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CN112816712A - 一种检测新冠病毒的试剂盒及其检测方法和应用 - Google Patents

一种检测新冠病毒的试剂盒及其检测方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物医药领域，具体涉及采用Pt‑Pd合金纳米颗粒标记的免疫层析法制备的新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒及其检测方法和应用。一种检测新冠病毒的试剂盒，含有新冠病毒SARS‑CoV‑2中和抗体Pt‑Pd合金纳米颗粒试纸条。所述新冠病毒SARS‑CoV‑2中和抗体Pt‑Pd合金纳米颗粒试纸条的制备方法为用合金纳米颗粒标记新冠病毒SARS‑CoV‑2抗原作为捕获抗体纳米标记物，再将纯化的A型表达抗原及其抗体包被在纤维素膜上，分别作为检测线T线和质控线C线，经条件优化，建立新冠病毒中和抗体Pt‑Pd合金纳米颗粒试纸条。该试剂盒操作和携带方便，具备较高灵敏度，相比胶体金灵敏度可提高24倍，同时具备可操作性与重现性，可用于新型冠状病毒引起的肺炎的诊断。

Description

一种检测新冠病毒的试剂盒及其检测方法和应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种抗体检测试剂盒，具体涉及采用 Pt-Pd 合金纳米颗粒标记的免疫层析法制备的新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒及其检测方法和应用。
背景技术
新型冠状病毒肺炎（Corona Virus Disease 2019，COVID-19）自爆发以来，在全球范围内迅速席卷多数国家，并还在持续蔓延。截止到2021年2月27日，国内现有确诊人数523人，累计确诊人数101872人；国外现有确诊人数24682961人，累计确诊人数113938891人。无论是新冠的检测、预防还是治疗，各国都承受着巨大的压力。
目前已开发出的诊断试剂盒按检测目标可以分为两类，一类是检测病毒的核酸，一类是检测病毒的抗体。但这些诊断试剂盒还存在有很多局限性，假阴性率过高，以致无法完全满足防疫及临床工作的需求。特别是流行病学调查普检的需求：核酸检测试剂盒的特异性接近100%，但由于取样困难等原因导致灵敏度偏低，仅为30%-50%，即存在较多的漏检：使用S蛋白、N蛋白等SARS-CoV-2组成蛋白的抗体检测试剂盒的灵敏度可达95%以上，但由于原理缺陷导致特异性偏低（特别是对于一些疾病的患者，其体内的非SARS-CoV-2抗体也能被这些组成蛋白识别），即存在较多的误检。迫切切需要研就开方一种准确、快速的检测方法，快速发现大量感染患者和无症状携带者，防止病毒传播，确保患者得到及时治疗。
发明内容
鉴于现有技术存在的问题问题，本发明的目的在于提供一种采用 Pt-Pd 合金纳米颗粒标记的免疫层析法制备的新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒及其检测方法和应用，该试剂盒操作和携带方便，具备较高灵敏度，相比胶体金灵敏度可提高 24倍，同时具备可操作性与重现性，可用于新型冠状病毒(SARS-CoV-2)引起的肺炎的诊断。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案。
一种检测新冠病毒的试剂盒，含有新冠病毒SARS-CoV-2中和抗体 Pt-Pd 合金纳米颗粒试纸条。
所述新冠病毒SARS-CoV-2中和抗体 Pt-Pd 合金纳米颗粒试纸条的制备方法为用合金纳米颗粒标记新冠病毒SARS-CoV-2抗原作为捕获抗体纳米标记物，再将纯化的A 型表达抗原及其抗体包被在纤维素膜上，分别作为检测线T 线和质控线C 线，经条件优化，建立新冠病毒(SARS-CoV-2)中和抗体 Pt-Pd 合金纳米颗粒试纸条。
