CN113736758B

CN113736758B - 一种岩白菜氧甲基转移酶BpOMT1基因及在制备4-甲氧基没食子酸中的应用

Info

Publication number: CN113736758B
Application number: CN202111040376.1A
Authority: CN
Inventors: 张广辉; 刘祥宇; 陈碧环; 王益娜; 袁慧娟; 向贵生; 张敬丽; 郝冰
Original assignee: Yunnan Agricultural University
Current assignee: Yunnan Agricultural University
Priority date: 2021-09-06
Filing date: 2021-09-06
Publication date: 2023-05-09
Anticipated expiration: 2041-09-06
Also published as: CN113736758A

Abstract

本发明公开一种岩白菜氧甲基转移酶BpOMT1基因及在制备4‑甲氧基没食子酸中的应用。所述岩白菜氧甲基转移酶BpOMT1基因的序列如SEQ ID NO：1所示。以没食子酸和S‑腺苷‑甲硫氨酸为原料，在岩白菜氧甲基转移酶BpOMT1的催化下，生成4‑甲氧基没食子酸，对于岩白菜素生物合成调控研究具有重要意义。

Description

一种岩白菜氧甲基转移酶BpOMT1基因及在制备4-甲氧基没食子酸中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种岩白菜氧甲基转移酶BpOMT1基因及在制备4-甲氧基没食子酸上的应用。

背景技术

岩白菜(Bergenia purpurascens)为虎耳草科岩白菜属(Bergenia)植物。该属植物亚洲共有10种，除3种产于东亚、南亚北部和中亚东南部外，主要分布于中国陕西(秦岭)、新疆、四川、云南及西藏等地区。岩白菜属植物全株含岩白菜素，特别是从岩白菜根状茎中提取的岩白菜素含量高达8.2％。岩白菜素具有镇咳、抗炎、抗焦虑、抗氧化、抗疟疾、抗癌、治疗糖尿病、抗肝毒性、免疫调节和神经保护等多种功效(Shihao Xiang,.BergeninExerts Hepatoprotective Effects by Inhibiting the Release of InflammatoryFactors,Apoptosis and Autophagy via the PPAR-γPathway.Drug Des DevelTher.2020；14:129-143.)。国内外学者还发现其与吗啡类抑制中枢止咳药不同，岩白菜素对咳嗽中枢具有选择性抑制作用，对其他神经中枢无抑制作用，且毒副作用小、不良反应少、连续使用不产生耐药性等特点(王进，岩白菜素的人体与动物药代动力学及对IGABA的作用研究.山东大学,2010.)。

岩白菜素属异香豆素类化合物，岩白菜素生物合成前体为2-葡萄糖-4-甲氧基没食子酸经由分子内脱水后重排(rearrangement after intramolecular dehydration)或在未知脱水酶(dehydratase)的作用下闭环生成(Gan B.Bajracharya.Diversity,pharmacology and synthesis of bergenin and its derivatives:potentialmaterials for therapeutic usages.Fitoterapia.2015；101:133-52.；)；2-葡萄糖-4-甲氧基没食子酸由4-甲氧基没食子酸在碳糖基转移酶(CGT,C-glucosyltransferase)的催化下以尿苷二磷酸葡萄糖(UDP-glucose)为糖基供体在2位连接葡萄糖生成；4-甲氧基没食子酸(4-O-Methylgallic acid，4-O-ME-GA)来源于没食子酸(Gallic acid，GA)，由没食子酸氧位甲基转移酶(OMT,O-methyltransferase)以S-腺苷-甲硫氨酸(SAM,S-adenosyL-methionine)为甲基供体催化生成，因此，生物合成4-甲氧基没食子酸对于岩白菜素生物合成调控研究具有重要意义。

