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CN111411099B - 雪胆乙酰基转移酶及其编码基因和在制备雪胆甲素中的应用 - Google Patents

雪胆乙酰基转移酶及其编码基因和在制备雪胆甲素中的应用 Download PDF

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CN111411099B CN202010408966.4A CN202010408966A CN111411099B CN 111411099 B CN111411099 B CN 111411099B CN 202010408966 A CN202010408966 A CN 202010408966A CN 111411099 B CN111411099 B CN 111411099B
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Abstract

本发明公开了一种雪胆乙酰基转移酶及其编码基因和在制备雪胆甲素中的应用，该雪胆乙酰基转移酶具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。本发明首次在雪胆中鉴定获得了雪胆甲素合成途径中的关键酶，即，雪胆乙酰基转移酶；该雪胆乙酰基转移酶能够雪胆乙素C‑25位的羟基转化为乙酰基，从而获得雪胆甲素；基于此，本发明构建了含有雪胆乙酰基转移酶编码基因的重组载体，并进一步构建了基因工程菌，利用转基因工程菌在体外表达雪胆乙酰基转移酶，经进一步对底物雪胆乙素进行催化，直接获得雪胆甲素，无需再通过种植雪胆属植物后提取雪胆甲素；为大量、快速地制备雪胆甲素提供了重要途径。

Description

雪胆乙酰基转移酶及其编码基因和在制备雪胆甲素中的应用
技术领域
本发明属于生物技术技术领域，具体涉及一种雪胆乙酰基转移酶及其编码基因和在制备雪胆甲素中的应用。
背景技术
雪胆(Hemsleya chinensis Cogn)为葫芦科雪胆属(Hewsleva Cogn.)植物，在全世界范围内有31种雪胆属植物，除2种产于印度、越南外，其他主要分布于中国云南、四川、贵州等西南地区。
已有研究发现，雪胆属植物的块茎中富含葫芦素类和其他三萜皂苷成分，特别是从该属植物中提取的雪胆素(雪胆甲素和雪胆乙素混合物，以雪胆甲素为主)，已经被开发成“雪胆素片”，发挥清热解毒、抗菌消炎等多种功效，临床上常用于治疗菌痢、肠炎、支气管炎及急性扁桃体炎等多种疾病。
此外，国内外学者还发现雪胆甲素(Cucurbitacin IIa)具有明显的细胞毒性作用，雪胆甲素能够通过抑制JAK2/STAT3下游的生存素(Survivin)破坏肌动蛋白细胞骨架，引导细胞发生PARP介导的凋亡，从而抑制肿瘤细胞的增殖，这就使得雪胆甲素成为一类新型的抗癌药物。
目前，雪胆甲素主要是从雪胆属植物块茎中提取获得的。近年来，由于人类无序采挖等原因，雪胆类药材的野生资源正在日益减少。为了缓解野生资源的压力，人们逐渐开展雪胆属植物的人工栽培，但雪胆属植物的种植周期长，且对种植地块和种植技术的要求也较高，使得雪胆属植物的人工栽培工作进展得并不顺利。
如何去高效地获得这些有用的次生代谢物，一直都是科研究人员思考和研究的问题。对于高附加值的天然产物，采用现代生物技术建立同源或异源表达系统高效生产药用活性成分，已被广泛认为是解决今后药用资源短缺的重要技术手段。但是，要搞清这些活性成分的生物合成途径，必需鉴定这些途径中相关的关键基因，发掘这些催化酶基因成为了研究植物代谢产物生物合成途径的关键环节。
学术界普遍认为，雪胆甲素是雪胆乙素C25位上的羟基被乙酰基化而获得的，然而由雪胆乙素获得雪胆甲素的合成路径并不清晰，负责乙酰基化的乙酰基转移酶的功能尚未得到验证，影响了雪胆甲素生物合成工作的推进。
发明内容
本发明的发明目的是提供一种雪胆乙酰基转移酶及其编码基因和在制备雪胆甲素中的应用，该雪胆乙酰基转移酶能够在植物体外将雪胆乙素(Cucurbitacin IIb)C-25位的羟基转化为乙酰基，获得雪胆甲素，为大量制备雪胆甲素提供了重要途径。
为实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：
本发明的雪胆乙酰基转移酶具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。
本发明首次在雪胆中鉴定获得了雪胆甲素合成途径中的关键酶：雪胆乙酰基转移酶，该雪胆乙酰基转移酶能够将雪胆乙素C-25位的羟基转化为乙酰基，从而获得雪胆甲素。
进一步地，本发明首次在雪胆中鉴定获得了雪胆乙酰基转移酶的编码基因，该编码基因具有如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。
