胞。在一些实例中，跨膜转运是将底物转化为多种生物碱的关键步骤。
在某些实施方案中，宿主细胞包括定位于脂质膜并使TA或TA前体跨同一脂质膜易位的一种或多种转运蛋白或其活性片段的一个或多个异源编码序列。在一些实例中，脂质膜是液泡膜。在其他实例中，脂质膜是ER膜。在一些实例中，脂质膜是过氧化物酶体膜。在其他实例中，脂质膜是细胞质膜。
在一些实例中，以此方式转运的TA和TA前体包括但不限于腐胺、N-甲基腐胺、4-甲基氨基丁醛、N-甲基吡咯啉鎓、托品酮、托品、苯基乳酸、1-O-β-苯基乳酰葡萄糖、利托林、莨菪碱、山莨菪碱和东莨菪碱。此类TA或TA前体在特定亚细胞区室中的积累可以阻止不同区室中可操作地连接的生物合成酶的进入；因此，使用使TA或TA前体从一个区室易位至另一区室的转运蛋白可以减轻此类转运限制。在某些情况下，一种或多种转运蛋白的异源编码序列在宿主细胞内的表达可以增加TA或TA前体的产生。
在一些实施方案中，转运蛋白或其活性片段是多药和毒素外排(MATE)转运蛋白。转运一种或多种上述TA或TA前体的任何便利的MATE转运蛋白可用于主题宿主细胞中。感兴趣的转运蛋白包括但不限于酶诸如普通烟草茉莉酸酯可诱导的生物碱转运蛋白1(NtJAT1)、普通烟草MATE1、普通烟草MATE2或如表1和表4中所述的任何其他蛋白。
在某些实施方案中，转运蛋白或其活性片段是硝酸盐/肽家族(NPF)转运蛋白。转运一种或多种上述TA或TA前体的任何便利的NPF转运蛋白可用于主题宿主细胞中。在其他实施方案中，转运蛋白或其活性片段是ATP结合盒(ABC)转运蛋白。转运一种或多种上述TA或TA前体的任何便利的NPF转运蛋白可用于主题宿主细胞中。在一些实施方案中，转运蛋白或其活性片段是多效耐药(PDR)转运蛋白。转运一种或多种上述TA或TA前体的任何便利的PDR转运蛋白可用于主题宿主细胞中。
在某些实施方案中，宿主细胞包括转运蛋白或其活性片段的异源编码序列。在本发明的一些实施方案中，对转运蛋白的氨基酸序列进行一种或多种改变亚细胞定位、底物易位的方向和/或酶的拓扑取向的修饰。此类修饰的实例包括但不限于：添加、去除或替换N端、C端或内部信号序列；添加、去除、替换或重排跨膜螺旋；以及蛋白质结构域与转运蛋白的N和/或C端的融合。
可以用于减轻底物转运限制和/或增加TA或TA前体在特定细胞区室中的积累的转运蛋白的氨基酸序列的实例提供于表4中。以此方式在非植物细胞中使用的转运蛋白的氨基酸序列可与如表4中列出的给定氨基酸序列具有50％或更多的同一性。例如，这种转运蛋白的氨基酸序列可包含与如本文所提供的氨基酸序列具有至少50％或更多、55％或更多、60％或更多、65％或更多、70％或更多、75％或更多、80％或更多、81％或更多、82％或更多、83％或更多、84％或更多、85％或更多、86％或更多、87％或更多、88％或更多、89％或更多、90％或更多、91％或更多、92％或更多、93％或更多、94％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多，或99％或更多同一性的氨基酸序列。此外，在某些实施方案中，“相同的”氨基酸序列在氨基酸水平上与特定氨基酸序列包含至少80％-99％的同一性。在一些情况下，“相同的”氨基酸序列在氨基酸水平上包含至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％和更多，在某些情况下至少95％、96％、97％、98％和99％的同一性。在一些情况下，氨基酸序列可以是相同的，但是DNA序列被改变，诸如以优化例如宿主生物体的密码子使用。
可提供一种工程化的非植物宿主细胞，其产生使一种或多种TA或TA前体从一个细胞区室易位至另一个细胞区室的转运蛋白，其中转运蛋白包含选自由表4中的那些序列组成的组的氨基酸序列。在一些实例中，所述方法提供产生生物碱产物的工程化的非植物宿主细胞，其中TA跨膜转运可构成生物碱产物产生中的关键步骤。在一些实例中，所产生的生物碱是药用TA。在其他实施方案中，所产生的生物碱衍生自药用TA，包括例如非天然TA。在其他实施方案中，生物碱产物选自由药用TA、非药用TA和非天然TA组成的组。
异源编码序列
在一些情况下，宿主细胞是含有一个或多个异源编码序列(诸如两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个，或甚至更多个)的细胞，所述序列编码使宿主细胞能够产生例如如本文所述的期望的感兴趣的TA的一种或多种活性。如本文所用，术语“异源编码序列”用于表示编码或最终编码通常不存在于宿主生物体中并且在适当条件下可在宿主细胞中表达的肽或蛋白质或其等效氨基酸序列(例如酶)的任何多核苷酸。因此，“异源编码序列”包括通常存在于宿主细胞中的编码序列的多个拷贝，使得细胞表达通常不存在于细胞中的编码序列的另外的拷贝。异源编码序列可以是RNA或其任何类型(例如mRNA)、DNA或其任何类型(例如cDNA)，或RNA/DNA的杂交体。感兴趣的编码序列包括但不限于包括诸如编码序列、内含子、启动子区域、3'-UTR和增强子区域等特征的全长转录单位。
在实例中，工程化的宿主细胞包含各自编码酶的多个异源编码序列。在一些实例中，由多个异源编码序列编码的多种酶可彼此不同。在一些实例中，由多个异源编码序列编码的多种酶中的一些可彼此不同，并且由多个异源编码序列编码的多种酶中的一些可以是重复拷贝。
在一些实例中，异源编码序列可以可操作地连接。可操作地连接的异源编码序列可处于产生特定莨菪烷生物碱产物的相同途径内。在一些实例中，可操作地连接的异源编码序列沿着产生特定莨菪烷生物碱产物的途径可以是直接连续的。在一些实例中，可操作地连接的异源编码序列可在由多个异源编码序列编码的一种或多种酶之间具有一种或多种天然酶。在一些实例中，异源编码序列可在由多个异源编码序列编码的一种或多种酶之间具有一种或多种异源酶。在一些实例中，异源编码序列可在由多个异源编码序列编码的一种或多种酶之间具有一种或多种非天然酶。
在一些实施方案中，宿主细胞包括腐胺N-甲基转移酶(PMT)活性。任何便利的PMT酶均可用于主题宿主细胞。感兴趣的PMT酶包括但不限于诸如EC 2.1.1.53的酶，如表1中所述。在某些实施方案中，宿主细胞包括PMT或其活性片段的异源编码序列。
在一些情况下，宿主细胞包括将NMP转化为4MAB的一种或多种酶或其活性片段的一个或多个异源编码序列。在某些情况下，一种或多种酶选自植物甲基腐胺氧化酶(MPO)和真核MPO(例如，EC 1.4.3.22)。
在某些实施方案中，细胞包括将NMPy转化为MPOB的一种或多种酶或其活性片段的一个或多个异源编码序列。在某些情况下，一种或多种酶是III型聚酮合酶(例如，EC2.3.1.-)。一个或多个异源编码序列可来源于任何便利的物种(例如，如本文所述)。在一些情况下，一个或多个异源编码序列可来源于表1中所述的物种。在一些情况下，一个或多个异源编码序列存在于选自表1中所述的那些的基因或酶中。
在某些实施方案中，宿主细胞包括托品酮合酶活性。任何便利的托品酮合酶(例如，CYP82M3)可用于主题宿主细胞中。感兴趣的托品酮合酶包括但不限于诸如EC1.14.14.-的酶，如表1中所述。在某些实施方案中，宿主细胞包括托品酮合酶或其活性片段的异源编码序列。
在某些实施方案中，宿主细胞包括托品酮还原酶活性。任何便利的托品酮还原酶均可用于主题宿主细胞中。感兴趣的托品酮还原酶包括但不限于诸如EC 1.1.1.206的酶，如表1中所述。在某些实施方案中，宿主细胞包括托品酮还原酶或其活性片段的异源编码序列。
在一些情况下，宿主细胞包括苯丙酮酸还原酶(PPR)活性。任何便利的PPR酶均可用于主题宿主细胞中。一些感兴趣的PPR酶包括但不限于诸如EC 1.1.1.237的酶，如表1中所述。在某些实施方案中，宿主细胞包括PPR或其活性片段的异源编码序列。
在某些实施方案中，宿主细胞包括苯基乳酸糖基转移酶活性。任何便利的苯基乳酸糖基转移酶均可用于主题宿主细胞中。糖基转移酶包括但不限于诸如2.4.1.-的酶，其通过糖苷酯键将葡萄糖部分从UDP-葡萄糖转移至苯基乳酸酯，如表1中所述。在某些实施方案中，宿主细胞包括苯基乳酸糖基转移酶或其活性片段的异源编码序列。
在某些实施方案中，细胞包括将托品和1-O-β-苯基乳酰葡萄糖转化为利托林的一种或多种酶或其活性片段的一个或多个异源编码序列。在一些实施方案中，宿主细胞包括利托林合酶活性。任何便利的利托林合酶或包含利托林合酶活性片段的酶均可用于主题宿主细胞中。感兴趣的利托林合酶包括但不限于诸如EC 2.3.1.-的酶，如表1中所述，以及包含其N端融合至表3中所述的可溶性蛋白结构域的利托林合酶的酶。在某些实施方案中，宿主细胞包括利托林合酶或其活性片段的异源编码序列。
在某些情况下，宿主细胞包括利托林变位酶活性。任何便利的利托林变位酶均可用于主题宿主细胞中。感兴趣的利托林变位酶包括但不限于诸如EC 1.14.19.-的酶，如表1中所述。在某些实施方案中，宿主细胞包括利托林变位酶或其活性片段的异源编码序列。
在一些实施方案中，宿主细胞包括莨菪碱脱氢酶(HDH)活性。任何便利的HDH酶均可用于主题宿主细胞中。一些感兴趣的HDH酶包括但不限于表2中描述的那些序列。在某些实施方案中，宿主细胞包括HDH或其活性片段的异源编码序列。
在某些实施方案中，宿主细胞包括莨菪碱6β-羟化酶/双加氧酶(H6H)活性。任何便利的H6H酶均可用于主题宿主细胞中。一些感兴趣的H6H酶包括但不限于诸如EC1.14.11.11的酶，如表1中所述。在某些实施方案中，宿主细胞包括H6H或其活性片段的异源编码序列。
在某些实例中，工程化的宿主细胞包含各自编码跨膜代谢物转运蛋白的多个异源编码序列。在一些实例中，由多个异源编码序列编码的多种转运蛋白可彼此不同。在一些实例中，由多个异源编码序列编码的多种转运蛋白中的一些可彼此不同，并且由多个异源编码序列编码的多种转运蛋白中的一些可以是重复拷贝。
如本文所用，术语“异源编码序列”还包括肽或酶的编码部分，即肽或酶的cDNA或mRNA序列，以及全长转录单位的编码部分，即，包括内含子和外显子的基因，以及编码酶或编码其等效氨基酸序列的“密码子优化的”序列、截短序列或其他形式的改变序列，前提是等效氨基酸序列产生功能蛋白。此类等效氨基酸序列可具有一个或多个氨基酸的缺失，其中缺失为N端、C端或内部。设想了截短形式，只要它们具有本文指出的催化能力即可。还设想了两种或更多种酶的融合体，以促进代谢物在途径中的转移，前提是催化活性得以保持。还包括一种或多种酶或催化蛋白结构域与一种或多种非催化蛋白结构域的融合体，其融合方式使得非催化蛋白结构域有利于融合的催化结构域的溶解、折叠、成熟和/或活性。
可操作的片段、突变体或截短形式可通过建模和/或筛选进行鉴定。通过以下方式使得这一点成为可能：以逐步方式添加或缺失例如蛋白质的N端、C端或内部区域，然后分析与原始序列相比，所得衍生物关于期望反应的活性。如果所讨论的衍生物以这种能力操作，则认为它完全构成酶的等效衍生物。
本发明的方面还涉及编码与各种酶的天然氨基酸序列等效的氨基酸序列的异源编码序列。为“等效”的氨基酸序列定义为这样的氨基酸序列：其与特定氨基酸序列不相同，而是包含至少一些氨基酸变化(缺失、取代、倒位、插入等)，当用于期望目的时，与特定氨基酸序列的相似活性相比，所述改变基本上不影响蛋白质的生物活性。在脱羧酶的实例中，生物活性是指其催化活性。等效序列还意在包括已经被工程化和/或进化成具有不同于原始氨基酸序列的特性的那些。感兴趣的可变特性包括催化活性、底物特异性、选择性、稳定性、溶解性、定位等。在某些实施方案中，“等效”氨基酸序列在氨基酸水平上与特定氨基酸包含至少80％-99％的同一性，在一些情况下在氨基酸水平上至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％和更多，在某些情况下，至少95％、96％、97％、98％和99％的同一性。在一些情况下，氨基酸序列可以是相同的，但是DNA序列被改变，诸如以优化例如宿主生物体的密码子使用。
宿主细胞也可被修饰成具有一种或多种遗传改变，以适应异源编码序列。天然宿主基因组的改变包括但不限于修饰基因组以减少或消融可能干扰期望途径的特定蛋白质的表达。此类天然蛋白质的存在可将途径的中间体或最终产物中的一种快速转化为代谢物或在期望途径中不可用的其他化合物。因此，如果天然酶的活性降低或完全不存在，则产生的中间体将更容易地可用于并入期望产物中。
在一些情况下，在可能对蛋白质表达的消融感兴趣时，所述改变处于参与多效药物反应的蛋白质中，包括但不限于ATP结合盒(ABC)转运蛋白、多药耐药(MDR)泵，以及相关的转录因子。这些蛋白质参与将TA分子和TA前体外向转运到培养基中，因此缺失控制化合物向培养基中的外向转运，使得它们更可用于并入期望产物中。在一些实施方案中，感兴趣的宿主细胞基因缺失包括与未折叠蛋白反应和内质网(ER)增殖相关的基因。此类基因缺失可导致TA产量的提高。细胞色素P450的表达可诱导未折叠蛋白反应并可导致ER增殖。与这些应激反应相关的基因的缺失可控制或减少宿主细胞的整体负担并改善途径性能。遗传改变还可包括修饰内源基因的启动子以增加表达和/或引入内源基因的另外拷贝。这方面的实例包括构建/使用过表达内源酵母NADPH-P450还原酶Ncp1p以增加异源P450酶的活性的菌株。此外，还可过表达直接参与中间代谢物的合成的内源酶，诸如Spe1p、Fms1p、Car1p、Arg2p、Aro8p、Aro9p、Pha2p、Ugp1p和Leu2p。
感兴趣的异源编码序列包括但不限于编码酶的序列，其为野生型或等效序列，所述酶通常负责植物中TA和前体的产生。在一些情况下，异源序列编码的酶可以是TA途径中的任何酶，并且可来自任何便利的来源。可基于期望的产物选择用于特定合成途径的由异源编码序列编码的酶的选择和数量。在某些实施方案中，本发明的宿主细胞可包括1个或多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、13个或更多个、14个或更多个，或甚至15个或更多个异源编码序列，诸如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个异源编码序列。
在一些情况下，由异源编码序列编码的多肽序列如GENBANK中所报道。感兴趣的酶包括但不限于本文所述的那些酶和表1中所示的那些。宿主细胞可包括来自任何来源的所列出的酶的任何组合。除非另有说明，否则表1中的登录号是指GenBank。一些登录号是指酵母基因组数据库(Saccharomyces genome database，SGD)，所述数据库可在万维网上在yeastgenome.org.获得。
在一些实施方案中，宿主细胞(例如，酵母菌株)被工程化以用于通过将一种或多种酶定位至细胞中的区室来选择性地产生感兴趣的TA。在一些情况下，酶可位于宿主细胞中，使得由此酶产生的化合物自发地重排，或在到达可将化合物转化为不期望的代谢物的局部酶(localized enzyme)之前被另一种酶转化为期望的代谢物。可选择两种酶之间的空间距离，以防止其中一种酶直接作用于化合物以产生不期望的代谢物，并限制不期望的终产物(例如，不期望的阿片类物质副产物)的产生。在一些其他情况下，酶可定位在宿主细胞中，使得其所定位的亚细胞区室为其活性提供比酶天然存在的区室更佳的pH、辅因子浓度、氧化还原电位、底物浓度和/或其他生化参数。在某些情况下，酶可定位于宿主细胞内的特定区室，使得将酶转运至所述区室的细胞内运输途径提供必要的翻译后修饰以使酶表现出活性。此类翻译后修饰包括但不限于乙酰化、乙酰糖基化、酰胺化、羧化、甲基化、谷胱甘肽化、羟基化、糖基化、磷酸化、磺化、二硫键形成、信号序列的切割以及多酶复合物形成。在某些实施方案中，本文所述的任何酶，单独或与第二酶一起，可定位于宿主细胞中的任何便利的区室，包括但不限于细胞器、内质网、高尔基体、液泡、细胞核、质膜、线粒体、过氧化物酶体、周质、任何上述细胞器的腔，或包围任何上述细胞器或与其相关的膜。在一种或多种酶定位于与任何上述细胞器相关的膜的情况下，酶可被定向成使得酶的催化结构域面向胞质溶胶、细胞器的腔和/或任何其他细胞内空间。在一些实施方案中，宿主细胞包括一种或多种包括定位标签的酶。可使用任何便利的标签。在一些情况下，定位标签是连接在酶的N端和/或C端的肽序列。
可使用任何便利的方法将标签连接到酶上。在一些情况下，定位标签衍生自内源性酵母蛋白。此类标签可提供通往多种酵母细胞器的路径，包括但不限于内质网(ER)、高尔基体(GA)、线粒体(MT)、质膜(PM)、过氧化物酶体(POX)和液泡(V)。在某些实施方案中，标签是ER路由标签(例如，ER1)。在某些实施方案中，标签是液泡标签(例如，V1)。在某些实施方案中，标签是质膜标签(例如，P1)。在某些实施方案中，标签是过氧化物酶体靶向序列(例如，PTS1)。在某些情况下，标签包括或衍生自尾锚定类别的蛋白质内的跨膜结构域。在一些实施方案中，定位标签将酶定位在细胞器的外部。在某些实施方案中，定位标签将酶定位在细胞器的内部。在一些实施方案中，定位标签将酶定位成使得酶的一个或多个部分在细胞器的内部和外部都被发现。
在本发明的一些实施方案中，通过表达一个或多个编码序列对宿主细胞进行修饰，所述编码序列编码一种或多种包含上述定位标签的酶。在某些实施方案中，通过表达一个或多个异源编码序列对宿主细胞进行修饰，使得一种或多种酶在胞质溶胶中表达。此类酶的实例包括但不限于精氨酸脱羧酶、腐胺N-甲基转移酶、吡咯烷酮合酶、托品酮还原酶、苯丙酮酸还原酶、UDP-葡糖基转移酶以及2-氧戊二酸依赖性双加氧酶，诸如莨菪碱6β-羟化酶/双加氧酶。在某些实施方案中，通过表达一个或多个异源编码序列对宿主细胞进行修饰，使得一种或多种酶在ER膜中表达。此类酶的实例包括但不限于细胞色素P450，诸如托品酮合酶(CYP82M3)和利托林变位酶(CYP80F1)，以及NADP+-细胞色素P450还原酶。在某些实施方案中，通过表达一个或多个异源编码序列对宿主细胞进行修饰，使得一种或多种酶在线粒体中表达。此类酶的实例包括但不限于N-乙酰谷氨酸合酶。在其他实施方案中，通过表达一个或多个异源编码序列对宿主细胞进行修饰，使得一种或多种酶在过氧化物酶体中表达。此类酶的实例包括但不限于胺氧化酶，诸如N-甲基腐胺氧化酶。在其他实施方案中，通过表达一个或多个异源编码序列对宿主细胞进行修饰，使得一种或多种酶在液泡腔中表达。此类酶的实例包括但不限于丝氨酸羧肽酶样酰基转移酶，诸如利托林合酶，以及其工程化变体。在其他实施方案中，通过表达一个或多个异源编码序列对宿主细胞进行修饰，使得一种或多种酶或蛋白质在液泡膜中表达。此类蛋白质的实例包括但不限于多药和毒素外排转运蛋白、硝酸盐/肽家族转运蛋白和ATP结合盒转运蛋白。在其他实施方案中，通过表达一个或多个异源编码序列对宿主细胞进行修饰，使得一种或多种酶或蛋白质在质膜中表达。此类蛋白质的实例包括但不限于ATP结合盒转运蛋白、多效耐药转运蛋白以及多药抗性转运蛋白。