近年来，由于人类无序采挖等原因，岩白菜类药材野生资源正在日益减少。开展岩白菜素生物合成途径研究，可为岩白菜人工栽培措施以及提高药效成分含量提供基础，缓解野生资源压力。同时，岩白菜素提取原材料的种植周期长，并且对种植地块和种植技术要求较高。因此，如何高效地获得这些有用的次生代谢物，一直都是科研究人员思考和研究的问题。对于高附加值的天然产物，采用现代生物技术建立同源或异源表达系统高效生产药用活性成分，已被广泛认为是解决今后药用资源短缺的重要技术手段。但是，要搞清这些活性成分的生物合成途径，必需鉴定这些途径中相关的关键基因，发掘这些催化酶基因成为研究植物代谢产物生物合成途径的关键环节。当前，没食子酸在C-4位羟基发生甲基化反应催化形成4-甲氧基没食子酸的合成路径并不清晰，负责甲基化的氧甲基转移酶的功能尚未得到验证，影响了岩白菜素生物合成工作的推进。

发明内容

为了解决如何获得大量高纯度4-甲氧基没食子酸生物合成技术问题，本发明提供了一种岩白菜氧甲基转移酶BpOMT1基因，可作为4-甲氧基没食子酸的生物合成调控基因以及应用于制备4-甲氧基没食子酸。

本发明提供了一种岩白菜氧甲基转移酶BpOMT1基因，其核酸序列如SEQ ID NO：1所示，序列全长1077bp。

本发明还提供了一种岩白菜氧甲基转移酶BpOMT1，由所述的岩白菜氧甲基转移酶BpOMT1基因编码获得，编码了358个氨基酸残基，其氨基酸系列如SEQ ID NO：2所示。

本发明还提供了一种含有所述的岩白菜氧甲基转移酶BpOMT1基因的重组质粒。

作为优选，所述重组质粒通过将上述的岩白菜氧甲基转移酶BpOMT1基因与pET28a载体同源重组获得，命名为pET28a-BpOMT1。

本发明还提供了一种转基因工程菌，所述转基因工程菌含有上述重组质粒，或所述基因工程菌的基因组中整合有外源的所述的岩白菜氧甲基转移酶BpOMT1基因。

作为优选，所述转基因工程菌为大肠杆菌BL21(DE3)菌株。

本发明还提供了所述的岩白菜氧甲基转移酶BpOMT1在制备4-甲氧基没食子酸中的应用。

作为优选，在所述的岩白菜氧甲基转移酶BpOMT1在制备4-甲氧基没食子酸中的应用中，以没食子酸和甲基供体S-腺苷-甲硫氨酸为原料，在由上述的岩白菜氧甲基转移酶BpOMT1基因编码得到的岩白菜氧位甲基转移酶(氨基酸系列如SEQ ID NO：2所示)的催化下，在没食子酸(Gallic acid)的C-4位上的羟基上进行甲基化反应，生成4-甲氧基没食子酸(4-O-Methylgallic acid，4-O-ME-GA)。

本发明还提供一种克隆所述的岩白菜氧甲基转移酶BpOMT1基因的引物，所述引物由引物F和引物R组成，所述引物F的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述引物R的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

本发明通过重组质粒，在体外表达后获得目标蛋白(岩白菜氧甲基转移酶BpOMT1)，经进一步对底物没食子酸进行催化，直接生成4-甲氧基没食子酸。

本发明所述的岩白菜氧甲基转移酶BpOMT1基因，是从岩白菜的根状茎中，通过转录组测序及生物信息学技术，经大量实验后筛选后得以鉴定出来的；采用RNA试剂后提取岩白菜根状茎的RNA，并反转录成cDNA后进行PCR扩增获得。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

(1)随着生物信息学技术的飞速发展，极大地推进了4-甲氧基没食子酸生物合成路径关键酶基因的挖掘。本发明中4-甲氧基没食子酸的生物合成调控基因即氧甲基转移酶BpOMT1基因，是首次鉴定并成功验证，开辟了一种生产4-甲氧基没食子酸的生物合成新方法。本发明通过异源表达与体外酶催化的方式来获得目标产物，采用体外生物合成，进行定向生产，具有副产物少等优点。

