MX2013004944A

MX2013004944A - Metodo para aumentar el rendimiento y la produccion de quimicos finos en las plantas.

Info

Publication number: MX2013004944A
Application number: MX2013004944A
Authority: MX
Inventors: Gunnar Plesch; Piotr Puzio; Astrid Blau; Birgit Wendel; Beate Kamlage; Christophe Reuzeau; Oliver Blaesing; Oliver Thimm; Michael Manfred Herold; Janneke Hendriks
Original assignee: Basf Plant Science Co Gmbh
Priority date: 2010-11-05
Filing date: 2011-10-27
Publication date: 2013-06-28
Also published as: EP2635685A1; WO2012059849A1; US20130340119A1; CN103282500A; ZA201304041B; CA2815341A1; AU2011324862A2; AR084726A1; AU2011324862A1; PH12013500995A1; EP2635685A4

Abstract

Se proporciona un método para mejorar los rasgos relacionados al rendimiento en plantas mediante la modulación de la expresión, en una planta, de un ácido nucleico que codifica un polipéptido POI (Proteína De Interés). Se proporcionan métodos para la producción de plantas que tienen expresión modulada de un ácido nucleico que codifica un polipéptido chaperón análogo a DnaJ, en que las plantas tienen rasgos relacionados al rendimiento, mejorados, en comparación a las plantas de control. También se proporcionan ácidos nucleicos que codifican el chaperón análogo a DnaJ, constructos que comprenden los mismos y usos de los mismos.

Description

MÉTODO PARA AUMENTAR EL RENDIMIENTO Y LA PRODUCCIÓN DE QUÍMICOS FINOS EN LAS PLANTAS CAMPO TÉCNICO La presente invención se basa en, y reivindica el beneficio de la solicitud provisional Norteamericana 61/485641, EP 11165957, EP 10190115.5, EP 10190348.2, EP 10190974.5 y la solicitud internacional WO 2011/060920 (PCT/EP2010/006988) . El contenido completo de las solicitudes de patente a las que se hace referencia anteriormente, se incorpora aquí por esta referencia, y en particular de EP 10190974.5, página 1431, último párrafo, a la linea 24 de la pagina 1432, página 1935, último párrafo · a la página 1937, linea 20 asi como aquellas lineas de las tablas I, II, IV y d, relacionadas con YnI064c, y sus secuencias relacionadas como se definen aquí, y de la solicitud internacional WO 2011/060920 ( PCT/EP2010/006988 ) página 5816, lineas 9 a 25, página 5878, linea 21 a linea 8 de la siguiente página, página 6235, linea 9 a 25, página 6301, lineas 4 a 34, página 1, linea 16 a 8 de la siguiente página, página 1, linea 20 a la última linea de la siguiente página, asi como aquellas lineas de las tablas d, I, II, IV y las relacionadas con YnI064c, SEC ID NO. 117495 y las secuencias relacionadas (por ejemplo, homólogos, parálogos), como se definen ahí.

La presente invención se refiere de forma general al campo de la biología molecular y se refiere a un método para mejorar los rasgos relacionados con el rendimiento en plantas y/o a la producción de químicos finos al modular la expresión en plantas, de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de POI (Proteína de Interés) . La presente invención también se refiere al uso de polipéptidos de POI en plantas, para tener la expresión modulada de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de POI, las cuales plantas tienen rasgos mejorados relacionados con el rendimiento o contenido aumentado de químicos finos con relación a las plantas de tipo silvestre correspondientes o a otras plantas de control.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La población mundial en constante crecimiento y la disponibilidad cada vez menor de tierra cultivable disponible para la agricultura, ha impulsado la investigación hacia el aumento de la eficiencia de la agricultura. Los medios convencionales para la mejora de cultivos y hortalizas utilizan técnicas de reproducción selectiva para identificar las plantas que tienen las características deseadas. Sin embargo, tales técnicas de reproducción selectiva tienen varias desventajas, es decir, que estas técnicas por lo general requieren mucha mano de obra y resultan en plantas que frecuentemente contienen componentes genéticos heterogéneos que pueden no siempre resultar en que el rasgo deseado sea transmitido desde las plantas originales. Los avances en la biología molecular han permitido que el hombre modifique el germoplasma de animales y plantas. La ingeniería genética de plantas implica el aislamiento y la manipulación del material genético (típicamente en forma de ADN o ARN) y la introducción posterior de ese material genético en una especie de plantas. Tal tecnología tiene la capacidad de suministrar cultivos o plantas que tengan varios rasgos económicos, agronómicos y hortícolas mejorados.

Un rasgo es el rendimiento aumentado. El rendimiento se define normalmente como la producción mensurable del valor económico de un cultivo. Esto puede ser definido en términos de la cantidad y/o la calidad. En rendimiento depende directamente de varios factores, por ejemplo, el número y el tamaño de los órganos, la arquitectura de las plantas (por ejemplo, el número de ramas) , la producción de semillas, la senescencia foliar y más. El desarrollo de las raíces, la absorción de los nutrientes, la tolerancia al estrés y el vigor temprano también pueden ser factores importantes para determinar el rendimiento. La optimización de los factores mencionados anteriormente puede contribuir por lo tanto a aumentar el rendimiento de los cultivos.

El rendimiento de las semillas es un rasgo importante, ya que las semillas de muchas plantas son importantes para la nutrición humana y animal. Los cultivos tales como maíz, arroz, trigo, cañóla y soya representan más de la mitad de la ingesta calóricas, ya sea a través del consumo directo de las semillas en si o a través del consumo de productos cárnicos generados de semillas procesadas. Estas también pueden ser una fuente de azúcares, aceites, y muchos tipos de metabolitos usados en procesos industriales. Las semillas contienen un embrión (la fuente de nuevos brotes y raices) y un endospermo (la fuente de nutrientes para el crecimiento del embrión durante la germinación y durante el crecimiento temprano de las plántulas) . El desarrollo de las semillas involucra muchos genes, y requiere la transferencia de metabolitos desde las raices, las hojas y los tallos hacia las semillas en desarrollo. En endospermo, en particular, asimila los precursores metabólicos de los carbohidratos, los aceites y las proteínas y los sintetiza en macromoléculas de almacenamiento para llenar los granos.

Otro rasgo importante para muchos cultivos es su vigor temprano. El mejoramiento del vigor temprano es un objetivo importante de los programas modernos de reproducción del arroz, tanto en variedades de clima templado y tropical. Las raíces largas son importantes para el anclaje apropiado al suelo en el arroz sembrado en agua. Cuando el arroz se siembra directamente en campos inundados, y cuando las plantas deben emerger rápidamente a través del agua, las raíces más largas se asocian con el vigor. Cuando se practica la siembra en hileras, los mesocotilos y los coleóptilos más largos son importantes para el surgimiento de plántulas adecuadas. La habilidad para modificar mediante ingeniería el vigor temprano de las plantas sería de gran importancia en la agricultura. Por ejemplo, un vigor temprano deficiente ha sido una limitación para la introducción de híbridos de maíz (Zea mays L.) basados en germoplasma de Corn Belt en el Atlántico Europeo .

Otro rasgo importante es el de la tolerancia mejorada a las presiones abióticas. Las presiones abióticas son una causa primaria de la pérdida de cultivos a nivel mundial, reduciendo el rendimiento promedio para la mayoría de las plantas de cultivo principales en más del 50% (Wang et al., Planta 218, 1-14, 2003) . Las presiones abióticas pueden ser provocadas por la sequía, la salinidad, las temperaturas extremas, la toxicidad química y el estrés oxidativo. La habilidad para mejorar la tolerancia de las plantas a las presiones abióticas, sería de gran ventaja económica para los granjeros alrededor del mundo y permitiría la siembra de cultivos durante las condiciones adversas y en territorios donde la siembra de cultivos no puede ser posible de otra manera.

El rendimiento de los cultivos puede ser aumentado por lo tanto, optimizando uno de los factores mencionados anteriormente .

Dependiendo del uso final, la modificación de ciertos rasgos relacionados con el rendimiento puede ser favorecida sobre otros. Por ejemplo, para las aplicaciones tales como la producción de forrajes o madera, o para recursos bioenergéticos, puede ser deseable un aumento en las partes vegetativas de las plantas, y para las aplicaciones tales como la producción de harinas, almidón o aceite, puede ser particularmente deseable un aumento en los parámetros de las semillas. Aun entre los parámetros de las semillas, algunos pueden ser favorecidos sobre otros, dependiendo de la aplicación. Varios mecanismos pueden contribuir a aumentar el rendimiento de las semillas, ya sea que este sea en forma del tamaño aumentado de las semillas o número aumentado de las semillas .

Mejorar la calidad de los productos alimenticios o de los alimentos para animales es una tarea importante de la industria de los alimentos y los. forrajes. Esto es necesario ya que, por ejemplo ciertos ácidos grados E, los cuales se presentan en las plantas, están limitados con respecto al suministro de los mamíferos. En especial, para la calidad de los productos alimenticios y los forrajes para animales es ventajoso un perfil de ácidos grasos tan balaceado como sea posible ya que un gran exceso de ciertos ácidos grados como los ácidos grados omega 3 por arriba de una concentración específica en los alimentos, puede no tener otros efectos positivos a menos que el contenido de ácido graspo omega 3 está en balance con el contenido del ácido graso omega 6 de la dieta. Un aumento adicional en la calidad solo es posible via la adición de más ácidos grasos, los cuales son limitantes bajo estas condiciones. La adición especifica de ácidos grasos limitantes en forma de productos sintéticos debe ser llevada a cabo con extrema precaución con el fin de evitar un desequilibrio de ácidos grasos.

Para asegurar una alta calidad de los alimentos y los forrajes para animales, es necesario por lo tanto agregar una pluralidad de ácidos grasos de manera balanceada para satisfacer al organismo respectivo. Por consiguiente, existe aún una gran demanda de genes nuevos y más adecuados, los cuales codifiquen las enzimas o los reguladores, los cuales participan en la biosintesis de los ácidos grasos y que hagan posible producir ciertos ácidos grasos específicamente a escala industrial sin que se formen subproductos no deseados. En la selección de los genes para la biosintesis o la regulación dos características anteriores son particularmente importantes. Por un lado, existe al igual que en cualquier otro tiempo una necesidad por procesos mejorados para obtener los contenidos más altos posibles de ácidos grasos y por otro lado tan pocos subproductos como sea posible se deben producir en el proceso de producción.

Los ácidos grasos son los bloques de construcción de los triglicéridos, los fosfolípidos , lípidos, aceites y grasas. Algunos de los ácidos grasos tales como el ácido linoléico o linoléico son "esenciales" puesto que el cuerpo humano no es capaz de sintetizarlos pero los necesita, de modo que los humanos deben ingerirlos a través de la dieta. El cuerpo humano puede sintetizar otros ácidos grasos, por lo tanto, estos no se designan como "esenciales". No obstante, muy frecuentemente la cantidad de producción de, por ejemplo, los ácidos grasos tales como el ácido eicosapentaenoico (=EPA, C20:5A5'8'11'14,: ) o el acido docosahexaenoico (=DHA, C22 : 6A4'7'10'13'16,19) en el cuerpo, no es suficiente para una función corporal óptima. Los ácidos grasos poliinsaturados (=PUFA) es decir, los ácidos grasos los cuales tienen más de 1 enlace doble en la cadena de carbonos, se dividen en familias, dependiendo de dónde se localiza su enlace doble más extremo. Hay dos subtipos principales de ácidos grasos: los ácidos grasos omega 3 y omega 6. Los Omega 3 son aquellos con su enlace doble más extremo en el tercer carbono desde su extremo metilado. Los Omega 6, son aquellos con su enlace doble más extremo en el 6 carbono desde su extremo metilado. El ácido linoléico (un omega 6) y el ácido alfa-linoléico (un omega 3) son los únicos ácidos grasos realmente "esenciales". Ambos se usan dentro del cuerpo como materia prima para sintetizar otros, tales como el EPA o el DHA.

Los ácidos grasos y los triglicéridos tienen numerosas aplicaciones en la industria de los alimentos y de los forrajes, en cosméticos y en el sector de los fármacos.

Dependiendo de si estos son ácidos libres saturados o insaturados libres, o enlazados, por ejemplo en forma de triglicéridos con un contenido aumentado de ácidos grasos saturados o insaturados, estos son adecuados para las aplicaciones más variadas; asi, por ejemplo, los ácidos grasos poliinsaturados (=PUFAs) se agregan a las fórmulas infantiles para aumentar su valor nutricional. Los varios ácidos grasos y triglicéridos se obtienen principalmente de microorganismos tales como los hongos, de animales tales como el pescado o de plantas que producen aceites, incluyendo el fitoplancton y las algas, tales como la soya, la colza, el girasol y otras, donde estos se obtienen comúnmente en forma de sus triglicéridos.

Un objetivo de la presente invención es desarrollar un proceso poco costoso para la síntesis del ácido linoléico y/o el ácido linolénico. El ácido linoléico y el ácido linolénico son dos de los ácidos grasos los cuales más frecuentemente son limitantes .

Un objetivo de la presente invención es desarrollar un proceso barato para la síntesis de sacarosa, y/o de mio-inositol. Un objetivo adicional de la presente invención es desarrollar un proceso barato para la síntesis de sacáridos, en particular derivados de monosacáridos, por ejemplo, mio- inositol; y/o de disacáridos, preferiblemente de sacarosa y garantizar que dichos sacáridos sean más accesibles y fáciles de aislar y recuperar de los organismos productores a escala industrial, preferiblemente de plantas.

Actualmente se ha descubierto que varios rasgos relacionados con el rendimiento y/o la producción de químicos finos, pueden ser mejorados en plantas al modular la expresión en las plantas de un ácido nucleico que codifique un polipéptido de POI (Proteína de Interés) en la plantas, mediante los procesos de acuerdo con la invención, descritos aquí y en las modalidades caracterizadas aquí, así como en las reivindicaciones .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El DnaJ es una co-chaperona molecular de la familia Hsp40. La Hsp40 coopera con la proteína de choque térmico 70 chaperona (Hsp70, también llamada Dnak) y el factor de intercambio de nucleótidos GrpE co-chaperón para facilitar diferentes aspectos del metabolismo celular de las proteínas que incluyen el ensamblaje de las ribosomas, la translocación de proteínas, el plegamiento y el desplazamiento de las proteínas, la supresión de la acumulación de polipéptidos y la señalización celular ( alid (2001) Curr Protein Peptide Sci 2: 227-244). La DnaJ estimula a la Hsp70 para hidrolizar la ATP, una etapa clave en el enlazamiento estable de un substrato a la Hsp70. Además, la DnaJ en si también posee funciones de chaperona molecular ya que se ha demostrado que se enlaza a las cadenas emergentes en sistemas de translación in vitro y evita la acumulación de polipéptidos desnaturalizados (Laufen et al., (2001) Proc Nati Acad Sci EUA 96: 5452-5457). Los miembros de la familia de la DnaJ han sido identificados en una variedad de organismos (tanto en procariotas y eucariotas) y en una variedad de compartimientos celulares tales como el citosol, las mitocondrias , las peroxisomas, las glioxisomas, el retículo endoplasmático y el estroma de los cloroplastos . Dentro de un organismo múltiples Hsp40s pueden interactuar con una sola Hsp70 para generar pares de Hsp70::Hsp40 que facilitan numerosas reacciones en el metabolismo celular de las proteínas.

Todas las proteínas DnaJ se definen por la presencia del asi llamado dominio VJ", que consiste de aproximadamente 70 aminoácidos, localizados usualmente en la terminal amino de la proteína, y por la presencia del tri-péptido HPD altamente conservado, a la mitad del dominio J (InterPro, referencia IPR001623; Zdobnov et al., (2002) 18(8): 1149-50); El dominio "J" que consiste de 35 tetrámeros de hélices alfa, interactúa con las proteínas Hsp70. En el genoma de la Arabidopsis thaliana, se han identificado al menos 89 proteínas que comprenden el dominio J (Miernyk (1001) Cell Stress & Chaperones) .

Las proteínas DnaJ han sido clasificadas además en el Tipo I, Tipo II y Tipo III.

Las proteínas del dominio de Dnaj (o proteínas DnaJ) del Tipo I (Miernyk (2001) Cell Stress & Chaperone 6(3): 209-218), comprende (desde la terminal amino a la terminal carboxilo) los dominios identificados dentro de la proteina DnaJ arquetipica como se ha caracterizado primero en Escherichia coli : 1) una región de dominio G/F de aproximadamente 30 residuos de aminoácidos, rica en glicina (G) y fenilalanina (F), la cual, como se ha propuesto, regula la especificidad del polipéptido: 2) un dominio de dedos de zinc, rico en cisteina que contiene cuatro repeticiones del CXXCXGXG, donde X representa un residuo polar cargado; estas cuatro repeticiones funcionan en pares para formar el dominio de enlace al zinc I y II (InterPro, referencia IPR001305: Linke et al., (2003) J Biol Chem 278 (45) : 44457- 66); se piensa que el dominio de dedos de zinc interviene en las interacciones directas proteina : proteina y más específicamente para enlazar los polipéptidos no nativos a ser suministrados a la Hsp70. 3) un dominio de la terminal carboxilo (CTD; InterPro, referencia IPR002939) .

Las proteínas de dominio de DnaJ Tipo II comprenden el dominio J localizado en la terminal amino de las proteínas, ya sea en el dominio G/F o dominio de 20 dedos de zinc y un CTD. Las proteínas de dominio de DnaJ Tipo III comprenden solo el dominio J, el cual puede estar localizado en cualquier parte dentro de las proteínas.

En su forma nativa, las proteínas DnaJ pueden ser dirigidas a una variedad de compartimientos subcelulares, en cualquier forma soluble o enlazada a la membrana. Los ejemplos de tales compartimientos subcelulares en las plantas incluyen mitocondrias, cloroplastos, peroxisomas, el núcleo, el citoplasma, y la vía secretoria. Las secuencias de señalización y los péptidos de tránsito, usualmente localizados en la terminal amino de las proteínas DnaJ codificadas en el núcleo, son responsables por la focalización de estas proteínas a compartimientos subcelulares específicos.

Se ha descubierto que los polipéptidos similares a DNAL aumentan el rendimiento en las plantas bajo condiciones no estresadas (Publicación Internacional WO06067236) .

Actualmente se ha descubierto que la actividad preferiblemente creciente en el citosol de células de plantas de una chaperona similar a DnaJ proporciona a las plantas cultivadas bajo condiciones de presión, rendimiento aumentado y/o contenido aumentado de químicos finos con relación a las plantas de tipo silvestre correspondientes cultivadas bajo condiciones comparables.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Actualmente se ha descubierto que modular la expresión de un ácido nucleico que codifica un polipéptido POI como se define aquí, proporciona las plantas que tienen rasgos relacionados con el rendimiento aumentado bajo condiciones de presión, preferiblemente bajo condiciones de presiones ambientales abióticas, y/o condiciones sin presiones, en particular, el rendimiento aumentado con relación a las plantas de control y/o aumentos en el contenido de químicos finos .

De acuerdo con una modalidad, se proporcionan métodos para mejorar los rasgos relacionados con el rendimiento de plantas bajo condiciones de presión, preferiblemente bajo condiciones de presiones ambientales abióticas como se describen aquí y/o aumento en la producción de químicos finos en las plantas, con relación a las plantas de control, que comprende modular la expresión en las plantas de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de POI como se define aqui .

Por consiguiente, en una modalidad, la invención se refiere a un proceso para la producción de al menos una sustancia química fina seleccionada del grupo que consiste de: ácido linoléico, ácido linoléico, sacarosa y mio-inositol .

Los subtítulos y encabezamientos de sección en esta especificación, tienen propósitos de conveniencia y referencia solamente y no deben afectar de ningún modo el significado o la interpretación de esta especificación.

Definiciones Las siguientes definiciones se usarán en toda la presente especificación .

Polipéptido (s) /Proteina (s) Los términos "polipéptido" y "proteina" se usan de forma intercambiable en este documento y hacen referencia a aminoácidos en forma polimérica de cualquier longitud, enlazados por medio de enlaces peptidicos.

Polinucleótido (s) /Ácido (s) nucleico (s) / Secuencia (s) de Ácidos nucleicos/secuencia (s) de nucleótidos Los términos "polinucleótido (s) ", secuencia (s) de ácidos nucleicos", "secuencia (s) de nucleótidos, "ácido (s) nucleico (s), "moléculas de ácido (s) nucleico (s)" se usan de forma intercambiable en este documento para hacer referencia a nucleótidos, ya sean ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos o una combinación de ambos, en una forma polimérica, no ramificada, de cualquier longitud.

Homólogo (s) Los "homólogos" de una proteina abarcan péptidos, oligopéptidos , polipéptidos, proteínas y enzimas que tengan sustituciones, eliminaciones y/o inserciones de aminoácidos, con relación a la proteína no modificada en cuestión y que tengan actividad biología y funcional similar que la proteína no modificada de la cual se derivan.

Una eliminación se refiere a la remoción de uno o más aminoácidos de una proteína.

Una inserción se refiere a uno o más residuos de aminoácidos que se introducen en un sitio predeterminado en una proteína. Las inserciones pueden comprender fusiones de la N-terminal y/o la C-terminal así como inserciones intra-secuencias de uno solo o múltiples aminoácidos. Por lo general, las inserciones dentro de la secuencia de aminoácidos serán más pequeñas que las fusiones de la N-terminal o C-terminal, del orden de aproximadamente 1 a 10 residuos. Los ejemplos de proteínas o péptidos de fusión de la N- o la C-terminal incluyen el dominio de enlace o el dominio de activación de un activador de la transcripción como se usa en el sistema de dos híbridos de levadura, proteínas de revestimiento de fagos (histidina) -6-etiqueta, glutatión S-transferasa-etiqueta, proteina A, proteína de enlace a maltosa, dihidrofolato reductasa, epítopo de Etiqueta»100, epítopo de c-myc, FLAG®-epítopo, lacZ, C P (péptido de enlace a calmodulina) , epítopo HA, epítopo de proteína C y epítopo de VSV.

Una sustitución se refiere al reemplazo de aminoácidos de la proteína con otros aminoácidos que tengan propiedades similares (tales como hidrofobicidad, hidrofilicidad, antigenicidad, propensión a formar o romper estructuras de hélice a o lámina beta) . Las sustituciones de aminoácidos típicamente son de residuos individuales, pero pueden ser en grupos, dependiendo de las restricciones funcionales colocadas sobre el polipéptido y pueden variar de 1 a 10 aminoácidos; las inserciones usualmente pueden ser del orden de aproximadamente 1 a 10 residuos de aminoácidos. Las sustituciones de aminoácidos preferiblemente son sustituciones de aminoácidos conservativas. Las tablas de sustituciones conservativas son bien conocidas en la técnica (véase, por ejemplo Creighton (1984) Proteins. W. H. Freeman and Company (Eds) y la Tabla 1 siguiente) .

Tabla 1: Ejemplos de sustituciones conservadas de aminoácidos Las sustituciones, eliminaciones y/o inserciones de aminoácidos se pueden hacer fácilmente usando técnicas sintéticas de péptidos bien conocidas en la técnica tales como síntesis de péptidos en fase solida y las similares, o mediante manipulación de ADN recombinante. Los métodos para la manipulación de secuencias de ADN para producir variantes de una proteína por sustitución, inserción o eliminación son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, las técnicas para hacer mutaciones de sustitución en sitios predeterminados en el ADN son bien conocidas por aquellas personas experimentadas en la técnica e incluyen mutagénesis M13, Gen T7 en mutagénesis in vitro (USB, Cleveland, OH) , mutagénesis Dirigida al Sitio Quickchange (Stratagene, San Diego, CA) , mutagénesis dirigida al sitio mediada por PCR u otros protocolos de mutagénesis dirigida al sitio.

Derivados Los "derivados" incluyen péptidos, oligopéptidos , r polipéptidos los cuales pueden, en comparación con la secuencia de aminoácidos de la forma de origen natural de la proteina, tal como la proteina de interés, comprender sustituciones de aminoácidos con residuos que de aminoácidos que no son de formación natural, o adiciones de residuos de aminoácidos que no son de formación natural. Los "derivados" de una proteina también abracan péptidos, oligopéptidos, polipéptidos los cuales comprenden residuos de aminoácidos de formación natural, alterados (glicosilados, acilados, prenilados, fosforilados , miristoilados , sulfatados, etc.) o que no son de formación natural, alterados, en comparación con la secuencia aminoácidos de una forma de formación natural del polipéptido. Un derivado también puede comprender uno o más sustituyentes o adiciones que no sean de aminoácidos, en comparación con la secuencia de aminoácidos de la cual se derivan, por ejemplo, moléculas reporteras u otros ligandos, enlazados covalentemente o no covalentemente a la secuencia de aminoácidos, como por ejemplo moléculas reporteras las cuales se enlazan para facilitar su detección, y residuos de aminoácidos que no son de formación natural con relación a la secuencia de aminoácidos de una proteína de formación natural. Además, los "derivados" también incluyen fusiones de la forma de formación natural de la proteína con péptidos de etiquetado tales como FLAG, HIS6 o tioredoxina (para un repaso de los péptidos de etiquetado, véase Terpe, Appl. Microbiol, Biotechnol. 60, 523-533, 2003).

Ortólogo (s) /Parálogo (s) Los ortólogos y los parálogos abarcan conceptos evolutivos usados para describir las relaciones ancestrales de los genes. Los parálogos son genes dentro de la misma especie, que se originan a través de la duplicación de un gen ancestral; los ortólogos son genes de organismos diferentes que se han originado a través de la especialización, y también se derivan de un gen ancestral común.

Dominio, Motivo/Secuencia Consenso/Firma El término "dominio" se refiere a un conjunto de aminoácidos conservados en posiciones específicas a lo largo una alineación de secuencias de proteínas relacionadas evolutivamente. En tanto que los aminoácidos en otras posiciones pueden variar entre los homólogos, los aminoácidos que están altamente conservados en posiciones específicas, indican aminoácidos que probablemente son esenciales en la estructura, la estabilidad o la función de una proteína. Identificados por su alto grado de conservación en secuencias alineadas de una familia de homólogos de proteínas, estos pueden ser usados como identificadores para determinar si algún polipéptido en cuestión pertenece a una familia de polipéptidos identificada previamente.

El término "motivo" o "secuencia consenso" o "firma" se refiere a una región conservada, corta, en la secuencia de proteínas relacionadas evolutivamente. Los motivos frecuentemente son partes altamente conservadas de dominios, pero también pueden incluir solo parte del dominio, o se localizan fuera del dominio conservado (si todos los aminoácidos del motivo están fuera de un dominio común) .

Existen bases de datos especializadas para la identificación de dominios, por ejemplo, SMART (Schultz, et al., (1989) Proc Nati. Acad. Sci . EUA 95, 5857-5864; Letunic et al., (2002) Nucleic Acids Res 30, 242, 244), InterPro (Mulder et al., (2003) Nucí. Acids. Res 31, 315-318), Prosite (Bucher y Bairoch (1994), A generalized profile syntax for biomolecular sequences motifs and its function in automatic sequence interpretation . (En) IS B-94; Proceedings 2nd International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology. Altman R., Brutlag D., Karp P., Lathrop R., Searls D., Eds., pp 53-61, AAAI Press, Menlo Park; Hulo et al., Nucí. · Acids. Res. 32 : D134-D137 , (2004)), o Pfam (Bateman et al., Nucleic Acids Research 30(1) : 276-280 (2002) y The Pfam protein families datábase: R.D. Finn, J. Mistry J. Tate, 0 Coggill, A. Heger, J.E. Pollington, O.L. Gavin, P. Gunesekaran, G. Ceric, K. Forslund, L. Holm, E. L. Sonnhameer, S. R. Eddy, A. Bateman Nucleic Acids Research (2010) Datábase Issue 38 : D211-222 ) . Un conjunto de herramientas para el análisis in silico de secuencias de proteínas está disponible en el servidor de ExPASy proteomics (Swiss Institute of Bioinformatics (Gasteiger et al., ExPASy: the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis, Nucleic Acids Res. 31:3784-3788(2003)) . Los Dominios o motivos también pueden ser identificados usando las técnicas de rutina, por ejemplo mediante alineación de secuencias.

Los métodos para la alineación de las secuencias para la comparación son bien conocidas en la técnica, tales métodos incluyen GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA y T ASTA . GAP usa el algoritmo de Needleman y Wunsch ((1970) J Mol Biol 48: 443-453) para encontrar la alineación global (es decir, que abarca las secuencias completas) de dos secuencias, que maximiza el número de correspondencias y minimiza el número de huecos. El algoritmo BLAST (Altschul et al., (1990) J Mol Biol 215: 403- 10) calcula la identidad porcentual de la secuencia y lleva a cabo un análisis estadístico de la similitud entre las dos secuencias. El programa informático para llevar a cabo el análisis BLAST está disponible públicamente a través del National Centre for Biotechnology Information (NCBI) . Los homólogos pueden ser identificados fácilmente usando, por ejemplo, el algoritmo de alineación de múltiples secuencias Clustal (versión 1.83), con los parámetros de alineación por pares, por defecto, y un método de puntaje en porcentaje. Los porcentajes globales de la similitud y la identidad también pueden ser determinados usando uno de los métodos disponibles en el paquete informático MatGAT (Campanella et al., BMC Bioinformatics . 2003 Jul 10; 4: 29. MatGAT: una aplicación que genera matrices de similitud/identidad usando secuencias de proteínas o de ADN) . Se puede llevar a cabo una edición manual pequeña para optimizar la alineación entre los motivos conservados, como sería aparente para las personas experimentadas en la técnica. Además, en lugar de usar secuencias de longitud completa para la identificación de los homólogos, también se pueden usar dominios específicos. Los valores de identidad de la secuencia pueden ser determinados sobre el ácido nucleico o las secuencias de aminoácidos completas o sobre dominios seleccionados o motivos conservados, usando los programas mencionados anteriormente usando los parámetros por defecto. Para las alineaciones locales, el algoritmo de Smith-Waterman es particularmente útil (Smith TF, Waterman MS (1981) J. Mol. Biol 147(1); 195- 7) .

BLAST Reciproco Típicamente, este involucra un primer BLAST que involucra la aplicación del BLAST a una secuencia problema (por ejemplo, usando cualquiera de las secuencias listadas en la Tabla A de la sección de Ejemplos) contra cualquier base de datos de secuencias, tal como la base de datos NCBI disponible públicamente. BLASTN o TBLASTX (usando los valores estándar por defecto) se usan por lo general cuando se inicia desde una secuencia de nucleótidos, y BLASTP o TBLASTN (usando los valores estándar por defecto) cuando se inicia desde una secuencia de proteina. Los resultados del algoritmo BLAST pueden ser filtrados opcionalmente . Las secuencias de longitud completa ya sea de los resultados filtrados o de los resultados no filtrados, se someten entonces de nuevo al algoritmo BLAST (segundo BLAST) contra las secuencias del organismo del cual se deriva la secuencia problema. Los resultados del primero y el segundo BLASTs se comparan entonces. Un parálogo se identifica si una correspondencia de alto rango es de la misma especie que aquella de la cual se deriva la secuencia problema, un nuevo BLAST resulta entonces idealmente en la secuencia problema, entre las correspondencias más altas; un ortólogo se identifica si una correspondencia de alto rango en el primer BLAST no es de la misma especie de la cual se deriva la secuencia problema, y preferiblemente resulta del nuevo BLAST en la secuencia problema que está entre las correspondencias más altas.

Las correspondencias de alto nivel son aquellas que tienen un valor E bajo. Mientras más bajo sea el valor E, más significativo será el puntaje (o en otras palabras menor será la probabilidad de que la correspondencia fuese encontrada de forma casual. El cálculo del valor E es bien conocido en la técnica. Además de los valores E, también se puntúan por la identidad porcentual. La identidad porcentual se refiere al número de nucleótidos (o aminoácidos) idénticos entre las dos secuencias de ácidos nucleicos (o polipéptidos ) comparados sobre un segmento particular. En el caso de las familias grandes, ClustalW puede ser usado, seguido por un árbol de vinculación de vecinos, para ayudar a visualizar la agrupación de genes relacionados y para identificar los ortólogos y los parálogos .

Hibridación El término "hibridación" como se define aquí, es un proceso en donde las secuencias de nucleótidos complementarias, sustancialmente homologas, se hibridan entre si. El proceso de hibridación puede ocurrir completamente en solución, es decir, ambos ácidos nucleicos complementarios están en solución. El proceso de hibridación también puede ocurrir con uno de los ácidos nucleicos complementarios inmovilizados sobre una matriz, como por ejemplo perlas magnéticas, perlas de Sefarosa o cualquier otra resina. El proceso de hibridación puede ocurrir además, con uno de los ácidos nucleicos complementarios inmovilizado sobre un soporte solido, tal como una membrana de nitrocelulosa o de nylon o inmovilizado mediante, por ejemplo, fotolitografía sobre, por ejemplo, un soporte de vidrio silíceo (este último conocido como arreglos o microarreglos de ácidos nucleicos o como circuitos integrados de ácidos nucleicos) . Con el fin de permitir que ocurra la hibridación, las moléculas del ácido nucleico por lo general se someten a desnaturalización por medios térmicos o químicos para fundir una hebra doble en dos hebras simples y/o remover las horquillas u otras estructuras secundarias de los ácidos nucleicos de hebra sencilla.

El término "rigor" se refiere a las condiciones bajo las cuales tiene lugar una hibridación. El rigor de la hibridación está influenciado por las condiciones tales como la temperatura, la concentración salina, la fuerza iónica y la composición del amortiguador de hibridación. Por lo general, las condiciones poco rigurosas se seleccionan para ser de aproximadamente 30°C menores que el punto de fusión térmica (Tm) para la secuencia específica a una fuerza iónica y pH definidos. Las condiciones de rigor medio son cuando la temperatura es 20°C menor que la Tm, y las condiciones de rigor alto son cuando la temperatura es 10°C menor a Tm. Las condiciones de hibridación en rigor alto se usan típicamente para aislar secuencias de hibridación que tienen similitud alta de la secuencia. Sin embargo, los ácidos nucleicos se pueden desviar en su secuencia y aún codificar un polipéptido sustancialmente idéntico, debido a la degeneración del código genético. Por lo tanto, las condiciones de hibridación en rigor medio pueden ser necesarias algunas veces para identificar tales moléculas de ácido nucleico.

La Tm es la temperatura bajo la fuerza iónica y el pH definidos, a la cual el 50% de la secuencia objetivo se híbrida con una sonda perfectamente acoplada. La Tra depende de las condiciones de la solución y de la composición base y la extensión de la sonda. Por ejemplo, las secuencias más largas se hibridan de forma especifica a altas temperaturas. La tasa de hibridación máxima se obtiene desde aproximadamente 16°C hasta 32°C por debajo de la Tm. La presencia de cationes monovalentes en la solución de hibridación, reduce la repulsión electrostática entre las dos hebras del ácido nucleico, promoviendo por ello la formación de híbridos; este efecto es visible para ' concentraciones de sodio de hasta 0.4M (para concentraciones mayores, este efecto puede ser ignorado) . La formamida reduce la temperatura de fusión de los dúplex de ADN-ADN y ADN-ARN con 0.6 a 0.7°C por cada porcentaje de formamida, y la adición de 50% de formamida permite que la hibridación se lleve a cabo a una temperatura de 30 a 45°C, aunque la tasa de hibridación se reducirá. Los pares de bases no apareados reducen la tasa de hibridación y la estabilidad térmica de los dúplex. En promedio y para las sondas grandes, la Tm se reduce aproximadamente 1°C por % de bases no apareadas. La Tm puede ser calculada usando las siguientes ecuaciones, dependiendo de lo tipos de híbridos: 1) híbrido de ADN-ADN (Meinkoth y Wahl, Anal. Biochem. 138: 167-284, 1984) : Tm=81.5°C + 16.6xlogi0[Na+] + 0.41x% [G/Cb] -500x [Lc] _1-0.61x%formamida 2) híbridos de ADN-ARN o ARN-ARN: Tm=79.8°C+18.5 (logio [Na+] a) +0.58 (%G/Cb) +11.8 (%G/Cb) 2-820/Lc 3) híbridos de oligo-ADN u oligo-ARNd: Para <20 nucleótidos: Tm=2(ln) Para 20-35 nucleótidos: Tm=22+1.46 ( ln) a o para otros catones monovalentes, pero solo es precisa en el rango de 0.01-0.4 M es precisa solo para %GC en el rango de 30% a 75%. c L=longitud del dúplex en pares de bases. d Oligo, oligonucleótido; ln= longitud efectiva del cebador=2x (no. de G/C)+(no. de A/T) .

El enlazamiento no específico puede ser controlado usando cualquiera de un número de técnicas conocidas tales como, por ejemplo, bloqueo de la membrana con soluciones que contengan proteína, adición de ARN, ADN, y SDS meteorólogos al amortiguador de hibridación, y tratamiento con Rnasa. Para las sondas no homologas, se puede llevar a cabo una serie de hibridaciones al variar uno de (i) reducir progresivamente la temperatura de hibridación (por ejemplo de 68°C a 42°C) o (ii) reducir progresivamente la concentración de formamida (por ejemplo de 50% a 0%) . Los técnicos experimentados tienen conocimiento de varios parámetros los cuales pueden ser alterados durante la hibridación y los cuales, ya sea mantendrán o cambiaran las condiciones del rigor.

Además, las condiciones de la hibridación, la especificidad de la hibridación típicamente también dependen de la función de los lavados post-hibridación . Para remover el trasfondo que resulta de la hibridación no específica, la muestras se lavan von soluciones salinas diluidas. Los factores críticos de tales lavados incluyen la fuerza iónica y la temperatura de la solución de lavado final: mientras menor sea la concentración salina y más alta la temperatura de lavado, mayor será el rigor de lavado. Las condiciones de lavado se desarrollan típicamente al mismo o a menor rigor de hibridación. Una hibridación positiva proporciona una señal que es al menos el doble del trasfondo. Por lo general las condiciones de rigor adecuadas para los ensayos de hibridación de ácidos nucleicos o los procedimientos de detección de la amplificación de genes son como se establecen anteriormente. Se pueden seleccionar condiciones más o menos rigurosas. Personas experimentadas en la técnica tendrán conocimiento de varios parámetros los cuales pueden ser alterados durante el lavado y los cuales mantendrán o bien cambiarán las condiciones del rigor.

Por ejemplo, las condiciones de hibridación de alto rigor típicas para híbridos de ADN mayores a 50 nucleótidos abarcan la hibridación a 65°C en Ix SSC o a 42°C en lx SSC y 50% de formamida, seguido por lavado a 65°C en 0.3x SSC. Lo ejemplos de condiciones de hibridación de rigor medio para híbridos de ADN mayores a 50 nucleótidos abarcan hibridación a 50°C en 4x SSC o a 40°C en 6x SSC y 50% de formamida, seguido por lavado a 50°C en 2x SSC. La longitud de los híbridos es la longitud anticipada para los ácidos nucleicos para la hibridación. Cuando se hibridan ácidos nucleicos de secuencia conocida, la longitud de los híbridos puede ser determinada alineando las secuencias e identificando las regiones conservadas descritas aquí. lxSSC es NaCl 0.15M y citrato de sodio 15mM; la solución de hibridación y las soluciones de lavado pueden incluir adicionalmente 5x reactivo de Denhardt, 0.5-1.0% de SDS, 100 g/ml de ADN de esperma de salmón fragmentado, desnaturalizado, 0.5% de pirofosfato de sodio.

Con el propósito de definir el nivel de rigor, se puede hacer referencia a Sambrook et al., (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3ra Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, Nueva York o a Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989 y las actualizaciones anuales) . ^ Variante de empalme El término "variante de empalme" como se usa aquí, abarca las variantes de una secuencia de ácido nucleico en las cuales, los intrones y/o los exones seleccionados han sido cortados, reemplazados, desplazados o agregados, o en las cuales, los intrones han sido acortados o alargados. Tales variantes serán aquellas en las cuales, la actividad biológica de la proteina se retiene sustancialmente ; esto puede ser logrado al retener selectivamente los segmentos funcionales de la proteina. Tales variantes de empalme pueden ser encontradas en la naturaleza o pueden ser construidas por el hombre. Los métodos para pronosticar y aislar tales variantes de empalme son bien conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, Foissac y Schiex (2005) BMC Bioinformatics 6: 25) .

Variante alélica Los alelos o variantes alélicas son formas alternativas de un gen dado, localizadas en la misma posición cromosómica. Las variantes alélicas abarcan Polimorfismos de Nucleótido Único (SNPs) , asi como Polimorfismos Pequeños de Inserción/Eliminación (INDELs) . El tamaño de los INDELs usualmente es menor a 100 bp. Los SNPs y los INDELs forman el conjunto más grande de variantes de la secuencia en las cepas polimórficas de origen natural de las mayoría de los organismos .

Gen endógeno La referencia en este documento a un gen "endógeno" no solo se refiere al gen en cuestión como se encuentra en las plantas en su forma natural (es decir, son que haya ninguna intervención humana) , sino también se refiere a ese mismo gen (o un ácido nucleico/gen sustancialmente homólogo) en una forma aislada ( re ) introducida posteriormente en las plantas (un transgen) . Por ejemplo, las plantas transgénicas que contiene un transgen pueden encontrar una reducción sustancial de la expresión del transgen y/o una reducción sustancial de la expresión del gen endógeno. El gen aislado puede ser aislado de un organismo o puede ser construido por el hombre, por ejemplo, mediante síntesis química.

Barajado de genes/Evolución dirigida El barajado de genes o la evolución dirigida consiste de iteraciones de barajado de ADN seguidas por la detección y/o selección adecuadas para generar variantes de ácidos nucleicos o de porciones de los mismos que codifican las proteínas que tienen una actividad biológica modificada (Castle et al., (2004) Science 304(5674): 1151-4; Patentes Norteamericanas 5,811,238 y 6395, 547) .

Constructos Los elementos reguladores adicionales pueden incluir mejoradores de la transcripción así como de la traducción. Aquellas personas experimentadas en la técnica tendrán conocimiento de las secuencias terminadoras y mej oradoras que pueden ser adecuadas para ser usadas en la realización de la invención. Una secuencia intronica también puede ser agregada a la región 5' no traducida (UTR) o en la secuencia codificante, para aumentar la cantidad del mensaje maduro que se acumula en el citosol, como se describe en la sección de definiciones. Otras secuencias de control (además del promotor, el mejorador, el silenciador, las secuencias intronicas, las regiones 3'UTR y/o 5'UTR) pueden ser proteínas y/o elementos de estabilización de ARN. Tales secuencias serian conocidas o pueden ser obtenidas fácilmente por las personas experimentadas en la técnica.

Los constructos genéticos de la invención pueden incluir además una secuencia de origen de la replicacion que se requiere para el mantenimiento y/o la replicacion en un tipo especifico de células. Un ejemplo es cuando se requiere que un constructo genético sea mantenido en células bacterianas como un elemento genético episómico (por ejemplo, moléculas de plásmido o de cósmido) . Los orígenes de replicacion preferidos incluyen, pero no se limitan a, el fl-or y coIEl.

Para la detección de la transferencia exitosa de las secuencias de ácidos nucleicos como se usan en los métodos de la invención y/o la selección de plantas transgénicas que comprenden estos ácidos nucleicos, es ventajoso usar genes marcadores (o genes reporteros) . Por lo tanto, los constructos genéticos pueden comprender opcionalmente un gen marcador seleccionable . Los marcadores seleccionables se describen con más detalle en la sección de "definiciones" de este documento. Los genes marcadores pueden ser eliminados o cortados de las células transgénicas una vez que estos ya no son necesarios. Las técnicas para la eliminación de marcadores son bien conocidas en la técnica, las técnicas útiles se describen anteriormente en la sección de definiciones.

Elementos Reguladores/Secuencias de Control/Promotores Los términos "elemento de control", "secuencia reguladora" y "promotor" se usan de forma intercambiable en este documento y se deben tomar en un contexto amplio para hacer referencia a las secuencias de ácidos nucleicos reguladores capaces de afectar la expresión de las secuencias a las cuales estas se ligan. El término "promotor" se refiere típicamente a una secuencia de control de ácido nucleico localizada corriente arriba desde el inicio de la transcripción de un gen y la cual está involucrada en el reconocimiento y el enlace de la ARN polimerasa y otras proteínas, dirigiendo por ello la transcripción de un ácido nucleico enlazado operativamente. Abarcadas por los términos mencionados anteriormente están las secuencias reguladoras derivadas de un gen genómico eucariota, clásico (que incluye la caja TATA la cual se requiere para el inicio exacto de la transcripción, con o sin una secuencia de caja CCAAT) y los elementos reguladores adicionales (es decir, las secuencias de activación corriente arriba, mejoradores y silenciadores) los cuales alteran la expresión de los genes en respuesta a estímulos del desarrollo y externos, o en una manera específica del tejido. También se incluyen dentro del término una secuencia reguladora de la transcripción de un gen procariota clásico, en cuyo caso, esta puede incluir la secuencia de 35 cajas y secuencias reguladoras de la transcripción de 10 cajas. El término "elemento regulador" también abarca las moléculas o derivados de fusión sintéticos que confieren, activan o aumentan la expresión de las moléculas de ácido nucleico en las células, tejidos u órganos.