进一步地，所述的合金纳米颗粒是通过抗坏血酸AA还原 K2PtCl4和Na2PdCl4制备的。
进一步地，所述的纤维素膜是硝酸纤维素膜（NC膜），在试纸条中用做C/T线的承载体，同时也是免疫反应的发生处。
一种新冠病毒的检测方法，具体包括以下步骤。
步骤1、制备新冠病毒SARS-CoV-2中和抗体 Pt-Pd 合金纳米颗粒试纸条。
步骤2、样品定性检测：向试纸卡的样品孔中加入 35 μL 待检血清，之后再加入等体积稀释液，反应 10 min 后向NC 膜反应区加入 TMB 显色剂，随即进行结果判定。
步骤3、样品定量检测：判定值CUT-OFF的确定，分别取已知抗体效价为 1:64、1:128、1:256 和 1:512 的阳性血清各 1 份，步骤1制备的试纸条进行检测，每份血清重复检测 10 次，用金标免疫分析仪扫描读取信号 T/C 比值。将 T/C 比值的平均值作为 CUT-OFF 值，并建立标准曲线。
步骤4、结果判定：Pt-Pd 合金纳米颗粒的形态与大小，制备好的 Pt-Pd 合金纳米颗粒的透射电镜扫描图，其基本颗粒尺寸在50nm左右。定性检测结果判定标准，阳性，C线和T线的显色；阴性，C线显色，T线不显色；可疑，C线显色，T线若隐若现，颜色很浅；无效，C线不显色。定量检测结果判定标准，建立定量标准曲线，将待测血清的T/C值带入标准曲线，即可对应获得该份血清的抗体效价。
进一步地，所述步骤1的具体制备方法如下。
步骤1、Pt-Pd 合金纳米颗粒的制备：分别取适量K2PtCl4、Na2PdCl4、HCl、抗坏血酸加入普朗尼克-F127 中，充分混匀，加热超声处理 5 h。将处理后用丙酮和纯水交替洗 5次，每次洗完均离心 3 000 r/min，5 min，弃去上清，收集沉淀，4℃备用。采用透射电子显微镜对 Pt-Pd 合金纳米颗粒的超微结构进行扫描，观察其聚集状态及粒径分布。
步骤2、Pt-Pd 合金纳米颗粒标记最适缓冲体系的确定：分别取磷酸盐缓冲液（PB溶液）、硼酸盐缓冲液和碳酸盐缓冲液配制Pt-Pd 合金纳米颗粒溶液，观察，继续搅拌 20min，再观察 Pt-Pd 合金纳米颗粒的稳定性以及是否会发生聚沉。
步骤3、Pt-Pd 合金纳米颗粒标记抗原量的优化：选择最适条件的 Pt-Pd 合金纳米颗粒溶液，组装试纸条，比较试纸条跑条结果，以确定 Pt-Pd 合金纳米颗粒标记抗原时的最佳抗体量。
步骤4、Pt-Pd 合金纳米颗粒试纸条的制备：将最佳标记量的 FMDV 抗原超离部分加入 Pt-Pd合金纳米颗粒溶液中，磁力搅拌之后离心，将沉淀用相应缓冲液重悬喷涂于玻璃纤维制成合金标记垫。将纯化好的 FMDV-146S 与 FMDV-146S-Ab 倍比稀释后确定最佳包被量并分别标记于 NC 膜的 T 线与C 线，按顺序装配，即制成新冠病毒SARS-CoV-2中和抗体 Pt-Pd 合金纳米颗粒试纸条。
所述的新冠病毒SARS-CoV-2中和抗体 Pt-Pd 合金纳米颗粒试纸条在制备新型冠状病毒SARS-CoV-2引起的肺炎诊断试剂盒中的应用。
所述的新冠病毒SARS-CoV-2中和抗体 Pt-Pd 合金纳米颗粒试纸条在制备用于新型冠状病毒(SARS-CoV-2)引起的肺炎（COVID-19）的诊断的新型冠状病毒SARS-CoV-2中和抗体检测试剂盒中的用途。
与现有技术比，本发明的有益效果如下。
本发明提供的试剂盒和检测方法采用 Pt-Pd 合金纳米颗粒为标记物建立免疫层析方法，应用于新冠病毒中和抗体检测，结果证实其具备较高灵敏度，相比胶体金灵敏度可提高 24倍，同时具备可操作性与重现性。该检测方法是快速免疫层析技术的创新想尝试，为合金类纳米材料应用提供新的思路，具有实践应用前景。
附图说明
图1是Pt-Pd 合金纳米颗粒的透射电镜扫描图。
图2是定量检测结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细说明，应当指出，下列实施例并非对本发明任何形式上和实质上的限制。对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发 明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。