(2)本发明提供了含有岩白菜氧甲基转移酶BpOMT1基因的重组质粒、基因工程菌和重组蛋白，为通过生物工程方法大量合成4-甲氧基没食子酸，进一步为岩白菜素生物合成调控研究奠定基础。

(3)通过体外生物合成4-甲氧基没食子酸，可控性强，可以减少对原料种植的需求，生产产物单一，便于后期4-甲氧基没食子酸的分离和纯化；还可减少化学合成困难，合成路径复杂等问题。所述岩白菜氧甲基转移酶BpOMT1基因作为4-甲氧基没食子酸生物合成的关键基因，还可用岩白菜等植物育种研究。

(4)本发明从岩白菜中分离并鉴定的岩白菜氧甲基转移酶BpOMT1基因，可作为岩白菜的分子辅助育种的重要标记基因，同时也可作为酵母底盘细胞构建中生产4-甲氧基没食子酸的重要候选基因。

序列表中SEQ ID NO：1所示的是岩白菜氧甲基转移酶BpOMT1基因的核苷酸序列。

序列表中SEQ ID NO：2所示的是岩白菜氧甲基转移酶BpOMT1的氨基酸系列。

序列表中SEQ ID NO：3所示的是引物F的核苷酸序列。

序列表中SEQ ID NO：4所示的是引物R的核苷酸序列。

序列表中SEQ ID NO：5所示的是上游同源臂引物的核苷酸序列。

序列表中SEQ ID NO：6所示的是下游同源臂引物的核苷酸序列。

附图说明

图1为4-甲氧基没食子酸推导的合成路径示意图。

图2为重组表达质粒pET28a-BpOMT1的构建示意图(用于表达岩白菜氧甲基转移酶BpOMT1基因)。

图3为岩白菜氧甲基转移酶BpOMT1基因重组后的电泳检测结果。其中，M为核酸Marker，1、2、3为三个阳性单菌落检测结果。

图4为岩白菜氧甲基转移酶BpOMT1的SDS-PAGE蛋白电泳检测图。其中，M：蛋白质分子质量标准；泳道1、2、3、4、5、6、7依次分别为沉淀、流穿洗脱液、20mmol/L咪唑洗脱液、30mmol/L咪唑洗脱液、50mmol/L咪唑洗脱液、100mmol/L咪唑洗脱液、250mmol/L咪唑洗脱液下蛋白。

图5为HPLC检测氧甲基转移酶BpOMT1对没食子酸(Gallic acid)的C-4位上的羟基上的甲基化作用。图5A：没食子酸(Gallic acid，GA)的C-4位上的羟基上的甲基化推测路径；图5B：岩白菜氧甲基转移酶BpOMT1的酶活反应结果，横坐标是时间,单位min；纵坐标是响应值,单位是mAU；其中，CK：对照组(没食子酸+S-腺苷-甲硫氨酸+灭活的岩白菜氧甲基转移酶BpOMT1)酶灭活的酶活反应结果；标品：没食子酸标准品+4-甲氧基没食子酸标准品；BpOMT1：实验组(没食子酸+S-腺苷-甲硫氨酸+岩白菜氧甲基转移酶BpOMT1)的酶活反应结果。

图6为标准品的质谱分析(LC/MS/MS)图谱，其中，图6-A为总离子流图；

图6-B为标准品没食子酸的保留时间15.96分钟；图6-C为标准品4-甲氧基没食子酸的保留时间23.26分钟。

图7为酶活性验证反应产物的质谱分析(LC/MS/MS)图谱，其中，图7-A为总离子流图；图7-B为底物没食子酸的保留时间15.45分钟；图7-C为反应产物4-甲氧基没食子酸的保留时间23.86分钟。