Un "promotor vegetal" comprende elementos reguladores, los cuales intervienen en la expresión de un segmento de la secuencia codificante en las células de plantas. Por consiguiente, un promotor vegetal no necesita ser de origen vegetal, sino que se puede originar de virus o microorganismos, por ejemplo, de virus, los cuales atacan las células de plantas. El "promotor vegetal" también se puede originar de células de plantas, por ejemplo, de las plantas las cuales se transforman con la secuencia de ácido nucleico a ser expresada en el proceso inventivo como se describe aquí. Esto también se aplica a otras señales de regulación "vegetales", tales como los terminadores "vegetales". Los promotores en la dirección 5' de las secuencias de nucleótidos útiles en los métodos de la presente invención pueden ser modificados mediante una o más sustituciones, inserciones y/o eliminaciones sin interferir con la funcionalidad o la actividad de cualquiera de los promotores, el marco de lectura abierto (ORF) o la región reguladora 3' tal como los terminadores y otras regiones reguladoras 3' las cuales se ubican lejos del ORF. Además es posible que la actividad de los promotores sea aumentada por la modificación de su secuencia, o que esta sea reemplazada completamente por promotores más activos, inclusive promotores de organismos meteorólogos. Para la expresión en plantas, las moléculas de ácido nucleico deben, como se describe anteriormente, estar enlazadas operativamente con, o comprender un promotor adecuado el cual expresa el gen en el punto de tiempo justo y con el patrón de expresión espacial requerido.

Para la identificación de promotores equivalentes funcionalmente, la fuerza del promotor y/o el patrón de expresión de un promotor candidato puede ser analizado, por ejemplo, enlazando operativamente el promotor con un gen reportero y estudiando el nivel y el patrón de expresión del gen reportero en varios tejidos de las plantas. Los genes reporteros bien conocidos, adecuados, incluyen, por ejemplo, beta-glucuronidasa o beta-galactosidasa . La actividad del promotor se estudia midiendo la actividad enzimática de la beta-glucuronidasa o la beta-galactosidasa. La fuerza del promotor y/o el patrón de expresión pueden ser comparados entonces con aquellos de un promotor de referencia (tal como aquel usado en los métodos de la presente invención) . Alternativamente la fuerza del promotor puede ser estudiada cuantificando los niveles de ARNm o comparando los niveles de ARNm del ácido nucleico usado en los métodos de la presente invención, con los niveles de ARNm de los genes constitutivos tales como 18S rRNA, usando métodos conocidos en la técnica, tales como la transferencia Wéstern con análisis densitométrico de autoradiogramas, PCR cuantitativa en tiempo real o RT-PCR (Heid et al., 1996 Genome Methods 6: 986-994). Por lo general, "promotor débil" significa un promotor que dirige la expresión de una secuencia codificante a bajo nivel. Por "bajo nivel" se quiere decir a niveles de aproximadamente 1/10,000 transcriptor a aproximadamente 1/100,000 transcriptor, a aproximadamente 1/500,0000 transcriptor por célula. Por el contrario un "promotor fuerte" dirige la expresión de una secuencia codificante a alto nivel, o a aproximadamente 1/10 transcriptos a aproximadamente 1/100 transcriptos a aproximadamente 1/1000 transcriptos por célula. Por lo general, por "promotor de fuerza media" se quiere decir un promotor que dirige la expresión de una secuencia codificante a un nivel más bajo que un promotor fuerte, en particular a un nivel que es, en todos los casos, menor que el obtenido bajo el control de un promotor 35S CaMV.

Enlazado operativamente El término "enlazado operativamente" como se usa aquí, se refiere a un enlace funcional entre la secuencia promotora y el gen de interés, de modo tal que la secuencia promotora sea capaz de iniciar la transcripción del gen de interés.

Promotor constitutivo Un "promotor constitutivo" se refiere a un promotor que es activo con respecto a la transcripción durante la mayor parte, pero no necesariamente todas, las fases de crecimiento y desarrollo y bajo la mayoría de las condiciones ambientales, en al menos un tipo de células, tejido y órgano. La Tabla 2a siguiente proporciona ejemplos de los promotores constitutivos Tabla 2: Ejemplos de promotores constitutivos Promotor ubicuo Un promotor ubicuo está activo en sustancialmente todos los tejidos o células de un organismo.

Promotor regulado por el desarrollo Un promotor regulado por el desarrollo está activo durante ciertas etapas del desarrollo o en partes de las plantas que experimentan cambios en el desarrollo.

Promotor inducible Un promotor inducible tiene un inicio de la transcripción inducido o aumentado en repuesta a estimulo químico (para un repaso véase Gatz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48:89-108), ambiental o físico, o puede ser "inducible por presiones", es decir, activado cuando las plantas se exponen a varias condiciones de presión, o "inducible por patógenos", es decir, activado cuando las plantas se exponen a varios patógenos.

Promotor específico del órgano/Específico del tejido Un promotor específico del tejido o específico del tejido es aquel que es capaz de iniciar preferiblemente la transcripción en ciertos órganos o tejidos, tales como la hojas, las rices, las semillas, etc. Por ejemplo, un "promotor específico de las raíces" es un promotor que está activo con relación a la transcripción predominantemente en las raíces de las plantas, sustancialmente para la exclusión de otras cualquiera de las partes de las plantas, en tanto que aun permite alguna expresión escasa en estas otras partes de las plantas. Los promotores capaces de iniciar la transcripción solamente en ciertas células se conocen aquí como "específicos de las células".

Los ejemplos de promotores especifico de la raíz se listan en la Tabla 2b siguiente: Tabla 2b: Ejemplos de promotores específicos de la raíz Un promotor especifico de las semillas está activo con respecto a la transcripción predominantemente en los tejidos de las semillas, pero no necesariamente de forma exclusiva en los tejidos de las semillas (en los caso de expresión escasa) . Los promotores específicos pueden estar activos durante el desarrollo de las semillas y/o durante la germinación. Los promotores específicos de las semillas pueden ser específicos del endospermo/aleurona/embrión. Los ejemplos de promotores específicos de las semillas (específicos del endospermo/aleurona/embrión) se muestran en la Tabla 2c a la Tabla 2f siguientes. Otros ejemplos de promotores específicos de las semillas se proporcionan en Qing Qu y Takaiwa (Plant Biotechnol. J. 2, 113-125, 2004), la descripción de la cual se incorpora aquí como referencia, como si estuvieran completamente descritos en el presente documento.

Tabla 2c: Ejemplos de promotores específicos de las semillas Tabla 2d: Ejemplos de promotores específicos del endospermo Un promotor especifico de los tejidos verdes como se define aquí, es un promotor que está activo con relación a la transcripción, predominantemente en los tejidos verdes, sustancialmente con la exclusión de cualquier otra de las partes las plantas, en tanto que permite aun la expresión escasa en estas otras partes de las plantas.

Los ejemplos de los promotores específicos de los tejidos verdes los cuales pueden ser usados para realizar los métodos de la invención, se muestran en la Tabla 2g siguiente.

Tabla 2g: Ejemplos de promotores específicos de los tejidos verdes Otro ejemplo de un promotor específico del tejido es el promotor específico del meristemo, el cual está activo con relación a la transcripción predominantemente en el tejido meristemático, sustancialmente con la exclusión con cualquiera de las otras partes de las plantas, en tanto que permite aún alguna expresión escasa en estas otras partes de las plantas. Los ejemplos de los promotores específicos del meristemo verde los cuales pueden ser usados para realizar los métodos de la invención, se muestran en la Tabla 2h siguiente.

Tabla 2h: Ejemplos de promotores específicos del meristemo Terminador El término "terminados" abarca las secuencias de control las cales son secuencias de ADN al final de una unidad de transcripción la cual indica el procesamiento en la dirección 3 ' y la poliadenilación de un transcripto primario y la terminación de la transcripción. Los terminadores pueden ser derivados del gen natural de una variedad de otros genes de plantas, o de ADN-T. El terminador a ser agregado puede ser derivado de, por ejemplo, los genes de nopalina sintasa u octopina sintasa, o alternativamente de otros genes de plantas, o menos preferiblemente de cualquier otro gen eucariota .

Marcador (gen) seleccionable/Gen reportero "Marcador seleccionable", gen marcador seleccionable", o "gen reportero" incluye todos los genes que confieren un fenotipo a las células en las cuales estos se expresan, para facilitar la identificación y/o la selección de células que son transíectadas o transformadas con un constructo de ácido nucleico de la invención. Estos genes marcadores permiten la identificación de una transferencia exitosa de las moléculas de ácido nucleico vía una serie de principios diferentes. Los marcadores adecuados pueden ser seleccionados de entre marcadores que confieren resistencia a antibióticos o herbicidas, que introducen un nuevo rasgo metabólico o que permiten su selección visual. Los ejemplos de los genes marcadores seleccionables incluyen genes que confieren resistencia a antibióticos (tales como NptII que fosforila la neomicina y la kanamicina, o hpt, que fosforila la higromicina, o genes que confieren resistencia a, por ejemplo, la bleomicina, estreptomicina, tetraciclina, cloranfenicol, ampicilina, gentamicina, geneticina (G418), espectinomicina o blasticidina) , a herbicidas (por ejemplo bar, el cual proporciona resistencia a Basta®; aroA o gox que proporcionan resistencia contra el glifosato, o los genes que confieren resistencia a, por ejemplo, imidazolinona, fosfinotricina o sulfonilurea) , o genes que proporcionan un rasgo metabólico (tal como manA que permite que las plantas usen la mañosa como la única fuente de carbono o la xilosa isomerasa para la utilización de la xilosa, o marcadores anti nutritivos tales como la resistencia a la 2-desoxiglucosa) . La expresión de los genes marcadores visuales resulta en la formación de colores (por ejemplo, ß-glucuronidasa, GUS o ß-galactosidasa con sus sustratos coloreados, por ejemplo, X-Gal) , luminiscencia (tal como el sistema luciferina/luceferasa) o fluorescencia (Proteina Fluorescente Verde, GFP, y derivados de la misma) . Esta lista representa solo un pequeño número de marcadores posibles. Los operarios experimentados estarán familiarizados con tales marcadores. Se prefieren diferentes arcadores, dependiendo del organismo y el método de selección.

Se sabe que tras la integración estable o transitoria de los ácidos nucleicos en células de plantas, solo una minoría de las células asimila el ADN extraño y, si se desea, lo integra en su genoma, dependiendo del vector de expresión usado y de la técnica de transfección usada. Para identificar y seleccionar estos integrantes, un gen que codifica un marcador seleccionable (tal como aquellos descritos anteriormente) se introducen usualmente en las células hospederas junto con el gen de interés. Estos marcadores pueden ser usados por ejemplo en mutantes en los cuales estos genes no son funcionales, por ejemplo, mediante eliminación por los métodos convencionales. Además, las moléculas de ácido nucleico que codifican un marcador seleccionable pueden ser introducidos en células hospederas en el mimo vector que comprende la secuencia que codifica los polipéptidos de la invención o usados en los métodos de la invención, o sino en un vector separado. Las células las cuales han sido transíectadas de forma estable con el ácido nucleico introducido pueden ser identificadas, por ejemplo, mediante selección (por ejemplo, las células las cuales tienen integrado el marcador seleccionable sobreviven, en tanto que las otras células mueren) .

Ya que los genes marcadores, en particular los genes para resistencia antibióticos y herbicidas, ya no se requieren o no se desean en las células hospederas transgénicas una vez que los ácidos nucleicos han sido introducidos exitosamente, el proceso de acuerdo con la invención para introducir los ácidos nucleicos, emplea ventajosamente las técnicas las cuales permiten la eliminación o la escisión de estos genes marcadores. Uno de tales métodos es el que se conoce como co-transformación . El método de co-transformación emplea dos vectores simultáneamente para la transformación, un vector que contiene el ácido nucleico de acuerdo con la invención y un segundo que contiene el o los genes marcadores. Una gran proporción de los transformantes recibe o, en el caso de las plantas, comprenden (hasta 40% o más de los transformantes), ambos vectores. En el caso de la transformación con Agrobacterium, los transformantes usualmente reciben solo una parte del vector, es decir, la secuencia flanqueada por el ADN-T, el cual usualmente representa el cartucho de expresión.

Los genes marcadores pueden ser eliminados posteriormente de las plantas transformadas, llevando a cabo cruzas. En otro método, los genes marcadores integrados en un transposon, se usan para la transformación, junto con el ácido nucleico deseado (conocida como la tecnología de Ac/Ds) . Los transformantes pueden ser cruzados con una fuente de transposasa o los transformantes se transforman con un constructo de ácido nucleico que confiere la expresión de una transposasa, de forma transitoria o estable. En algunos casos (aproximadamente 10%), de los transposones salen del genoma de las células hospederas, una vez que ha tenido lugar la transformación de forma exitosa, y se pierden. En otros casos, los transposones salen a una ubicación diferente. En estos casos, el gen marcador puede ser eliminado llevando a cabo cruzas. En microbiología, se han desarrollarlo técnicas las cuales hacen posible, o facilitan, la detección de tales eventos. Un método ventajoso adicional se basa en lo que se conoce como sistemas recombinantes ; cuya ventaja es que se puede prescindir de la eliminación mediante cruzamiento. El sistema mejor conocido de este tupo es el que se conoce como el sistema Cre/Iox. Creí es una recombinasa que elimina las secuencias ubicadas entre las secuencias IoxP. Si el gen marcador se integra entre las secuencias IoxP. Este se elimina una vez que la transformación ha tenido lugar exitosamente, mediante la expresión de la recombinasa. Otros sistemas de recombinación son el sistema HIN/HIX, FLP/FRT y REP/STB (Tribble et al., J. Biol . Chem. , 275, 2000: 22255-22267; Velmurugan et al., J. Cell Biol., 149, 2000: 553-556). Es posible una integración especifica del sitio en el genoma de las plantas, de las secuencias de ácido nucleico de acurdo con la invención. Naturalmente, estos métodos también pueden ser aplicados a microorganismos tales como levaduras, hongos o bacterias .

Transgénico/Transgen/Recombinante Para los propósitos de la invención, "transgénico", "transgen" o "recombinante" significa, con respecto a, por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico, un cartucho de expresión, constructo genético o un vector que comprende la secuencia de ácido nucleico o un organismo transformado con las secuencias de ácido nucleico, los cartuchos de expresión o los vectores de acuerdo con la invención, todas estas construcciones se lleva a cabo mediante métodos recombinantes en los cuales (a) las secuencias de ácido nucleico que codifican las proteínas útiles en los métodos de la invención, o bien (b) la o las secuencias de control genético las cuales se enlazan operativamente con la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la invención, por ejemplo un promotor, o (c) a) y b) no están ubicados en su ambiente genético natural o han sido modificados mediante métodos recombinantes , siendo posible que. la modificación tome la forma de, por ejemplo, una sustitución, adición, eliminación, inversión o inserción de uno o más residuos de nucleótidos. Se entiende que, ambiente genético natural quiere decir el lugar genómico o cromosómico en la planta original o la presencia en la genoteca genómica. En el caso de una genoteca genómica, el ambiente genético natural de la secuencia de ácido nucleico preferiblemente se retiene, al menos en parte. El ambiente flanquea la secuencia de ácido nucleico al menos por un lado y tiene una longitud de la secuencia de al menos 50 bp, preferiblemente al menos 50 bp, en especial, preferiblemente al menos 1000 bp, más preferiblemente al menos 5000 bp . Un cartucho de expresión de origen natural - por ejemplo, la combinación de origen natural del promotor natural de las secuencias de ácido nucleico con la secuencia de ácido nucleico correspondiente que codifica un polipéptido útil en los métodos de la presente invención, como se define anteriormente - se vuelve un cartucho de expresión transgénico cuando este cartucho de expresión se modifica mediante métodos sintéticos ("artificiales") no naturales, tales como, por ejemplo, tratamiento mutagénico. Los métodos adecuados se describen por ejemplo, en US 5,565,350 o WO 00/15815.

Se entiende que una planta transgénica, para los propósitos de la invención, significa, como anteriormente, que los ácidos nucleicos usados en el método de la invención no están presentes en, o se originan del, genoma de dicha planta, o están presentes en el genoma de dicha planta pero no en su locus natural en el genoma de dicha planta, es posible que los ácidos nucleicos sean expresados de forma homologa o de forma heteróloga. Sin embargo, como se menciona, transgénico también significa que, mientras que los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención o usados en el método inventivo, están en su posición natural en el genoma de una planta, la secuencia ha sido modificada con respecto a la secuencias natural, y/o que las secuencias reguladoras de las secuencias naturales han sido modificadas. Preferiblemente se entiende que transgénico significa la expresión de los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención en un locus no natural en el genoma, es decir, tiene lugar la expresión homologa o, preferiblemente heteróloga de los ácidos nucleicos. Las plantas transgénicas preferidas se mencionan aquí.

Se notará además que, en el contexto de la presente invención, el término "ácido nucleico aislado" o "polipéptido aislado" pueden ser considerados en algunos casos como sinónimos de "ácido nucleico recombinante" o "polipéptido recombinante" , respectivamente y hace referencia a un ácido nucleico o polipéptido que no se localiza en si ambiente genético natural y/o que ha sido modificado mediante métodos recombinantes .

En una modalidad de la invención, una secuencia de ácido nucleico "aislado" se ubica en alrededores cromosómicos no nativos .

Modulación El término "modulación" significa, con relación a la expresión o la expresión genética, un proceso en el cual, el nivel de expresión se cambia por dicha expresión genética en comparación con las plantas de control, el nivel de expresión puede ser aumentado y reducido. La expresión original, no modulada, puede ser cualquier tipo de expresión de ARN (ARNr, ARNt) o ARNm estructural con la traducción posterior. Para los propósitos de esta invención, la expresión original no modulada también puede ser la ausencia de cualquier expresión. El término "modulación de la actividad" o el término "modulación de la expresión" significarán cualquier cambio de la expresión de las secuencias de ácido nucleico inventivas o las proteínas codificadas, la cual lleva a rendimiento aumentado y/o crecimiento aumentado de las plantas. La expresión puede aumentar desde cero (ausencia de, o expresión inconmensurable) a una ciertas cantidad, o se puede reducir de una cierta cantidad a cantidades pequeñas inconmensurables o cero .

Expresión El término "expresión" o "expresión genética" significa la transcripción de un gen especifico o de genes específicos o de constructos genéticos específicos. El término "expresión" o "expresión genética" significa en particular la transcripción de un gen o de genes o de constructos genéticos en ARN (ARNr, ARNt) o ARNm estructural con o sin la traducción posterior de este último en una proteína. El proceso incluye la transcripción del ADN y el procesamiento del producto de ARNm resultante .

Expresión alimentada/sobreexpresión El término "expresión aumentada" o "sobreexpresión" como se usa aquí, significa cualquier forma de expresión que sea adicional al nivel de expresión de tipo silvestre, original. Para los propósitos de esta invención, el nivel de expresión de tipo silvestre, original también podría ser cero, es decir, ausencia de la expresión o expresión inconmensurable.

Los métodos para aumentar la expresión de genes o productos genéticos están bien documentados en la técnica e incluyen, por ejemplo, la sobreexpresión dirigida por promotores apropiados, el uso de mej oradores de la transcripción o mejoradores de la traducción. Los ácidos nucleicos aislados los cuales sirven como elementos promotores o mejoradores, pueden ser introducidos en una posición apropiada (típicamente corriente arriba) de una forma no heteróloga de un polinucleótido para aumentar la expresión de un ácido nucleico que codifica el polipéptido de interés. Por ejemplo, los promotores endógenos pueden ser alterados in vivo mediante la mutación, eliminación y/o sustitución (véase, Kmiec, US 5,565,350; Zarling et al., W09322443) , o los promotores aislados pueden ser introducidos en células de plantas en la orientación apropiada, y la distancia desde un gen de la presente invención para controlar la expresión del gen .

Si se desea la expresión del polipéptido, por lo general es deseable incluir una región de poliadenilación en el extremo 3' de una región codificante del polinucleótido . La región de poliadenilación puede ser derivada del gen natural, de una variad de otros genes de plantas, o de ADN-T. La secuencia del extremo 3' a ser agregada puede ser derivada de, por ejemplo, de los genes de nopalina sintasa o de octopina sintasa, o alternativamente de otros genes de plantas, o menos preferiblemente de cualquier otro gen eucariota.

'Una secuencia intronica también puede ser agregada a la región 5' no traducida (UTR) o la secuencia codificante de la secuencia codificante parcial para aumentar la cantidad del mensaje maduro que se acumula en el citosol. Se ha demostrado que la inclusión del intrón que se puede empalmar, en la unidad de transcripción en constructos de expresión tanto de plantas y animales, aumenta la expresión genética en los niveles tanto de ARNm y de las proteínas hasta de 1000 veces (Buchman y Berg (1988) Mol. Cell Biol . 8: 4395-4405; Callis et al., (1987) Genes Dev 1:1183-1200). Tal mejoramiento intronico de la expresión genética típicamente es más grande cuando se coloca cerca del extremo 5' de la unidad de transcripción. El uso de los intrones de maíz, intrón Adhl-S, intrón 1, 2, y 6, intrón Bronce-1, se conoce en la técnica. Para información general véase: The Maize Handbook, Capítulo 116, Freeling y albot, Eds., Springer, N.Y. (1994).

Expresión disminuida La referencia aquí a la "expresión disminuida" o "reducción o eliminación sustancial" de la expresión se interpreta como una disminución en la expresión del gen endógeno y/o los niveles de polipéptido y/o la actividad del polipéptido con relación a las plantas de control. La reducción o eliminación sustancial es en orden creciente de preferencia al menos 10%, 20%, 30%, 40% o 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, o 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más reducida en comparación con aquella de las plantas de control.

Para la reducción o eliminación sustancial de la expresión de un gen endógeno en una planta, se requiere una suficiente longitud de nucleótidos -sustancialmente contiguos-de una secuencia de ácidos nucleicos. A fin de realizar el silenciamiento genético, ésta puede ser tan pequeña como 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10 o menos nucleótidos, alternativamente, ésta puede ser tanto como el gen entero (incluyendo la UTR 5' y/o 3', ya sea en parte o en su totalidad) . El tramo de nucleótidos sustancialmente contiguos se puede derivar a partir del ácido nucleico que codifica la proteina de interés (gen objetivo), o a partir de cualquier ácido nucleico capaz de codificar un ortólogo, parálogo u homólogo de la proteina de interés. Preferiblemente, el tramo de nucleótidos sustancialmente contiguos es capaz de formar enlaces de hidrógeno con el gen objetivo (ya sea hebra sentido o anti-sentido) , más preferiblemente, el tramo de nucleótidos sustancialmente contiguos tiene, en orden creciente de preferencia, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% de identidad de secuencia al gen objetivo (ya sea hebra sentido o anti-sen ido) . Una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido (funcional) no es un requerimiento para los diversos métodos aquí discutidos para la reducción o eliminación sustancial de la expresión de un gen endógeno.

Esta reducción o eliminación sustancial de la expresión se puede lograr utilizando técnicas y herramientas de rutina. Un método preferido para la reducción o eliminación sustancial de la expresión del gen endógeno es introduciendo y expresando, en una planta, un constructo genético en el cual el ácido nucleico (en este caso, un tramo de nucleótidos sustancialmente contiguos derivados a partir del gen de interés, o a partir de cualquier ácido nucleico capaz de codificar un ortólogo, parálogo u homólogo de cualquiera de la proteína de interés) se clona como una repetición invertida (en parte o completamente) , separado por un espaciador (ADN no codificante) .

En tal método preferido, la expresión del gen endógeno se reduce o se elimina sustancialmente a través del silenciamiento mediado por ARN utilizando una repetición invertida de un ácido nucleico o una parte de la misma (en este caso, un tramo de nucleótidos sustancialmente contiguos derivados a partir del gen de interés, o a partir de cualquier ácido nucleico capaz de codificar un ortólogo, parálogo u homólogo de la proteína de interés) , preferiblemente capaz de formar una estructura de horquilla. La repetición invertida se clona en un vector de expresión que comprende secuencias de control. Una secuencia de ácido nucleico ADN no codificante (un espaciador, por ejemplo un fragmento de la región de unión a la matriz (MAR) , un intrón, un polienlazador, etcétera) se localiza entre los dos ácidos nucleicos invertidos que forman la repetición invertida. Después de la transcripción de la repetición invertida, se forma un ARN quimérico con una estructura auto-complementaria (parcial o completo) . Esta estructura de ARN de doble hebra se refiere como el ARN en horquilla (ARNhp) . El ARNhp se procesa por la planta en ARNsi's que se incorporan en un complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC) . El RISC adicionalmente escinde los transcritos de ARNm, reduciendo sustancialmente por consiguiente el número de transcritos de ARNm a ser traducidos a polipéptidos . Para más detalles generales véase por ejemplo, Grierson et al. (1998) WO 98/53083; Waterhouse et al. (1999) O 99/53050) .

La realización de los métodos de la invención no se basa en introducir y expresar, en una planta, un constructo genético en el cual el ácido nucleico se clona como una repetición invertida, sino se puede utilizar cualquiera o más de los varios métodos de "silenciamiento genético" bien conocidos para lograr los mismos efectos.

Uno de tales métodos para la reducción de la expresión del gen endógeno es el silenciamiento mediado por ARN de la expresión del gen (regulación hacia abajo) . El silenciamiento, en este caso, se dispara en una planta por una secuencia de ARN de doble hebra (ARNds) que es sustancialmente similar al gen endógeno objetivo. Este ARNds se procesa adicionalmente por la planta en aproximadamente 20 a aproximadamente 26 nucleótidos llamados ARNs cortos de interferencia (ARNsi's). Los ARNsi's se incorporan en un complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC) que escinde el trascrito de ARNm del gen endógeno objetivo, reduciendo sustancialmente por consiguiente el número de transcritos de ARNm a ser traducidos a un polipéptido. Preferiblemente, la secuencia de ARN de doble hebra corresponde a un gen objetivo.

Otro ejemplo de un método de silenciamiento de ARN involucra la introducción de secuencias de ácidos nucleicos o partes de las mismas (en este caso, un tramo de nucleótidos sustancialmente contiguos derivados a partir del gen de interés, o a partir de cualquier ácido nucleico capaz de codificar un ortólogo, parálogo u homólogo de la proteina de interés) en una planta en una orientación sentido. La "orientación sentido" se refiere a una secuencia de ADN que es homologa a un trascrito de ARNm de la misma. Por consiguiente, en una planta se introduciría al menos una copia de la secuencia de ácidos nucleicos. La secuencia de ácidos nucleicos adicional reducirá la expresión del gen endógeno, dando lugar a un fenómeno conocido como co-supresión . La reducción de la expresión del gen será más pronunciada si varias copias adicionales de una secuencia de ácidos nucleicos se introducen en la planta, ya que hay una correlación positiva entre los altos niveles de transcrito y el disparo de la co-supresión.

Otro ejemplo de un método de silenciamiento de ARN involucra el uso de secuencias de ácidos nucleicos anti-sentido. Una secuencia de ácidos nucleicos "anti-sentido" comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria para una secuencia de ácidos nucleicos "sentido" que codifica una proteína, es decir, complementaria para la hebra codificante de una molécula de ADNc de doble hebra o complementaria para una secuencia del trascrito de ARNm. La secuencia de ácidos nucleicos anti-sentido es preferiblemente complementaria para el gen endógeno a ser silenciado. La complementariedad puede estar ubicada en la "región codificante" y/o en la "región no codificante" de un gen. El término "región codificante" se refiere a una región de la secuencia de nucleotidos que comprende codones que se traducen a residuos de aminoácidos. El término "región no codificante" se refiere a las secuencias 5' y 3' que flanquean la región codificante que se trascriben pero no se traducen a aminoácidos (también referidas como regiones no traducidas 5' y 3' ) .

Las secuencias de ácidos nucleicos anti-sentido se pueden diseñar de acuerdo con las reglas del apareamiento de bases de Watson-Crick . La secuencia de ácidos nucleicos anti-sentido puede ser complementaria para la secuencia de ácidos nucleicos entera (en este caso, un tramo de nucleotidos sustancialmente contiguos derivados a partir del gen de interés, o a partir de cualquier ácido nucleico capaz de codificar un ortólogo, parálogo u homólogo de la proteina de interés) , pero también puede ser un oligonucleótido que es anti-sentido para sólo una parte de la secuencia de ácidos nucleicos (incluyendo la UTR 5' y 3' del ARNm) . Por ejemplo, la secuencia de oligonucleótidos anti-sentido puede ser complementaria para la región que rodea el sitio de inicio de traducción de un trascrito de ARNm que codifica un polipéptido. La longitud de una secuencia de oligonucleótidos anti-sentido adecuada es conocida en el arte y puede iniciar desde aproximadamente 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15 o 10 nucleótidos de longitud o menos. Una secuencia de ácidos nucleicos anti-sentido de acuerdo con la invención se puede construir utilizando síntesis química y reacciones de ligación enzimática utilizando métodos conocidos en el arte. Por ejemplo, una secuencia de ácidos nucleicos anti-sentido (por ejemplo, una secuencia de oligonucleótidos anti-sentido) se puede sintetizar químicamente utilizando nucleótidos presentes de manera natural o nucleótidos diversamente modificados diseñados para incrementar la estabilidad biológica de las moléculas o para incrementar la estabilidad física del dúplex formado entre las secuencias de ácidos nucleicos anti-sentido y sentido, por ejemplo, se pueden utilizar derivados de fosforotioato y nucleótidos sustituidos con acridina. Los ejemplos de los nucleótidos modificados que se pueden utilizar para generar secuencias de ácidos nucleicos anti-sentido son bien conocidos en el arte. Las modificaciones de nucleótido conocidas incluyen metilación, ciclización y "remates" o "terminaciones" y sustitución de uno o más de los nucleótidos presentes naturalmente con un análogo tal como inosina. Otras modificaciones de los nucleótidos son bien conocidas en el arte.

La secuencia de ácidos nucleicos anti-sentido se puede producir biológicamente utilizando un vector de expresión en el cual una secuencia de ácidos nucleicos ha sido sub-clonada en una orientación anti-sentido (es decir, el ARN transcrito del ácido nucleico insertado será de una orientación anti-sentido para un ácido nucleico objetivo de interés) . Preferiblemente, la producción de secuencias de ácidos nucleicos anti-sentido en plantas ocurre por medio de un constructo de ácido nucleico establemente integrado que comprende un promotor, un oligonucleótido anti-sentido operativamente enlazado, y un terminador.

Las moléculas de ácido nucleico utilizadas para el silenciamiento en los métodos de la invención (ya sea introducidas en una planta o generadas in situ) hibridan con o se enlazan a los transcritos de ARNm y/o el ADN genómico que codifica un polipéptido para inhibir por consiguiente la expresión de la proteina, por ejemplo, inhibiendo la transcripción y/o la traducción. La hibridación puede ser mediante complementariedad de nucleótido convencional para formar un dúplex estable, o, por ejemplo, en el caso de una secuencia de ácidos nucleicos anti-sentido que se enlaza a los dúplex de ADN, a través de interacciones especificas en el surco principal de la doble hélice. Las secuencias de ácidos nucleicos anti-sentido se pueden introducir en una planta mediante transformación o inyección directa en un sitio de tejido especifico. Alternativamente, las secuencias de ácidos nucleicos anti-sentido se pueden modificar para tener como objetivo células seleccionadas y posteriormente se pueden administrar sistémicamente . Por ejemplo, para la administración sistémica, las secuencias de ácidos nucleicos anti-sentido se pueden modificar tal que específicamente se enlacen a los antigenos o receptores expresados en una superficie celular seleccionada, por ejemplo, enlazando la secuencia de ácidos nucleicos anti-sentido a los péptidos o anticuerpos que se enlazan a los antigenos o receptores de la superficie celular. Las secuencias de ácidos nucleicos antisentido también se pueden entregar a las células utilizando los vectores aquí descritos .

De acuerdo con un aspecto adicional, la secuencia de ácidos nucleicos anti-sentido es una secuencia de ácidos nucleicos a-anomérica. Una secuencia de ácidos nucleicos a-anomérica forma híbridos de doble hebra específicos con ARN complementario en el cual, contrario a las unidades b usuales, las hebras corren paralelamente entre sí (Gaultier et al. (1987) Nucí Ac Res 15: 6625-6641). La secuencia de ácidos nucleicos anti-sentido también puede comprender un 2 ' -o-metilribonucleótido (Inoue et al. (1987) Nucí Ac Res 15, 6131- 6148) o un análogo de ARN-ADN quimérico (Inoue et al. (1987) FEBS Lett. 215, 327-330).

La reducción o eliminación sustancial de la expresión del gen endógeno también se puede realizar utilizando ribozimas.

Las ribozimas son moléculas de ARN catalítico con actividad de ribonucleasa que son capaces de escindir una secuencia de ácido nucleico de una sola hebra, tal como un ARNm, para la cual tienen una región complementaria. De esta manera, las ribozimas (por ejemplo, las ribozimas cabeza de martillo (descritas en Haselhoff and Gerlach (1988) Nature 334, 585-591)) se pueden utilizar para escindir catalíticamente los transcritos de ARNm que codifican un polipéptido, reduciendo sustancialmente por consiguiente el número de transcritos de ARNm a ser traducidos a un polipéptido. Se puede diseñar una ribozima que tenga especificidad para una secuencia de ácidos nucleicos (véase por ejemplo: Cech et al. Patente Norteamericana No. 4,987,071; y Cech et al. Patente Norteamericana No.' 5,116,742). Alternativamente, los transcritos de ARNm correspondientes a una secuencia de ácidos nucleicos se pueden utilizar para seleccionar un ARN catalítico que tiene una actividad de ribonucleasa específica a partir de un grupo de moléculas de ARN (Bartel and Szostak (1993) Science 261, 1411-1418). El uso de ribozimas para el silenciamiento genético en plantas es conocido en el arte (por ejemplo, Atkins et al. (1994) WO 94/00012; Lenne et al. (1995) WO 95/03404; Lutziger et al. (2000) WO 00/00619; Prinsen et al. (1997) WO 97/13865 y Scott et al. (1997) WO 97/38116).

El silenciamiento genético también se puede lograr mediante mutagénesis por inserción (por ejemplo, inserción de ADN-T o inserción de transposón) o mediante estrategias según se describe por, entre otros, Angelí and Baulcombe ((1999) Plant J 20(3): 357-62), (Amplicon VIGS WO 98/36083), o Baulcombe (WO 99/15682) .

El silenciamiento genético también puede ocurrir si hay una mutación en un gen endógeno y/o una mutación en un ácido nucleico/gen aislado subsiguientemente introducido en una planta. La reducción o eliminación sustancial puede ser causada por un polipéptido no funcional. Por ejemplo, el polipéptido se puede enlazar a diversas proteínas interactuantes; una o más mutaciones y/o truncamientos pueden proporcionar por consiguiente un polipéptido que todavía es capaz de enlazar proteínas interactuantes (tales como las proteínas receptoras) pero que no puede exhibir su función normal (tal como el ligando de señalización) .

Una aproximación adicional para el silenciamiento genético es el direccionamiento de secuencias de ácidos nucleicos complementarias para la región reguladora del gen (por ejemplo, el promotor y/o los mejoradores) para formar estructuras de triple hélice que previenen la transcripción del gen en las células objetivo. Véase Helene, C, Anticancer Drug Res. 6, 569-84, 1991; Helene et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 660, 27-36 1992; y aher, L. J. Bioassays 14, 807-15, 1992.

Otros métodos, tal como el uso de anticuerpos dirigidos a un polipéptido endógeno para inhibir su función en la planta, o la interferencia en la trayectoria de señalización en la cual está involucrado un polipéptido, serán bien conocidos por el artesano experto. En particular, se puede prever que las moléculas hechas por el hombre pueden ser útiles para inhibir la función biológica de un polipéptido objetivo, o para interferir con la trayectoria de señalización en la cual está involucrado el polipéptido objetivo.

Alternativamente, un programa de detección se puede configurar para identificar en una población de plantas las variantes naturales de un gen, cuyas variantes codifican los polipéptidos con actividad reducida. Tales variantes naturales también se pueden utilizar, por ejemplo, para realizar la recombinación homologa.

Los micro ARNs (miARNs) artificiales y/o naturales se pueden utilizar para bloquear la expresión del gen y/o la traducción del ARNm. Los miARNs endógenos son ARNs pequeños de una sola hebra de típicamente 19-24 nucleótidos de longitud. Éstos funcionan principalmente para regular la expresión del gen y/o la traducción de ARNm. La mayoría de los micro ARNs (miARNs) de planta tienen complementariedad perfecta o casi perfecta con sus secuencias objetivo. Sin embargo, existen objetivos naturales con hasta cinco desapareamientos. Éstos se procesan a partir de ARNs no codificantes más largos con estructuras plegadas características mediante RNasas específicas de doble hebra de la familia Dicer. Tras el procesamiento, se incorporan en el complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC) mediante enlace a su componente principal, una proteina Argonauta. Los miARNs sirven como los componentes de especificidad del RISC, debido a que forman pares de bases para los ácidos nucleicos objetivo, principalmente los ARNm's, en el citoplasma. Los eventos reguladores subsiguientes incluyen la inhibición traduccional y/o la escisión y destrucción del ARNm objetivo. De esta manera, los efectos de la sobre-expresión del miARN a menudo se reflejan en niveles de ARNm disminuidos de los genes objetivo.

Los micro ARNs artificiales (amiARNs), que son típicamente de 21 nucleótidos de longitud, se pueden diseñar genéticamente específicamente para regular negativamente la expresión de gen de los genes sencillos o múltiples de interés. Los factores determinantes de la selección del objetivo de microARN de planta son bien conocidos en el arte. Los parámetros empíricos para el reconocimiento del objetivo han sido definidos y se pueden utilizar para ayudar en el diseño de amiARNs específicos, (Schwab et al., Dev. Cell 8, 517-527, 2005). Las herramientas convenientes para el diseño y la generación de amiARNs y sus progenitores también están disponibles para el público (Schwab et al., Plant Cell 18, 1121-1133, 2006).

Para el óptimo desempeño, las técnicas de silenciamiento genético utilizadas para reducir la expresión, en una planta, de un gen endógeno requieren el uso de secuencias de ácidos nucleicos de plantas monocotiledóneas para la transformación de plantas monocotiledóneas, y de plantas dicotiledóneas para la transformación de plantas dicotiledóneas. Preferiblemente, una secuencia de ácidos nucleicos de cualquier especie de planta dada se introduce en esa misma especie. Por ejemplo, una secuencia de ácidos nucleicos de arroz se transforma en una planta de arroz. Sin embargo, no es un requerimiento absoluto que la secuencia de ácidos nucleicos a ser introducida se origine de la misma especie de planta que la planta en la cual será introducida. Es suficiente que haya una homología sustancial entre el gen objetivo endógeno y el ácido nucleico a ser introducido.

Anteriormente se describen ejemplos de diversos métodos para la reducción o eliminación sustancial de la expresión, en una planta, de un gen endógeno. Una persona experta en el arte fácilmente podría adaptar los métodos anteriormente mencionados para el silenciamiento a fin de lograr la reducción de la expresión de un gen endógeno en una planta entera o en partes de la misma, por ejemplo, a través del uso de un promotor apropiado.

Transformación El término "introducción" o "transformación" según se refiere aquí abarca la transferencia de un polinucleótido exógeno en una célula hospedera, independientemente del método utilizado para la transferencia. El tejido de planta capaz de propagación clonal subsiguiente, ya sea por organogénesis o embriogénesis, se puede transformar con un constructo genético de la presente invención y una planta entera regenerada a partir del mismo. El tejido particular seleccionado variará dependiendo de los sistemas de propagación clonal disponibles para, y mejor adecuados para, la especie particular que se transforma. Los objetivos de tejido ejemplares incluyen discos de hojas, polen, embriones, cotiledones, hipocótilos, megagametofitos, tejido de callo, tejido meristemático existente (por ejemplo, meristema apical, brotes axilares, y meristemas de la raíz), y tejido de meristema inducido (por ejemplo, meristema de cotiledón y meristema de hipocótilo) . El polinucleótido se puede introducir transitoriamente o establemente en una célula hospedera y se puede mantener no integrado, por ejemplo, como un plásmido. Alternativamente, se puede integrar en el genoma hospedero. La célula de planta transformada resultante se puede utilizar entonces para regenerar una planta transformada en una manera conocida por las personas expertas en el arte.

La transferencia de genes extraños al genoma de una planta se denomina transformación. La transformación de especies de planta es ahora una técnica bastante rutinaria. Ventajosamente, cualquiera de varios métodos de transformación se puede utilizar para introducir el gen de interés en una célula antecesora adecuada. Los métodos descritos para la transformación y regeneración de plantas a partir de tejidos de planta o células de planta se pueden utilizar para la transformación transitoria o para la transformación estable. Los métodos de transformación incluyen el uso de liposomas, electroporación, químicos que incrementan la captación del ADN libre, la inyección del ADN directamente en la planta, el bombardeo con pistola de partículas, la transformación utilizando virus o polen y la microproyección . Los métodos se pueden seleccionar a partir del método de calcio/polietilenglicol para protoplastos (Krens, F.A. et al., (1982) Nature 296, 72-74; Negrutiu I et al. (1987) Plant Mol Biol 8: 363-373); electroporación de protoplastos (Shillito R.D. et al. (1985) Bio/Technol 3, 1099-1102); microinyección en material de planta (Crossway A et al., (1986) Mol. Gen Genet 202: 179-185); bombardeo de partículas recubiertas con ADN o ARN (Klein TM et al., (1987) Nature 327: 70), infección con virus (no integrativos ) y similares. Las plantas transgénicas, incluyendo las plantas de cultivo transgénico, preferiblemente se producen por medio de la transformación mediada por Agrobacterium. Un método de transformación ventajoso es la transformación in planta. Para este fin, es posible, por ejemplo, permitir que la agrobacteria actúe sobre las semillas de planta o inocular la meristema de planta con la agrobacteria . Ha resultado ser particularmente conveniente de conformidad con la invención, permitir que una suspensión de agrobacteria transformada actúe sobre la planta intacta o al menos sobre los primordios florales. La planta subsiguientemente se cultiva hasta que se obtienen las semillas de la planta tratada (Clough and Bent, Plant J. (1998) 16, 735-743). Los métodos para la transformación -mediada por Agrobacterium- del arroz incluyen los métodos bien conocidos para la transformación del arroz, tales como aquellos descritos en cualquiera de los siguientes: Solicitud de Patente Europea EP 1198985 Al, Aldemita and Hodges (Planta 199: 612-617, 1996); Chan etal . (Plant Mol Biol 22 (3): 491-506, 1993), Hiei et al. (Plant J 6 (2): 271-282, 1994), cuyas divulgaciones se incorporan aquí por referencia como si se expusieran completamente. En el caso de la transformación del maíz, el método preferido es como se describe en ya sea Ishida et al. (Nat. Biotechnol 14(6): 745-50, 1996) o Frame et al. (Plant Physiol 129(1): 13-22, 2002), cuyas divulgaciones se incorporan aquí por referencia como si se expusieran completamente. Dichos métodos se describen adicionalmente a manera de ejemplo en B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol . 1, Engineering and Utilization, eds. S.D. ung and R. Wu, Academic Press (1993) 128-143 y en Potrykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205-225). Los ácidos nucleicos o el constructo a ser expresado preferiblemente se clona en un vector, que es adecuado para la transformación de Agrobacterium tumefaciens, por ejemplo pBinl9 (Bevan et al., Nucí. Acids Res. 12 (1984) 8711) . La agrobacteria transformada por tal vector posteriormente se puede utilizar en una manera conocida para la transformación de plantas, tales como plantas utilizadas como un modelo, como Arabidopsis (la Arabidopsis thaliana está dentro del alcance de la presente invención no considerada como una planta de cultivo) , o plantas de cultivo tales como, a manera de ejemplo, plantas de tabaco, por ejemplo sumergiendo hojas magulladas u hojas picadas en una solución agrobacteriana y posteriormente cultivándolas en un medio adecuado. La transformación de plantas por medio de Agrobacterium tumefaciens se describe, por ejemplo, por Hofgen and Willmitzer en Nucí. Acid Res. (1988) 16, 9877 o es conocida ínter alia a partir de F.F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds . S.D. Kung and R. Wu, Academic Press, 1993, pp. 15-38.

