CN113999211B

CN113999211B - 一类特异性抗前列腺癌活性的含1,2,3-三氮唑的吲唑骨架衍生物

Info

Publication number: CN113999211B
Application number: CN202111392875.7A
Authority: CN
Inventors: 吴春丽; 曹亚权; 杨莹雪; 杨璞; 张烁; 关建丽; 孟庆芬; 杨先玉; 王兴; 多晓静; 周全丽; 王新敏
Original assignee: Henan Fusen Pharmaceutical Co ltd; Zhengzhou University
Current assignee: Henan Fusen Pharmaceutical Co ltd; Zhengzhou University
Priority date: 2021-11-23
Filing date: 2021-11-23
Publication date: 2022-11-29
Anticipated expiration: 2041-11-23
Also published as: CN113999211A

Abstract

本发明属于药物化学领域，公开了一种具有特异性抗前列腺癌活性的含1,2,3三氮唑的吲唑骨架衍生物、其合成方法及应用。其制备方法简单，条件温和，收率高。体外活性评价结果表明，本发明化合物对前列腺癌具有特异性抗增殖活性，而对于乳腺癌、肝癌和胃癌却没有表现出活性，与阳性化合物5‑氟尿嘧啶相比，具有显著的优越性，并且表现出较优的体外和体内安全性，具有制备前列腺癌药物应用前景。其具有以下结构通式：

Description

一类特异性抗前列腺癌活性的含1,2,3-三氮唑的吲唑骨架衍生物

技术领域

本发明涉及一种新型含1,2,3-三氮唑的吲唑骨架衍生物及其作为前列腺癌治疗药物应用，属于药物化学领域。

背景技术

前列腺癌是全球男性第二常见的癌症，在欧美国家，前列腺癌已逐渐成为威胁男性健康的主要杀手。化学疗法疗在当前临床治疗中起着不可或缺的作用。因此，寻找、设计和合成高效、安全的抗肿瘤药物治疗前列腺癌具有重要意义。

具有不同官能团的不同取代吲唑衍生物在过去和近年来都受到了广泛关注，因为它们具有不同的生物学特性，如抗炎、抗菌、抗HIV、抗心律失常、抗真菌和抗肿瘤等。目前，至少43种以吲唑为基础的治疗药物已进入临床应用或临床试验。基于吲唑骨架的新药开发在未来具有重要的前景。

1,2,3-三氮唑基团是一个有吸引力的连接单元。大量含有1,2,3-三氮唑的分子具有多种生物活性，如抗肿瘤、抗HIV、抗结核、抗菌等。因为它们对代谢降解稳定，并且可以形成氢键，这有利于生物分子目标的结合，并可以提高溶解性。与其他氮杂环相反，1,2,3-三唑环在生理pH值下不会质子化，因为其碱性差。因此，1,2,3-三唑可以用作小药物分子的药效团。

以1,2,3-三氮唑作为连接单元在吲唑上引入活性基团，合成新型化合物，对其药物活性进行研究，尝试开发抗前列腺癌药物，目前未见此类化合物的相关报道。

发明内容

本发明目的在于提供一种具有良好抗前列腺癌活性的含1,2,3-三氮唑的吲唑骨架衍生物衍生物或其盐。

本发明的另一个目的是提供其合成方法。

本发明再一个目的是提供所述化合物在制备抗前列腺癌药物方面的应用。

为实现本发明目的，技术方案如下：

所述含1,2,3-三氮唑的吲唑骨架衍生物的结构通式如下：

包括其药学上可接受的盐、酯、前药或者溶剂化合物

n＝0,1,2

R₁选自i或ii或iii或iv：

i：R₁为氢，含有1-3个碳原子的直链烷基或异丙基；

ii：R₁为苯基或被取代的苯基，取代基为单取代基或双取代基或三取代基，取代基选自F、Cl、Br或I，或1-3个碳原子的直链或支链烷基或羟基，硝基，甲氧基，叔丁基；

iii：R₁为含单氮或多氮不饱和五元或六元杂环基；或被取代的单氮或多氮不饱和五元或六元杂环基，取代基为单取代基或双取代基，取代基选自F、Cl、Br或I，或1-3个碳原子的直链或支链烷基或羟基，硝基，三氟甲基，乙酰氨基，N，N-二甲氨基，甲氧基，叔丁基；

iv：R₁为含单氧，单硫，氮氧，氮硫不饱和五元或六元杂环基；或被取代的含单氧，单硫，氮氧，氮硫不饱和五元或六元杂环基，取代基为单取代基或双取代基，取代基选自F、Cl、Br或I，或1-3个碳原子的直链或支链烷基或羟基，硝基，三氟甲基，乙酰氨基，N，N-二甲氨基，甲氧基，羟乙基；

R₂选自v或vi或vii或viii：

v：R₂为氢，含有1-3个碳原子的直链烷基或异丙基；

vi：R₂为苯基或被取代的苯基，取代基为单取代基或双取代基或三取代基，取代基选自F、Cl、Br或I，或1-3个碳原子的直链或支链烷基或羟基，硝基，三氟甲基，乙酰氨基，N，N-二甲氨基，甲氧基，叔丁基，腈基；

vii：R₂为含单氮或多氮不饱和五元或六元杂环基；或被取代的单氮或多氮不饱和五元或六元杂环基，取代基为单取代基或双取代基，取代基选自F、Cl、Br或I，或1-3个碳原子的直链或支链烷基或羟基，硝基，三氟甲基，乙酰氨基，N，N-二甲氨基，甲氧基，叔丁基；

viii：R₂为含单氧，单硫，氮氧，氮硫不饱和五元或六元杂环基；或被取代的含单氧，单硫，氮氧，氮硫不饱和五元或六元杂环基，取代基为单取代基或双取代基，取代基选自F、Cl、Br或I，或1-3个碳原子的直链或支链烷基或羟基，硝基，三氟甲基，乙酰氨基，N，N-二甲氨基，甲氧基，羟乙基；

优选如下取代基化合物：

n＝0,1

R₁选自i：

i：R₁为氢，含有1-3个碳原子的直链烷基或异丙基；

R₂选自vi

vi：R₂为苯基或被取代的苯基，取代基为单取代基或双取代基，取代基选自F、Cl、Br或I，或1-3个碳原子的直链或支链烷基或羟基，硝基，三氟甲基，甲氧基，叔丁基，腈基；