在一些情况下，通过另外的基因拷贝(即，多个拷贝)增加各类型的酶的表达，这增加中间体积累和/或感兴趣的TA的产生。本发明的实施方案包括通过同时表达单一或多种酶的多种物种变体来增加宿主细胞中感兴趣的TA的产生。在一些情况下，宿主细胞中包括单一或多种酶的另外的基因拷贝。可使用任何便利的方法，包括宿主细胞中酶的异源编码序列的多个拷贝。
在一些实施方案中，宿主细胞包括酶的异源编码序列的多个拷贝，诸如2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个，或甚至10个或更多个拷贝。在某些实施方案中，宿主细胞包括一种或多种酶的异源编码序列的多个拷贝，诸如两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种等的多个拷贝。在一些情况下，酶的异源编码序列的多个拷贝来源于两种或更多种与宿主细胞相比不同的源生物体。例如，宿主细胞可包括一个异源编码序列的多个拷贝，其中每个拷贝来源于不同的源生物体。因此，基于由异源编码序列编码的感兴趣的酶的物种间差异，每个拷贝可在外显序列中包括一些变异。
在宿主细胞的一些实施方案中，异源编码序列来自选自由以下组成的组的源生物体：大肠杆菌、凝结芽孢杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、乳杆菌属物种、荧光威克酵母、水母属物种、香菇珊瑚属物种、拟南芥、燕麦、番茄(Solanum lycopersicum)、马铃薯(Solanumtuberosum)、普通烟草(Nicotiana tabacum)、本氏烟草(Nicotiana benthamiana)、颠茄、天仙子(Hyoscyamus niger)、黑莨菪(Hyoscyamus muticus)、大花曼陀罗(Daturastramonium)、洋金花(Datura metel)、毛曼陀罗(Datura innoxia)、都柏林(Duboisiamyoporoides)、铃铛子(Anisodus luridus)、山莨菪(Anisodus tanguticus)、三分三、木本曼陀罗(Brugmansia arborea)、白花曼陀罗(Brugmansia×candida)、红花曼陀罗(Brugmansia sanguinea)、古柯树(Erythroxylum coca)、岩荠(Cochleariaofficinalis)、茄属物种(Solanum spp)、烟草属物种(Nicotiana spp)、颠茄属物种(Atropa spp)、天仙子属物种(Hyoscyamus spp)、曼陀罗属物种(Datura spp)、澳洲毒茄属物种(Duboisia spp)、山莨菪属物种(Anisodus spp)、木曼陀罗属物种(Brugmansia spp)、古柯属物种(Erythroxylum spp)或岩荠属物种(Cochlearia spp)。在某些情况下，异源编码序列来自选自颠茄、天仙子和大花曼陀罗的源生物体。在一些实施方案中，宿主细胞包括来自表1中描述的一种或多种源生物体的异源编码序列。
可对工程化宿主细胞培养基进行取样并监测感兴趣的TA的产生。可使用任何便利的方法观察和测量感兴趣的TA。感兴趣的方法包括但不限于LC-MS方法(例如，如本文所述)，其中通过与已知量的标准化合物进行比较来分析感兴趣的样品。可例如通过m/z和MS/MS碎片模式确认身份，并且化合物的定量或测量可参考已知量的化合物标准品的相应LC-MS分析通过已知保留时间的LC痕量峰和/或EIC MS峰分析来实现。
方法
过程步骤
如上所述，本发明的方面包括制备感兴趣的莨菪烷生物碱(TA)的方法。因此，本发明的方面包括在一定条件下培养宿主细胞，在所述条件下一种或多种宿主细胞修饰(例如，如本文所述)功能性地表达，使得细胞将感兴趣的起始化合物转化为感兴趣的产物TA或其前体(例如，预酯化TA)。还提供了方法，其包括在适合蛋白质产生的条件下培养宿主细胞，使得一个或多个异源编码序列功能性地表达并将感兴趣的起始化合物转化为感兴趣的产物TA。在一些情况下，所述方法是制备莨菪烷生物碱(TA)的方法，其包括培养宿主细胞(例如，如本文所述)；向细胞培养物中添加起始化合物；以及从细胞培养物中回收TA。在所述方法的一些实施方案中，起始化合物、TA产物和宿主细胞通过表1中的条目之一描述。
发酵培养基可包含合适的碳底物。适于执行本公开的方法的碳源可包括广泛多种含碳底物。合适的底物可包括但不限于单糖(例如，葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖)、寡糖(例如，乳糖、蔗糖、棉子糖)、多糖(例如，淀粉、纤维素)或其组合。在一些情况下，可使用来自可再生原料的未纯化混合物(例如，玉米浆、甜菜糖蜜、大麦芽)。在一些情况下，碳底物可以是一碳底物(例如，甲醇、二氧化碳)或二碳底物(例如，乙醇)。在其他情况下，可使用其他含碳化合物，例如甲胺、葡糖胺和氨基酸。
培养宿主细胞的任何便利的方法可用于产生TA前体和感兴趣的下游TA。所采用的具体方案可变化，例如，取决于宿主细胞、异源编码序列、期望的TA前体和感兴趣的下游TA等。细胞可存在于任何便利的环境中，诸如其中细胞能够表达一种或多种功能性异源酶的环境。体外，如本文所用，仅指在活细胞外部，而不考虑细胞的位置。如本文所用，术语体内表示在活细胞内部，而不考虑细胞的位置。在一些实施方案中，细胞在有益于酶表达的条件下并且与可获得以允许在体内产生TA前体和感兴趣的下游TA的适当底物一起培养。在一些实施方案中，从宿主中提取功能酶以在体外条件下产生TA。在一些情况下，将宿主细胞放回多细胞宿主生物体中。宿主细胞处于任何生长期，包括但不限于静止期和对数生长期等。此外，培养物本身可以是连续培养物或它们可以是分批培养物。
可使细胞在适当的发酵培养基中在20-40℃之间的温度下生长。可使细胞在任何便利速度(例如，200rpm)的振荡下生长。可使细胞在合适的pH下生长。适合发酵的pH范围可在pH5-9之间。发酵可在需氧、厌氧或微需氧条件下进行。可使用任何合适的生长培养基。合适的生长培养基可包括但不限于常见的商业制备培养基，诸如合成限定(SD)基本培养基或酵母提取物蛋白胨右旋糖(YEPD)富集培养基。可使用适合微生物的任何其他富集的、限定的或合成的生长培养基。
细胞可在基本上任何尺寸和形状的容器中培养。适于执行本公开的方法的容器的实例可包括但不限于多孔摇板、试管、烧瓶(带挡板的和不带挡板的)以及生物反应器。培养基的体积可在10微升至大于10,000升的范围内。
可包括向生长培养基添加已知以生物碱的产生所期望的方式调节代谢的剂。在一个非限制性实例中，可将环腺苷2’3’-单磷酸添加至生长培养基，以调节分解代谢物阻抑。
可利用用于特定细胞类型的任何便利的细胞培养条件。在某些实施方案中，包括一种或多种修饰的宿主细胞在标准或容易优化的条件下用标准细胞培养基和补充剂培养。例如，当不需要用于质粒维持的选择性压力时，标准生长培养基可含有20g/L酵母提取物、10g/L蛋白胨以及20g/L右旋糖(YPD)。含有质粒的宿主细胞在合成完全(SC)培养基中生长，所述培养基含有1.7g/L酵母氮碱、5g/L硫酸铵和20g/L右旋糖，并补充有生长和选择所需的适当氨基酸。可用于可诱导的酶表达的替代性碳源包括但不限于蔗糖、棉子糖和半乳糖。在实验室中，使细胞在任何便利的温度(例如，30℃)下在任何便利速率(例如，200rpm)的振荡下在容器中生长，所述容器例如体积范围为1-1000mL或更大的试管或烧瓶。
例如，作为工业过程的一部分，可扩大培养体积以在更大的发酵容器中生长。工业发酵过程可在封闭分批、补料分批或连续恒化条件下或任何合适的发酵模式下进行。在一些情况下，细胞可固定在底物上作为整体细胞催化剂并经受发酵条件以产生生物碱。
分批发酵是一种封闭系统，其中培养基的组成在发酵开始时设定并且在发酵过程中不改变。在发酵开始时将一种或多种期望的生物体接种到培养基中。在一些情况下，在对系统作出改变以控制诸如pH和氧浓度(但不是碳)等因素的情况下运行分批发酵。在此类型的发酵系统中，系统的生物质和代谢物组成在发酵过程中不断变化。细胞通常经历一个迟滞期，然后进入对数期(高生长速率)，然后进入静止期(生长速率降低或停止)，并且最终进入死亡期(如果不加处理的话)。
补料分批发酵类似于分批发酵，不同之处在于在发酵工艺过程中将底物间隔地添加到系统中。补料分批系统用于减少分解代谢物阻抑对宿主细胞代谢的影响，以及在期望生长培养基中具有有限量的底物的其他情况下。
连续发酵是开放系统，其中将限定的发酵培养基连续添加到生物反应器中，并从容器中连续取出等量的发酵培养基用于加工。通常操作连续发酵系统以维持稳态生长条件，使得必须通过发酵中的生长速率来平衡由于取出培养基造成的细胞损失。连续发酵通常在细胞处于恒定高细胞密度的条件下操作。连续发酵允许调节影响靶标产物浓度和/或细胞生长的一种或多种因素。
液体培养基可包括但不限于具有上述添加剂组分的富集或合成限定培养基。培养基组分可溶解在水中并通过加热、加压、过滤、辐射、化学品或其任何组合进行灭菌。几种培养基组分可单独制备和灭菌，然后在发酵容器中配混。可缓冲培养基以帮助在整个发酵过程中维持恒定的pH。
可在发酵过程中监测或控制过程参数，包括温度、溶解氧、pH、搅拌、通气速率和细胞密度。例如，发酵过程的温度可通过浸入培养基中的温度探针进行监测。可通过调节夹套温度将培养温度控制在设定点。水可在外部冷却器中冷却，然后流入生物反应器控制塔中，并在维持容器中的设定点温度所需的温度下循环至夹套。
此外，在发酵过程中可监测气体流参数。例如，气体可通过喷射器(sparger)流入培养基中。适用于本公开的方法的气体可包括压缩空气、氧气和氮气。气体流可处于固定速率或被调节以维持溶解氧设定点。
还可监测培养基的pH。在实例中，可通过浸入容器内部的培养基中的pH探针监测pH。如果pH控制有效，则可通过酸泵和碱泵调整pH，所述泵将每种溶液以所需的速率添加到培养基中。用于控制pH的酸溶液可以是硫酸或盐酸。用于控制pH的碱溶液可以是氢氧化钠、氢氧化钾或氢氧化铵。
此外，可通过浸入培养基中的溶解氧探针来监测培养基中的溶解氧。如果溶解氧调控有效，那么可通过增大或减小搅拌速度来调整氧含量。溶解氧含量也可通过增大或减小气体流速来调整。气体可以是压缩空气、氧气或氮气。
在发酵过程中还可监测搅拌速度。在实例中，搅拌器马达可驱动搅动器。搅拌器速度可在整个发酵过程中设置为一致的rpm，或者可动态调控以维持设定的溶解氧含量。
此外，在发酵过程中可监测浊度。在实例中，可使用浊度探针测量细胞密度。可替代地，可通过从生物反应器中取样并在分光光度计中对其进行分析来测量细胞密度。此外，可通过无菌取样装置以时间间隔从生物反应器中取出样品。可分析样品中由宿主细胞产生的生物碱。还可分析样品的其他代谢物和糖、培养基组分的消耗，或细胞的密度。
在另一个实例中，可在发酵过程期间监测原料参数。具体地，可使用外部泵将包括糖和其他碳源、营养物质和辅因子的原料添加到发酵中。在发酵过程中还可添加其它组分，包括但不限于消泡剂、盐、螯合剂、表面活性剂和有机液体。
用于优化异源多核苷酸在宿主细胞中的表达的任何便利的密码子优化技术都可适用于主题宿主细胞和方法，参见例如Gustafsson,C.等人(2004)Trends Biotechnol,22,346-353，其全部内容以引用方式并入。
主题方法还可包括向细胞培养物中添加起始化合物。任何便利的添加方法都可适用于主题方法。细胞培养物可补充有足够量的感兴趣的起始材料(例如，如本文所述)，例如mM至μM量，诸如约1-5mM之间的起始化合物。应当理解，所添加的起始材料的量、添加的时间和速率、所添加的材料的形式等可根据多种因素变化。起始材料可以纯添加或预先溶解在合适的溶剂(例如，细胞培养基、水或有机溶剂)中。起始材料可以浓缩形式(例如，超过期望浓度的10x)添加，以最小化添加后细胞培养基的稀释。起始材料可以一个或多个批次或通过在延长的时间段(例如，数小时或数天)内连续添加来添加。
用于从发酵培养基中分离产物的方法
主题方法还可包括从细胞培养物中回收感兴趣的TA。任何便利的分开(separation)和分离(isolation)方法(例如，色谱法或沉淀法)均可适用于主题方法以从细胞培养物中回收感兴趣的TA。过滤方法可用于将细胞培养物的可溶性级分与不可溶级分分开。在一些情况下，液相色谱方法(例如，反相HPLC、尺寸排阻、正相色谱)可用于将感兴趣的TA与细胞培养物的其他可溶性组分分开。在一些情况下，萃取方法(例如，液体萃取、基于pH的纯化等)可用于将感兴趣的TA与细胞培养物的其他组分分开。
可使用本领域已知的方法从发酵培养基中分离所产生的生物碱。多个回收步骤可在发酵之后立即(或在一些情况下，在发酵期间)进行以初始回收期望产物。通过这些步骤，可将生物碱(例如，TA)与细胞、细胞碎片和废弃物分开，并且其他营养物质、糖和有机分子可保留在废培养基中。此过程可用于得到富含TA的产物。
在一个实例中，通过向分批反应器中提供工程化的酵母细胞和包括营养物质和水的原料来形成具有莨菪烷生物碱(TA)产物的产物流。工程化的酵母细胞可具有选自由以下组成的组的至少一种修饰：细胞固有的生物合成酶基因中的反馈抑制缓解突变；细胞固有的生物合成酶基因的转录调节修饰；以及细胞固有的酶中的失活突变。当工程化的酵母细胞处于分批反应器内时，工程化的酵母细胞可进行发酵。具体地，可通过将工程化的酵母细胞孵育至少约5分钟的时间段来使工程化的酵母细胞进行发酵，以产生包含TA产物和细胞材料的溶液。一旦工程化的酵母细胞已进行发酵，就可使用至少一个分离单元将TA产物与细胞材料分离以提供包含TA产物的产物流。具体地，产物流可包括TA产物以及附加组分，诸如澄清的酵母培养基。此外，TA产物可包含一种或多种感兴趣的TA，诸如一种或多种TA化合物。
可使用不同的方法从包括感兴趣的TA的生物反应器培养基中去除细胞。在实例中，可通过随时间沉降来去除细胞。这种沉降过程可通过冷却或通过添加澄清剂(finingagent)(诸如二氧化硅)来加速。然后可从反应器顶部虹吸废培养基，或可从反应器底部滗析出细胞。可替代地，可通过利用过滤器、膜或其他多孔材料过滤来去除细胞。细胞也可通过离心去除，例如通过连续流动离心或通过使用连续萃取器。
如果一些有价值的感兴趣的TA存在于细胞内部，则可对细胞进行透化或裂解，并且可通过任何上述方法去除细胞碎片。用于使细胞透化的剂可包括但不限于有机溶剂(例如，DMSO)或盐(例如，乙酸锂)。裂解细胞的方法可包括添加表面活性剂诸如十二烷基硫酸钠，或通过珠磨或超声进行的机械破碎。
通过添加与含水培养基不混溶的有机液体，可通过液-液萃取从澄清的废培养基中萃取感兴趣的TA。合适的有机液体的实例包括但不限于肉豆蔻酸异丙酯、乙酸乙酯、氯仿、乙酸丁酯、甲基异丁基酮、油酸甲酯、甲苯、油醇、丁酸乙酯。可将有机液体添加至含水培养基体积的少至10％或多至100％。
在一些情况下，有机液体可在发酵开始时或在发酵过程中的任何时间添加。这种萃取发酵过程通过不断地将TA前体或TA移除至有机相中可提高来自宿主细胞的感兴趣的TA的收率。
搅动可导致有机相与含水培养基形成乳液。促进两相分离成不同层的方法可包括但不限于添加破乳剂或成核剂，或调整pH。也可将乳液离心以分离两相，例如通过连续锥形板离心。
可替代地，可从含水培养基中分离有机相，以便在萃取后物理去除。例如，溶剂可封装在膜中。
在实例中，可使用吸附方法从发酵培养基中萃取感兴趣的TA。具体地，可通过添加树脂诸如XAD4或通过吸附移除TA的其他剂从澄清的废培养基中萃取感兴趣的TA。然后可使用有机溶剂从树脂中释放感兴趣的TA。合适的有机溶剂的实例包括但不限于甲醇、乙醇、乙酸乙酯或丙酮。
也可使用过滤从发酵培养基中萃取感兴趣的TA。在高pH下，感兴趣的TA可在生物反应器中形成结晶样沉淀物。这种沉淀物可通过利用过滤器、膜或其他多孔材料过滤直接去除。沉淀物也可通过离心和/或滗析收集。
上述萃取方法可原位(在生物反应器中)或异位(例如，在外部回路中，培养基通过所述回路流出生物反应器并接触萃取剂，然后再循环回到容器中)进行。可替代地，萃取方法可在发酵终止后使用从生物反应器容器中取出的澄清培养基进行。
用于从富含生物碱的溶液中纯化产物的方法
后续纯化步骤可涉及使用本领域已知的方法处理发酵后的富含TA前体或TA的产物，以便以高纯度回收各个感兴趣的产物物种。
在一个实例中，可将萃取于有机相中的TA前体或TA转移到水溶液中。在一些情况下，可通过加热和/或真空蒸发有机溶剂，并且可将所得粉末溶解于合适pH的水溶液中。在另一个实例中，可通过添加促进将TA前体或TA萃取到水相中的合适pH的水溶液来从有机相中萃取TA前体或TA。然后可通过滗析、离心或另一方法去除水相。
可进一步处理含有TA前体或TA的溶液以去除金属，例如，通过用合适的螯合剂处理。可通过沉淀进一步处理含有TA前体或TA的溶液以去除其他杂质，诸如蛋白质和DNA。在一个实例中，用适当的沉淀剂诸如乙醇、甲醇、丙酮或异丙醇处理含有TA前体或TA的溶液。在一个替代性实例中，可通过透析或通过将较小的生物碱与污染的生物大分子分开的其他尺寸排阻方法去除DNA和蛋白质。
在另外的实例中，可使用本领域已知的方法通过连续错流过滤将含TA前体、TA或经修饰的TA的溶液萃取至高纯度。
如果溶液含有TA前体或TA的混合物，则可使用本领域已知的方法对其进行酸碱处理以得到单独的感兴趣的TA物种。在此过程中，调整水溶液的pH以使单独的TA前体或TA在各自的pKa下沉淀。
对于高纯度、小规模的制备，TA前体或TA可通过液相色谱在单一步骤中纯化。
酵母衍生的生物碱API相对于植物衍生的API
澄清的酵母培养基(CYCM)可能含有多种杂质。澄清的酵母培养基可通过真空和/或加热脱水，以产生富含生物碱的粉末。此产物类似于茄属植物叶片(CNL)的浓缩物，活性药物成分(API)制造商将其用于提取待进行进一步的化学处理和纯化的莨菪烷生物碱。出于本发明的目的，CNL是任何类型的纯化植物提取物的代表性实例，最终可从中进一步纯化一种或多种期望的生物碱产物。表5突出显示了这两种产物中的杂质，所述杂质可以是CYCM或CNL特有的，或可存在于两者中。通过针对这些杂质的子集分析未知来源的产物，本领域技术人员可以确定所述产物是来源于酵母还是植物生产宿主。
