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CN114457165A - 一种用于检测hla-a02基因的引物探针组、试剂盒及检测方法 - Google Patents

一种用于检测hla-a02基因的引物探针组、试剂盒及检测方法 Download PDF

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CN114457165A
CN114457165A CN202210382857.9A CN202210382857A CN114457165A CN 114457165 A CN114457165 A CN 114457165A CN 202210382857 A CN202210382857 A CN 202210382857A CN 114457165 A CN114457165 A CN 114457165A
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hla
primer
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gene
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郑仲征
杜可明
徐祥
王思谕
袁志阳
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Original Assignee
Shenzhen Tissuebank Precision Medicine Co ltd
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Abstract

本发明公开了一种用于检测HLA‑A02基因的引物探针组、试剂盒及检测方法；其中，引物探针组包括核苷酸如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.6所示的HLA‑A02特异性引物和HLA‑A02特异性探针；HLA‑A02基因的检测方法是采用试剂盒检测HLA‑A02，基于TaqMan®探针PCR技术来实现的，具有很高的特异性；同时，该方法通过合理的引物和探针搭配，有效避免引物与引物之间、引物与探针之间，以及探针与探针之间的相互作用，提高了HLA‑A02检测的特异性，有效避免了假阳性。

Description

一种用于检测HLA-A02基因的引物探针组、试剂盒及检测方法
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种用于检测HLA-A02基因的引物探针组、试剂盒及检测方法。
背景技术
癌症免疫疗法利用免疫系统来对抗癌症。尽管免疫疗法几十年来一直是癌症治疗的重要组成部分，但直到最近十年才引起关注，尤其在因发现细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白（CTLA-4)和程序性细胞死亡蛋白-1/程序性细胞死亡蛋白配体-1(PD-1/PD-L1)而被授予诺贝尔生理学和医学奖之后。如今免疫检查点抑制剂被用于治疗各种癌症，包括晚期非小细胞肺癌（NSCLC）、黑色素瘤和肾细胞癌的一线治疗。除了免疫检查点抑制剂，过继细胞疗法和肿瘤疫苗也是常见的癌症免疫疗法。这些癌症免疫疗法的基本机制是T细胞通过识别由肿瘤细胞膜上的主要组织相容性复合物(MHC)呈递的肿瘤抗原来发挥免疫功能。MHC是一组几乎在所有脊椎动物中都表达的多态性基因，它决定了不同个体之间的组织相容性。由于基因不同的小鼠之间的肿瘤排斥，MHC在20世纪的第一个十年中首次被发现。人类MHC也称为人类白细胞抗原(HLA)。HLAⅠ类分子在包括人类肿瘤细胞在内的大多数细胞类型上表达，将内源性抗原呈递给免疫系统。HLAⅡ类分子主要由抗原呈递细胞(APC)表达，将外源性抗原呈递给T辅助细胞。HLAⅠ类和Ⅱ类分子都表现出高度的多态性，这意味着它们在人群中具有许多不同的等位基因。这就是为什么供体和受体之间的HLA不匹配是移植排斥反应的主要原因。根据IMGT/HLA数据库，超过12,000个等位基因被鉴定为HLAⅠ类基因。在进化上，HLA分子的多样性确保了免疫系统能够识别尽可能多的抗原，并帮助我们防御各种病原体。有趣的是，在研究HLAⅠ类差异对免疫检查点抑制剂治疗癌症疗效的影响时，Chowell等人发现HLAⅠ类基因型的更大序列差异与自身、肿瘤和病毒免疫肽组的更高多样性有关。此外，与低HLAⅠ类差异的患者相比，具有高HLAⅠ类差异的患者对免疫检查点抑制剂的反应更好。这些发现表明，HLA多态性对我们对抗癌症至关重要。