图8为标准品4-甲氧基没食子酸的碎片离子图(理论分子量184)(LC/MS/MS)。

图9为反应产物4-甲氧基没食子酸的碎片离子图(理论分子量184)(LC/MS/MS)。

具体实施方式

实施例1

基于岩白菜转录组Unigene基本功能注释信息，在测序注释结果中进行筛选OMT候选基因，同时，以植物中鉴定的氧甲基转移酶(OMT)，通过序列本地BLAST分析，然后对筛选结果进行整理分析，最后发现1个氧甲基转移酶(OMT)基因。之后进行cDNA的制备、候选基因的扩增及回收、同源重组、蛋白表达、体外酶活反应，以及HPLC及LC/MS/MS检测等一系列工作后，最终鉴定出可以催化没食子酸(Gallic acid)C-4位上的羟基上的甲基化反应生成4-甲氧基没食子酸的目标候选氧甲基转移酶BpOMT1基因(图1)。4-甲氧基没食子酸合成的各阶段操作步骤如下(以下实施所用试剂、原料、仪器设备等均为市售)：

(1)cDNA模板的制备

取岩白菜根状茎的鲜样，切片后液氮速冻，进行总RNA提取。总RNA提取采用Magen(广州美基生物科技有限公司)的HiPure Plant RNA Mini Kit试剂盒，按该试剂盒的操作步骤提取总RNA，经检测合格后，使用TAKARA反转录试剂盒，将总RNA反转录成cDNA，-20℃保存备用。

(2)基因扩增及回收

利用引物设计软件(CE Design)v1.04，设计扩增岩白菜氧甲基转移酶BpOMT1基因的引物，所述引物由引物F(SEQ ID NO：3)和引物R(SEQ ID NO：4)组成，按高保真KOD酶使用说明书操作，采用KOD高保真酶以岩白菜cDNA为模板进行基因扩增。PCR反应程序为：94℃、5min；94℃、30S，58℃、50S，72℃、1min，35个循环；72℃、7min。PCR结束后，进行跑胶，确认扩增成功后进行目的条带回收。基因切胶回收使用北京全式金生物技术有限公司的EasyPureQuick Gel Extraction Kit试剂盒进行目的基因回收。回收后在NanoReady超微量紫外可见分光光度计上测定其回收浓度，最后放-20℃冰箱中保存备用，获得岩白菜氧甲基转移酶BpOMT1基因片段，经测序其核酸序列如SEQ ID NO：1所示。

此外，带载体同源臂的岩白菜氧甲基转移酶BpOMT1基因片段与载体pET28a进行同源重组时(同源臂为大肠杆菌pET28a)，岩白菜氧甲基转移酶BpOMT1基因则需要使用带同源壁的引物(即同源臂引物)进行扩增及回收，所述同源臂引物由上游同源臂引物(序列表中SEQ ID NO：5所示)和下游同源臂引物(序列表中SEQ ID NO：6所示)组成，以岩白菜氧甲基转移酶BpOMT1基因为模板，按高保真KOD酶使用说明书操作，再次进行PCR扩增，获得带载体同源臂的岩白菜氧甲基转移酶BpOMT1基因片段。

上游同源臂引物：atgggtcgcggatcc ATGGCTCCACAAAATGAAGCAG(SEQ ID NO：5)。

下游同源臂引物：

acggagctcgaattcggatccCTACTTCAAGAATTCCATGATATAAGAATTGAAAGC(SEQ ID NO：6所示)。

上述上游同源臂引物(SEQ ID NO：5)和下游同源臂引物(SEQ ID NO：6所示)中小写字母代表pET28a同源臂，大写字母代表扩增岩白菜氧甲基转移酶BpOMT1基因引物序列。