API级药物成分是高度纯化的分子。因此，可指示API的植物或酵母来源的杂质(诸如表2和3中列出的那些)在产物的API阶段可能不存在。实际上，来源于本发明的酵母菌株的许多API产物可能在很大程度上与传统的植物衍生的API无法区分。然而，在一些情况下，可使用化学合成方法对常规生物碱化合物进行化学修饰，其在需要此类化学修饰的基于植物的产物中可显示为化学杂质。例如，化学衍生化通常可导致一组与化学合成过程相关的杂质。在某些情况下，这些修饰可在酵母生产平台中以生物学方式进行，从而避免一些与化学衍生相关的杂质存在于酵母衍生的产物中。具体地，来自化学衍生产物的这些杂质可存在于使用化学合成过程产生的API产物中，但可不存在于使用酵母衍生的产物产生的API产物中。可替代地，如果酵母衍生的产物与化学衍生的产物混合，则所得杂质可存在，但量低于仅或主要包含化学衍生的产物的API中将预期的量。在此实例中，通过针对这些杂质的子集分析API产物，本领域技术人员可以确定产物是来源于酵母生产宿主还是传统的化学衍生化路径。
可存在于化学衍生的莨菪烷生物碱API中但不存在于生物合成的API中的杂质的非限制性实例包括通过莨菪碱和东莨菪碱的化学N-烷基化(诸如N-甲基化和N-丁基化)形成的卤化氢，诸如氯化氢、碘化氢和溴化氢。
然而，在酵母衍生的化合物和植物衍生的化合物均通过化学合成方法进行化学修饰的情况下，可预期产物中存在与化学合成过程相关的相同杂质。在这种情况下，可如上所述分析起始材料(例如，CYCM或CNL)。
工程化宿主细胞的方法
还包括工程化宿主细胞以用于产生感兴趣的TA或其前体的方法。可使用任何便利的方法实现将DNA插入宿主细胞中。所述方法用于将异源编码序列插入宿主细胞中，使得宿主细胞功能性地表达酶并将感兴趣的起始化合物转化为感兴趣的产物TA。
在主题宿主细胞和方法中可使用任何便利的启动子。驱动异源编码序列表达的启动子可以是组成型启动子或诱导型启动子，前提是所述启动子在宿主细胞中具有活性。异源编码序列可由其天然启动子表达，或可使用非天然启动子。此类启动子在使用它们的宿主中可具有低至高强度。启动子可以是受调控的或组成型的。在某些实施方案中，使用不受葡萄糖阻抑或仅被培养基中葡萄糖的存在轻度阻抑的启动子。感兴趣的启动子包括但不限于糖酵解基因的启动子，诸如枯草芽孢杆菌tsr基因的启动子(编码果糖二磷酸醛缩酶基因的启动子区域)或来自编码甘油醛3-磷酸脱氢酶(GPD、GAPDH或TDH3)的酿酒酵母基因的启动子、烘焙酵母的ADH1启动子、磷酸盐饥饿诱导启动子诸如酵母的PHO5启动子、来自地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)的碱性磷酸酶启动子、酵母诱导型启动子诸如Gal1-10、Gal1、GalL、GalS、阻抑型启动子Met25、tetO，以及组成型启动子，诸如甘油醛3-磷酸脱氢酶启动子(GPD)、醇脱氢酶启动子(ADH)、翻译延伸因子-1-α启动子(TEF)、细胞色素c-氧化酶启动子(CYC1)、MRP7启动子、磷酸甘油酸激酶(PGK)、磷酸丙糖异构酶(TPI)等。也可使用含有通过诸如糖皮质激素、类固醇和甲状腺激素的激素可诱导的启动子的自主复制酵母表达载体并且包括但不限于糖皮质激素反应元件(GRE)和甲状腺激素反应元件(TRE)。这些和其他实例在美国专利号7,045,290中有所描述，其通过引用并入，包括其中引用的参考文献。可使用含有组成型或诱导型启动子诸如α因子、醇氧化酶和PGH的另外的载体。此外，任何启动子/增强子组合(根据真核启动子数据库EPDB也可用于驱动基因的表达。任何便利的适当的启动子可被选择用于宿主细胞，例如大肠杆菌。还可使用启动子选择来优化转录，并且因此优化酶水平，以使产量最大化，同时使能源资源最小化。
在主题宿主细胞和方法中可使用任何便利的载体。感兴趣的载体包括用于酵母和其他细胞的载体。酵母载体的类型可分为4大类：整合载体(YIp)、自主复制高拷贝数载体(YEp或2μ质粒)、自主复制低拷贝数载体(YCp或着丝粒质粒)以及用于克隆大片段的载体(YAC)。通过任何便利的转化或转染技术将载体DNA引入原核或真核细胞中。
实用性
本发明的宿主细胞和方法，例如，如上所述，可用于多种应用。感兴趣的应用包括但不限于：研究应用和治疗应用。本发明的方法可用于多种不同的应用，包括对TA的产生感兴趣的任何便利的应用。
主题宿主细胞和方法可用于多种治疗应用。感兴趣的治疗应用包括对制备包括TA的药物产品感兴趣的那些应用。本文所述的宿主细胞产生莨菪烷生物碱前体(TA前体)和感兴趣的TA。托品酮和托品是TA合成(包括产生终产物(诸如药用TA产物)的工程化努力)中感兴趣的主要分支点中间体。主题宿主细胞可用于由简单且廉价的起始材料产生TA前体，所述起始材料可用于产生感兴趣的TA，包括托品酮、托品和TA终产物。因此，主题宿主细胞可用于供应治疗活性TA或其前体。
在一些情况下，宿主细胞和方法可用于产生商业规模量的TA或其前体，其中这些化合物的化学合成收率低，并且不是大规模生产的可行手段。在某些情况下，宿主细胞和方法在发酵设施中使用，所述发酵设施将包括例如5,000-200,000升容量的生物反应器(发酵罐)，从而允许快速生产用于治疗产品的感兴趣的TA或其前体。此类应用可包括由可发酵碳源(诸如纤维素、淀粉和游离糖)以工业规模生产感兴趣的TA。
主题宿主细胞和方法可用于多种研究应用。主题宿主细胞和方法可用于分析多种酶对多种感兴趣的TA或其前体的生物合成途径的影响。此外，宿主细胞可被工程化以产生TA或其前体，所述TA或其前体可用于在尚未证实的治疗功能方面测试感兴趣的生物活性。在一些情况下，将宿主细胞工程化以包括编码多种酶的多种异源编码序列阐明了朝向感兴趣的TA或其前体的高收率生物合成途径。在某些情况下，研究应用包括产生感兴趣的治疗分子的前体，然后可进一步对其进行化学修饰或将其衍生化为期望的产物，或用于针对增加的感兴趣的治疗活性进行筛选。在一些情况下，宿主细胞株用于针对此类途径中感兴趣的酶活性进行筛选，这可导致通过在这些菌株中产生的TA代谢物的转化来发现酶。
主题宿主细胞和方法可用作植物专用代谢物的生产平台。主题宿主细胞和方法可用作药物库开发以及植物酶发现的平台。例如，主题宿主细胞和方法可用于通过获取产生感兴趣的支架分子(诸如莨菪碱和东莨菪碱)的酵母菌株，并通过组合生物合成或化学手段对化合物结构进一步功能化来开发基于天然产物的药物库。通过以此方式产生药物库，任何潜在的药物命中都已经与适合大规模培养和生产的生产宿主相关联。作为另一个实例，这些主题宿主细胞和方法可用于植物酶发现。主题宿主细胞提供限定代谢物的干净背景，以表达植物表达的序列标签(EST)文库，以鉴定新的酶活性。主题宿主细胞和方法为酵母中植物酶的功能性表达和活性增加提供了表达方法和培养条件。
试剂盒和系统
本发明的方面还包括试剂盒和系统，其中试剂盒和系统可包括本发明的方法中使用的一种或多种组分，例如宿主细胞、起始化合物、异源编码序列、载体、培养基等，如本文所述。在一些实施方案中，主题试剂盒包括宿主细胞(例如，如本文所述)和一种或多种选自以下的组分：起始化合物、异源编码序列和/或包括所述异源编码序列的载体、载体、生长原料、适用于表达系统的组分(例如，细胞、克隆载体、多克隆位点(MCS)、双向启动子、内部核糖体进入位点(IRES)等)以及培养基。
本文所述的任何组分可在试剂盒中提供，例如，包括一种或多种修饰的宿主细胞、起始化合物、培养基等。适用于制备和使用异源编码序列、克隆载体和表达系统的多种组分可用于主题试剂盒中。试剂盒还可包括管、缓冲液等，以及使用说明。根据需要，试剂盒的各种试剂组分可存在于单独容器中，或它们中的一些或全部可在单个容器中预先配混成试剂混合物。
还提供了用于产生感兴趣的TA的系统，其中所述系统可包括包含一种或多种修饰(例如，如本文所述)的工程化的宿主细胞、起始化合物、培养基、发酵罐和发酵设备，例如适用于维持宿主细胞的生长条件、取样和监测设备和部件等的装置。适用于酵母细胞的大规模发酵的多种部件可用于主题系统中。
在一些情况下，所述系统包括用于工程化的宿主细胞的大规模发酵，以及由发酵的宿主细胞产生的TA化合物的监测和纯化的部件。在某些实施方案中，在发酵罐中的工程化的宿主细胞借由产生一种或多种期望的TA产物或其前体的条件下，将一种或多种起始化合物(例如，如本文所述)添加至系统。在一些情况下，宿主细胞产生感兴趣的TA(例如，如本文所述)。在某些情况下，感兴趣的TA产物是药用TA产物，诸如莨菪碱、N-甲基莨菪碱、山莨菪碱、东莨菪碱、N-甲基东莨菪碱和N-丁基东莨菪碱。
在一些情况下，所述系统包括用于监测和或分析由主题宿主细胞产生的一种或多种TA化合物或其前体的装置。例如，如本文所述的LC-MS分析系统、色谱系统，或其中可对样品进行分析并与例如如本文所述的标准品进行比较的任何便利的系统。发酵培养基可在发酵之前和发酵期间的任何便利的时间通过取样和分析进行监测。当起始化合物向感兴趣的TA产物或前体的转化完成时，可停止发酵并且可进行TA产物的纯化。因此，在一些情况下，主题系统包括适用于从产生感兴趣的TA产物或前体的宿主细胞培养基中纯化所述感兴趣的TA产物或前体的纯化部件。纯化部件可包括可用于纯化发酵的TA产物或前体的任何便利的手段，包括但不限于二氧化硅色谱(silica chromatography)、反相色谱、离子交换色谱、HIC色谱、尺寸排阻色谱、液体萃取以及pH萃取方法。在一些情况下，在将一种或多种起始化合物输入系统之后，主题系统提供感兴趣的TA发酵产物的产生和分离。
给出以下实施例以便为本领域的普通技术人员提供如何制备和使用本发明的完整公开和描述，并且既不旨在限制发明人所认为的他们的发明的范围，也不旨在表示以下实验是所进行的全部或仅有的实验。已经做出努力以确保关于所使用的数字(例如量、温度等)的准确性，但是应当考虑一些实验误差和偏差。除非另外说明，否则份数是重量份，分子量是重均分子量，温度是摄氏度，并且压力是大气压或接近大气压。
示例性方法
以下部分提供可以用于构建、培养和测试用于产生TA前体和TA的微生物菌株(诸如酵母菌株)以及进行此类菌株的发酵以生产TA前体和TA的方法和程序的实例。还包括可以用于产生微生物宿主的修饰所需的DNA序列并将期望DNA序列引入微生物宿主中的方法、程序和材料的实例。
化学化合物和标准品。用于验证由工程化的宿主细胞产生的代谢物的身份并对其定量的TA前体和TA的化学标准品可从商业供应商处购买。例如，腐胺二盐酸盐、N-甲基腐胺、古豆碱、托品酮和托品可购自Santa Cruz Biotechnology(Dallas,TX)。4-(甲基氨基)丁酸盐酸盐可购自Sigma(St.Louis,MO)。γ-甲基氨基丁醛(4MAB)二乙缩醛和利托林可购自Toronto Research Chemicals(Toronto,ON)。NMPy的化学标准品可以通过以下方式合成：在60℃下持续30分钟用五体积的2M HCl对一体积的二乙缩醛进行脱保护，如先前所述(参见Feth,F.、Wray,V.和Wagner,K.G.Determination of methylputrescine oxidase byhigh performance liquid chromatography.Phytochemistry 24,1653–1655(1985))，在室温下孵育过夜，并且然后用三体积的二乙醚洗涤所得浓缩物两次以去除残留的有机杂质。
质粒构建。用于通过聚合酶链反应(PCR)生成新DNA序列和用于DNA测序的寡核苷酸可以获自DNA合成公司，诸如IDT DNA、Twist Bioscience或Stanford Protein andNucleic Acid Facility(Stanford,CA)。可以通过菌落PCR由酿酒酵母基因组DNA扩增天然酵母基因(参见Kwiatkowski,T.J.、Zoghbi,H.Y.、Ledbetter,S.A.、Ellison,K.A.和Chinault,A.C.Rapid identification of yeast artificial chromosome clones bymatrix pooling and crude iysate PCR.Nucleic Acids Res.18,7191(1990))。可使用合适的密码子优化软件，诸如GeneArt GeneOptimizer软件(Thermo Fisher Scientific)，对异源酶的基因序列进行密码子优化，以改善在酿酒酵母中的表达。然后可以由商业DNA合成公司将异源基因序列合成为线性双链DNA片段。两种类型的质粒可以用于酵母中的基因表达：用于测试感兴趣的生物合成基因的直接表达(DE)质粒和为选定的启动子-基因-终止子盒的基因组整合提供模板的酵母整合(YI)保持质粒。
DE质粒包含侧翼为组成型启动子和终止子的感兴趣的基因、低拷贝CEN6/ARS4酵母复制起点以及营养缺陷型选择标志物。DE质粒可通过以下方式构建：PCR扩增感兴趣的基因以使用引物突出端附连5’和3’限制性位点，用适当的限制性酶对(例如，SpeI、BamHI、EcoRI、PstI或XhoI)消化PCR产物或合成的基因片段，并且接着使用T4 DNA连接酶将基因片段连接到具有合适的酵母启动子、终止子和复制序列的类似消化的载体中，诸如质粒pAG414GPD-ccdB、pAG415GPD-ccdB或pAG416GPD-ccdB(参见Alberti,S.、Gitler,A.D.和Lindquist,S.Asuite of Gateway cloning vectors for high-throughput geneticanalysis in Saccharomyces cerevisiae.Yeast 24,913–9(2007))。
YI质粒包含侧翼为组成型启动子和终止子的感兴趣的基因，但缺乏酵母复制起点或营养缺陷型选择标志物。YI质粒可通过利用被设计成分别结合在启动子和终止子的3’和5’末端的引物，使用‘环角(around-the-horn)’PCR将具有合适的启动子和终止子的空保持载体线性化来构建。也可以对感兴趣的基因进行PCR扩增，以将具有35-40bp同源性的5’和3’突出端附连到线性化的载体骨架的末端。然后可使用Gibson组装将基因组装到YI载体中。表达生物合成酶的GFP融合体的DE质粒可通过以下方式制备：首先使用Gibson组装来组装分别编码GFP、靶标酶和YI载体骨架的PCR扩增的DNA片段，并且随后如所描述的那样使用限制性酶和连接克隆将来自YI质粒的融合构建体亚克隆到DE载体中。
PCR扩增可使用任何可从商业供应商处获得的高保真重组DNA聚合酶进行，并且线性DNA可使用合适的DNA柱纯化试剂盒进行纯化。在具有羧苄青霉素(100μg/mL)、卡那霉素(50μg/mL)或另一抗生素选择的Luria-Bertani(LB)液体培养基或LB琼脂平板中，使用热休克转化和选择，可以在任何化学感受态大肠杆菌菌株中繁殖组装的质粒。可以根据制造商的方案，使用质粒纯化柱通过碱性裂解从在选择性LB培养基中在37℃和250rpm下生长的过夜大肠杆菌培养物中分离质粒DNA。质粒序列应通过Sanger测序验证。
酵母菌株构建。任何合适的实验室酵母菌株都可用作宿主生物体。实验部分的实施例中描述的酵母菌株来源于亲本菌株CEN.PK2-1D(参见Entian,K.D.和P.25YeastGenetic Strain and Plasmid Collections.Methods Microbiol.36,629–666(2007))，称为CEN.PK2。菌株可以在补充有2％w/v右旋糖的酵母-蛋白胨培养基(YPD培养基)、补充有合成完全氨基酸混合物(YNB-SC)和2％w/v右旋糖的酵母氮碱(YNB)限定培养基中，或在上述培养基的琼脂平板上非选择性地生长。用带有营养缺陷型选择标志物(URA3、TRP1、HIS3和/或LEU2)的质粒转化的菌株可在补充有2％w/v右旋糖和适当的缺失(dropout)溶液(YNB-DO)的YNB培养基中或在YNB-DO琼脂平板上选择性地生长。乙酸代谢缺陷的酵母菌株可以在补充有0.1％w/v乙酸钾的上述培养基(即，YPAD或YNBA)上生长。
酵母基因组修饰可使用CRISPRm方法进行(参见Ryan,O.W.等人Selection ofchromosomal DNAlibraries using a multiplex CRISPR system.Elife 3,1–15(2014))。CRISPRm质粒表达化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)Cas9和靶向酵母基因组中的感兴趣基因座的单向导RNA(sgRNA)，并且可通过编码Sp Cas9、tRNA启动子和HDV核酶(20-nt的向导RNA序列)，以及tracrRNA和终止子的DNA片段的组装PCR和Gibson组装构建。对于基因插入，可使用PCR扩增构建包含一个或多个侧翼为独特启动子和终止子的感兴趣的基因的整合片段，并通过Gibson组装将其克隆到保持载体中。整合片段是使用合适的高保真DNA聚合酶在整合位点利用相邻片段和/或酵母基因组的侧接40bp的微同源性区域PCR扩增的。对于基因破坏，整合片段在所有三个阅读框中包含6-8个终止密码子，其侧翼与破坏位点具有40bp微同源性，位于开放阅读框的前半部分。对于完整的基因缺失，整合片段包含一个营养缺陷型标志物基因，其侧翼与缺失位点具有40bp微同源性。每个整合片段都与靶向期望基因组位点的CRISPRm质粒共转化。阳性整合体可通过酵母菌落PCR、Sanger测序和/或通过液相色谱和串联质谱(LC-MS/MS)进行的功能筛选来鉴定。
酵母转化。酵母菌株可使用任何合适的方法转化，包括热休克、电穿孔和化学转化进行转化。例如，使用Frozen-EZ Yeast Transformation II试剂盒(Zymo Research)对实验部分的实施例中描述的酵母菌株进行化学转化。将单独酵母菌落接种到YP(A)D培养基中，并在30℃和250rpm下生长过夜。饱和培养物在YP(A)D培养基中反稀释至1:10与1:50之间，并再生长5-7小时以达到指数期。通过以500×g离心4分钟使培养物沉淀，然后通过将沉淀物重悬于pH 8.5的50mM Tris-HCl缓冲液中来洗涤两次。每次转化将洗涤的沉淀物重悬于20μL的EZ2溶液中，然后与100-600ng的总DNA和200μL的EZ3溶液混合。酵母悬浮液在30℃下轻轻旋转孵育1小时。对于质粒转化，将转化的酵母直接涂布到YNB(A)-DO琼脂平板上。对于Cas9介导的染色体修饰，将酵母悬浮液替代地与1mL YP(A)D培养基混合，通过500×g离心4分钟沉淀，然后重悬于250μL新鲜YP(A)D培养基中。然后将悬浮液在30℃下轻轻旋转再孵育两个小时，以产生G418抗性蛋白，然后将其涂铺在含有400mg/L G418(遗传霉素)硫酸盐的YP(A)D平板上。然后将平板在30℃下孵育48-60小时以允许菌落形成。
斑点稀释测定。将菌株接种到YNB(A)-DO培养基中并使其在30℃和250rpm下生长过夜。饱和的过夜培养物通过以500×g离心4分钟沉淀并重悬于无菌Tris-HCl缓冲液(pH8.0)中至基于OD600为107个细胞/mL的浓度。然后在Tris-HCl缓冲液中制备各菌株的10倍连续稀释液，并将10μL的各稀释液点在预热的YNB(A)-DO平板上。平板在30℃下孵育并在48小时后成像。