CD8+ T细胞（通常称为细胞毒性 T 淋巴细胞或CTL）是针对肿瘤的适应性免疫系统的重要组成部分。大多数细胞毒性T细胞表达可以识别特定抗原的T细胞受体(TCR)。TCR与肿瘤细胞表达的肽-HLA复合物结合后，CTL被激活，在肿瘤部位聚集，释放效应子攻击肿瘤细胞。CTL通过两个主要途径对肿瘤细胞发挥特异性杀伤作用：（一）释放细胞毒物质如穿孔素、颗粒酶和细胞因子来杀死肿瘤细胞；(二)激活死亡受体通路，如T细胞表面表达的FasL，与肿瘤细胞表面的死亡受体Fas结合，启动凋亡相关信号，导致肿瘤细胞凋亡。最近在慢病毒等基因工程技术的帮助下，将识别肿瘤抗原的特异性TCR插入到大量T细胞的基因组中，这使得为每个人生产抗原特异性T细胞成为可能。因此TCR工程T细胞(TCR-T)被认为是一种更有希望的癌症患者治疗方法。TCR识别的肽-HLA复合物称为T细胞表位。已在临床试验中鉴定出数量非常有限的T细胞表位并用于免疫治疗，大多数已知肽受HLA-A02，HLA-A02等抗原限制，因此检测患者HLA-A02对提高癌症治疗效果有重要意义。
HLA目前的分型方法主要有3类：血清学、细胞学和分子生物学分型法。其中血清学和细胞学分型法，由于高特异性的抗体和特异的细胞获取困难，且操作繁琐，因此目前很少使用。随着分子生物学技术的发展，建立在DNA分子水平上的快速准确的HLA基因分型已逐步取代传统的血清学分型方法。分子生物学分型方法主要有聚合酶链反应-等位基因组特异性引物(PCR-SSP)、聚合酶链反应-序列特异寡核苷酸探针(PCR-SSO)、聚合酶反应-直接测序法(PCR-SBT)以及荧光定量PCR（qPCR）。其中PCR-SBT可以直接对HLA基因型的序列进行测定，分辨率高，能直接发现新的等位基因，但是由于杂合子的存在，需将同源染色体分离后才能得到各个单元型的准确结果，增加了操作的复杂性，检测成本也相应较高；PCR-SSP和PCR-SSO属于低分辨HLA分型方法，其中PCR-SSP法通过几对特异性引物扩增DNA并通过电泳结果来分析，污染风险大，周期长，不适合临床应用目前临床上应用；现行的荧光PCR检测方法，其主要优点有（1）闭管操作、封闭状态检测，减少了模板污染和假阳性的可能；（2）无需对PCR产物进行后处理，操作更简便快速；（3）灵敏度高，可以检测单拷贝基因；（4）特异性高，荧光PCR可通过Taqman探针与靶序列特异性的结合，特异性的检测目的基因。
当前检测HLA-A02的方法还无法满足高效、精准、简便等要求，对于大量样本的检测时间冗长繁琐，所以亟需一种快速、有效、精准且适用于大批量样本检测HLA-A02的方法。
发明内容
本发明针对现有技术中存在的上述缺陷，基于最新的科研动态和临床应用，设计了用于检测HLA-A02的引物探针组、试剂盒及检测方法。本发明的检测方法简便快速、精准有效、结果简单易辨别且适用于大批量样本的检测。
本发明的技术方案如下：
一种用于检测HLA-A02基因的引物探针组，包括核苷酸如SEQ ID NO.1至 SEQ IDNO.6所示的引物探针组，且该所述引物探针组包括HLA-A02特异性引物和探针；其中，所述SEQ ID NO.1至 SEQ ID NO.6所示的引物探针组包括如下：
上游引物SEQ ID NO.1:5'-TCCTCGTCCCCAGGCACT-3'；
下游引物SEQ ID NO.2: 5'-GAACTGCGTGTCGTCCACG-3'；
上游引物SEQ ID NO.3: 5'-CGGGAACCTCCTGGACTACC-3'；
下游引物SEQ ID NO.4: 5'-CATGGCTGACGAGATCTGAGTG-3'；
探针SEQ ID NO.5: FAM-CCGCTTCATCGCAGTG-MGB；
探针SEQ ID NO.6: VIC-CAGCAGCACCACGGCGTTCACC-BHQ1。
较好地，上述引物探针组中，引物探针组中含有HLA-A02基因和ABL1管家基因。