更优选如下具体化合物：

本发明提供的上述化合物的制备方法，通过以下反应路线实现(以4位侧链取代为例)：

(1)将1H-吲唑-4-羧酸甲酯溶于有机溶剂中，加入碘代的化合物，无机碱，回流得到橘黄色目标物1。

R₁选自i或ii或iii或iv。

所用的无机碱为碳酸钾、碳酸钠和碳酸铯中的一种或两种；

所用的有机溶剂为乙腈，N,N-二甲基甲酰胺中的一种或两种；

其中，1H-吲唑-4-羧酸甲酯和碘代化合物可市售得到。

(2)将通式1化合物溶于有机溶剂之中，加入强碱回流反应，调酸得白色的固体目标物2。

所用通式1化合物：R₁选自i或ii或iii或iv。

所用的有机溶剂为甲醇或乙醇中的一种或两种；

所用的强碱为氢氧化钠或氢氧化钾中的一种或两种。

(3)将通式2化合物溶于有机溶剂之中，加入酸胺缩合剂和炔丙基胺室温反应，得米白色目标物3。

所用通式2化合物：R₁选自i或ii或iii或iv。

所用的有机溶剂为二氯甲烷或N,N-二甲基甲酰胺中的一种或两种；

所用的酸胺缩合剂为EDCI/HOBT(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐/1-羟基苯并三唑)、HATU(N,N,N′,N′-四甲基-O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)六氟磷酸脲)、HBTU(苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐)中的一种或两种；

原料炔丙基胺和酸胺缩合剂可市售得到。

(4)将通式3化合物和通式7化合物溶于有机溶剂和水(V:V＝1:1)之中，加入无水硫酸铜和抗坏血酸钠室温反应，得米白色目标物4。

所用通式3化合物：R₁选自i或ii或iii或iv。

所用的有机溶剂为二氯甲烷或四氢呋喃中的一种或两种；

所用通式7化合物：R₂选自v或vi或vii或viii；n＝0,1,2

当n＝0时：

将芳香胺溶于稀盐酸中，依次滴加亚硝酸钠和叠氮化钠的水溶液，反应完全后体系调pH成中性，乙酸乙酯萃取，有机相干燥得通式7化合物；

当n＝1,2时：

将溴取代物和叠氮化钠加入到有机溶剂中，回流过夜，体系萃取有机相蒸干得通式7化合物。

所用的有机溶剂为二甲基亚砜或N,N-二甲基甲酰胺的一种或两种；

原料叠氮化钠可市售得到。

本发明的合成方法包括但不限于上述步骤的前或后添加或去除适当的保护基以得到本发明化合物。此外，改变反应步骤的顺序得到本发明化合物也是属于本发明的合成方法的范畴。

本发明化合物可用于治疗或预防前列腺癌疾病。

本发明表述的治疗或预防前列腺癌疾病的量表述为“治疗有效量”，可以根据体重、比表面积或本发明的化合物的不同而变化。

本发明的有效量可以根据病情的紧急程度成比例增加或减少。

本发明化合物及其药学上可接受的盐、酯、前药或者溶剂化合物的应用：作为活性成分，至少与一种药学上可接受的载体，辅剂或稀释剂结合制成药物组合物或兽药组合物，用于生产生物医药产品，治疗。

“可接受的载体”为药学领域公开的可接受的成分，为固体或者液体的填料、赋形剂、溶剂、稀释剂等，帮助受试药物在体内的运输和吸收、分布，必须对患者无害。

本发明的制剂包括但不限于最终灭菌注射液、非最终灭菌注射液、粉针、片剂、颗粒剂、胶囊、可溶性粉、散剂。

除非其他方面表明，本发明化合物所有的立体异构体，几何异构体，互变异构体，氮氧化合物，水合物，溶剂化物，代谢产物，盐和药学上可接受的前药都属于本发明的范围。

本发明以1,2,3-三氮唑作为连接单元分别在吲唑的4位，5位和6位引入活性基团，经实验发现该类化合物对前列腺癌表现出特异性的抗增殖活性，而对于乳腺癌，肝癌，胃癌都没有活性，与阳性化合物5-氟尿嘧啶相比，具有显著的优越性，并且表现出较优的体外安全性。

本发明创新点及优点：通过对吲唑母核和活性基团1,2,3-三氮唑巧妙结合，设计合成了含1,2,3-三氮唑的吲唑骨架衍生物，并对本发明化合物进行了抗肿瘤活性评价，包括前列腺癌细胞(PC-3)、乳腺癌细胞(MCF-7)、肝癌细胞(HepG-2)及胃癌细胞(MGC-803)。本发明化合物显示出了对PC-3的特异性抑制活性(见表1)。本发明化合物4-16抗增殖活性比对照药5-氟尿嘧啶更加显著。此外，本发明化合物4-16对正常前列腺细胞WPYM-1抗增殖活性是PC-3的四到五倍(见表2)，显示了本发明化合物4-16的优越性。本发明合成方法简单，收率高，有利于生产实施转化。为研究新的抗前列腺癌药开辟了新的道路，同时也对开发自主知识产权的抗前列腺癌药物具有重要意义。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步描述。以4位取代为例，5与6位取代需将原料更换为1H-吲唑-5-羧酸甲酯或1H-吲唑-6-羧酸甲酯，该原料均可市售获得。

实施例1：制备通式1化合物所显示的衍生物(1-1)

将碘代异丙烷滴加到搅拌均匀的1H-吲唑-4-羧酸甲酯与碳酸铯的乙腈溶液中，回流搅拌4-6小时，TLC监测反应，待反应完全后冷却至室温，抽滤，滤液蒸干柱层析得无色透明液体，收率66％。

实施例2：制备通式2化合物所显示的衍生物(2-1)

将1-异丙基-1H-吲唑-4-羧酸甲酯溶于无水甲醇中，缓慢加入氢氧化钠，回流搅拌1-2小时，冷却至室温，减压蒸馏除去溶剂，在体系加入适量的水，用盐酸调pH 3-4，有大量白色固体析出，抽滤得白色固体，收率：85％。

实施例3：制备通式3化合物所显示的衍生物(3-1)

室温下将1-异丙基-1H-吲唑-4-羧酸和HATU加入到无水二氯甲烷中搅拌均匀，然后加入炔丙基胺室温搅拌过夜。蒸干得粗产物，粗产物浓缩后得白色固体，收率87％。

实施例4：制备通式7化合物所显示的衍生物(7-1)

室温下将苯胺溶于质量百分含量10％的盐酸水溶液中搅拌均匀，滴加亚硝酸钠的水溶液，反应一小时，再滴加叠氮化钠的水溶液，室温搅拌1-2小时。向体系中缓慢加入碳酸氢钠使体系为弱碱性，用乙酸乙酯萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，蒸干得棕色油状液体，收率：63％。