代谢物测定的生长条件。小规模代谢物产生测试可在YNB(A)-SC或YNB(A)-DO培养基中进行。可将酵母菌落接种到300-500μL培养基中，并使其在摇床中，在30℃、460rpm和80％相对湿度下，在覆盖有透气膜的2mL深孔96孔板中生长48-72小时。
代谢物产生分析。可使用液相色谱和串联质谱(LC-MS/MS)分析代谢物谱和滴度。为了从培养基中分离细胞进行分析，可通过在12℃下以3,500×g离心5分钟使发酵培养物沉淀，然后可以取出100-200μL上清液的等分试样进行直接分析。代谢物的产生可使用与三重四极杆质谱仪配对的任何合适的HPLC装置(诸如Agilent 1260Infinity Binary HPLC和Agilent 6420三重四极杆质谱仪)通过LC-MS/MS进行分析。可使用C18反相柱诸如ZorbaxEclipsePlus C18柱(2.1x 50mm，1.8μm；Agilent Technologies)进行色谱，其中0.1％v/v甲酸水溶液用作流动相溶剂A并且0.1％v/v甲酸/乙腈用作溶剂B。在40℃下以0.4mL/min的恒定流速和5μL的样品进样体积操作所述柱。可使用以下梯度进行化合物分离：0.00-0.75分钟，1％ B；0.75-1.33分钟，1-25％ B；1.33-2.70分钟，25-40％ B；2.70-3.70分钟，40-60％ B；3.70-3.71分钟，60-95％ B；3.71-4.33分钟，95％ B；4.33-4.34分钟，95-1％ B；4.34-5.00分钟，用1％ B平衡。LC洗脱液在0.01-5分钟被引导至MS，以正模式的电喷雾电离(ESI)、源气体温度350℃、气体流速11L/min和雾化器压力40psi进行操作。代谢物可以通过基于多反应监测(MRM)参数和标准曲线的积分峰面积进行定量。
荧光显微镜检查。将用编码与荧光蛋白报告基因融合的生物合成酶的质粒转化的酵母菌株的单独菌落接种到1mL YNB-DO培养基中，并使其在30℃和250rpm下生长过夜。过夜培养物通过以500×g离心4分钟沉淀，并重悬于具有2％w/v右旋糖的2mL YNB-DO培养基中，然后在30℃和250rpm下再生长4-6小时以达到指数期并允许表达的荧光蛋白完全折叠。然后将大约5-10μL的培养物点到玻璃显微镜载玻片上，并用玻璃盖玻片覆盖，然后使用具有60X油浸物镜的合适的倒置荧光显微镜成像。可使用氙弧灯和以下滤光片设置进行荧光激发：GFP，ET470/40X激发滤光片和ET525/50发射滤光片；mCherry，ET572/35X激发滤光片和ET632/60发射滤光片。发射光由CCD相机捕获，并且后续图像分析可在任何合适的科学图像分析软件中进行，诸如ImageJ(NIH)。
从转录组数据库中鉴定新基因变体。可使用转录组和基因组数据库的基于序列比对的搜索来鉴定新基因及其变体。例如，普通烟草N-甲基腐胺氧化酶(NtMPO1)的直系同源物是使用洋金花和颠茄的转录组的tBLASTn搜索在1000Plants Project数据库中鉴定的(参见Matasci,N.等人Data access for the 1,000Plants(1KP)project.Gigascience 3,17(2014))。然后可以针对酵母表达优化使用这些搜索策略鉴定的推定基因的编码序列，并且然后如先前所述将其克隆到表达载体中。
酶结构分析。通过检查使用任何合适的同源性建模或从头结构预测软件(诸如RaptorX或Rosetta)构建的同源性模型，可分析异源酶的结构特征，所述特征在酵母中表达的过程中可能存在问题，诸如大的未结构化区域。所得的蛋白质模型可以使用任何三维分子查看软件进行可视化，诸如PyMOL(Schrodinger)或UCSF Chimera。可使用任何合适的配体对接模拟软件，诸如AutoDock、SwisDock、GOLD或Glide，分析酶对特定底物的亲和力。
通过蛋白质印迹分析酵母中的蛋白质表达。对于酵母表达的蛋白质的免疫印迹分析，将合适的菌株用含有带有表位标签的感兴趣的蛋白质的表达载体转化。转化后三天，将转化的菌落接种到2mL YNB-DO培养基中，并在30℃和460rpm下过夜(～16-20h)生长至静止期。将细胞以3,000×g离心5分钟沉淀，重悬于200μL H2O中，与200μL的0.2M NaOH混合，并在室温下孵育5分钟以允许细胞壁糖蛋白水解。将细胞以3,000×g重沉淀5分钟，重悬于75μL H2O中，与25μL的4X NuPAGE LDS样品缓冲液(Thermo Fisher)混合，然后在95℃下煮沸3分钟以裂解细胞。以16,000×g离心5分钟使悬浮液沉淀以去除不溶性碎片，并将上清液转移到预冷管中。为了在还原条件下进行分析，将蛋白质裂解物与β-巯基乙醇(终浓度10％)混合并在70℃下孵育10分钟。将大约20-40μg的总蛋白上样到具有Precision Plus DualColor蛋白质分子量标志物(BioRad)的NuPAGE Bis-Tris 4-12％丙烯酰胺凝胶(ThermoFisher)上。电泳在1X NuPAGE MOPSSDS运行缓冲液中在150V下进行90分钟。按照制造商的说明，使用Trans-Blot Semi-Dry装置(BioRad)和NuPAGE转移缓冲液(Thermo Fisher)在15V下将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，持续15分钟。对于还原条件，将NuPAGE抗氧化剂(Thermo Fisher)添加到运行缓冲液和转移缓冲液中，使其终浓度为1X。将具有转移蛋白的膜在具有吐温的Tris缓冲盐水(TBS-T；137mM NaCl、2.7mM KCl、19mM Tris碱、0.1％吐温20，pH7.4)中洗涤5分钟，然后在室温下用在TBS-T中的5％脱脂牛奶封闭1h。将膜在4℃下用HRP缀合抗体在具有5％牛奶的TBS-T中的合适稀释液孵育过夜，用TBS-T洗涤3次，每次5分钟，然后使用Western Pico PLUS HRP底物(Thermo Fisher)和合适的成像仪可视化。
实验
一系列特定的遗传修饰提供了用于由简单的廉价原料或前体分子产生TA的酿酒酵母中的生物合成过程。描述了用于构建能够由非TA前体或简单原料产生早期TA分子腐胺、N-甲基腐胺、4-甲基氨基丁醛、N-甲基吡咯啉鎓(NMPy)、托品酮、托品、苯基乳酸(PLA)和1-O-β-苯基乳酰葡萄糖(PLA葡糖苷)的新型菌株的方法。NMPy是所有已知的TA分子的天然前体。还描述了用于操纵酵母生物合成途径的调控和优化氨基酸衍生的TA前体的产生的方法。描述了用于构建能够由简单原料产生非药用TA诸如假托品生物碱和打碗花精的新型菌株的方法。此外，还描述了用于构建能够由非TA前体或简单原料产生药用TA诸如莨菪碱、山莨菪碱和东莨菪碱的新型菌株的方法。此外，描述了用于构建能够由非TA前体或简单原料产生非天然TA诸如肉桂酰托品的新型菌株的方法。
实施例1.工程化用于高水平腐胺生产的平台酵母菌株
TA的托品部分通过多胺分子腐胺由氨基酸精氨酸衍生。出于增加包括腐胺、NMP、4MAB和NMPy在内的TA前体分子的细胞内浓度的目的，开发了通过精氨酸和多胺生物合成途径的通量提高的酿酒酵母菌株。这些菌株组合了遗传修饰，以用于增加总体上从中央代谢到精氨酸和多胺生物合成的碳和氮通量，并且包括引入关键异源酶以另外产生TA前体腐胺。采用遗传修饰，包括编码天然生物合成酶和调控蛋白的基因的反馈抑制缓解突变的引入、天然生物合成酶的转录调控的微调、编码使前体分子偏离预期途径的酶的基因的缺失或破坏，以及用于将内源分子转化为TA前体分子的异源酶的引入。
1.1)工程化菌株中的生物合成途径并入参与精氨酸代谢和多胺生物合成的天然酵母基因的过表达(图4)。
1.1.1)酵母中的过表达天然基因的实例包括但不限于：谷氨酸N-乙酰转移酶(Arg2p)，其催化由谷氨酸酯生物合成精氨酸的第一步；精氨酸酶(Car1p)，其去除精氨酸的胍鎓基团，以在线粒体基质中产生鸟氨酸；线粒体膜转运蛋白(Ort1p)，其将鸟氨酸从线粒体基质外向转运至胞质溶胶；鸟氨酸脱羧酶(Spe1p)，其将胞质溶胶鸟氨酸脱羧为腐胺；以及多胺氧化酶(Fms1p)，其将精胺和亚精胺脱烷基化为腐胺。
1.1.2)这些天然酶的过表达对腐胺产量的影响通过用三个低拷贝质粒的不同组合共转化酵母菌株进行检查，所述质粒各自表达SPE1、ORT1、CAR1、ARG2、FMS1或作为阴性对照的蓝色荧光蛋白(BFP)中的一种。在选择性培养基中生长48小时后，共转化细胞的细胞外介质中积累的腐胺的滴度通过LC-MS/MS进行定量(图5)。单独SPE1的过表达导致腐胺滴度增加13.4倍，达到23mg/L。虽然CAR1或ARG2与SPE1的共同过表达导致相对于单独的SPE1腐胺产量增加27％和12％，ORT1与SPE1的过表达导致与SPE1相比腐胺滴度降低35％。SPE1、CAR1、ARG2和FMS1中的任何三者的过表达共同将细胞外腐胺滴度增加至34-35mg/L。
1.2)工程化菌株中的生物合成途径并入来自在除酵母以外的生物体中发现的多胺产生途径的异源酶的表达，以进一步增加腐胺产量(图4)。
1.2.1)除了在大多数植物、动物和真菌中发现的鸟氨酸依赖性途径(由此通过精氨酸的脱胍以及随后鸟氨酸的脱羧合成腐胺)之外，许多细菌和植物还表达替代路径，其中通过所述路径，精氨酸首先通过由精氨酸脱羧酶(ADC)脱羧生成胍丁胺。在植物中，胍丁胺的胍基团随后被亚氨基水解酶(AIH)转化为脲以产生N-氨基甲酰腐胺(NCP)，然后通过酰胺酶(CPA)从中去除酰胺基团以得到腐胺(参见Patel,J.等人Dual functioning of plantarginases provides a third route for putrescine synthesis.Plant Sci.262,62–73(2017))。一些细菌已经进化出胍丁胺脲水解酶(AUH)，其能够直接从胍丁胺中去除胍基团以产生腐胺，而没有N-氨基甲酰基化的中间体(参见Klein,R.D.等人Reconstitution of abacterial/plant polyamine biosynthesis pathway in Saccharomycescerevisiae.Microbiology 145(Pt 2,301–7(1999))。
1.2.2)为了在酵母中重新构建异源腐胺生物合成途径，可使用以下酶：ADC、AIH、CPA和AUH。作为具有这些酶促活性的工程化菌株的一个实例，先前在酿酒酵母中展示出活性的来自燕麦的ADC(Avena sativa；AsADC)(参见Klein,R.D.等人Reconstitution ofabacterial/plant polyamine biosynthesis pathway in Saccharomycescerevisiae.Microbiology 145(Pt2,301–7(1999))、来自拟南芥的AIH(AtAIH)、来自番茄(Solanum lycopersicum；SlCPA)和拟南芥(AtCPA)的两个CPA直系同源物，以及来自大肠杆菌(speB)和拟南芥(AtARGAH2)的两个AUH被选择用于在酵母中表达。
1.2.3)为了建立每种异源酶在酵母中的功能性，以逐步方式重构三步(精氨酸→胍丁胺→NCP→腐胺)或两步(精氨酸→胍丁胺→腐胺)腐胺途径，这通过用表达AsADC、AtAIH和SlCPA或AtCPA；或者AsADC和speB或AtARGAH2的低拷贝质粒共转化野生型酵母菌株来实现。为了消除由不同营养缺陷水平引起的对细胞生长和代谢物产生的影响，所有转化均使用三种含有不同营养缺陷标志物的低拷贝质粒进行，代替空白或不存在质粒，使用BFP作为阴性对照。通过LC-MS/MS分析转化细胞在选择性培养基中生长48小时后细胞外介质中胍丁胺、NCP和腐胺的相对积累，表明除SlCPA和AtARGAH2之外，所有酶在酵母中保留活性(图6、7)。包含AsADC、AtAIH和AtCPA的植物特异性途径的重构能够以23mg/L的滴度产生腐胺，相对于野生型滴度提高了22倍。当与AsADC和AtAIH组合时，来自番茄的直系同源CPA(SlCPA)能够以4.5mg/L的滴度产生腐胺，这类似于表达AsADC和AtAIH的细胞中的腐胺水平。通过AsADC和大肠杆菌脲水解酶(speB)重构细菌捷径途径(bacterial shortcutpathway)使得能够以34mg/L的滴度产生腐胺，比野生型高32倍。
1.3)工程化菌株中的生物合成途径并入参与精氨酸和多胺生物合成的天然酵母基因的过表达和来自在除酵母以外的生物体中发现的多胺产生途径的异源生物合成酶的表达，以进一步增加腐胺的产生。
1.3.1)将用于腐胺生物合成的过表达的天然基因的最佳三联体(top-performingtriad)(SPE1、ARG2、CAR1；1.1.2)与最佳异源腐胺途径(AsADC、speB；1.2.3)相组合，这通过用编码SPE1、AsADC和speB的低拷贝质粒和编码ARG2和CAR1的低拷贝质粒共转化野生型酵母菌株来实现。48小时后通过LC-MS/MS分析测量转化细胞的培养基中的腐胺滴度。所得菌株以47mg/L的滴度产生腐胺(图10)。
1.4)通过若干机制调控酵母中的多胺生物合成(图8)。工程化菌株中的生物合成途径并入一种或多种这些调控机制的破坏，以减少腐胺产生的反馈抑制。
1.4.1)参与多胺生物合成的调控并且因此可能被破坏以改善细胞内腐胺积累的天然酵母基因包括但不限于以下实例(图8)。甲硫腺苷磷酸化酶(Meu1p)催化脱羧的S-腺苷甲硫氨酸(dcSAM)的再循环途径中的驱动步骤，其构成烷基供体以用于通过亚精胺合酶(Spe3p)和精胺合酶(Spe4p)的催化将腐胺转化为亚精胺和精胺(参见Chattopadhyay,M.K.、Tabor,C.W.和Tabor,H.Methylthioadenosine and polyamine biosynthesis in aSaccharomyces cerevisiae meu1Δmutant.Biochem.Biophys.Res.Commun.343,203–207(2006))。已知甲硫腺苷抑制亚精胺合酶的活性(参见Chattopadhyay,M.K.、Tabor,C.W.和Tabor,H.Studies on the regulation of ornithine decarboxylase in yeast:Effectof deletion in the MEU1 gene.Proc.Natl.Acad.Sci.102,16158–16163(2005))。多胺生物合成通过跨真菌和后生动物保守的抗酶介导的负反馈回路进行调控(参见Pegg,A.E.Regulation of ornithine decarboxylase.Journal of Biological Chemistry281,14529–14532(2006))。在酵母中，OAZ1基因包含由单个核苷酸分开的两个外显子，它们共同编码抗酶-1，一种鸟氨酸脱羧酶(Spe1p)的竞争性抑制剂。多胺诱导的核糖体移码机制仅能够在高多胺水平下翻译全长抗酶，从而对其生物合成施加反馈抑制。最后，从细胞外环境中摄取多胺由涉及Agp2p(一种对肉碱、亚精胺和精胺具有亲和力的质膜的通透酶)和Sky1p(一种被认为与Agp2p相互作用的蛋白激酶)的信号传导途径介导。
1.4.2)通过在野生型酵母中的每个开放阅读框的前三分之一内插入一系列串联无义突变来构建针对MEU1、OAZ1、SPE4、SKY1和AGP2中的每一个的酵母单基因破坏菌株。为了表征各调控性破坏在天然和异源腐胺产生途径的上下文中的影响，使任一酵母ODC(SPE1)过表达，或在每个单基因破坏菌株中由低拷贝质粒共表达AsADC和speB。在生长72小时后，通过LC-MS/MS测量细胞外介质中的腐胺滴度(图9)。当通过SPE1的天然腐胺产生途径过表达时，MEU1破坏将腐胺滴度提高68％。类似地，当与SPE1的过表达组合时，OAZ1破坏显著地将腐胺产量提高174％。OAZ1的破坏导致不具有过表达的天然或异源腐胺途径的未转化细胞中的腐胺滴度增加21倍。当与SPE1一起过表达时，SKY1和AGP2的破坏导致腐胺滴度分别增加29％和14％。当与AsADC和speB的异源表达组合时，SKY1破坏导致腐胺滴度降低41％。
1.5)工程化菌株中的生物合成途径将MEU1和OAZ1调控基因敲除与天然和异源腐胺生物合成基因的过表达相组合，以便进一步增加工程化菌株中的腐胺产量。天然精氨酸和多胺生物合成基因ARG2、CAR1和FMS1的另外拷贝被整合到meu1/oaz1双破坏菌株的基因组中。将此菌株用表达SPE1、AsADC和speB的低拷贝质粒转化。该转化菌株的细胞外介质的LC-MS/MS分析表明，在选择性培养基中生长48小时后，腐胺滴度达到86mg/L(图10)。
实施例2.工程化用于产生NMPy的酵母菌株
酿酒酵母的菌株是通过对实施例1中开发的过量产生腐胺的菌株进行修饰而开发的，以用于产生TA前体NMPy。这些菌株组合了遗传修饰，目的是增加从腐胺到NMPy生物合成的碳和氮通量，并包括引入关键的异源酶以产生TA前体NMP、4MAB和NMPy。使用了遗传修饰，包括用以改善在异源宿主中的活性的感兴趣的酶的N和/或C端结构域的修饰，以及编码驱动前体分子远离预期途径的酶的基因的缺失或破坏。
2.1)工程化菌株中的生物合成途径能够由内源腐胺产生NMPy。首先通过SAM依赖性N-甲基转移酶(PMT)将腐胺转化为N-甲基腐胺(NMP)，其随后被铜依赖性二胺氧化酶(MPO)氧化为4-甲基氨基丁醛(4MAB)。与许多醛化合物一样，4MAB在水溶液中不稳定，并通过碱催化的亲核攻击自发环化形成NMPy(图11)。
2.1.1)含有表达SPE1、AsADC和speB的低拷贝质粒以过量产生腐胺的实施例1.5的过量产生腐胺的菌株用表达来自颠茄的PMT(AbPMT1)和来自普通烟草的后续MPO酶(NtMPO1)的另外的低拷贝质粒共转化。在生长48小时后，通过LC-MS/MS分析比较表达腐胺与NMPy之间的每种连续酶的转化细胞的细胞外介质中的中间体的积累。NtMPO1的直接产物(4MAB)及其自发环化产物(NMPy)是通过AbPMT1和NtMPO1(图11)的表达以及它们的前体NMP和腐胺(图12)产生的。
2.1.2)通过LC-MS/MS分析测量具有和不具有MEU1基因的破坏的过量产生腐胺的酵母菌株(实施例1.4.2中描述)的生长培养基中的NMP积累。该分析表明，过量产生腐胺的菌株中MEU1的先前破坏及其对SAM再循环的伴随影响不抑制通过AbPMT1进行的腐胺N-甲基化(图13)。