较好地，上述引物探针组中，所述引物探针组中，荧光定量PCR探针的5’端有FAM或VIC修饰及荧光定量PCR探针的3’端有NFQ-MGB或BHQ1修饰。
本发明还提供一种使用上述引物探针组的试剂盒。
较好地，所述试剂盒包括阳性対照液和空白对照液；所述阳性対照液中含有质粒DNA；所述空白对照为TE缓冲液；所述阳性対照液中加入有保护质粒DNA作用的carrier RNA溶液，且所述carrier RNA溶液的终浓度为10~50ng/μL；以及所述质粒DNA含有HLA-A02基因和ABL1管家基因片段序列。
本发明还提供上述试剂盒在检测HLA-A02基因方面非诊断目的上的应用。
本发明还提供一种使用上述试剂盒进行不同HLA-A02基因的检测方法，用于非疾病诊断目的，包括步骤：
获取待测样本基因组DNA，稀释DNA至1ng/μL~5ng/μL；
在同一荧光PCR扩增的反应体系中，将待测样本基因组DNA与核苷酸如SEQ IDNO.1至 SEQ ID NO.6所示的引物探针组的HLA-A02特异性引物和HLA-A02特异性探针按照确定比例进行混合；以所述待测样本基因组DNA为模板，进行荧光PCR扩增，并收集荧光信号；
荧光信号收集结束后，导出数据结果并进行分析：
其中，所述核苷酸如SEQ ID NO.1至 SEQ ID NO.6所示的引物探针组如下：
上游引物SEQ ID NO.1:5'-TCCTCGTCCCCAGGCACT-3'；
下游引物SEQ ID NO.2: 5'-GAACTGCGTGTCGTCCACG-3'；
上游引物SEQ ID NO.3: 5'-CGGGAACCTCCTGGACTACC-3'；
下游引物SEQ ID NO.4: 5'-CATGGCTGACGAGATCTGAGTG-3'；
探针SEQ ID NO.5: FAM-CCGCTTCATCGCAGTG-MGB；
探针SEQ ID NO.6: VIC-CAGCAGCACCACGGCGTTCACC-BHQ1。
较好地，检测方法中，所述荧光PCR扩增中的反应体系中，还包括组分TaqMan FASTadvance Master Mix和超纯水；其中，包括5μL的TaqMan FAST advance Master Mix，上游引物SEQ ID NO.1和下游引物SEQ ID NO.2各400nM，上游引物SEQ ID NO.3和下游引物SEQID NO.4各300nM，探针SEQ ID NO.5和探针SEQ ID NO.6各200nM，1ng~20ng的基因组DNA，其余用超纯水补齐。
较好地，检测方法中，所述荧光PCR扩增中的反应体系，不同阶段的反应条件如下：
预处理：50℃下预处理2分钟；
预变性：95℃下预变性5分钟；
所述预变性阶段还需要按照下述反应条件执行10个循环：
降落PCR：首先，95℃预变性15秒；其次，65℃起，每隔一个循环降低0.5℃进行退火10秒；最后，72℃下延伸20秒；
所述降落PCR阶段后还需要按照下述反应条件执行30个循环：
首先，95℃预变性15秒；
然后，60℃下退火30秒。
由上述描述可知，与现有技术相比，本发明具备如下优点：
1、基于TaqMan®探针的PCR技术来实现的，具有很高的特异性以及检测灵敏度；
2、通过合理的引物和探针搭配，可以有效避免引物与引物之间、引物与引物之间，以及探针与探针之间的相互作用，从而提高了HLA-A02基因检测的特异性，大大降低了假阳性，从而减少了检测误差；
3、对HLA-A02基因检测中，提供了重组质粒DNA样本作为阳性对照，使HLA-A02基因的荧光分析更为精准。
附图说明
图1为本发明的试剂盒进行HLA-A02基因的检测方法工艺流程图；
图2实施例1中HLA-A02等位基因携带者样本试剂盒检测图；
图3为实施例1中HLA-A02等位基因未携带者样本试剂盒检测图；
图4为实施例2中阳性对照液样本试剂盒检测图；
图5为实施例2中阴性对照液样本试剂盒检测图。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的较佳实施例作进一步详细说明。
本发明提供了一种用于检测HLA-A02的引物探针组，其由核苷酸如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.6所示的HLA-A02特异性引物和探针组合；其中，所述核苷酸如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.6所示的引物探针组如下：
