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CN113699243A - 一种用于检测bcl2-igh染色体易位的引物探针组、试剂盒及检测方法 - Google Patents

一种用于检测bcl2-igh染色体易位的引物探针组、试剂盒及检测方法 Download PDF

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CN113699243A CN202111237148.3A CN202111237148A CN113699243A CN 113699243 A CN113699243 A CN 113699243A CN 202111237148 A CN202111237148 A CN 202111237148A CN 113699243 A CN113699243 A CN 113699243A
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fam
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Shanghai Tissuebank Biotechnology Co ltd
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Abstract

本发明公开了一种用于检测BCL2‑IGH染色体易位的引物探针组、试剂盒及检测方法；其中，引物探针组包括核苷酸如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.32所示的BCL2‑IGH特异性引物和BCL2‑IGH特异性探针组合；试剂盒中包含有引物探针组，检测方法是采用试剂盒检测14种不同的BCL2‑IGH染色体易位情形。本发明的检测方法是基于TaqMan®探针PCR技术来实现的，具有很高的特异性以及检测灵敏度，同时，该方法通过合理的引物和探针搭配，有效避免引物与引物之间、引物与探针之间、以及探针与探针之间的相互作用，提高了BCL2‑IGH染色体易位检测的特异性，降低了假阳性，从而减少了检测误差。

Description

一种用于检测BCL2-IGH染色体易位的引物探针组、试剂盒及 检测方法
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种用于检测BCL2-IGH染色体易位的引物探针组、试剂盒及检测方法。
背景技术
BCL2-IGH是t(14:18)(q32:q21)染色体易位产物，其将18号染色体q21区的BCL2原癌基因整合到14号染色体32区IGH，见于85%-90%的滤泡性淋巴瘤（follicular lymphoma,FL）及30%的弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma, DLBCL)。并少见于慢性淋巴细胞白血病（chronic lymphocytic leukemia, CLL）和急性淋巴细胞白血病（acutelymphoblastic leukemia, ALL）。BCL2全长230kb，包含3个外显子，断裂点多样化，其中60%-70%易位发生于BCL2基因序列第3个外显子3'端150bp的非翻译区，为主要断裂点决定区(Major break point region, MBR)；20%-30%发生于BCL2基因序列第3个外显子3'端25kb处，称次要断裂点决定区（Minor cluster region, MCR)；其余断裂点分布于BCL2基因其他区域。BCL2-IGH融合导致BCL2基因在滤泡中心B细胞高表达，抑制B细胞凋亡，使B细胞持续增殖，引发肿瘤。BCL2-IGH阴性患者无病生存期较阳性患者明显增加（P<0.00001)，阳性患者复发风险比前者高48倍。另外，BCL2-IGH是FL最重要的分子生物学特征，检测该基因对FL的发现、鉴别及预后具有重要意义。
目前临床应用的BCL2-IGH染色体易位检测方法主要有四种：细胞遗传学分析，荧光原位杂交，Southern杂交分析和荧光TaqMan®探针PCR法。细胞遗传学分析相对比较耗费人力且昂贵，需要的检测时间很长，操作复杂，并且灵敏度低；荧光原位杂交的操作要求高，分析成本适中，灵敏度不高且平均周转时间长；Southern杂交分析的样本要求高，流程复杂冗长，周转时间最长，且实验中用到的放射性探针对人体有害；因而这三种方法在临床上的推广都存在一定局限性。目前临床上应用最广的融合基因多检测方法为荧光PCR法，其主要优点有（1）闭管操作、封闭状态检测，减少了模板污染和假阳性的可能；（2）无需对PCR产物进行后处理，操作更简便快速；（3）灵敏度高，可以检测单拷贝基因；（4）特异性高，荧光PCR可通过Taqman探针与靶序列特异性的结合，特异性的检测目的基因。
当前检测BCL2-IGH染色体易位的方法还无法满足高效、精准、简便等要求，对于小（少）量样本的检测更是难以解决，且无法确定大概的断裂位置，所以亟需一种快速、有效、精准且适合于小样本检测BCL2-IGH染色体易位的方法。
发明内容
本发明针对现有技术中存在的上述缺陷，基于最新的科研动态和临床应用，重新设计了用于检测BCL2-IGH染色体易位的引物探针组、试剂盒及检测方法。本发明的检测方法简便快速、精准有效、结果简单易辨别且对于小样本依然适用。
本发明的技术方案一如下：