Además de la transformación de células somáticas, que posteriormente tienen que ser regeneradas en plantas intactas, también es posible transformar las células de meristemas de planta y en particular aquellas células que se desarrollan en gametos. En este caso, los gametos transformados siguen el desarrollo natural de la planta, dando lugar a las plantas transgénicas . De esta manera, por ejemplo, las semillas de Arabidopsis se tratan con agrobacteria y las semillas se obtienen a partir de las plantas en desarrollo de las cuales una cierta proporción es transformada y de esta manera transgénica [Feldman, KA and Marks MD (1987). Mol Gen Genet 208:1-9; Feldmann K (1992). En: C Koncz, N-H Chua and J Shell, eds, ethods in Arabidopsis Research. Word Scientific, Singapur, pp. 274-289] . Los métodos alternativos se basan en la remoción repetida de las inflorescencias y la incubación del sitio de excisión en el centro de la roseta con agrobacteria transformada, por lo que las semillas transformadas asimismo se pueden obtener en un punto posterior en el tiempo (Chang (1994). Plant J. 5: 551-558; Katavic (1994). Mol Gen Genet, 245: 363-370). Sin embargo, un método especialmente efectivo es el método de infiltración de vacio con sus modificaciones tales como el método "inmersión floral". En el caso de la infiltración de vacio de Arabidopsis, las plantas intactas bajo presión reducida se tratan con una suspensión agrobacteriana [Bechthold, N (1993) . C R Acad Sci Paris Life Sci, 316: 1194-1199], mientras que en el caso del método de "inmersión floral" el tejido floral en desarrollo se incuba brevemente con una suspensión agrobacteriana tratada con surfactante [Clough, SJ and Bent AF (1998) The Plant J. 16, 735-743] . Una cierta proporción de las semillas transgénicas se cosecha en ambos casos, y estas semillas se pueden distinguir de las semillas no transgénicas mediante cultivo bajo las condiciones selectivas anteriormente descritas. Además, la transformación estable de plástidos es ventajosa debido a que los plástidos se heredan maternalmente en la mayoría de los cultivos reduciendo o eliminando el riesgo de flujo de transgenes a través del polen. La transformación del genoma del cloroplasto generalmente se logra mediante un proceso que ha sido exhibido esquemáticamente en Klaus et al., 2004 [Nature Biotechnology 22 (2) , 225-229] . Brevemente las secuencias a ser transformadas se clonan conjuntamente con un gen marcador seleccionable entre las secuencias flanqueantes homologas para el genoma del cloroplasto. Estas secuencias flanqueantes homologas dirigen la integración específica al sitio en el plastoma. La transformación plastidial se ha descrito para muchas especies de planta diferentes y una visión general se proporciona en Bock (2001) Transgenic plastids in basic research and plant biotechnology. J Mol Biol. 2001 Sep 21; 312 (3):425-38 o Maliga, P (2003) Progrese towards commercialization of plastid transformation technology. Trends Biotechnol . 21, 20-28. Recientemente se ha reportado más progreso biotecnologico en forma de transformantes de plástido libres de marcadores, que se pueden producir mediante un gen marcador co-integrado transitorio (Klaus et al., 2004, Nature Biotechnology 22(2), 225-229).

Las células de planta genéticamente modificadas se pueden regenerar mediante todos los métodos con los cuales está familiarizado el artesano experimentado. Los métodos adecuados se pueden encontrar en las publicaciones anteriormente mencionadas por S.D. Kung and R. Wu, Potrykus o Hofgen and illmitzer .

Generalmente después de la transformación, las células de planta o los agrupamientos celulares se seleccionan para la presencia de uno o más marcadores que se codifican por los genes expresables en plantas co-transferidos con el gen de interés, después de lo cual el material transformado se regenera en una planta entera. Para seleccionar las plantas transformadas, el material de planta obtenido en la transformación, por regla general, se somete a condiciones selectivas de modo que las plantas transformadas se puedan distinguir de las plantas no transformadas. Por ejemplo, las semillas obtenidas en la manera anteriormente descrita se pueden plantar y, después de un periodo de crecimiento inicial, se pueden someter a una selección adecuada mediante rociado. Una posibilidad adicional consiste en cultivar las semillas, si es apropiado después de la esterilización, en placas de agar utilizando un agente de selección adecuado de modo que sólo las semillas transformadas puedan crecer en la forma de plantas. Alternativamente, las plantas transformadas se examinan para detectar la presencia de un marcador seleccionable tal como los descritos anteriormente.

Después de la transferencia de ADN y la regeneración, las plantas putativamente transformadas también se pueden evaluar, por ejemplo utilizando análisis Southern, por la presencia del gen de interés, número de copias y/u organización genómica. Alternativamente o adicionalmente, los niveles de expresión del ADN recién introducido se pueden monitorear utilizando el análisis Northern y/o Western, ambas técnicas siendo bien conocidas por las personas que tienen habilidad ordinaria en el arte.

Las plantas transformadas generadas se pueden propagar por una variedad de medios, tales como mediante propagación clonal o técnicas clásicas de reproducción. Por ejemplo, una planta transformada de primera generación (o TI) puede ser transformantes de segunda generación (o T2) auto-fecundados y homocigotos seleccionados, y las plantas T2 se pueden propagar adicionalmente a través de técnicas clásicas de reproducción. Los organismos transformados generados pueden tomar una variedad de formas. Por ejemplo, pueden ser quimeras de células transformadas y células no transformadas; transformantes clónales (por ejemplo, todas las células transformadas para contener el cásete de expresión) ; injertos de tejidos transformados y no transformados (por ejemplo, en las plantas, un rizoma transformado, injertado a un retoño no transformado) .

A lo largo de esta solicitud, una planta, parte de planta, semilla o célula de planta transformada con - o intercambiablemente transformada por - un constructo o transformada con o por un ácido nucleico, se debe entender como una planta, parte de planta, semilla o célula de planta que transporta dicho constructo o dicho ácido · ucleico como un transgen debido al resultado de una introducción de dicho constructo o dicho ácido nucleico por medios biotecnológicos . La planta, parte de planta, semilla o célula de planta comprende por consiguiente dicho constructo recombinante o dicho ácido nucleico recombinante. Cualquier planta, parte de planta, semilla o célula de planta que ya no contiene dicho constructo recombinante o dicho ácido nucleico recombinante después de la introducción en el pasado, se denomina segregante nulo, nulicigoto o control nulo, pero no se considera una planta, parte de planta, semilla o célula de planta transformada con dicho constructo o con dicho ácido nucleico dentro del significado de esta solicitud.

Etiquetado de la activación del ADN-T El etiquetado de la activación del ADN-T (Hayashi et al. Science (1992) 1350-1353), involucra la inserción de ADN-T, usualmente que contiene un promotor (también puede ser un mej orador de traducción o un intrón) , en la región genómica del gen de interés o 10 kb corriente arriba o abajo de la región codificante de un gen en una configuración tal que el promotor dirige la expresión del gen que se tiene como objetivo. Típicamente, la regulación de la expresión del gen que se tiene como objetivo mediante su promotor natural es perturbada y el gen cae bajo el control del promotor recién introducido. El promotor típicamente se incrusta en un ADN-T. Este ADN-T se inserta aleatoriamente en el genoma de la planta, por ejemplo, a través de infección de Agrobacterium y conduce a la expresión modificada de genes cerca del ADN-T insertado. Las plantas transgénicas resultantes muestran fenotipos dominantes debido a la expresión modificada de los genes cerca del promotor introducido.

TILLING El término "TILLING" es una abreviatura de "Lesiones Locales Dirigidas Inducidas en el Genoma" y se refiere a una tecnología de mutagénesis útil para generar y/o identificar ácidos nucleicos que codifican proteínas con actividad y/o expresión modificada. Las TILLING también permiten la selección de plantas que transportan tales variantes mutantes. Estas variantes mutantes pueden exhibir una expresión modificada, ya sea en fuerza o en ubicación o en tiempo (si por ejemplo las mutaciones afectan al promotor) . Estas variantes mutantes pueden exhibir mayor actividad que aquella exhibida por el gen en su forma natural. Las TILLING combinan la mutagénesis de alta densidad con métodos de selección de alto rendimiento. Las etapas típicamente seguidas en las TILLING son: (a) mutagénesis EMS (Redei GP and Koncz C (1992) En Methods in Arabidopsis Research, Koncz C, Chua NH, Schell J, eds . Singapur, World Scientific Publishing Co, pp. 16-82; Feldmann et al., (1994) En eyerowitz EM, Somerville CR, eds, Arabidopsis. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, pp 137-172; Lightner J and Caspar T (1998) En J Martinez-Zapater, J Salinas, eds, Methods on Molecular Biology, Vol. 82. Humana Press, Totowa, NJ, pp 91-104); (b) preparación de ADN y agrupación de individuos; (c) amplificación PCR de una región de interés; (d) desnaturalización y recocido para permitir la formación de heterodúplex; (e) DHPLC, donde la presencia de un heterodúplex en un grupo se detecta como un máximo adicional en el cromatograma; (f) identificación del individuo mutante; y (g) secuenciación del producto PCR mutante. Los métodos para las TILLING son bien conocidos en el arte (McCallum et al., (2000) Nat Biotechnol 18: 455-457; revisado por Stemple (2004) Nat Rev Genet 5(2): 145-50).

Recombinación homologa La recombinación homologa permite la introducción en un genoma de un ácido nucleico seleccionado en una posición seleccionada definida. La recombinación homologa es una tecnología estándar utilizada rutinariamente en las ciencias biológicas para organismos inferiores tales como la levadura o el musgo Physcomitrella . Los métodos para realizar la recombinación homologa en plantas han sido descritos no sólo para plantas modelo (Offringa et al. (1990) EMBO J 9(10) : 3077-84) sino también para plantas de cultivo, por ejemplo arroz (Terada et al. (2002) Nat Biotech 20(10) : 1030-4; lida and Terada (2004) Curr Opin Biotech 15(2) : 132-8), y existen aproximaciones que son generalmente aplicables independientemente del organismo objetivo (Miller et al, Nature Biotechnol. 25, 778-785, 2007) .

Rasgos relacionados al rendimiento Los rasgos relacionados al rendimiento son rasgos o características que se relacionan al rendimiento de la planta. Los rasgos relacionados al rendimiento pueden comprender uno o más de la siguiente lista no limitante de características: tiempo de floración anticipada, rendimiento, biomasa, rendimiento de la semilla, vigor temprano, índice de verdor, tasa de crecimiento incrementada, rasgos agronómicos mejorados, tales como, por ejemplo, tolerancia incrementada a la inmersión (que conduce al rendimiento incrementado en el arroz) , Eficiencia de Uso de Agua (WUE) mejorada, Eficiencia de Uso de Nitrógeno (NUE) mejorada, etcétera.

Rendimiento El término "rendimiento" en general significa un producto mensurable de valor económico, típicamente relacionado a un cultivo especificado, a un área, y a un periodo de tiempo. Las partes de planta individuales directamente contribuyen al rendimiento con base en su número, tamaño y/o peso, o el rendimiento real es el rendimiento por metro cuadrado para un cultivo y año, que se determina dividiendo la producción total (incluye la producción cosechada y estimada) por los metros cuadrados plantados.

Los términos "rendimiento" de una planta y "rendimiento de planta" se utilizan aquí de forma intercambiable y pretenden referirse a la biomasa vegetativa tal como la biomasa de la raíz y/o del brote, para órganos reproductivos, y/o para propágulos tales como las semillas de esa planta.

Las flores en el maiz son unisexuales; las inflorescencias macho (borlas) se originan a partir del tallo apical y las inflorescencias hembra (mazorca) surgen a partir de los ápices de los botones axilares. La inflorescencia hembra produce pares de espiguillas en la superficie de un eje central (olote) . Cada una de las espiguillas hembra encierra dos flósculos fértiles, uno de ellos usualmente madurará en un grano de maiz, una vez fertilizado. Por lo tanto, un incremento del rendimiento en el maiz puede ser manifestado como uno o más de lo siguiente: el incremento en el número de plantas establecidas por metro cuadrado, un incremento en el número de mazorcas por planta, un incremento en el número de hileras, el número de granos por hilera, el peso del grano, el peso de mil granos, la longitud/diámetro de la mazorca, el incremento en la tasa de llenado de las semillas, cuál es el número de flósculos llenos (es decir, los flósculos que contienen semillas) dividido por el número total de flósculos y multiplicado por 100, entre otros.

Las inflorescencias en las plantas de arroz se llaman panículas. La panícula alberga las espiguillas, que son las unidades básicas de las panículas, y que consisten de un pedúnculo y un flósculo. El flósculo es llevado en el pedúnculo e incluye una flor que está cubierta por dos glumas de protección: una gluma más larga (la lema) y una gluma más corta (la pálea) . Por lo tanto, tomando al arroz como ejemplo, un incremento del rendimiento puede manifestarse como un incremento en uno o más de lo siguiente: el número de plantas por metro cuadrado, el número de panículas por planta, la longitud de la panícula, número de espiguillas por panícula, el número de flores (o flósculos) por panícula; un incremento en la tasa de llenado de las semillas que es el número de flósculos llenos (es decir, los flósculos que contienen semillas) dividido por el número total de flósculos y multiplicado por 100; un incremento en el peso de mil granos, entre otros.

Tiempo de floración anticipada Las plantas que tienen un "tiempo de floración anticipada" según se utiliza aquí son plantas que comienzan a florecer antes que las plantas de control. Por lo tanto, este término se refiere a las plantas que muestran un comienzo de más temprano de la floración. El tiempo de la floración de las plantas se puede evaluar contando el número de días ("tiempo para florecer") entre la siembra y la emergencia de una primera inflorescencia. El "tiempo de floración" de una planta puede, por ejemplo, determinarse utilizando el método según se describe en la WO 2007/093444.

Vigor temprano "El vigor temprano" se refiere al crecimiento bien balanceado, saludable, activo, especialmente durante las etapas tempranas del crecimiento de la planta, y puede resultar de la aptitud incrementada de la planta debido a, por ejemplo, las plantas que se adaptan mejor a su ambiente (es decir, la optimización del uso de recursos energéticos y la partición entre el brote y la raíz). Las plantas que tienen vigor temprano también muestran supervivencia incrementada de las plántulas y un mejor establecimiento del cultivo, lo cual a menudo da como resultado campos altamente uniformes (con el cultivo creciendo en una manera uniforme, es decir, con la mayor parte de las plantas alcanzando las diversas etapas de desarrollo en sustancialmente el mismo tiempo) , y a menudo mejor y más alto rendimiento. Por consiguiente, el vigor temprano se puede determinar midiendo diversos factores, tales como el peso de mil granos, la germinación porcentual, la emergencia porcentual, el crecimiento de la plántula, la altura de la plántula, la longitud de la raíz, la biomasa de la raíz y del brote y muchos más.

Tasa de crecimiento incrementada La tasa de crecimiento incrementada puede ser específica para una o más partes de una planta (incluyendo las semillas), o puede estar a través de sustancialmente toda la planta. Las plantas que tienen una tasa de crecimiento incrementada pueden tener un ciclo de vida más corto. El ciclo de vida de una planta puede ser interpretado como el tiempo necesario para crecer desde una semilla madura seca hasta la etapa donde la planta ha producido semillas maduras secas, similares al material de inicio. Este ciclo de vida puede ser influenciado por factores tales como la velocidad de germinación, el vigor temprano, la tasa de crecimiento, el índice de verdor, el tiempo de floración y la velocidad de maduración de la semilla. El incremento en la tasa de crecimiento puede tener lugar en una o más etapas en el ciclo de vida de una planta o durante sustancialmente todo el ciclo de vida de la planta. La tasa de crecimiento incrementada durante las etapas tempranas en el ciclo de vida de una planta puede reflejar un vigor mejorado. El incremento en la tasa de crecimiento puede alterar el ciclo de cosecha de una planta permitiendo que las plantas sean sembradas más tarde y/o cosechadas antes de lo que sería posible de otra manera (un efecto similar se puede obtener con un tiempo de floración anticipada) . Si la tasa de crecimiento se incrementa de manera suficiente, puede permitir la siembra adicional de semillas de la misma especie de planta (por ejemplo la siembra y cosecha de plantas de arroz seguido por la siembra y cosecha de más plantas de arroz todo dentro de un periodo de crecimiento convencional) . De modo semejante, si la tasa de crecimiento se incrementa de manera suficiente, puede permitir la siembra adicional de semillas de diferentes especies de plantas (por ejemplo la siembra y la cosecha de plantas de maíz seguido por, por ejemplo, la siembra y la cosecha opcional de soya, papa o cualquier otra planta adecuada) . También puede ser posible la cosecha en ocasiones adicionales a partir del mismo porta injerto en el caso de algunas plantas de cultivo. Alterar el ciclo de cosecha de una planta puede conducir a un incremento en la producción de biomasa anual por metro cuadrado (debido a un incremento en el número de veces (dicho en un año) que cualquier planta particular se puede cultivar y cosechar) . Un incremento en la tasa de crecimiento también puede permitir el cultivo de plantas transgénicas en un área geográfica más ancha que sus contrapartes de tipo salvaje, debido a que las limitaciones territoriales para el crecimiento de un cultivo a menudo se determinan por las condiciones ambientales adversas ya sea al momento de la plantación (principios de la estación) o al momento de la cosecha (finales de la estación). Tales condiciones adversas se pueden evitar si se acorta el ciclo de la cosecha. La tasa de crecimiento se puede determinar derivando diversos parámetros a partir de las curvas de crecimiento, tales parámetros pueden ser: el T-Medio (el tiempo requerido para que las plantas alcancen el 50% de su tamaño máximo) y el T-90 (el tiempo requerido para que las plantas alcancen el 90% de su tamaño máximo), entre otros.

Resistencia al estrés Un incremento en el rendimiento y/o la tasa de crecimiento ocurre si la planta está bajo condiciones sin estrés o si la planta está expuesta a diversos estreses en comparación a las plantas de control. Las plantas típicamente responden a la exposición al estrés creciendo más lentamente. En condiciones de estrés severo, la planta incluso puede dejar de crecer completamente. El estrés moderado, por otra parte, se define aquí como cualquier estrés al cual se expone una planta que no da como resultado que la planta deje de crecer completamente sin la capacidad para reanudar el crecimiento. El estrés moderado en el sentido de la invención conduce a una reducción en el crecimiento de las plantas bajo estrés de menos que 40%, 35%, 30% o 25%, más preferiblemente menos que 20% o 15% en comparación a la planta de control bajo condiciones sin estrés. Debido a los avances en las prácticas agrícolas (irrigación, fertilización, tratamientos con pesticidas), los estreses severos no se encuentran a menudo en las plantas de cultivo cultivadas. Como consecuencia, el crecimiento comprometido inducido por el estrés moderado es a menudo una característica indeseable para la agricultura. Los "estreses moderados" son los estreses bióticos y/o abióticos cotidianos (medioambientales) a los cuales se expone una planta. Los estreses abióticos pueden ser debidos a la sequía o el exceso de agua, el estrés anaerobio, el estrés por salinidad, la toxicidad química, el estrés oxidativo y las temperaturas calientes, frías o gélidas.

"Los estreses bióticos" son típicamente aquellos estreses causados por patógenos, tales como bacterias, virus, fungosidades, nemátodos e insectos.

El "estrés abiótico" puede ser un estrés osmótico causado por un estrés hidrico, por ejemplo, debido a la sequía, el estrés por salinidad, o el estrés por helamiento. El estrés abiótico también puede ser un estrés oxidativo o un estrés por frío. "El estrés por helamiento" pretende referirse al estrés debido a las temperaturas gélidas, es decir, temperaturas en las cuales las moléculas de agua disponibles se congelan y se vuelven hielo. El "estrés por frío", también llamado "estrés por enfriamiento", pretende referirse a temperaturas frías, por ejemplo, temperaturas debajo de 10°, o preferiblemente debajo de 5°C, pero en las cuales las moléculas de agua no se congelan. Según se reporta en Wang et al. (Planta (2003) 218: 1-14), el estrés abiótico conduce a una serie de cambios morfológicos, fisiológicos, bioquímicos y moleculares que afectan adversamente el crecimiento de las plantas y la productividad. Se sabe que la sequía, la salinidad, las temperaturas extremas y el estrés oxidativo están interconectados y pueden inducir crecimiento y daño celular a través de mecanismos similares. Rabbani et al. (Plant Physiol (2003) 133: 1755-1767) describe un grado particularmente alto de "diafonía" entre el estrés por sequía y el estrés por alta salinidad. Por ejemplo, la sequía y/o la salinización se manifiestan principalmente como estrés osmótico, dando como resultado la perturbación de la homeostasis y la distribución iónica en la célula. El estrés oxidativo, que frecuentemente acompaña el estrés por salinidad o sequía, de alta o baja temperatura, puede provocar la desnaturalización de las proteínas funcionales y estructurales. Como consecuencia, estos diversos estreses medioambientales a menudo activan similares trayectorias de señalización celular y respuestas celulares, tales como la producción de proteínas de estrés, la regulación hacia arriba de antioxidantes, la acumulación de solutos compatibles y la detención del crecimiento. El término condiciones "sin estrés" según se utiliza aquí son aquellas condiciones medioambientales que permiten el crecimiento óptimo de las plantas. Las personas expertas en el arte están al tanto de las condiciones del suelo y las condiciones climáticas normales para una ubicación dada. Las plantas con condiciones de crecimiento óptimo, (cultivadas bajo condiciones sin estrés) típicamente producen en orden creciente de preferencia al menos 97%, 95%, 92%, 90%, 87%, 85%, 83%, 80%, 77% o 75% de la producción promedio de tal planta en un ambiente dado. La producción promedio se puede calcular en base a la cosecha y/o a la estación. Las personas expertas en el arte están al tanto de las producciones de rendimiento promedio de un cultivo.

En particular, los métodos de la presente invención se pueden realizar bajo condiciones sin estrés. En un ejemplo, los métodos de la presente invención se pueden realizar bajo condiciones sin estrés tales como sequía moderada para producir plantas que tienen rendimiento incrementado con relación a las plantas de control.

En otra modalidad, los métodos de la presente invención se pueden realizar bajo condiciones de estrés, preferiblemente bajo condiciones de estrés abiótico.

En un ejemplo, los métodos de la presente invención se pueden realizar bajo condiciones de estrés medioambiental abiótico tales como sequía para producir plantas que tienen rendimiento incrementado con relación a las plantas de control .

En otro ejemplo, los métodos de la presente invención se pueden realizar bajo condiciones de estrés medioambiental abiótico tales como la deficiencia de nutrientes para producir plantas que tienen rendimiento incrementado con relación a las plantas de control.

La deficiencia de nutrientes puede resultar de una falta de nutrientes tales como nitrógeno, fosfatos y otros compuestos que contienen fósforo, potasio, calcio, magnesio, manganeso, hierro y boro, entre otros.

En todavía otro ejemplo, los métodos de la presente invención se pueden realizar bajo condiciones de estrés medioambiental abiótico tales como el estrés por salinidad para producir plantas que tienen rendimiento incrementado con relación a las plantas de control. El término estrés por salinidad no está restringido a la sal común (NaCl), sino puede ser cualquiera o más de: NaCl, KC1, LiCl, MgCl2, CaCl2, entre otras.

En todavía otro ejemplo, los métodos de la presente invención se pueden realizar bajo condiciones de estrés medioambiental abiótico tales como estrés por frío o estrés por helamiento para producir plantas que tienen rendimiento incrementado con relación a las plantas de control.

Incrementar/Mej orar Los términos "incrementar" y "mejorar" son intercambiables y significarán en el sentido de la solicitud al menos un 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% o 10%, preferiblemente al menos 15% o 20%, más preferiblemente 25%, 30%, 35% o 40% más rendimiento y/o crecimiento en comparación a las plantas de control según se define aquí.

Los términos "con relación a las plantas de control" y "en comparación a las plantas de control" son intercambiables y significarán en el sentido de la solicitud que los parámetros relacionados al rendimiento y/o el químico fino de la planta alterada son comparados con los valores correspondientes de la planta de control cultivada bajo condiciones tan similares como sea posible.

Rendimiento de la semilla El rendimiento incrementado de la semilla puede manifestarse como uno o más de lo siguiente: a) un incremento en la biomasa de semilla (peso de la semilla total) que puede estar en una base de semilla individual y/o por planta y/o por metro cuadrado; b) un número incrementado de flores por planta; c) un número incrementado de semillas; d) una tasa de llenado de las semillas incrementada (que se expresa como la proporción entre el número de flósculos llenos dividido por el número total de flósculos) ; e) un índice de cosecha incrementado, que se expresa como una proporción del rendimiento de las partes cosechables, tales como las semillas, dividida por la biomasa de las partes de planta por arriba del suelo; y f) Un peso de mil granos (TKW) incrementado, que se extrapola1" a partir del número de semillas contadas y su peso total. Un TKW incrementado puede resultar de un tamaño de semilla y/o peso de semilla incrementado, y también puede resultar de un incremento en el tamaño del embrión y/o endosperma .

Los términos "flósculos llenos" y "semillas llenas" se pueden considerar sinónimos.

Un incremento en el rendimiento de la semilla también se puede manifestar como un incremento en el tamaño de la semilla y/o el volumen de la semilla. Además, un incremento en el rendimiento de la semilla también puede manifestarse como un incremento en el área de la semilla y/o la longitud de la semilla y/o la anchura de la semilla y/o el perímetro de la semilla . índice de verdor El "índice de verdor" según se utiliza aquí se calcula a partir de imágenes digitales de las plantas. Para cada pixel perteneciente al objeto de planta en la imagen, se calcula la proporción del valor verde frente al valor rojo (en el modelo RGB para la codificación del color) . El índice de verdor se expresa como el porcentaje de pixeles para los cuales la proporción verde a rojo excede un umbral dado. Bajo condiciones normales de crecimiento, bajo condiciones de crecimiento de estrés por salinidad, y bajo condiciones de crecimiento de disponibilidad de nutrientes reducida, el índice de verdor de las plantas se mide en la última obtención de imágenes antes la floración. En contraste, bajo condiciones de crecimiento de estrés por sequía, el índice de verdor de las plantas se mide en la primera obtención de imágenes después de la sequía.

Biomasa El término "biomasa" según se utiliza aquí pretende referirse al peso total de una planta. Dentro de la definición de biomasa, se puede hacer una distinción entre la biomasa de una o más partes de una planta, que puede incluir cualquiera o más de lo siguiente: - partes por arriba del suelo tales como, pero no limitado a, biomasa de los brotes, biomasa de las semillas, biomasa de las hojas, etcétera; - partes cosechables por arriba del suelo tales como, pero no limitado a, biomasa de los brotes, biomasa de las semillas, biomasa de las hojas, etcétera; - partes debajo del suelo, tales como, pero no limitado a, biomasa de las raíces, tubérculos, bulbos, etcétera; - partes cosechables debajo del suelo tales como, pero no limitado a, biomasa de las raíces, tubérculos, bulbos, etcétera; - partes cosechables parcialmente insertadas en o en contacto con el suelo tales como, pero no limitado a, remolachas y otras áreas de hipocótilo de una planta, rizomas, estolones o porta injertos; - biomasa vegetativa tal como la biomasa de las raíces, la biomasa de los brotes, etcétera; - órganos reproductivos; y - propágulos tales como la semilla.

Reproducción asistida por marcador Tales programas de reproducción algunas veces requieren la introducción de variación alélica mediante el tratamiento mutagénico de las plantas, utilizando por ejemplo mutagénesis EMS; alternativamente, el programa puede iniciar con una colección de variantes alélicas del denominado origen "natural" causado involuntariamente. Posteriormente tiene lugar la identificación de las variantes alélicas, por ejemplo, mediante PCR. Esto es seguido por una etapa para la selección de variantes alélicas superiores de la secuencia en cuestión y que entregan un rendimiento incrementado. La selección típicamente se lleva a cabo monitoreando el desempeño del crecimiento de las plantas que contienen diferentes variantes alélicas de la secuencia en cuestión. El desempeño del crecimiento se puede monitorear en un invernadero o en el campo. Adicionalmente, las etapas opcionales incluyen cruzar plantas en las cuales se identificó la variante alélica superior con otra planta. Esto podría utilizarse, por ejemplo, para hacer una combinación de características fenotípicas interesantes.

Uso como sondas en (mapeo genético) El uso de ácidos nucleicos que codifican la proteína de interés para mapear genéticamente y físicamente los genes requiere sólo una secuencia de ácidos nucleicos de al menos 15 nucleótidos de longitud. Estos ácidos nucleicos se pueden utilizar como marcadores del polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP) . Las manchas Southern (Sambrook J, Fritsch EF and Maniatis T (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual) del ADN genómico de planta digerido por restricción se pueden sondear con los ácidos nucleicos que codifican la proteina de interés. Los patrones de bandas resultantes se pueden someter posteriormente a análisis genético utilizando programas de computadora tales como MapMaker (Lander et al. (1987) Genomics 1: 174-181) a fin de construir un mapa genético. Además, los ácidos nucleicos se pueden utilizar para sondear las manchas Souther que contienen ADNs genómicos tratados con endonucleasa de restricción de un conjunto de individuos que representan un progenitor y la progenie de una cruza genética definida. La segregación de los polimorfismos de ADN se nota y utiliza para calcular la posición del ácido nucleico que codifica la proteina de interés en el mapa genético previamente obtenido utilizando esta población (Botstein et al. (1980) Am. J. Hum. Genet. 32:314-331) .

La producción y el uso de sondas derivadas de genes de planta para el uso en el mapeo genético se describe en Bematzky and Tanksley (1986) Plant Mol. Biol . Repórter 4: 37- 41. Numerosas publicaciones describen el mapeo genético de clones de ADNc específicos utilizando la metodología descrita anteriormente o variaciones de la misma. Por ejemplo, para el mapeo se pueden utilizar poblaciones de intercruza F2, poblaciones de retrocruza, poblaciones apareadas aleatoriamente, líneas isogénicas cercanas y otros conjuntos de individuos. Tales metodologías son bien conocidas por aquellos expertos en el arte.

Las sondas de ácidos nucleicos también se pueden utilizar para el mapeo físico (es decir, la colocación de secuencias en los mapas físicos; véase Hoheisel et al. En: Non-mammalian Genomic Analysis: A Practical Guide, Academic press 1996, pp. 319-346, y las referencias ahi citadas) .

En otra modalidad, las sondas de ácidos nucleicos se pueden utilizar en el mapeo de hibridación in situ por fluorescencia directa (FISH) (Trask (1991) Trends Genet. 7:149-154). Aunque los métodos actuales de mapeo FISH favorecen el uso de clones grandes (varios kb a varios cientos de kb; véase Laan et al. (1995) Genome Res. 5:13-20), las mejoras en la sensibilidad pueden permitir la realización del mapeo FISH utilizando sondas más cortas.

Se puede llevar a cabo una variedad de métodos basados en la amplificación de ácidos nucleicos para el mapeo genético y físico utilizando los ácidos nucleicos. Los ejemplos incluyen la amplificación específica de alelos (Kazazian (1989) J. Lab. Clin. Med 11:95-96), polimorfismo de fragmentos amplificados por PCR (CAPS; Sheffield et al. (1993) Genomics 16:325-332), ligadura especifica de alelos (Landegren et al. (1988) Science 241:1077-1080), reacciones de extensión de nucleótidos (Sokolov (1990) Nucleic Acid Res. 18:3671), Mapeo de Híbrido por Radiación (Walter et al. (1997) Nat . Genet . 7:22-28) y Mapeo Happy (Dear and Cook (1989) Nucleic Acid Res. 17:6795-6807) . Para estos métodos, se utiliza la secuencia de un ácido nucleico para diseñar y producir pares de cebadores para el uso en la reacción de amplificación o en las reacciones de extensión de cebadores. El diseño de tales cebadores es bien conocido por aquellos expertos en el arte. En los métodos que emplean el mapeo genético basado en PCR, puede ser necesario identificar las diferencias de secuencias de ADN entre los progenitores de la cruza por mapeo en la región correspondiente a la presente secuencia de ácidos nucleicos. Sin embargo, generalmente no es necesario para los métodos de mapeo .

Planta Según se utiliza aquí, el término "planta" abarca plantas enteras, antecesores y progenie de las plantas y partes de plantas, incluyendo semillas, brotes, tallos, hojas, raíces (incluyendo tubérculos), flores, y tejidos y órganos, en donde cada uno de los antes mencionados comprende el gen/ácido nucleico de interés. El término "planta" también abarca células de plantas, cultivos en suspensión, tejidos de callos, embriones, regiones meristemáticas, gametofitos, esporofitos, polen y microesporas , nuevamente en donde cada uno de los antes mencionados comprende el gen/ácido nucleico de interés.

Las plantas que son particularmente útiles en los métodos de la invención incluyen todas las plantas que pertenecen a la superfamilia Viridiplantae, en particular, plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas, incluyendo forraje o legumbres forrajeras, plantas ornamentales, cultivos para alimentación, árboles o arbustos seleccionados de la lista que comprende Acer spp., Actinidia spp., Abelmoschus spp., Agave sisalana, Agropyron spp., Agrostis stolonifera, Allium spp., Ama.ra.nth.us spp., Ammophila arenaria, Ananas comosus, Annona spp., Apium graveolens , Arachis spp, Artocarpus spp., Asparagus officinalis, Avena spp. (por ejemplo, Avena sativa, Avena fatua, Avena byzantina , Avena fatua var. sativa, Avena hybrida) , Averrhoa carambola, Bambusa sp. , Benincasa hispida, Bertholletia excelsea , Beta vulgaris , Brassica spp. (por ejemplo, Brassica napus, Brassica rapa ssp. [cañóla, colza oleaginosa, nabo]), Cadaba farinosa, Camellia sinensis, Canna indica, Cannabis sativa, Capsicum spp., Carex elata, Carica papaya, Carissa macrocarpa, Carya spp., Carthamus tinctorius, Castanea spp., Ceiba pentandra, Cichorium endivia , Cinnamomum spp., Citrullus lanatus, Citrus spp., Cocos spp., Coffea spp., Colocasia esculenta, Cola spp., Corchorus sp. , Coriandrum sativum, Corylus spp., Crataegus spp., Crocus sativus, Cucúrbita spp., Cucumis spp., Cynara spp., Daucus carota, Desmodium spp., Dimocarpus longan, Dioscorea spp., Diospyros spp., Echinochloa spp., Elaeis (por ejemplo, Elaeis guineensis, Elaeis oleífera) , Eleusine coracana, Eragrostis tef, Erianthus sp. , Eriobotrya japónica, Eucalyptus sp. , Eugenia uniflora, Fagopyrum spp., Fagus spp., Festuca arundinacea, Ficus carica, Fortunella spp., Fragaria spp., Ginkgo biloba, Glycine spp. (por ejemplo, Glycine max, Soja hispida o Soja max), Gossypium hirsutum, Helianthus spp. (por ejemplo, Helianthus annuus) , Hemerocallis fulva, Hibiscus spp., Hordeum spp. (por ejemplo, Hordeum vulgare) , Ipomoea batatas, Juglans spp., Lactuca sativa, Lathyrus spp., Lens culinaris, Linum usitatissimum , Litchi chinensis, Lotus spp., Luffa acutangula, Lupinus spp., Luzula sylvatica, Lycopersicon spp. (por ejemplo, Lycopersicon esculentum, Lycopersicon lycopersicum , Lycopersicon pyriforme) , Macrotyloma spp., Malus spp., Malpighia emarginata, Mammea americana, Mangifera indica, Manihot spp., Manilkara zapota, Medicago sativa, Melilotus spp., Mentha spp., Miscanthus sinensis, Momordica spp., Morus nigra, Musa spp., Nicotiana spp., Olea spp., Opuntia spp., Ornithopus spp., Oryza spp. (por ejemplo, Oryza sativa, Oryza latifolia) , Panicum miliaceum , Panicum virgatum, Passiflora edulis, Pastinaca sativa, Pennisetum sp. , Persea spp., Petroselinum crispum, Phalaris arundinacea, Phaseolus spp., Phleum pratense, Phoenix spp., Phragmites australis, Physalis spp., Pinus spp., Pistacia vera, Pisum spp., Poa spp., Populus spp., Prosopis spp., Prunus spp., Psidium spp., Púnica granatum, Pyrus communis, Quercus spp., Raphanus sativus, Rheum rhabarba um , Ribes spp., Ricinus communis, Rubus spp., Saccharum spp., Salix sp., Sambucus spp., Sécale cereale, Sesamum spp., Sinapis sp., Solanum spp. (por ejemplo, Solanum tuberosum , Solanum integrifolium o Solanum lycopersicum) , Sorghum bicolor, Spinacia spp., Syzygium spp., Tagetes spp., Tamarindus indica, Theobroma cacao, Trifolium spp., Tripsacum dactyloides, Triticosecale rimpaui, Triticum spp. (por ejemplo, Triticum aestívum, Triticum durum, Triticum turgidum, Triticum hybernum, Triticum macha, Triticum sativum, Triticum monococcum o Triticum vulgare) , Tropaeolum minus, Tropaeolum majus, Vaccinium spp., Vicia spp., Vigna spp., Viola odorata, Vitis spp., Zea mays , Zizania palustris, Ziziphus spp., entre otros.

Con respecto a las secuencias de la invención, una secuencia de polipéptidos o ácidos nucleicos de origen de planta tiene la característica de un uso de codón optimizado para la expresión en plantas, y del uso de aminoácidos y sitios reguladores comunes en plantas, respectivamente. La planta de origen puede ser cualquier planta, pero preferiblemente aquellas plantas según se describe en el párrafo anterior.

Planta (s) de Control La elección de las plantas de control adecuadas es una parte rutinaria en la preparación experimental y puede incluir las plantas de tipo salvaje correspondientes o las plantas correspondientes sin el gen de interés. La planta de control es típicamente de la misma especie de planta o incluso de la misma variedad que la planta a ser evaluada. La planta de control también puede ser una nulicigoto de la planta a ser evaluada. Los nulicigotos (también denominados plantas de control nulas) son individuos que carecen del trasngen por segregación. Además, una planta de control ha sido cultivada bajo condiciones de cultivo iguales a las condiciones de cultico de plantas de la invención. Típicamente, la planta de control se cultiva bajo iguales condiciones de cultivo y, por lo tanto, cerca de las plantas de la invención y al mismo tiempo. Según se utiliza aquí, una "planta de control" se refiere no sólo a plantas enteras, sino también a partes de planta, incluyendo semillas y partes de semillas.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Sorprendentemente, se ha encontrado ahora que modular la expresión, en una planta, de un ácido nucleico que codifica a un polipéptido POI produce plantas que tienen rasgos mejorados relacionados al rendimiento, con relación a las plantas de control .

De acuerdo con una primera modalidad, la presente invención proporciona un método para mejorar los rasgos relacionados al rendimiento en plantas con relación a las plantas de control, que comprende modular la expresión, en una planta, de un ácido nucleico que codifica un polipéptido POI y opcionalmente seleccionar plantas que tienen rasgos relacionados al rendimiento mejorados. De acuerdo con otra modalidad, la presente invención proporciona un método para producir plantas que tienen rasgos relacionados al rendimiento mejorados con relación a las plantas de control, en donde dicho método comprende las etapas de modular la expresión en dicha planta de un ácido nucleico que codifica un polipéptido POI según se describe aqui y opcionalmente seleccionar plantas que tienen rasgos relacionados al rendimiento mejorados.

Un método preferido para modular (preferiblemente, incrementar) la expresión de un ácido nucleico que codifica un polipéptido POI es introduciendo y expresando, en una planta, un ácido nucleico que codifica un polipéptido POI.

Cualquier referencia a partir de ahora a una "proteína útil en los métodos de la invención" significa un polipéptido POI, según se define aquí. Cualquier referencia a partir de ahora a un "ácido nucleico útil en los métodos de la invención" significa un ácido nucleico capaz de codificar tal polipéptido POI. El ácido nucleico a ser introducido en una planta (y, por lo tanto, útil en realizar los métodos de la invención) es cualquier ácido nucleico que codifique el tipo de proteína que se describirá ahora, en adelante también denominado "ácido nucleico POI" o "gen POI".

Un "polipéptido POI" según se define aquí se refiere a cualquier polipéptido chaperón análogo a DnaJ, preferiblemente a cualquier secuencia provista por el SEQ ID NO en las columna 5 o 7 de la Tabla II o codificada por un polinucleótido según se representa por los SEQ ID NOs en la columna 5 y 7 de la Tabla I, u homólogos de la misma.

En una modalidad el polipéptido chaperón análogo a DnaJ útil en los procesos de la invención comprende los tres dominios PFAM DnaJ (PF00226), DnaJ_C (PF01556) (DnaJ_C = DnaJ dominio C terminal) y dominio central DnaJ DnaJ_CXXCXGXG (PF00684) (de acuerdo con la base de datos PFAM versión 25.0 (publicada en Marzo de 2011) del Welcome Trust SANGER Institute, Hinxton, Inglaterra, Reino Unido (http://pfam.sanger.ac.uk /).

En otra modalidad, el polipéptido chaperón análogo a DnaJ comprende uno o más de los patrones de consenso mostrados en los SEQ ID NOs: 45, 46 y 47.

En una modalidad preferida, el polipéptido chaperón análogo a DnaJ comprende los aminoácidos en las posiciones 6 a 67, 143 a 208 y 265 a 348 de YNL064C (SEQ ID NO: 2).

El término "POI" o "polipéptido POI" según se utiliza aqui también pretenden incluir los homólogos, según se define a continuación, del "polipéptido POI", es decir, los polipéptidos chaperones análogos a DnaJ según se define aqui y los homólogos según se define a continuación.

Adicionalmente o alternativamente, el homólogo de una proteina POI, es decir, el polipéptido chaperón análogo a DnaJ tiene en orden creciente de preferencia al menos 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad de secuencia global al aminoácido representado por el SEQ ID NO: 2 o 42, preferiblemente por el SEQ ID NO: 2, siempre que la proteina homologa comprenda cualquiera o más de los dominios PFAM conservados según se esboza anteriormente, preferiblemente al menos y más preferiblemente los tres dominios PFAM según se esboza anteriormente. La identidad de secuencia global se determina utilizando un algoritmo de alineación global, tal como el algoritmo de Needleman Wunsch en el programa GAP (GCG Wisconsin Package, Accelrys) , preferiblemente, con parámetros predeterminados y, preferiblemente, con secuencias de proteínas maduras (es decir, sin considerar las señales de secreción o los péptidos de tránsito) .

En una modalidad, el nivel de identidad de secuencia se determina mediante la comparación de las secuencias de polipéptidos sobre la longitud completa de la secuencia de SEQ ID NO: 2 o 42, preferiblemente SEQ ID NO: 2.

En otra modalidad, el nivel de identidad de secuencia de una secuencia de ácidos nucleicos se determina mediante la comparación de la secuencia de ácidos nucleicos sobre la longitud completa de la secuencia codificante de la secuencia de SEQ ID NO: 1 o 41, preferiblemente SEQ ID NO: 1.

En otra modalidad, se proporciona un método en donde dicho polipéptido chaperon análogo a DnaJ comprende una parte de secuencia con al menos 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad de secuencia a cualquiera de los patrones de consenso representados por la secuencia de SEQ ID NO: 45, 46 o 47. En una modalidad preferida, el polipéptido chaperon análogo a DnaJ comprende partes de secuencia con al menos 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad de secuencia a los tres patrones de consenso representados por la secuencia de SEQ ID NO: 45, 46 o 47.

En otra modalidad, se proporciona un método en donde dicho polipéptido chaperon análogo a DnaJ comprende un dominio conservado (o secuencia recurrente) con al menos 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad de secuencia al dominio conservado que inicia con el aminoácido 6 hasta el aminoácido 67 y/o al dominio conservado que inicia con el aminoácido 143 hasta el aminoácido 208 y/o al dominio conservado que inicia con el aminoácido 265 hasta el aminoácido 348 en el SEQ ID NO: 2.

Los términos "dominio", "signatura" y "secuencia recurrente" se definen en la sección de "definiciones" aquí.