为了提高雪胆甲素产量，减少生产雪胆甲素对雪胆属植物的依赖，本发明提供了含有上述雪胆乙酰基转移酶的编码基因的重组载体；以及，表达上述的雪胆乙酰基转移酶的转基因工程菌。
本发明中，雪胆乙酰基转移酶的编码基因在该转基因工程菌内存在的方式有两种，其一：所述的转基因工程菌中包含有上述的含有雪胆乙酰基转移酶的编码基因的重组载体；其二：所述的转基因工程菌的基因组中整合有上述的雪胆乙酰基转移酶的编码基因。
本发明还提供了上述的表达雪胆乙酰基转移酶的转基因工程菌在制备雪胆甲素中的应用。
作为优选，所述的应用包括：利用所述的转基因工程菌生产雪胆乙酰基转移酶，再利用所述的雪胆乙酰基转移酶制备雪胆甲素。
本发明还提供了上述的雪胆乙酰基转移酶在制备雪胆甲素中的应用。
作为优选，所述的应用包括：以雪胆乙素和乙酰基供体为原料，以所述的雪胆乙酰基转移酶为催化剂，在28-35℃下反应20-40min，获得雪胆甲素。
本发明能够利用转基因工程菌在体外表达雪胆乙酰基转移酶，经进一步对底物雪胆乙素进行催化，直接获得雪胆甲素，无需再通过种植雪胆属植物后提取雪胆甲素。本发明还提供了上述的雪胆乙酰基转移酶的编码基因在作为雪胆辅助育种分子标记中的应用。
鉴于雪胆乙酰基转移酶编码基因是植物合成雪胆甲素的关键基因，因此雪胆乙酰基转移酶编码基因能够作为雪胆的分子辅助育种的重要标记基因，同时也可作为酵母底盘细胞构建中生产雪胆甲素的重要候选基因。
与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：
本发明首次在雪胆中鉴定获得了雪胆甲素合成途径中的关键酶：雪胆乙酰基转移酶，该雪胆乙酰基转移酶能够将雪胆乙素C-25位的羟基转化为乙酰基，从而获得雪胆甲素；基于此，本发明构建了含有雪胆乙酰基转移酶编码基因的重组载体，并进一步构建了基因工程菌，利用转基因工程菌在体外表达雪胆乙酰基转移酶，经进一步对底物雪胆乙素进行催化，直接获得雪胆甲素，无需再通过种植雪胆属植物后提取雪胆甲素；为大量、快速地制备雪胆甲素提供了重要途径。
附图说明
图1为本发明的雪胆乙酰基转移酶催化雪胆乙素生成雪胆甲素的合成示意图；
其中，Cucurbitacin IIb表示雪胆乙素，Cucurbitacin IIa表示雪胆甲素，HCAT1表示本发明的雪胆乙酰基转移酶，下同；
图2为含有本发明雪胆乙酰基转移酶编码基因的重组质粒pET32a-HCAT1的电泳检测结果图；
M表示Marker蛋白标准品，下同；
图3为含有本发明雪胆乙酰基转移酶编码基因的重组质粒pET32a-HCAT1的结构示意图；
图4为本发明制备的雪胆乙酰基转移酶HCAT1的蛋白电泳检测结果图；
图5为本发明制备的雪胆乙酰基转移酶HCAT1的蛋白免疫印迹检测结果图；
图6为本发明雪胆乙酰基转移酶HCAT1的酶活反应HPLC检测结果图；
其中，Control表示空白对照，standard表示标准品；
图7为雪胆乙素的特征离子峰图；
其中，Mass-to-Charge(m/z)表示质荷比(m/z)，下同；
图8为雪胆甲素的特征离子峰图；
图9为本发明雪胆乙酰基转移酶HCAT1的酶活反应FC-MS检测结果图；
其中，Substrate表示反应底物，Product表示反应产物，Retention time(min)表示出峰时间(分钟)。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案做进一步详细说明。
本实施例基于雪胆转录组Unigene基本功能注释信息，在测序注释结果中对BAHD类型乙酰基转移酶(BAHD-AT)候选基因进行筛选，同时，以葫芦科植物中已被鉴定的BAHD-AT基因，主要以黄瓜(Cucumis sativus)中鉴定的CsACT、甜瓜(Cucumis melo)中鉴定的CmACT为线索，通过序列本地BLAST分析，然后对筛选结果进行整理分析，最后在雪胆转录组中发现了2个BAHD-AT基因。之后进行cDNA的制备、候选基因的扩增及回收、同源重组、蛋白表达、体外酶活反应，以及HPLC及LC/MS检测等一系列工作后，最终鉴定出可以催化雪胆乙素(Cucurbitacin IIb)C-25位上羟基的乙酰基化反应，生成雪胆甲素的目标候选乙酰基转移酶HCAT1基因(图1)。
具体包括如下步骤：
(1)cDNA模板的制备
取雪胆块茎的鲜样，切片后液氮速冻，用Magen(广州美基生物科技有限公司)的HiPure Plant RNA Mini Kit试剂盒进行RNA提取。提取的RNA经检测合格后，使用TAKARA反转录试剂盒，将RNA反转录成cDNA，-20℃保存备用。
(2)基因扩增及回收
利用引物设计软件(CE Design)v1.04，为乙酰基转移酶HCAT1基因设计扩增引物：
上游引物：5'-ATGGAGATGCCATTGAAAGTG-3'(SEQ ID No.3)；
下游引物：5'-CTAAACTTGAATGACATTAGGATTTATGG-3'(SEQ ID No.4)；