实施例5：制备通式7化合物所显示的衍生物(7-2)

室温下将2,4-二甲基苯胺溶于质量百分含量10％的盐酸水溶液中搅拌均匀，滴加亚硝酸钠的水溶液，反应一小时，再滴加叠氮化钠的水溶液，室温搅拌1-2小时。向体系中缓慢加入碳酸氢钠使体系为弱碱性，用乙酸乙酯萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，蒸干得棕色油状液体，收率：82％。

实施例6：制备通式7化合物所显示的衍生物(7-3)

室温下将3,4-二甲基苯胺溶于质量百分含量10％的盐酸水溶液中搅拌均匀，滴加亚硝酸钠的水溶液，反应一小时，再滴加叠氮化钠的水溶液，室温搅拌1-2小时。向体系中缓慢加入碳酸氢钠使体系为弱碱性，用乙酸乙酯萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，蒸干得棕色油状液体，收率：81％。

实施例7：制备通式7化合物所显示的衍生物(7-4)

室温下将4-碘苯胺溶于质量百分含量10％的盐酸水溶液中搅拌均匀，滴加亚硝酸钠的水溶液，反应一小时，再滴加叠氮化钠的水溶液，室温搅拌1-2小时。向体系中缓慢加入碳酸氢钠使体系为弱碱性，用乙酸乙酯萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，蒸干得棕色油状液体，收率：87％。

实施例8：制备通式7化合物所显示的衍生物(7-5)

室温下将4-氟苯胺溶于质量百分含量10％的盐酸水溶液中搅拌均匀，滴加亚硝酸钠的水溶液，反应一小时，再滴加叠氮化钠的水溶液，室温搅拌1-2小时。向体系中缓慢加入碳酸氢钠使体系为弱碱性，用乙酸乙酯萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，蒸干得棕色油状液体，收率：38％。

实施例9：制备通式7化合物所显示的衍生物(7-6)

室温下将3-溴苯胺溶于质量百分含量10％的盐酸水溶液中搅拌均匀，滴加亚硝酸钠的水溶液，反应一小时，再滴加叠氮化钠的水溶液，室温搅拌1-2小时。向体系中缓慢加入碳酸氢钠使体系为弱碱性，用乙酸乙酯萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，蒸干得棕色油状液体，收率：56％。

实施例10：制备通式7化合物所显示的衍生物(7-7)

室温下将3-氟苯胺溶于质量百分含量10％的盐酸水溶液中搅拌均匀，滴加亚硝酸钠的水溶液，反应一小时，再滴加叠氮化钠的水溶液，室温搅拌1-2小时。向体系中缓慢加入碳酸氢钠使体系为弱碱性，用乙酸乙酯萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，蒸干得棕色油状液体，收率：78％。

实施例11：制备通式7化合物所显示的衍生物(7-8)

室温下将4-硝基苯胺溶于质量百分含量10％的盐酸水溶液中搅拌均匀，滴加亚硝酸钠的水溶液，反应一小时，再滴加叠氮化钠的水溶液，室温搅拌1-2小时。

向体系中缓慢加入碳酸氢钠使体系为弱碱性，用乙酸乙酯萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，蒸干得棕色油状液体，收率：77％。

实施例12：制备通式7化合物所显示的衍生物(7-9)

室温下将4-甲基苯胺溶于质量百分含量10％的盐酸水溶液中搅拌均匀，滴加亚硝酸钠的水溶液，反应一小时，再滴加叠氮化钠的水溶液，室温搅拌1-2小时。

向体系中缓慢加入碳酸氢钠使体系为弱碱性，用乙酸乙酯萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，蒸干得棕色油状液体，收率：79％。

实施例13：制备通式7化合物所显示的衍生物(7-10)

室温下将3-甲基苯胺溶于质量百分含量10％的盐酸水溶液中搅拌均匀，滴加亚硝酸钠的水溶液，反应一小时，再滴加叠氮化钠的水溶液，室温搅拌1-2小时。

向体系中缓慢加入碳酸氢钠使体系为弱碱性，用乙酸乙酯萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，蒸干得棕色油状液体，收率：59％。

实施例14：制备通式7化合物所显示的衍生物(7-11)

室温下将2-甲基苯胺溶于质量百分含量10％的盐酸水溶液中搅拌均匀，滴加亚硝酸钠的水溶液，反应一小时，再滴加叠氮化钠的水溶液，室温搅拌1-2小时。

向体系中缓慢加入碳酸氢钠使体系为弱碱性，用乙酸乙酯萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，蒸干得棕色油状液体，收率：69％。

实施例15：制备通式7化合物所显示的衍生物(7-12)

室温下将2-氟苯胺溶于质量百分含量10％的盐酸水溶液中搅拌均匀，滴加亚硝酸钠的水溶液，反应一小时，再滴加叠氮化钠的水溶液，室温搅拌1-2小时。向体系中缓慢加入碳酸氢钠使体系为弱碱性，用乙酸乙酯萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，蒸干得棕色油状液体，收率：61％。

实施例16：制备通式7化合物所显示的衍生物(7-13)

室温下将4-三氟甲基苯胺溶于质量百分含量10％的盐酸水溶液中搅拌均匀，滴加亚硝酸钠的水溶液，反应一小时，再滴加叠氮化钠的水溶液，室温搅拌1-2小时。向体系中缓慢加入碳酸氢钠使体系为弱碱性，用乙酸乙酯萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，蒸干得棕色油状液体，收率：80％。

实施例17：制备通式7化合物所显示的衍生物(7-14)

室温下将4-乙基苯胺溶于质量百分含量10％的盐酸水溶液中搅拌均匀，滴加亚硝酸钠的水溶液，反应一小时，再滴加叠氮化钠的水溶液，室温搅拌1-2小时。向体系中缓慢加入碳酸氢钠使体系为弱碱性，用乙酸乙酯萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，蒸干得棕色油状液体，收率：64％。

实施例18：制备通式7化合物所显示的衍生物(7-15)

室温下将4-甲氧基苯胺溶于质量百分含量10％的盐酸水溶液中搅拌均匀，滴加亚硝酸钠的水溶液，反应一小时，再滴加叠氮化钠的水溶液，室温搅拌1-2小时。向体系中缓慢加入碳酸氢钠使体系为弱碱性，用乙酸乙酯萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，蒸干得棕色油状液体，收率：73％。

实施例19：制备通式7化合物所显示的衍生物(7-16)

将溴化苄和叠氮化钠加入到二甲基亚砜中80℃搅拌8小时，体系放置冷却至室温，用二氯甲烷和饱和食盐水萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，蒸干得棕色油状液体，收率80％。