En una modalidad, los polipéptidos chaperones análogos a DnaJ empleados en los métodos, constructos, plantas, partes cosechables y productos de la invención son chaperones análogos a DnaJ pero excluyendo los chaperones análogos a DnaJ de las secuencias divulgadas en el SEQ ID NO: 42.

Preferiblemente, la secuencia de polipéptidos que, cuando se utiliza en la construcción de un árbol filogenético, se agrupa con el grupo de polipéptidos chaperones análogos a DnaJ que comprenden la secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 2 y/o 42, preferiblemente 2 en vez de con cualquier otro grupo. En otra modalidad, los polipéptidos de la invención, cuando se utilizan en la construcción de un árbol filogenético, agrupan no más que 4, 3, o 2 puntos de ramificación jerárquicos lejos de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 y/o 42, preferiblemente 2.

Adicionalmente, los polipéptidos chaperones análogos a DnaJ (al menos en su forma nativa) típicamente tienen actividad de chaperón. Las herramientas y las técnicas para medir la actividad de chaperón son bien conocidas en el arte.

Además, los polipéptidos chaperones análogos a DnaJ, cuando se expresan en plantas tales como Arabidopsis de acuerdo con los métodos de la presente invención según se esboza en los Ejemplos 8 y 9, producen plantas que tienen rasgos relacionados al rendimiento incrementado, en particular bajo condiciones de estrés, más preferiblemente bajo condiciones de limitación de agua, más preferiblemente bajo condiciones de estrés por sequía, y/o dan como resultado la producción incrementada de un químico fino según se lista en la Tabla FC.

Una modalidad adicional de la presente invención se refiere a métodos para incrementar el contenido de cualquiera o más de los químicos finos listados en la Tabla FC en plantas comparadas a las plantas de control y para mejorar simultáneamente los rasgos relacionados al rendimiento en plantas bajo condiciones de estrés medioambiental y/o condiciones sin estrés en plantas con relación a las plantas de control, que comprenden modular la expresión, en una planta, de los ácidos nucleicos que codifican un chaperón análogo a DnaJ según se define anteriormente. En una modalidad, los métodos de la invención son métodos para incrementar el contenido de cualquiera o más de los químicos finos listados en la Tabla FC en plantas comparadas a las plantas de control y para mejorar al mismo tiempo los rasgos relacionados al rendimiento en plantas bajo condiciones de estrés medioambiental abiótico, preferiblemente bajo condiciones de disponibilidad de agua limitada, más preferiblemente bajo condiciones de sequía, en plantas con relación a las plantas de control, que comprenden modular la expresión, en una planta, de los ácidos nucleicos que codifican un chaperón análogo a DnaJ según se define anteriormente. En otra modalidad, los métodos de la invención son para incrementar el contenido de cualquiera o más de los químicos finos listados en la Tabla FC en plantas comparadas a las plantas de control y para mejorar al mismo tiempo los rasgos relacionados al rendimiento en plantas bajo condiciones sin estrés en plantas con relación a las plantas de control, que comprenden modular la expresión, en una planta, de los ácidos nucleicos que codifican un chaperón análogo a DnaJ según se define anteriormente. En otra modalidad, los métodos de la invención modulan la expresión de dichos ácidos nucleicos que codifican un chaperón análogo a DnaJ según se define anteriormente introduciendo y expresando dichos ácidos nucleicos, preferiblemente introduciendo y expresando dichos ácidos nucleicos por medios biotecnológicos como ácidos nucleicos recombinantes , preferiblemente mediante integración estable en el genoma de la planta.

La presente invención se ilustra transformando plantas con la secuencia de ácidos nucleicos representada por el SEQ ID NO: 1, que codifica la secuencia de polipéptidos de SEQ ID NO: 2. Sin embargo, la función de la invención no está restringida a estas secuencias; los métodos de la invención ventajosamente se pueden realizar utilizando cualquier ácido nucleico que codifique el chaperón análogo a DnaJ o polipéptido chaperón análogo a DnaJ según se define aquí.

Los ejemplos de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos chaperones análogos a DnaJ se proporcionan en la Tabla II. Tales ácidos nucleicos son útiles al realizar los métodos de la invención. Las secuencias de aminoácidos proporcionadas en la Tabla II de la sección de Ejemplos son secuencias de ejemplo de ortólogos y parálogos del polipéptido chaperón análogo a DnaJ representado por el SEQ ID NO: 2 o 42, preferiblemente por el SEQ ID NO: 2, los términos "ortólogos" y "parálogos" siendo según se define aqui . Ortólogos y parálogos adicionales pueden ser identificados fácilmente realizando una denominada búsqueda blast reciproca según se describe en la sección de definiciones; donde la secuencia de consulta es SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, la segunda BLAST (BLAST hacia atrás) seria contra secuencias de Saccharomyces cerevisiae .

De acuerdo con una modalidad adicional de la presente invención, se proporciona por consiguiente una molécula de ácido nucleico aislada útil en los métodos, procesos, usos seleccionados a partir de: (i) un ácido nucleico representado por SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39 o 41; (ii) el complemento de un ácido nucleico representado por SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39 o 41; (iii) un ácido nucleico que codifica un polipéptido chaperón análogo a DnaJ que tiene en orden creciente de preferencia al menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad de secuencia a la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40 o 42 y que adicionalmente comprende uno o más dominios que tienen en orden creciente de preferencia al menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia a cualquiera o más de los dominios PFAM PF00226, PF01556 y PF00684, preferiblemente al dominio conservado que inicia con el aminoácido 6 hasta el aminoácido 67 y/o al dominio conservado que inicia con el aminoácido 143 hasta el aminoácido 208 y/o al dominio conservado que inicia con el aminoácido 265 hasta el aminoácido 348 en el SEQ ID NO: 2, y adicionalmente preferiblemente que confiere rasgos relacionados al rendimiento mejorados con relación a las plantas de control bajo condiciones de estrés, preferiblemente bajo condiciones de estrés medioambiental abiótico según se define aquí, y/o contenido incrementado de químicos finos de uno o más químicos finos según se lista en la Tabla FC. (iv) un ácido nucleico que codifica un polipéptido chaperón análogo a DnaJ que comprende uno o más, preferiblemente a los tres patrones de consenso de SEQ ID NO: 45, 46 y 47 y adicionalmente preferiblemente que confiere rasgos relacionados al rendimiento mejorados con relación a las plantas de control bajo condiciones de estrés, preferiblemente bajo condiciones de estrés medioambiental abiótico según se define aquí, y/o contenido incrementado de químicos finos de uno o más químicos finos según se lista en la Tabla FC; (v) una molécula de ácido nucleico que híbrida con una molécula de ácido nucleico de (i) a (iii) bajo condiciones de hibridación de alta severidad y preferiblemente confiere rasgos relacionados al rendimiento mejorados con relación a las plantas de control bajo condiciones de estrés, preferiblemente bajo condiciones de estrés medioambiental abiótico según se define aquí, y/o contenido incrementado de químicos finos de uno o más químicos finos según se lista en la Tabla FC.

De acuerdo con una modalidad adicional de la presente invención, también se proporciona un polipéptido aislado seleccionado a partir de: (i) una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: Y; (ii) una secuencia de aminoácidos que tiene, en orden creciente de preferencia, al menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad de secuencia a la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40 o 42, y que adicionalmente comprende uno o más dominios que tienen en orden creciente de preferencia al menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más identidad de secuencia a cualquiera o más de los dominios PFA PF00226, PF01556 y PF00684, preferiblemente al dominio conservado que inicia con el aminoácido 6 hasta el aminoácido 67 y/o al dominio conservado que inicia con el aminoácido 143 hasta el aminoácido 208 y/o al dominio conservado que inicia con el aminoácido 265 hasta el aminoácido 348 en el SEQ ID NO: 2, y adicionalmente preferiblemente que confiere rasgos relacionados al rendimiento mejorados con relación a las plantas de control bajo condiciones de estrés, preferiblemente bajo condiciones de estrés medioambiental abiótico según se define aquí, y/o condiciones sin estrés, y/o contenido incrementado de químicos finos de uno o más químicos finos según se lista en la Tabla FC; (iii) un ácido nucleico que codifica un polipéptido chaperón análogo a DnaJ que comprende uno o más, preferiblemente a los tres patrones de consenso de SEQ ID NO: 45, 46 y 47 y adicionalmente preferiblemente que confiere rasgos relacionados al rendimiento mejorados con relación a las plantas de control bajo condiciones de estrés, preferiblemente bajo condiciones de estrés medioambiental abiótico según se define aquí, y/o condiciones sin estrés, y/o contenido incrementado de químicos finos de uno o más químicos finos según se lista en la Tabla FC; (iv) derivados de cualquiera de las secuencias de aminoácidos proporcionadas en (i) o (ii) anteriores.

Las variantes de ácido nucleico también pueden ser útiles al practicar los métodos de la invención. Ejemplos de tales variantes incluyen ácidos nucleicos que codifican homólogos y derivados de cualquiera de las secuencias de aminoácidos proporcionadas en la Tabla II de la sección de Ejemplos, en donde los términos "homólogo" y "derivado" son como se define aquí. También son útiles en los métodos de la invención los ácidos nucleicos que codifican homólogos y derivados de ortólogos o parálogos de cualquiera de las secuencias de aminoácidos proporcionadas en la Tabla II de la sección de Ejemplos. Los homólogos y derivados útiles en los métodos de la presente invención tienen sustancialmente la misma actividad biológica y funcional que la proteína no modificada a partir de la cual se derivan. Variantes adicionales útiles al practicar los métodos de la invención son las variantes en las cuales se optimiza el uso del codón o en las cuales se remueven los sitios objetivos de miARN .

Variantes de ácidos nucleicos adicionales útiles al practicar los métodos de la invención incluyen porciones de ácidos nucleicos que codifican polipeptidos chaperones análogos a DnaJ, ácidos nucleico que hibridan a ácidos nucleicos que codifican polipéptidos chaperones análogos a DnaJ, variantes de empalme de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos chaperones análogos a DnaJ, variantes alélicas de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos chaperones análogos a DnaJ y variantes de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos chaperones análogos a DnaJ obtenidas mediante rearreglo por mezclado de genes. Los términos secuencia de hibridación, variante de empalme, variante alélica y rearreglo por mezclado de genes son como se describe aquí.

En una modalidad de la presente invención la función de las secuencias de ácidos nucleicos de la invención es conferir información para una proteina que incrementa el rendimiento o los rasgos relacionados al rendimiento, cuando una secuencia de ácidos nucleicos de la invención se trascribe y traduce en una célula de planta viva.

Los ácidos nucleicos que codifican polipéptidos chaperones análogos a DnaJ no necesitan ser ácidos nucleicos de longitud completa, debido a que la realización de los métodos de la invención no se basa en el uso de secuencias de ácidos nucleicos de longitud completa. De acuerdo con la presente invención, se proporciona un método para mejorar los rasgos relacionados al rendimiento en plantas, que comprende introducir y expresar, en una planta, una porción de cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos dadas en la Tabla ? de la sección de Ejemplos, o una porción de un ácido nucleico que codifica un ortólogo, parálogo u homólogo de cualquiera de las secuencias de aminoácidos dadas en la Tabla II de la sección de Ejemplos.

Una porción de un ácido nucleico se puede preparar, por ejemplo, haciendo una o más deleciones al ácido nucleico. Las porciones se pueden utilizar en forma aislada o se pueden fusionar a otras secuencias codificantes (o no codificantes) a fin de, por ejemplo, producir una proteina que combine varias actividades. Cuando se fusionan a otras secuencias codificantes, el polipéptido resultante producido tras la traducción puede ser mayor que aquel predicho para la porción de proteína.

Las porciones útiles en los métodos de la invención, codifican un polipéptido chaperón análogo a DnaJ según se define aquí, y tienen sustancialmente la misma actividad biológica que las secuencias de aminoácidos dadas en la Tabla II de la sección de Ejemplos. Preferiblemente, la porción es una porción de cualquiera de los ácidos nucleicos dados en la Tabla I de la sección de Ejemplos, o es una porción de un ácido nucleico que codifica un ortólogo o parálogo de cualquiera de las secuencias de aminoácidos dadas en la Tabla II de la sección de Ejemplos. Preferiblemente, la porción es de al menos 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300 nucleótidos consecutivos de longitud, los nucleótidos consecutivos siendo de cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos dadas en la Tabla I de la sección de Ejemplos, o de un ácido nucleico que codifica un ortólogo o parálogo de cualquiera de las secuencias de aminoácidos dadas en la Tabla II de la sección de Ejemplos. Más preferiblemente, la porción es una porción del ácido nucleico de SEQ ID NO: 1. Preferiblemente, la porción codifica un fragmento de una secuencia de aminoácidos que, cuando se utiliza en la construcción de un árbol filogenético, se agrupa con el grupo de polipéptidos chaperones análogos a DnaJ que comprenden la secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 2 o 42, preferiblemente por el SEQ ID NO: 2 en vez de con cualquier otro grupo, y/o comprende los dominios PFAM PF00226, PF01556 y PF00684, o uno o más, preferiblemente los tres patrones de consenso según se proporciona en el SEQ ID NO: 45, 46 y 47, preferiblemente comprende el dominio conservado que inicia con el aminoácido 6 hasta el aminoácido 67 y/o el dominio conservado que inicia con el aminoácido 143 hasta el aminoácido 208 y/o el dominio conservado que inicia con el aminoácido 265 hasta el aminoácido 348 en el SEQ ID NO: 2 Otra variante de ácido nucleico útil en los métodos de la invención es un ácido nucleico capaz de hibridación, bajo condiciones de severidad reducida, preferiblemente bajo condiciones rigurosas, con un ácido nucleico que codifica un polipéptido chaperón análogo a DnaJ según se define aquí, o con una porción según se define aquí.

De acuerdo con la presente invención, se proporciona un método para mejorar los rasgos relacionados al rendimiento en plantas, que comprende introducir y expresar, en una planta, un ácido nucleico capaz de hibridar a cualquiera de los ácidos nucleicos dados en la Tabla I de la sección de Ejemplos, o que comprende introducir y expresar, en una planta, un ácido nucleico capaz de hibridar a un ácido nucleico que codifica un ortólogo, parálogo u homólogo de cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos dadas en la Tabla A de la sección de Ejemplos .

Las secuencias de hibridación útiles en los métodos de la invención codifican un polipéptido chaperón análogo a DnaJ según se define aquí, que tiene sustancialmente la misma actividad biológica que las secuencias de aminoácidos dadas en la Tabla II de la sección de Ejemplos. Preferiblemente, la secuencia de hibridación es capaz de hibridar al complemento de cualquiera de los ácidos nucleicos dados en la Tabla I de la sección de Ejemplos, o a una porción de cualquiera de estas secuencias, una porción siendo como se define anteriormente, o la secuencia de hibridación es capaz de hibridar al complemento de un ácido nucleico que codifica un ortólogo o parálogo de cualquiera de las secuencias de aminoácidos dadas en la Tabla II de la sección de Ejemplos. Más preferiblemente, la secuencia de hibridación es capaz de hibridar al complemento de un ácido nucleico según se representa por el SEQ ID NO: 1 o 41, preferiblemente por el SEQ ID NO: l o a una porción del mismo.

Preferiblemente, la secuencia de hibridación codifica un polipéptido con una secuencia de aminoácidos que, cuando es de longitud completa y se utiliza en la construcción de un árbol filogenético, se agrupa con el grupo de polipéptidos chaperones análogos a DnaJ que comprenden la secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 2 o 42, preferiblemente por el SEQ ID NO: 2 en vez de con cualquier otro grupo, y/o comprende los dominios PFAM PF00226, PF01556 y PF00684, o uno o más, preferiblemente los tres patrones de consenso según se proporciona en el SEQ ID NO: 45, 46 y 47, preferiblemente comprende el dominio conservado que inicia con el aminoácido 6 hasta el aminoácido 67 y/o el dominio conservado que inicia con el aminoácido 143 hasta el aminoácido 208 y/o el dominio conservado que inicia con el aminoácido 265 hasta el aminoácido 348 en el SEQ ID NO: 2 En una modalidad, la secuencia de hibridación es capaz de hibridar al complemento de un ácido nucleico según se representa por el SEQ ID NO: 1 o 41, preferiblemente por el SEQ ID NO: l o a una porción del mismo bajo condiciones de severidad media o alta, preferiblemente severidad alta según se define anteriormente. En otra modalidad, la secuencia de hibridación es capaz de hibridar al complemento de un ácido nucleico según se representa por el SEQ ID NO: 1 o 41, preferiblemente por el SEQ ID NO: 1 bajo condiciones rigurosas .

Otra variante de ácido nucleico útil en los métodos de la invención es una variante de empalme que codifica un polipéptido chaperón análogo a DnaJ según se define aquí anteriormente, una variante de empalme siendo como se define aquí .

De acuerdo con la presente invención, se proporciona un método para mejorar los rasgos relacionados al rendimiento en plantas, que comprende introducir y expresar, en una planta, una variante de empalme de cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos dadas en la Tabla A de la sección de Ejemplos, o una variante de empalme de un ácido nucleico que codifica un ortólogo, parálogo u homólogo de cualquiera de las secuencias de aminoácidos dadas en la Tabla II de la sección de Ejemplos.

Las variantes de empalme preferidas son variantes de empalme de un ácido nucleico representado por el SEQ ID NO: 1 o 41, preferiblemente por el SEQ ID NO: 1, o una variante de empalme de un ácido nucleico que codifica un ortólogo o parálogo de SEQ ID NO: 2. Preferiblemente, la secuencia de aminoácidos codificada por la variante de empalme, cuando se utiliza en la construcción de un árbol filogenético, se agrupa con el grupo de polipéptidos chaperones análogos a DnaJ que comprenden la secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 2 o 42, preferiblemente por el SEQ ID NO: 2 en vez de con cualquier otro grupo y/o comprende los dominios PFAM PF00226, PF01556 y PF00684, o uno o más, preferiblemente los tres patrones de consenso según se proporciona en el SEQ ID NO: 45, 46 y 47, preferiblemente comprende el dominio conservado que inicia con el aminoácido 6 hasta el aminoácido 67 y/o el dominio conservado que inicia con el aminoácido 143 hasta el aminoácido 208 y/o el dominio conservado que inicia con el aminoácido 265 hasta el aminoácido 348 en el SEQ ID NO: 2 Otra variante de ácido nucleico útil al realizar los métodos de la invención es una variante alélica de un ácido nucleico que codifica un polipéptido chaperón análogo a DnaJ según se define aquí anteriormente, una variante alélica siendo como se define aquí.

De acuerdo con la presente invención, se proporciona un método para mejorar los rasgos relacionados al rendimiento en plantas, que comprende introducir y expresar, en una planta, una variante alélica de cualquiera de los ácidos nucleicos dados en la Tabla I de la sección de Ejemplos, o que comprende introducir y expresar, en una planta, una variante alélica de un ácido nucleico que codifica un ortólogo, parálogo u homólogo de cualquiera de las secuencias de aminoácidos dadas en la Tabla II de la sección de Ejemplos.

Los polipéptidos codificados por las variantes alélicas útiles en los métodos de la presente invención tienen sustancialmente la misma actividad biológica que el polipéptido chaperón análogo a DnaJ de SEQ ID NO: 2 y cualquiera de los aminoácidos representados en la Tabla A de la sección de Ejemplos. Las variantes alélicas existen en la naturaleza, y el uso de estos alelos naturales está comprendido dentro de los métodos de la presente invención. Preferiblemente, la variante alélica es una variante alélica de SEQ ID NO: l o una variante alélica de un ácido nucleico que codifica un ortólogo o parálogo de SEQ ID NO: 2.

Preferiblemente, la secuencia de aminoácidos codificada por la variante alélica, cuando se utiliza en la construcción de un árbol filogenético, se agrupa con los polipéptidos chaperones análogos a DnaJ que comprenden la secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 2 o 42, preferiblemente por el SEQ ID NO: 2 en vez de con cualquier otro grupo y/o comprende los dominios PFAM PF00226, PF01556 y PF00684, o uno o más, preferiblemente los tres patrones de consenso según se proporciona en el SEQ ID NO: 45, 46 y 47, preferiblemente comprende el dominio conservado que inicia con el aminoácido 6 hasta el aminoácido 67 y/o el dominio conservado que inicia con el aminoácido 143 hasta el aminoácido 208 y/o el dominio conservado que inicia con el aminoácido 265 hasta el aminoácido 348 en el SEQ ID NO: 2 El re-arreglo por mezclado de genes o la evolución dirigida también se puede utilizar para generar variantes de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos chaperones análogos a DnaJ según se define anteriormente; el término "rearreglo por mezclado de genes" siendo como se define aquí.

De acuerdo con la presente invención, se proporciona un método para mejorar los rasgos relacionados al rendimiento en plantas, que comprende introducir y expresar, en una planta, una variante de cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos dadas en la Tabla A de la sección de Ejemplos, o que comprende introducir y expresar, en una planta, una variante de un ácido nucleico que codifica un ortólogo, parálogo u homólogo de cualquiera de las secuencias de aminoácidos dadas en la Tabla II de la sección de Ejemplos, cuyo ácido nucleico variante se obtiene por re-arreglo por mezclado de genes.

Preferiblemente, la secuencia de aminoácidos codificada por el ácido nucleico variante obtenido mediante re-arreglo por mezclado de genes, cuando se utiliza en la construcción de un árbol filogenético, se agrupa con el grupo de polipéptidos chaperones análogos a DnaJ que comprenden la secuencia de aminoácidos representada por el SEQ ID NO: 2 o 42, preferiblemente por el SEQ ID NO: 2 en vez de con cualquier otro grupo y/o comprende los dominios PFAM PF00226, PF01556 y PF00684, o uno o más, preferiblemente los tres patrones de consenso según se proporciona en el SEQ ID NO: 45, 46 y 47, preferiblemente comprende el dominio conservado que inicia con el aminoácido 6 hasta el aminoácido 67 y/o el dominio conservado que inicia con el aminoácido 143 hasta el aminoácido 208 y/o el dominio conservado que inicia con el aminoácido 265 hasta el aminoácido 348 en el SEQ ID NO: 2 Además, las variantes de ácido nucleico también se pueden obtener mediante mutagénesis dirigida al sitio. Varios métodos están disponibles para lograr la mutagénesis dirigida al sitio, los más comunes siendo los métodos basados en PCR (Current Protocols in Molecular Biology. iley Eds . ) .

Los ácidos nucleicos que codifican polipéptidos chaperones análogos a DnaJ se pueden derivar a partir de cualquier fuente natural o artificial. El ácido nucleico se puede modificar a partir de su forma nativa en la composición y/o el ambiente genómico a través de manipulación humana deliberada. Preferiblemente el ácido nucleico que codifica el polipéptido chaperón análogo a DnaJ es de una levadura o una planta, adicionalmente preferiblemente de una planta monocotiledónea o una levadura Saccharomyces, más preferiblemente el ácido nucleico es de Oryza sativa o Saccharomyces cerevisiae, más preferiblemente de Saccharomyces cerevisiae .

En otra modalidad, la presente invención se extiende al ADN cromosomico recombinante que comprende una secuencia de ácidos nucleicos útil en los métodos de la invención, en donde dicho ácido nucleico está presente en el ADN cromosomico como resultado de los métodos recombinantes, es decir, dicho ácido nucleico no está en el ADN cromosómico en su entorno nativo. Dicho ADN cromosómico recombinante puede ser un cromosoma de origen nativo, con dicho ácido nucleico insertado por medios recombinantes, o puede ser, por ejemplo, un mini-cromosoma o una estructura cromosómica no nativa o un cromosoma artificial. La naturaleza del ADN cromosómico puede variar, en tanto permita el paso estable a las generaciones sucesivas del ácido nucleico recombinante útil en los métodos de la invención, y permita la expresión de dicho ácido nucleico en una célula de planta viva dando como resultado un rendimiento incrementado o los rasgos relacionados al rendimiento incrementado de la célula de planta o una planta que comprende la célula de planta.

En una modalidad adicional, el ADN cromosómico recombinante de la invención está comprendido en una célula de planta .

La realización de los métodos de la invención produce plantas que tienen rasgos relacionados al rendimiento mejorados bajo condiciones de estrés medioambiental abiótico y/o condiciones sin estrés, y/o contenido incrementado de cualquiera o más de los químicos finos listados en la Tabla FC con relación a las plantas de control. En particular, la realización de los métodos de la invención produce plantas que tienen rendimiento incrementado, especialmente biomasa y/o rendimiento de semilla incrementado con relación a las plantas de control, bajo condiciones de estrés medioambiental abiótico y/o condiciones sin estrés, preferiblemente bajo condiciones de disponibilidad de agua limitada, más preferiblemente bajo condiciones de sequía, y/o contenido incrementado de cualquiera o más de los químicos finos listados en la Tabla FC con relación a las plantas de control. Los términos "rendimiento" y "rendimiento de semilla" y "biomasa" se describen en más detalle en la sección de "Definiciones" en la presente.

La referencia aquí a los rasgos relacionados al rendimiento mejorados se interpreta como un incremento en el vigor temprano y/o en la biomasa (peso) de una o más partes de una planta, que puede incluir (i) partes por arriba del suelo y preferiblemente partes cosechables por arriba del suelo y/o (ii) partes debajo del suelo y preferiblemente cosechables debajo del suelo. En particular, tales partes cosechables son raices tales como raices primarias, tallos, remolachas, hojas, flores o semillas, y la realización de los métodos de la invención da como resultado plantas que tienen rendimiento de semilla incrementado con relación al rendimiento de semilla de las plantas de control, y/o biomasa de tallo incrementada con relación a la biomasa de tallo de las plantas de control, y/o biomasa de raíz incrementada con relación a la biomasa de raíz de las plantas de control y/o biomasa de remolacha incrementada con relación a la biomasa de remolacha de las plantas de control. Además, se contempla particularmente que el contenido de azúcar (en particular el contenido de sacarosa) en el tallo (en particular de las plantas de caña de azúcar) y/o en la raíz (en particular en las remolachas azucareras) se incrementa con relación al contenido de azúcar (en particular el contenido de sacarosa) en el tallo y/o en la raíz de la planta de control.

La presente invención proporciona un método para incrementar el rendimiento - los rasgos relacionados al rendimiento, especialmente la biomasa y/o el rendimiento de semilla de plantas, con relación a las plantas de control, bajo condiciones de estrés, preferiblemente bajo condiciones de estrés medioambiental abiótico según se define aquí, y/o condiciones sin estrés, preferiblemente bajo condiciones de disponibilidad de agua limitada, más preferiblemente bajo condiciones de sequía, y/o el contenido incrementado de cualquiera o más de los químicos finos listados en la Tabla FC con relación a las plantas de control; cuyo método comprende modular la expresión, en una planta, de un ácido nucleico que codifica un polipéptido chaperón análogo a DnaJ según se define aquí.

De acuerdo con una característica preferida de la presente invención, la realización de los métodos de la invención produce plantas que tienen una tasa de crecimiento incrementada bajo condiciones de estrés medioambiental abiótico y/o condiciones sin estrés, preferiblemente bajo condiciones de disponibilidad de agua limitada, más preferiblemente bajo condiciones de sequía, y/o contenido incrementado de cualquiera o más de los químicos finos listados en la Tabla FC; con relación a las plantas de control. Por consiguiente, de acuerdo con la presente invención, se proporciona un método para incrementar la tasa de crecimiento de las plantas, cuyo método comprende modular la expresión, en una planta, de un ácido nucleico que codifica un polipéptido chaperón análogo a DnaJ según se define aquí.

La realización de los métodos de la invención produce plantas cultivadas bajo condiciones de estrés medioambiental abiótico y/o condiciones sin estrés, particularmente bajo condiciones de sequía que incrementaron el rendimiento con relación a las plantas de control cultivadas bajo condiciones comparables. Por consiguiente, de acuerdo con la presente invención, se proporciona un método para incrementar el rendimiento en plantas cultivadas bajo condiciones de estrés medioambiental abiótico y/o condiciones sin estrés, particularmente condiciones de sequía moderada, cuyo método comprende modular la expresión, en una planta, de un ácido nucleico que codifica un polipéptido chaperón análogo a DnaJ.

De acuerdo con la presente invención, se proporciona un método para incrementar el contenido de cualquiera o más de los químicos finos listados en la Tabla FC con relación a las plantas de control en plantas cultivadas bajo condiciones de estrés o sin estrés, en donde las condiciones de estrés son preferiblemente bajo condiciones de disponibilidad de agua limitada, particularmente condiciones de sequía, cuyo método comprende modular la expresión, en una planta, de un ácido nucleico que codifica un polipéptido chaperón análogo a DnaJ.

Adicionalmente se proporcionan por la presente invención métodos para incrementar los rasgos relacionados al rendimiento de plantas bajo condiciones de estrés medioambiental abiótico y/o condiciones sin estrés, y para incrementar el contenido de cualquiera o más de los químicos finos listados en la Tabla FC con relación a las plantas de control en plantas cultivadas bajo condiciones de estrés o sin estrés, cuyo método comprende modular la expresión, en una planta, de un ácido nucleico que codifica un polipéptido chaperón análogo a DnaJ.

La realización de los métodos de la invención produce plantas cultivadas bajo condiciones de sequía, incrementado rendimiento y/o contenido de químico fino de cualquiera o más de los químicos finos listados en la Tabla FC, con relación a las plantas de control cultivadas bajo condiciones comparables. Por consiguiente, de acuerdo con la presente invención, se proporciona un método para incrementar el rendimiento y/o el contenido de químico fino de cualquiera o más de los químicos finos listados en la Tabla FC, en plantas cultivadas bajo condiciones de sequía, cuyo método comprende modular la expresión, en una planta, de un ácido nucleico que codifica un polipéptido chaperón análogo a DnaJ.

La realización de los métodos de la invención produce plantas cultivadas bajo condiciones de deficiencia de nutrientes, particularmente bajo condiciones de deficiencia de nitrógeno, incrementado rendimiento y/o contenido de químico fino de cualquiera o más de los químicos finos listados en la Tabla FC, con relación a las plantas de control cultivadas bajo condiciones comparables. Por consiguiente, de acuerdo con la presente invención, se proporciona un método para incrementar el rendimiento y/o el contenido de químico fino de cualquiera o más de los químicos finos listados en la Tabla FC, en plantas cultivadas bajo condiciones de deficiencia de nutrientes, cuyo método comprende modular la expresión, en una planta, de un ácido nucleico que codifica un polipéptido chaperón análogo a DnaJ.

La realización de los métodos de la invención produce plantas cultivadas bajo condiciones de estrés por salinidad, incrementado rendimiento y/o contenido de químico fino de cualquiera o más de los químicos finos listados en la Tabla FC, con relación a las plantas de control cultivadas bajo condiciones comparables. Por consiguiente, de acuerdo con la presente invención, se proporciona un método para incrementar el rendimiento y/o el contenido de químico fino de cualquiera o más de los químicos finos listados en la Tabla FC, en plantas cultivadas bajo condiciones de estrés por salinidad, cuyo método comprende modular la expresión, en una planta, de un ácido nucleico que codifica un polipéptido chaperón análogo a DnaJ.

La invención también proporciona vectores y constructos genéticos para facilitar la introducción y/o la expresión, en plantas, de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos chaperones análogos a DnaJ. Los constructos genéticos se pueden insertar en vectores, que pueden estar comercialmente disponibles, adecuados para la transformación en plantas y adecuados para la expresión del gen de interés en las células transformadas. La invención también proporciona el uso de un constructo genético según se define aquí en los métodos de la invención .

Más específicamente, la presente invención proporciona un constructo que comprende: (a) un ácido nucleico que codifica un polipéptido chaperón análogo a DnaJ según se define anteriormente; (b) una o más secuencias de control capaces de dirigir la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos de (a) ; y opcionalmente (c) una secuencia de terminación de la transcripción.

Preferiblemente, el ácido nucleico que codifica un polipéptido chaperón análogo a DnaJ es como se define anteriormente. El término "secuencia de control" y "secuencia de terminación" son como se define aquí.

La invención adicionalmente proporciona plantas transformadas con un constructo según se describe anteriormente. En particular, la invención proporciona plantas transformadas con un constructo según se describe anteriormente, cuyas plantas tienen rasgos relacionados al rendimiento incrementado según se describe aquí.

Las plantas se transforman con un vector que comprende cualquiera de los ácidos nucleicos descritos anteriormente. El artesano experto en el arte conoce los elementos genéticos que deben estar presentes en el vector a fin de transformar, seleccionar y propagar exitosamente las células hospederas que contienen la secuencia de interés. La secuencia de interés se enlaza operativamente a una o más secuencias de control (al menos a un promotor) en los vectores de la invención.

En una modalidad, las plantas de la invención se transforman con un cásete de expresión que comprende cualquiera de los ácidos nucleicos antes descritos. El experto en el arte conoce los elementos genéticos que deben estar presentes en el cásete de expresión a fin de transformar, seleccionar y propagar exitosamente las células hospederas que contienen la secuencia de interés. En los casetes de expresión de la invención, la secuencia de interés se enlaza operativamente a una o más secuencias de control (al menos a un promotor) . El promotor en dicho cásete de expresión puede ser un promotor no nativo para el ácido nucleico antes descrito, es decir, un promotor que no regula la expresión de dicho ácido nucleico en su entorno nativo.

En una modalidad adicional, los casetes de expresión de la invención confieren incrementado rendimiento o rasgos relacionados al rendimiento a una célula de planta viva, cuando se han introducido en dicha célula de planta y dan como resultado la expresión del ácido nucleico según se define anteriormente, comprendido en los casetes de expresión.

Los casetes de expresión de la invención pueden estar comprendidos en una célula hospederas, una célula de planta, una semilla, un producto agrícola o una planta.

Ventajosamente, se puede utilizar cualquier tipo de promotor, ya sea natural o sintético, para dirigir la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos. En una modalidad, el promotor es de origen de planta. Un promotor constitutivo es particularmente útil en los métodos. Preferiblemente, el promotor constitutivo es un promotor constitutivo ubicuo de fuerza media o fuerza alta. Véase la sección de "Definiciones" de la presente para las definiciones de los diversos tipos de promotores.

Debe ser claro que la aplicabilidad de la presente invención no está restringida al ácido nucleico que codifica el polipéptido chaperón análogo a DnaJ representado por el SEQ ID NO: 1 o 41, preferiblemente por el SEQ ID NO: 1, ni está restringida a la expresión de un ácido nucleico que codifica el polipéptido chaperón análogo a DnaJ cuando se dirige por un promotor constitutivo.

Preferiblemente, el promotor constitutivo es un promotor de fuerza media o alta. En una modalidad, es un promotor derivado de una planta, por ejemplo, un promotor de origen cromosómico de planta, tal como un promotor G0S2, un promotor PcUbi, un promotor USP o un promotor de sustancialmente la misma fuerza y que tiene sustancialmente el mismo patrón de expresión (un promotor funcionalmente equivalente) .

En otra modalidad, el promotor constitutivo es un promotor derivado a partir del promotor CaMV35S, por ejemplo el promotor Big35S o el promotor Super. Véase las explicaciones para la Tabla III debajo para mayor información sobre los promotores USP, PcUbi, Super y Big35S.

Véase la sección de "Definiciones" en la presente para más ejemplos de los promotores constitutivos.

Opcionalmente, una o más secuencias terminadoras se pueden utilizar en el constructo introducido en una planta. Preferiblemente, el constructo comprende un cásete de expresión que comprende un promotor constitutivo, por ejemplo el promotor Big35S, operativamente enlazado al ácido nucleico que codifica el polipéptido chaperón análogo a DnaJ. Más preferiblemente, el constructo comprende un terminador, por ejemplo el terminador t-Nos o zein (t-zein) enlazado al extremo 3' de la secuencia que codifica el chaperón análogo a DnaJ. Adicionalmente, una o más secuencias que codifican marcadores seleccionables pueden estar presentes en el constructo introducido en una planta.

De acuerdo con una característica preferida de la invención, la expresión modulada es expresión incrementada. Los métodos para incrementar la expresión de ácidos nucleicos o genes, o productos de gen, están bien documentados en el arte y se proporcionan ejemplos en la sección de definiciones.

Como se menciona anteriormente, un método preferido para modular la expresión de un ácido nucleico que codifica un polipéptido chaperón análogo a DnaJ es introduciendo y expresando, en una planta, un ácido nucleico que codifica un polipéptido chaperón análogo a DnaJ; sin embargo, los efectos de realizar el método, es decir, mejorar los rasgos relacionados al rendimiento, también se pueden lograr utilizando otras técnicas bien conocidas, incluyendo pero no limitado al etiquetado de la activación del ADN-T, TILLING, recombinación homologa. Una descripción de estas técnicas se proporciona en la sección de definiciones .

La invención también proporciona un método para la producción de plantas transgénicas que tienen rasgos relacionados al rendimiento mejorados bajo condiciones de estrés medioambiental abiótico y/o condiciones sin estrés, preferiblemente bajo condiciones de disponibilidad de agua limitada, más preferiblemente bajo condiciones de sequía, y/o contenido incrementado de cualquiera o más de los químicos finos listados en la Tabla FC con relación a las plantas de control, que comprende la introducción y expresión, en una planta, de cualquier ácido nucleico que codifique un polipéptido chaperón análogo a DnaJ según se define aquí anteriormente .

Más específicamente, la presente invención proporciona un método para la producción de plantas transgénicas que tienen rasgos relacionados al rendimiento mejorados, particularmente incrementada biomasa y/o rendimiento de semilla, bajo condiciones de estrés medioambiental abiótico y/o condiciones sin estrés, preferiblemente bajo condiciones de disponibilidad de agua limitada, más preferiblemente bajo condiciones de sequía, y/o contenido incrementado de cualquiera o más de los químicos finos listados en la Tabla FC con relación a las plantas de control, cuyo método comprende: (i) introducir y expresar, en una planta o célula de planta, un ácido nucleico que codifica el polipéptido chaperón análogo a DnaJ o un constructo genético que comprende un ácido nucleico que codifica el polipéptido chaperón análogo a DnaJ; y (ii) cultivar la célula de planta bajo condiciones que promueven el crecimiento y desarrollo de la planta.

Cultivar la célula de planta bajo condiciones que promueven el crecimiento y desarrollo de la planta, puede o no incluir la regeneración y/o el crecimiento hasta la madurez.

El ácido nucleico de (i) puede ser cualquiera de los ácidos nucleicos capaces de codificar un polipéptido chaperón análogo a DnaJ según se define aquí.

El ácido nucleico se puede introducir directamente en una célula de planta o en la planta misma (incluyendo la introducción en un tejido, órgano o cualquier otra parte de una planta) . De acuerdo con una característica preferida de la presente invención, el ácido nucleico preferiblemente se introduce en una planta mediante transformación. El término "transformación" se describe en más detalle en la sección de "Definiciones" en la presente.

En una modalidad, la presente invención claramente se extiende a cualquier parte cosechable de una planta con contenido incrementado de cualquiera o más de los químicos finos listados en la Tabla FC con relación a las partes cosechables de las plantas de control, producida por cualquiera de los métodos aquí descritos, y a todos los productos con contenido incrementado de cualquiera o más de los químicos finos listados en la Tabla FC de la misma. Las partes cosechables de la misma comprenden un transgen de ácido nucleico que codifica un polipéptido chaperón análogo a DnaJ según se define anteriormente.

La presente invención también se extiende en otra modalidad a las partes cosechables con contenido incrementado de cualquiera o más de los químicos finos listados en la Tabla FC que comprenden la molécula de ácido nucleico de la invención en un cásete de expresión de planta o un constructo de expresión de planta.

En todavía otra modalidad, las partes cosechables de la invención son células que no se propagan, por ejemplo, las células no se pueden utilizar para regenerar una planta entera a partir de esta célula en su totalidad mediante el uso de técnicas de cultivo celular estándar, es decir, métodos de cultivo celular, pero excluyendo métodos de transferencia de núcleos, organelos o cromosomas in vitro. Mientras que las células de planta generalmente tienen la característica de totipotencia, algunas células de planta no se pueden utilizar para regenerar o propagar plantas intactas a partir de dichas células. En una modalidad de la invención, las células de planta de la invención son tales células.

En otra modalidad, las partes cosechables de la invención son partes cosechables que no se sostienen a sí mismas a través de la fotosíntesis mediante la síntesis de carbohidratos y proteínas a partir de sustancias inorgánicas, tales como agua, dióxido de carbono y sales minerales, es decir, se les puede considerar una variedad que no es planta. En una modalidad adicional, las partes cosechables de la invención son una variedad que no es planta y no se pueden propagar .

En una modalidad, un incremento de mio-inositol en un organismo no humano, en comparación a un organismo no humano de tipo salvaje, no transformado, correspondiente, se confiere en el proceso de la invención, si se incrementa o genera la actividad de un polipéptido que muestra la actividad de un chaperón molecular, o si se incrementa o genera la actividad del polipéptido Ynl064c, preferiblemente representado por el SEQ ID NO: 2 o 42, preferiblemente el SEQ ID NO: 2, o un homólogo o fragmento del mismo, o si se incrementa o genera la actividad de un polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico que comprende el ácido nucleico SEQ ID NO: 1 o 41, preferiblemente SEQ ID NO: 1, preferiblemente la región codificante del mismo, o un homólogo o fragmento del mismo, por ejemplo derivado a partir de Saccharomyces cerevisiae. Por ejemplo, se incrementa o genera la actividad de una molécula de ácido nucleico o un polipéptido que comprende el ácido nucleico, preferiblemente la región codificante del mismo, o el polipéptido o la secuencia de consenso o la secuencia recurrente del polipéptido, según se representa en la Tabla I, II o IV, columna 5 o 7 en la misma linea respectiva que la molécula de ácido nucleico SEQ ID NO: 1 o 41, preferiblemente SEQ ID NO: 1 o el polipéptido SEQ ID NO: 2 o 42, preferiblemente SEQ ID NO: 2, respectivamente, o un homólogo o fragmento del mismo, o si se incrementa o genera- la actividad del chaperón molecular en un organismo no humano, como un microorganismo o una célula de planta, una planta o parte de la misma, especialmente con localización no dirigida, por lo que la linea respectiva divulga en la Tabla Rl el químico fino mio-inositol . Por ejemplo, se confiere un incremento del mio- inositol de al menos 1 por ciento, particularmente en un rango de 28 a 50 por ciento en comparación a un organismo no humano de tipo salvaje, no transformado, correspondiente.

Consecuentemente, en otra modalidad, un incremento de sacarosa en un organismo no humano, en comparación a un organismo no humano de tipo salvaje, no transformado, correspondiente, se confiere en el proceso de la invención, si se incrementa o genera la actividad de un polipéptido que muestra la actividad de un chaperón molecular, o si se incrementa o genera la actividad del polipéptido Ynl064c, preferiblemente representado por el SEQ ID NO: 2 o 42, preferiblemente el SEQ ID NO: 2, o un homólogo o fragmento del mismo, o si se incrementa o genera la actividad de un polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico que comprende el ácido nucleico SEQ ID NO: 1 o 41, preferiblemente SEQ ID NO: 1, preferiblemente la región codificante del mismo, o un homólogo o fragmento del mismo, por ejemplo derivado a partir de Saccharomyces cerevisiae. Por ejemplo, se incrementa o genera la actividad de una molécula de ácido nucleico o un polipéptido que comprende el ácido nucleico, preferiblemente la región codificante del mismo, o el polipéptido o la secuencia de consenso o la secuencia recurrente del polipéptido, según se representa en la Tabla I, II o IV, columna 5 o 7 en la misma linea respectiva que la molécula de ácido nucleico SEQ ID NO: 1 o 41, preferiblemente SEQ ID NO: 1 o el polipéptido SEQ ID NO: 2 o 42, preferiblemente SEQ ID NO: 2, respectivamente, o un homólogo o fragmento del mismo, o si se incrementa o genera la actividad del chaperón molecular en un organismo no humano, como un microorganismo o una célula de planta, una planta o parte de la misma, especialmente con localización no dirigida, por lo que la linea respectiva divulga en la Tabla Rl el químico fino sacarosa. Por ejemplo, se confiere un incremento de la sacarosa de al menos 1 por ciento, particularmente en un rango de 25 a 31 por ciento en comparación a un organismo no humano de tipo salvaje, no transformado, correspondiente.