一种用于检测BCL2-IGH染色体易位的引物探针组，包括核苷酸如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.32所示的引物探针组，且该所述引物探针组包括BCL2-IGH特异性引物和BCL2-IGH特异性探针。
较好地，上述引物探针组中，引物探针组中含有14种不同的BCL2-IGH染色体易位基因和1种管家基因ABL1。
较好地，上述引物探针组中，所述SEQ ID NO.1至 SEQ ID NO.32所示的引物探针组包括如下组合：
组合1：
SEQ ID NO.1:5'-TGACCTTTAGAGAGTTGCTTTACG-3'；
SEQ ID NO.32: 5'-CATGGCTGACGAGATCTGAGTG -3'；
SEQ ID NO.2: FAM-CTGTTTCAACACAGACCCACCCAGAG-BHQ1；
组合2：
SEQ ID NO.3: 5'-GGAGAATTGCTTGAACCCAAT-3'；
SEQ ID NO.32: 5'-CATGGCTGACGAGATCTGAGTG -3'；
SEQ ID NO.4: FAM-CACACCATTGTACTCC-MGB；
组合3：
SEQ ID NO.5:5'-AATCTGACGTTCAGTCATTTCTGA-3'；
SEQ ID NO.32: 5'-CATGGCTGACGAGATCTGAGTG -3'；
SEQ ID NO.6: FAM-CCAGAGAGCTATTCAAT- MGB；
组合4：
SEQ ID NO.7: 5'-AATGGAGCTGGAACAACTGG-3'；
SEQ ID NO.32: 5'-CATGGCTGACGAGATCTGAGTG -3'；
SEQ ID NO.8: FAM-ATGGATCAGAAATGAATGCCATCTCAAATC-BHQ1；
组合5：
SEQ ID NO.9:5'-CCTGGCTTCCTTCCCTCTGT-3'；
SEQ ID NO.32: 5'-CATGGCTGACGAGATCTGAGTG -3'；
SEQ ID NO.10: FAM-TCTCTGGGGAGGAGTGGAAAGGAAGG-BHQ1；
组合6：
SEQ ID NO.11: 5'-GCACCTGCTGGATACAACACTG -3'；
SEQ ID NO.32: 5'-CATGGCTGACGAGATCTGAGTG -3'；
SEQ ID NO.12: FAM-ATGCATACTACCTTTTGCTCTCAAACCTTTCAAG-BHQ1；
组合7：
SEQ ID NO.13:5'-CATGTAGGGTATTGAGTATCATGCC -3'；
SEQ ID NO.32: 5'-CATGGCTGACGAGATCTGAGTG -3'；
SEQ ID NO.14: FAM-TATGGTATTTCGATTCCAATGGATATCGTTTGAA -BHQ1；
组合8：
SEQ ID NO.15: 5'-GCATCTTAACTGCTCTTTATGAATGAA -3'；
SEQ ID NO.32: 5'-CATGGCTGACGAGATCTGAGTG -3'；
SEQ ID NO.16:FAM-CAGTCCTCTGTATGTACTCCTCTTTACACTGGCC -BHQ1；
组合9：
SEQ ID NO.17:5'-AAGCAGATACTACCCAGCGGAG -3'；
SEQ ID NO.32: 5'-CATGGCTGACGAGATCTGAGTG -3'；
SEQ ID NO.18: FAM-AATTAATCTTTCTGTCAGCACCAAGGAAACAAGTAA -BHQ1；
组合10：
SEQ ID NO.19: 5'-AATCTCAGCCCTACACCATCCTA -3'；
SEQ ID NO.32: 5'-CATGGCTGACGAGATCTGAGTG -3'；
SEQ ID NO.20: FAM-TCCTCCATTTGGACATATTTCACATAGCAACAT -BHQ1；
组合11：
SEQ ID NO.21:5'-TCTTCCAGTTTAGAATCAGCCTTG -3'；
SEQ ID NO.32: 5'-CATGGCTGACGAGATCTGAGTG -3'；
SEQ ID NO.22: FAM-CATTGATGGAATAACTCTGTGGCATTATTGCA -BHQ1；
组合12：
SEQ ID NO.23: 5'-CCTTCTGAAAGAAACGAAAGCA -3'；
SEQ ID NO.32: 5'-CATGGCTGACGAGATCTGAGTG -3'；
SEQ ID NO.24: FAM-CAGGAACACTCATTTGTGCCATTGTGTTT -BHQ1；
组合13：
SEQ ID NO.25:5'-TAGACTCCCAATCGGCTGAAT -3'；
SEQ ID NO.32: 5'-CATGGCTGACGAGATCTGAGTG -3'；
SEQ ID NO.26: FAM-TCCTTGTGTCCTCAGTGGAGACATGCA -BHQ1；
组合14：
SEQ ID NO.27: 5'-ATGACTGGCTGCTGCTGCT -3'；
SEQ ID NO.32: 5'-CATGGCTGACGAGATCTGAGTG -3'；
SEQ ID NO.28: FAM-TCCGACTTTCCTTCTGCCCTCCTTC -BHQ1；
组合15：
SEQ ID NO.29: 5'-ACCTGAGGAGACGGTGACC -3'；
SEQ ID NO.30: 5'-CGGGAACCTCCTGGACTACC -3'；