上游引物SEQ ID NO.1:5'-TCCTCGTCCCCAGGCACT-3'；
下游引物SEQ ID NO.2: 5'-GAACTGCGTGTCGTCCACG-3'；
上游引物SEQ ID NO.3: 5'-CGGGAACCTCCTGGACTACC-3'；
下游引物SEQ ID NO.4: 5'-CATGGCTGACGAGATCTGAGTG-3'；
探针SEQ ID NO.5: FAM-CCGCTTCATCGCAGTG-MGB；
探针SEQ ID NO.6: VIC-CAGCAGCACCACGGCGTTCACC-BHQ1。
本发明所设计的HLA-A02特异性引物Tm值均在58℃附近，可以整合搭配组合中的引物，从而尽量避免了各引物之间二聚体的产生；同时HLA-A02检测选用MGB探针，使得Tm值均在68℃附近，避免了探针与其他非特异性探针序列之间的结合，同时也避免了探针相互之间形成复杂的二聚体，进而可以提高HLA-A02中DNA的PCR扩增特异性。
较好地，一实施例中，所述引物探针组中的荧光定量PCR探针的5’端有FAM或VIC修饰，用以指示相应基因的扩增情况（FAM，A02；VIC，ABL1），以及荧光定量PCR探针的3’端有NFQ-MGB或BHQ1修饰，用以在无扩增反应的情况下，淬灭5’端的荧光基团。TaqMan PCR技术是实时荧光PCR的一种。与传统的PCR相对比，其在反应体系中增加了一条两端分别标记荧光报告基团和淬灭基团的探针。探针结构完整时，荧光报告基团发出的荧光的能量转移给淬灭基团，呈现淬灭效应。如果扩增过程中有靶序列的存在，扩增的过程中探针分子逐渐被水解切断，荧光报告基团与淬灭基团相互解离，阻断了二者间荧光共振能量转移效应，荧光报告基团发出荧光信号。随着扩增的进行，荧光信号随着目的片段的扩增而呈现线性增强。
针对上述引物探针组，本发明还提供一种试剂盒，用于检测HLA-A02等位基因；该试剂盒中包含有上述引物探针组，具有检测时间短，灵敏度高的优势。
所述试剂盒中，还包括阳性対照液和空白对照液。阳性対照液中含有质粒DNA和可以保证阳性质粒稳定性的配方；所述阳性対照液中加入有保护质粒DNA作用的carrier RNA溶液，且所述carrier RNA溶液的终浓度为10~50ng/μL，以及质粒DNA含有HLA-A02基因和ABL1管家基因片段序列；所述空白对照为TE缓冲液。ABL1管家基因（house-keeping gene），因为其表达水平受环境因素影响较小，而且在个体各个生长阶段的几乎全部组织中持续表达变化很小；管家基因的优点是与样品中的靶基因经历完全相同的处理程序，用以监控采样，运输，核酸提取和扩增的全部过程。
如图1所示，使用上述试剂盒进行HLA-A02基因的检测方法，用于非疾病诊断目的，包括步骤：
S1、获取待测样本基因组DNA；优选，稀释后DNA终浓度至1ng/μL~5ng/μL；
S2、将待测样本基因组DNA与试剂盒中引物探针组的HLA-A02特异性引物和HLA-A02特异性探针，按照确定比例进行混合，并以步骤S1中的基因组DNA为模板，进行荧光PCR扩增，并收集荧光信号；
S3、步骤S2中的荧光信号收集结束后，将数据结果从软件7500 Software v2.3中导出进行分析，判断所述检测样品基因组DNA中是否携带HLA-A02基因。
对于步骤S2中，荧光PCR扩增反应体系为10μL总反应体系，包括5μL的TaqMan FASTadvance Master Mix，上游引物SEQ ID NO.1和下游引物SEQ ID NO.2各400nM，上游引物SEQ ID NO.3和下游引物SEQ ID NO.4各300nM，探针SEQ ID NO.5和探针SEQ ID NO.6各200nM，1ng~20ng的基因组DNA，其余用水补齐。
其中，荧光PCR扩增中的反应体系中，不同阶段的反应条件如下：
预处理：50℃下预处理2分钟；
预变性：95℃下预变性5分钟；
所述预变性阶段还需要按照下述反应条件按照执行10个循环：
降落PCR：95℃预变性15秒，65℃（每隔一个循环降低0.5℃）下退火10秒，然后72℃下延伸20秒；