2.2)酶在异源表达时可定位于与在其原始宿主生物体中不同的亚细胞区室，从而导致功能降低。工程化菌株中的生物合成途径可并入对天然和异源酶的多肽序列的修饰，以诱导这些经修饰的酶定位至除它们天然定位的那些区室之外的亚细胞区室。例如，先前的研究表明，虽然NtPMT在烟草细胞的胞质溶胶中表达，但NtMPO1定位于过氧化物酶体腔(参见Naconsie,M.、Kato,K.、Shoji,T.和Hashimoto,T.Molecular evolution of n-methylputrescine oxidase in Tobacco.Plant Cell Physiol.55,436–444(2014))。
2.2.1)NtMPO1的亚细胞定位通过使用用于信号肽检测的SherLoc2实用程序进行酶亚细胞定位的计算机模拟预测来检查(参见Briesemeister,S.等人SherLoc2:A high-accuracy hybrid method for predicting subcellular localization ofproteins.J.Proteome Res.8,5363–5366(2009))。该分析表明，NtMPO1在其C端含有强的酵母共有过氧化物酶体靶向序列(PTS)(Ala-Lys-Leu，表示为PTS1)，这表明NtMPO1当在酵母中异源表达时可定位于过氧化物酶体(图14)。
2.2.2)由低拷贝质粒表达带有N端或C端GFP标签的AbPMT1和NtMPO1的野生型酵母细胞的荧光显微镜检查表明，虽然AbPMT1主要存在于胞质溶胶中，但NtMPO1在过氧化物酶体中的定位取决于暴露的C端PTS(图15a、16)。
2.2.3)通过用GFP融合体遮蔽C端PTS实现的NtMPO1的胞质溶胶表达不显著影响细胞外4MAB或NMPy水平(图15b)。
2.3)工程化菌株中的生物合成途径可并入表1中列出的那些之外的生物合成酶的直系同源物。当在异源宿主中表达时，酶的不同直系同源物可表现出显著的活性差异。因此，在本文中作为实例提供并在表1中列出的生物合成酶的直系同源物也可用于工程化的非植物细胞中以进行相同的生物化学转化。
2.3.1)颠茄和洋金花的转录组在1000Plants Project数据库中的tBLASTn搜索(参见Matasci,N.等人Data access for the 1,000Plants(1KP)project.Gigascience 3,17(2014))使用NtMPO1的氨基酸序列作为查询序列和10-150的E值阈值进行。鉴定了表示为AbMPO1和DmMPO1的两个全长直系同源物序列，它们各自与NtMPO1共享91％的序列同一性(图17a)。
2.3.2)获得AbMPO1和DmMPO1的酵母密码子优化序列，并将其克隆到低拷贝表达质粒中。为了评估它们的活性，三种MPO变体中的每一种都在实施例1.5的过量产生腐胺的菌株中由低拷贝质粒与AbPMT1共表达，并且在选择性培养基中生长48小时后，通过LC-MS/MS测量细胞外介质中4MAB和NMPy的积累。DmMPO1显示出与原始NtMPO1变体相当的4MAB和NMPy产生水平(图17b)。
2.3.3)直系同源酶之间的活性差异通常可以至少部分地归因于其活性位点中的结构差异。NtMPO1、AbMPO1和DmMPO1的基于模板的同源性模型是使用RaptorX网络服务器，基于豌豆含铜氨基氧化酶的晶体结构(PDB：1KSI)构建的(参见M.等人Template-based protein structure modeling using the RaptorX web server.Nat.Protoc.7,1511–22(2012))。同源性模型表明直系同源物具有长的、未结构化的N端和C端尾区(图17c)。
2.3.4)在工程化酵母中测试两种活性直系同源物NtMPO1和DmMPO1的截短物的活性。N端截短物分别去除了两种直系同源物的前84个和81个残基。C端截短物去除了最后21个残基。还构建了C端截短物，其中去除未结构化尾但保留了PTS(表示为ΔC-PTS1)。每个MPO截短物与AbPMT1一起在实施例1.5的过量产生腐胺的菌株中由低拷贝质粒共表达，并且在生长48小时后通过LC-MS/MS对培养基中的4MAB和NMPy积累进行定量。在NtMPO1截短物之间没有观察到活性的显著差异(图18)。从DmMPO1中去除C端未结构化区域同时保留C端PTS三肽导致细胞外4MAB水平相对于野生型DmMPO1酶增加31％。
2.4)工程化菌株中的生物合成途径并入一种或多种遗传修饰，以减少或消除不良副反应的代谢通量。在异源宿主中表达的生物合成酶可参与不良副反应，所述副反应将代谢物通量从期望化合物的生物合成中抽离。例如，酵母醛脱氢酶可将异源醛分子(诸如4MAB)氧化成它们的同源羧酸。基于LC-MS/MS分析，当AbPMT1和DmMPO1ΔC-PTS1由低拷贝质粒共表达时，但不是在不存在MPO酶的情况下，在实施例1.5的过量产生腐胺的菌株的生长培养基中观察到4MAB酸的积累(图11)。
2.4.1)六种酵母基因(ALD2-ALD6和HFD1)在文献中已被证明编码具有醛脱氢酶活性的酶(参见Datta,S.、Annapure,U.S.和Timson,D.J.Different specificities of twoaldehyde dehydrogenases from Saccharomyces cerevisiaevar.boulardii.Biosci.Rep.37,BSR20160529(2017)；以及Nakahara,K.等人The -Larsson Syndrome Gene Encodes a Hexadecenal Dehydrogenase of the Sphingosine1-Phosphate Degradation Pathway.Mol.Cell 46,461–471(2012))。ALD2和ALD3基因编码一对几乎相同的胞质溶胶脱氢酶，所述酶在泛酸的生物合成中催化3-氨基丙醛氧化为β-丙氨酸(参见White,W.H.、Skatrud,P.L.、Xue,Z.和Toyn,J.H.Specialization of FunctionAmong Aldehyde Dehydrogenases:Genetics 163,69–77(2003))。ALD4、ALD5和ALD6基因分别编码两种线粒体和一种胞质溶胶乙醛脱氢酶，除了在葡萄糖和乙醇上发酵生长过程中将乙醛氧化成乙酸酯之外(参见Saint-Prix,F.、L.和Dequin,S.Functionalanalysis of the ALD gene family of Saccharomyces cerevisiae during anaerobicgrowth on glucose:The NADP+-dependent Ald6p and Ald5p isoforms play a majorrole in acetate formation.Microbiology 150,2209–2220(2004))，所述酶已被证明将一系列不同的脂肪族和芳香族醛氧化成羧酸(参见Datta,S.、Annapure,U.S.和Timson,D.J.Different specificities of two aldehyde dehydrogenases from Saccharomycescerevisiae var.boulardii.Biosci.Rep.37,BSR20160529(2017))。这四种靶基因的单独敲除菌株通过在实施例1.5的过量产生腐胺的菌株中在其开放阅读框的前三分之一内插入一系列串联无义突变来构建。通过在每种单破坏菌株中由低拷贝质粒共表达AbPMT1和DmMPO1ΔC-PTS1并在生长48小时后通过LC-MS/MS测量培养基中的4MAB酸积累来评估四种脱氢酶中的每一种对4MAB氧化的贡献。在单独HFD1和ALD4-6破坏情况下观察到4MAB酸水平的边际下降(图19)。
2.4.2)虽然ALD4-6由于其在乙酸盐和乙酰-CoA产生中的作用被认为是必需基因，但是之前的研究已经表明，这三种基因是至少部分冗余的并且双重和三重敲除的致死表型可通过用乙酸盐补充培养基来拯救(参见Saint-Prix,F.、L.和Dequin,S.Functional analysis of the ALD gene family of Saccharomyces cerevisiaeduring anaerobic growth on glucose:The NADP+-dependent Ald6p and Ald5pisoforms play a major role in acetate formation.Microbiology 150,2209–2220(2004)；以及Luo,Z.、Walkey,C.J.、Madilao,L.L.、Measday,V.和Van Vuuren,H.J.J.Functional improvement of Saccharomyces cerevisiae to reduce volatileacidity in wine.FEMS Yeast Res.13,485–494(2013))。构建四重敲除酵母菌株，其中HFD1和ALD4-6的开放阅读框被破坏，并由低拷贝质粒表达AbPMT1和DmMPO1ΔC-PTS1。与不具有破坏的菌株相比，该菌株显示出4MAB酸水平的45％降低(图20a)和伴随的NMPy产量的46％增加(图20b)。
2.4.3)通过从实施例2.4.2的四重敲除菌株的基因组中缺失串联ALD2-ALD3基因并由低拷贝质粒共表达AbPMT1和DmMPO1ΔC-PTS1来构建ALD无效菌株。在生长48小时后，LC-MS/MS分析表明，与所有六个ALD基因完整的菌株相比，ALD2和ALD3的缺失完全消除了4MAB酸副产物，并使4MAB和NMPy产量分别增加83％和75％(图20a、b)。
2.4.4)通过将先前的质粒携带的过量产生腐胺的基因盒(SPE1、AsADC、speB)整合到实施例2.4.3的ALD无效菌株的基因组中，并且另外整合AbPMT1和DmMPO1ΔC-PTS1来构建产NMPy的酵母菌株。LC-MS/MS分析证实，该菌株在非选择性培养基中生长48小时后的NMPy产量与由低拷贝质粒表达必需的腐胺产生基因AbPMT1和DmMPO1ΔC-PTS1并在选择性培养基中培养的实施例2.4.3的ALD无效菌株相当(图21)。
实施例3.用于由单糖和营养物质产生托品的工程化酵母菌株
III型聚酮合酶(PKS)和细胞色素P450能够通过TA前体MPOB将NMPy转化为托品酮。托品酮可以被立体特异性还原酶(表示为托品酮还原酶1(TR1))还原，以产生托品(参见Kim,N.、Estrada,O.、Chavez,B.、Stewart,C.和D’Auria,J.C.Tropane and GranataneAlkaloid Biosynthesis:ASystematic Analysis.Molecules 21,(2016))(图22)。
3.1)工程化菌株中的生物合成途径并入吡咯烷酮合酶、托品酮合酶CYP82M3、一种或多种细胞色素P450还原酶以及托品酮还原酶1，以将NMPy转化为托品。
3.1.1)获得编码颠茄吡咯烷酮合酶(AbPYKS)、托品酮合酶(AbCYP82M3)和大花曼陀罗托品酮还原酶1(DsTR1)的酵母密码子优化的DNA序列。还获得一组四种不同CPR的酵母密码子优化序列，包括来自拟南芥、花菱草(Eschscholzia californica)(加州罂粟(California poppy))和罂粟(Papaver somniferum)(鸦片罂粟(opium poppy))的三种植物CPR，以及天然酵母CPR(NCP1)，以用于在酵母中表达，因为P450酶需要NADP+-细胞色素P450还原酶(CPR)配偶体进行持续的电子交换。通过将DsTR1整合到实施例2.4.4的产NMPy菌株的基因组中并由低拷贝质粒表达AbPYKS、AbCYP82M3和四种CPR中的每一种来构建酵母菌株。为了验证酶活性并鉴定潜在的瓶颈，在生长48小时后，通过LC-MS/MS监测转化菌株的培养基中NMPy、MPOB、托品酮和托品的积累(图23)。在测定条件下，在所有四种CPR配偶体的情况下都观察到相当水平的从头托品产生(175-210μg/L)。
3.2)其低活性限制了通过生物合成途径的一部分的通量的被定义为生物合成酶或自发步骤的代谢瓶颈的存在可导致期望TA和前体的次优产生。
3.2.1)例如，对实施例3.1.1的工程化菌株的培养基中的TA中间体积累的分析表明，尽管AbCYP82M3的产物托品酮的积累很少，但AbPYKS产生的大部分MPOB仍然保持未被AbCYP82M3消耗(图24)。
3.2.2)将托品生物合成基因整合到酵母基因组中可以通过实现更稳定的AbCYP82M3表达来改善托品的产生。通过将AtATR1与AbPYKS和AbCYP82M3一起整合到实施例3.1.1的产NMPy菌株的基因组中构建产托品的平台菌株。48小时后，通过LC-MS/MS分析将整合菌株的托品和古豆碱积累与相同基因的基于质粒的表达进行比较(图28)。相对于基于质粒的表达(189μg/L)，AbPYKS、AbCYP82M3和AtATR1的基因组表达使托品滴度增加近三倍(565μg/L)。工程化菌株还显示出古豆碱积累的2.6倍增加。
3.3)工程化菌株的生物合成途径中副产物的积累可导致期望的TA和前体的次优产生。
3.3.1)例如，对实施例3.1.1的工程化菌株的培养基中TA中间体的积累的分析表明，NMPy的衍生物古豆碱大量积累，滴度几乎比托品大四倍(775-900μg/L)。在相关文献中，已经观察到古豆碱通过MPOB的自发脱羧积累(参见Bedewitz,M.A.、Jones,A.D.、D’Auria,J.C.和Barry,C.S.Tropinone synthesis via an atypical polyketide synthase andP450-mediated cyclization.Nat.Commun.9,5281(2018))(图22)。作为另一个实例，实施例3.1.1的工程化菌株的生长培养基的LC-MS/MS分析表明，由于与NMPy的脱羧性缩合，古豆碱也在缺乏AbPYKS和AbCYP82M3的阴性对照菌株中积累(图22)。
3.3.2)生长温度的调节可用于减少工程化菌株的生物合成途径中副产物的积累，以增加朝向期望TA和前体的通量。在一个实例中，温度对自发古豆碱产生的影响通过借助以下动力学原理进行评估：即，酶促和自发反应的速率在较低温度下降低。由于颠茄和其他产TA的茄科植物适于在较冷的气候条件下最佳生长，表达茄科植物基因的酵母菌株在25℃下的生长可改善酶折叠和/或活性，从而能够实现与在30℃下生长相当的酶促生成的托品产量，同时降低自发古豆碱产生的速率。实施例3.2.2的产托品菌株的培养物在非选择性限定培养基中在30℃和25℃下生长并且在48小时后通过生长培养基的LC-MS/MS分析比较托品和古豆碱的积累。托品滴度受温度降低的影响最小。古豆碱积累在25℃下相比于30℃减少了42％，从而导致所产生的托品与古豆碱的比率增加60％(图25)。
3.3.3)减少或消除不良副反应可以用于提高工程化菌株的生物合成途径中朝向期望的TA和TA前体的代谢物通量。在一个实例中，可通过减少由与乙酸酯的自发脱羧性缩合导致的古豆碱产生来提高朝向TA前体托品的通量。对从实施例2.4.4的产NMPy菌株的培养基中去除补料的乙酸盐对古豆碱和托品产量的影响进行评估。通过在低拷贝质粒上表达ALD4和ALD6的功能拷贝并且接着在48小时生长后通过LC-MS/MS分析监测古豆碱和4MAB酸的积累来评估在实施例2.4.4的工程化菌株中消融乙酸盐营养缺陷型的影响。虽然ALD4或ALD6的重构能够实现在不存在补料乙酸盐的情况下在选择性培养基上生长(图26a)，但ALD4的添加导致4MAB酸的积累增加5倍，而ALD6没有产生显著增加(图26b)。此外，在ALD4或ALD6的情况下消除乙酸盐补料导致古豆碱积累分别减少38％和59％(图26b)。
3.3.4)ALD6基因的功能拷贝在先前破坏的ald6基因座处重新整合到实施例3.2.2的产托品菌株中。在非选择性培养基中生长48小时后，通过LC-MS/MS分析测量这种整合对NMPy与托品之间的所有代谢物的积累的影响。通过Ald6p恢复乙酸盐代谢导致托品滴度增加2.7倍，并且古豆碱积累增加1.6倍(图28)。此外，ALD6整合导致NMPy和托品酮的产量显著增加并且MPOB的消耗增加(图27)。
3.3.5)在实施例3.3.4的工程化菌株中由低拷贝质粒表达腐胺与托品之间的各生物合成酶基因(即，AbPMT1、DmMPO1ΔC-PTS1、AbPYKS和AbCYP82M3)的另外拷贝并且在选择性培养基中生长48小时后，通过LC-MS/MS将TA中间体的产量与表达BFP的相同菌株的TA中间体的产量进行比较。AbPYKS的另外拷贝的表达导致NMP积累增加4.3倍并且托品产量增加1.3倍(图29)。AbPMT1的另外拷贝的表达导致NMP与托品酮之间的所有TA前体的产量均显著提高，并且托品产量增加2.4倍(图29)。因此，在PAD1基因座上将PMT(AbPMT1和DsPMT1)和PYKS(AbPYKS)的另外拷贝整合到实施例3.3.4的产托品菌株(CSY1249)的基因组中。使所得的工程化菌株(CSY1251)在非选择性培养基中于25℃生长48小时，导致以3.4mg/L的滴度产生托品，比实施例3.3.4中的产托品菌株(CSY1249)大2.2倍(图30)。
实施例4：被工程化以由L-精氨酸产生假托品生物碱的酵母。
可以对酵母菌株进行工程化以由早期氨基酸前体(诸如L-精氨酸)产生非药用TA。例如，可以进一步工程化实施例3中描述的平台酵母菌株，以由L-精氨酸产生假托品生物碱(图1)。
由L-精氨酸产生托品酮的平台酵母菌株(参见实施例3中的描述)可以进一步工程化，以并入立体特异性还原酶，例如托品酮还原酶2(TR2；EC 1.1.1.236)，以将生物合成的托品酮转化为假托品。含有强组成型启动子(诸如TDH3)和TR2变体(例如，来自大花曼陀罗的TR2(DsTR2))的编码序列的表达盒可以整合到产托品酮的平台酵母菌株的基因组中。通过整合一个或多个含有强组成型启动子(诸如PGK1)和羟基化酶(诸如作用于假托品支架的细胞色素P450)的表达盒，可以进一步工程化所得的菌株，以产生假托品的羟基化衍生物，例如打碗花精。通过并入各自作用于假托品骨架的不同位置的多种P450酶，可以生物合成多种打碗花精及其衍生物。然后可以将工程化菌株在非选择性合成完全培养基中在30℃或25℃下培养48至96小时，然后可以通过LC-MS/MS分析培养基中假托品生物碱的积累。