SEQ ID NO.31: VIC-CAGCAGCACCACGGCGTTCACC -BHQ1。
较好地，上述引物探针组中，所述引物探针组中的探针的5’端有FAM或VIC修饰，及探针的3’端有NFQ-MGB或BHQ1修饰。
本发明还提供一种使用上述引物探针组的试剂盒。
较好地，所述试剂盒包括阳性对照液和空白对照液；所述阳性对照液中含有15种质粒DNA；所述空白对照为TE缓冲液；所述阳性对照液中加入有保护质粒作用的carrierRNA溶液，且所述carrier RNA溶液的终浓度为10~50ng/μL；以及所述15种质粒DNA分别含有14种不同的BCL2-IGH染色体易位基因和1种管家基因ABL1。
本发明还提供一种使用上述试剂盒进行不同BCL2-IGH染色体易位基因的检测方法，包括以下步骤：
获取待测样品基因组DNA；
利用试剂盒中引物探针组的BCL2-IGH特异性引物和BCL2-IGH特异性探针，以所述基因组DNA为模板，进行荧光PCR扩增，并收集荧光信号；
荧光信号收集结束后，导出数据结果并进行分析。
较好地，检测方法中，所述荧光PCR扩增中的反应体系中还包括组分为：TaqManFAST advance Master Mix和超纯水。
较好地，检测方法中，所述荧光PCR扩增中的反应体系，不同阶段的反应条件如下：
预处理：50℃下预处理2分钟；
预变性：95℃下预变性5分钟；
其中，所述预变性阶段还需要按照下述反应条件按照执行45个循环：
首先，95℃预变性15秒；
然后，60℃下预变性60秒。
由上述描述可知，与现有技术相比，本发明具备如下优点：
1、本发明的检测方法是基于TaqMan®探针PCR技术来实现的，具有很高的特异性以及检测灵敏度。
2、本发明的检测方法通过合理的引物和探针搭配，如，15种如SEQ ID NO.1至SEQID NO.32所示组合，可以有效避免引物与引物之间、引物与探针之间，以及探针与探针之间的相互作用，从而提高了BCL2-IGH染色体易位检测的特异性，大大降低了假阳性，从而减少了检测误差。
3、本发明针对不同的BCL2-IGH染色体易位形式，分别提供了重组质粒DNA样本作为阳性对照，使BCL2-IGH染色体易位的荧光分析更为精准。
附图说明
图1a、1b为实施例1中采用30例健康人的基因组DNA样本确认本发明BCL2-IGH染色体易位组合1检测体系空白限扩增曲线结果图；
图2为实施例3中采用重组质粒DNA检测BCL2-IGH染色体14种易位验证本发明检测体系重复性的数据汇总图；
图3为实施例3中采用重组质粒DNA检测BCL2-IGH染色体易位组合1验证本发明检测体系重复性的扩增曲线结果图；
图4为实施例4中采用重组质粒DNA检测BCL2-IGH染色体易位验证本发明检测体系灵敏度的检出限数据汇总图；
图5a、5b、5c为实施例4中采用重组质粒DNA检测BCL2-IGH染色体易位组合1验证本发明检测体系灵敏度的扩增曲线结果图；
图6为实施例5中采用人类临床基因组DNA样本检测BCL2-IGH染色体易位的结果图；
图7为实施例6中采用阳性重组质粒DNA检测BCL2-IGH染色体14种易位形式以及内参基因ABL1的结果图。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的较佳实施例作进一步详细说明。
本发提供了一种用于检测BCL2-IGH染色体易位的引物探针组，其由核苷酸如SEQID NO.1至 SEQ ID NO.32所示的BCL2-IGH特异性引物和BCL2-IGH特异性探针组合。又由于BCL2-IGH融合形式的多样化，可以组合成15组，其中14组（即组合1-14）引物探针组合用于检测BCL2-IGH染色体易位，而另一组，即组合15用于检测内参基因ABL1。
发明所设计的BCL2-IGH特异性引物Tm值均在58℃附近，可以整合搭配各个组合中的引物，从而尽量避免了各引物之间二聚体的产生；同时BCL2-IGH染色体易位检测选用的探针Tm值均在68℃附近，避免了探针与其他非特异性探针序列之间的结合，同时也避免了探针与引物相互之间形成复杂的二聚体，进而可以保证BCL2-IGH染色体易位中DNA的PCR扩增特异性和扩增效率。
较好地，一实施例中，所述引物探针组中的探针（即荧光定量PCR探针）的5’端有FAM或VIC修饰，及荧光定量PCR探针的3’端有NFQ-MGB或BHQ1修饰。
TaqMan PCR技术是实时荧光PCR的一种，与传统的PCR相对比，其在反应体系中增加了一条两端分别标记荧光报告基团和淬灭基团的探针。探针结构完整时，荧光报告基团发出的荧光的能量转移给淬灭基团，呈现淬灭效应。如果扩增过程中有靶序列的存在，扩增的过程中探针分子逐渐被水解切断，荧光报告基团与淬灭基团相互解离，阻断了二者间荧光共振能量转移效应，荧光报告基团发出荧光信号。随着扩增的进行，荧光信号随着目的片段的扩增而呈现线性增强。
针对上述引物探针组，本发明还提供一种试剂盒，用于检测BCL2-IGH染色体易位；该试剂盒中包含有上述引物探针组，具有检测灵敏度高的优势。
所述试剂盒中，还包括阳性对照液和空白对照液。阳性对照液中含有15种质粒DNA，可以保证融合阳性质粒稳定性的配方；所述阳性对照液中加入有保护质粒作用的carrier RNA溶液，且所述carrier RNA溶液的终浓度为10~50 ng/μL，以及15种质粒DNA分别含有14种不同的BCL2-IGH染色体易位基因和1种管家基因ABL1，分别对应于上述15组基因多态性组合。所述空白对照为TE缓冲液；其中，所述carrier RNA溶液的终浓度优选31ng/μL。