En una modalidad adicional, un incremento de ácido linoleico en un organismo no humano, en comparación a un organismo no humano de tipo salvaje, no transformado, correspondiente, se confiere en el proceso de la invención, si se incrementa o genera la actividad de un polipéptido que muestra la actividad de un chaperón molecular, o si se incrementa o genera la actividad del polipéptido Ynl064c, preferiblemente representado por el SEQ ID NO: 2 o 42, preferiblemente SEQ ID NO: 2, o un homólogo o fragmento del mismo, o si se incrementa o genera la actividad de un polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico que comprende el ácido nucleico SEQ ID NO: 1 o 41, preferiblemente SEQ ID NO: 1, preferiblemente la región codificante del mismo, o un homólogo o fragmento del mismo, por ejemplo derivado a partir de Saccharomyces cerevisiae. Por ejemplo, se incrementa o genera la actividad de una molécula de ácido nucleico o un polipéptido que comprende el ácido nucleico, preferiblemente la región codificante del mismo, o el polipéptido o la secuencia de consenso o la secuencia recurrente del polipéptido, según se representa en la Tabla I, II o IV, columna 5 o 7 en la misma linea respectiva que la molécula de ácido nucleico SEQ ID NO: 1 o 41, preferiblemente SEQ ID NO: 1 o el polipéptido SEQ ID NO: 2 o 42, preferiblemente SEQ ID NO: 2, respectivamente, o un homólogo o fragmento del mismo, o si se incrementa o genera la actividad del chaperón molecular en un organismo no humano, como un microorganismo o una célula de planta, una planta o parte de la misma, especialmente con localización no dirigida, por lo que la linea respectiva divulga en la Tabla Rl el químico fino ácido linoleico. Por ejemplo, se confiere un incremento del ácido linoleico de al menos 1 por ciento, particularmente en un rango de 15 a 25 por ciento en comparación a un organismo no humano de tipo salvaje, no transformado, correspondiente.

En una modalidad adicional, un incremento de ácido linolénico en un organismo no humano, en comparación a un organismo no humano de tipo salvaje, no transformado, correspondiente, se confiere en el proceso de la invención, si se incrementa o genera la actividad de un polipéptido que muestra la actividad de un chaperón molecular, o si se incrementa o genera la actividad del polipéptido Ynl064c, preferiblemente representado por el SEQ ID NO: 2 o 42, preferiblemente SEQ ID NO: 2, o un homólogo o fragmento del mismo, o si se incrementa o genera la actividad de un polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico que comprende el ácido nucleico SEQ ID NO: 1 o 41, preferiblemente SEQ ID NO: 1, preferiblemente la región codificante del mismo, o un homólogo o fragmento del mismo, por ejemplo derivado a partir de Saccharomyces cerevisiae. Por ejemplo, se incrementa o genera la actividad de una molécula de ácido nucleico o un polipéptido que comprende el ácido nucleico, preferiblemente la región codificante del mismo, o el polipéptido o la secuencia de consenso o la secuencia recurrente del polipéptido, según se representa en la Tabla I, II o IV, columna 5 o 7 en la misma linea respectiva que la molécula de ácido nucleico SEQ ID NO: 1 o 41, preferiblemente SEQ ID NO: 1 o el polipéptido SEQ ID NO: 2 o 42, preferiblemente SEQ ID NO: 2, respectivamente, o un homólogo o fragmento del mismo, o si se incrementa o genera la actividad del chaperón molecular en un organismo no humano, como un microorganismo o una célula de' planta, una planta o parte de la misma, especialmente con localización no dirigida, por lo que la linea respectiva divulga en la Tabla Rl el químico fino ácido linolénico. Por ejemplo, se confiere un incremento del ácido linolénico de al menos 1 por ciento, particularmente en un rango de 13 a 24 por ciento en comparación a un organismo no humano de tipo salvaje, no transformado, correspondiente.

Una modalidad adicional de esta invención se refiere a genes que incrementan o generan la producción del químico fino ácido linoleico en células de planta, plantas o parte de las mismas. Los fenotipos para esto se asocian con el rendimiento de las plantas (= fenotipos relacionados al rendimiento) . De conformidad con la invención, por consiguiente, los genes respectivos identificados en la Tabla I, columnas 5 o 7, en donde para el gen principal correspondiente en la Tabla Rl, columna 5 se menciona el ácido linoleico, especialmente la región codificante del mismo, u homólogos o fragmentos del mismo, se pueden emplear para mejorar cualquier fenotipo relacionado al rendimiento.

El químico fino mio-inositol puede proteger las células de planta contra limitaciones en la disponibilidad del agua y por lo tanto puede incrementar los fenotipos relacionados al rendimiento bajo condiciones sin estrés y/o bajo condiciones de estrés.

De conformidad con la invención, por consiguiente, los genes respectivos identificados en la Tabla I, columnas 5 o 7, en donde para el gen principal correspondiente en la Tabla Rl, columna 5 se menciona el mio-inositol, especialmente la región codificante del mismo, u homólogos o fragmentos del mismo, se pueden emplear para mejorar cualquier fenotipo relacionado al rendimiento .

Adicionalmente, en los cultivos con partes cosechables cosechadas principalmente por su contenido de azúcar, tal como la caña de azúcar o la remolacha azucarera, un incremento en el contenido de azúcar, y el contenido particular del químico fino sacarosa mejorará directamente el rendimiento de las partes cosechables pertinentes. De conformidad con la invención, por consiguiente, los genes respectivos identificados en la Tabla I, columnas 5 o 7, en donde para el gen principal correspondiente en la Tabla Rl, columna 5 se menciona la sacarosa, especialmente la región codificante de la misma, u homólogos o fragmentos de la misma, se pueden emplear para mejorar cualquier fenotipo relacionado al rendimiento.

El rendimiento incrementado se puede determinar en pruebas de campo de plantas transgénicas y plantas de control adecuadas. Alternativamente, la habilidad de un transgen para incrementar el rendimiento se puede determinar en una planta modelo. Un fenotipo de rendimiento incrementado se puede determinar en la prueba de campo o en una planta modelo midiendo cualquiera o cualquier combinación de los siguientes fenotipos, en comparación a una planta de control: rendimiento de las partes cosechables secas de la planta, rendimiento de las partes cosechables aéreas secas de la planta, rendimiento de las partes cosechables bajo tierra secas de la planta, rendimiento de las partes cosechables de peso fresco de la planta, rendimiento de las partes cosechables de peso fresco aéreas de la planta, rendimiento de las partes cosechables de peso fresco bajo tierra de la planta, rendimiento del fruto de la planta (tanto fresco como seco) , peso seco del grano, rendimiento de las semillas (tanto frescas como secas) , y similares .

El fenotipo relacionado al rendimiento más básico es el rendimiento incrementado asociado con la presencia del gen o un homólogo o fragmento del mismo como un transgen en la planta, es decir, el rendimiento intrínseco de la planta. La capacidad de rendimiento intrínseco de una planta se puede manifestar, por ejemplo, en una prueba de campo o en un sistema modelo demostrando una mejora del rendimiento de la semilla (por ejemplo, en términos del tamaño incrementado de la semilla/grano, el número incrementado de mazorcas, el número incrementado de semillas por mazorca, la mejora del llenado de las semillas, la mejora de la composición de la semilla, las mejoras del embrión y/o del endosperma, y similares); la modificación y mejora de los mecanismos de crecimiento y desarrollo inherentes de una planta (tal como la altura de la planta, la tasa de crecimiento de la planta, el número de vainas, la posición de la vaina en la planta, el número de internodos, la incidencia de resquebrajamiento de las vainas, la eficiencia de la nodulación y la fijación del nitrógeno, la eficiencia de la asimilación del carbono, la mejora del vigor temprano/vigor de plántula, la eficacia mejorada de la germinación (bajo condiciones sin estrés) , la mejora de la arquitectura de la planta) . De conformidad con la invención, los genes respectivos identificados en la Tabla 1, columnas 5 o 7, especialmente la región codificante de los mismos, u homólogos o fragmentos de los mismos, en donde en la linea respectiva de la Tabla Rl se menciona ácido linoleico, mio-inositol y/o sacarosa, se pueden emplear para mejorar la capacidad de rendimiento intrínseco.

Los fenotipos relacionados al rendimiento incrementado también se pueden medir para determinar la tolerancia al estrés abiótico, es decir, el estrés medioambiental. En una modalidad, "estrés abiótico", "estrés medioambiental" y "estrés medioambiental abiótico" se utilizan de forma intercambiable, también al referirse a la tolerancia a tal estrés. Los estreses abióticos incluyen sequía, baja temperatura, deficiencia de nutrientes, salinidad, estrés osmótico, sombra, alta densidad de la planta, estreses mecánicos, y estrés oxidativo, preferiblemente sequía y disponibilidad de agua reducida, y los fenotipos relacionados al rendimiento están abarcados por la tolerancia a tales estreses abióticos. Los fenotipos adicionales que se pueden monitorear para determinar la tolerancia mejorada al estrés medioambiental abiótico incluyen, sin limitación, marchitamiento; amarronamiento de las hojas; pérdida de turgencia; lo que da como resultado la caída de hojas o acículas, tallos, y flores; caída y/o desprendimiento de hojas o acículas; las hojas son verdes pero la hoja se angula ligeramente hacia el suelo en comparación con los controles; los limbos foliares comienzan a plegarse (rizarse) hacia adentro; senectud prematura de las hojas o acículas; pérdida de clorofila en las hojas o acículas y/o amarillamiento. Cualquiera de los fenotipos relacionados al rendimiento, anteriormente descritos, se puede monitorear en pruebas de campo o en plantas modelo para demostrar que una planta transgénica tiene tolerancia incrementada al estrés medioambiental abiótico.

Un polipéptido que confiere una actividad que incrementa el rendimiento se puede codificar por una secuencia de ácidos nucleicos respectiva según se muestra en la Tabla I, columna 5 o 7, y/o comprende o consiste de un polipéptido respectivo según se representa en la Tabla II, columna 5 y 7, y/o se puede amplificar con el conjunto de cebadores respectivo mostrado en la Tabla III, columna 7, en el caso que en la línea correspondiente en la Tabla Rl se indica ácido linoleico, mio-inositol y/o sacarosa.

La "adaptación mejorada" al estrés medioambiental, como por ejemplo, temperaturas gélidas y/o de enfriamiento se refiere a un desempeño mejorado de la planta bajo condiciones de estrés medioambiental.

Una modificación, por ejemplo un incremento, puede provocarse por factores endógenos o exógenos. Por ejemplo, un incremento en la actividad en un organismo o parte del mismo se puede provocar agregando un producto genético o un progenitor o un activador o una agonista al medio o nutrición o se puede provocar introduciendo dichos sujetos en un organismo, transitorio o estable. Además, tal incremento se puede alcanzar por la introducción de la secuencia de ácidos nucleicos inventiva, respectiva, o la proteina codificada en el compartimiento celular correcto, por ejemplo, en el núcleo o citoplasma respectivamente, o en plástidos ya sea mediante transformación y/o direccionamiento.

En una modalidad, el término "rendimiento" según se utiliza aquí generalmente se refiere a un producto mensurable de una planta, particularmente un cultivo. El rendimiento y el incremento del rendimiento (en comparación a una planta de tipo salvaje o una planta de inicio no transformada) se pueden medir de muchas maneras, y se entiende que una persona experta podrá aplicar el significado correcto en vista de las modalidades particulares, el cultivo particular concernido y el propósito especifico o la aplicación concernida. Los términos "rendimiento mejorado" o "rendimiento incrementado" se pueden utilizar de manera intercambiable.

Por ejemplo, el "rendimiento" mejorado o incrementado se refiere a uno o más parámetros de rendimiento seleccionados a partir del grupo que consiste del rendimiento de la biomasa, rendimiento de la biomasa seca, rendimiento de la biomasa seca aérea, rendimiento de la biomasa seca bajo tierra, rendimiento de la biomasa de peso fresco, rendimiento de la biomasa de peso fresco aérea, rendimiento de la biomasa de peso fresco bajo tierra; rendimiento mejorado de las partes cosechables, ya sea secas o de peso fresco o ambos, ya sea aéreas o bajo tierra o ambos; rendimiento mejorado del fruto de cultivo, ya sea seco o de peso fresco o ambos, ya sea aéreo o bajo tierra o ambos; y rendimiento mejorado de las semillas, ya sea secas o de peso fresco o ambos, ya sea aéreas o bajo tierra o ambos. Preferiblemente se incrementa el rendimiento de la biomasa por arriba del suelo, y/o la biomasa de la remolacha, la biomasa del tubérculo y/o el rendimiento de la biomasa de la raíz.

Consecuentemente, el rendimiento de una planta se puede incrementar mejorando uno o más de los fenotipos relacionados al rendimiento.

Tales rasgos o fenotipos relacionados al rendimiento de una planta, la mejora de los cuales da como resultado el rendimiento incrementado, comprenden, sin limitación, el incremento de la capacidad de rendimiento intrínseco de una planta, y/o la tolerancia incrementada al estrés, por ejemplo, la tolerancia mejorada a la sequía o la eficiencia mejorada del uso de nutrientes. Por ejemplo, el rendimiento se refiere al rendimiento de la biomasa, por ejemplo, el rendimiento de la biomasa de peso seco y/o el rendimiento de la biomasa de peso fresco. El rendimiento de la biomasa se refiere a las partes aéreas o bajo tierra de una planta o a las partes en contacto con el suelo o parcialmente insertadas en el suelo como las remolachas, dependiendo de las circunstancias especificas (condiciones de prueba, cultivo especifico de interés, aplicación de interés, y similares) . En una modalidad, el rendimiento de la biomasa se refiere a las partes aéreas y bajo tierra. El rendimiento de la biomasa se puede calcular como base en peso fresco, base en peso seco o base ajustada en humedad. El rendimiento de la biomasa se puede calcular en una base por planta o en relación a un área especifica (por ejemplo, rendimiento de la biomasa por acre / metro cuadrado / o similar) .

Por ejemplo, el término "rendimiento incrementado" significa que una planta, exhibe una tasa de crecimiento incrementada, bajo condiciones de estrés medioambiental abiótico, en comparación a la planta de tipo salvaje correspondiente .

Una tasa de crecimiento incrementada se puede reflejar ínter alia por o confiere una producción de biomasa incrementada de la planta entera, o una producción de biomasa incrementada de las partes aéreas de una planta, o una producción de biomasa incrementada de las partes en contacto con el suelo o parcialmente insertadas en el suelo como las remolachas, o por una producción de biomasa incrementada de las partes bajo tierra de una planta, o por una producción de biomasa incrementada de las partes de una planta, como los tallos, hojas, florescencias, frutos, y/o semillas. El rendimiento incrementado incluye rendimientos más altos de los frutos, rendimiento más alto de las semillas, mayor producción de materia fresca, y/o mayor producción de materia seca.

En una modalidad, el término "rendimiento incrementado" significa que la planta, exhibe un crecimiento prolongado bajo condiciones de estrés medioambiental abiótico, en comparación a, por ejemplo, el organismo de tipo salvaje, no transformado, correspondiente. Un crecimiento prolongado comprende la supervivencia y/o el crecimiento continuado de la planta, en el momento cuando el organismo de tipo salvaje, no transformado, muestra síntomas visuales de deficiencia y/o muerte .

Dicho rendimiento incrementado típicamente se puede lograr mejorando uno o más rasgos relacionados al rendimiento de la planta. Tales rasgos relacionados al rendimiento de una planta comprenden, sin limitación, el incremento de la capacidad de rendimiento intrínseco de una planta, y/o la tolerancia incrementada al estrés, en particular la tolerancia incrementada al estrés abiótico, como por ejemplo, la eficiencia mejorada del uso de nutrientes, por ejemplo, la eficiencia del uso de nitrógeno, la eficiencia de uso de agua.

La capacidad de rendimiento intrínseco de una planta se puede manifestar, por ejemplo, mejorando el rendimiento de la biomasa especifico (intrínseco) (por ejemplo, en términos del tamaño incrementado de brotes, raíces o remolachas, la mejora de la composición de las remolachas, raíces o brotes, similares) ; la modificación y mejora de los mecanismos de crecimiento y desarrollo inherentes de una planta (tal como la altura de la planta, la tasa de crecimiento de la planta, el número de hojas, la posición de la hoja en la planta, el número de internodos, la eficiencia de la nodulación y la fijación del nitrógeno, la eficiencia de la asimilación del carbono, la mejora del vigor temprano/vigor de plántula, la eficacia mejorada de la germinación (bajo condiciones de estrés o sin estrés), la mejora en la arquitectura de la planta, las modificaciones del ciclo celular, las modificaciones a la fotosíntesis, diversas modificaciones a la trayectoria de señalización, la modificación de la regulación transcripcional, la modificación de regulación traduccional, la modificación de las actividades de la enzima, y similares); y/o similares.

La mejora o incremento de la tolerancia al estrés de una planta se puede manifestar, por ejemplo, mejorando o incrementando la tolerancia de una planta contra el estrés, particularmente el estrés abiótico. En la presente solicitud, el estrés abiótico se refiere generalmente a las condiciones medioambientales abióticas con las cuales una planta típicamente está confrontada, incluyendo, pero no limitado a, sequía (la tolerancia a la sequía se puede lograr como resultado de la eficiencia mejorada del uso de agua), calor, bajas temperaturas y condiciones de frío (tales como condiciones de helamiento y enfriamiento) , agotamiento de nutrientes, salinidad, estrés osmótico, sombra, alta densidad de la planta, estrés mecánico, estrés oxidativo, y similares.

Consecuentemente, esta invención proporciona métodos y medidas respectivas para producir plantas con rendimiento incrementado, por ejemplo genes que confieren un rasgo relacionado al rendimiento incrementado, por ejemplo tolerancia mejorada al estrés medioambiental abiótico, por ejemplo una tolerancia incrementada a la sequía y/o una tolerancia a bajas temperaturas y/o una eficiencia incrementada del uso de nutrientes, un rendimiento intrínseco y/u otro rasgo relacionado al rendimiento incrementado, tras la expresión o sobre-expresión, especialmente bajo condiciones de sequía. Consecuentemente, la presente invención proporciona tales genes en el caso que en la Tabla Rl se indica ácido linoleico, mio-inositol y/o la sacarosa. En particular, tales genes se describen en la columna 5 así como en la columna 7 de las Tablas I, especialmente la región codificante de los mismos, u homólogos o fragmentos de los mismos, en el caso que se indica ácido linoleico, mio-inositol y/o sacarosa en la Tabla Rl o los polipéptidos respectivos se describen en la columna 5 así como en la columna 7 de la Tabla II, u homólogos o fragmentos de los mismos, en el caso que se indica ácido linoleico, mio-inositol y/o sacarosa en la Tabla Rl .

Consecuentemente, la presente invención proporciona plantas transgénicas respectivas que muestran uno o más rasgos relacionados al rendimiento mejorados en comparación al control correspondiente o la planta de tipo salvaje y métodos para producir tales plantas transgénicas con rendimiento incrementado en el caso que en la Tabla Rl se indica ácido linoleico, mio-inositol y/o sacarosa.

En una modalidad, una o más de dichas actividades que incrementan el rendimiento se incrementan incrementando la cantidad y/o la actividad especifica de una o más proteínas listadas en la Tabla I, columna 5 o 7 en un compartimiento de una célula indicada en la Tabla I, columna 6, en el caso que en la Tabla Rl se indica ácido linoleico, mio-inositol y/o sacarosa .

Consecuentemente para la presente invención, el rendimiento de la planta de la invención se incrementas mejorando uno o más de los rasgos relacionados al rendimiento según se define aquí. Dicho rendimiento incrementado de conformidad con la presente invención típicamente se puede lograr mejorando, en comparación a un control o planta de tipo salvaje, uno o más rasgos relacionados al rendimiento de dicha planta. Tales rasgos relacionados al rendimiento de una planta, la mejora de los cuales da como resultado el rendimiento incrementado, comprenden, sin limitación, el incremento de la capacidad de rendimiento intrínseco de una planta, y/o la tolerancia incrementada al estrés, por ejemplo, la eficiencia mejorada del uso de nutrientes, como la eficiencia del uso de nitrógeno; especialmente la capacidad de rendimiento mejorada bajo estrés por sequía o limitación de agua .

La actividad del producto genético de la secuencia de ácidos nucleicos de Ynl064c de Saccharomyces cerevisiae, por ejemplo, según se muestra en la línea respectiva en la columna 5 de la Tabla I, es la actividad del chaperón molecular.

Consecuentemente, en una modalidad, el proceso de la presente invención para producir mio-inositol en un organismo no humano, como un microorganismo o una planta o una parte de la misma, comprende incrementar o generar la actividad de un producto genético con la actividad de un producto genético que confiere la actividad de "chaperón molecular", especialmente de Saccharomyces cerevisiae o su equivalente funcional o su homólogo, por ejemplo el incremento de (a) un producto genético de un gen que comprende la molécula de ácido nucleico según se muestra en la línea respectiva en la columna 5 de la Tabla I (por lo que la línea respectiva divulga en la columna 7 el químico fino mio- inositol) , preferiblemente la región codificante del mismo, o un homólogo o fragmento del mismo, y que se representa en la misma linea respectiva que dicho Ynl064c, o un equivalente funcional o un homólogo del mismo según se muestra en la columna 7 de la Tabla I, preferiblemente la región codificante del mismo, y preferiblemente la actividad se incrementa de manera no dirigida, o (b) un polipéptido que comprende un polipéptido, una secuencia de consenso o al menos una secuencia recurrente del polipéptido según se muestra en la linea respectiva en la columna 5 de la Tabla II o en la columna 7 de la Tabla IV, respectivamente, y que se representa en la misma linea respectiva que dicho Ynl064c, o un equivalente funcional o un homólogo del mismo según se representa en la columna 7 de la Tabla II, y que se representa en la misma linea respectiva que dicho Ynl064c, y preferiblemente la actividad se incrementa de manera no dirigida, por lo que la linea respectiva divulga en la Tabla Rl el químico fino mio-inositol.

Consecuentemente, en una modalidad, la molécula cuya actividad debe ser incrementada en el proceso de la invención es el producto genético con una actividad como un "chaperón molecular", preferiblemente es la molécula de la sección (a) o (b) recién mencionada.

En particular, se observó que en las plantas, especialmente en Arabidopsis thaliana, incrementar o generar la actividad de un producto genético de manera no dirigida con la actividad de un "chaperón molecular", preferiblemente que se codifica por un gen que comprende la secuencia de ácidos nucleicos SEQ ID NO: 1 o 41, preferiblemente SEQ ID NO: 1, preferiblemente la región codificante del mismo, confirió la producción de o el incremento en mio-inositol en comparación con el control de tipo salvaje.

Consecuentemente, en una modalidad adicional, el proceso de la presente invención para producir sacarosa en un organismo no humano, como un microorganismo o una planta o una parte de la misma, comprende incrementar o generar la actividad de un producto genético con la actividad de un producto genético que confiere la actividad de "chaperón molecular", especialmente de Saccharomyces cerevisiae o su equivalente funcional o su homólogo, por ejemplo el incremento de (a) un producto genético de un gen que comprende la molécula de ácido nucleico según se muestra en la linea respectiva en la columna 5 de la Tabla I (por lo que la linea respectiva divulga en la columna 7 el químico fino sacarosa), preferiblemente la región codificante del mismo, o un homólogo o fragmento del mismo, y que se representa en la misma línea respectiva que dicho Ynl064c, o un equivalente funcional o un homólogo del mismo según se muestra en la columna 7 de la Tabla I, preferiblemente la región codificante del mismo, y preferiblemente la actividad se incrementa de manera no dirigida, o (b) un polipéptido que comprende un polipéptido, una secuencia de consenso o al menos una secuencia recurrente del polipéptido según se muestra en la linea respectiva en la columna 5 de la Tabla II o en la columna 7 de la Tabla IV, respectivamente, y que se representa en la misma linea respectiva que dicho Ynl064c, o un equivalente funcional o un homólogo del mismo según se representa en la columna 7 de la Tabla II, y que se representa en la misma linea respectiva que dicho Ynl064c, y preferiblemente la actividad se incrementa de manera no dirigida, por lo que la linea respectiva divulga en la Tabla Rl el químico fino sacarosa.

En particular, se observó que en las plantas, especialmente en Arabidopsis thaliana, incrementar o generar la actividad de un producto genético de manera no dirigida con la actividad de un "chaperón molecular", preferiblemente que se codifica por un gen que comprende la secuencia de ácidos nucleicos SEQ ID NO: 1 o 41, preferiblemente SEQ ID NO: 1, preferiblemente la región codificante del mismo, confirió la producción de o el incremento en sacarosa en comparación con el control de tipo salvaje.

Consecuentemente, en una modalidad adicional, el proceso de la presente invención para producir ácido linoleico en un organismo no humano, como un microorganismo o una planta o una parte de la misma, comprende incrementar o generar la actividad de un producto genético con la actividad de un producto genético que confiere la actividad de "chaperón molecular", especialmente de Saccharomyces cerevisiae o su equivalente funcional o su homólogo, por ejemplo el incremento de (a) un producto genético de un gen que comprende la molécula de ácido nucleico según se muestra en la linea respectiva en la columna 5 de la Tabla I (por lo que la linea respectiva divulga en la columna 7 el químico fino ácido linoleico) , preferiblemente la región codificante del mismo, o un homólogo o fragmento del mismo, y que se representa en la misma línea respectiva que dicho Ynl064c, o un equivalente funcional o un homólogo del mismo según se muestra en la columna 7 de la Tabla I, preferiblemente la región codificante del mismo, y preferiblemente la actividad se incrementa de manera no dirigida, o (b) un polipéptido que comprende un polipéptido, una secuencia de consenso o al menos una secuencia recurrente del polipéptido según se muestra en la línea respectiva en la columna 5 de la Tabla II o en la columna 7 de la Tabla IV, respectivamente, y que se representa en la misma línea respectiva que dicho Yni064c, o un equivalente funcional o un homólogo del mismo según se representa en la columna 7 de la Tabla II, y que se representa en la misma linea respectiva que dicho Ynl064c, y preferiblemente la actividad se incrementa de manera no dirigida, por lo que la linea respectiva divulga en la Tabla Rl el químico fino ácido linoleico.

En particular, se observó que en las plantas, especialmente en Arabidopsis thaliana, incrementar o generar la actividad de un producto genético de manera no dirigida con la actividad de un "chaperón molecular", preferiblemente que se codifica por un gen que comprende la secuencia de ácidos nucleicos SEQ ID NO: 1 o 41, preferiblemente SEQ ID NO: 1, preferiblemente la región codificante del mismo, confirió la producción de o el incremento en ácido linoleico en comparación con el control de tipo salvaje.

Consecuentemente, en una modalidad adicional, el proceso de la presente invención para producir ácido linolénico en un organismo no humano, como un microorganismo o una planta o una parte de la misma, comprende incrementar o generar la actividad de un producto genético con la actividad de un producto genético que confiere la actividad de "chaperón molecular", especialmente de Saccharomyces cerevisiae o su equivalente funcional o su homólogo, por ejemplo el incremento de (a) un producto genético de un gen que comprende la molécula de ácido nucleico según se muestra en la linea respectiva en la columna 5 de la Tabla I (por lo que la linea respectiva divulga en la columna 7 el químico fino ácido linolénico) , preferiblemente la región codificante del mismo, o un homólogo o fragmento del mismo, y que se representa en la misma línea respectiva que dicho Ynl064c, o un equivalente funcional o un homólogo del miamo según se muestra en la columna 7 de la Tabla I, preferiblemente la región codificante del mismo, y preferiblemente la actividad se incrementa de manera no dirigida, o (b) un polipéptido que comprende un polipéptido, una secuencia de consenso o al menos una secuencia recurrente del polipéptido según se muestra en la línea respectiva en la columna 5 de la Tabla II o en la columna 7 de la Tabla IV, respectivamente, y que se representa en la misma línea respectiva que dicho Ynl064c, o un equivalente funcional o un homólogo del mismo según se representa en la columna 7 de la Tabla II, y que se representa en la misma línea respectiva que dicho Ynl064c, y preferiblemente la actividad se incrementa de manera no dirigida, por lo que la línea respectiva divulga en la Tabla Rl el químico fino ácido linolénico.

En particular, se observó que en las plantas, especialmente en Arabidopsis thaliana, incrementar o generar la actividad de un producto genético de manera no dirigida con la actividad de un "chaperón molecular", preferiblemente que se codifica por un gen que comprende la secuencia de ácidos nucleicos SEQ ID NO: 1 o 41, preferiblemente SEQ ID NO: 1, preferiblemente la región codificante del mismo, confirió la producción de o el incremento en ácido linolénico en comparación con el control de tipo salvaje.

Tabla FC: Químicos finos incrementados en las plantas y/o las células de planta y/o las partes cosechables por los procesos inventivos De esta manera, en una modalidad, la presente invención proporciona un proceso para la producción de cualquiera o más de los químicos finos listados en la Tabla FC, incrementando o generando una o más actividades de chaperón análogo a DnaJ que se confiriere por uno o más POIs o el producto genético de uno o más genes POI, por ejemplo, por el producto genético de unas secuencias de ácidos nucleicos que comprenden un polinucleótido seleccionado a partir del grupo según se muestra en la Tabla I columna 5 o 7, (preferiblemente por la región codificante del mismo) , o un homólogo o fragmento del mismo, por ejemplo, o por una o más proteínas que comprenden cada una un polipéptido codificado por una o más secuencias de ácidos nucleicos seleccionadas a partir del grupo según se muestra en la Tabla I columna 5 o 7, (preferiblemente por la región codificante de las mismas) , o un homólogo o fragmento del mismo, o por una o más proteínas que comprenden cada una un polipéptido seleccionado a partir del grupo según se representa en la Tabla II columna 5 y 8, o un homólogo del mismo, o una proteína que comprende una secuencia correspondiente a la secuencia de consenso o que comprende al menos una secuencia recurrente del polipéptido según se muestra en la Tabla IV columna 7.

Como se menciona, el proceso para la producción del químico fino de acuerdo con la presente invención, en particular que muestra una generación o un incremento del químico fino respectivo en un organismo no humano o una parte del mismo en comparación a un organismo no humano, de tipo salvaje, correspondiente o parte del mismo, se puede mediar por uno o más genes chaperones análogos a DnaJ o chaperones análogos a DnaJ.

En una modalidad, el proceso comprende incrementar o generar la actividad de uno o más polipéptidos que tienen dicha actividad, por ejemplo generando o incrementando la cantidad y/o actividad especifica en la célula o un compartimiento de una célula de uno o más POIs, especialmente el chaperón análogo a DnaJ por ejemplo del polipéptido respectivo según se representa en la Tabla II columna 5 y 8, o un homólogo o fragmento del mismo, o el polipéptido respectivo que comprende una secuencia correspondiente a las secuencias de consenso según se muestra en la Tabla IV columna 7, o el polipéptido respectivo que · comprende al menos una secuencia recurrente del polipéptido según se representa en la Tabla IV columna 7.

Una modalidad adicional de la presente invención se refiere a un proceso para la producción de cualquiera o más de los químicos finos listados en la Tabla FC, que comprende (a) incrementar o generar la actividad de un chaperón análogo a DnaJ de manera no dirigida en un organismo no humano o una parte del mismo, preferiblemente un microorganismo, una célula de planta, una planta o una parte de la misma, en comparación a un organismo no humano de tipo salvaje, no transformado, correspondiente o una parte del mismo; y (b) cultivar el organismo no humano o una parte del mismo bajo condiciones que permiten la producción de cualquiera o más de los químicos finos listados en la Tabla FC o una composición que comprende cualquiera o más de los químicos finos listados en la Tabla FC en dicho organismo no humano o en el medio de cultivo que rodea dicho organismo no humano.

Una modalidad adicional de la presente invención se refiere a un proceso para la producción de cualquiera o más de los químicos finos listados en la Tabla FC, que comprende (a) incrementar o generar la actividad de un polipéptido que comprende un polipéptido según se representa en la línea respectiva en la columna 5 o 7 de la Tabla II o un homólogo o fragmento del mismo, una secuencia de consenso o al menos una secuencia recurrente del polipéptido según se representa en la línea respectiva en la columna 7 de la Tabla IV o incrementar o generar la actividad de un producto de expresión de una o más moléculas de ácido nucleico que comprenden un polinucleótido según se representa en la línea respectiva en la columna 5 o 7 de la Tabla I, preferiblemente la región codificante del mismo, o un homólogo o fragmento del mismo; de manera no dirigida en un organismo no humano o una parte del mismo; preferiblemente un microorganismo, una célula de planta, una planta o una parte de la misma, en comparación a un organismo no humano de tipo salvaje, no transformado, correspondiente o una parte del mismo; y (b) cultivar el organismo no humano bajo condiciones que permiten la producción de cualquiera o más de los químicos finos listados en la Tabla FC, o una composición que comprende cualquiera o más de los químicos finos listados en la Tabla FC en dicho organismo no humano o en el medio de cultivo que rodea dicho organismo no humano.

Una modalidad adicional de la presente invención se refiere a un proceso para la producción de cualquiera o más de los químicos finos listados en la Tabla FC, que comprende (a) incrementar o generar una o más actividades seleccionadas a partir del grupo que consiste de chaperón análogo a DnaJ en un organelo, preferiblemente en plástidos o la mitocondria, especialmente en plástidos, de un organismo no humano o una parte del mismo, preferiblemente un microorganismo, una célula de planta, una planta o una parte de la misma, en comparación a un organismo no humano de tipo salvaje, no transformado, correspondiente o una parte del mismo; y (b) cultivar el organismo no humano o una parte del mismo bajo condiciones que permiten la producción de cualquiera o más de los químicos finos listados en la Tabla FC o una composición que comprende cualquiera o más de los químicos finos listados en la Tabla FC en dicho organismo no humano o en el medio de cultivo que rodea dicho organismo no humano.

Una modalidad adicional de la presente invención se refiere a un proceso para la producción de cualquiera o más de los químicos finos listados en la Tabla FC, que comprende (al) incrementar o generar la actividad de un polipéptido que comprende un polipéptido según se representa en la línea respectiva en la columna 5 o 7 de la Tabla II o un homólogo o fragmento del mismo, una secuencia de consenso o al menos una secuencia recurrente del polipéptido según se representa en la columna 7 de la Tabla IV o incrementar o generar la actividad de un producto de expresión de una o más moléculas de ácido nucleico que comprenden un polinucleótido según se representa en la linea respectiva en la columna 5 o 7 de la Tabla I, preferiblemente la región codificante del mismo, o un homólogo o fragmento del mismo ; en un organelo, preferiblemente en plástidos o la mitocondria, especialmente en plástidos, en un organismo no humano o una parte del mismo; preferiblemente un microorganismo, una célula de planta, una planta o una parte de la misma, en comparación a un organismo no humano de tipo salvaje, no transformado, correspondiente o una parte del mismo; o (a2) incrementar o generar la actividad de un polipéptido que comprende un polipéptido según se representa en la línea respectiva en la columna 5 o 7 de la Tabla II o un homólogo o fragmento del mismo, una secuencia de consenso o al menos una secuencia recurrente del polipéptido según se representa en la linea respectiva en la columna 7 de la Tabla IV que se une a un péptido de tránsito; o incrementar o generar la actividad de un producto de expresión de una o más moléculas de ácido nucleico que comprenden un polinucleótido según se representa en la linea respectiva en la columna 5 o 7 de la Tabla I, preferiblemente la región codificante del mismo, o un homólogo o fragmento del mismo, que se une a una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una secuencia de localización de organelo, preferiblemente una secuencia de localización de plástido o una secuencia de localización de mitocondrión, especialmente una secuencia de localización de plástido; en un organismo no humano o una parte del mismo; preferiblemente un microorganismo, una célula de planta, una planta o una parte de la misma, en comparación a un organismo no humano de tipo salvaje, no transformado, correspondiente o una parte del mismo; o (a3) incrementar o generar la actividad de un polipéptido que comprende un polipéptido según se representa en la linea respectiva en la columna 5 o 7 de la Tabla II o un homólogo o fragmento del mismo, una secuencia de consenso o al menos una secuencia recurrente del polipéptido según se representa en la linea respectiva en la columna 7 de la Tabla IV o incrementar o generar la actividad de un producto de expresión de una o más moléculas de ácido nucleico que comprenden un polinucleótido según se representa en la línea respectiva en la columna 5 o 7 de la Tabla I, preferiblemente la región codificante del mismo, o un homólogo o fragmento del mismo; en un organelo, preferiblemente en plástidos o la mitocondria, especialmente en plástidos, en un organismo no humano o una parte del mismo; preferiblemente un microorganismo, una célula de planta, una planta o una parte de la misma, a través la transformación del organelo, en comparación a un organismo no humano de tipo salvaje, no transformado, correspondiente o una parte del mismo; y (b) cultivar el organismo no humano bajo condiciones que permiten la producción de cualquiera o más de los químicos finos listados en la Tabla FC, o una composición que comprende cualquiera o más de los químicos finos listados en la Tabla FC en dicho organismo no humano o en el medio de cultivo que rodea dicho organismo no humano.

Preferiblemente, la presente invención se refiere a un proceso para la producción de cualquiera o más de los químicos finos listados en la Tabla FC, que comprende: (a) incrementar o generar la actividad de un chaperón análogo a DnaJ en el citosol de una célula de un organismo no humano o una parte del mismo, preferiblemente un microorganismo, una célula de planta, una planta o una parte de la misma, en comparación a un organismo no humano de tipo salvaje, no transformado, correspondiente o una parte del mismo; y (b) cultivar el organismo no humano o una parte del mismo bajo condiciones que permiten la producción de cualquiera o más de los químicos finos listados en la Tabla FC o una composición que comprende cualquiera o más de los químicos finos listados en la Tabla FC en dicho organismo no humano o en el medio de cultivo que rodea dicho organismo no humano.

Consecuentemente, la presente invención se refiere a un proceso para la producción de cualquiera o más de los químicos finos listados en la Tabla FC, que comprende (a) incrementar o generar la actividad de un polipéptido que comprende un polipéptido según se representa en la línea respectiva en la columna 5 o 7 de la Tabla II o un homólogo o fragmento del mismo, una secuencia de consenso o al menos una secuencia recurrente del polipéptido según se representa en la línea respectiva en la columna 7 de la Tabla IV o incrementar o generar la actividad de un producto de expresión de una o más moléculas de ácido nucleico que comprenden un polinucleótido según se representa en la línea respectiva en la columna 5 o 7 de la Tabla I, preferiblemente la región codificante del mismo, o un homólogo o fragmento del mismo; en el citosol de una célula de un organismo no humano o una parte del mismo; preferiblemente un microorganismo, una célula de planta, una planta o una parte de la misma, en comparación a un organismo no humano de tipo salvaje, no transformado, correspondiente o una parte del mismo; y (b) cultivar el organismo no humano bajo condiciones que permiten la producción de cualquiera o más de los químicos finos listados en la Tabla FC, o una composición que comprende cualquiera o más de los químicos finos listados en la Tabla FC en dicho organismo no humano o en el medio de cultivo que rodea dicho organismo no humano.

A lo largo de esta solicitud, una referencia a cualquiera o más de los químicos finos según se lista en la Tabla FC pretende significar sacarosa, mio-inositol , ácido linoleico o ácido linolénico, o cualquier combinación de los mismos.

En una modalidad, el químico fino generado o incrementado por los procesos inventivos en una planta, una célula de planta, una parte cosechable o un producto agrícola es sacarosa, o una combinación seleccionada a partir del grupo que consiste de: 1. sacarosa y mio-inositol, 2. sacarosa y ácido linoleico, 3. sacarosa y ácido linolénico, y 4. sacarosa y mio-inositol y ácido linoleico y ácido linolénico.

En otra modalidad, el químico fino generado o incrementado por los procesos inventivos en una planta, una célula de planta, una parte cosechable o un producto agrícola es mio-inositol, o una combinación seleccionada a partir del grupo que consiste de: 1. mio-inositol y sacarosa, 2. mio-inositol y ácido linoleico, 3. mio-inositol y ácido linolénico, y 4. sacarosa y mio-inositol y ácido linoleico y linolénico .

En otra modalidad, el químico fino generado o incrementado por los procesos inventivos en una planta, una célula de planta, una parte cosechable o un producto agrícola es ácido linoleico, o una combinación seleccionada a partir del grupo que consiste de: 1. ácido linoleico y sacarosa, 2. mio-inositol y ácido linoleico, 3. ácido linoleico y ácido linolénico, y 4. sacarosa y mio-inositol y ácido linoleico y ácido linolénico .

En otra modalidad, el químico fino generado o incrementado por los procesos inventivos en una planta, una célula de planta, una parte cosechable o un producto agrícola es ácido linolénico, o una combinación seleccionada a partir del grupo que consiste de: 1. ácido linolénico y sacarosa, 2. mio-inositol y ácido linolénico, 3. ácido linoleico y ácido linolénico, y 4. sacarosa y mio-inositol y ácido linoleico y ácido linolénico.

A causa de la introducción de un gen o una pluralidad de genes que confieren la expresión de la molécula que codifica el chaperón análogo a DnaJ o del polipéptido chaperón análogo a DnaJ, por ejemplo el constructo de ácido nucleico mencionado a continuación, o que codifican la proteina según se muestra en la linea respectiva en la Tabla II columna 5 o 7, u homólogos o fragmentos de la misma, en un organismo no humano solos o en combinación con otros genes, es posible no sólo incrementar el flujo biosintético hacia el producto final, sino también incrementar, modificar o crear de novo una composición de metabolitos, preferiblemente novedosa, ventajosa, en el organismo no humano, por ejemplo una composición ventajosa que comprende un contenido más alto de (desde un punto de vista de la fisiología nutricional limitada) cualquiera o más de los químicos finos listados en la Tabla FC y si se desea otros ácidos grasos y/o sacáridos, y/u otros metabolitos, en forma libre o enlazada.

En una modalidad adicional, la actividad del polipéptido que comprende un polipéptido según se representa en la línea respectiva en la columna 5 o 7 de la Tabla II o un homólogo o fragmento del mismo, una secuencia de consenso o al menos una secuencia recurrente del polipéptido según se representa en la linea respectiva en la columna 7 de la Tabla IV, se incrementa o genera de manera no dirigida en el proceso anteriormente mencionado en un microorganismo o planta o una parte de los mismos .

En una modalidad adicional, dicho polipéptido tiene la actividad del polipéptido respectivo representado por una proteina que comprende un polipéptido según se representa en la linea respectiva en la columna 5 de la Tabla II.

En una modalidad adicional, la actividad del producto de expresión de una o más moléculas de ácido nucleico que comprenden un polinucleót ido según se representa en la linea respectiva en la columna 5 o 7 de la Tabla I, preferiblemente la región codificante del mismo, o un homólogo o fragmento del mismo, se incrementa o genera de manera no dirigida en el proceso anteriormente mencionado en un microorganismo o planta o una parte de los mismos.

En una modalidad adicional, la actividad del polipéptido que comprende un polipéptido según se representa en la linea respectiva en la columna 5 o 7 de la Tabla II o un homólogo o fragmento del mismo, una secuencia de consenso o al menos una secuencia recurrente del polipéptido según se representa en la linea respectiva en la columna 7 de la Tabla IV, se incrementa o genera en el proceso anteriormente mencionado en el citosol de una célula, de un microorganismo o planta.

En una modalidad adicional, la actividad del producto de expresión de una o más moléculas de ácido nucleico que comprenden un polinucleótido según se representa en la linea respectiva en la columna 5 o 7 de la Tabla I, preferiblemente la región codificante del mismo, o un homólogo o fragmento del mismo, se incrementa o genera en el proceso anteriormente mencionado en el citosol de una célula, de un microorganismo o planta .

En una modalidad adicional de la presente invención, el proceso adicionalmente comprende la etapa de recuperar el químico fino, cual se sintetiza por el organismo a partir del organismo y/o a partir del medio de cultivo utilizado para el crecimiento o mantenimiento del organismo.

Para los propósitos de la presente invención, por regla general, el plural pretende abarcar el singular y viceversa, salvo indicación contraria.

Los términos "incrementar", "elevar", "extender", "mejorar", y "amplificar" así como las versiones gramaticales de los mismos se refieren a un cambio correspondiente de una propiedad en un organismo no humano, una parte de un organismo tal como un tejido, semilla, raíz, hoja, flor, polen, etcétera, o en una célula y son intercambiables. Preferiblemente, la actividad global en el volumen se incrementa o mejora en los casos si el incremento o la mejora se refiere al incremento o la mejora de una actividad de un producto genético, independientemente si se incrementa o mejora la cantidad de producto genético o la actividad especifica del producto genético o ambos, o si se incrementa o mejora la cantidad, la estabilidad o la eficacia de traducción de la secuencia de ácidos nucleicos o el gen que codifica el producto genético.