实施例5：被工程化以过量产生苯丙酮酸酯和相关TA前体的酵母。
酵母菌株可以被工程化以过量产生苯丙酮酸酯，所述苯丙酮酸酯代表产生药用TA所需的酰基供体分子的前体(图2)，目的是增加从中央代谢朝向期望的TA和TA前体的碳和氮通量。可以通过并入遗传修饰对酵母菌株进行工程化以过量产生苯丙酮酸酯，所述遗传修饰包括但不限于天然生物合成酶的转录调控的微调、编码使前体分子偏离预期途径的酶的基因的缺失或破坏，以及用于将内源分子转化为TA前体分子的异源酶的引入。
在一个实例中，可以通过并入天然基因的另外拷贝来工程化酵母菌株以增加苯丙酮酸酯的产生，所述天然基因编码由氨基酸或其他中央代谢物产生苯丙酮酸酯的生物合成酶。这些另外的拷贝可以由强组成型启动子控制，诸如GPD、TEF1或PGK1。天然基因靶标的实例包括但不限于芳香酸氨基转移酶ARO8和ARO9，以及脱水酶PHA2。在一种情况下，ARO8的一个或多个另外的拷贝可以在强组成型启动子的控制下并入工程化菌株中。在一种情况下，ARO9的一个或多个另外的拷贝可以在强组成型启动子的控制下并入工程化菌株中。在另一种情况下，PHA2的一个或多个另外的拷贝可以在强组成型启动子的控制下并入工程化菌株中。在本发明的一个实施方案中，选自包括ARO8、ARO9和PHA2的组的一种或多种基因的一个或多个另外的拷贝可以在独特的强组成型启动子的控制下并入工程化菌株中。
实施例6：被工程化以由L-苯丙氨酸或L-酪氨酸产生用于TA支架的生物合成的酰基供体的酵母。
酵母菌株可以被工程化，以由L-苯丙氨酸和L-酪氨酸产生各种苯丙烷酰基供体化合物，包括PLA、肉桂酸、香豆酸、阿魏酸、苯甲酸和辅酶A硫酯以及这些化合物的糖苷衍生物，其可以与托品、假托品或其衍生物发生酯化，以生物合成药用TA、非药用TA和非天然TA(图1-3)。
6.1)由于野生型酵母仅产生痕量PLA，因此必须增加这种TA前体的产生，以允许下游TA有足够的积累。为了提高PLA产量，可在工程化的宿主细胞中表达异源苯丙酮酸还原酶(PPR)。通过在CSY1251中由低拷贝质粒表达每种酶并且在选择性培养基中生长72h后通过LC-MS/MS测量PLA产量来针对在酵母中的活性筛选来自大肠杆菌、乳杆菌、颠茄和荧光威克酵母的PPR直系同源物，以及来自芽孢杆菌和乳杆菌的对3-苯基丙酮酸酯具有报道活性的乳酸脱氢酶(LDH)(表1)。相对于对照，所有LDH候选物以及来自植物乳杆菌、大肠杆菌和颠茄的PPR在PLA产生方面产生了中等(1.3至3.5倍)改善，而来自荧光威克酵母的PPR的表达导致PLA产量增加近80倍，达到～250mg/L(图31)。因此，选择WfPPR整合到CSY1251中来制备菌株CSY1287。
6.2)作为另一个实例，酵母菌株可被工程化以产生肉桂酸和香豆酸，它们是苯丙烷，可以用作酰基供体化合物，用于与托品或假托品酯化，以分别由L-苯丙氨酸和L-酪氨酸形成非天然TA。通过并入解氨酶，诸如苯丙氨酸解氨酶(PAL；EC 4.3.1.24)，可以对酵母进行工程化以由L-苯丙氨酸产生肉桂酸。类似地，通过并入解氨酶，诸如酪氨酸解氨酶(TAL；EC 4.3.1.23)，可以对酵母进行工程化以由L-酪氨酸产生香豆酸。通过用具有TRP1选择性标志物、TEF1启动子和来自拟南芥的PAL变体的编码序列(AtPAL1)的低拷贝CEN/ARS质粒进行转化来对酵母菌株进行工程化，以由L-苯丙氨酸产生肉桂酸。所得的含有低拷贝质粒的菌株在具有适当的氨基酸缺失溶液(-Ura)的合成完全培养基中于30℃下生长。在生长48小时后，通过LC-MS/MS分析对培养基的肉桂酸含量进行分析(图32)。
6.3)在颠茄中，利用UDP-葡糖基转移酶84A27(AbUGT)通过葡糖基化激活PLA以将酰基转移至托品(参见Qiu,F.等人,Functional genomics analysis reveals two novelgenes required for littorine biosynthesis.New Phytol.,nph.16317(2019))。由于植物UGT参与各种苯丙烷的生物合成，并且通常表现出广泛的底物范围(参见Ross,J.、Li,Y.、Lim,E.-K.、D.J.Bowles,Higher plant glycosyltransferases.Genome Biol.2,3004.1–3004.6(2001))，有必要选择对期望的酰基供体具有足够高活性的UGT。
6.3.1)例如，AbUGT对不同苯丙烷酰基供体(包括经典底物PLA)的活性通过在CSY1251中由低拷贝质粒表达AbUGT并测量三种苯丙烷酰基供体(PLA、肉桂酸、阿魏酸)向它们各自的糖苷的转化来评估。虽然AbUGT分别葡糖基化了～60％和90％的肉桂酸和阿魏酸，但PLA的葡糖基化是测试底物中最低的，转化率<3％(图33)。
6.3.2)可评估来自其他产TA的茄科植物的AbUGT的直系同源物对PLA和其他苯丙烷的活性。在此实例中，使用tBLASTn搜索从1000Plants数据库中的红花曼陀罗(BsUGT)和洋金花(DmUGT)的转录组中获得编码UGT84A27的转录本。通过在CSY1251中由低拷贝质粒表达AbUGT、BsUGT、DmUGT或BFP阴性对照，针对活性对编码这些直系同源UGT的酵母密码子优化序列进行筛选。在补充有500μM PLA、肉桂酸(CA)或阿魏酸(FA)作为葡萄糖受体的选择性培养基中生长72h后，通过LC-MS/MS测量转化菌株的培养物中的葡糖苷产生。所有三个UGT直系同源物都表现出CA(34-65％转化率)和FA(85-90％转化率)的显著糖基化，并且对PLA仅表现出痕量活性(<3％转化率)，并且AbUGT显示出最大的PLA转化率(2.7％)(图33、34)。
6.3.3)鉴于AbUGT在结构相似的底物肉桂酸酯、阿魏酸酯和PLA上的活性差异不成比例，可实施结构引导的合理诱变方法来工程化AbUGT的活性位点，以改善对PLA的活性。在本实施例中，首先使用RaptorX网络服务器，基于拟南芥水杨酸UDP-葡糖基转移酶UGT74F2的晶体结构(PDB：5V2K)构建与UDP-葡萄糖结合的AbUGT的同源性模型(图35)。接下来，使用Maestro/GlideXP软件套件模拟D-PLA在活性位点的对接。基于能量最小化结合模式，D-PLA的芳基环可能通过与F130的π堆积相互作用而稳定，而其α-羟基和羧酸酯基团分别通过与Q151和H24的氢键而稳定，使得亲核羧酸酯氧位于UDP-葡萄糖的亲电C1碳的以内(图35)。D-PLA还与残基L205和I292相邻，这两个残基似乎都不与任一底物相互作用。这表明(i)F130突变为酪氨酸可保留与D-PLA的芳基环的π堆积，同时提供另外的氢键以稳定D-PLA的α-羟基氧，而肉桂酸酯和阿魏酸酯中不存在所述氧；(ii)L205突变为苯丙氨酸可增加D-PLA与F130Y的π堆积稳定；并且(iii)I292突变为谷氨酰胺将与D-PLA和UDP-葡萄糖生成两个另外的稳定氢键(图35)。通过在CSY1251中由低拷贝质粒表达各突变体、野生型AbUGT或BFP对照来针对活性筛选AbUGT的F130Y、L205F和I292Q点突变体，并在补充有500μm PLA、CA或FA的选择性培养基中生长72h后通过LC-MS/MS测量葡糖苷的产生。尽管F130Y和I292Q突变显著降低CA上的UGT活性，但所有三种突变体均表现出相对于野生型AbUGT(<3％转化率)相当低(并且在统计学上不可区分)的对PLA的活性(图36)。
6.3.4)基于部分6.1和6.3中描述的结果，通过将酵母密码子优化的WfPPR和AbUGT整合到CSY1251的基因组中来构建菌株CSY1288，通过验证PLA产生(66mg/L)和最小PLA葡糖苷积累来验证(图37)。
6.4)由于AbUGT对PLA的活性差可能限制TA前体朝向下游TA的通量，因此可通过并入促进UDP-葡萄糖积累和减少糖苷降解的遗传修饰来增加苯丙氨酸向PLA葡糖苷的通量。
6.4.1)UDP-葡萄糖对于储存多糖、细胞壁葡聚糖和糖蛋白的形成至关重要，并且因此其生物合成受到严格调控(参见Nishizawa,M.、Tanabe,M.、Yabuki,N.、Kitada,K.、Toh-e,A.Pho85kinase,a yeast cyclin-dependent kinase,regulates the expressionof UGP1 encoding UDP-glucose pyrophosphorylase.Yeast.18,239–249(2001))。在葡萄糖上生长的过程中，酵母沿着两个主要代谢路径，即糖酵解和淀粉生物合成直接生成葡萄糖-6-磷酸。由于柠檬酸盐是糖酵解速率限制酶磷酸果糖激酶的变构抑制剂(参见Li,Y.等人,Production of Rebaudioside Afrom Stevioside Catalyzed by the EngineeredSaccharomyces cerevisiae.Appl.Biochem.Biotechnol.178,1586–1598(2016))，通过补充柠檬酸盐部分抑制糖酵解可能增加UDP-葡萄糖的可用性和葡糖苷的产生(图38)。编码用于内源PLA葡糖苷产生的基因组WfPPR和AbUGT的菌株CSY1288在补充有2％柠檬酸盐和500μM CA或FA的培养基中培养，并在生长72h后通过LC-MS/MS比较葡糖苷的产生。补充柠檬酸盐使PLA、CA和FA的葡糖基化分别降低83％、56％和78％(图39)。
6.4.2)其基因产物分别催化葡萄糖-6-磷酸异构化为葡萄糖-1-磷酸以及将葡萄糖-1-磷酸转化为UDP-葡萄糖的PGM2和UGP1的过表达可以用于增加UDP-葡萄糖供应。
6.4.2.1)PGM2和UGP1的额外拷贝在CSY1288中由低拷贝质粒表达并且在选择性培养基中生长72h后测量PLA葡糖苷的产量。虽然PGM2过表达相对于对照没有产生改善，但是UGP1的过表达导致PLA葡糖苷产量增加～1.8倍(图40)，这支持增加UDP-葡萄糖池(pool)改善AbUGT对PLA的利用率。
6.4.2.2)天然葡糖苷酶可作用于PLA和其他TA前体葡糖苷以减少积累，因为已显示其他异源葡糖苷在酵母中以此方式水解(参见Schmidt,S.、Rainieri,S.、Witte,S.、Matern,U.、Martens,S.,Identification of a Saccharomyces cerevisiae glucosidasethat hydrolyzes flavonoid glucosides.Appl.Environ.Microbiol.77,1751–1757(2011)；另外参见Wang,H.等人,Engineering Saccharomyces cerevisiae with thedeletion of endogenous glucosidases for the production of flavonoidglucosides.Microb.Cell Fact.15,1–12(2016))。在此实例中，三种天然葡糖苷酶基因—EXG1、SPR1和EGH1——在CSY1288中被破坏，并且在破坏突变体在非选择性培养基中生长72h后测量PLA葡糖苷产量。EGH1的破坏使PLA葡糖苷产量增加了一倍以上(图41)，表明通过Egh1p进行的水解构成TA前体通量的重大损失。
实施例7：被工程化以将利托林转化为莨菪醛的酵母
酵母菌株可以被工程化以将利托林转化为莨菪醛(图2)。例如，实施例6中描述的产托品和产PLA葡糖苷的酵母菌株可以进一步工程化以表达细胞色素P450 CYP80F1(EC1.14.19.-)以催化利托林重排为莨菪醛，并表达细胞色素P450还原酶(CPR；EC 1.6.2.4)以支持P450酶的活性。酵母菌株被工程化以将补料的利托林转化为莨菪醛，这通过用具有LEU2选择标志物、TDH3启动子和来自颠茄的CYP80F1变体(AbCYP80F1)的编码序列的低拷贝CEN/ARS质粒；以及用具有TRP1选择标志物、TEF1启动子和来自酿酒酵母(NCP1)或拟南芥(AtATR1)的细胞色素P450还原酶(CPR)的编码序列的低拷贝CEN/ARS质粒转化所述酵母菌株来实现。含有低拷贝质粒的所得菌株在补充有1mM利托林的具有适当的氨基酸缺失溶液((-Leu-Trp))的合成完全培养基中于30℃下生长。在生长48小时后，通过LC-MS/MS分析对培养基的莨菪醛含量进行分析(图42)。
实施例8：被工程化以将莨菪碱转化为东莨菪碱的酵母。
酵母菌株可以被工程化以将莨菪碱转化为东莨菪碱(图2)。例如，实施例7中描述的酵母菌株可以进一步工程化以并入在莨菪碱的6β位具有羟化酶活性以形成山莨菪碱的酶和在山莨菪碱的6β-羟基位具有双加氧酶活性以形成东莨菪碱的酶，或同时具有这两种活性的酶(EC 1.14.11.11)。通过用低拷贝CEN/ARS质粒转化酵母菌株来将其工程化，以将补料的莨菪碱转化为东莨菪碱，所述质粒具有LEU2选择标志物、TDH3启动子，以及来自大花曼陀罗(DsH6H)、三分三(AaH6H)、木本曼陀罗(BaH6H)或洋金花(DmH6H)的莨菪碱6β-羟化酶/双加氧酶(H6H)的编码序列。含有低拷贝质粒的所得菌株在具有适当的氨基酸缺失溶液(-Leu)且补充有1mM莨菪碱的合成完全培养基中于30℃下生长。在生长72小时后，通过LC-MS/MS分析对培养基的东莨菪碱含量进行分析(图43)。表达来自大花曼陀罗的H6H变体的菌株表现出补料莨菪碱向东莨菪碱的最大转化，尽管所有测试变体均显示出体内H6H活性。通过在该工程化酵母菌株的培养基中补充不同的辅因子并在生长72小时后通过LC-MS/MS分析培养基来对辅因子需求进行进一步优化。该分析确定，补充亚铁增加莨菪碱向东莨菪碱的转化(图44)。
实施例9.鉴定莨菪碱脱氢酶候选物并在工程化的非植物细胞中将莨菪醛还原为莨菪碱
为了鉴定适于进行本文公开的方法的TA醇-醛相互转化，尤其是将莨菪醛还原为莨菪碱的脱氢酶，从公开可获得的植物RNA测序数据中鉴定出莨菪碱脱氢酶(HDH)开放阅读框。
9.1)从密歇根州立大学药用植物基因组学资源(Michigan State UniversityMedicinal Plant Genomics Resource)中获得从颠茄转录组中鉴定的43,861个独特转录本中的每一个的组织特异性丰度(每千碱基重叠群的片段/百万映射读段，FPKM)和推定的蛋白质结构和功能注释。使用以下计算过滤算法，基于组织特异性表达谱与分别处于TA生物合成途径中的脱氢酶步骤之前和之后的诱饵基因(bait gene)CYP80F1(利托林变位酶)和H6H(莨菪碱6β-羟化酶/双加氧酶)的聚类，鉴定编码莨菪碱脱氢酶候选物的转录本。
首先，对43,861个转录本的完整列表进行过滤，以查找带有任何以下蛋白质家族(PFAM)ID的注释的那些：PF00106、PF13561、PF08659、PF08240、PF00107、PF00248、PF00465、PF13685、PF13823、PF13602、PF16884、PF00248；或任何以下功能注释关键词：醇脱氢酶、醛还原酶、短链、醛/酮。此外，任何具有包含关键词腐胺、托品酮和托品的功能注释的转录本都包括在过滤器中作为阳性对照TA相关基因，以验证与诱饵基因的聚类。接下来，针对CYP80F1和H6H诱饵基因生成平均组织特异性表达谱。对于两种诱饵基因中的每一种，构建线性回归模型以将诱饵基因表达谱(在FPKM中)表示为每个候选基因谱的线性函数，并计算每个候选物的相关性p值。将使用两种诱饵基因中的每一种鉴定的候选物合并，并去除重复。每个候选物的组合p值计算为与两种诱饵基因中的每一种的相关性的log10 p值的总和。去除与TA生物合成途径中的已知脱氢酶(即，托品酮还原酶I和II)匹配的转录本，并且其余候选物通过组合p值并且通过与诱饵基因的距离经由组织特异性表达谱的分层聚类进行排序(图45)。
9.2)在实施例9.1中鉴定的几乎所有候选物都表现出与针对已知的TA生物合成基因观察到的相同的次生根特异性表达模式(secondary root-specific expressionpattern)。针对UniPROT/SwissPROT数据库对所得的～30个候选物进行BLASTp搜索，发现许多转录本缺少末端或内部序列区域。为了解决这个问题，使用Trinity软件包，由存放的原始RNAseq读段重复从头转录组组装(参见Haas,B.J.等人,De novo transcript sequencereconstruction from RNA-seq using the Trinity platform for referencegeneration and analysis.Nat.Protoc.8,1494–512(2013))，并且通过针对新组装的转录组进行不完整序列区域的BLAST比对，重构十二个HDH候选物的所有缺失序列片段(表2)。
9.3)通过在酵母中筛选实施例9.1和9.2中产生的候选物来鉴定失去的HDH活性。
9.3.1)莨菪醛的真正商业标准品缺乏并且化学合成的收率不足要求HDH候选物与上游生物合成酶——细胞色素P450利托林变位酶(CYP80F1)共表达—以通过补料的利托林进行体内活性筛选(参见实施例7)。由于利托林表现出与HDH产物莨菪碱相似的色谱和质谱特性，通过将酵母密码子优化的AbCYP80F1和DsH6H(参见实施例8)整合到CSY1251的基因组中构建HDH筛选菌株(CSY1292)，从而使得能够通过检测通过三步生物合成途径(图2)由补料的利托林(m/z+290)产生的东莨菪碱(m/z+304)来筛选HDH候选物。
9.3.2)编码12个HDH候选物中的每一个的酵母密码子优化序列在菌株CSY1292中由低拷贝质粒表达，并且在补充有1mM利托林的培养基中生长72h后测量东莨菪碱产量。十二个候选物之一，HDH2(称为AbHDH)，表现出莨菪醛水平的35％降低和可测量的东莨菪碱积累(7.2μg/L)，表明它编码失去的HDH活性(图46)。
9.4)结构和系统发生分析提供对HDH的催化机制和进化历史的进一步了解。
9.4.1)AbHDH的同源性模型是基于颤杨芥子醇脱氢酶(PtSAD；PDB：1YQD)的晶体结构构建的(图47)。AbHDH是中等链脱氢酶/还原酶(MDR)超家族中的锌依赖性醇脱氢酶(ZADH)家族的成员。该家族的典型特征是，AbHDH表现出双小叶结构，具有高度保守的核苷酸结合结构域和可变性较高的底物结合结构域。AbHDH核苷酸结合结构域内的残基S216、T217、S218和K221与PtSAD中的磷酸稳定化残基S214、T215、S216和K219的比对表明，AbHDH是NADPH依赖性氧化还原酶。同样，ZADH的典型特征是，AbHDH似乎使用接近蛋白质表面的半胱氨酸残基的四联体(tetrad)(C105、C108、C111和C119)结合结构Zn2+，并且结合活性位点内的催化Zn2+。