为了便于扩增获得的乙酰基转移酶HCAT1基因能够与载体pET32a进行同源重组，需要在引物上加上同源臂(同源臂为大肠杆菌pET32a)；即：
上游引物：5'-ccatggctgatatcggatccATGGAGATGCCATTGAAAGTG-3'(SEQ IDNo.5)；
下游引物：
5'-tgtcgacggagctcgaattcCTAAACTTGAATGACATTAGGATTTATGG-3'(SEQ ID No.6)；
之后采用KOD高保真酶进行基因扩增。
PCR反应体系为：94℃、5min；94℃、30s，62℃、50S，72℃、1min，35个循环；72℃、7min。
PCR结束后，进行跑胶，确认扩增成功后进行目的条带回收。基因切胶回收使用北京全式金生物技术有限公司的EasyPure Quick Gel Extraction Kit试剂盒进行目的基因回收。回收后在NanoReady超微量紫外可见分光光度计上测定其回收浓度，最后放-20℃冰箱中保存备用。
(3)基因重组载体的构建与鉴定
首先使用BamH I酶进行单酶切，获得线性化pET32a载体；而后按下表的反应体系进行同源重组，在冰上将各组分加入到PCR反应管中：
Figure BDA0002492484390000071
其中X＝(0.02×pET32a碱基对数)ng/线化化pET32a浓度ng/μL；Y＝(0.02×pET32a碱基对数)ng/HCAT1回收浓度ng/μL；
重组完成后对结果进行检测并送公司测序，组装后的电泳检测结果见图2，表明组装成功；获得的重组质粒pET32a-HCAT1的结构示意图如图3所示。
(4)SDS-PAGE蛋白电泳和免疫印迹检测
经蛋白表达小试后确定乙酰基转移酶HCAT1的诱导条件为：17℃、0.1mM的IPTG、220r/min，诱导12h；然后进行大摇，并收菌、破壁，经高速离心后获得蛋白上清，再采用SDS-PAGE蛋白电泳和检测。检测结果见图4。
为进一步确认目标蛋白，开展了免疫印迹检测。因乙酰基转移酶HCAT1的N末端带有His标签，需使用高纯度小鼠来源单克隆抗体His-Tag抗体(GenStar，中国深圳)，按WB检测要求进行封闭和孵育抗体。
先在PBST中以1:2000的稀释度和5％w/v脱脂奶稀释一抗，接种载有转移蛋白的膜，在室温下孵育1h或在4℃过夜，回收一抗混合液，然后加PBST缓冲液中于室温摇床震荡培养20min(40rpm)，再用兔抗小鼠免疫球蛋白G-辣根过氧化物酶(IgG-HRP)偶联的二抗(GenStar，中国深圳)以1:5000的稀释度用PBST和5％w/v脱脂牛奶稀释，室温下摇床1h；最后，弃二抗混合液，用20mL 1×PBST摇床10min，重复3次，通过StarSignal超敏化学发光检测试剂盒(GenStar，中国深圳)提供的发光底物，然后将膜暴露于X射线胶片来进行偶联二抗的可视化发光检测。检测结果见图5，表明获得了目标基因的上清蛋白。
(5)酶活反应
乙酰基转移酶HCAT1的活性是通过发生乙酰化反应合成葫芦素IIa(即雪胆甲素)来确定的，反应在1.5mL离心管中进行。
反应体系中包含：40mM乙酰基CoA，400μM底物雪胆乙素，50mM磷酸钠缓冲液(pH7.5)，以及40μg纯化的乙酰基转移酶HcAT1，反应体系总体积为100μL。
在31℃下保温30min后，将反应混合物用等体积的乙酸乙酯萃取3次，之后短暂离心，取上清，浓缩。将产物溶解在甲醇中，最后通过HPLC和LC-MS分析，进行反应产物检测。
(6)产物检测
HPLC检测条件如下：
HPLC检测所用仪器为安捷伦1290超高效液相色谱仪。色谱柱为PhenomenexKinetex C18 analytical column(4.6×100mm,2.6μm)，测定雪胆素(包括雪胆甲素和雪胆乙素)的流动相为0.2％磷酸水溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脱：0～15min，25％～33％B；15～20min，33％～40％B；20～24min，40％～60％B；24～28min,60％～90％B；检测波长212nm。检测结果见图6，表明反应产物中存在雪胆甲素。
LC-MS检测条件如下：
为了进一步确认HPLC所检测到的反应产物，采用Agilent 1290 UPLC/6540 Q-TOF液相色谱质谱联用仪(LC/MS)进行检测，检测方法如下：
质谱条件：离子源采用的是正离子模式，电压：3500V；碎裂电压:135V；锥孔电压:60V；射频电压:750V，扫描范围：100-1000m/z；
色谱条件：色谱柱为Phenomenex Kinetex C18 analytical column(4.6×100mm,2.6μm)，测定雪胆素的流动相为0.2％磷酸水溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脱：0～15min，25％～33％B；15～20min，33％～40％B；20～24min，40％～60％B；24～28min,60％～90％B；检测波长212nm。检测结果见图7、图8和图9。