(3)基因重组载体的构建与鉴定

同源重组的示意图详见图2。首先对载体pET28a进行线性化，使用BamH I酶进行单酶切获得线性化载体。同源重组时则按照同源重组酶的操作说明进行组装，然后根据插入带载体同源臂的岩白菜氧甲基转移酶BpOMT1基因片段和pET28a载体的浓度，并按照重组说明计算各组分用量；最后在冰上将各组分加入到PCR反应管中，将岩白菜氧甲基转移酶BpOMT1基因与pET28a载体同源重组获得重组质粒，命名为pET28a-BpOMT1。组装后对结果检测并送公司测序，组装后的电泳检测结果见图3，表明组装成功。按以下过程重组操作：

表1候选基因重组反应体系

其中，X＝(0.02×pET28a碱基对数)ng/线化化pET28a浓度ng/μL；Y＝(0.02×pET28a碱基对数)ng/岩白菜氧甲基转移酶BpOMT1回收浓度ng/μL，插入基因片段是插入带载体同源臂的岩白菜氧甲基转移酶BpOMT1基因片段。

(4)SDS-PAGE蛋白电泳检测

经蛋白表达小试后确定BpOMT1的蛋白诱导条件为：17℃、0.1mM的IPTG、220r/min，诱导12h；然后进行大摇，并收菌、破壁，经高速离心(12000r/min)后获得蛋白上清，再采用SDS-PAGE蛋白电泳和检测。检测结果见图4，图4表明BpOMT1蛋白在250mmol/L咪唑洗脱液下可以洗脱纯化。

(5)酶活反应

岩白菜氧甲基转移酶BpOMT1的酶活性是通过发生甲基化反应合成4-甲氧基没食子酸来确定的，在1.5mL离心管中进行。实验样品反应体系中混合物包含：100mM S-腺苷-甲硫氨酸2微升、100mM没食子酸2微升、40μg纯化的岩白菜氧甲基转移酶BpOMT1，加入50mMTris-HCl缓冲液(pH 8.0)至总体积100μL，反应体系总体积为100μL。在31℃下保温2小时后，等体积1M盐酸终止，短暂离心(12000r/min)，取上清。最后通过HPLC和LC-MS/MS分析，进行反应产物检测。

对照组(CK)反应体系：100mM没食子酸2微升、100mM S-腺苷-甲硫氨酸2微升、40μg灭活的纯化的岩白菜氧甲基转移酶BpOMT1，加入50mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)至总体积100μL，反应体系总体积为100μL。

标品：10mM没食子酸标准品50微升、10mM 4-甲氧基没食子酸标准品50微升。

(6)产物检测

HPLC检测条件如下：

HPLC检测所用仪器为安捷伦1290超高效液相色谱仪。色谱柱为XBridge ShieldRP18(4.6mm×250mm,5μm)，柱温：30℃；测定4-甲氧基没食子酸流动相为0.01％v/v甲酸水溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脱：0～8min，1％～5％B；8～13min，5％～10％B；13～20min，10％～20％B；20～25min,20％～45％B；25～35min,45％～90％B；35～40min,90％～90％B；洗脱时间：40min；进样量：10微升；流速：0.6ml/min；检测波长230nm。检测结果见图5，表明实验样品在岩白菜氧甲基转移酶BpOMT1的催化下有4-甲氧基没食子酸的产生。

LC-MS/MS检测条件如下：

为了进一步确认HPLC所检测到的反应产物，采用Agilent 1290UPLC/6540Q-TOF液相色谱质谱联用仪(LC/MS/MS)进行检测：质谱条件：离子源采用的是负离子模式，电压：3500V；碎裂电压:135V；锥孔电压:60V；射频电压:750V，扫描范围：100-1000m/z，扫描方式：SRM。色谱条件：色谱柱为XBridge Shield RP18(4.6mm,×250mm,5μm)，柱温：30℃，测定4-甲氧基没食子酸流动相为0.01％v/v甲酸水溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脱：0～8min，1％～5％B；8～13min，5％～10％B；13～20min，10％～20％B；20～25min,20％～45％B；25～35min,45％～90％B；35～40min,90％～90％B；洗脱时间：40min；进样量：10微升；流速：0.6ml/min；检测波长230nm。