Bajo "cambio de una propiedad" se entiende que la actividad, el nivel de expresión o la cantidad de un producto genético o el contenido del metabolito se cambia en un volumen especifico con relación a un volumen correspondiente de un control, referencia o tipo salvaje, incluyendo la creación de novo de la actividad o la expresión.

Con relación a los químicos finos, el término "incrementar" se puede dirigir a un cambio de dicha propiedad en el sujeto de la presente invención o sólo en una parte del mismo, por ejemplo, el cambio se puede encontrar en un compartimiento de una célula, como un organelo, o en una parte de un organismo no humano, como el tejido de la planta, la semilla de la planta, la raíz de la planta, el polen, la hoja, la flor, etcétera, pero no es detectable en el sujeto entero, es decir, la célula o planta completa, si se prueba.

El término "incrementar" significa que la actividad específica de un polipéptido o la cantidad de un compuesto o de un metabolito, por ejemplo de un polipéptido, una molécula de ácido nucleico o un ADN o ARNm codificante o el químico fino, se puede incrementar en un volumen.

El término "incrementar" incluye que un compuesto o una actividad se introduce en una célula o un compartimiento sub- celular u organelo de novo, o que el compuesto o la actividad no ha sido detectable antes, en otras palabras, se "genera". Son particularmente preferidos los incrementos debidos la introducción de un ADN, preferiblemente un ADN extraño, mediante tecnología genética recombinante.

Consecuentemente, a lo largo de la solicitud, el término "incrementar" también comprende el término "generar" o "estimular". La actividad incrementada se manifiesta en un incremento del químico fino.

En una modalidad, los métodos de la invención se realizan por la sobre-expresión de la molécula de ácido nucleico de la invención en una célula de planta o una planta.

La invención también incluye métodos para la producción de un producto que comprenden a) cultivar las plantas con expresión incrementada del chaperón(es) análogo (s) a DnaJ, (^preferiblemente plantas en donde la expresión de dicho chaperón análogo a DnaJ según se define anteriormente se incrementa por medios biotecnológicos, por ejemplo, por introducción estable de dicho chaperón(es) análogo (s) a DnaJ y b) producir dicho producto a partir de o por las plantas de la invención o partes, incluyendo semillas, de estas plantas, en donde el producto tiene un contenido incrementado de cualquiera o más de los químicos finos listados en la Tabla FC en comparación a un producto producido a partir de una planta de control. En una modalidad adicional, los métodos comprenden las etapas a) cultivar las plantas con expresión incrementada del chaperón análogo a DnaJ, b) remover las partes cosechables según se define anteriormente a partir de las plantas y c) producir dicho producto a partir de o por las partes cosechables de la invención, en donde el producto tiene un contenido incrementado de cualquiera o más de los químicos finos listados en la Tabla FC en comparación a un producto producido a partir de una planta de control.

Los productos de los procesos inventivos para la producción de dichos productos son superiores a los productos producidos a partir de las plantas de control, debido a que la plantas y las partes de planta utilizadas para la producción del producto son de calidad mejorada y/o tienen un contenido incrementado de uno o más de los químicos finos listados en la Tabla FC. Por ejemplo, las semillas con contenido incrementado de los ácidos grasos no saturados y ácidos linoleico y linolénico pueden ser tal producto, el cual ventajosamente se puede utilizar en un número de aplicaciones que se extienden dentro del rango desde comida y pienso hasta la producción de aceites y lubricantes. La biomasa con contenido incrementado de sacarosa puede ser otro producto de propiedad incrementada para diversas aplicaciones que se extienden dentro del rango desde la producción de azúcares, forraje, materia prima para los procesos de fermentación hasta la producción de etanol o gas biológico.

Un ejemplo de tales métodos inventivos seria cultivar plantas de maiz de la invención, cosechar las mazorcas de maíz y remover los granos. Estos se pueden utilizar como forraje mejorado o se pueden procesar a aceite y jarabe de almidón de maíz como productos agrícolas.

El producto se puede producir en el sitio donde se ha cultivado la planta, o las plantas o las partes de las mismas se pueden remover del sitio donde se han cultivado las plantas, para producir el producto. Típicamente, la planta se cultiva, las partes cosechables deseadas se remueven de la planta, si es factible en ciclos repetidos, y el producto se hace a partir de las partes cosechables de la planta. La etapa de cultivar la planta se puede realizar solo una vez cada vez que se realizan los métodos de la invención, mientras que se permiten repetidas veces las etapas de producción del producto, por ejemplo, mediante la remoción repetida de las partes cosechables de las plantas de la invención y, si es necesario, el procesamiento adicional de estas partes para llegar al producto. También es posible que se repita la etapa de cultivar las plantas de la invención, y que las plantas o las partes cosechables se almacenen hasta que se realice posteriormente la producción del producto para las plantas o partes de las plantas acumuladas. Además, las etapas de cultivar las plantas y producir el producto se pueden realizar con un traslape en el tiempo, incluso simultáneamente en gran parte, o secuencialmente . Generalmente, las plantas se cultivan durante cierto tiempo antes de que se produzca el producto. Ventajosamente, los métodos de la invención son más eficientes que los métodos conocidos, debido a que las plantas de los procesos inventivos tienen rendimiento incrementado, rasgo (s) relacionado ( s ) al rendimiento y tolerancia de estrés a un estrés medioambiental, particularmente a la disponibilidad de agua limitada y la sequía en comparación a una planta de control utilizada en métodos comparables y/o contenido incrementado de cualquiera o más de los químicos finos listados en la Tabla FC en las plantas, partes cosechables tales como la biomasa de los brotes, semilla, o la biomasa de la remolacha y/o los productos producidos.

Otra modalidad de la presente invención se dirige a métodos para la producción de un producto con contenido incrementado de cualquiera o más de los químicos finos listados en la Tabla FC con relación a un producto de una planta de control, que comprenden las etapas de a. generar una o más plantas utilizando cualquiera de los métodos inventivos para incrementar el contenido de cualquiera o más de los químicos finos listados en la Tabla FC en las plantas en comparación a las plantas de control según se describe aquí, b. cultivar las plantas de la etapa a) o las plantas progenie de las mismas, es decir, la descendencia de las plantas generadas en la etapa a) , en donde las plantas progenie tienen contenido incrementado, al menos en algunas partes de la planta utilizadas en los métodos para la producción de dicho producto, de cualquiera o más de los químicos finos listados en la Tabla FC en comparación a una planta de control, y comprenden y expresan, al menos en algunas partes de la planta, el ácido nucleico que codifica el chaperón análogo a DnaJ, preferiblemente el ácido nucleico recombinante que codifica el chaperón análogo a DnaJ, y c. producir dicho producto a partir de o por (i) dichas plantas; o (ii) partes, incluyendo semillas, biomasa de los brotes, biomasa de la remolacha, tubérculos, de dichas plantas, en donde dichas plantas o partes de dichas plantas tienen un contenido incrementado de cualquiera o más de los químicos finos listados en la Tabla FC con relación a una planta de control o partes de una planta de control.

En una modalidad, los productos producidos por dichos métodos de la invención son productos de planta tales como, pero no limitado a, un producto alimenticio, forraje, un suplemento alimenticio, un suplemento de pienso, fibra, un producto cosmético o un producto farmacéutico. Los productos alimenticios se consideran como composiciones utilizadas para la nutrición o para suplementar la nutrición. Los forrajes animales y los suplementos de pienso animal, en particular, se consideran como productos alimenticios.

En otra modalidad, los métodos inventivos para la producción se utilizan para hacer productos agrícolas tales como, pero no limitado a, extractos de plantas, proteínas, aminoácidos, carbohidratos, grasas, aceites, polímeros, vitaminas, y similares.

Es posible que un producto de planta consista de uno o más productos agrícolas en gran medida.

En todavía otra modalidad, las secuencias de polinucleótidos o las secuencias de polipéptidos de la invención están comprendidas en un producto agrícola, en donde el producto agrícola tiene un contenido incrementado de cualquiera o más de los químicos finos listados en la Tabla FC en comparación a un producto agrícola producido a partir de una planta de control.

En una modalidad adicional, las secuencias de ácidos nucleicos y las secuencias de proteínas de la invención se pueden utilizar como marcadores del producto, por ejemplo para un producto agrícola producido por los métodos de la invención. Tal marcador se puede utilizar para identificar un producto por haber sido producido por un proceso ventajoso que da como resultado no sólo una mayor eficiencia del proceso sino también calidad mejorada del producto debido a la calidad incrementada del material de planta y las partes cosechables utilizadas durante el proceso. Tales marcadores se pueden detectar por una variedad de métodos conocidos en el arte, por ejemplo, pero no limitado a, métodos basados en PCR para la detección de ácidos nucleicos o métodos basados en anticuerpos para la detección de proteínas.

Los métodos de la invención son ventajosamente aplicables a cualquier planta, en particular a cualquier planta según se define aqui. Las plantas que son particularmente útiles en los métodos de la invención incluyen todas las plantas que pertenecen a la superfamilia Viridiplantae, en particular plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas incluyendo forraje o legumbres forrajeras, plantas ornamentales, cultivos comestibles, árboles o arbustos.

De acuerdo con una modalidad de la presente invención, la planta es una planta de cultivo. Ejemplos de las plantas de cultivo incluyen, pero no se limitan a, achicoria, zanahoria, mandioca, trébol, soya, remolacha, remolacha azucarera, girasol, cañóla, alfalfa, colza, linaza, algodón, tomate, papa y tabaco.

De acuerdo con otra modalidad de la presente invención, la planta es una planta monocotiledónea . Ejemplos de plantas monocotiledóneas incluyen la caña de azúcar.

De acuerdo con otra modalidad de la presente invención, la planta es un cereal. Ejemplos de los cereales incluyen arroz, maíz, trigo, cebada, mijo, centeno, triticale, sorgo, escanda, espelta, escaña, teff, sorgo milo y avena.

En una modalidad, las plantas utilizadas en los métodos de la invención se seleccionan a partir del grupo que consiste de maíz, trigo, arroz, soya, algodón, colza oleaginosa incluyendo cañóla, caña de azúcar, remolacha azucarera y alfalfa .

En otra modalidad de la presente invención, las plantas utilizadas en los métodos de la invención son plantas de caña de azúcar con biomasa incrementada y/o contenido incrementado de sacarosa de los tallos.

En otra modalidad de la presente invención, las plantas utilizadas en los métodos de la invención son plantas de remolacha azucarera con biomasa incrementada y/o contenido incrementado de sacarosa de la remolacha.

La invención también se extiende a partes cosechables de una planta tales como, pero no limitado a semillas, hojas, frutos, flores, tallos, raices, rizomas, tubérculos de remolachas y bulbos, cuyas partes cosechables comprenden un ácido nucleico recombinante que codifica un polipéptido chaperón análogo a DnaJ. La invención adicionalraente se refiere a productos derivativos o producidos, preferiblemente derivados directamente o producidos directamente, a partir de una parte cosechable de tal planta, tales como pelets secos o polvos, aceite, grasa y ácidos grasos, almidón o proteínas. En una modalidad, el producto comprende un ácido nucleico recombinante que codifica un polipéptido chaperón análogo a DnaJ y/o un polipéptido chaperón análogo a DnaJ recombinante.

La presente invención también abarca el uso de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos chaperones análogos a DnaJ según se describe aquí y el uso de estos polipéptidos chaperones análogos a DnaJ en mejorar cualquiera de los rasgos relacionados al rendimiento anteriormente mencionados en plantas bajo condiciones de estrés medioambiental abiótico y/o condiciones sin estrés, preferiblemente bajo condiciones de disponibilidad de agua limitada, más preferiblemente bajo condiciones de sequía, y/o el contenido incrementado de cualquiera o más de los químicos finos listados en la Tabla FC con relación a la planta de control. Por ejemplo, los ácidos nucleicos que codifican el polipéptido chaperón análogo a DnaJ aquí descrito, o los polipéptidos chaperones análogos a DnaJ mismos, pueden encontrar uso en programas de reproducción en los cuales se identifica un marcador de ADN que puede estar genéticamente vinculado a un gen que codifica el polipéptido chaperón análogo a DnaJ. Los ácidos nucleicos/genes, o los polipéptidos chaperones análogos a DnaJ mismos se pueden utilizar para definir un marcador molecular. Este marcador de proteina o ADN posteriormente se puede utilizar en los programas de reproducción para seleccionar plantas que tienen rasgos relacionados al rendimiento, mejorados, según se define aquí anteriormente en los métodos de la invención. Adicionalmente, las variantes alélicas de un gen/ácido nucleico que codifica el polipéptido chaperón análogo a DnaJ pueden encontrar uso en programas de reproducción asistida por marcador. Los ácidos nucleicos que codifican polipéptidos chaperones análogos a DnaJ también se pueden utilizar como sondas para mapear genéticamente y físicamente los genes de los cuales son parte, y como marcadores para los rasgos asociados a esos genes. Tal información puede ser útil en la reproducción de plantas a fin de desarrollar líneas con los fenotipos deseados.

En una modalidad, se realiza cualquier comparación para determinar los porcentajes de identidad de secuencia - en el caso de una comparación de ácidos nucleicos sobre la región codificante entera de SEQ ID NO: 1 o 41, preferiblemente SEQ ID NO: 1, o en el caso de una comparación de secuencias de polipéptidos sobre la longitud completa de SEQ ID NO: 2, o 42, preferiblemente SEQ ID NO: 2.

Por ejemplo, una identidad de secuencia del 50%, en esta modalidad, significa que sobre la región codificante entera de SEQ ID NO: 1, 50 por ciento de todas las bases son idénticas entre la secuencia de SEQ ID NO: 1 y la secuencia relacionada. De modo semejante, en esta modalidad, una secuencia de polipéptidos es 50% idéntica a la secuencia de polipéptidos de SEQ ID NO: 2, cuando el 50 por ciento de los residuos de aminoácidos de la secuencia según se representa en SEQ ID NO: 2, se encuentra en el polipéptido probado al comparar desde la metionina de inicio hasta el final de la secuencia de SEQ ID NO: 2.

En una modalidad, las secuencias de ácidos nucleicos empleadas en los métodos, constructos, plantas, partes cosechables y productos de la invención son secuencias que codifican el chaperón análogo a DnaJ pero excluyendo aquellos ácidos nucleicos que codifican las secuencias de polipéptidos divulgadas en cualquiera de: 1. WO0216655 2. WO2004061 080 3. US2004181830 4. WO03012096 5. Base de datos EMBL acceso de entrada no. AK066420 En una modalidad adicional, las secuencias de ácidos nucleicos empleadas en los métodos, constructos, plantas, partes cosechables y productos de la invención son aquellas secuencias que no son los polinucleótidos que codifican las proteínas seleccionadas a partir del grupo que consiste de las proteínas de SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40 o 42, y aquellas de al menos 60, 70, 75, 80, 85, 90, 93, 95, 98 o 99% de identidad de nucleótidos cuando se alinean óptimamente a las secuencias que codifican las proteínas listadas en la Tabla A, pero excluyendo aquellas que codifican las proteínas de SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40 o 42.

En otra modalidad, los términos "con relación a", "en comparación con" y "comparado a" se pueden utilizar de forma intercambiable, preferiblemente al referirse a la comparación de plantas con las plantas de control, partes o productos producidos a partir de las plantas en comparación a aquellos de las plantas de control o el contenido de los químicos finos de las mismas.

En una modalidad adicional, los términos "producto de expresión" y "producto genético" se deben entender como ambos: que se refieren a y que son sinónimos con el polipéptido (s) chaperón(es) análogo (s) a DnaJ según se define aquí anteriormente .

En lo siguiente, la expresión "según se define en la reivindicación/elemento X" pretende dirigir al artesano para aplicar la definición según se divulga en el elemento/reivindicación X. Por ejemplo, "un ácido nucleico según se define en el elemento 1" se tiene que entender de modo que la definición de un ácido nucleico del elemento 1 deba ser aplicada al ácido nucleico. En consecuencia, el término "según se define en el elemento" o "según se define en la reivindicación" se puede reemplazar con la definición correspondiente de ese elemento o reivindicación, respectivamente .

Elementos Las definiciones y explicaciones dadas aquí anteriormente aplican mutatis mutandis a los siguientes elementos. 1. Un método para incrementar el contenido de cualquiera o más de los químicos finos listados en la Tabla FC en plantas comparadas a las plantas de control y para mejorar los rasgos relacionados al rendimiento en plantas bajo condiciones de estrés, preferiblemente bajo condiciones de estrés medioambiental abiótico según se define aquí, y/o condiciones sin estrés, que comprende modular la expresión, en una planta, de un ácido nucleico que codifica un polipéptido POI, en donde dicho polipéptido POI es un chaperón análogo a DnaJ. 2. Un método para mejorar los rasgos relacionados al rendimiento en plantas bajo condiciones de estrés, preferiblemente bajo condiciones de estrés medioambiental abiótico según se define aquí, con relación a las plantas de control, que comprende modular la expresión, en una planta, de un ácido nucleico que codifica un polipéptido POI, en donde dicho polipéptido POI es un chaperón análogo a DnaJ. 3. Un método para incrementar el contenido de cualquiera o más de los químicos finos listados en la Tabla FC en plantas con relación a las plantas de control, que comprende modular la expresión, en una planta, de un ácido nucleico que codifica un polipéptido POI, en donde dicho polipéptido POI es un chaperón análogo a DnaJ. 4. El método de acuerdo con cualquiera de los elementos 1 a 3, en donde dicha expresión modulada se efectúa introduciendo y expresando, en una planta, dicho ácido nucleico que codifica dicho polipéptido POI, preferiblemente introduciendo y expresando dicho ácido nucleico por medios biotecnológicos como ácido nucleico recombinante, preferiblemente mediante integración estable en el genoma de la planta. 5. El método de acuerdo con cualquier elemento previo, en donde el ácido nucleico que codifica el chaperón análogo a DnaJ se selecciona a partir del grupo que consiste de: (i) un ácido nucleico representado por SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39 o 41; (ii) el complemento de un ácido nucleico representado por SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39 o 41; (iii) un ácido nucleico que codifica un polipéptido POI que tiene en orden creciente de preferencia al menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad de secuencia a la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40 o 42 y que adicionalmente comprende uno o más dominios que tienen en orden creciente de preferencia al menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia a cualquiera o más de los dominios PFAM PF00226, PF01556 y PF00684, preferiblemente al dominio conservado que inicia con el aminoácido 6 hasta el aminoácido 67 y/o al dominio conservado que inicia con el aminoácido 143 hasta el aminoácido 208 y/o al dominio conservado que inicia con el aminoácido 265 hasta el aminoácido 348 en el SEQ ID NO: 2, y adicionalmente preferiblemente que confiere rasgos relacionados al rendimiento mejorados con relación a las plantas de control bajo condiciones de estrés medioambiental abiótico y/o condiciones sin estrés, y/o contenido incrementado de químicos finos de uno o más químicos finos según se lista en la tabla FC. (iv) un ácido nucleico que codifica el polipéptido según se representa por (cualquiera de) SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40 o 42 preferiblemente como resultado de la degeneración del código genético, dicho ácido nucleico aislado se puede derivar o deducir a partir de una secuencia de polipéptidos según se representa por (cualquiera de) SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40 o 42 y adicionalmente preferiblemente que confiere rasgos relacionados al rendimiento mejorados con relación a las plantas de control bajo condiciones de estrés medioambiental abiótico y/o condiciones sin estrés, y/o contenido incrementado de químicos finos de uno o más químicos finos según se lista en la tabla FC; (v) un ácido nucleico que codifica un polipéptido POI que comprende uno o más, preferiblemente a los tres patrones de consenso de SEQ ID NO: 45, 46 y 47 y adicionalmente preferiblemente que confiere rasgos relacionados al rendimiento mejorados con relación a las plantas de control bajo condiciones de estrés medioambiental abiótico y/o condiciones sin estrés, y/o contenido incrementado de químicos finos de uno o más químicos finos según se lista en la tabla FC; (vi) una molécula de ácido nucleico que híbrida con una molécula de ácido nucleico de (ii) bajo condiciones de hibridación de alta severidad y preferiblemente confiere rasgos relacionados al rendimiento mejorados con relación a las plantas de control bajo condiciones de estrés medioambiental abiótico y/o condiciones sin estrés, y/o contenido incrementado de químicos finos de uno o más químicos finos según se lista en la tabla FC. 6. El método de acuerdo con el elemento de cualquiera de los elementos 1, 2, 4 o 5, en donde dichos rasgos relacionados al rendimiento mejorados comprenden incrementado rendimiento -vigor temprano con relación a las plantas de control, y preferiblemente comprenden biomasa incrementada y/o rendimiento de semilla incrementado con relación a las plantas de control. 7. El método de acuerdo con cualquiera de los elementos 1, 2, 4, 5 o 6, en donde dichos rasgos relacionados al rendimiento mejorados se obtienen bajo condiciones de sequía, estrés por salinidad o deficiencia de nitrógeno, preferiblemente sequía. 8. El método de acuerdo con el elemento 1, 2, 4 o 5 en donde dicho contenido incrementado de uno o más químicos finos se obtiene bajo condiciones sin estrés. 9. El método de acuerdo con cualquiera de los elementos 1 a 8, en donde dicho polipéptido POI comprende a. uno o más, preferiblemente dos, y más preferiblemente los tres de los siguientes dominios PFAM PF00226, PF01556 y PF00684 y al menos uno, preferiblemente cualesquiera dos, más preferiblemente los tres patrones de consenso de SEQ ID NO: 45, 46 y 47; y/o b. un dominio conservado que inicia con el aminoácido 6 hasta el aminoácido 67 y/o un dominio conservado que inicia con el aminoácido 143 hasta el aminoácido 208 y/o un dominio conservado que inicia con el aminoácido 265 hasta el aminoácido 348 en el SEQ ID NO: 2. 10. El método de acuerdo con cualquiera de los elementos 1 a 9, en donde dicha molécula de ácido nucleico o dicho polipéptido, respectivamente, es de origen de levadura, preferiblemente del género Saccharomyces, más preferiblemente de Saccharomyces cerevisiae . 11. El método de acuerdo con cualquiera de los elementos I a 10, en donde dicho ácido nucleico que codifica un POI codifica cualquiera de los polipéptidos listados en la Tabla II o es una porción de tal ácido nucleico, o un ácido nucleico capaz de hibridación con una secuencia complementaria de tal ácido nucleico. 12. El método de acuerdo con cualquiera de los elementos l a 11, en donde dicha secuencia de ácidos nucleicos codifica un ortólogo o parálogo de cualquiera de los polipéptidos dados en la Tabla II. 13. El método de acuerdo con cualquiera de los elementos 1 a 12, en donde dicho ácido nucleico codifica el polipéptido representado por el SEQ ID NO: 2 o 42, preferiblemente por el SEQ ID NO: 2. 14. El método de acuerdo con cualquiera de los elementos 1 a 13, en donde dicho ácido nucleico se enlaza operativamente a un promotor constitutivo. 15. El método de acuerdo con cualquiera de los elementos previos en donde dicha planta es una planta de cultivo, preferiblemente una dicotiledónea tal como remolacha azucarera, alfalfa, trébol, achicoria, zanahoria, mandioca, algodón, soya, colza oleaginosa incluyendo cañóla, o una monocotiledónea, tal como caña de azúcar, o un cereal, tal como arroz, maíz, trigo, cebada, mijo, centeno, triticale, sorgo, escanda, espelta, sécale, escaña, teff, sorgo milo y avena . 16. El uso de un constructo que comprende: (i) el ácido nucleico que codifica un POI según se define en cualquiera de los elementos 1, 5, 9 a 12; (ii) una o más secuencias de control capaces de dirigir la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos de (i) ; y opcionalmente (iü) una secuencia de terminación de la transcripción para incrementar el contenido de cualquiera o más de los químicos finos listados en la Tabla FC en plantas con relación a las plantas de control y/o incrementar los rasgos relacionados al rendimiento de una planta bajo condiciones de estrés, preferiblemente bajo condiciones de estrés medioambiental abiótico según se define aquí, y/o condiciones sin estrés, preferiblemente bajo condiciones de disponibilidad de agua limitada, más preferiblemente bajo condiciones de sequía con relación a una planta de control. 17. Los métodos de acuerdo con cualquiera de los elementos 1 a 15, en donde el ácido nucleico que codifica el POI se enlaza operativamente a una secuencia de control, o un uso de acuerdo con el elemento 16 en donde una de dichas secuencias de control es un promotor constitutivo. 18. Las partes cosechables de una planta obtenible mediante un método de acuerdo con cualquiera de los elementos 1 a 15, en donde dicha parte cosechable comprende un ácido nucleico recombinante que codifica dicho polipéptido según se define en cualquiera de los elementos 1, 5, 9 a 12, en donde dichas partes cosechables son preferiblemente biomasa de los brotes y/o semillas. 19. Los productos derivados o producidos a partir de una planta obtenible mediante un método de acuerdo con cualquiera de los elementos 1 a 15 y/o a partir de partes cosechables de una planta de acuerdo con el elemento 18. 20. El uso de un ácido nucleico que codifica un polipéptido POI según se define en cualquiera de los elementos 1, 5, 9 a 12, para incrementar el contenido de cualquiera o más de los químicos finos listados en la Tabla FC en plantas con relación a las plantas de control y/o incrementar los rasgos relacionados al rendimiento de una planta bajo condiciones de estrés, preferiblemente bajo condiciones de estrés medioambiental abiótico según se define aquí, y/o condiciones sin estrés, preferiblemente bajo condiciones de disponibilidad de agua limitada, más preferiblemente bajo condiciones de sequía con relación a una planta de control. 21. Un método para la producción de un producto con contenido incrementado de cualquiera o más de los químicos finos listados en la Tabla FC con relación a un producto de una planta de control que comprende las etapas de a. generar una o más plantas utilizando cualquiera de los métodos de acuerdo con cualquiera de los elementos 1 a 15; b. cultivar las plantas de la etapa a) o las plantas progenie de las mismas, en donde las plantas progenie tienen contenido incrementado, al menos en algunas partes de la planta utilizadas en los métodos para la producción de dicho producto, de cualquiera o más de los químicos finos listados en la Tabla FC en comparación a una planta de control, y comprenden y expresan, al menos en algunas partes de la planta, el ácido nucleico que codifica el chaperón análogo a DnaJ, preferiblemente el ácido nucleico recombinante que codifica el chaperón análogo a DnaJ, y c. producir dicho producto a partir de o por (i) dichas plantas; o (ii) partes, incluyendo semillas, biomasa de los brotes, biomasa de la remolacha, tubérculos, de dichas plantas, en donde dichas plantas o partes de dichas plantas tienen un contenido incrementado de cualquiera o más de los químicos finos listados en la Tabla FC con relación a una planta de control o partes de una planta de control. 22. Cualquiera de los elementos 1, 3 a 21, en donde el químico fino incrementado es sacarosa . 23. Cualquiera de los elementos 1, 3 a 21, en donde el químico fino incrementado es mio-inositol . 24. Cualquiera de los elementos 1, 3 a 21, en donde el químico fino incrementado es ácido linoleico. 25. Cualquiera de los elementos 1, 3 a 21, en donde el químico fino incrementado es ácido linolénico. 26. Cualquiera de los elementos 1, 3 a 21, en donde se incrementa una combinación de cualquiera de los químicos finos sacarosa, mio-inositol, ácido linoleico y ácido linolénico. Otras modalidades Elemento A a R: A. Un método para incrementar el contenido de cualquiera o más de los químicos finos listados en la Tabla FC en plantas comparadas a las plantas de control y/o para mejorar el rendimiento en plantas bajo condiciones de estrés, preferiblemente bajo condiciones de estrés medioambiental abiótico según se define aquí, y/o condiciones sin estrés, preferiblemente bajo condiciones de disponibilidad de agua limitada, más preferiblemente bajo condiciones de sequía, que comprende modular la expresión, en una planta, de una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido, en donde dicho polipéptido es un chaperón análogo a DnaJ B. El método de acuerdo con el elemento A, en donde dicho polipéptido comprende a) . uno o más, preferiblemente dos y más preferiblemente los tres de los siguientes dominios PFAM PF00226, PF01556 y PF00684 y al menos uno, preferiblemente cualesquiera dos, más preferiblemente los tres patrones de consenso de SEQ ID NO: 45, 46 y 47; y/o b) . el dominio conservado que inicia con el aminoácido 6 hasta el aminoácido 67 y/o el dominio conservado que inicia con el aminoácido 143 hasta el aminoácido 208 y/o el dominio conservado que inicia con el aminoácido 265 hasta el aminoácido 348 en el SEQ ID NO: 2.

C. El método de acuerdo con el elemento A o B, en donde dicha expresión modulada se efectúa introduciendo y expresando, en una planta, una molécula de ácido nucleico que codifica un chaperón análogo a DnaJ, preferiblemente introduciendo y expresando dicho ácido nucleico por medios biotecnológicos como ácido nucleico recombinante, preferiblemente mediante integración estable en el genoma de la planta.

D. El método de acuerdo con cualquiera de los elementos A a C, en donde dicho polipéptido se codifica por una molécula de ácido nucleico que comprende una molécula de ácido nucleico seleccionada a partir del grupo que consiste de: (i) un ácido nucleico representado por (cualquiera de) SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39 o 41; (ii) el complemento de un ácido nucleico representado por (cualquiera de) SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39 o 41; (iü) un ácido nucleico que codifica el polipéptido según se representa por (cualquiera de) SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40 o 42 preferiblemente como resultado de la degeneración del código genético, dicho ácido nucleico aislado se puede deducir a partir de una secuencia de polipéptidos según se representa por (cualquiera de) SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40 o 42 y adicionalmente preferiblemente que confiere rasgos relacionados al rendimiento mejorados con relación a las plantas de control bajo condiciones de estrés medioambiental abiótico y/o condiciones sin estrés, y/o contenido incrementado de químicos finos de uno o más químicos finos según se lista en la tabla FC; (iv) un ácido nucleico que tiene, en orden creciente de preferencia al menos 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43% , 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52 % / 53%/ 54%, 55% , 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67% , 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79% , 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91% , 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad de secuencia con cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39 o 41, y adicionalmente preferiblemente que confiere rasgos relacionados al rendimiento mejorados con relación a las plantas de control bajo condiciones de estrés medioambiental abiótico y/o condiciones sin estrés, y/o contenido incrementado de químicos finos de uno o más químicos finos según se lista en la tabla FC (v) una primera molécula de ácido nucleico que híbrida con una segunda molécula de ácido nucleico de (i) a (iv) bajo condiciones de hibridación rigurosas y adicionalmente preferiblemente que confiere rasgos relacionados al rendimiento mejorados con relación a las plantas de control bajo condiciones de estrés medioambiental abiótico y/o condiciones sin estrés, y/o contenido incrementado de químicos finos de uno o más químicos finos según se lista en la tabla FC; (vi) un ácido nucleico que codifica dicho polipéptido que tiene, en orden creciente de preferencia, al menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad de secuencia a la secuencia de aminoácidos representada por (cualquiera de) SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40 o 42 y adicionalmente preferiblemente que confiere rasgos relacionados al rendimiento mejorados con relación a las plantas de control bajo condiciones de estrés medioambiental abiótico y/o condiciones sin estrés, y/o contenido incrementado de químicos finos de uno o más químicos finos según se lista en la tabla FC; o (vii) un ácido nucleico que comprende cualquier combinación (es) de las características de (i) a (vi) anteriores .

E. El método de acuerdo con cualquier elemento A a D, en donde dichos rasgos relacionados al rendimiento mejorados comprenden rendimiento incrementado, preferiblemente rendimiento de la semilla y/o biomasa de los brotes con relación a las plantas de control.

F. El método de acuerdo con cualquiera de los elementos A a E, en donde dichos rasgos relacionados al rendimiento mejorados se obtienen bajo condiciones de disponibilidad de agua limitada.

G. El método de acuerdo con cualquiera de los elementos A a E, en donde dichos rasgos relacionados al rendimiento mejorados se obtienen bajo condiciones de estrés por sequía, estrés por salinidad o deficiencia de nitrógeno.

H. El método de acuerdo con cualquiera de los elementos A a D, en donde el incremento en al menos un químico fino se obtiene bajo condiciones sin estrés.

I. El método de acuerdo con cualquiera de los elementos A a D, F o G, en donde el incremento en al menos un químico fino se obtiene bajo condiciones de estrés medioambiental abiótico, preferiblemente condiciones de disponibilidad de agua limitada, más preferiblemente bajo condiciones de estrés por sequía .

J. El método de acuerdo con cualquiera de los elementos A a I, en donde dicho ácido nucleico se enlaza operativamente a un promotor constitutivo, preferiblemente a un promotor Big35S .

K. El método de acuerdo con cualquiera de los elementos A a J, en donde dicha molécula de ácido nucleico o dicho polipéptido, respectivamente, es de origen de planta, preferiblemente de una planta monocotiledónea, adicionalmente preferiblemente de la familia Poaceae, más preferiblemente del género Oryza, más preferiblemente de arroz.

L. El método de acuerdo con cualquiera de los elementos A a J, en donde dicha molécula de ácido nucleico o dicho polipéptido, respectivamente, es de origen de levadura, preferiblemente del género Saccharomyces, más preferiblemente de Saccharomyces cerevisiae.

M. El uso de un constructo que comprende: (i) el ácido nucleico que codifica dicho polipéptido según se define en cualquiera de los elementos A a D, K o L; (ii) una o más secuencias de control capaces de dirigir la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos de (a) ; y opcionalmente (iii) una secuencia de terminación de la transcripción; en un método para incrementar el contenido de cualquiera o más de los químicos finos listados en la Tabla FC en plantas con relación a las plantas de control y/o incrementar los rasgos relacionados al rendimiento de una planta bajo condiciones de estrés, preferiblemente bajo condiciones de estrés medioambiental abiótico según se define aqui, y/o condiciones sin estrés, preferiblemente bajo condiciones de disponibilidad de agua limitada, más preferiblemente bajo condiciones de sequía con relación a una planta de control.

N. Un método para la producción de un producto con contenido incrementado de contenido de cualquiera o más de los químicos finos listados en la Tabla FC con relación a un producto de una planta de control que comprende las etapas de i. generar una o más plantas utilizando cualquiera de los métodos de acuerdo con cualquiera de los elementos A a L; ii. cultivar las plantas de la etapa a) o las plantas progenie de las mismas, en donde las plantas progenie tienen contenido incrementado, al menos en algunas partes de la planta utilizadas en los métodos para la producción de dicho producto, de cualquiera o más de los químicos finos listados en la Tabla FC en comparación a una planta de control, y comprenden y expresan, al menos en algunas partes de la planta, el ácido nucleico que codifica el chaperón análogo a DnaJ, preferiblemente el ácido nucleico recombinante que codifica el chaperón análogo a DnaJ, y iii. producir dicho producto a partir de o por (i) dichas plantas; o (ii) partes, incluyendo semillas, biomasa de los brotes, biomasa de la remolacha, tubérculos, de dichas plantas, en donde dichas plantas o partes de dichas plantas tienen un contenido incrementado de cualquiera o más de los químicos finos listados en la Tabla FC con relación a una planta de control o partes de una planta de control. 0. El método de cualquier elemento A a L o N en donde dicha planta es una planta de cultivo, preferiblemente una dicotiledónea tal como remolacha azucarera, alfalfa, trébol, achicoria, zanahoria, mandioca, algodón, soya, cañóla o una monocotiledónea, tal como caña de azúcar, o un cereal, tal como arroz, maíz, trigo, cebada, mijo, centeno, triticale, sorgo, escanda, espelta, sécale, escaña, teff, sorgo milo y avena .

P. Las partes cosechables de una planta obtenible mediante un método de acuerdo con cualquiera de los elementos A a L u 0, en donde dicha parte cosechable de la misma comprende un ácido nucleico recombinante que codifica dicho polipéptido según se define en cualquiera de los elementos A a D, J, K, o L, en donde dichas partes cosechables son preferiblemente biomasa de los brotes y/o de las raices y/o semillas .

Q. Los productos producidos a partir de una planta obtenible mediante un método de acuerdo con cualquiera de los elementos A a L u O y/o a partir de partes cosechables de una planta de acuerdo con el elemento P.

R. El uso de un ácido nucleico que codifica un polipéptido según se define en cualquiera de los elementos A a D, K, L para incrementar el contenido de cualquiera o más de los químicos finos listados en la Tabla FC en plantas con relación a las plantas de control y/o incrementar los rasgos relacionados al rendimiento de una planta bajo condiciones de estrés, preferiblemente bajo condiciones de estrés medioambiental abiótico según se define aquí, y/o condiciones sin estrés, preferiblemente bajo condiciones de disponibilidad de agua limitada, más preferiblemente bajo condiciones de sequía con relación a una planta de control.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La presente invención se describirá ahora con referencia a las siguientes figuras en las cuales: Figura 1 Vector pMTX155 (SEQ ID NO: 48) utilizado para clonar el gen de interés para la expresión no dirigida.

Tablas 0 a III En una linea de la Tabla I se listan las moléculas de ácidos nucleicos relacionadas. En la columna 3 se proporciona el nombre del locus, a menudo también referido como nombre del gen, en la columna 5 el principal SEQ ID NO. y en la columna 7 el SEQ ID NO. de los homólogos del mismo. En la linea correspondiente de la Tabla II, se listan los polipéptidos respectivos. En la columna 3, se proporciona el nombre de la proteina (que está de acuerdo con el entendimiento común de la persona experta en el arte usualmente utilizado para el gen asi como para el polipéptido y por consiguiente idéntico con el nombre del gen/nombre del locus) , en la columna 5 el (correspondiente) principal SEQ ID NO. y en la columna 7 el (correspondiente) SEQ ID NO. de los homólogos del mismo.

En las Tablas I y II, en la columna 4 se proporciona la información acerca de a partir de cuál organismo se ha identificado la principal secuencia de acuerdo con la columna 5, en la columna 7 se proporciona la información acerca de cuál químico fino se genera o incrementa, y en una modalidad especial en la columna 6 se proporciona la información acerca de la expresión no dirigida o la expresión en los plástidos o la mitocondria.

Las Tablas III y IV se disponen en consecuencia por lo que en la columna 7 de la Tabla III se listan los cebadores que se pueden utilizar para amplificar la secuencia de la principal secuencia correspondiente indicada en la columna 5 de la misma línea y por lo que en la columna 7 de la Tabla IV se listan las secuencias de consenso y patrón que se comparten por la principal secuencia según se indica en la columna 5 de la misma línea y sus homólogos listados en la misma línea en la Tabla II columna 7. El cómo se determinan las secuencias de consenso y patrón se describe más adelante, en más detalle, en la solicitud.

La Tabla 0 muestra los vectores binarios utilizados en el Ejemplo 8.

Visión general de los diferentes vectores utilizados para clonar los ORFs; que muestra sus SEQ ID NOs (columna 1), sus nombres de vector (columna 2) , los promotores que éstos contienen para la expresión de los ORFs (columna 3) , si está presente, la secuencia objetivo artificial adicional (columna 4), la secuencia adaptadora (columna 5), el tipo de expresión conferido por el promotor mencionado en la columna 3 (columna 6) y el número de figura (columna 7) .

En la columna 3 PcUbi se refiere al promotor PcUbi (Kawalleck et al., Plant . Molecular Biology, 21, 673 (1993)) también llamado p-PcUBI en la tabla d, Súper al Súper promotor (Ni et al., Plant Journal 7, 661 (1995), WO 95/14098) también llamado p-Súper en la tabla d, Big35S al promotor 35S mejorado (Comai et al., Plant Mol Biol 15, 373-383 (1990) y USP al promotor USP (Baeumlein et al., Mol Gen Genet . 225 ( 3 ) : 59-67 (1991)) también llamado p-USP en la tabla 'd.

Tabla I: Números de ID de secuencia de ácidos nucleicos Tabla II: Números de ID de secuencia de aminoácidos Tabla III: Números de ID de secuencia de ácidos nucleicos del cebador Tabla IV: Números de ID de secuencia de aminoácidos de consenso Ejemplos La presente invención se describirá ahora con referencia a los siguientes ejemplos, los cuales sirven a modo de ilustración solamente. Los siguientes ejemplos no tienen la intención de limitar el ámbito de la invención.

Manipulación del ADN: a menos que se establezca de otra manera, las técnicas de ADN recombinante se lleva a cabo de acuerdo con los protocolos estándar escritos en (Sambrook (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3ra Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, Nueva York) o en los Volúmenes 1 y 2 de Ausubel et al., (1994), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols. Los materiales y los métodos estándar para el trabajo molecular en plantas se describen en Plant Molecular Biology Labfax (1993) de R.D.D. Croy, publicado por Bios Scientific Publications Ltd (RU) y Blackwell Scientific Publications (RU) .

Ejemplo 1 : Identificación de las secuencias relacionadas con la SEC ID NO: 1 y la SEC ID NO: 2 Las secuencias (ADNc de longitud completa, ESTs o genómicas) relacionadas con la SEC ID NO: 1 y la SEC ID NO: 2, se identificaron entre aquellas mantenidas en la base de datos de Nucleótidos Entrez en el National Center for Biotechnology Information (NCBI) usando las herramientas de búsqueda de secuencias de la base de datos, tales como la Herramienta de Alineación Local Básica (BLAST) (Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410; y Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402). El programa se usa para encontrar las regiones de similitud local entre las secuencias, al comparar las secuencias del ácido nucleico o del polipéptido con las bases de datos de secuencias y calculando la significación estadística de las correspondencias. Por ejemplo, el polipéptidos codificado por el ácido nucleico de la SEC ID NO: 1 se usó para el algoritmo TBLASTN, con los ajustes por defecto y el filtro para ignorar la activación de las secuencias de baja complejidad. El resultado del análisis se visualizó mediante la comparación por pares, y se calificó de acuerdo con el puntaje de probabilidad (valor E) , donde el puntaje refleja la probabilidad de que ocurra una alineación particular por casualidad (mientras menor sea el valor E, más significativa será la correspondencia. La identidad porcentual se refiere al número de nucleótidos (o aminoácidos) idénticos entre las dos secuencias de ácidos nucleicos (o polipéptidos ) comparadas sobre un segmento particular. En algunos casos, los parámetros por defecto pueden ser ajustados para modificar el rigor de la búsqueda. Por ejemplo, el valor E puede ser aumentado para mostrar las correspondencias menos rigurosas. De este modo, pueden ser identificadas correspondencias menos exactas.

La Tabla I proporciona una lista de secuencias de ácidos nucleicos relacionados con la SEC ID NO: 1 y la Tabla II muestra una lista de secuencias de aminoácidos relacionados con la SEC ID NO: 2. Las secuencias han sido ensambladas de forma tentativa y descritas públicamente por las instituciones de investigación, tales como The Institute for Genomic Research (TIGR; comenzando con TA) . Por ejemplo, la base de datos de Ortólogos de Genes Eucariotas (EGO) puede ser usada para identificar tales secuencias relacionadas, ya sea mediante búsqueda por teclado o usando el algoritmo BLAST con la secuencia de ácido nucleico o la secuencia de polipéptido de interés. Las bases de datos de secuencias de ácidos nucleicos especiales han sido creadas para organismos particulares, por ejemplo, para ciertos organismos procariotas, por ejemplo por el Joint Genome Institute.

Además, el acceso a las bases de datos de propiedad exclusiva, ha permitido la identificación de secuencias novedosas de ácidos nucleicos y polipéptidos .

Ejemplo 2 : Alineación de las secuencias de polipéptidos de chaperonas similares a DnaJ La alineación de las secuencias de polipéptido se lleva a cabo usando el algoritmo ClustalW 2.0 de alineación progresiva (Thompson et al., (1997) Nucleic Acids Res 25:4876-4882; Chenna et al., (2003), Nucleic Acid Res 31:3497-3500) con los ajustes estándar (alineación lenta, matriz de similitud: Gonnet, penalización por apertura de huecos 10, penalización por extensión del hueco 0.2) . Se realiza una edición manual menor para optimizar adicionalmente la alineación.

Se construye un árbol filogenético de los polipéptidos de chaperona similares a DnaJ, alineando las secuencias de chaperona similares a DnaJ usando MAFFT (Katoh y Toh (2008) -Briefings in Bioinformatics 9:286-289). Se calculó un árbol de vinculación con el vecino más próximo usando Quick-Tree (Howe et al., (2002) Bioinformatics 18(11): 1546-7), 100 repeticiones de bootstrap o auto-sostenidas. El dendograma se dibuja usando un Dendroscopio (Hudson et al., (2007), BMC Bioinformatics 8(1): 60). Los niveles de confianza para 100 repeticiones de bootstrap o auto-sostenidas se indican para las ramificaciones principales.