从图9的结果中可以看出，反应液中底物雪胆乙素(Cucurbitacin IIb)和反应产物雪胆甲素(Cucurbitacin IIa)的出峰时间与雪胆乙素标准品、雪胆甲素标准品的出峰时间相吻合；进一步确认生成的产物为雪胆甲素。
序列表
<110> 云南农业大学
<120> 雪胆乙酰基转移酶及其编码基因和在制备雪胆甲素中的应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 435
<212> PRT
<213> 中华雪胆(Hemsleya chinensis Cogn)
<400> 1
Met Glu Met Pro Leu Lys Val Lys Ile Ile Ser Glu Glu Arg Ile Lys
1 5 10 15
Pro Ser Ser Pro Thr Pro Glu Ser Gln Lys Tyr Leu Asn Phe Ser Leu
20 25 30
Leu Asp Gln Leu Ala Leu Pro Val Tyr Val Pro Leu Leu Leu Phe Tyr
35 40 45
Val Gly Gly Gly Asp Cys Glu Asp Ala Asn Glu Arg Ser Arg Ser Leu
50 55 60
Lys Val Ser Leu Ser Asp Glu Leu Thr Arg Phe Tyr Pro Leu Ala Gly
65 70 75 80
Arg Val Lys Glu Asp Asn Glu Ser Ile Phe Cys Asn Asp Glu Gly Ala
85 90 95
Ile Tyr Val Glu Ala Lys Ala Asn Cys Leu Leu Ser Asp Phe Leu Asn
100 105 110
Gln Leu Glu Ile Asp Ser Leu Asn Asp Phe Leu Pro Phe Asp Ser Ala
115 120 125
Lys Gly Cys Ile Leu Leu Val Gln Ile Thr Ser Phe Glu Cys Gly Gly
130 135 140
Met Ala Ile Gly Leu Leu Met Ser His Lys Ile Ser Asp Ala Ser Ser
145 150 155 160
Ile Ser Ala Phe Ile Lys Ser Trp Thr Ala Thr Ser Arg Gly Cys Lys
165 170 175
Leu Ser Glu Ser Glu Leu Pro Lys Phe Ile Gly Ala Ser Val Leu Pro
180 185 190
Pro Pro Gln Asp Phe Pro Ile Ser Thr Pro Thr Ser Asp Ser Gly Ile
195 200 205
His Ala Lys Gly Val Thr Lys Arg Leu Val Phe Glu Ala Ser Lys Ile
210 215 220
Ile Glu Leu Lys Ala Lys Ala Thr Ser Ala Thr Val Lys Gln Pro Thr
225 230 235 240
Arg Val Glu Ala Val Thr Gly Leu Ile Trp Lys Cys Ala Ile Ala Ala
245 250 255
Ser Lys Ser Thr Ser Gly Ile Ser Lys Pro Ser Val Val Gly Gln Ala
260 265 270
Val Asn Leu Arg Lys Arg Leu Val Pro Thr Leu Pro Asp Thr Ser Ile
275 280 285
Gly Asn Leu Leu Gly Phe Ile Thr Pro Glu Thr Lys Thr Glu Ala Gly
290 295 300
Glu Ile Glu Leu Gln Gly Leu Val Gly Leu Leu Arg Glu Gly Ile Thr
305 310 315 320
Glu Phe Asn Glu Asn Gly Phe Lys Lys Tyr Gln Asp Thr Glu Ala Tyr
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Leu Thr Tyr Phe Lys Thr Leu Met Asn Pro Asp Gly Pro Tyr Gly Gly