实施例20：制备通式7化合物所显示的衍生物(7-17)

将4-三氟甲基溴化苄和叠氮化钠加入到二甲基亚砜中80℃搅拌8小时，体系放置冷却至室温，用二氯甲烷和饱和食盐水萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，蒸干得棕色油状液体，收率67％。

实施例21：制备通式7化合物所显示的衍生物(7-18)

将4-腈基溴化苄和叠氮化钠加入到二甲基亚砜中80℃搅拌8小时，体系放置冷却至室温，用二氯甲烷和饱和食盐水萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，蒸干得棕色油状液体，收率85％。

实施例23：制备通式7化合物所显示的衍生物(7-19)

将4-甲氧基溴化苄和叠氮化钠加入到二甲基亚砜中80℃搅拌8小时，体系放置冷却至室温，用二氯甲烷和饱和食盐水萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，蒸干得棕色油状液体，收率81％。

实施例24：制备通式7化合物所显示的衍生物(7-20)

将4-叔丁基溴化苄和叠氮化钠加入到二甲基亚砜中80℃搅拌8小时，体系放置冷却至室温，用二氯甲烷和饱和食盐水萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，蒸干得棕色油状液体，收率98％。

实施例25：制备通式4化合物所显示的衍生物(4-1)

室温下将1-异丙基-N-(丙-2-炔-1-基)-1H-吲唑-4-甲酰胺加入到四氢呋喃和水的混合溶液中,然后缓慢加入无水硫酸铜和抗坏血酸钠搅拌均匀，0.5小时后加入叠氮苯，室温反应6-8小时。体系用二氯甲烷萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，蒸干，粗产物用二氯甲烷和石油醚重结晶得目标化合物，收率68％。核磁数据：¹H NMR(400MHz,DMSO)δ9.14(t,J＝5.6Hz,1H),8.73(s,1H),8.43(s,1H),7.94–7.87(m,3H),7.66(d,J＝7.1Hz,1H),7.59(t,J＝7.9Hz,2H),7.51–7.42(m,2H),5.05(dt,J＝13.1,6.6Hz,1H),4.68(d,J＝5.6Hz,2H),1.48(d,J＝6.6Hz,6H).¹³C NMR(101MHz,DMSO)δ166.74,146.77,139.24,137.16,133.21,130.34,129.01,127.75,125.58,121.97,121.60,120.42,113.32,73.32,49.85,35.26,22.57.HR-MS(ESI),calcd.C₂₀H₂₀N₆O,[M+H]⁺m/z:361.1777,found:361.1782.

实施例26：制备通式4化合物所显示的衍生物(4-2)

室温下将1-异丙基-N-(丙-2-炔-1-基)-1H-吲唑-4-甲酰胺加入到四氢呋喃和水的混合溶液中,然后缓慢加入无水硫酸铜和抗坏血酸钠搅拌均匀，0.5小时后加入1-叠氮-2,4-二甲苯，室温反应6-8小时。体系用二氯甲烷萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，蒸干，粗产物用二氯甲烷和石油醚重结晶得目标化合物，收率52％。核磁数据：¹H NMR(400MHz,DMSO)δ9.12(t,J＝5.4Hz,1H),8.42(s,1H),8.33(s,1H),7.89(d,J＝8.4Hz,1H),7.65(d,J＝7.1Hz,1H),7.45(m,J＝8.2,7.4Hz,1H),7.33–7.25(m,2H),7.19(d,J＝8.0Hz,1H),5.04(m,J＝13.1,6.5Hz,1H),4.69(d,J＝5.5Hz,2H),2.36(s,3H),2.12(s,3H),1.48(d,J＝6.6Hz,6H).¹³C NMR(101MHz,DMSO)δ166.75,139.75,139.22,134.47,133.19,132.21,127.84,126.19,125.59,125.05,121.96,120.41,113.17,49.86,35.24,22.56,21.08,17.84.HR-MS(ESI),calcd.C₂₂H₂₄N₆O,[M+H]⁺m/z:389.2090,found:389.2088.

实施例27：制备通式4化合物所显示的衍生物(4-3)

室温下将1-异丙基-N-(丙-2-炔-1-基)-1H-吲唑-4-甲酰胺加入到四氢呋喃和水的混合溶液中,然后缓慢加入无水硫酸铜和抗坏血酸钠搅拌均匀，0.5小时后加入1-叠氮-3,4-二甲苯，室温反应6-8小时。体系用二氯甲烷萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，蒸干，粗产物用二氯甲烷和石油醚重结晶得目标化合物，收率76％。核磁数据：¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.50(t,1H),8.05(d,J＝23.9Hz,1H),7.58(d,J＝8.4Hz,1H),7.52(d,J＝7.4Hz,2H),7.45–7.34(m,2H),7.29(s,1H),7.25(d,J＝8.2Hz,1H),4.87(t,J＝5.9Hz,3H),2.32(d,J＝7.6Hz,6H),1.60(d,J＝6.7Hz,6H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ167.28,139.07,138.40,137.69,134.84,132.84,130.66,127.49,125.25,121.80,120.85,119.81,117.88,112.48,50.46,35.29,22.18,19.92,19.50.HR-MS(ESI),calcd.C₂₂H₂₄N₆O,[M+H]⁺m/z:389.2090,found:389.2088.

实施例28：制备通式4化合物所显示的衍生物(4-4)

室温下将1-异丙基-N-(丙-2-炔-1-基)-1H-吲唑-4-甲酰胺加入到四氢呋喃和水的混合溶液中,然后缓慢加入无水硫酸铜和抗坏血酸钠搅拌均匀，0.5小时后加入1-叠氮-4-碘苯，室温反应6-8小时。体系用二氯甲烷萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，蒸干，粗产物用二氯甲烷和石油醚重结晶得目标化合物，收率73％。核磁数据：¹H NMR(400MHz,DMSO)δ9.14(t,J＝5.5Hz,1H),8.75(s,1H),8.42(s,1H),7.92(m,J＝18.7,8.6Hz,3H),7.76(d,J＝8.7Hz,2H),7.66(d,J＝7.1Hz,1H),7.52–7.38(m,1H),5.05(m,J＝13.1,6.6Hz,1H),4.67(d,J＝5.5Hz,2H),1.48(d,J＝6.6Hz,6H).¹³C NMR(101MHz,DMSO)δ166.74,147.00,139.23,139.03,136.80,133.29,127.71,125.59,122.31,121.96,121.53,120.44,113.24,94.63,49.86,35.24,22.57.HR-MS(ESI),calcd.C₂₀H₁₉IN₆O,[M+H]⁺m/z:487.0743,found:487.0740.