一种检测新冠病毒的试剂盒，含有新冠病毒SARS-CoV-2中和抗体 Pt-Pd 合金纳米颗粒试纸条。
新冠病毒(SARS-CoV-2)中和抗体 Pt-Pd 合金纳米颗粒试纸条的具体制备方法如下。
步骤1、Pt-Pd 合金纳米颗粒的制备：分别取900 μL K2PtCl4（20 mmol·L-1）、100μL Na2PdCl4（22 mmol·L-1）、22 μL HCl（6 mol·L-1）、1 mL 抗坏血酸（100 mmol·L-1）加入10 mg 普朗尼克-F127 中，中，充分混匀，加热超声处理 5 h。将处理后用丙酮和纯水交替洗 5 次，每次洗完均离心 3 000 r/min，5 min，弃去上清，收集沉淀，4℃备用。采用透射电子显微镜对 Pt-Pd 合金纳米颗粒的超微结构进行扫描，观察其聚集状态及粒径分布。
步骤2、分别取 pH 7.5 0.02 mol·L-1 磷酸盐缓冲液（PB 溶液）、pH 8.5 0.05mol·L-1 硼酸盐缓冲液和 pH 9.5 0.05 mol·L-1 碳酸盐缓冲液配制 Pt-Pd 合金纳米颗粒溶液， 观察 Pt-Pd 合金纳米颗粒在 3 种缓冲体系中的分散状态。继续将抗原超离部分稀释为38.69 µg·mL-1， 在缓慢搅拌条件下分别加入不同缓冲体系的 Pt-Pd 合金纳米颗粒溶液中，控制最终抗原量为 0.387 µg·mL-1， 继续搅拌 20 min，再观察 Pt-Pd 合金纳米颗粒的稳定性以及是否会发生聚沉。静置 20 min 后，溶解于 pH 7.5 磷酸盐缓冲液和pH 8.5 硼酸盐缓冲液中的捕获抗原纳米标记物出现肉眼可见的颗粒性沉淀；而在 pH 9.5的碳酸盐缓冲液中则分散状态稳定，未出现团聚现象。最终确定pH 9.5，0.05 mol·L-1 碳酸盐缓冲液为 Pt-Pd 合金纳米颗粒溶解与标记的最适缓冲体系。当检测线标记量为0.774 µg·mL-1，加入 TMB 后试纸条背景整体显色较深，且出现非特异性反应；标记量为0.193 µg·mL-1 时，试纸条检测线显色变浅；为保证试纸条显色和灵敏度，最终确定抗原最适标记量为 0.387 μg·mL-1。
步骤3、Pt-Pd 合金纳米颗粒标记抗原量的优化：选择最适条件的 Pt-Pd 合金纳米颗粒溶液。将抗原超离部分稀释为 38.69 µg·mL-1 后，分别取适量在缓慢搅拌条件下加入到 Pt-Pd 合金纳米颗粒溶液中，控制最终抗原量分别为 0.774、0.387 和 0.193 µg·mL-1， 组装试纸条，比较试纸条跑条结果，以确定 Pt-Pd 合金纳米颗粒标记抗原时的最佳抗体量。紫外分光光度计检测，收集 OD260 nm≥0.4 的抗原，计算可得标记抗原病毒含量为 386.9 µg·mL-1，检测抗原病毒含量为 275.3 µg·mL-1，-20℃冻存备用。
步骤4、Pt-Pd 合金纳米颗粒试纸条的制备：将最佳标记量0.387 µg·mL-1的抗原超离部分加入 Pt-Pd合金纳米颗粒溶液中，磁力搅拌之后离心，将沉淀用相应缓冲液重悬喷涂于玻璃纤维制成合金标记垫。将纯化好的抗原和抗体倍比稀释后确定最佳包被量并分别标记于 NC 膜的 T 线与C 线，按顺序装配，即制成检测试纸条。
一种新冠病毒的检测方法，具体包括以下步骤。
步骤1、制备新冠病毒SARS-CoV-2中和抗体 Pt-Pd 合金纳米颗粒试纸条。
步骤2、样品定性检测：向试纸卡的样品孔中加入 35 μL 待检血清，之后再加入等体积稀释液，反应 10 min 后向NC 膜反应区加入 TMB 显色剂，随即进行结果判定。
步骤3、样品定量检测：判定值CUT-OFF的确定，分别取已知抗体效价为 1:64、1:128、1:256 和 1:512 的阳性血清各 1 份，步骤1制备的试纸条进行检测，每份血清重复检测 10 次，用金标免疫分析仪扫描读取信号 T/C 比值。将 T/C 比值的平均值作为 CUT-OFF 值，并建立标准曲线。