本发明还提供一种使用上述试剂盒进行不同BCL2-IGH染色体易位基因的检测方法，包括步骤：
S1、获取待测样品基因组DNA；
S2、利用试剂盒中引物探针组的BCL2-IGH特异性引物和BCL2-IGH特异性探针，以步骤S1中的基因组DNA为模板，进行荧光 PCR扩增，并收集荧光信号；
S3、步骤S2中的荧光信号收集结束后，将数据结果从软件7500 Software v2.3中导出进行分析。
对于步骤S2中，荧光PCR扩增反应体系为20μL总反应体系，其中包括10μL的TaqManFAST advance Master Mix，上游引物和下游引物各600nM，探针400nM，100ng~1μg的基因组DNA，其余用ddH2O补齐。
其中，荧光PCR扩增中的反应体系中，不同阶段的反应条件如下：
预处理：50℃下预处理2分钟；
预变性：95℃下预变性5分钟，且，所述预变性阶段还需要按照下述反应条件按照执行45个循环：
首先，95℃预变性15秒；
然后，60℃下预变性60秒，用于收集荧光信号。
BCL2-IGH染色体易位基因的检测时，荧光PCR扩增反应体系中，BCL2-IGH特异性引物用于扩增DNA样本的目标基因区域，而BCL2-IGH特异性探针结合于目标基因，在扩增过程中逐渐被水解，然后释放荧光信号。探针作为一线性的寡核苷酸，两端分别标记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，荧光监测系统检测不到荧光信号，PCR扩增过程中，探针被切断，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可检测到荧光信号。
另外，探针的位置尽可能地靠近对应目标基因区域的上游引物，在PCR反应过程中，利用高温使待测样本中的DNA模板变性为单链，降低温度进行退火，引物与目标区域的DNA模板结合；同时，探针也会与目标区域的DNA模板结合，最后通过聚合酶的作用，由引物开始沿着DNA链合成互补链，从而扩增目标区域，扩增过程中，扩增产物不断延伸，聚合酶将与DNA模板结合的探针水解，释放出对应的荧光信号。
下面通过实施例对本发明作进一步的详细说明，旨在用于说明本发明而非限定本发明。
实施例1：采用30例健康人的基因组DNA样本确认本发明检测体系空白限。
本实施例采用30例健康人的基因组DNA样本来确认验证本发明检测方法的空白限。
具体检测方法如下：
采用本说明书已说明的PCR反应体系和反应条件，选取30例健康人基因组样本，浓度介于40ng/μL~100ng/μL，批内和批间各重复一次检测，每个易位形式检测体系产生120个反应，确认每个检测体系的阈值线以及空白限ct值，空白限ct值计算公式如下：健康人样本检测ct值平均值+三倍的标准差值；例如：BCL2-IGH染色体易位组合1检测体系最终确认阈值线为0.5，空白限ct值为37.7，BCL2-IGH染色体易位组合1检测的扩增曲线结果，如图1a和1b所示；其中，标识①代表的是阳性质粒样本扩增曲线，标识②代表的是健康人样本扩增曲线。采用30例健康人的基因组DNA样本确认本发明BCL2-IGH染色体14种易位检测体系空白限结果汇总如下：设置组合1，2，3，8的检测体系阈值线为0.5，空白限ct值分别为37.7，39.6，42.24，41.44，其余10种组合检测体系阈值线为0.2，空白限ct值均大于45。
由此可见，14种BCL2-IGH染色体易位形式检测体系能特异性的扩增相应重组质粒DNA阳性样本，且为每种检测体系设置了阈值线和空白限ct值，有效避免假阳性的发生。
实施例2：采用重组质粒DNA确认BCL2-IGH染色体14种易位形式以及内参基因ABL1的标准曲线方程。
本实施例采用重组质粒DNA样本，以其为模板进行RT-PCR荧光检测，质粒拷贝数通过数字PCR定量获得。
具体检测方法如下：
利用高拷贝融合基因阳性质粒10倍梯度稀释，31ng/μL的carrier RNA溶液作为稀释基质，依照qPCR体系与扩增步骤进行检测，获取对应融合基因的扩增效率；选取10倍稀释后的中低拷贝质粒DNA样本通过数字PCR方法进行定量，获取高拷贝融合基因阳性质粒的绝对拷贝数，将拷贝数输入软件7500 Software v2.3中，仪器自动获取BCL2-IGH染色体14种易位形式以及内参基因ABL1的标准曲线方程，主要包括PCR扩增效率，截距，斜率以及R2值，最终利用标准曲线方程计算公式如下：
待测融合基因拷贝数=10e；
其中，e=（待测融合基因ct值-截距）/斜率，且标准曲线方程数据如下：组合1扩增效率为97%，截距为37.627，斜率为-3.4，R2值为0.999；组合2扩增效率为95%，截距为37.229，斜率为-3.441，R2值为0.999；组合3扩增效率为98%，截距为37.18，斜率为-3.364，R2值为0.999；组合4扩增效率为92%，截距为38.355，斜率为-3.523，R2值为0.999；组合5扩增效率为97%，截距为35.698，斜率为-3.398，R2值为0.999；组合6扩增效率为101%，截距为36.456，斜率为-3.306，R2值为0.999；组合7扩增效率为98%，截距为37.894，斜率为-3.365，R2值为0.998；组合8扩增效率为97%，截距为37.696，斜率为-3.398，R2值为0.998；组合9扩增效率为94%，截距为38.371，斜率为-3.478，R2值为0.999；组合10扩增效率为100%，截距为37.295，斜率为-3.315，R2值为0.998；组合11扩增效率为97%，截距为36.555，斜率为-3.396，R2值为0.999；组合12扩增效率为93%，截距为36.671，斜率为-3.511，R2值为0.999；组合13扩增效率为97%，截距为35.981，斜率为-3.399，R2值为1；组合14扩增效率为97%，截距为36.289，斜率为-3.397，R2值为0.999；组合15扩增效率为100%，截距为36.854，斜率为-3.31，R2值为0.999。