9.4.2)AbHDH的催化机制通过使用Maestro/Glide软件包将底物莨菪醛分子对接到活性位点中来阐明(图47)。最有利的结合模式将底物的醛基团定位在催化Zn2+和NADPH氢化物供体的之内。ZADH的对接结果和一般机制(参见Bomati,E.K.、Noel,J.P.,Structural and kinetic basis for substrate selectivity in Populus tremuloidessinapyl alcohol dehydrogenase.Plant Cell.17,1598–1611(2005))表明AbHDH的以下催化机制。在不存在底物的情况下，活性位点内的催化Zn2+因C52、H74、C168和水分子而稳定，所述水分子通过与S54的极性相互作用定位，并在与莨菪醛结合时被置换。二氢烟酰胺氢化物对醛羰基的亲核攻击形成因与催化Zn2+的相互作用而稳定的氧阴离子中间体，并且其可能通过NADP+的核糖基团与S54之间的质子穿梭而质子化。
9.5)为了确认直系同源氧化还原酶是否在其他产TA的茄科植物中催化莨菪碱的生物合成，使用tBLASTx搜索从毛曼陀罗和大花曼陀罗的转录组中鉴定出AbHDH编码序列的变体(图48)。通过在CSY1292中由低拷贝质粒共表达酵母密码子优化序列与通量限制性DsH6H的另外拷贝并测量补充有1mM利托林的培养基中的东莨菪碱产量来验证两种已鉴定的直系同源物(DiHDH、DsHDH)的HDH活性。DsHDH显示出测试变体的最高底物消耗和产物积累(图49)。
9.6)将包含最佳酶变体和通量限制酶的过表达的药用TA生物合成分支整合到平台酵母菌株中。菌株CSY1294是通过将酵母密码子优化的WfPPR和AbUGT、DsHDH以及第二拷贝的DsH6H整合到CSY1292中构建的。在CSY1294中验证由补料的利托林产生东莨菪碱(图50)。
实施例10：被工程化以进行用于产生TA支架的酰基供体和受体的酯化的酵母。
酵母菌株可以被工程化以表达酶，所述酶催化活化的酰基供体化合物和酰基受体化合物的酯化，以产生各种TA支架(图2、3)。酰基供体基团的活化可以通过工程化产酰基供体的酵母菌株以并入酶来实现，所述酶将具有高基团转移潜力的化学部分诸如辅酶A(CoA)或葡萄糖(葡糖苷)附连至酰基供体的羧基，如实施例6中所述。可以用于该能力的酰基供体激活酶的实例包括CoA连接酶和UDP-糖基转移酶。可以用于催化活化的酰基供体化合物和酰基受体诸如托品和假托品的酯化的酯化酶的实例是酰基转移酶，包括丝氨酸羧肽酶样酰基转移酶(SCPL-AT)和BAHD型酰基转移酶。当在异源宿主诸如酵母中表达时，可对此类酰基转移酶的编码序列进行修饰以提高它们的活性。
10.1)在其中通常发现SCPL-AT天然存在的植物中，SCPL-AT的编码序列包括N端信号肽，其将新生多肽引导至内质网(ER)。一旦定位于ER，SCPL-AT多肽就通过分泌运输途径通过高尔基体转运至液泡腔，在那里它们被发现表现出活性。在这个ER到液泡的运输过程中，它们经历若干翻译后修饰(图51)，包括但不限于信号肽切割、N-糖基化、内部前肽序列的去除和二硫键形成(参见Stehle,F.、Stubbs,M.T.、Strack,D.和Milkowski,C.Heterologous expression of a serine carboxypeptidase-like acyltransferaseand characterization of the kinetic mechanism,FEBS Journal,275,(2008))。然而，由于细胞内运输途径和翻译后修饰的模式在生物体之间有所不同，因此SCPL-AT在异源宿主中的表达可能导致不正确的亚细胞定位和/或针对活性的不正确的翻译后修饰。例如，当在酵母中表达时，可对SCPL-AT诸如利托林合酶(LS)(表1)的编码序列进行修饰以提高活性。
10.1.1)信号肽序列可影响酵母中SCPL-AT的加工和定位。
10.1.1.1)推定的N端信号肽在AbLS中的存在表明它遵循植物体中的预期SCPL ER至液泡运输途径。通过在CSY1294中由低拷贝质粒表达AbLS的N端和C端GFP融合体来检查酵母中的AbLS定位。荧光显微镜检查揭示，N端融合体(GFP-AbLS)与液泡膜染色剂FM4-64共定位(图52)。未检测到C端融合体(AbLS-GFP)的荧光，这与天然C端对于SCPL酰基转移酶的稳定性至关重要的报道是一致的(参见Stehle,F.、Stubbs,M.T.、Strack,D.和Milkowski,C.Heterologous expression of a serine carboxypeptidase-like acyltransferaseand characterization of the kinetic mechanism,FEBS Journal,275,(2008))。
10.1.1.2)酵母中SCPL-AT的液泡隔离(Vacuolar sequestration)可能阻止进入胞质溶胶底物池，因为酵母可能缺乏植物中存在的用于与胞质溶胶交换次级代谢物的必要的液泡膜(tonoplastic)转运蛋白。为了确定将AbLS强制定位到其他酵母区室—可能是通过改善对胞质溶胶代谢物的接近—是否能够实现活性，将野生型N端SP序列替换为一组取自酵母蛋白的N端信号序列，所述蛋白靶向液泡腔(Prc1p和Pep4p)、面向腔的液泡膜(Dap2p)、反式高尔基网(Och1p)、面向腔的ER膜(Mns1p)和线粒体基质(Cit1p)(图53)。野生型SP也完全去除，并且对于另一变体，将经典的过氧化物酶体靶向序列(PTS1)附连至C端。这些嵌合AbLS变体在CSY1294中由高拷贝质粒表达，并且在选择性培养基中生长96h后，通过LC-MS/MS针对活性对转化体进行筛选。对于任何变体，均未观察到利托林或下游中间体的产生(图53)。
10.1.2)酵母中SCPL-AT的不正确的翻译后加工可能阻止活性酶的表达。
10.1.2.1)蛋白质N-糖基化模式在酵母与植物之间有所不同，并且先前的报告表明，各种植物酶的正确的N-糖基化对其折叠、稳定性和/或活性至关重要(参见Kar,B.、Verma,P.、den Haan,R.、Sharma,A.K.,Effect of N-linked glycosylation on theactivity and stability of aβ-glucosidase from Putranjiva roxburghii.Int.J.Biol.Macromol.112,490–498(2018)；另外参见Podzimek,T.等人,N-glycosylation oftomato nuclease TBN1 produced in N.benthamiana and its effect on the enzymeactivity.Plant Sci.276,152–161(2018)；另外参见Strasser,R.,Plant proteinglycosylation.Glycobiology.26,926–939(2016))。AbLS多肽的计算机模拟分析预测了四个N-糖基化位点(N152、N320、N376、N416)，并且在本氏烟草中未检测到该蛋白的O-糖基化(图54)。在CSY1294和本氏烟草中表达带有C端HA标签的野生型AbLS、四种N→Q突变体中的每一种(其中N到Q的突变消除了N-糖基化(23))，或四重N→Q突变体，并且通过蛋白质印迹比较糖基化谱。而野生型AbLS、N→Q单突变体和四重突变体在本氏烟草中全部以单条带的形式出现，表明单糖基化状态，只有四重N→Q突变体在酵母中产生单条带；所有其他变体均表现为双条带或三条带，表明多种糖基化状态的组合(图55)。然而，由于酵母中两个野生型AbLS条带的深浓部分(denser)与烟草中野生型AbLS的深浓部分显示出部分重叠，酵母表达的AbLS的至少一些级分必须处于正确的糖基化状态，并且错误糖基化不太可能解释酵母中AbLS活性的完全缺乏。(图54-55)。
10.1.2.2)SCPL酰基转移酶的一个子集，包括来自拟南芥的芥子酰基葡萄糖:胆碱芥子酰基转移酶(AtSCT)和来自糙伏毛燕麦的燕麦素合酶(AsSCPL1)，已被证明含有内部前肽接头，所述接头通过蛋白水解去除以产生通过二硫键连接的活性异源二聚体(参见Shirley,A.M.、Chapple,C.,Biochemical characterization of sinapoylglucose:choline sinapoyltransferase,a serine carboxypeptidase-like protein thatfunctions as an acyltransferase in plant secondarymetabolism.J.Biol.Chem.278,19870–19877(2003)；另外参见Mugford,S.T.等人,Aserine carboxypeptidase-like acyltransferase is required for synthesis ofantimicrobial compounds and disease resistance in oats.Plant Cell.21,2473–2484(2009))。AbLS氨基酸序列与先前表征的植物丝氨酸羧肽酶和SCPL酰基转移酶的那些氨基酸序列的比较揭示，存在25至30个残基的内部序列，所述序列与AtSCT、AsSCPL1和小麦羧肽酶2(TaCBP2)的高度可变的前肽对齐，表明AbLS也经历内蛋白水解切割以形成异源二聚体(图56)。此外，AbLS的同源性模型表明，预测的内部前肽阻断活性位点，因此需要去除活性(图57)。然而，在本氏烟草中表达的野生型AbLS似乎不经历蛋白水解切割，因为在二硫化物还原条件下通过蛋白质印迹未检测到预期的～20-25kDa C端片段(图54、55)。由于推定的前肽在植物体中似乎不被切割或去除，AbLS可能采用在植物中的天然构象，使前肽从活性位点偏移，但酵母分泌途径和/或液泡的生化环境中的差异阻止了这种偏移，从而阻断活性。
为了解决这种失败模式，构建分裂AbLS对照，其中位于推定的前肽接头侧翼的N和C端结构域独立表达，具有或不具有单独的信号肽。此外，构建了AbLS变体，其中推定的前肽替换为柔性(GGGS)n(SEQ ID NO:26)接头，先前证明在酵母中被切割的来自AtSCT的内部前肽(参见Shirley,A.M.、Chapple,C.,Biochemical characterization ofsinapoylglucose:choline sinapoyltransferase,a serine carboxypeptidase-likeprotein that functions as an acyltransferase in plant secondarymetabolism.J.Biol.Chem.278,19870–19877(2003))，或含有由反式高尔基体蛋白酶Kex2p切割的聚精氨酸位点的合成接头(参见Chen,X.、Zaro,J.L.、Shen,W.C.,Fusion proteinlinkers:Property,design and functionality.Adv.Drug Deliv.Rev.65,1357–1369(2013)；另外参见Redding,K.、Seeger,M.、Payne,G.S.、Fuller,R.S.,The effects ofclathrin inactivation on localization of Kex2 protease are independent of theTGN localization signal in the cytosolic tail of Kex2p.Mol.Biol.Cell.7,1667–1677(1996))(图58)。分裂AbLS对照和前肽/接头变体中的每一个均在CSY1294中由低拷贝质粒表达，并且在选择性培养基中生长96h后，通过LC-MS/MS针对LS活性对转化体进行筛选。对于这些变体中的任一个，均未观察到利托林或下游TA的产生。
为了解决蛋白质表达的问题，在CSY1294中由低拷贝质粒表达以上带有C端HA标签的AbLS变体中的每一个，并通过蛋白质印迹将表观蛋白质大小与分裂AbLS对照相比较(图58)。AtSCT和聚精氨酸接头都不产生蛋白水解切割所预期的20-25kDa C端片段。在后一种情况下，聚精氨酸AbLS变体的切割失败表明，蛋白质在反式高尔基体网络(TGN；在酵母中也称为晚期高尔基体)上游的分泌途径中变得停滞，这可能是由于在表达野生型或靶向高尔基体(Och1p SP融合的)的AbLS的CSY1294中观察到的严重生长缺陷。
10.1.3)SCPL-AT在酵母中的功能表达可以通过工程化N端融合体来实现，所述融合体改变从TGN的分选。可溶性酵母蛋白从TGN到液泡的转运需要通过液泡蛋白分选(Vps)货物转运蛋白识别典型的N端信号序列，而到达酵母TGN的整合膜蛋白似乎默认分选到液泡(参见Stack,J.H.,Receptor-Mediated Protein Sorting to the Vacuole in Yeast:Roles for Protein Kinase,Lipid Kinase and GTP-Binding Proteins.Annu.Rev.CellDev.Biol.11,1–33(1995)；另外参见Roberts,C.J.、Nothwehr,S.F.、Stevens,T.H.,Membrane protein sorting in the yeast secretory pathway:Evidence that thevacuole may be the default compartment.J.Cell Biol.119,69–83(1992))。因此，通过用N端融合的可溶性结构域遮蔽SP，将SCPL-AT转化为跨膜蛋白可以解决TGN分选中的阻碍。
10.1.3.1)在一个实例中，AbLS变体是用一组N端融合的可溶性结构域构建的，包括来自水母(GFP、BFP、mVenus)和香菇珊瑚(mCherry、DsRed)家族的荧光蛋白；具有突变的蛋白酶切割位点(SUMO*)的小泛素相关修饰剂(Smt3p)；以及TA途径中的上游酶AbUGT。这些变体和野生型AbLS在CSY1294中由低拷贝质粒表达，并在选择性培养基中生长96h后针对利托林合酶活性进行筛选。所有N端融合的AbLS变体都表现出可测量的莨菪碱和东莨菪碱的积累。将水母GFP衍生的荧光蛋白与AbLS融合导致莨菪碱和东莨菪碱的产量分别为～1μg/L和～0.1μg/L；而香菇珊瑚衍生的荧光蛋白的融合则导致明显更高的TA产量，其中通过DsRed融合体获得最大滴度(10.3μg/L莨菪碱，0.87μg/L东莨菪碱)(图59)。AbLS活性的增强似乎与N端结构域的低聚化状态相关，其中东莨菪碱产量按照从单体(GFP、BFP、mVenus、mCherry、SUMO*)到同源二聚体(AbUGT)到同源四聚体(DsRed)结构域的顺序增加。
10.2)为了产生能够完成TA生物合成的菌株，将酵母密码子优化的DsRed-ABLS和第二拷贝的UGP1在被破坏的EGH1位点处整合到CSY1294的基因组中，以产生CSY1296。CSY1296表现出滴度分别为10.2μg/L和1.0μg/L的从头莨菪碱和东莨菪碱产生。
实施例11.使用异源转运蛋白缓解细胞内底物转运限制
由于进行TA生物合成的酶分布于多个亚细胞区室(胞质溶胶、ER膜、过氧化物酶体、液泡、线粒体)，并且酵母不太可能具有在植物中发现的能够在不同区室之间移动TA生物合成中间体的转运蛋白，因此细胞内代谢物转运可能限制TA的产生。
11.1)区室间转运限制可通过植物转运蛋白在非植物宿主细胞中的功能表达来解决。DsRed-AbLS的液泡区室化(图60)需要将胞质溶胶托品和PLA葡糖苷内向转运至液泡腔，并将液泡利托林外向转运至胞质溶胶。已经在茄科植物中鉴定了几种负责液泡生物碱和糖苷隔离的多药和毒素外排(MATE)转运蛋白，包括对TA具有观察到的或预测的活性的三种(参见Morita,M.等人,Vacuolar transport of nicotine is mediated by a multidrugand toxic compound extrusion(MATE)transporter in Nicotiana tabacum.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.106,2447–2452(2009)；另外参见Shoji,T.等人,Multidrug and toxiccompound extrusion-type transporters implicated in vacuolar sequestration ofnicotine in tobacco roots.Plant Physiol.149,708–718(2009))。在一个实例中，普通烟草茉莉酸酯可诱导的生物碱转运蛋白1(NtJAT1)和两种MATE(NtMATE1、NtMATE2)在CSY1296中由低拷贝质粒表达，并且在选择性培养基中生长96h后测量TA的积累。NtJAT1和NtMATE2的表达改善了TA的产生，其中前者导致莨菪碱和东莨菪碱滴度分别增加74％和18％(图61)。
11.2)为了评估这些转运蛋白的亚细胞定位，并确定可能的作用机制，对由低拷贝质粒表达NtJAT1或NtMATE2的C端GFP融合体的CSY1296进行荧光显微镜检查。分析支持NtJAT1几乎完全定位于液泡膜(与DsRed-AbLS共定位)，而NtMATE2被分配在液泡膜与质膜之间(图60)，这表明这两种转运蛋白都可起到消除液泡底物转运限制的作用，而后者还可能改善细胞TA外向转运。
实施例12：被工程化以由L-苯丙氨酸或L-酪氨酸和L-精氨酸产生非天然TA的酵母
除了被工程化以产生在生物体中天然存在的药用和非药用TA之外，酵母还可以被工程化以产生非天然TA(图3)。例如，酵母可以被工程化为表达生物合成途径，以产生不被植物天然并入TA中的酰基供体化合物。
12.1)在一个实例中，实施例3中描述的平台产托品酵母菌株可以进一步工程化以产生酰基供体化合物肉桂酸(如实施例6中所述)并表达肉桂酸活化酶和酯化酶以产生非天然TA，诸如肉桂酰托品。