所述降落PCR阶段后还需要按照下述反应条件按照执行30个循环:
首先，95℃预变性15秒；
然后，60℃下退火30秒。
荧光PCR扩增反应体系中，HLA-A02特异性引物用于扩增DNA样本的目标基因区域，而HLA-A02特异性探针结合于目标基因，在扩增过程中逐渐被水解，然后释放荧光信号。探针为一线性的寡核苷酸，两端分别标记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，荧光监测系统检测不到荧光信号，PCR扩增过程中，探针被切断，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可检测到荧光信号。
另外，探针的位置尽可能地靠近对应目标基因区域的上游引物，在PCR反应过程中，利用高温使待测样本中的DNA模板变性为单链，降低温度进行退火，引物与目标区域的DNA模板结合；同时，探针也会与目标区域的DNA模板结合，最后通过聚合酶的作用，由引物开始沿着DNA链合成互补链，从而扩增目标区域，扩增过程中，扩增产物不断延伸，聚合酶将与DNA模板结合的探针水解，释放出对应的荧光信号。
下面通过实施例对本发明作进一步的详细说明，旨在用于说明本发明而非限定本发明：
实施例1：
采用542例健康人的基因组DNA样本验证本发明检测体系准确性。
具体检测方法如下：
采用本说明书已说明的PCR反应体系和反应条件，选取542例健康人基因组DNA样本，稀释后DNA终浓度介于1ng/μL~5ng/μL，检测结果与Sanger测序结果对比，阳性符合率达到100%，阴性符合率达到100%。
图2表示HLA-A02等位基因携带者样本检测的扩增曲线结果；图3表示HLA-A02等位基因未携带者样本检测的扩增曲线结果。如图2和3所示，标识①代表的是HLA-A02基因扩增曲线，标识②和③代表的是管家基因ABL1扩增曲线。
由此可见，HLA-A02等位基因检测体系能特异性的扩增HLA-A02等位基因携带者样本。
实施例2：
采用13例健康人的基因组DNA样本、阳性对照液和阴性对照液样本确认本发明检测体系的可重复性。
具体检测方法如下：
采用本说明书已说明的PCR反应体系和反应条件，选取13例健康人基因组DNA样本、阳性对照液和阴性对照液样本，共15例参考品样本。其中13例健康人基因组样本由5例HLA-A02等位基因携带者样本和8例HLA-A02等位基因未携带者样本组成，浓度介于1ng/μL~5ng/μL。对15例参考品样本重复检测20次，分4个批次做完，每批次重复检测5次，检测结果与Sanger测序结果对比，阳性符合率达到100%，阴性符合率达到100%。
图4表示HLA-A02等位基因阳性对照液检测的扩增曲线结果；图5表示HLA-A02等位基因阴性对照液样本检测的扩增曲线结果（实际上，其结果中无相应的扩增曲线）；如图4和5所示，标识④代表的是HLA-A02基因扩增曲线，标识⑤代表的是管家基因ABL1扩增曲线。
以上实施例1和2的结果表明，本发明的HLA-A02等位基因荧光PCR检测体系可以精准可靠地对HLA-A02等位基因进行快速检测;并且与其它检测方法相比，本发明的荧光PCR定量检测体系具有较高的灵敏度、特异性与准确性，检测工序简单，大大缩短了检测时间，节省了大量人力、物力与精力，提供了一种更加全新快速简便的检测HLA-A02等位基因分析技术，具有广泛的临床应用价值。
应当理解的是，上述针对本发明较佳实施例的表述较为详细，并不能因此而认为是对本发明专利保护范围的限制，本发明的专利保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种用于检测HLA-A02基因的引物探针组，其特征在于，包括核苷酸如SEQ ID NO.1至 SEQ ID NO.6所示的HLA-A02特异性引物和HLA-A02特异性探针；其中，所述核苷酸如SEQID NO.1至 SEQ ID NO.6所示的引物探针组如下：
上游引物SEQ ID NO.1:5'-TCCTCGTCCCCAGGCACT-3'；
下游引物SEQ ID NO.2: 5'-GAACTGCGTGTCGTCCACG-3'；
上游引物SEQ ID NO.3: 5'-CGGGAACCTCCTGGACTACC-3'；
下游引物SEQ ID NO.4: 5'-CATGGCTGACGAGATCTGAGTG-3'；