实施例3：采用重组质粒DNA检测BCL2-IGH染色体易位验证本发明检测体系重复性。
本实施例同样以重组质粒DNA样本为模板来验证本发明检测体系的精密度。
具体检测方法如下：
利用合成的融合基因阳性质粒样本，构建高拷贝阳性(10^6 copies/mL)、中拷贝(10^4 copies/mL)和低拷贝数(10^3 copies/mL)三个浓度的参考品，质粒拷贝数经构建好的荧光PCR标准曲线方程定量获得。每个样本做20次重复，分4个批次做完，每种融合基因检测60个反应。计算批间CV值，结果显示融合基因批间检测结果CV值均小于3%，BCL2-IGH染色体易位组合1-14检测体系重复性确认数据汇总，如附图2所示。例如：BCL2-IGH染色体易位组合1检测体系三种浓度阳性质粒样本的扩增曲线结果参见说明书附图3，其中，标识④表示的是高拷贝阳性(10^6 copies/mL)质粒样本扩增曲线，标识⑤表示的是中拷贝阳性(10^4 copies/mL)样本扩增曲线，标识⑥表示的是低拷贝阳性(10^3 copies/mL)样本扩增曲线。
实施例4：采用重组质粒DNA检测BCL2-IGH染色体易位确认本发明检测体系灵敏度的检出限。
本实施例同样以重组质粒DNA样本为模板来确认本发明检测体系的灵敏度。
具体检测方法如下：
选取上述精密度实验低拷贝数（10^3 copies/mL）浓度的参考品，3倍梯度稀释两次，构建三种浓度的样本。每个样本做20次重复，每种融合基因检测60个反应。选取融合基因检出率均≥95%的样本浓度作为该融合检测体系的最低检测浓度（最低检测限），BCL2-IGH染色体易位组合1-14检测体系灵敏度确认数据汇总如图4所示，BCL2-IGH染色体易位组合1-14检测体系灵敏度的检测最低数据值如下：组合9检测体系的最低检测限为1000copies/mL，其余13种组合的最低检测限均为500copies/mL。例如：BCL2-IGH染色体易位组合1检测体系三种浓度阳性质粒样本的扩增曲线结果，如图5a、5b、5c所示，其中，标识⑦表示的是低拷贝阳性(10^3 copies/mL)质粒样本扩增曲线，标识⑧表示的是稀释3倍后的质粒样本扩增曲线，标识⑨表示的是稀释9倍后的质粒样本扩增曲线。
实施例5：采用人类临床基因组DNA样本检测BCL2-IGH染色体易位。
本实施例以人类临床基因组DNA样本为模板，按照本发明的检测体系进行BCL2-IGH染色体易位检测。
本实施例采用本说明书已说明的PCR反应体系和反应条件，具体的操作方法与本发明其它实施例相同，但模板为人类临床基因组DNA样本，BCL2-IGH染色体易位检测结果，如图6所示，其中，标识i表示的是内参基因ABL1扩增曲线，标识ii表示的是BCL2-IGH染色体易位组合1扩增曲线，根据标准曲线方程换算BCL2-IGH染色体易位组合1阳性拷贝为535copies/mL，内参基因ABL1拷贝数为1559094 copies/mL，易位占比0.034%，易位占比是融合基因阳性拷贝数与内参基因ABL1拷贝数的比值。
实施例6：采用阳性重组质粒DNA检测BCL2-IGH染色体14种易位形式以及内参基因ABL1。
本实施例以构建的阳性对照品为模板，按照本发明的检测体系进行BCL2-IGH染色体14种易位形式以及内参基因ABL1检测。
本实施例采用本说明书已说明的PCR反应体系和反应条件，具体的操作方法与本发明其它实施例相同，但模板为构建的阳性对照品样本，BCL2-IGH染色体易位检测结果，如图7所示，其中，标识iii表示的是内参基因ABL1扩增曲线，其余曲线为BCL2-IGH染色体易位组合1~14扩增曲线。
以上结果表明，本发明的BCL2-IGH染色体易位荧光PCR检测体系可以精准可靠地对BCL2-IGH染色体14种易位形式进行快速检测。并且与其它检测方法相比，本发明的荧光PCR定量检测体系具有较高的灵敏度、特异性与准确性，检测工序简单，大大缩短了检测时间，节省了大量人力、物力与精力，提供了一种更加全新快速简便的检测BCL2-IGH染色体易位的技术，具有广泛的临床应用价值。
应当理解的是，上述针对本发明较佳实施例的表述较为详细，并不能因此而认为是对本发明专利保护范围的限制，本发明的专利保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 深圳荻硕贝肯精准医学有限公司
上海荻硕贝肯医学检验所有限公司
上海荻硕贝肯生物科技有限公司
上海荻硕贝肯基因科技有限公司
<120> 一种用于检测BCL2-IGH染色体易位的引物探针组、试剂盒及检测方法
<141> 2021-10-21
<160> 32
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificaial Sequence
<400> 1
tgacctttag agagttgctt tacg 24
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificaial Sequence
<400> 2