实施例29：制备通式4化合物所显示的衍生物(4-5)

室温下将1-异丙基-N-(丙-2-炔-1-基)-1H-吲唑-4-甲酰胺加入到四氢呋喃和水的混合溶液中,然后缓慢加入无水硫酸铜和抗坏血酸钠搅拌均匀，0.5小时后加入1-叠氮-4-氟苯，室温反应6-8小时。体系用二氯甲烷萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，蒸干，粗产物用二氯甲烷和石油醚重结晶得目标化合物，收率75％。核磁数据：¹H NMR(400MHz,DMSO)δ9.14(t,J＝5.6Hz,1H),8.72(s,1H),8.43(s,1H),8.02–7.92(m,2H),7.89(d,J＝8.5Hz,1H),7.66(d,J＝7.1Hz,1H),7.45(m,J＝8.8,4.9,2.4Hz,3H),5.13–4.96(m,1H),4.67(d,J＝5.6Hz,2H),1.48(d,J＝6.6Hz,6H).¹³C NMR(101MHz,DMSO)δ166.74,162.01(d,J＝245.6Hz),146.84,139.23,133.71,133.30,127.73,125.59,122.76(d,J＝8.8Hz),121.91,120.44,117.16(d,J＝23.2Hz),113.23,49.85,35.24,22.57.HR-MS(ESI),calcd.C20H19FN6O,[M+H]⁺m/z:379.1682,found:379.1678.

实施例30：制备通式4化合物所显示的衍生物(4-6)

室温下将1-异丙基-N-(丙-2-炔-1-基)-1H-吲唑-4-甲酰胺加入到四氢呋喃和水的混合溶液中,然后缓慢加入无水硫酸铜和抗坏血酸钠搅拌均匀，0.5小时后加入1-叠氮-3-溴苯，室温反应6-8小时。体系用二氯甲烷萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，蒸干，粗产物用二氯甲烷和石油醚重结晶得目标化合物，收率58％。核磁数据：¹H NMR(400MHz,DMSO)δ9.15(t,J＝5.6Hz,1H),8.83(s,1H),8.43(s,1H),8.20(t,J＝1.8Hz,1H),7.99(m,J＝8.1,1.2Hz,1H),7.90(d,J＝8.4Hz,1H),7.68(t,J＝6.7Hz,2H),7.55(t,J＝8.1Hz,1H),7.49–7.40(m,1H),5.05(m,J＝13.1,6.6Hz,1H),4.68(d,J＝5.6Hz,2H),1.49(d,J＝6.6Hz,6H).¹³C NMR(101MHz,DMSO)δ166.74,147.06,139.24,138.26,133.31,132.30,131.74,127.71,125.59,122.91,121.97,121.77,120.46,119.36,113.25,49.86,35.24,22.57.HR-MS(ESI),calcd.C₂₀H₁₉BrN₆O,[M+H]⁺m/z:439.0882,found:439.0878.

实施例31：制备通式4化合物所显示的衍生物(4-7)

室温下将1-异丙基-N-(丙-2-炔-1-基)-1H-吲唑-4-甲酰胺加入到四氢呋喃和水的混合溶液中,然后缓慢加入无水硫酸铜和抗坏血酸钠搅拌均匀，0.5小时后加入1-叠氮-3-氟苯，室温反应6-8小时。体系用二氯甲烷萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，蒸干，粗产物用二氯甲烷和石油醚重结晶得目标化合物，收率80％。核磁数据：¹H NMR(400MHz,DMSO)δ9.15(t,J＝5.6Hz,1H),8.80(s,1H),8.40(d,J＝19.5Hz,1H),7.91–7.82(m,3H),7.67–7.59(m,2H),7.47–7.43(m,1H),7.34(m,J＝8.5,1.9Hz,1H),5.08–5.02(m,1H),4.67(d,J＝5.6Hz,2H),1.48(d,J＝6.6Hz,6H).¹³C NMR(101MHz,DMSO)δ166.74,162.91(d,J＝244.9Hz),147.04,139.24,138.38,133.21,132.30(d,J＝9.2Hz),127.71,127.34,125.59,122,120.40,116.29(d,J＝3.0Hz),115.71(d,J＝20.9Hz),113.33,108.00,107.73,49.85,35.23,22.57.HR-MS(ESI),calcd.C20H19FN6O,[M+H]+m/z:379.1682,found:379.1685.

实施例32：制备通式4化合物所显示的衍生物(4-8)

室温下将1-异丙基-N-(丙-2-炔-1-基)-1H-吲唑-4-甲酰胺加入到四氢呋喃和水的混合溶液中,然后缓慢加入无水硫酸铜和抗坏血酸钠搅拌均匀，0.5小时后加入1-叠氮-4-硝基苯，室温反应6-8小时。体系用二氯甲烷萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，蒸干，粗产物用二氯甲烷和石油醚重结晶得目标化合物，收率50％。核磁数据：¹H NMR(400MHz,DMSO)δ9.18(t,J＝5.7Hz,1H),8.96(s,1H),8.44(d,J＝9.3Hz,3H),8.26(d,J＝9.2Hz,2H),7.90(d,J＝8.5Hz,1H),7.67(d,J＝7.1Hz,1H),7.46(m,J＝8.3,7.3Hz,1H),5.05(m,J＝13.1,6.6Hz,1H),4.69(d,J＝5.6Hz,2H),1.48(d,J＝6.6Hz,6H).¹³C NMR(101MHz,DMSO)δ166.77,147.57,147.08,141.38,139.24,133.30,127.66,126.04,125.59,122.01,120.95,120.46,113.29,49.86,35.21,22.58.HR-MS(ESI),calcd.C₂₀H₁₉N₇O₃,[M+H]⁺m/z:406.1627,found:406.1618.

实施例33：制备通式4化合物所显示的衍生物(4-9)

室温下将1-异丙基-N-(丙-2-炔-1-基)-1H-吲唑-4-甲酰胺加入到四氢呋喃和水的混合溶液中,然后缓慢加入无水硫酸铜和抗坏血酸钠搅拌均匀，0.5小时后加入1-叠氮-4-甲基苯，室温反应6-8小时。体系用二氯甲烷萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，蒸干，粗产物用二氯甲烷和石油醚重结晶得目标化合物，收率44％。核磁数据：¹H NMR(400MHz,DMSO)δ9.13(t,J＝5.5Hz,1H),8.68(s,1H),8.43(s,1H),7.90(d,J＝8.4Hz,1H),7.80(d,J＝8.4Hz,2H),7.67(d,J＝7.1Hz,1H),7.50–7.42(m,1H),7.38(d,J＝8.3Hz,2H),5.11–5.00(m,1H),4.67(d,J＝5.5Hz,2H),2.38(s,3H),1.49(d,J＝6.6Hz,6H).¹³C NMR(101MHz,DMSO)δ166.73,146.64,139.24,138.59,134.93,133.30,130.68,127.75,125.59,121.97,121.47,120.37,113.22,49.85,35.27,22.57,21.03.HR-MS(ESI),calcd.C₂₁H₂₂N₆O,[M+H]⁺m/z:375.1933,found:375.1932.