Ejemplo 3: Cálculo del porcentaje de identidad global entre las secuencias de polipeptido .

Los procentajes globales de similitud e identidad entre las secuencias de polipéptidos de longitud completa útiles para llevar a cabo los métodos de la invención, se determina usando uno de los métodos disponibles en la técnica, el programa MatGAT (Herramienta de Alineación Global por Matrices) (BMC Bioinformatics 2003 4:29. MatGat : una aplicación que genera matrices de similitud/identidad usando proteínas o secuencias de ADN. Campanella JJ, Bitincka L, Smalley J; programa hospedado por Ledion Bitincka) . El programa MatGAT genera matrices de similitud/identidad para secuencias de ADN o proteína sin necesitar pre-alineamiento de los datos. El programa lleva a cabo una serie de alineaciones por pares usando el algoritmo de alineación global de Myers y Miller (con una penalización por apertura de huecos de 12, y una penalización por extensión del hueco de 2), calcula la similitud y la identidad usando por ejemplo Blosum 62 (para los polipéptidos) , y después coloca los resultados en una matriz de distancias.

Ejemplo 4: identificación de los dominios comprendidos en las secuencias de nucleótidos útiles para llevar a cabo los métodos de la invención Búsqueda del dominio Pfam Para la identificación de los dominios de proteína como se definen en la Base de Datos de Familias de proteínas Pfam, se buscaron las secuencias de las proteínas usando el algoritmo hmmmscan. Hmmscan es parte del paquete informático HMMER3 que está disponible públicamente del Howard Hughes Medical Institute, Janelia Farm Research Campus (http: //hmmer . org) . La búsqueda de los dominios Pfam se realizó usando la versión 25.0 (publicada en Marzo del 2011) de la Base de Datos de Familias de Proteínas Pfam (http://pfam.sanger.ac.uk) . Los parámetros para el algoritmo hmmscan fueron los parámetros por defecto implementados en hmmscan (HMMER versión 3.0). Los dominios reportados por el algoritmo hmmscan se tomaron en cuenta si el valor de E independiente fue de 0.1 o menor y si al menos 80% de la longitud del modelo de dominio PFAM estuvo cubierto por la alineación.

Anotación de los dominio Pfam identificados Dominio 1: DnaJ (PF00226) La Hsp40 (proteína de choque térmico de 40 kD) conocida también cono DnaJ es una familia de proteínas de choque térmico que se expresan en una amplia variedad de organismos desde bacteria a los humanos. Hsp40 es una familia de proteínas de choque térmico que contienen una secuencia consenso de 70 aminoácidos, conocida como el dominio J. el dominio J de Hsp40 interactúa con las proteínas de bloque térmico Hsp70. Las proteínas de choque térmico Hsp40 tienen una función en la regulación de la actividad de la ATPasa de las proteínas de choque térmico Hsp70 (Referencia: http: / /pfam. ssanger . ac.uk) .

Dominio 2: DnaJ-C (PF01556) ( DnaJ_C=dominio de la c terminal de DnaJ) esta familia consiste de la región de c terminal de la proteína DnaJ. Aunque la función de esta región es desconocida, esta se encuentra asociada frecuentemente con PF00226 y PF00648. La DnaJ es una chaperona asociada con el sistema de cloque térmico de Hsp70 involucrado en el plegamiento y la renaturalización de las proteínas después del estrés (Referencia: http: //pfam. sanger .ac.uk) Dominio 3: dominio central de DnaJ DnaJ_CXXCXGXC (PF00684) El dominio central rico en cisteína (CR) de las proteínas DnaJ contiene cuatro repeticiones del motivo CXXCXGXG donde X es cualquier aminoácido. El dominio rico en cisteína, aislado, se pliega en un modo dependiente del zinc. Cada conjunto de dos repeticiones se enlaza a una unidad de zinc. Aunque este dominio ha sido implicado en el enlazamiento al sustrato, no se ha encontrado ninguna interacción específica entre el dominio rico en cisteína de DnaJ aislado y varios péptidos hidrológicos (Referencia: http : //pfam. sanger. ac.uk) Interpro La base de datos de Recursos Integrados de Familias de Proteínas, Dominios y sitios (InterPro) es una interfaz integrada para las bases de datos representativas usadas comúnmente para búsquedas de basadas en texto y en secuencias. La base de datos InterPro combina estas bases de datos, las cuales usan diferentes metodologías y grados variables de información biológica sobre las proteínas bien caracterizadas para derivar diseños propios de proteínas. Las bases de datos colaboradores incluyen SWISS-PROT, PROSITE, TrEMBL, PRINTs, ProDom y Pfam, Smart y TIGRFAMs. Pfam es una gran colección de múltiples alineaciones de secuencias y móldelos de Markov ocultos que cubren muchos dominios y familias de proteínas comunes. Pfam está hospedada en el servidor del Sanger Institute en el Reino Unido. Interpro se aloja en el European Bioinformatics Institute en el Reino Unido.

En una modalidad, un polipéptido de chaperona similar a DnaJ comprende un dominio (o motivo) conservado con al menos 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 785, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad de la secuencia con un dominio conservado desde el aminoácido 6 hasta el aminoácido 67 y/o al dominio conservado que inicio con el aminoácido 143 hasta el aminoácido 208 y/o al dominio conservado que inicia con el aminoácido 265 hasta el aminoácido 348 en la SEC ID NO: 2.

Ejemplo 5: Predicción de la topología de las secuencias de polipéptido chaperonas similares a DnaJ.

TargetP 1.1 predice la ubicación subcelular de las proteínas eucariotas. La asignación de la posición se basa en la presencia pronosticada de cualquiera de las pre-secuencias N-terminales : péptido de tránsito de cloroplastos (cTP) , péptido de focalización raitocondrial (mTP) o péptido de la señal secretoria (SP) . Los puntajes sobre los cuales se basa la predicción final no son realmente probabilidades y estos no necesariamente se suman a uno. Sin embargo, la ubicación con el puntaje más alto es la más probable de acuerdo con TargetP, y la relación entre los puntajes (la clase de conflabilidad) puede ser una indicación de cuán cierta es la predicción. La clase de conflabilidad (RC) varía desde 1 a 5 donde 1 indica la predicción más fuerte. TargetP se mantiene en el servidor de la Technical University of Dinamarca.

Para las secuencias pronosticadas para contener la presecuecia N-terminal también se puede predecir un sitio de escisión potencial.

Muchos otros algoritmos pueden ser usados para llevar a cabo tales análisis, incluyendo: · ChloroP 1.1 alojado en el servidor de la Technical University de Dinamarca; • Predictor de Localización subcelular del Merodeador de Proteínas versión 1.2 alojado en el servidor del Institute for Molecular Bioscience, University of Queensland, Brisbane, Australia; • PENCE Proteome Analyst PA-GOSUB 2.5 alojado en el servidor de la University of Alberta, Edmonton, Alberta, Canadá ; TMHMM, alojado en el servidor de la Technical University de Dinamarca • PSORT (URL: psort.org) • PLOC (Park y Kanehisa, Bioinformatics, 19, 1656-1663, 2003) .

Ejemplo 6 : Identificación de Genes Idénticos y Heterólogos .

Las secuencia genéticas pueden ser usadas para identificar los genes idénticos o heterólogos a partir de genotecas de ADNc genómico. Los genes idénticos (por ejemplo, los clones de ADNc de longitud completa) pueden ser aislados vía hibridación de ácidos nucleicos usando por ejemplo genotecas de ADNc. Dependiendo de la abundancia del gen de interés, 100,000 hasta 1,000,000 de bacteriófagos recombinantes se colocan sobre placas y se transfieren a membranas de nylon. Después de la desnaturalización con álcali, el ADN se inmoviliza sobre la membrana, por ejemplo mediante reticulación por UV. La hibridación se lleva a cabo en condiciones de rigor alto. En solución acuosa, la hibridación y los lavados se llevan a cabo a una fuerza iónica de NaCl 1 y una temperatura de 68 °C. Las sondas de hibridación se genera por ejemplo, mediante etiquetado por transcripción de muescas radioactivas (32P) (High Prime, Roche, Mannheim, Alemania) . Las señales se detectan por medio de autoradiografia .

Los genes parcialmente idénticos o heterólogos que se relacionan pero no son idénticos pueden ser identificados en una manera análoga al procedimiento descrito anteriormente usando condiciones de hibridación y de lavado de rigor bajo. Para a hibridación acuosa, la fuerza iónica se mantiene normalmente a NaCl 1M en tanto que la temperatura se reduce progresivamente desde 68 a 42°C.

El aislamiento de las secuencia genéticas con homología (o identidad/similitud de la secuencia) solo en un dominio distinto de (por ejemplo, 10-20 aminoácidos) puede ser llevado a cabo usando sondas de oligonucleótido radioetiquetadas , sintéticas. Los oligonucleótidos radioetiquetados se preparan mediante fosforilación del extremo 5' de dos oligonucleótidos complementarios con T4 polinucleótido cinasa. Los oligonucleótidos complementarios se hibridan y se ligan para formar concatémeros . Los concatémeros de hebra doble se etiquetan entonces radioactivamente, por ejemplo por medio de transcripción de muescas. La hibridación se lleva a cabo normalmente en condiciones de bajo rigor usando altas concentraciones del oligonucleótido.

Solución de hibridación de oligonucleótidos: 6x SSC Fosfato de sodio 0.01 M EDTA 1 mM (pH 8) 0.5% de SDS 100 g/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado 0.1% de leche descremada en polvo Durante la hibridación, la temperatura se reduce por etapas a 5-10°C por debajo de la Tm estimada del oligonucleótido o por debajo de la temperatura ambiente seguido por etapas de lavado y autoradiografia . El lavado se lleva a cabo con rigor bajo, por ejemplo 3 etapas de lavado usando 4x SSC. Otros detalles se describen en Sambrook J. et al., 1989 "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Press o Ausubel F.M. et al., 1994 "Current Protocols in Molecular Biology", John iley & Sons.

Ejemplo 7. Identificación de Genes Idénticos Mediante Geno ecas de Expresión de Identificación con Anticuerpos .

Los clones de ADNc pueden ser usados para producir polipéptidos recombinantes, por ejemplo, en E. coli (por ejemplo, el sistema Qiagen QIAexpress pQE) . Los polipéptidos recombinantes normalmente se purifican entonces por afinidad vía cromatografía de afinidad Ni-NTA (Qiagen) . Los polipéptidos recombinantes se usan entonces para producir anticuerpos específicos, por ejemplo usando las técnicas estándar para la inmunización de conejos. Los anticuerpos se purifican mediante afinidad usando una columna de Ni-NTA saturada con el antígeno recombinante, como se describe en Gu et al., BioTechniques 17, 257 (1994). El anticuerpo puede ser usado entonces para examinar las genotecas de expresión de ADNc para identificar los genes idénticos o heterólogos vía un examen inmunológico (Sambrook J. et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, o Ausubel F . M. et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John iley & Sons, 1994) .

Ejemplo 8: Clonación de la secuencia de ácido nucleico que codifica la chaperona similar a DnaJ.

Ejemplo 8a: Amplificación de las secuencias por PCR A menos que se especifique de otra manera, se usan los métodos estándar como se describen en Sambrook et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Las secuencias inventivas como se muestran en la linea respectiva en la Tabla I, columna 5, preferiblemente la región codificante de las mimas, se amplificaron mediante PCR como se describe en el protocolo de Pfu Ultra, Pfu Turbo o Herculasa ADN polimerasa (Stratagene) . La composición del protocolo de Pfu ultra, Pfu Turbo o Herculasa ADN polimerasa fue la siguiente: lx amortiguador de PCR (Stratagene), 0.2 mM de cada dNTP, 100 ng de ADN genómico de Saccharomyces cerevisiae (cepa S288C; Research Genetics, Inc., ahora Invitrogen) , Escherichia coli (cepa MG1655; E. coli Genetic Stock Center) , Synechocystis sp. (cepa PCC6803), Azotobacter vinelandii (cepa N . R. Smith, 16), Thermus thermophilus (HB8) o 50 ng de ADNc de varios tejidos y etapas de desarrollo de Arabidopsis thaliana (ecotipo Columba) , Physcomitrella patens, Glycine max (variedad resnick) , Brassica napus, Oryza sativa o Zea mays (variedad b73, Mol7, A188), 50 pmol de cebador directo, 50 pmol de cebador inverso, con o sin Betaina 1M, 2.5 y Pfu Ultra Turbo o Herculasa ADN polimerasa.

Los ciclos de amplificación fueron los siguientes: 1 ciclo de 2.3 minutos a 94-95°C, después 25-36 ciclos con 30-60 segundos a 94-95°C, 30-40 segundos a 50-60°C y 210-48' segundos a 72°C, seguido por 2 ciclo de 5-10 minutos a 72°C, después 4-16°C - preferiblemente para Saccharomyces cerevisiae, Escherichia coli, Synechocystis sp., Azotobacter vinelandii, Thermus thermophilus.

En el caso de Arabidopsis thaliana, Brassica napus, Glycine max, Oryza sativa, Physcomitrella patens, Zea mays, los ciclos de amplificación fueron los siguientes: ' 1 ciclo con 30 segundos a 94°C, 30 segundos a 61°C, 15 minutos a 72°C, después 2 ciclos con 30 segundos a 94°C, 30 segundos a 60°C, 15 minutos a 72°C, después 3 ciclos con 30 segundos a 94°C, 30 segundos a 59°C, 15 minutos a 72°C, después 4 ciclos con 30 segundos a 94°C, 30 segundos a 58°C, 15 minutos a 72°C, después 25 ciclos con 30 segundos a 94°C, 30 segundos a 57°C, 15 minutos a 72°C, después 1 ciclo con 10 minutos a 72°C, después finalmente 4-16°C.

Los ARNs se generaron con el Equipo RNeasy para Plantas de acuerdo con el protocolo estándar (Qiagen) y se uso Superscript II Reverse Transkriptase para producir el ADNc de hebra doble de acuerdo con el protocolo estándar (Invitrogen) .

Los pares de cebadores específicos de ORF para los ganes a ser expresados de muestran en la línea respectiva en la tabla III, columna 7. Las siguientes secuencias adaptadores se agregaron a los cebadores específicos de ORF de Saccharomyces cerevisiae (véase la Tabla III) con propósitos de clonación: i) cebador directo 5' -GGAATTCCAGCTGACCACC-3' ii) cebador inverso: 5' -GATCCCCGGGAATTGCCATG-3' Estas secuencias adaptadores permiten la clonación del ORF en los varios vectores que contienen los adaptadores de Resgen, véase la columna 5 de la Tabla 0.

Las siguientes secuencias adaptadores pueden ser agregadas a los cebadores específicos de ORF de Saccharomyces cerevisiae, Escherichia coli, Synechocystis sp., Azotobacter vinelandii, Thermus termophilus, Arabidopsis thaliana, Brassica napus, Glycine max, Oryza sativa, Physcomitrella patens, o Zea Mays, con propósitos de clonación: iii) cebador directo: 5' -TTGCTCTTCC-3' iiii) cebador inverso: 5' -TTGCTCTTCG-3' Las secuencias adaptadores permiten la clonación del ORF en los varios vectores que contienen los adaptadores de Colic.

Por lo tanto, para la amplificación y la clonación de Saccharomyces cerevisiae SEC ID NO: 1, se usó un cebador que consiste de la secuencia adaptadora i) y la secuencia especifica de ORF SEC ID NO: 43 y un segundo cebador que consiste de la secuencia adaptadora ii) y la secuencia especifica de ORF SEC ID NO: 44.

Para la amplificación y la clonación de Saccharomyces cerevisiae, Escherichia coli, Synechocystis sp., Azotobacter vinelandii, Thermus thermophilus , Arabidopsis thaliana, Brassica napus, Glycine max, Oryza sativa, Physcomitrella patens, o Zea mays, se usa un cebador que consiste de la secuencia adaptadora iii) y una secuencia A especifica de ORF y un segundo cebador que consiste de la secuencia adaptadora iiii) y una segunda secuencia B especifica de ORF.

Siguiendo estos ejemplos cada secuencia descrita en la Tabla I, preferiblemente la columna 5, en especial la región codificante de las mismas, puede ser clonada fusionando las secuencias adaptadoras a las secuencias cebadores específicos como se describen en la Tabla III, columna 7, usando el vector mostrado en la Tabla 0 y otros vectores conocidos en la técnica .

El ADN se somete a secuenciamiento mediante los procedimientos estándar, en particular, el método de determinación de la cadena, usando secuenciadores ABI377 (véase, por ejemplo, Fleischman R. D. et al., Science 269, 496 (1995) ) .

Ejemplo 8b: construcción de vectores binarios para la expresión no focalizada de proteínas La expresión "no focalizada", en este contexto, significa que no se agregaron secuencias de focalización adicionales al ORF a ser expresado.

Para la expresión no focalizada los vectores binarios usados para la clonación fueron pMTXl55 (SEC ID NO: 48), VC-MME220-lqcz, VC-MME221-lqcz, y VC-MME489-1QCZ . Otros vectores binarios útiles son conocidos por los operarios expertos; una compendio de los vectores vinarios y su uso puede ser encontrado en Hellens R. , Mullineaux P. y lee H. (Trends in Plant Science, 5 (10), 446 (2000)). Tales vectores deben estar equipados igualmente con los promotores y las secuencias de focalización apropiados.

Ejemplo 8c: Clonación de las secuencias inventivas como se muestran en la Tabla I, columna 5 en los diferentes vectores de expresión.

Para la clonación, por ejemplo, de los ORFs de la SEC ID NO: 1 de Saccharomyces cerevisiae o de cualquier otro ORF de Saccharomyces cerevisiae en los vectores que contienen la secuencia adaptadora de Resgen el ADN del vector respectivo se trató con la enzima de restricción Ncol .

La reacción se detuvo mediante la desactivación a 70°C por 20 minutos, y se purifico a través de columnas QIAquick o NucleoSpin Extract II siguiendo el protocolo estándar (Qiagen o Macherey-Nagel ) .

Entonces, el producto de PCR que representa el ORF amplificado con las secuencias adaptadoras respectivas y el ADN del vector se trataron con T4 ADN polimerasa de acuerdo con el protocolo estándar (MBI Fermentas) para producir nucleótidos protuberantes con los parámetros de 1 unidad de T4 ADN polimerasa a 37°C por 2-10 minutos para el vector y 1-2 y de T4 ADN polimerasa a 15-17°C durante 10-60 minutos para el producto de PCR que representa la SEC ID NO: 7081.

La reacción se detuvo mediante la adición de amortiguador con alto contenido de sal y se purificó a trabes de columnas QIAquick o Nucleo-Spin Extract II siguiendo el protocolo estándar (Qiagen o Macherey-Nagel) .

De acuerdo con este ejemplo, las personas experimentadas en la técnica son capaces de clonar todas las secuencias descritas en la Tabla I, preferiblemente la columna 5 o la columna 7, en especial la región codificante de las mismas. Aproximadamente 30-60 ng del vector preparado y una cantidad definida del amplificado preparado, se mezclaron y se hibridaron a 65°C durante 15 minutos seguido por 37°C 0,1 °C/1 segundo, seguido por 37°C 10 minutos, seguido por 0,1 °C/1 segundo, después 4-10°C. Los constructos ligados se transformaron en el mismo recipiente de reacción mediante la adición de células de E. coli competentes (cepa DH5alfa) e incubación durante 20 minutos a 1°C seguido por un cloque térmico durante 90 segundos a 42°C y enfriamiento a 1-4°C. Después, se agregó medio completo (SOC) y la mezcla se incubó durante 45 minutos a 37°C. Posteriormente la mezcla completa se colocó sobre placas de agar con 0.05 mg/ml de kanamicina y se incubó durante toda la noche a 37 °C.

El resultado de la etapa de clonación se verificó mediante amplificación con la ayuda de los cebadores los cuales se enlazaron corriente arriba y corriente debajo del sitio de integración, siguiendo por lo tanto la amplificación de la inserción. Las amplificaciones se llevaron a cabo como se describe en el protocolo de la Taq ADN polimerasa (Gibco-BRL) .

Los ciclos de amplificación fueron los siguientes: 1 ciclo de 1.5 minutos a 94°C, seguido por 35 ciclos de, en cada caso, 15-60 segundos a 94°C, 15-60 segundos a 50-66°C y 5.15 minutos a 72°C, seguido por 2 ciclo de 10 minutos a 72°C, después 4-16°C.

Se verificaron varias colonias, pero solo una colonia para la cual se detectó un producto de PCR del tamaño esperado, se usó en las siguientes etapas.

Una porción de esta colonia positiva se transfirió a un recipiente de reacción llenado con medio completo (LB) suplementado con kanamicina y se incubó durante toda la noche a 37°C.

La preparación del plásmido se llevó a cabo como se especifica en el protocolo estándar de Qiaprep o NucleoSpin Multi-96 plus (Qiagen o acherey-Nagel) .

Ejemplo 9: Generación de Plantas transgénicas de Arabidopsis thaliana las cuales expresan la SEC ID NO: 1 1-5 ng del ADN del plásmido aislado, se transformaron mediante electroporación o transformación en células competentes de Agrobacterium tumefaciens, de la cepa GV 3101 pMP90 (Koncz y Schell, Mol. Gen. Gent . 204, 383 (1986)) . Después se agregó medio completo (YEP) y la mezcla se transfirió a un recipiente de reacción fresco durante 3 horas a 28°C. Después toda la mezcla de reacción se colocó sobre placas de agar YEP suplementadas con los antibióticos respectivos, por ejemplo, rifampicina (0.1 mg/ml) , gentamicina (0.025 mg/ml y kanamicina (0.05 mg/ml) y se incubó durante 48 horas a 28°C.

Las agrobacterias que contienen el constructo del plásmido se usaron entonces para la transformación de las plantas .

Una colonia se recolectó de la placa de agar con la ayuda de la punta de una pipeta y se colocó en 3 mi de medio TB liquido, el cual también contenia los antibióticos adecuados como se describe anteriormente. El precultivo se cultivo durante 48 horas a 28°C y 120 rpm. 400 mi de medio LB conteniendo los mismos antibióticos como anteriormente se usaron para el cultivo principal. El precultivo se transfirió al cultivo principal. Este se cultivó durante 18 horas a 28°C y 120 rpm. Después de la centrifugación a 4 000 rpm, la pelotilla se volvió a suspender en medio de infiltración (medio MS, 10% de sacarosa) .

Con el fin de cultivar las plantas para la transformación, platos (Piki Saat 80, verdes, proporcionadas con un fondo de tamiz, 30 x 20 x 4.5 cm, de Wiesauplast, Kunststoff echnik, Alemania) se llenaron a la mitad con un sustrato de Gs 90 (suelo estándar, Werkverband E. V., Alemania) . Los platos de regaron durante toda la noche con solución de Proplant al 0.05% (Chimac-Apriphar , Bélgica) . Semillas C24 de A. thaliana (Notthingham Arabidopsis stock Centre, RU; NASC Stock N906) se dispersaron sobre el plato, aproximadamente 1000 semillas por plato los platos se cubrieron con una capucha y se colocaron en la instalación de estratificación (8 h, 110 µp??? m-2 s-1, 22°C; 16 h, oscuridad, 6°C) . Después de 5 días, los platos de colocaron en la cámara de ambiente controlado, de día corto (8 h, 130 µp?1 m-2 s-1, 22°C; 16 h, oscuridad, 20°C) donde estos permanecieron durante aproximadamente 10 días, hasta que se hubieron formados las primeras hojas verdaderas.

Las plántulas se transfirieron a macetas que contenían el mismo sustrato (macetas Teku, 7 cm, serie LC, fabricadas por Poppelmann GmbH & Co, Alemania) . Cinco plantas se transplantaron a cada maceta. Las macetas se regresaron entonces a la cámara de ambiente controlado de dia corto, para que las plantas siguieran creciendo.

Después de 10 días, las plantas se transfirieron a una cabina de invernadero (iluminación suplementaria, 16 h, 340 µ???? m-2 s-1, 22°C; 8 h, oscuridad, 20°C) , donde se les permitió crecer durante otros 17 días.

Para la transformación, plantas de Arabidopsis de 6 semanas de edad, las cuales recién habían iniciado la floración se sumergieron durante 1 segundos en la suspensión de agrobacterias descritas anteriormente la cual había sido tratada previamente con 10 µ? de Silwett L77 (Crompton S.A., Osi Specialties, Suiza) . El método en cuestión se describe por Clough J. C. y Bent A. F. (Plant J. 16, 735 (1998)).

Las plantas se colocaron posteriormente durante 18 horas en una cámara húmeda. Después, las macetas se regresaron al invernadero para que las plantas siguieran creciendo. Las plantas permanecieron en el invernadero durante otras 10 semanas hasta que las semillas estuvieron listas para ser cosechadas.

Dependiendo del marcador de tolerancia usado para la selección de las plantas transformadas las semillas cosechadas se plantaron en el invernadero y se sometieron a selección por rociado o de otra manera se esterilizaron primero y después se cultivaron en placas de agar suplementadas con el agente de selección respectivo. Ya que el vector contenia el gen bar como el marcador de tolerancia, las plántulas se rociaron cuatro veces a un intervalo de 2 a 3 días con BASTA® al 0.02% y se permitió que las plantas transformadas produzcan semillas.

Las semillas de las plantas transgénicas de A. thaliana se almacenaron en el congelador (a -20°C) .

Ejemplo 10: Transformación de otras plantas Transformación del arroz Agrobacterium conteniendo el vector de expresión se usaron para transformar plantas de Oryza sativa. Las semillas maduras secas de la variedad japónica del arroz Nipponbare se descascarillaron . La esterilización se llevó a cabo mediante incubación durante un minuto en etanol al 70%, seguido por 30 minutos en HgCl2 al 0.2%, seguido por 6 lavados de 15 minutos con agua destilada estéril. Las semillas estériles se hicieron germinar entonces en un medio que contenia 2,4-D (medio de inducción de callos) . Después de la incubación en la oscuridad durante cuatro semanas los callos derivados del escutelo, embriogénicos, se cortaron y se propagaron en el mismo medio. Después de dos semanas, los callos se multiplicaron o se propagaron mediante subjuntivo en el mismo medio durante otras 2 semanas. Fragmentos de los callos embriogénicos se subcultivaron en medio fresco 3 días antes del co-cultivo (para potenciar la actividad de división celular) .

La cepa LBA4404 de Agrobacterium conteniendo el vector de expresión se usa para el co-cultivo. La Agrobacterium se inoculó en medio AB con los antibióticos apropiados y se cultivaron durante 3 días a 28°C. Las bacterias se colectaron entonces y se suspendieron en medio de co-cultivo líquido a una densidad (OD6oo) de aproximadamente 1. La suspensión de transfirió entonces a cajas de Petri y los callos se sumergieron en la suspensión durante 15 minutos. Los tejidos de los callos se secaron con material absorbente y se transfirieron a medio de co-cultivo, solidificado, y se incubaron por 3 días en la oscuridad a 25°C. Los callos co-cultivados se cultivaron en medio conteniendo 2,4-D durante 4 semanas, en la oscuridad a 28°C en presencia de un agente de selección. Durante este periodo, se desarrollaron islas de callos resistentes, que crecieron rápidamente. Después de la transferencia de este material a un medio de regeneración e incubación en la luz, se liberó el potencial embriogénico y los brotes se desarrollaron en las siguientes cuatro a cinco semanas. Los brotes se cortaron de los callos y se incubaron durante 2 a 3 semanas en medio que contenía auxina desde el cual se transfirieron a la tierra. Los brotes endurecidos se cultivaron bajo alta humedad y días cortos, en un invernadero.

Aproximadamente 45 transformantes del arroz TO independientes se generaron para un constructo. Los transformantes primarios se transfirieron desde una cama de cultivo de tejidos a un invernadero. Después de un análisis PCR cuantitativo para verificar el número de copias del inserto de ADN-T, solo las plantas transgénicas con una copia, que exhibieron tolerancia al agente de selección, se mantuvieron para la cosecha de las semillas de TI. Las semillas se cosecharon entonces tres a cinco meses después del trasplante. El método proporciona transformantes de locus único a una tasa superior al 50% (Aldemita y Hodges 1996, Chan et al., 1993, Hiei et al., 1994).

Transformación del maíz La transformación del maíz (Zea mays) se lleva a cabo con una modificación del método descrito por Ishida et al., (1996) Nature Biotech 14(6): 745-50. La transformación es dependiente del genotipo en el maiz y solo los genotipos específicos son sensibles a la transformación y la regeneración. La línea endogámica A188 (University of Minnesota) o los híbridos con A188 como progenitores, son buenas fuentes de material donador para la transformación, pero también otros genotipos pueden ser usados exitosamente. Las mazorcas se cosecharon de las plantas de maíz aproximadamente 11 días después de la polinización (DAP) cuando la longitud de los embriones maduros es de aproximadamente 1 a 1.2 mm. Los embriones inmaduros se co-cultivaron con Agrobacterium tumefaciens que contenía el vector de expresión, y las plantas transgénicas se recuperaron a través de organogénesis. Los embriones cortados se cultivaron en medio de inducción de callos, después medio de regeneración del maíz, conteniendo el agente de selección (por ejemplo, imidazolinona pero pueden ser usados varios marcadores de selección) . Las cajas de Petri se incubaron en la luz a 25°C durante 2-3 semanas, o hasta que se desarrollen los brotes. Los brotes verdes se transfirieron de cada embrión a medio de enraizamiento de maíz y se incubaron a 25°C durante 2-3 semanas, hasta que se desarrollaron las raices. Los brotes enraizados se transplantaron a tierra en el invernadero. Las semillas TI se produjeron a partir de plantas que exhiben tolerancia al agente de selección que contiene una sola copia del inserto de ADN-T.

Transformación del trigo La transformación del trigo se lleva a cabo con el método descrito por Ishida et al., (1996) Nature Biotech 14(6): 745-50. La variedad Bobwhite (disponible de CI MYT, México) se usa comúnmente en la transformación. Los embriones inmaduros se co-cultivaron con Agrobacterium tumefaciens conteniendo el vector de expresión, y las plantas transgénicas se recuperan a través de organogénesis. Después de la incubación con Agrobacterium, los embriones se cultivaron in vitro en medio de inducción de callos, después medio de regeneración, conteniendo el agente de selección (por ejemplo imidazolinona, pero se pueden usar varios marcadores de selección) . Las cajas de petri se incubaron en la luz a 25°C durante 2-3 semanas, o hasta que se desarrollaron los brotes. Los brotes verdes se transfirieron de cada embrión al medio de enraizamiento y se incubaron a 25°C durante 2-3 semanas, hasta que se desarrollaron las raices. Los brotes enraizados se transplantaron al suelo en el invernadero. Las semillas TI se producen a partir de las plantas que exhiben tolerancia al agente de selección y que contienen una sola copia del inserto de ADN-T.

Transformación de la soya La soya se transforma de acuerdo con una modificación del método descrito en la patente de Texas A&M, US 5,164,310. Varias variedades comerciales de soya son susceptibles a la transformación por este método. La variedad Jack (disponible de la Illinois Seed Foundation) se usa comúnmente para la transformación. Las semillas de soya se esterilizan para el sombrado in vitro. Se corta el hipocótilo, la radícula y un cotiledón de las plántulas de varios días de edad. El epicótilo y el cotiledón restante se cultivan adicionalmente para desarrollar nodos auxiliares. Estos nodos auxiliares se cortan y se incuban con Agrobacterium tumefaciens que contienen el vector de expresión. Después del tratamiento de co-cultivo, los explantes de lavan y se transfieren a medio de selección. Los brotes regenerados se cortan y se colocan en un medio de alargamiento de brotes. Los brotes no mayores a 1 cm se colocan en medio de enraizamiento hasta que se desarrollan las raices. Los brotes enraizados se trasplantan a la tierra en el invernadero. Las semillas TI se producen a partir de plantas que exhiben tolerancia al agente de selección y que contienen una sola copia del inserto de ADN-T.

Transformación de la colza/canola Los peciolos cotiledonares y los hipocotilos de plantones jóvenes de 5-56 dias de edad se usan como explantes para el cultivo de tejidos y se transforman de acuerdo con Babic et al., (1998, Plant Cell Rep 17: 183-188). La variedad comercial estar (Agriculture Canadá) es la variedad estándar usada para la transformación, pero también se pueden usar otras variedades. Las semillas de cañóla se esterilizan superficialmente para su sembrado in vitro. Explantes del peciolo cotiledonar con el cotiledón unido, se cortan de las plántulas in vitro, y se inoculan con Agrobacterium (que contienen el vector de expresión) al sumergir el extremo cortado del explante del peciolo en la suspensión de bacterias. Los explantes se cultivan entonces durante 2 dias en medio MSBAP-3 que contiene de mg/ml de BAP, 3% de sacarosa, 0.7% de Phytagar a 23°C, 16 hr a la luz. Después de dos dias de co-cultivo con Agrobacterium, los explantes de peciolos se transfieren a medio MSBAP-3 que contiene 3 mg/ml de BAP, cefotaxima, carbenicilina, o timentina (300 mg/1) por 7 dias, y después se cultivan en medio MSBAP-3 con cefotaxima, carbenicilina, o timentina y el agente de selección hasta la regeneración de los brotes. Cuando los brotes tienen 5-10 mm de longitud, estos se cortan y se transfieren a medio de alargamiento de brotes (MSBAP-0.5 que contiene 0.5 mg/1 de BAP) . Los brotes de aproximadamente 2 cm de longitud se transfieren al medio de enraizamiento (MSO) para la inducción de las raices. Los brotes enraizados se trasplantan al suelo en el invernadero. Las semillas TI se producen a partir de plantas que exhiben tolerancia al agente de selección y que contienen una sola copia del inserto de ADN-T.

Transformación de la alfalfa Un clon de regeneración de la alfalfa (Medicago sativa) se transforma usando el método de (McKersie et al., 1999 Plant Physiol 119:839-847). La regeneración y la transformación de la alfalfa es dependiente del genotipo y por lo tanto, se requieren plantas regenerantes. Los métodos para obtener las plantas regenerantes han sido descritos. Por ejemplo, estas pueden ser seleccionadas de entre la variedad Rangelander (Agriculture Canadá) o cualquier otra variedad comercial de alfalfa, como se describe por Brown DC y A Atanassov (1985. Plant Cell Tissue Organ Culture 4:111-112). Alternativamente, la variedad RA3 (University of Wisconsin) ha sido seleccionada para ser usada en el cultivo de tejidos (Walker et al., 1978 Am J Bot 65:654-659). Los explantes de peciolos se co-cultivan con un cultivo durante toda la noche de Agrobacterium tumefaciens C58C1 pMP90 (Mckersie et al., 1999 Plant Physiol 119: 839-847) o LBA4404 que contiene el vector de expresión. Los explantes se co-cultivan durante 3 días en la oscuridad en medio de inducción SH que contiene 288 mg/L de Pro, 53 mg/L de tioprolina, 4.35 g/L de K2S04, y 100 ym de acetosiringinona . Los explantes se lavan en medio de Murashige-Skoog de fuerza media (Murashige y Skoog, 1962) y se colocan sobre placas en el mismo medio de inducción SH sin acetosiringinona pero con un agente de selección y un antibiótico adecuado, para inhibir el crecimiento de las Agrobacterium. Después de varias semanas, los embriones somáticos se transfieren a medio de desarrollo BOÍ2Y que no contiene reguladores de crecimiento, sin antibióticos, y 50 g/L de sacarosa. Posteriormente los embriones somáticos se hacen germinar en medio de Murashige-Skoog de fuerza media. Las plántulas enraizadas se transplantaron a macetas y se cultivaron en un invernadero. Las semillas TI se producen a partir de las platas que exhiben tolerancia al agente de selección y que contienen una copia única del inserto de ADN-T.

Transformación del algodón El algodón se transforma usando Agrobacterium tumefaciens de acuerdo con el método descrito en US 5,159,135. Las semillas se algodón se esterilizan superficialmente en solución de hipoclorito de sodio al 3% durante 20 minutos y se lavan con agua destilada con 500 g/ml de benomilo para la germinación. Se extraen los hipocótilos de plantones de 4 a 6 días de edad, se cortan en fragmentos de 0.5 cm y se colocan en agar al 0.8%. Una suspensión de Agrobacterium (aproximadamente 108 células por mi, diluidas de un cultivo durante toda la noche, transformadas con el gen de interés y los marcadores de selección adecuados) se usa para la inoculación de los explantes de hipocotilos. Después de 3 días a la temperatura ambiente y a la luz, los tejidos se transfieren a un medio sólido (1.6 g/1 de Gelrita) con sales de Murashige y Skoog con vitaminas B5 (Gamborg et al., Exp. Cell Res. 50:151-158 (1968)), 0.1 mg/1 de 2,4-D, 0.1 mg/1 de 6-furfurilaminopurina y 750 g/ml de MgCL2, y con 50 a 100 µq/ml de cefotaxamina y 400-500 g/ml de carbenicilina para matar las bacterias residuales. Las líneas celulares individuales se aislan después de dos a tres meses (con subjuntivos cada cuatro a seis semanas) y se cultivan adicionalmente en medio selectivo para la amplificación del tejido (30°C, 16 hr de fotoperiodo) . Los tejidos transformados se cultivan además posteriormente en medio no selectivo durante 2 a 3 meses para dar lugar a embriones somáticos. Los embriones de apariencia saludable de al menos 4 mm de longitud se transfieren a tubos con medio SH en vermiculita fina, suplementados con 0.1 mg/1 de ácido indol acético, 6 furfurilaminopurina y ácido giberélico. Los embriones se cultivan a 30°C con un fotoperiodo de 16 hr, y las plántulas se endurecen y posteriormente se mueven al invernadero para su cultivo posterior.

Transformación de remolacha Las semillas de remolacha (Beta vulgaris L.) se esterilizan en etanol al 70% durante un minuto seguido por 20 minutos de agitación en Blanqueador de hipoclorito al 20%, por ejemplo blanqueador regular Clorox® (disponible comercialmente de Clorox, 1221 Broadway, Oakland, CA 94612, EUA) . Las semillas se enjuagan con agua esterilizada y se secan al aire seguido por colocación en placas sobre medio de germinación (medio basado en urashige y Skoog ( S) (véase Murashige, T., y Skoog., 1962. A revised médium for rapid growth and bioassays with tobáceo tissue cultures. Physiol. Plant, vol. 15, 473-497) que incluye vitamina B5 (Gamborg et al.; Nutrient requirements of suspensión cultures of soybean root cells. Exp. Cell Res., vol. 50, 151-8) suplementado con 10 g/1 de sacarosa y 0.8% de agar) . El tejido del hipocótilo se usa esencialmente para el inicio del cultivo de los brotes de acuerdo con Hussey y Hepher (Hussey, G., y Hepher, A., 1978. Clonal propagation of sugarbeet plants and the formation of polylpoids by tissue culture. Annals of Botany, 42, 477-9) y se mantienen en medio basado en MS suplementado con 30 g/1 de sacarosa más 0.25 mg/1 de bencilamino purina y agar al 0.75%, pH 5.8 a 23-25°C con un fotoperiodo de 16 horas.

La cepa de Agrobacterium tumefaciens que contiene un plásmido binario que aloja un gen marcador seleccionable, por ejemplo, nptll se usa en los experimentos de transformación. Un dia antes de la transformación un cultivo de LB liquido que incluye antibióticos se cultiva en un agitador (28°C, 150 rpm) hasta que se alcanza una densidad óptica (O. D. ) a 600 nm de ~ 1. Los cultivos bacterianos cultivados durante toda la noche se someten a centrifugación y se vuelven a suspender en medio de inoculación (0. D. ~1) que incluye Acetosiringona, pH 5.5.

El tejido de la base de los brotes se corta en rebanadas (1.0 cm x 1.0 cm * 2.0 mm aproximadamente) . El tejido se sumerge por 30s en medio de inoculación bacterial liquido. El liquido en exceso se extrae mediante secado con papel filtro. El co-cultivo ocurrió durante 24-72 horas en medio basado en Ms que incluye 30 g/1 de sacarosa seguido por un periodo no selectivo que incluye medio basado en MS, 30 g/1 de sacarosa con 1 mg/1 de BAP, para inducir el desarrollo de brotes y cefataxima para elimina la Agrobacterium. Después de 3-10 días los explantes de transfieren a medio selectivo similar que contiene por ejemplo kanamicina o G418 (50-100 mg/1 dependiendo del genotipo) .

Los tejidos se transfieren a medio fresco cada 2-3 semanas para mantener la presión de la selección. El inicio muy rápido de los brotes (después de 3-4 días) indica la regeneración de los meristemos en lugar de la organogénesis de meristemos transgénicos recién desarrollados. Los brotes pequeños se transfieren después de varias rondas de subjuntivo, a medio de inducción de raices que contiene 5 mg/1 de NAA y kanamicina o G418. Se toman las etapas adicionales para reducir el potencial de generación de plantas transformadas que son quiméricas (parcialmente transgénicas) . Se usan muestras de tejido de los brotes regenerados para el análisis del ADN.

Otros métodos de transformación para la remolacha se conocen en la técnica, por ejemplo, aquellos de Linsey y Gallois (Linsey, K. , y Gallois, P., 1990. Transíormation of sugarbeet (Beta vulgaris) by Agrobacterium tumefaciens. Journal of Experimental Botany; vol . 41, No. 226; 15 529-36) o los métodos publicados en la solicitud internacional publicada como W09623891A.

Transformación de la caña de azúcar Se aislan vástagos de plantas de caña de azúcar cultivadas en el campo, de 6 meses de edad (véase, Arencibia A., et 20 al., 1998. An efficient protocol for sugarcane (Saccharum spp. L.) transformation mediated by Agrobacterium tumefaciens. Transgenic Research, vol. 7, 213-22; Enriquez-Obregon G., et al., 1998. Herbicide-resistant sugarcane (Saccharum officinarum L.) plants by Agrabacterium-mediated transformation . Planta, vol. 206, 20-27) . El material se esteriliza mediante inmersión en un blanqueador de hipoclorito al 20% por ejemplo blanqueador regular Clorox® (disponible comercialmente de Clorox, 1221 Broadway, Oakland, CA 94612, EUA) durante 20 minutos. Secciones transversales de alrededor de 0.5 cm se colocan en el medio en la dirección de llenado. El material vegetal se cultiva durante 4 semanas en medio basado en S (Murashige, T., y Skoog, 1962. A revised médium for rapid growth and bioassays with tobáceo tissue cultures. Physiol. Plant, vol. 15, 473-497) que incluye vitaminas B5 (Gamborg, O., et al., 1968. Nutrient requirements 30 of suspensión cultures of soybean root cells. Exp. Cell Res., vol. 50, 151-8) suplementado con 20 g/1 de sacarosa, 500 mg/1 de caseína, 0.8% de agar y 5 mg/1 de 2,4-D a 23°C en la oscuridad. Los cultivos se transfieren después de 4 semanas a medio fresco idéntico.

La cepa de Agrobacterium tumefaciens que contiene un plásmido binario que aloja un gen marcador seleccionable, por ejemplo hpt se usa en los experimentos de transformación. Un día antes de la transformación, un cultivo de LB líquido que incluye antibióticos, se cultiva en un agitador (28°C, 150 rpm hasta que se alcanza una densidad óptica (O. D. ) a 600 nm -0.6. los cultivos bacterianos, cultivados durante toda la noche, se someten a centrifugación y se vuelven a suspender en medio de inoculación basado en MS (O. D. ~0.4) que incluye acetosiringona, pH 5.5.

Fragmentos de callos embriogénicos de caña de azúcar (2-4 mm) se aislan con base en sus características morfológicas como su estructura compacta y el color amarillo y se secan durante 20 min en la cabina de flujo, seguido por inmersión en un medio de inoculación bacterial liquido durante 10-20 minutos. El liquido en exceso se extrae mediante secado con papel filtro. El co-cultivo ocurrió durante 3-5 días en la oscuridad sobre papel filtro, el cual se coloca en la parte superior de medio basado en MS que incluye vitaminas B5, conteniendo 1 mg/1 de 2,4-D. Después del co-cultivo los callos se enjuagan con agua destilada seguida por un periodo no selectivo en un medio similar que contiene 500 mg/1 de cefotaxima para eliminar las Agrobacterium. Después de 3-10 días, los explantes se transfieren a medio selectivo basado en Ms que incluye vitaminas B5, conteniendo 1 mg/1 de 2,4-D durante otras 3 además, que contiene 25 mg/1 de higromicina (dependiendo del genotipo) . Todos los tratamientos se realizan a 23°C bajo condiciones de oscuridad.