ctgtttcaac acagacccac ccagag 26
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificaial Sequence
<400> 3
ggagaattgc ttgaacccaa t 21
<210> 4
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificaial Sequence
<400> 4
cacaccattg tactcc 16
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificaial Sequence
<400> 5
aatctgacgt tcagtcattt ctga 24
<210> 6
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificaial Sequence
<400> 6
ccagagagct attcaat 17
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificaial Sequence
<400> 7
aatggagctg gaacaactgg 20
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificaial Sequence
<400> 8
atggatcaga aatgaatgcc atctcaaatc 30
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificaial Sequence
<400> 9
cctggcttcc ttccctctgt 20
<210> 10
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificaial Sequence
<400> 10
tctctgggga ggagtggaaa ggaagg 26
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificaial Sequence
<400> 11
gcacctgctg gatacaacac tg 22
<210> 12
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificaial Sequence
<400> 12
atgcatacta ccttttgctc tcaaaccttt caag 34
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificaial Sequence
<400> 13
catgtagggt attgagtatc atgcc 25
<210> 14
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificaial Sequence
<400> 14
tatggtattt cgattccaat ggatatcgtt tgaa 34
<210> 15
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificaial Sequence
<400> 15
gcatcttaac tgctctttat gaatgaa 27
<210> 16
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificaial Sequence
<400> 16
cagtcctctg tatgtactcc tctttacact ggcc 34
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificaial Sequence
<400> 17
aagcagatac tacccagcgg ag 22
<210> 18
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificaial Sequence
<400> 18
aattaatctt tctgtcagca ccaaggaaac aagtaa 36
<210> 19
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificaial Sequence
<400> 19
aatctcagcc ctacaccatc cta 23
<210> 20
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificaial Sequence
<400> 20
tcctccattt ggacatattt cacatagcaa cat 33
<210> 21
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificaial Sequence
<400> 21
tcttccagtt tagaatcagc cttg 24
<210> 22
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificaial Sequence
<400> 22
cattgatgga ataactctgt ggcattattg ca 32
<210> 23