实施例34：制备通式4化合物所显示的衍生物(4-10)

室温下将1-异丙基-N-(丙-2-炔-1-基)-1H-吲唑-4-甲酰胺加入到四氢呋喃和水的混合溶液中,然后缓慢加入无水硫酸铜和抗坏血酸钠搅拌均匀，0.5小时后加入1-叠氮-3-甲基苯，室温反应6-8小时。体系用二氯甲烷萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，蒸干，粗产物用二氯甲烷和石油醚重结晶得目标化合物，收率39％。核磁数据：¹H NMR(400MHz,DMSO)δ9.14(t,J＝5.5Hz,1H),8.70(s,1H),8.43(s,1H),7.90(d,J＝8.5Hz,1H),7.77(s,1H),7.69(dd,J＝17.3,7.6Hz,2H),7.51–7.41(m,2H),7.29(d,J＝7.6Hz,1H),5.05(m,J＝13.2,6.6Hz,1H),4.67(d,J＝5.6Hz,2H),2.41(s,3H),1.49(d,J＝6.6Hz,6H).¹³C NMR(101MHz,DMSO)δ166.73,146.72,140.09,139.24,137.12,133.30,130.13,129.58,127.74,125.59,121.98,121.51,120.80,120.45,117.47,113.23,49.85,35.27,22.57,21.37.HR-MS(ESI),calcd.C₂₁H₂₂N₆O,[M+H]⁺m/z:375.1933,found:375.1928.

实施例35：制备通式4化合物所显示的衍生物(4-11)

室温下将1-异丙基-N-(丙-2-炔-1-基)-1H-吲唑-4-甲酰胺加入到四氢呋喃和水的混合溶液中,然后缓慢加入无水硫酸铜和抗坏血酸钠搅拌均匀，0.5小时后加入1-叠氮-2-甲基苯，室温反应6-8小时。体系用二氯甲烷萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，蒸干，粗产物用二氯甲烷和石油醚重结晶得目标化合物，收率39％。核磁数据：¹H NMR(400MHz,DMSO)δ9.14(t,J＝5.5Hz,1H),8.70(s,1H),8.43(s,1H),7.90(d,J＝8.5Hz,1H),7.77(s,1H),7.69(dd,J＝17.3,7.6Hz,2H),7.51–7.41(m,2H),7.29(d,J＝7.6Hz,1H),5.05(m,J＝13.2,6.6Hz,1H),4.67(d,J＝5.6Hz,2H),2.41(s,3H),1.49(d,J＝6.6Hz,6H).¹³C NMR(101MHz,DMSO)δ166.73,146.72,140.09,139.24,137.12,133.30,130.13,129.58,127.74,125.59,121.98,121.51,120.80,120.45,117.47,113.23,49.85,35.27,22.57,21.37.HR-MS(ESI),calcd.C₂₁H₂₂N₆O,[M+H]⁺m/z:375.1933,found:375.1928.

实施例36：制备通式4化合物所显示的衍生物(4-12)

室温下将1-异丙基-N-(丙-2-炔-1-基)-1H-吲唑-4-甲酰胺加入到四氢呋喃和水的混合溶液中,然后缓慢加入无水硫酸铜和抗坏血酸钠搅拌均匀，0.5小时后加入1-叠氮-2-氟苯，室温反应6-8小时。体系用二氯甲烷萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，蒸干，粗产物用二氯甲烷和石油醚重结晶得目标化合物，收率49％。核磁数据：¹H NMR(400MHz,DMSO)δ9.16(t,J＝6.0Hz,1H),8.45(m,J＝43.0,4.8Hz,2H),7.93–7.79(m,2H),7.68–7.29(m,5H),5.05(m,J＝13.1,6.6Hz,1H),4.69(d,J＝5.7Hz,2H),1.48(d,J＝6.6Hz,6H).13C NMR(101MHz,DMSO)δ166.79,154.25(d,J＝252.6Hz),149.88,146.27,139.23,133.23,131.62(d,J＝8.0Hz),127.75,126.36,126.03,125.50,124.91(d,J＝2.5Hz),121.93,120.41,117.61(d,J＝19.4Hz),113.24,49.81,35.13,22.58.HR-MS(ESI),calcd.C20H19FN6O,[M+H]+m/z:379.1682,found:379.1679.

实施例37：制备通式4化合物所显示的衍生物(4-13)

室温下将1-异丙基-N-(丙-2-炔-1-基)-1H-吲唑-4-甲酰胺加入到四氢呋喃和水的混合溶液中,然后缓慢加入无水硫酸铜和抗坏血酸钠搅拌均匀，0.5小时后加入1-叠氮-4-三氟甲基苯，室温反应6-8小时。体系用二氯甲烷萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，蒸干，粗产物用二氯甲烷和石油醚重结晶得目标化合物，收率45％。核磁数据：¹H NMR(400MHz,DMSO)δ9.17(t,J＝5.6Hz,1H),8.90(s,1H),8.43(s,1H),8.20(d,J＝8.5Hz,2H),7.98(d,J＝8.6Hz,2H),7.90(d,J＝8.5Hz,1H),7.67(d,J＝7.1Hz,1H),7.46(m,J＝8.4,7.2Hz,1H),5.05(m,J＝13.2,6.6Hz,1H),4.69(d,J＝5.6Hz,2H),1.49(d,J＝6.6Hz,6H).¹³C NMR(101MHz,DMSO)δ166.77,147.27,139.24,133.30,127.77(q,J＝32Hz),125.68(d,J＝3.0Hz),123.22(q,J＝268Hz),120.87,120.45,113.26,49.85,35.22,22.57.HR-MS(ESI),calcd.C₂₁H₁₉F₃N₆O,[M+H]⁺m/z:429.1650,found:429.1645.