12.1.1)肉桂酸酯可以通过苯丙氨酸解氨酶，例如来自拟南芥的PAL1(AtPAL1)，由苯丙氨酸产生。由于EcCS需要辅酶A(CoA)激活的酰基供体，可以表达对肉桂酸酯具有确定活性的4-香豆酸-CoA连接酶，诸如来自拟南芥的4CL5(At4CL5)(参见Eudes,A.等人Exploiting members of the BAHD acyltransferase family to synthesize multiplehydroxycinnamate and benzoate conjugates in yeast.Microbial Cell Factories,15,(2016))，以在酵母中实现肉桂酰-CoA生物合成。如实施例6中所述，用能够产生肉桂酸的低拷贝质粒转化实施例3中所述的平台产托品酵母菌株。
12.1.2)通过用具有URA3选择性标志物、HXT7和PMA1启动子，以及来自拟南芥的4-香豆酸-CoA连接酶变体(At4CL5)和来自古柯的可卡因合酶(EcCS)的编码序列的高拷贝2μ质粒对其进行转化，对实施例12.1.1的工程化菌株进行进一步修饰，以产生肉桂酰托品。含有低拷贝和高拷贝质粒的所得菌株在具有适当的氨基酸缺失溶液(-Ura-Trp)的合成完全培养基中于25℃下生长。在生长72小时后，通过LC-MS/MS分析对培养基中的肉桂酰托品进行分析(图62)。串联MS/MS和碎片分析用于检测和验证肉桂酰托品的身份。与肉桂酰托品的母体质量(m/z+＝272)相对应的MS/MS谱图的比较揭示了在3.684分钟的保留时间处的新峰，并且产生质量似乎与真正的肉桂酰托品标准品的转变相匹配的片段(图62a)。丰度最大的质量转变，m/z+272→124，与在莨菪碱的碎片化过程中产生的主要m/z+＝124托品片段一致(参见Bedewitz,M.A.等人A Root-Expressed L-Phenylalanine:4-Hydroxyphenylpyruvate Aminotransferase Is Required for Tropane AlkaloidBiosynthesis in Atropa belladonna.The Plant Cell,26,(2014))。
12.1.3)基于实施例12.1.2中描述的肉桂酰托品的272→124LC-MS/MS转变，开发了多反应监测(MRM)LC-MS/MS方法，以测量从头肉桂酰托品产生。肉桂酰托品在实施例12.1.2的工程化菌株的细胞外介质中积累到相当高的水平，但在不存在AtPAL1、At4CL5和EcCS的情况下则不然(图62b)。基于标准曲线，从头产生的肉桂酰托品的滴度估计为6.0μg/L。
实施例13：改良生长培养基以提高TA和TA前体产量
TA前体和TA的生产滴度可以通过改良培养基组成来提高。例如，培养基类型可以在培养基基础(例如，酵母蛋白胨、酵母氮碱)、碳源(例如，葡萄糖、麦芽糊精)和氮源(例如，氨基酸、硫酸铵、脲)的方面变化。培养基类型也可以在各组分的相对比例上有所不同，诸如碳源的浓度和氮源的浓度，或各单独氨基酸的浓度。
13.1)产托品酵母菌株(如实施例3所述)最初在具有不同碳源的限定培养基(即，具有硫酸铵和所有氨基酸的YNB)中生长，并在25℃下生长48小时后测定托品产量。在2％半乳糖的情况下观察到托品的最高产量(图63a)。然而，一些工程化菌株在某些碳源(诸如甘油、阿拉伯糖和山梨糖醇)的情况下无法生长或生长严重减慢，这可能是由于无法将这些碳源同化到中央代谢中。
13.2)产托品酵母菌株(如实施例3所述)在具有用于生长的2％右旋糖并补充有2％的另一碳源的限定培养基中培养，并且在25℃下生长48小时后测定托品产量。在2％右旋糖和2％甘油的情况下观察到托品的最高产量(图63b)。甘油是非糖碳源，其可通过几种机制为TA前体和TA的更高产量作出贡献，包括稳定细胞脂质膜、改善异源蛋白质的折叠和稳定性，以及再生细胞色素P450和一些短链脱氢酶/还原酶的活性所需的NADPH辅因子(参见Li,Y.等人Complete biosynthesis of noscapine and halogenated alkaloids in yeast.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2018,115(17)E3922-E3931)。
13.3)可以通过缓解通量瓶颈和转运限制来实现工程化酵母中从头药用TA生物合成的改善。
13.3.1)通过瓶颈酶的过表达和培养基优化实现TA产量的提高。由于托品在CSY1296中的产量(～mg/L)不太可能限制向东莨菪碱的通量(～μg/L)，因此通过在CSY1296中由低拷贝质粒表达苯丙酮酸与东莨菪碱之间的每种异源酶的另外拷贝并测量TA和中间体的产量来鉴定限制东莨菪碱产量的代谢瓶颈(图2)。WfPPR和DsH6H的另外拷贝导致莨菪碱和东莨菪碱滴度分别增加64％和89％，表明这些酶是途径通量的主要限制因素(图64)。
13.3.2)通过将NtJAT1以及第二拷贝的WfPPR和DsH6H整合到CSY1296中构建改进的产东莨菪碱菌株。所得菌株CSY1297显示出相对于CSY1296的莨菪碱和东莨菪碱积累的相应2.4倍和7.1倍增加(图65)。
尽管有附加条款，但本公开可由以下条款限定：
条款1.一种工程化的非植物细胞，其产生莨菪烷生物碱产物、莨菪烷生物碱产物的前体，或莨菪烷生物碱产物的衍生物。
条款2.根据条款1所述的细胞，其中所述细胞是微生物细胞。
条款3.根据条款1或2所述的细胞，其中所述工程化细胞包含用于编码多种酶的多个异源编码序列，其中所述酶中的至少一种选自由以下组成的组：精氨酸脱羧酶、胍丁胺脲水解酶、胍丁胺酶、腐胺N-甲基转移酶、N-甲基腐胺氧化酶、吡咯烷酮合酶、托品酮合酶、细胞色素P450还原酶、托品酮还原酶、苯丙酮酸还原酶、3-苯基乳酸UDP-葡糖基转移酶84A27、利托林合酶、利托林变位酶、莨菪碱脱氢酶、莨菪碱6β-羟化酶/双加氧酶以及可卡因合酶。
条款4.根据条款1-3中任一项所述的细胞，其中内源性精氨酸代谢在所述细胞中被改良。
条款5.根据条款1-4中任一项所述的细胞，其中内源性苯丙氨酸和苯丙烷代谢在所述细胞中被改良。
条款6.根据权利要求1-5中任一项所述的细胞，其中内源性多胺调控机制在所述细胞中被破坏。
条款7.根据条款1-6中任一项所述的细胞，其中内源性乙酸盐代谢在所述细胞中被改良。
条款8.根据条款1-7中任一项所述的细胞，其中内源性糖苷代谢在所述细胞中被改良。
条款9.根据条款1-8中任一项所述的细胞，其中所述细胞产生莨菪烷生物碱产物、莨菪烷生物碱产物的前体，或莨菪烷生物碱产物的衍生物，其选自由以下组成的组：莨菪碱、阿托品、山莨菪碱、东莨菪碱、打碗花精、可卡因或非天然莨菪烷生物碱。
条款10.根据条款1-9中任一项所述的细胞，其中所述工程化细胞包含编码多种酶的多个异源编码序列，所述酶包含与丝氨酸羧肽酶样酰基转移酶结构域的N端融合的一个或多个可溶性蛋白结构域。
条款11.根据条款1-10中任一项所述的细胞，其中TA、TA前体和/或TA衍生物跨细胞内膜或跨质膜的转运在所述细胞中被改良。
条款12.根据条款1-11中任一项所述的细胞，其中所述工程化细胞包含用于编码多种转运蛋白的多个异源编码序列，其中所述转运蛋白中的至少一种选自由以下组成的组：多药和毒素外排转运蛋白、硝酸盐/肽家族转运蛋白、ATP结合盒转运蛋白以及多效耐药转运蛋白。
条款13.一种用于产生莨菪烷生物碱、莨菪烷生物碱产物的前体或莨菪烷生物碱产物的衍生物的方法，其包括
(a)在适于蛋白质产生的条件下培养根据条款1-12中任一项所述的细胞；
(b)向细胞培养物中添加起始化合物；以及
(c)从所述培养物中回收所述莨菪烷生物碱或莨菪烷生物碱产物的所述前体。
尽管前述发明已通过说明和实例为了清楚理解的目的相当详细地描述，但是本领域的普通技术人员显而易见的是鉴于本发明的教导，在不背离所附权利要求的精神或范围的情况下可以对其进行某些变化和修改。
因此，前述仅仅说明了本发明的原理。应当理解的是，本领域的技术人员将能够设计各种布置，尽管没有在本文中明确地描述或显示，但所述各种布置体现本发明的原理并且包括在本发明的精神和范围内。此外，本文列举的所有实例和条件性语言主要旨在帮助读者理解本发明的原理和发明人为促进本领域的发展而贡献的概念，并且被解释为不限于这些具体列举的实例和条件。此外，本文叙述本发明的原理、方面和实施方案以及其具体实例的所有陈述旨在涵盖其结构和功能等同物。另外，预期此类等同物包括当前已知的等同物以及未来开发的等同物，即，开发的不论结构如何执行相同功能的任何要素。因此，本发明的范围不旨在限于本文示出和描述的示例性实施方案。相反，本发明的范围和精神由随附权利要求体现。

Claims (35)

1.一种产生莨菪烷生物碱产物的前体、莨菪烷生物碱产物或莨菪烷生物碱产物的衍生物的工程化的非植物细胞，其中所述工程化的非植物细胞包含编码用于产生莨菪烷生物碱产物的所述前体、所述莨菪烷生物碱产物或莨菪烷生物碱产物的所述衍生物的途径内的多种酶的多个异源编码序列；
其中所述细胞包含对选自下组的一种或多种内源代谢途径或调控机制的一种或多种改变：内源性精氨酸代谢、内源性苯丙氨酸和苯丙烷代谢、内源性多胺调控机制和代谢、内源性乙酸盐代谢，以及内源性糖苷代谢。
2.根据权利要求1所述的细胞，其中所述细胞包含对选自下组的一种或多种内源代谢途径或调控机制的一种或多种改变：内源性精氨酸代谢、内源性苯丙氨酸和苯丙烷代谢、内源性多胺调控机制和代谢，以及内源性乙酸盐代谢。
3.根据权利要求1所述的细胞，其中所述细胞包含对内源性糖苷代谢的一种或多种改变。
4.根据权利要求1-3所述的细胞，其中所述细胞是微生物细胞。
5.根据权利要求4所述的细胞，其中所述细胞是真菌细胞。
6.根据权利要求1-5所述的细胞，其中所述工程化细胞包含一种或多种酶的一个或多个异源编码序列，其中所述酶中的至少一种选自由以下组成的组：精氨酸脱羧酶、胍丁胺脲水解酶、胍丁胺酶、腐胺N-甲基转移酶、N-甲基腐胺氧化酶、吡咯烷酮合酶、托品酮合酶、细胞色素P450还原酶、托品酮还原酶、苯丙氨酸解氨酶、酪氨酸解氨酶、苯丙酮酸还原酶、4-香豆酸-CoA连接酶、3-苯基乳酸UDP-葡糖基转移酶84A27、利托林合酶、利托林变位酶、莨菪碱脱氢酶、莨菪碱6β-羟化酶/双加氧酶以及可卡因合酶。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的细胞，其中通过对一种或多种内源酶的一个或多个编码序列进行修饰来改变所述细胞中的内源性精氨酸代谢，其中所述酶中的至少一种选自由以下组成的组：谷氨酸N-乙酰转移酶、乙酰谷氨酸激酶、N-乙酰-γ-谷氨酰-磷酸还原酶、乙酰鸟氨酸氨基转移酶、鸟氨酸乙酰转移酶、鸟氨酸氨基甲酰转移酶、精氨基琥珀酸合酶、精氨基琥珀酸裂解酶以及精氨酸酶。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的细胞，其中通过对一种或多种内源酶的一个或多个编码序列进行修饰来改变所述细胞中的内源性苯丙氨酸和苯丙烷代谢，其中所述酶中的至少一种选自由以下组成的组：五功能AROM多肽、分支酸合酶、分支酸变位酶、预苯酸脱水酶、芳香族氨基转移酶以及苯丙烯酸脱羧酶。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的细胞，其中通过对一种或多种内源蛋白的一个或多个编码序列进行修饰来改变所述细胞中的内源性多胺调控机制，其中所述蛋白质中的至少一种选自由以下组成的组：甲硫腺苷磷酸化酶、鸟氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶抗酶、多胺氧化酶、亚精胺合酶、精胺合酶、多胺转运蛋白以及多胺通透酶。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的细胞，其中通过对一种或多种内源酶的一个或多个编码序列进行修饰来改变所述细胞中的内源性乙酸盐代谢，其中所述酶中的至少一种选自由醇脱氢酶和醛脱氢酶组成的组。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的细胞，其中通过对一种或多种内源酶的一个或多个编码序列进行修饰来改变所述细胞中的内源性糖苷代谢，其中所述酶中的至少一种选自由葡聚糖1,3-β-葡糖苷酶和甾基-β-葡糖苷酶组成的组。
12.根据权利要求6-11中任一项所述的细胞，其中一个或多个编码序列的修饰选自由以下组成的组：所述细胞固有的生物合成酶或调控蛋白基因中的反馈抑制缓解突变、所述细胞固有的生物合成酶基因的转录调节修饰，以及所述细胞固有的酶或蛋白质中的失活突变。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的细胞，其中所述工程化细胞包含编码一种或多种酶的一个或多个异源编码序列，所述酶包含一个或多个可溶性蛋白结构域，所述可溶性蛋白结构域与丝氨酸羧肽酶样酰基转移酶结构域的N端融合，以使得所述酰基转移酶结构域能够在所述工程化细胞的亚细胞区室中功能性地表达。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的细胞，其中所述细胞产生莨菪烷生物碱产物的前体，其选自由以下组成的组：胍丁胺、N-氨基甲酰腐胺、N-甲基腐胺、4-甲基氨基丁醛、N-甲基吡咯啉鎓、4-(1-甲基-2-吡咯烷基)-3-氧代丁酸、托品酮、托品、假托品、芽子碱、甲基芽子碱、通过硫酯键与苯基乳酸共价键合的辅酶A，或通过糖苷键与肉桂酸、阿魏酸、香豆酸或苯基乳酸共价键合的糖。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的细胞，其中所述细胞产生莨菪烷生物碱产物，其选自由以下组成的组：莨菪碱、阿托品、山莨菪碱、东莨菪碱、打碗花精、可卡因，或非天然莨菪烷生物碱。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的细胞，其中所述细胞产生莨菪烷生物碱产物的衍生物，其选自由以下组成的组：对羟基阿托品、对羟基莨菪碱、对氟莨菪碱、对氯莨菪碱、对溴莨菪碱、对氟东莨菪碱、对氯东莨菪碱、对溴东莨菪碱、N-甲基莨菪碱、N-丁基莨菪碱、N-甲基东莨菪碱、N-丁基东莨菪碱、N-乙酰莨菪碱以及N-乙酰东莨菪碱。
17.根据权利要求15所述的细胞，其中所述细胞产生选自由莨菪碱、阿托品或东莨菪碱组成的组的莨菪烷生物碱产物。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的细胞，其中一种或多种TA、一种或多种TA前体和/或一种或多种TA衍生物跨细胞内膜或跨质膜的转运在所述细胞中被改良。
19.根据权利要求18所述的细胞，其中通过编码一种或多种转运蛋白的一个或多个异源编码序列实现改良的转运，其中所述转运蛋白中的至少一种选自由以下组成的组：多药和毒素外排转运蛋白、硝酸盐/肽家族转运蛋白、ATP结合盒转运蛋白以及多效耐药转运蛋白。
20.一种产生莨菪烷生物碱产物或莨菪烷生物碱产物的衍生物的工程化的非植物细胞，其中所述工程化的非植物细胞包含编码用于产生所述莨菪烷生物碱产物或莨菪烷生物碱产物的所述衍生物的途径内的多种酶的多个异源编码序列。
21.根据权利要求20所述的细胞，其中所述细胞是微生物细胞。
22.根据权利要求21所述的细胞，其中所述细胞是真菌细胞。
23.根据权利要求20-22所述的细胞，其中所述工程化细胞包含一种或多种酶的一个或多个异源编码序列，其中所述酶中的至少一种选自由以下组成的组：精氨酸脱羧酶、胍丁胺脲水解酶、胍丁胺酶、腐胺N-甲基转移酶、N-甲基腐胺氧化酶、吡咯烷酮合酶、托品酮合酶、细胞色素P450还原酶、托品酮还原酶、苯丙氨酸解氨酶、酪氨酸解氨酶、苯丙酮酸还原酶、4-香豆酸-CoA连接酶、3-苯基乳酸UDP-葡糖基转移酶84A27、利托林合酶、利托林变位酶、莨菪碱脱氢酶、莨菪碱6β-羟化酶/双加氧酶以及可卡因合酶。
24.根据权利要求20-23中任一项所述的细胞，其中所述工程化细胞包含编码一种或多种酶的一个或多个异源编码序列，所述酶包含一个或多个可溶性蛋白结构域，所述可溶性蛋白结构域与丝氨酸羧肽酶样酰基转移酶结构域的N端融合，以使得所述酰基转移酶结构域能够在所述工程化细胞的亚细胞区室中功能性地表达。
25.根据权利要求20-24中任一项所述的细胞，其中所述细胞产生莨菪烷生物碱产物，其选自由以下组成的组：莨菪碱、阿托品、山莨菪碱、东莨菪碱、打碗花精、可卡因，或非天然莨菪烷生物碱。
26.根据权利要求20-25中任一项所述的细胞，其中所述细胞产生莨菪烷生物碱产物的衍生物，其选自由以下组成的组：对羟基阿托品、对羟基莨菪碱、对氟莨菪碱、对氯莨菪碱、对溴莨菪碱、对氟东莨菪碱、对氯东莨菪碱、对溴东莨菪碱、N-甲基莨菪碱、N-丁基莨菪碱、N-甲基东莨菪碱、N-丁基东莨菪碱、N-乙酰莨菪碱以及N-乙酰东莨菪碱。
27.根据权利要求25所述的细胞，其中所述细胞产生选自由莨菪碱、阿托品或东莨菪碱组成的组的莨菪烷生物碱产物。
28.根据权利要求20-27中任一项所述的细胞，其中一种或多种TA、一种或多种TA前体和/或一种或多种TA衍生物跨细胞内膜或跨质膜的转运在所述细胞中被改良。
29.根据权利要求28所述的细胞，其中通过编码一种或多种转运蛋白的一个或多个异源编码序列实现改良的转运，其中所述转运蛋白中的至少一种选自由以下组成的组：多药和毒素外排转运蛋白、硝酸盐/肽家族转运蛋白、ATP结合盒转运蛋白以及多效耐药转运蛋白。
30.一种用于产生莨菪烷生物碱产物、莨菪烷生物碱产物的前体或莨菪烷生物碱产物的衍生物的方法，其包括
(a)在适于蛋白质产生的条件下培养根据权利要求1-29中任一项所述的细胞；
(b)向细胞培养物中添加起始化合物；以及
(c)从所述培养物中回收所述莨菪烷生物碱产物、莨菪烷生物碱产物的所述前体或莨菪烷生物碱产物的所述衍生物。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述细胞在补料分批或分批发酵中培养。
32.根据权利要求30-31所述的方法，其中添加到所述细胞培养物中的所述起始化合物是糖或底物，所述底物含有一种或多种糖，或在微生物发酵过程中转化为一种或多种糖。
33.根据权利要求30-31所述的方法，其中添加到所述细胞培养物中的所述起始化合物是氨基酸或包含一种或多种氨基酸的混合物，或在微生物发酵过程中转化为一种或多种氨基酸的底物。
34.根据权利要求30-31所述的方法，其中添加到所述细胞培养物中的所述起始化合物是莨菪烷生物碱产物的前体。
35.根据权利要求30-34所述的方法，其中莨菪烷生物碱产物的所述前体、所述莨菪烷生物碱产物或莨菪烷生物碱产物的所述衍生物通过包括液-液萃取、色谱分离、蒸馏或重结晶的过程回收。
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