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificaial Sequence
<400> 23
ccttctgaaa gaaacgaaag ca 22
<210> 24
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificaial Sequence
<400> 24
caggaacact catttgtgcc attgtgttt 29
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificaial Sequence
<400> 25
tagactccca atcggctgaa t 21
<210> 26
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificaial Sequence
<400> 26
tccttgtgtc ctcagtggag acatgca 27
<210> 27
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificaial Sequence
<400> 27
atgactggct gctgctgct 19
<210> 28
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificaial Sequence
<400> 28
tccgactttc cttctgccct ccttc 25
<210> 29
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificaial Sequence
<400> 29
acctgaggag acggtgacc 19
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificaial Sequence
<400> 30
cgggaacctc ctggactacc 20
<210> 31
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificaial Sequence
<400> 31
cagcagcacc acggcgttca cc 22
<210> 32
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificaial Sequence
<400> 32
catggctgac gagatctgag tg 22

Claims (10)

1.一种用于检测BCL2-IGH染色体易位的引物探针组，其特征在于，包括核苷酸如SEQID NO.1至 SEQ ID NO.32所示的BCL2-IGH特异性引物和BCL2-IGH特异性探针组；该引物探针组中含有14种不同的BCL2-IGH染色体易位基因和1种管家基因ABL1；所述引物探针组中的探针的5’端有FAM或VIC修饰，及探针的3’端有NFQ-MGB或BHQ1修饰。
2.根据权利要求1所述的引物探针组，其特征在于，所述SEQ ID NO.1至 SEQ ID NO.32所示的引物探针组包括如下组合：
组合1：
SEQ ID NO.1:5'-TGACCTTTAGAGAGTTGCTTTACG-3'；
SEQ ID NO.32: 5'-CATGGCTGACGAGATCTGAGTG -3'；
SEQ ID NO.2: FAM-CTGTTTCAACACAGACCCACCCAGAG-BHQ1；
组合2：
SEQ ID NO.3: 5'-GGAGAATTGCTTGAACCCAAT-3'；
SEQ ID NO.32: 5'-CATGGCTGACGAGATCTGAGTG -3'；
SEQ ID NO.4: FAM-CACACCATTGTACTCC-MGB；
组合3：
SEQ ID NO.5:5'-AATCTGACGTTCAGTCATTTCTGA-3'；
SEQ ID NO.32: 5'-CATGGCTGACGAGATCTGAGTG -3'；
SEQ ID NO.6: FAM-CCAGAGAGCTATTCAAT- MGB；
组合4：
SEQ ID NO.7: 5'-AATGGAGCTGGAACAACTGG-3'；
SEQ ID NO.32: 5'-CATGGCTGACGAGATCTGAGTG -3'；
SEQ ID NO.8: FAM-ATGGATCAGAAATGAATGCCATCTCAAATC-BHQ1；
组合5：
SEQ ID NO.9:5'-CCTGGCTTCCTTCCCTCTGT-3'；
SEQ ID NO.32: 5'-CATGGCTGACGAGATCTGAGTG -3'；
SEQ ID NO.10: FAM-TCTCTGGGGAGGAGTGGAAAGGAAGG-BHQ1；
组合6：
SEQ ID NO.11: 5'-GCACCTGCTGGATACAACACTG -3'；
SEQ ID NO.32: 5'-CATGGCTGACGAGATCTGAGTG -3'；
SEQ ID NO.12: FAM-ATGCATACTACCTTTTGCTCTCAAACCTTTCAAG-BHQ1；
组合7：
SEQ ID NO.13:5'-CATGTAGGGTATTGAGTATCATGCC -3'；
SEQ ID NO.32: 5'-CATGGCTGACGAGATCTGAGTG -3'；