实施例38：制备通式4化合物所显示的衍生物(4-14)

室温下将1-异丙基-N-(丙-2-炔-1-基)-1H-吲唑-4-甲酰胺加入到四氢呋喃和水的混合溶液中,然后缓慢加入无水硫酸铜和抗坏血酸钠搅拌均匀，0.5小时后加入1-叠氮-4-乙基苯，室温反应6-8小时。体系用二氯甲烷萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，蒸干，粗产物用二氯甲烷和石油醚重结晶得目标化合物，收率42％。核磁数据：¹H NMR(400MHz,DMSO)δ9.13(t,J＝5.6Hz,1H),8.68(s,1H),8.43(s,1H),7.89(d,J＝8.5Hz,1H),7.81(d,J＝8.5Hz,2H),7.66(d,J＝7.0Hz,1H),7.48–7.39(m,3H),5.04(m,J＝13.0,6.5Hz,1H),4.67(d,J＝5.6Hz,2H),2.70–2.65(m,2H),1.48(d,J＝6.6Hz,6H),1.21(t,J＝7.6Hz,3H).¹³CNMR(101MHz,DMSO)δ166.73,146.63,144.81,139.24,135.11,133.30,129.54,127.76,125.59,121.97,121.52,120.43,113.22,49.85,35.26,28.13,22.57,15.93.HR-MS(ESI),calcd.C₂₂H₂₄N₆O,[M+H]⁺m/z:389.2090,found:389.2086.

实施例39：制备通式4化合物所显示的衍生物(4-15)

室温下将1-异丙基-N-(丙-2-炔-1-基)-1H-吲唑-4-甲酰胺加入到四氢呋喃和水的混合溶液中,然后缓慢加入无水硫酸铜和抗坏血酸钠搅拌均匀，0.5小时后加入1-叠氮-4-甲氧基苯，室温反应6-8小时。体系用二氯甲烷萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，蒸干，粗产物用二氯甲烷和石油醚重结晶得目标化合物，收率49％。核磁数据：¹H NMR(400MHz,DMSO)δ9.11(t,J＝5.6Hz,1H),8.62(s,1H),8.42(s,1H),7.89(d,J＝8.5Hz,1H),7.85–7.77(m,2H),7.65(d,J＝7.1Hz,1H),7.45(dd,J＝8.3,7.3Hz,1H),7.12(d,J＝9.0Hz,2H),5.05(dt,J＝13.2,6.6Hz,1H),4.65(d,J＝5.6Hz,2H),3.82(s,3H),1.48(d,J＝6.6Hz,6H).¹³CNMR(101MHz,DMSO)δ166.71,159.61,146.50,139.23,133.29,127.76,125.59,122.02,121.57,120.43,115.31,113.22,56.01,49.85,35.27,22.58.HR-MS(ESI),calcd.C₂₁H₂₂N₆O₂,[M+H]⁺m/z:391.1882,found:391.1878.

实施例40：制备通式4化合物所显示的衍生物(4-16)

室温下将1-异丙基-N-(丙-2-炔-1-基)-1H-吲唑-4-甲酰胺加入到四氢呋喃和水的混合溶液中,然后缓慢加入无水硫酸铜和抗坏血酸钠搅拌均匀，0.5小时后加入(叠氮甲基)苯，室温反应6-8小时。体系用二氯甲烷萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，蒸干，粗产物用二氯甲烷和石油醚重结晶得目标化合物，收率47％。核磁数据：¹H NMR(400MHz,DMSO)δ9.06(t,J＝5.1Hz,1H),8.38(s,1H),8.07(s,1H),7.88(d,J＝8.4Hz,1H),7.60(d,J＝7.1Hz,1H),7.43(t,J＝7.8Hz,1H),7.38–7.29(m,5H),5.57(s,2H),5.04(dt,J＝12.6,6.3Hz,1H),4.56(d,J＝5.4Hz,2H),1.48(d,J＝6.4Hz,6H).¹³C NMR(101MHz,DMSO)δ166.67,145.94,139.23,136.67,133.23,129.19,128.50,127.77,125.59,123.54,121.93,120.30,113.20,53.16,49.85,35.29,22.57.HR-MS(ESI),calcd.C₂₁H₂₂N₆O,[M+H]⁺m/z:375.1933,found:375.1935.

实施例41：制备通式4化合物所显示的衍生物(4-17)

室温下将1-异丙基-N-(丙-2-炔-1-基)-1H-吲唑-4-甲酰胺加入到四氢呋喃和水的混合溶液中,然后缓慢加入无水硫酸铜和抗坏血酸钠搅拌均匀，0.5小时后加入1-(叠氮甲基)-4-(三氟甲基)苯，室温反应6-8小时。体系用二氯甲烷萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，蒸干，粗产物用二氯甲烷和石油醚重结晶得目标化合物，收率45％。核磁数据：¹H NMR(400MHz,DMSO)δ9.07(t,J＝5.5Hz,1H),8.38(s,1H),8.14(s,1H),7.88(d,J＝8.4Hz,1H),7.74(d,J＝8.0Hz,2H),7.60(d,J＝7.1Hz,1H),7.50(d,J＝8.1Hz,2H),7.46–7.39(m,1H),5.71(s,2H),5.05(m,J＝12.6,6.3Hz,1H),4.57(d,J＝5.6Hz,2H),1.48(d,J＝6.3Hz,6H).¹³C NMR(101MHz,DMSO)δ166.70,146.08,141.35,139.22,133.22,129.07(q,J＝32Hz),127.77,126.13(q,J＝4.0Hz),125.59,123.67(q,J＝270Hz),120.30,115.15,113.21,52.49,49.85,35.28,22.56.HR-MS(ESI),calcd.C₂₂H₂₁F₃N₆O,[M+H]⁺m/z:443.1807,found:443.1811.

实施例42：制备通式4化合物所显示的衍生物(4-18)

室温下将1-异丙基-N-(丙-2-炔-1-基)-1H-吲唑-4-甲酰胺加入到四氢呋喃和水的混合溶液中,然后缓慢加入无水硫酸铜和抗坏血酸钠搅拌均匀，0.5小时后加入1-(叠氮甲基)-4-(腈基)苯，室温反应6-8小时。体系用二氯甲烷萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，蒸干，粗产物用二氯甲烷和石油醚重结晶得目标化合物，收率45％。核磁数据：¹H NMR(400MHz,DMSO)δ9.08(t,J＝5.5Hz,1H),8.38(s,1H),8.14(s,1H),7.87(m,J＝15.5,8.3Hz,3H),7.60(d,J＝7.1Hz,1H),7.45(d,J＝8.1Hz,3H),5.70(s,2H),5.04(m,J＝13.1,6.5Hz,1H),4.57(d,J＝5.5Hz,2H),1.48(d,J＝6.5Hz,6H).¹³C NMR(101MHz,DMSO)δ166.70,146.11,142.15,139.22,133.18,129.15,127.75,125.59,123.98,121.92,120.31,119.02,113.22,111.34,52.53,49.85,35.29,22.57.HR-MS(ESI),calcd.C₂₂H₂₁N₇O,[M+H]⁺m/z:400.1886,found:400.1891.