检测结果见图6～图9，从结果中可以看出，产物的出峰时间、及特征碎离子均与标准品4-甲氧基没食子酸相吻合，确认反应产物为4-甲氧基没食子酸。最终得出氧甲基转移酶BpOMT1具有催化没食子酸的C4位上的氧进行一次甲基化的能力，生成4-甲氧基没食子酸。

序列表

<110> 云南农业大学

<120> 一种岩白菜氧甲基转移酶BpOMT1基因及在制备4-甲氧基没食子酸中的应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1077

<212> DNA

<213> 岩白菜(Bergenia purpurascens)

<400> 1

atggctccac aaaatgaagc agcagcagct gaagaagaag caaacctatt tgccatgcaa 60

ctagcaagtg catcagtctt accaatggta cttaaatcag ccatagaact agaccttcta 120

gaaatcatgg ctaaatctgg cccaggtgca tacatgtcac ccatagatat agcctctcag 180

cttcctacaa acaatccaga tgcacctgtc atgctcgacc gcattttgcg cctgctagca 240

tgctactctg ttctcacttg ctctgtccga aatctccctg atggccgtgt tgagaggctt 300

tatggtctgg cacctgtttg taagtacttg accaagaatg aggaaggtgt ctctattgct 360

gctctttgtc tcatgaatca agacaagatc ctcatggaga gctggtacca cttgaaagat 420

gcagttcttg atggtggcat tccattcaac aaggcttatg gaatgtctgc cttcgagtac 480

cacggcacgg atcctagatt caacaaggtt tttaacaggg gaatgtctga tcactcaaca 540

attaccatga agaaaatcct tgagacatac aaaggatttg agggactcac atctgtcgtc 600

gacgttggtg gtggtactgg agccactctt aacatgatcc tctccaagta tcccaacatt 660

aggggcatta actttgattt gcctcatgtg attgaggatg ccccatctta tcctggtgtg 720

gagcatgttg gaggagacat gtttgttagt gttccaaaag gggatgctat tttcatgaag 780

tggatatgtc atgactggag cgacgaacac tgcttgaaat ttttgaagaa ttgctatgat 840

gcacttccga gcaatgggaa ggtgattctt gctgaatgca ttcttccagt aacgccggac 900

actagccttg caactaaagg agttgtccat atcgatgtga tcatgttagc gcataatcca 960

ggagggaagg aaaggactga gaaggagttt gaggccttgg caaaaggtgc tggatttcaa 1020

ggcttccaag tattctgcaa tgctttcaat tcttatatca tggaattctt gaagtag 1077

<210> 2

<211> 358

<212> PRT

<213> 岩白菜(Bergenia purpurascens)