SEQ ID NO.14: FAM-TATGGTATTTCGATTCCAATGGATATCGTTTGAA -BHQ1；
组合8：
SEQ ID NO.15: 5'-GCATCTTAACTGCTCTTTATGAATGAA -3'；
SEQ ID NO.32: 5'-CATGGCTGACGAGATCTGAGTG -3'；
SEQ ID NO.16:FAM-CAGTCCTCTGTATGTACTCCTCTTTACACTGGCC -BHQ1；
组合9：
SEQ ID NO.17:5'-AAGCAGATACTACCCAGCGGAG -3'；
SEQ ID NO.32: 5'-CATGGCTGACGAGATCTGAGTG -3'；
SEQ ID NO.18: FAM-AATTAATCTTTCTGTCAGCACCAAGGAAACAAGTAA -BHQ1；
组合10：
SEQ ID NO.19: 5'-AATCTCAGCCCTACACCATCCTA -3'；
SEQ ID NO.32: 5'-CATGGCTGACGAGATCTGAGTG -3'；
SEQ ID NO.20: FAM-TCCTCCATTTGGACATATTTCACATAGCAACAT -BHQ1；
组合11：
SEQ ID NO.21:5'-TCTTCCAGTTTAGAATCAGCCTTG -3'；
SEQ ID NO.32: 5'-CATGGCTGACGAGATCTGAGTG -3'；
SEQ ID NO.22: FAM-CATTGATGGAATAACTCTGTGGCATTATTGCA -BHQ1；
组合12：
SEQ ID NO.23: 5'-CCTTCTGAAAGAAACGAAAGCA -3'；
SEQ ID NO.32: 5'-CATGGCTGACGAGATCTGAGTG -3'；
SEQ ID NO.24: FAM-CAGGAACACTCATTTGTGCCATTGTGTTT -BHQ1；
组合13：
SEQ ID NO.25:5'-TAGACTCCCAATCGGCTGAAT -3'；
SEQ ID NO.32: 5'-CATGGCTGACGAGATCTGAGTG -3'；
SEQ ID NO.26: FAM-TCCTTGTGTCCTCAGTGGAGACATGCA -BHQ1；
组合14：
SEQ ID NO.27: 5'-ATGACTGGCTGCTGCTGCT -3'；
SEQ ID NO.32: 5'-CATGGCTGACGAGATCTGAGTG -3'；
SEQ ID NO.28: FAM-TCCGACTTTCCTTCTGCCCTCCTTC -BHQ1；
组合15：
SEQ ID NO.29: 5'-ACCTGAGGAGACGGTGACC -3'；
SEQ ID NO.30: 5'-CGGGAACCTCCTGGACTACC -3'；
SEQ ID NO.31: VIC-CAGCAGCACCACGGCGTTCACC -BHQ1。
3.一种试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括权利要求1和2任一所述的引物探针组。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括阳性对照液和空白对照液；所述阳性对照液中含有15种质粒DNA；所述空白对照为TE缓冲液。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照液中加入有保护质粒作用的carrier RNA溶液，且所述carrier RNA溶液的终浓度为10~50ng/μL。
6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述15种质粒DNA分别含有14种不同的BCL2-IGH染色体易位基因和1种管家基因ABL1。
7.一种非诊断目的的不同BCL2-IGH染色体易位基因的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
获取待测样品基因组DNA；
利用试剂盒中引物探针组的BCL2-IGH特异性引物和BCL2-IGH特异性探针，以所述基因组DNA为模板，进行荧光PCR扩增，并收集荧光信号；
荧光信号收集结束后，导出数据结果并进行分析。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述荧光PCR扩增中的反应体系中还包括TaqMan FAST advance Master Mix和超纯水。
9.根据权利要求7或8所述的检测方法，其特征在于，所述荧光PCR扩增中的反应体系，不同阶段的反应条件如下：
预处理：50℃下预处理2分钟；
预变性：95℃下预变性5分钟。
10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，所述预变性阶段还需要按照下述反应条件按照执行45个循环：
首先，95℃预变性15秒；
然后60℃下预变性60秒。
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Denomination of invention: A primer probe set, reagent kit, and detection method for detecting BCL2-IGH chromosomal translocation

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