实施例43：制备通式4化合物所显示的衍生物(4-19)

室温下将1-异丙基-N-(丙-2-炔-1-基)-1H-吲唑-4-甲酰胺加入到四氢呋喃和水的混合溶液中,然后缓慢加入无水硫酸铜和抗坏血酸钠搅拌均匀，0.5小时后加入1-(叠氮甲基)-4-(甲氧基)苯，室温反应6-8小时。体系用二氯甲烷萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，蒸干，粗产物用二氯甲烷和石油醚重结晶得目标化合物，收率43％。核磁数据：¹H NMR(400MHz,DMSO)δ9.05(t,J＝5.7Hz,1H),8.38(s,1H),8.01(s,1H),7.88(d,J＝8.4Hz,1H),7.59(d,J＝7.1Hz,1H),7.43(m,J＝8.2,7.4Hz,1H),7.30(d,J＝8.6Hz,2H),6.91(d,J＝8.6Hz,2H),5.48(s,2H),5.05(m,J＝13.1,6.4Hz,1H),4.54(d,J＝5.7Hz,2H),3.72(s,3H),1.48(d,J＝6.6Hz,6H).¹³C NMR(101MHz,DMSO)δ166.65,159.56,145.88,139.22,133.23,130.10,128.56,127.77,125.58,123.17,121.92,120.29,114.54,113.19,55.58,52.72,49.85,35.28,22.57.HR-MS(ESI),calcd.C₂₂H₂₄N₆O₂,[M+H]⁺m/z:405.2039,found:405.2034.

实施例44：制备通式4化合物所显示的衍生物(4-20)

室温下将1-异丙基-N-(丙-2-炔-1-基)-1H-吲唑-4-甲酰胺加入到四氢呋喃和水的混合溶液中,然后缓慢加入无水硫酸铜和抗坏血酸钠搅拌均匀，0.5小时后加入1-(叠氮甲基)-4-(叔丁基)苯，室温反应6-8小时。体系用二氯甲烷萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，蒸干，粗产物用二氯甲烷和石油醚重结晶得目标化合物，收率43％。核磁数据：¹H NMR(400MHz,DMSO)δ9.06(t,J＝5.7Hz,1H),8.37(s,1H),8.05(s,1H),7.88(d,J＝8.5Hz,1H),7.59(d,J＝7.1Hz,1H),7.43(m,J＝8.3,7.3Hz,1H),7.37(d,J＝8.3Hz,2H),7.25(d,J＝8.3Hz,2H),5.52(s,2H),5.04(m,J＝13.2,6.6Hz,1H),4.55(d,J＝5.7Hz,2H),1.48(d,J＝6.6Hz,6H),1.24(s,9H).¹³C NMR(101MHz,DMSO)δ166.67,151.04,139.22,133.71,133.22,128.26,127.80,125.95,125.58,123.42,121.92,120.29,113.18,52.88,49.84,35.28,34.75,31.51,22.57.HR-MS(ESI),calcd.C₂₅H₃₀N₆O,[M+H]⁺m/z:431.2559,found:431.2552.

实施例45：本发明化合物体外抗肿瘤活性评价

称取1～2mg样品置于1.5mL EP管中，用DMSO配制成10mmol/L的溶液，4℃保存，根据实验所需浓度用培养基稀释。取对数生长期的细胞，消化计数后，用培养基调整细胞密度，以3×10³个/孔接种至96孔板，每孔100μL培养基，培养8-12h待细胞贴壁后,弃去培养基，加入用培养基稀释好的药物，即将待测样品以80.0，40.0，20.0，10.0，5.00，2.50，1.25，0.625μmol/L浓度加入96孔板中，每个浓度设3个复孔，另设空白对照组和阳性药对照组。药物作用72h，每孔加入20μL噻唑蓝(MTT)溶液(5mg/mL)，37℃孵育4h,吸去液体，加入150μL的DMSO，摇均匀，酶标仪490nm处检测吸光度值，试验结果采用SPSS21.0统计软件计算IC₅₀值。

表1化合物对四种人类癌细胞的体外抗增殖活性

^a Anti-tumor activity was assayed by exposure for 72h to substancesand expressed as concentration required to inhibit tumor cells proliferationby 50％(IC₅₀).Dataare presented as the mean±SDs of three independentexperiments.^b Used as a positive control.

对表1进行分析，该系列化合物对四种癌细胞中的PC-3细胞的活性良好,而对于其余三种癌细胞的活性几乎没有，虽然当取代由苯环变为没有取代的苄基时，化合物8a不仅对PC-3有较强的抗增殖活性，对其他三种癌症细胞系的抗增殖活性也大大提高，但是相对于PC-3来说提升的并不明显，且抗增殖活性远远不如PC-3,使其表现出了显著的特异性。并且我们发现，4位取代的活性虽然大部分与5位和6位取代差异性不大，但是最优活性化合物却明显优于5位与6位，如化合物4-16IC₅₀＝4.42±0.06μmol/L明显优于化合物5-16IC₅₀＝6.21±0.84μmol/L和化合物6-16IC₅₀＝6.43±0.80μmol/L。因此，4-16可以作为优选化合物进行下一步针对正常前列腺细胞的活性评价。

表2化合物4-16对前列腺基质细胞的体外抗增殖活性

^a Anti-tumor activity was assayed by exposure for 72h to substancesand expressed as concentration required to inhibit tumor cells proliferationby 50％(IC50).Data are presented as the mean±SDs of three independentexperiments.^b Used as a positive control.

对表2进行分析，我们可以看出化合物4-16对于WPYM-1存在一定的抗增殖活性，IC50值为20.34±0.97μmol/L，但是远远弱于其对PC-3的抗增殖活性，其活性只有PC-3的四分之一左右，可以看出4-16对于正常的前列腺基质细胞具有较好的安全性。综上所述，4-16可作为先导化合物进行下一步的研究和开发，具有制备前列腺癌药物应用前景。

4-16可作为活性成分或与其他药物组合，与制药中可以接受的辅助和/或添加成分混合后，按常规制药方法和工艺要求，可制成用于抗前列腺癌的药物制剂。

代表性化合物表征数据：