<400> 2

Met Ala Pro Gln Asn Glu Ala Ala Ala Ala Glu Glu Glu Ala Asn Leu

1 5 10 15

Phe Ala Met Gln Leu Ala Ser Ala Ser Val Leu Pro Met Val Leu Lys

20 25 30

Ser Ala Ile Glu Leu Asp Leu Leu Glu Ile Met Ala Lys Ser Gly Pro

35 40 45

Gly Ala Tyr Met Ser Pro Ile Asp Ile Ala Ser Gln Leu Pro Thr Asn

50 55 60

Asn Pro Asp Ala Pro Val Met Leu Asp Arg Ile Leu Arg Leu Leu Ala

65 70 75 80

Cys Tyr Ser Val Leu Thr Cys Ser Val Arg Asn Leu Pro Asp Gly Arg

85 90 95

Val Glu Arg Leu Tyr Gly Leu Ala Pro Val Cys Lys Tyr Leu Thr Lys

100 105 110

Asn Glu Glu Gly Val Ser Ile Ala Ala Leu Cys Leu Met Asn Gln Asp

115 120 125

Lys Ile Leu Met Glu Ser Trp Tyr His Leu Lys Asp Ala Val Leu Asp

130 135 140

Gly Gly Ile Pro Phe Asn Lys Ala Tyr Gly Met Ser Ala Phe Glu Tyr

145 150 155 160

His Gly Thr Asp Pro Arg Phe Asn Lys Val Phe Asn Arg Gly Met Ser

165 170 175

Asp His Ser Thr Ile Thr Met Lys Lys Ile Leu Glu Thr Tyr Lys Gly

180 185 190

Phe Glu Gly Leu Thr Ser Val Val Asp Val Gly Gly Gly Thr Gly Ala

195 200 205

Thr Leu Asn Met Ile Leu Ser Lys Tyr Pro Asn Ile Arg Gly Ile Asn

210 215 220

Phe Asp Leu Pro His Val Ile Glu Asp Ala Pro Ser Tyr Pro Gly Val

225 230 235 240

Glu His Val Gly Gly Asp Met Phe Val Ser Val Pro Lys Gly Asp Ala

245 250 255

Ile Phe Met Lys Trp Ile Cys His Asp Trp Ser Asp Glu His Cys Leu

260 265 270

Lys Phe Leu Lys Asn Cys Tyr Asp Ala Leu Pro Ser Asn Gly Lys Val

275 280 285

Ile Leu Ala Glu Cys Ile Leu Pro Val Thr Pro Asp Thr Ser Leu Ala

290 295 300

Thr Lys Gly Val Val His Ile Asp Val Ile Met Leu Ala His Asn Pro

305 310 315 320

Gly Gly Lys Glu Arg Thr Glu Lys Glu Phe Glu Ala Leu Ala Lys Gly

325 330 335

Ala Gly Phe Gln Gly Phe Gln Val Phe Cys Asn Ala Phe Asn Ser Tyr

340 345 350

Ile Met Glu Phe Leu Lys

355

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 岩白菜(Bergenia purpurascens)

<400> 3

atggctccac aaaatgaagc ag 22

<210> 4

<211> 36

<212> DNA

<213> 岩白菜(Bergenia purpurascens)

<400> 4

ctacttcaag aattccatga tataagaatt gaaagc 36

<210> 5

<211> 37

<212> DNA

<213> 岩白菜(Bergenia purpurascens)

<400> 5

atgggtcgcg gatccatggc tccacaaaat gaagcag 37

<210> 6

<211> 57

<212> DNA

<213> 岩白菜(Bergenia purpurascens)

<400> 6

acggagctcg aattcggatc cctacttcaa gaattccatg atataagaat tgaaagc 57

Claims

1.一种岩白菜氧甲基转移酶BpOMT1基因，其核酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种岩白菜氧甲基转移酶BpOMT1，其氨基酸系列如SEQ ID NO：2所示。

3.一种含有权利要求1所述的岩白菜氧甲基转移酶BpOMT1基因的重组质粒。

4.根据权利要求3所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒通过将权利要求1所述的岩白菜氧甲基转移酶BpOMT1基因与pET28a载体同源重组获得，命名为pET28a-BpOMT1。

5.一种转基因工程菌，其特征在于，含有权利要求3或4所述的重组质粒，或所述转基因工程菌的基因组中整合有外源的权利要求1所述的岩白菜氧甲基转移酶BpOMT1基因。

6.根据权利要求5所述的转基因工程菌，其特征在于，所述转基因工程菌为大肠杆菌BL21(DE3)菌株。

7.权利要求2所述的岩白菜氧甲基转移酶BpOMT1在制备4-甲氧基没食子酸中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，以没食子酸和S-腺苷-甲硫氨酸为原料，在权利要求2所述的岩白菜氧甲基转移酶BpOMT1的催化下，生成4-甲氧基没食子酸。

9.一种克隆权利要求1所述的岩白菜氧甲基转移酶BpOMT1基因的引物，其特征在于，所述引物由引物F和引物R组成，所述引物F的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述引物R的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。