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Asp Lys Asn Phe Tyr Leu Cys Ser Ser Trp Ser Arg Phe Gln Phe Tyr
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Ser Met Phe Ser Asn Phe Phe Leu Leu Met Asp Thr Lys Asp Gly Arg
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Gly Ile Glu Ala Leu Val Thr Leu Ser Glu Glu Asp Met Ala Leu Phe
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Ile Gln Val
435
<210> 2
<211> 1308
<212> DNA
<213> 中华雪胆(Hemsleya chinensis Cogn)
<400> 2
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acaccagaga gccagaaata tttaaacttc tcgttgttag accagctagc tctgcctgtt 120
tacgtaccat tacttctttt ctacgttgga ggcggtgatt gtgaagatgc aaatgaaaga 180
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agctggagca gatttcaatt ttacgaagct gattttgggt ggggttgccc agtttggttt 1140
attggaggga tttccatgtt ttcaaatttt ttcttactga tggatacaaa agatggacgt 1200
ggaattgaag ctttggtaac attgagtgaa gaggacatgg ccctgttcca acgtgatgaa 1260
gacttgcttg catatgggtc cataaatcct aatgtcattc aagtttag 1308
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成序列(Unknown)
<400> 3
atggagatgc cattgaaagt g 21
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工合成序列(Unknown)
<400> 4
ctaaacttga atgacattag gatttatgg 29
<210> 5
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工合成序列(Unknown)
<400> 5
ccatggctga tatcggatcc atggagatgc cattgaaagt g 41
<210> 6
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工合成序列(Unknown)
<400> 6
tgtcgacgga gctcgaattc ctaaacttga atgacattag gatttatgg 49

Claims (10)

1.一种雪胆乙酰基转移酶，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.如权利要求1所述的雪胆乙酰基转移酶的编码基因。
3.如权利要求2所述的雪胆乙酰基转移酶的编码基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
4.含有如权利要求2所述的雪胆乙酰基转移酶的编码基因的重组载体。
5.含有如权利要求3所述的雪胆乙酰基转移酶的编码基因的重组载体。
6.表达如权利要求1所述的雪胆乙酰基转移酶的转基因工程菌。
7.如权利要求6所述的表达雪胆乙酰基转移酶的转基因工程菌，其特征在于，包含有如权利要求4或5所述的含有雪胆乙酰基转移酶的编码基因的重组载体；
或者，基因组中整合有如权利要求2或3所述的雪胆乙酰基转移酶的编码基因。
8.如权利要求6或7所述的表达雪胆乙酰基转移酶的转基因工程菌在制备雪胆甲素中的应用。
9.如权利要求1所述的雪胆乙酰基转移酶在制备雪胆甲素中的应用。
10.如权利要求9所述的雪胆乙酰基转移酶在制备雪胆甲素中的应用，其特征在于，包括：以雪胆乙素和乙酰基供体为原料，以所述的雪胆乙酰基转移酶为催化剂，在28-35℃下反应20-40 min，获得雪胆甲素。
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