探针SEQ ID NO.5: FAM-CCGCTTCATCGCAGTG-MGB；
探针SEQ ID NO.6: VIC-CAGCAGCACCACGGCGTTCACC-BHQ1。
2.根据权利要求1所述的引物探针组，其特征在于，所述引物探针组中含有HLA-A02基因和ABL1管家基因。
3.根据权利要求1所述的引物探针组，其特征在于，所述引物探针组中,荧光定量PCR探针的5’端有FAM或VIC修饰及荧光定量PCR探针的3’端有NFQ-MGB或BHQ1修饰。
4.一种试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括权利要求1至3任一所述用于检测HLA-A02基因的引物探针组。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性対照液和空白对照液；其中，所述阳性対照液中含有质粒DNA；所述空白对照为TE缓冲液；所述阳性対照液中加入有起保护质粒DNA作用的carrier RNA溶液，且所述carrier RNA溶液的终浓度为10~50ng/μL。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述质粒DNA中含有HLA-A02基因和ABL1管家基因。
7.一种检测HLA-A02基因方面的检测方法，用于非疾病诊断目的，包括如下步骤：
获取抽提的待测样本基因组DNA；
在同一荧光PCR扩增的反应体系中，将待测样本基因组DNA与核苷酸如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.6所示的引物探针组的HLA-A02特异性引物和HLA-A02特异性探针按照确定比例进行混合；以所述待检测样本基因组DNA为模板，进行荧光PCR扩增，并收集荧光信号；
荧光信号收集结束后，导出数据结果并进行分析，判断所述检测样品基因组DNA中是否携带HLA-A02基因；
其中，所述核苷酸如SEQ ID NO.1至 SEQ ID NO.6所示的引物探针组如下：
上游引物SEQ ID NO.1:5'-TCCTCGTCCCCAGGCACT-3'；
下游引物SEQ ID NO.2: 5'-GAACTGCGTGTCGTCCACG-3'；
上游引物SEQ ID NO.3: 5'-CGGGAACCTCCTGGACTACC-3'；
下游引物SEQ ID NO.4: 5'-CATGGCTGACGAGATCTGAGTG-3'；
探针SEQ ID NO.5: FAM-CCGCTTCATCGCAGTG-MGB；
探针SEQ ID NO.6: VIC-CAGCAGCACCACGGCGTTCACC-BHQ1。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述待测样本基因组DNA中，稀释后DNA终浓度至1ng/μL~5ng/μL，所述荧光PCR扩增的反应体系中，还包括组分TaqMan FASTadvance Master Mix和超纯水。
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述荧光PCR扩增反应体系为10μL总反应体系；其中，包括5μL的TaqMan FAST advance Master Mix，上游引物SEQ ID NO.1和下游引物SEQ ID NO.2各400nM，上游引物SEQ ID NO.3和下游引物SEQ ID NO.4各300nM，探针SEQ ID NO.5和探针SEQ ID NO.6各200nM，1ng~20ng的基因组DNA，其余用超纯水补齐。
10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，所述荧光PCR扩增的反应体系，不同阶段的反应条件如下：
预变性处理：50℃下预处理2分钟；
变性处理：95℃下预变性5分钟；
降落PCR： 95℃预变性15秒，65℃起，每隔一个循环降低0.5℃进行退火10秒；然后72℃下延伸20秒；持续执行10个循环；
延伸处理：95℃预变性15秒，60℃下退火30秒，收集荧光信号；持续执行30个循环。
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