Los callos resistentes se cultivan adicionalmente en medio que carece de 2,4-D, que incluye 1 mg/1 de Ba y 25 mg/1 de higromicina con un fotoperiodo de 16 h de luz, resultando en el desarrollo de estructuras de brotes. Los brotes se aislaron y se cultivaron en medio de enraizamiento selectivo (basado en MS que incluye 20 g/1 de sacarosa, 20 mg/1 de higromicina y 500 mg/1 de cefotaxima) . Para el análisis del ADN se usaron muestras de tejido de los brotes regenerados.

Otros métodos de transformación para la caña de azúcar se conocen en la técnica, por ejemplo, de la solicitud internacional publicada como 2010/151634A y la Párente europea otorgada EP1831378.

Ejemplo 11: Clonación de las secuencias como se muestra en la Tabla I , columna 5 o 7 en Escherichia coli .

Las secuencias inventivas como se muestran en la linea respectiva en la Tabla I, columna 5 o 7 se clonan en los plásmidos pBR322 (Sutcliffe J.G., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 75, 3737 (1979)), PA-CYC177 (Change y Cohén, J. Bacteriol. 134, 1141 (1 978)), los plásmidos de la serie pBS (pBSSK+, pBSSK- y otros; Stratagene, LaJolla, EUA) o cósmidos tales como SuperCosl (Stratagene, LaJolla, EUA) o Lorist6 (Gibson T.J., Rosenthal A. y Waterson R.H., Gene 53, 283 (1987) para la expresión en E. coli usando los procedimientos conocidos, bien establecidos (véase por ejemplo, J. Sambrook et al. "Molecular Cloning: A Laboratory Manual". Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) o F.M. Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John iley & Sons (1994)).

Ejemplo 12 : Determinación de la expresión de la proteina mutante/transgénica en células hospedaras o plantas Un método adecuado para determinar la cantidad de transcripción del gen mutante, transgénico (una señal de la cantidad de ARNm la cual está disponible para la traducción del producto genético) es llevar a cabo una transferencia Northern (véase por ejemplo, Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", Wiley, New York (1988) ), donde un cebador, el cual se diseña de manera tal que este se enlace al gen de interés, cuenta con un marcador detectable (usualmente un marcador radioactivo o quimioluminiscente) , de modo tal que, cuando el ARN total de un cultivo del organismo se extrae, se separa en un gel, se aplica a una matriz estable y se incuba con esta sonda, el enlazamiento y la cantidad del enlazamiento de la sonda indica la presencia y también a cantidad de ARNm de este gen. Otro método es una PCR cuantitativa. Esta información detecta la extensión a la cual ha sido transcrito el gen. El ARN celular total puede ser aislado, por ejemplo, de levaduras o E. coli mediante una variedad de métodos, los cuales son conocidos en la técnica, por ejemplo, con el equipo Ambion de acuerdo con las instrucciones del fabricante o como se describe en Edgington et al., Promega Notes Magazine Número 41, 14 (1993) .

Las técnica estándar, tales como la transferencia Wéstern, pueden ser empleadas para determinar la presencia o la cantidad relativa de la proteina traducida a partir de este ARNm (véase por ejemplo, Ausubel et al. "Current Protocols in Molecular Biology", Wiley, Nueva York (1988)) . En este método, las proteínas celulares totales se extraen, se separan mediante electroforesis en gel, se transfieren a una matriz tal como nitrocelulosa, y se incuban con una sonda, tal como un anticuerpo, el cual se enlaza específicamente a la proteína deseada. Esta sonda usualmente recibe directa o indirectamente un marcador quimioluminiscente o colorimétrico, el cual puede ser detectado fácilmente. La presencia y la cantidad observada del marcador indican la presencia y la cantidad de la proteina mutante buscada en las células. Sin embargo, también se conocen otros métodos.

Ejemplo 13. Cultivo de las plantas (Arabidopsis) para análisis bioanaliticos Para los análisis bioanaliticos de las plantas transgénicas, estas últimas se cultivaron de forma uniforme en una instalación de cultivo específica. Con este fin, el sustrato GS-90 se introdujo en la máquina enmacetadora (Laible System GmbH, Singen, Alemania) como una mezcla de composta y se llenó en las macetas. Después, 35 macetas de combinaron en una bandeja para macetas y se trataron con Previcur. Para el tratamiento, 25 mi de Pre-vicur se colocaron en 10 1 de agua del grifo. Esta cantidad fue suficiente para el tratamiento de aproximadamente 200 macetas. Las macetas se colocaron en la solución de Previcur y se irrigaron adicionalmente por aspersión con agua del grifo sin Previcur. Estas se usaron dentro de un periodo de cuatro días.

Para el sembrado, la semillas, las cuales habían sido almacenadas en el refrigerador (a -20°C) , se extrajeron de los tubos Eppendorf con la ayuda de un palillo para dientes y se transfirieron a macetas con la composta. En total, aproximadamente 5 a 12 semillas se distribuyeron en el medio de las macetas.

Después que las semillas habían sido sembradas, las bandejas con las macetas de cubrieron con una capucha de plástico equiparable y se colocaron en la cámara de estratificación durante 4 días, en la oscuridad, a 4°C. La humedad fue de aproximadamente 90%. Después de la estratificación, las plantas de prueba se cultivaron por 22 a 23 días a un ritmo de 16 h a la luz 8 horas de oscuridad a 20°C, a una humedad atmosférica del 60% y una concentración de C02 de aproximadamente 400 ppm. Las fuentes de luz usadas fueron Lámparas de Luz de Día Powerstar HGL-T 250W/D de Osram, las cuales generan una luz que asemeja al espectro de color del sol con una intensidad de luz de aproximadamente 220 E/m2/s-l.

La selección de las plantas transgénica se realizó dependiendo del uso del marcador de resistencia. En el caso del gen bar como el marcador de resistencia, las plántulas se rociaron tres veces en los días 8-10 después del sembrado con BASTA® al 0.02%, Bayer Cropscience, Alemania, Leverkusen. Las plantas con resistencia se podaron cuando estas hubieron alcanzado la edad de 14 días. Las plantas que habían crecido menor en el centro de las macetas se consideraron las plantas objetivo. Todas las plantas restantes se removieron cuidadosamente con la ayuda de pinzas metálicas y se desecharon .

Durante si crecimiento, las plantas recibieron irrigación por aspersión con agua destilada (sobre la composta) e irrigación inferior en las ranuras de colocación. Una vez que las plantas cultivadas habían alcanzado la edad de 23 días, estas se cosecharon. En el caso de que se desearan sus semillas estas habían sido cosechadas 10 a 12 semanas después del sembrado (una vez que estas estén maduras) .

Ejemplo 14: Análisis metabólico de las plantas transformadas .

Las modificaciones identificadas de acuerdo con la invención, en el contenido de los metabolitos descritos anteriormente, se identificaron mediante el siguiente procedimiento . a) muestreo y almacenamiento de las muestras El muestreo se llevó a cabo directamente en la cámara de medio ambiente controlado. Las plantas, o las partes respectivas de las mismas, como las hojas, se cortaron usando tijeras de laboratorio pequeñas, se pesaron rápidamente en balanzas de laboratorio, se transfirieron a un dedal de extracción pre-enfriado y se colocaron en un soporte de aluminio enfriado por nitrógeno líquido. Si se requiere, los dedales de extracción pueden ser almacenados en el congelador a 80°C. El tiempo transcurrido entre el corte de las plantas/partes de las plantas al congelamiento en nitrógeno liquido no alcanza más de 10 a 20 segundos. b) Liofilización Durante el experimento, se tuvo cuidado de que las plantas permanecieran en el estado de congelación profunda (temperaturas < -40°C) o estuvieran libres de agua por liofilización hasta el primero contacto con los solventes.

El soporte de aluminio con las muestras de las plantas en los dedales de extracción se colocó en el equipo de liofilización pre-enfriado (-40°C) . La temperatura inicial durante la fase principal de secado fue de -35°C y la presión fue de 0.120 mbar. Durante la fase de secado, los parámetros se alteraron siguiendo un programa de presión y temperatura. La temperatura final después de 12 horas fue de +30°C y la presión final fue de 0.001 a 0.004 mbar. Después, que se apagó la bomba de vacio y la máquina de refrigeración, el sistema se inundó con aire (secado por medio de un tubo de secado) o argón . c) extracción Extracción del tejido verde de Arabidopsis: Inmediatamente después que el aparato de liofilización había sido inundado, los dedales de extracción con el material vegetal liofilizado, se transfirieron a cartuchos de extracción de 5 mi del dispositivo ASE (Extractor Acelerado por Solvente ASE 200 con Controlador de Solvente y el programa AutoASE (DIONEX) ) .

Las 24 posiciones de muestreo de un dispositivo ASE (Extractor Acelerado por Solvente ASE 200 con el Controlador de Solvente y el programa AutoASE (DIONEX) ) se llenaron con muestras de las plantas, incluyendo algunas muestras para evaluación del control de calidad.

Las sustancias polares se extrajeron con aproximadamente 10 mi de metanol/agua (80/20, v/v) a una T= 70°C y una p = 140 bar, 5 minutos de fase de calentamiento, 1 minuto de extracción estática. Las sustancias más lipofilicas se extrajeron con aproximadamente 10 mi de metanol/diclorometano (40/60, v/v) a una T= 70°C y una p= 140 bar, fase de calentamiento de 5 minutos, 1 minuto de extracción estática. Las dos mezclas de solventes se extrajeron a los mismos tubos de vidrio (tubos de centrifugación, 50 mi, equipados con una tapa con rosca y con un septo perforable para el ASE (DIONEX) ) .

La solución se trato con los estándares internos disponibles comercialmente, tales como ribitol, L-glicina-2, 2-d2, L-alanina-2, 3, 3, 3-d4, metionina-d3 , Arginina_ ( 13C) , Triptofano-d5, y a-metilglucopiranosido y nonadecanoato de metilo, undecanoato de metilo, tridecanoato de metilo, pentadecanoato de metilo, nonacosanoato de metilo.

El extracto total se trató con 8 mi de agua. El residuo sólido de las muestras de las plantas y de los dedales de extracción se desechó.

El extracto se agitó y después se sometió a centrifugación durante 5 a 10 minutos al menos a 1400 g con el fin de acelerar la separación de las fases. 1 mi de la fase de metanol/agua sobrenadante ("fase polar", incolora) se extrajo para el análisis de GC posterior, y 1 mi se extrajo para el análisis de LC. El resto de la fase de metanol/agua se desechó. 0.5 mi de la fase organiza (fase lipidica, verde oscuro) se extrajo para el análisis de GC posterior y 0,5 mi se extrajeron para el análisis de LC. Todas las porciones extraídas se evaporaron a sequedad usando el evaporador al vacío por infrarrojos IR Dancer (Hettich) . La temperatura máxima durante el proceso de evaporación no excedió los 40°C. La presión en el aparato no fue menor a 10 mbar.

Extracción de las semillas de Arabidopsis: 3 mg de semillas de Arabidopsis se trasfirieron a un tarro de molienda de acero inoxidable, de 1.2 mL y se trituraron y se extrajeron con una mezcla de 770 L de metanol y 290 yL de agua. Una solución que contenía las sustancias estándar disponibles comercialmente (ribitol, L-glicina-2 , 2-d2, L alanina-2 , 3, 3, 3-d , metionina-etil-d3 , triftofano-d5, Arginina 13C615N4, Pep3 (Boc-Ala-Gly-Gly-Gly-OH) , y a-metilglucopiranosida) se agrega como el estándar interno. La extracción se lleva a cabo usando una bola de acero inoxidable y un molino de bolas (Restsch MM 200, Retsch, Alemania) operado a 30 Hz durante 3 minutos. Después de la centrifugación a 6000 rpm durante 5 min, 800 del solvente de extracción se trasfieren a un tubo de reacción de 2 mL (Eppendorf ) . Una solución de las sustancia estándar disponibles comercialmente (Coenzima Ql, Coenzima Q2, Coenzima Q4, y nanodecanoato de metilo, ácido undecanoico, ácido tridecanoico, ácido pentadecanoico, nonacosanoato de metilo) se agrega como el estándar interno. Para la extracción de los metabolitos lipofilicos, se agregan 640 pL de cloruro de metileno y 170 µ? de metanol y la muestra se extrae en un molino de bolas operado a 30 Hz durante 3 minutos. Después de la centrifugación a 6000 rpm durante 5 min, 800 del solvente de extracción se transfieren y se combinan con el extracto de la primera etapa de extracción. Después de la adición de 400 \i~L de agua y una etapa de centrifugación para asegurar la separación apropiada de la capa orgánica y acuosa, de toman dos alícuotas de 500 pL de la capa acuosa superior (fase polar) para los análisis de GC y LC, respectivamente.

De toman dos alícuotas de 100 yL de la capa orgánica inferior (fase lipídica) para los análisis de GC y LC respectivamente .

Todas las porciones extraídas se evaporaron a sequedad usando el evaporador infrarrojo al vacío, IR Dancer (Hettich) . La temperatura máxima durante el proceso de evaporación no excedió los 40°C. La presión en de aparato no fue menor a 10 mbar .

Extracción del material de las semillas de arroz y maíz: 20 granos de arroz o maíz se homogeneizaron con un tarro de molienda, de acero inoxidable, de 50 mL y se molieron con una bola de molino de acero inoxidable usando un molino de bolas (Retsch M 200, Retsch, Alemania) operado a 30 Hz durante 3 minutos. Las muestras molidas se sometieron a liofilización durante toda la noche. La temperatura inicial durante la fase de secado principal fue de -35°C y la presión fue de 0.120 mbar. Durante la fase de secado, los parámetros de alteraron siguiendo un programa de presión y temperatura. La temperatura final después de 12 horas fue de +30°C y la presión final fie de 0.001 a 0.004 mbar. Después que la bomba de vacio y la máquina de refrigeración habían sido apagadas, el sistema se inundó con aire (secado por medio de un tubo de secado) o argón. 50 mg del material de los granos liofilizados se pesaron en dedales de extracción de fibra de vidrio y se extrajeron y se procesaron posteriormente como se describe para la Extracción del tejido verde de Arabidopsis. d) Procesamiento de la fase lipídica y polar para el análisis de LC/MS o LC/MS/MS El extracto lipídico, el cual había sido evaporado a sequedad, se colocó en la fase móvil. El extracto polar, el cual había sido evaporado a sequedad se clocó en la fase móvil .

Análisis de LC- S: La parte de LC se llevo a cabo en un sistema de LCMS disponible comercialmente, de Agilent Technologies, EUA. Para los extractos polares 10 µ? se inyectaron en el sistema a una velocidad de flujo de 200 µ?/min. La columna de separación (C18 de Fase Invertida) se mantuvo a 15°C durante la cromatografía. Para los extractos lipidíeos 15 yl se inyectaron en el sistema a una velocidad de flujo de 200 µ?/min. La columna de separación (C18 de Fase Invertida) se mantuvo a 30°C. La HPLC se llevó a cabo con elución por gradiente .

El análisis de espectrometría de masas se llevó a cabo en un instrumento tetrapolo, triple API 4000 de applied Biosystems con una fuente de aerosol electrónico asistida neumáticamente. Para los extractos polares el instrumental midió en el modo de iones negativos en el modo MRM y el modo de barrido completo del espectro de 100-1000 amu. Para los extractos lipidíeos el instrumento midió en el modo de iones positivos en el modo MRM y en el modo de barrido completo del espectro desde 100-1000 amu. El análisis de MS se describe con más detalle en la publicación de patente número WO 03/073464 (Walk y Dostler) . e) Derivación de la fase lipídica y polar para el análisis de GC/MS Derivación de la fase lipídica para el análisis de GC/MS Para la transmetanolisis, una mezcla de 140 µ? de cloroformo, 37 µ? de ácido clorhídrico (37% en peso de HC1 en agua) , 230 µ? de metanol y 20 µ? de tolueno se agregaron al extracto evaporado. El recipiente se selló herméticamente y se calentó por 22 a 100°C, con agitación. La solución se evaporó posteriormente a sequedad. El residuo se secó completamente.

La metoximación de los grupos carbonilo se llevó a cabo mediante la reacción con clorhidrato de metoxiamina (5 mg/ml en piridina, 100 µ? durante 1,5 horas a 60°C) en un recipiente sellado herméticamente. 20 µ? de una solución de ácidos grasos de cadena lineal, con números impares (solución de 0.3 mg/mL de cada uno de los ácidos grados desde 7 a 25 átomos de carbono y 0.6 mg/mL de cada uno de los ácidos grasos con 27, 29, y 31 átomos de carbono en 3/7 (v/v) piridina/tolueno) se agregaron como los estándares de tiempo. Finalmente, la derivación con 100 µ? de N-metil-N- (trimetilsilil ) -2 , 2 , 2-trifluoroacetamida (MSTFA) se lelvó a cabo durante 30 minutos a 60°C, otra vez en el recipiente sellado herméticamente. El volumen final antes de la inyección en la GC fue de 220 µ?.

Derivación de la fase polar para el análisis de GC/MS La metoximación de los grupos carbonilo se llevó a cabo mediante reacción con clorhidrato de metoxiamina (5 mg/ml en piridina, 50 µ? durante 1,5 horas a 60°C) en un recipiente sellado herméticamente. 10 µ? de una solución de ácidos grasos de cadena línea, de números impares (solución de 0.3 mg/mL de cada uno de los ácidos grasos de 7 a 25 astomos de carbono y 0.6 mg/mL de cada uno de los ácidos grasos con 27, 29 y 31 átomos de carbono en 3/7 (v/v) piridina/tolueno) se agregaron como estándares de tiempo. Finalmente, la derivación con 50 µ? de N-metil-N- ( trimetilsilil ) -2, 2, 2-trifluoroacetamida (MSTFA) se llevó a cabo durante 30 minutos a 60°C, otra vez en el recipiente sellado herméticamente. El volumen final antes de la inyección en el GC fue de 110 µ?. f) Análisis de GC-MS Los sistemas de GC-MS consistieron de un Agilent 6890 GC acoplado a un Agilent 5973 MSD. Los muestreadores automáticos fueron CompiPal o GCPal de CTC. Para el análisis, se usaron columnas capilares de separaciones comerciales, usuales, (30 m x 0.25 mm x 0.25 µp\) con diferentes fases estacionarias de poli-metil-siloxano, conteniendo 0% hasta 25% de radicales aromáticos, dependiendo de los materiales de las muestras analizadas y las fracciones de la etapa de separación de fases, (por ejemplo: DB-lms HP-5ms, DB-XLB, DB-35ms, Agilent Technologies) . Hasta 1 µL del volumen final se inyectó sin fraccionamiento y se inició el programa de temperatura del horno a 70°C y se terminó a 340°C con diferentes velocidades de calentamiento, dependiendo del material de la muestra y la fracción de la etapa de separación de fases con el fin de lograr una separación cromatografica y un número de barridos suficientes dentro de cada pico del analito. Se usaron las condiciones estándar comunes de análisis de GC- S, por ejemplo, flujo constante con una velocidad de flujo nominal de 1 a 1.7 ml/min, y helio como el gas de la fase móvil. La ionización se realizó mediante impacto de electrones con 70 eV, el barrido dentro de un rango de m/z desde 15 a 600 con velocidades de barrido de 2.5 a 3 barridos/seg y las condiciones de sintonización estándar. g) Análisis de las varias muestras de plantas Las muestras se midieron en series individuales de 20 a 21 muestras de cada una de las plantas o semillas (llamadas también secuencias) , cada secuencia que contenia al menos 5 muestras de plantas o semillas de tipo silvestre como controles. Las muestras de semillas fueron de plantas individuales. El área máxima de cada analito se dividió entre el área máxima del estándar interno respectivo. Los datos se estandarizaron para el peso fresco establecido para las muestras de plantas o semillas, respectivamente. Los valores asi calculados se relacionaron con el grupo de control de tipo silvestre al ser divididos entre el promedio de los datos correspondientes del grupo de control de tipo silvestre de la misma secuencia. Los valores obtenidos se designaron como la relación_entre_WT, estos se pueden comparar entre las secuencias e indican cuánto de la concentración del analito en los mutantes difiere con relación al control de tipo silvestre. Los controles apropiados se realizaron previamente para comprobar que el vector y el procedimiento de transformación en si no tuvieran influencia sobre la composición metabólica de las plantas. Por lo tanto los cambios descritos en comparación con los tipos silvestres fueron provocados por los constructos genéticos introducidos. Al menos 3-5 lineas independientes se analizaron en dos experimentos independientes para cada constructo.

Ejemplo 15. Mediciones de los químicos finos Purificación de un químico fino que es un sacárido, por ejemplo r mio-inositol sacarosa.

Los sacáridos (carbohidratos) pueden ser detectados ventajosamente, por ejemplo, por medio de los métodos tradicionales del análisis de azúcares acoplados a cromatografía, usando un Detector del índice de Refracción (RID) debido a la falta de un cromóforo de absorción de UV en las moléculas de los azúcares. También se usan otros detectores como la Espectrometría de Masas (MS) o la Detección Amperométrica Pulsada (PAD) . Los métodos para el análisis de los azúcares son la electroforesis capilar, GC, HPLC o LC.

Los sacáridos (carbohidratos) se detectan mediante GC o LC combinadas con MS. Los métodos tradicionales para el análisis de los azúcares acoplados con la cromatografía usan un Detector del índice de Refracción (RID) debido a la falta de un cromóforo de absorción de UV en las moléculas de los azúcares. También se usan otros detectores como la Espectrometría de Masas (MS) o la Detección Amperométrica Pulsada (PAD) . En una modalidad de la invención la fructuosa puede ser detectada mediante cromatografía, cromatografía en capa fina, cromatografía de gases (GC) , cromatografía liquida (LC) , electroforesis capilar y HPLC. Alternativamente, la fructuosa puede ser detectada y analizada mediante biodetectores : se construyó un electrodo enzimático amperométrico para el análisis de la fructosa, mediante la coinmovilización de una enzima pirrólo quinolico quinona (PQQ) (fructuosa-5-deshidrogenasa de Gluconobacter sp. FDH, EC-1.1.99.11) con un mediador en una membrana delgada de polipirrol (PP) (Anal. Chim. Acta; (1993) 281, 3, 527-33). Se desarrollaron dos biodetectores amperométricos para la detección de la fructuosa, mediante la inmovilización de la d-fluctuosa 5-deshidrogenasa mediante dos diferentes procesos de inmovilización (Analytica Chimica Acta, Volumen 374, número 2, 23 de Noviembre de 1998, pp. 201-208(8)).

La glucosa puede ser detectada mediante espectroscopia cercana al infrarrojo con transformación de Fourier (FT-NIR) en el modo de reluctancia difusa (Liu et al., 2006), mediante HPLC (Siehe z. B. Sanchez-Mata et al., European Food Research and Technology, 2004) o mediante análisis de enzimas colorimétricas (Ciantar et al., J Periodontal Res., 2002).

Un método adicional es el análisis de glicanos etiquetados con fluoróforos mediante electroforesis en gel de poliacrilamida de alta resolución (Jackson et al., Anal. Biochem. 216 (1994) 243-52). La sacarosa de la invención se detecta, en una modalidad, mediante los métodos tradicionales de análisis de los azucares acoplados a cromatografía, usando un Detector del índice de Refracción (RID, Koimur et al., Chromatographia 43, 1996, p. 254-260; Callul et al., J. Chromatogr. 590, 1992, p. 215-222); debido a la falta de un cromóforo de absorción de UV en las moléculas de los azúcares. También se usan otros detectores como la Espectrometría de Masas (MS) o la Detección Amperométrica Pulsada (PAD, Weston et al., Food Chem. 64, 1999, p. 33-37; Sigvardson et al., J. Pharm. Biomed. Anal. 15, 1996, p. 227-231) . En otra modalidad, la sacarosa se detecta mediamente el ensayo inmunosorbente enlazado a una enzima (Patente norteamericana 5972631), o mediante Detección por Infrarrojos con Transformación de Fourier en Sistemas de Análisis Total Miniaturizados para el Análisis de la Sacarosa (Anal. Chem. 1997, 69, 2877-2881).

Purificación de los químicos finos que son ácidos grasos, por ejemplo, ácido linoléico y ácido linolénico.

Los microorganismos pueden ser desintegrados mediante sonificación, maceración en un molino de vidrio, nitrógeno líquido, y maceración, cocinado, o por medio de otros métodos aplicables. Después de la desintegración, puede segur la contribución. El sedimento se vuelve a suspender en agua destilada, se calienta durante 10 minutos a 100°C se enfría en hielo y se somete a centrifugación, seguido por extracción durante una hora a 90°C en ácido sulfúrico 0.5 M en metanol con 2% de dimetoxipropano, lo cual lleva a compuestos que son aceites y lipidos hidrolizados, los cuales damn lipidos transmetilados . Estos metil ésteres de ácido graso se extraen con éter de petróleo y el solvente se evapora más tarde. El análisis de los estrés de ácido graso asi obtenido se llevará a cabo mediante análisis por GC usando una columna capilar (Chrompack, Sílice Fusionada WCOT, CP-Wax-52 CB, 25 micrómetros, 0.32 mm) a un gradiente de temperatura de entre 170°C y 240°C durante 2 minutos y 5 minutos a 240°C. La identidad de los metil ésteres de ácido graso resultantes puede ser determinada usando los estándares los cuales están disponibles de las fuentes comerciales (es decir, Sigma) .

Tabla Rl La Columna 1 muestra la SEC ID NO, la Columna 2 muestra el tipo de la expresión (focalizada, no focalizada), la Columna 3 muestra el "nombre del gen" (secuencia), la Columna 4 muestra el metabolito analizado, la Columna 5 indica el tejido de la fuente A. thaliana analizado, la Columna 6 indica el promotor usado para la expresión, la Columna 7 indica el método analítico. Las Columnas 8 y 9 muestran el aumento mínimo y máximo del metabolito analizado (en porcentaje) en comparación con el tipo silvestre (relación_en_WT) , dado como el aumento porcentual) .

El término "sin objetivo" en la Columna 2 la cual muestra el tipo de la expresión significa "no focalizado" es decir, la secuencia de la SEC ID NO: 1, no está vinculada con un plastidio, secuencia de focalización secretoria o mitocondrial , o ninguna señal de focalización.

Ejemplo 16, Procedimiento de evaluación fenotipica del estrés .

Sequía En el ensayo de sequía cíclica, se aplica una presión repetitiva a plantas Arabidopsis son llevar a la desecación. En un experimento estándar se prepara tierra como una mezcla 1:1 (v/v) de suelo rico en nutrientes (GS90, Tantau, Wansdorf, Alemania) y arena de cuarzo. Se llenaron macetas (6 cm de diámetro) con esta mezcla y se colocaron en bandejas. Se agregó agua a las bandejas y se dejó que la mezcla de tierra absorberá una cantidad apropiada de agua para el procedimiento de sembrado (día 1) y posteriormente las semillas de la generación T2 de plantas transgénicas de A. thaliana y de sus controles de tipo silvestre se sembraron en las macetas.

Entonces, las bandejas llenas se cubrieron con una tapa transparente y se transfirieron a una cámara de crecimiento pre enfriada (4°C-5°C) y oscurecida. La estratificación se estableció por un periodo de 3 días en la oscuridad a 4°C-5°C, o, alternativamente durante 4 días en la oscuridad a 4°C. La germinación y el crecimiento de las semillas se iniciaron a las condiciones de cultivo de 20°C, 60% de humedad relativa, 16h de fotoperiodo e iluminación con luz fluorescente a 200µp??1/?t?23 o, alternativamente a 220 mol/m2s. Las cubiertas se removieron 7.8 días después del sembrado. La selección por BASTA se realizó el día 10 o el dia 11 (o o 10 días después del sembrado) rociando las macetas con las plántulas desde la parte superior. En el experimento estándar, una solución de 0.07% (v/v) de concentrado de BASTA (183 g/1 de glufosinato de amonio) en agua del grifo se roció una vez o, alternativamente, una solución de 0.02% (V/V) de BASTA se roción tres veces. Las plantas de control de tipo silvestre se rociaron con agua del grifo solamente (en lugar del rociado con BASTA disuelta en agua del grifo) pero aparte de eso se trataron de forma idéntica. Las plantas se individualizaron 13-14 días después del sembrado al remover el excedente de plántulas y dejando una plántula en la tierra. Los eventos transgénicos y las plantas de control de tipo silvestre se distribuyeron de forma uniforme a través de la cámara.

El suministro de agua durante todo el experimento fue limitado y las plantas se sometieron a ciclos de sequía y reinicio del regado. El regado se llevó a cabo el día 1 (antes del sembrado), el día 14 o el día 15, el día 21 o el día 22, y finalmente, el día 27 o el día 28. Para medir la producción de la biomasa, se determinó el peso fresco de las plantas un día después del regado final (día 28 o día 29) cortando los brotes y pesándolos. Además, del pesado, se agregó la información fenotípica en el caso de las plantas que diferían del control de tipo silvestre. Las plantas estaban en la etapa anterior a la floración y anterior al crecimiento de la inflorescencia cuando se cosecharon. Los valores de la significación para la significación estadística de los cambios de la biomasa se calcularon aplicando la 'prueba t de student' (parámetros: dos lados, varianza desigual) . En este experimento, la resistencia o la tolerancia a la sequía cíclica y la producción de la biomasa se compararon con las de las plantas de tipo silvestre. Los resultados de resumen la tabla R2.

Selección por eficiencia en el uso del nitrógeno Las plantas de TI y T2 se cultivaron en macetas con tierra bajo condiciones normales, excepto por la solución de nutrientes. Las macetas se regaron desde el trasplante hasta la maduración con una solución de nutrientes específica que contenía un contenido reducido N de nitrógeno (N) , usualmente de entre 7 a 8 veces menor. El resto del cultivo (maduración de las plantas, cosecha de las semillas) fue igual para las plantas que no se cultivaron bajo presión abiótica. Los parámetros de crecimiento y rendimiento se registran como se detalla para el crecimiento bajo las condiciones normales.

Selección por estrés por sal Las plantas TI y T2 se cultivaron en un substrato preparado de fibras de coco y particular de arcilla horneada (Argex) (proporción de 3 a 1) . Una solución de nutrientes normal se uso durante las primeras dos semanas después del trasplante de las plántulas en el invernadero. Después de las primeras dos semanas, se agregaron 25 mM de sal (NaCl) a la solución de nutrientes, hasta que las plantas se cosecharon. Los parámetros de crecimiento y de rendimiento se registran como se detalla para el crecimiento bajo las condiciones normales .

Ejemplo 11 : Resultados de la evaluación fenotipica del estrés de las plantas transgénicas La producción de la biomasa se midió pesando las rosetas de las plantas. El aumento de la biomasa se calculó como la relación del peso promedio para las plantas transgénicas comparado con el peso promedio de la plantas de control de tipo silvestre del mismo experimento. El porcentaje máximo de aumento de la biomasa dentro del grupo de los cinco eventos fue de más de 1.49. El porcentaje promedio de la biomasa sobre la superficie de la tierra de las plantas transgénicas versus las plantas de control se muestra en la tabla R2 y fue un aumento en la biomasa sobre la superficie de la tierra mayor al 22%.

Tabla R2 : Producción de biomasa de la A. thaliana transgénica desarrollada bajo condiciones de cultivo en sequía cíclica.

SeCID Objetivo Secuencia Aumento de la Biomasa 1 Citoplasmático Ynl064c 1.2248 Ejemplo 17: Plantas de Arabidopsis modificadas por ingeniería, con producción aumentada de un químico fino mediante la (sobre) expresión de una proteína chaperona similar a DnaJ de la secuencia de cualquiera de las SEC ID Nos de la tabla XX, preferiblemente la SEC XD NO : 2 o 42, usando promotores específicos del tejido y/o inducibles por el estrés .

Plantas transgénicas de Arabidopsis se crearon como en el ejemplo 9 para expresar el gen de chaperona similar a DnaJ bajo el control de un promotor específico del tejido y/o inducible por el estrés.

Se produjeron plantas de la generación T2 y se cultivaron bajo las condiciones estándar. La producción de la sustancia química fina se determina después de un tiempo total de 29 a 30 días iniciando con el sembrado. Las plantas transgénicas de Arabidopsis producen más de una o más de las químicos finos listadas en la tabla FC, que las plantas de control no transgénicas .

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para incrementar el contenido de cualquiera o más de los químicos finos listados en la Tabla FC en plantas comparadas a las plantas de control y para mejorar los rasgos relacionados al rendimiento en plantas bajo condiciones de estrés medioambiental abiótico y/o condiciones sin estrés en plantas con relación a las plantas de control, caracterizado en que comprende incrementar la expresión, en una planta, de un ácido nucleico que codifica un polipéptido POI, en donde dicho polipéptido POI es un chaperón análogo a DnaJ.

2. Un método para mejorar los rasgos relacionados al rendimiento en plantas bajo condiciones de estrés medioambiental abiótico con relación a las plantas de control, caracterizado en que comprende incrementar la expresión, en una planta, de un ácido nucleico que codifica un polipéptido POI, en donde dicho polipéptido POI es un chaperón análogo a DnaJ.

3. Un método para incrementar el contenido de cualquiera o más de los químicos finos listados en la Tabla FC en plantas con relación a las plantas de control, caracterizado en que comprende incrementar la expresión, en una planta, de un ácido nucleico que codifica un polipéptido POI, en donde dicho polipéptido POI es un chaperón análogo a DnaJ.

4. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado en que dicha expresión incrementada se efectúa introduciendo y expresando, en una planta, dicho ácido nucleico que codifica dicho polipéptido POI .

5. El método de acuerdo con cualquier reivindicación previa, caracterizado en que el ácido nucleico que codifica el chaperón análogo a DnaJ se selecciona a partir del grupo que consiste de: (i) un ácido nucleico representado por SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39 o 41; (ii) el complemento de un ácido nucleico representado por SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39 o 41; (iii) un ácido nucleico que codifica un polipéptido POI que tiene en orden creciente de preferencia al menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad de secuencia a la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40 o 42 y que adicionalmente comprende uno o más dominios que tienen en orden creciente de preferencia al menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia a cualquiera o más de los dominios PFAM PF00226, PF01556 y PF00684, y preferiblemente al dominio conservado que inicia con el aminoácido 6 hasta el aminoácido 67 y/o al dominio conservado que inicia con el aminoácido 143 hasta el aminoácido 208 y/o al dominio conservado que inicia con el aminoácido 265 hasta el aminoácido 348 en el SEQ ID NO: 2, y adicionalmente preferiblemente que confiere rasgos relacionados al rendimiento mejorados con relación a las plantas de control bajo condiciones de estrés medioambiental abiótico y/o condiciones sin estrés, y/o contenido incrementado de químicos finos de uno o más químicos finos según se lista en la tabla FC . (iv) un ácido nucleico que codifica el polipéptido según se representa por (cualquiera de) SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40 o 42 preferiblemente como resultado de la degeneración del código genético, dicho ácido nucleico aislado se puede derivar a partir de una secuencia de polipéptidos según se representa por (cualquiera de) SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40 o 42 y adicionalmente preferiblemente que confiere rasgos relacionados al rendimiento mejorados con relación a las plantas de control bajo condiciones de estrés medioambiental abiótico y/o condiciones sin estrés, y/o contenido incrementado de químicos finos de uno o más químicos finos según se lista en la tabla FC; (v) un ácido nucleico que codifica un polipéptido POI que comprende uno o más, preferiblemente a los tres patrones de consenso de SEQ ID NO: 45, 46 y 47, y adicionalmente preferiblemente que confiere rasgos relacionados al rendimiento mejorados con relación a las plantas de control bajo condiciones de estrés medioambiental abiótico y/o condiciones sin estrés, y/o contenido incrementado de químicos finos de uno o más químicos finos según se lista en la tabla FC ; (vi) una molécula de ácido nucleico que híbrida con una molécula de ácido nucleico de (ii) bajo condiciones de hibridación de alta severidad y preferiblemente confiere rasgos relacionados al rendimiento mejorados con relación a las plantas de control bajo condiciones de estrés medioambiental abiótico y/o condiciones sin estrés, y/o contenido incrementado de químicos finos de uno o más químicos finos según se lista en la tabla FC.

6. El método de acuerdo con la reivindicación de cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 4 o 5, caracterizado en que dichos rasgos relacionados al rendimiento mejorados comprenden biomasa incrementada y/o rendimiento de semilla incrementado con relación a las plantas de control.

7. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 4, 5 o 6, caracterizado en que dichos rasgos relacionados al rendimiento mejorados se obtienen bajo condiciones de sequía, estrés por salinidad o deficiencia de nitrógeno, preferiblemente sequía.

8. El método de acuerdo con la reivindicación 1, 2, 3, 4 o 5 caracterizado en que dicho contenido incrementado de uno o más químicos finos se obtiene bajo condiciones sin estrés.

9. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado en que dicho polipéptido POI comprende (i) uno o más, preferiblemente dos, y más preferiblemente los tres de los siguientes dominios PFAM PF00226, PF01556 y PF00684 y al menos uno, preferiblemente cualesquiera dos, más preferiblemente los tres patrones de consenso de SEQ ID NO: 45, 46 y 47; y/o (ii) el dominio conservado que inicia con el aminoácido 6 hasta el aminoácido 67 y/o un dominio conservado que inicia con el aminoácido 143 hasta el aminoácido 208 y/o un dominio conservado que inicia con el aminoácido 265 hasta el aminoácido 348 en el SEQ ID NO: 2.

10. Un constructo de expresión de la planta, caracterizado en que comprende (a) un ácido nucleico que codifica un polipéptido chaperón análogo a DnaJ según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1, 5 o 9; (b) una o más secuencias de control capaces de dirigir la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos de (a) , en donde al menos una secuencia de control es un promotor constitutivo operativamente enlazado al ácido nucleico de (a) ; y opcionalmente (c) una secuencia de terminación de la transcripción.

11. El cásete de expresión caracterizado en que comprende el ácido nucleico según se define en las reivindicaciones 1, 5 o 9 y operativamente enlazado a un promotor constitutivo, no nativo .

12. El uso de un constructo caracterizado en que comprende : (i) el ácido nucleico que codifica un POI según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1, 5 o 9; (ii) una o más secuencias de control capaces de dirigir la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos de (i); y opcionalmente (iii) una secuencia de terminación de la transcripción; o del constructo de la reivindicación 10 o del cásete de expresión de la reivindicación 11; para incrementar el contenido de cualquiera o más de los químicos finos listados en la Tabla FC en plantas con relación a las plantas de control y/o incrementar los rasgos relacionados al rendimiento de una planta bajo condiciones de estrés, preferiblemente bajo condiciones de estrés medioambiental abiótico, y/o condiciones sin estrés, preferiblemente bajo condiciones de disponibilidad de agua limitada, más preferiblemente bajo condiciones de sequía con relación a una planta de control.

13. Los métodos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizados en que el ácido nucleico que codifica el POI se enlaza operativamente a una secuencia de control, o un uso de acuerdo con la reivindicación 10 en donde una de dichas secuencias de control es un promotor constitutivo.

14. Las partes cosechables de una planta obtenible por un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 o 13, caracterizadas en que dichas partes cosechables comprenden un ácido nucleico recombinante que codifica dicho polipéptido según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1, 5 o 9 y/o el constructo de la reivindicación 10 y/o el cásete de expresión de la reivindicación 11, en donde dichas partes cosechables son preferiblemente biomasa de los brotes y/o semillas.

15. Los productos derivados a partir de una planta obtenible por un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 o 13 y/o a partir de partes cosechables de una planta de acuerdo con la reivindicación 14, caracterizados en que los productos comprenden un ácido nucleico recombinante que codifica un polipéptido chaperón análogo a DnaJ según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1, 5 o 9 y/o un polipéptido chaperón análogo a DnaJ recombinante según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1, 5 o 9 y/o el constructo de la reivindicación 10 y/o el cásete de expresión de la reivindicación 11.

16. El uso de un ácido nucleico que codifica un polipéptido POI según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1, 5 o 9, para incrementar el contenido de cualquiera o más de los químicos finos listados en la Tabla FC en plantas con relación a las plantas de control y/o incrementar los rasgos relacionados al rendimiento de una planta bajo condiciones de estrés, preferiblemente bajo condiciones de estrés medioambiental abiótico, y/o condiciones sin estrés, preferiblemente bajo condiciones de disponibilidad de agua limitada, más preferiblemente bajo condiciones de sequía con relación a una planta de control.

17. Un método para la producción de un producto con contenido incrementado de cualquiera o más de los químicos finos listados en la Tabla FC con relación a un producto de una planta de control, caracterizado en que comprende las etapas de cultivar las plantas obtenibles por un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 o 13 y producir dicho producto a partir de o por (i) dichas plantas; o (ii) partes, incluyendo semillas, de dichas plantas.

18. El método de la reivindicación 17, caracterizado en que los productos comprenden un ácido nucleico recombinante que codifica un polipéptido chaperón análogo a DnaJ según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1, 5 o 9 y/o un polipéptido chaperón análogo a DnaJ recombinante según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1, 5 o 9.

19. Una planta transformada con el constructo de la reivindicación 10 o el cásete de expresión de la reivindicación 11, caracterizada en que la planta tiene rasgos relacionados al rendimiento incrementado bajo condiciones de estrés abiótico y/o contenido incrementado de cualquiera o más de los químicos finos listados en la Tabla FC bajo condiciones de estrés medioambiental abiótico y/o condiciones sin estrés en comparación a una planta de control.

20. El producto agrícola caracterizado en que comprende los ácidos nucleicos según se define en cualquiera de las reivindicaciones 1, 5 o 9 o el polipéptido POI según se define en las reivindicaciones 1, 5 o 9 o el cásete de expresión de la reivindicación 11 o el constructo de la reivindicación 10.

21. El ADN cromosómico recombinante caracterizado en que comprende el constructo de la reivindicación 10 o el cásete de expresión de la reivindicación 11 o el ácido nucleico según se define en las reivindicaciones 1, 5 o 9.

22. Un constructo de acuerdo con la reivindicación 10 o un cásete de expresión de la reivindicación 11 o el ADN cromosómico recombinante de la reivindicación 20 comprendido en una célula de planta.

23. Cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada en que la planta se selecciona a partir del grupo que cosiste de maíz, trigo, arroz, soya, algodón, colza oleaginosa incluyendo cañóla, caña de azúcar, remolacha azucarera y alfalfa.

24. Cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada en que la planta es una planta de caña de azúcar con biomasa incrementada y/o contenido incrementado de sacarosa de los tallos.

25. La célula hospedera caracterizada en que comprende el constructo de la reivindicación 10 o el cásete de expresión de la reivindicación 11 o el ácido nucleico según se define en las reivindicaciones 1, 5 o 9, en donde la célula hospedera es un microorganismo.

26. Un proceso para la producción de cualquiera o más de los químicos finos listados en la Tabla FC, caracterizado en que comprende a. incrementar o generar la actividad de un chaperón análogo a DnaJ de manera no dirigida en un organismo no humano o una parte del mismo, preferiblemente un microorganismo, una célula de planta, una planta o una parte de la misma, en comparación a un organismo no humano de tipo salvaje, no transformado, correspondiente o una parte del mismo; y b. cultivar el organismo no humano o una parte del mismo bajo condiciones que permiten la producción de cualquiera o más de los químicos finos listados en la Tabla FC o una composición que comprende cualquiera o más de los químicos finos listados en la Tabla FC en dicho organismo no humano o en el medio de cultivo que rodea dicho organismo no humano.

27. Cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada en que el químico fino es sacarosa.

28. Cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada en que el químico fino es mio-inositol.

29. Cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada en que el químico fino es ácido linoleico.

30. Cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada en que el químico fino es ácido linolénico.

31. Cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada en que se incrementa una combinación de cualquiera de los químicos finos, sacarosa, mio-inositol, ácido linoleico y ácido linolénico. RESUMEN DE LA INVENCIÓN Se proporciona un método para mejorar los rasgos relacionados al rendimiento en plantas mediante la modulación de la expresión, en una planta, de un ácido nucleico que codifica un polipéptido POI (Proteina De Interés) . Se proporcionan métodos para la producción de plantas que tienen expresión modulada de un ácido nucleico que codifica un polipéptido chaperón análogo a DnaJ, en que las plantas tienen rasgos relacionados al rendimiento, mejorados, en comparación a las plantas de control. También se proporcionan ácidos nucleicos que codifican el chaperón análogo a DnaJ, constructos que comprenden los mismos y usos de los mismos.