步骤4、结果判定：Pt-Pd 合金纳米颗粒的形态与大小，制备好的 Pt-Pd 合金纳米颗粒的透射电镜扫描图，如图1所示，其基本颗粒尺寸在50nm左右。定性检测结果判定标准，阳性，C线和T线的显色；阴性，C线显色，T线不显色；可疑，C线显色，T线若隐若现，颜色很浅；无效，C线不显色。定量检测结果判定标准，建立定量标准曲线，将待测血清的T/C值带入标准曲线，即可对应获得该份血清的抗体效价，如图2所示。
对于 50 份A 型阳性血清，新冠病毒SARS-CoV-2中和抗体 Pt-Pd 合金纳米颗粒试纸条采用上述检测方法可检测出阳性结果 49 份，胶体金试纸条可检测出阳性结果 48份，敏感性分别为 98%和96%。对于 22 份阴性血清，新冠病毒SARS-CoV-2中和抗体 Pt-Pd合金纳米颗粒试纸条和胶体金试纸条均可检测出阴性结果 22 份，特异性均为 100%；对于36 份特异性血清（包括 30 份新冠肺炎 O、亚 I 型病毒血清和 6 份其他病毒感染阳性血清），新冠病毒SARS-CoV-2中和抗体 Pt-Pd 合金纳米颗粒试纸条可检测出阴性结果34 份，胶体金试纸条可检测出阴性结果 31 份，特异性分别为 94%和 86%；综合以上分析，两种试纸条特异性分别为 94.8 %和 91.4%。结果表明，新冠病毒SARS-CoV-2中和抗体 Pt-Pd 合金纳米颗粒试纸条有更高的敏感性和特异性。

Claims (8)

1.一种检测新冠病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有新冠病毒SARS-CoV-2中和抗体 Pt-Pd 合金纳米颗粒试纸条。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述新冠病毒SARS-CoV-2中和抗体 Pt-Pd合金纳米颗粒试纸条的制备方法为用合金纳米颗粒标记新冠病毒SARS-CoV-2抗原作为捕获抗体纳米标记物，再将纯化的A 型表达抗原及其抗体包被在纤维素膜上，分别作为检测线T 线和质控线C 线，经条件优化，建立新冠病毒中和抗体 Pt-Pd 合金纳米颗粒试纸条。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的Pt-Pd合金纳米颗粒是通过抗坏血酸AA还原 K2PtCl4和Na2PdCl4制备的。
4.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的纤维素膜是硝酸纤维素膜。
5.一种新冠病毒的检测方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
步骤1、制备新冠病毒SARS-CoV-2中和抗体 Pt-Pd 合金纳米颗粒试纸条；
步骤2、样品定性检测：向试纸卡的样品孔中加入 35 μL 待检血清，之后再加入等体积稀释液，反应 10 min 后向NC 膜反应区加入 TMB 显色剂，随即进行结果判定；
步骤3、样品定量检测：判定值CUT-OFF的确定，分别取已知抗体效价为 1:64、1:128、1:256 和 1:512 的阳性血清各 1 份，步骤1制备的试纸条进行检测，每份血清重复检测 10次，用金标免疫分析仪扫描读取信号 T/C 比值，将 T/C 比值的平均值作为 CUT-OFF 值，并建立标准曲线；
步骤4、结果判定：定性检测结果判定标准，阳性，C线和T线的显色；阴性，C线显色，T线不显色；可疑，C线显色，T线若隐若现，颜色很浅；无效，C线不显色；定量检测结果判定标准，建立定量标准曲线，将待测血清的T/C值带入标准曲线，即可对应获得该份血清的抗体效价。
6.如权利要求5所述的检测方法，其特征在于，步骤1的具体制备方法如下：
步骤1、Pt-Pd 合金纳米颗粒的制备：分别取K2PtCl4、Na2PdCl4、HCl、抗坏血酸加入普朗尼克-F127 中，充分混匀，加热超声处理 5 h；将处理后用丙酮和纯水交替洗 5 次，每次洗完均离心 3 000 r/min，5 min，弃去上清，收集沉淀，4℃备用；采用透射电子显微镜对 Pt-Pd 合金纳米颗粒的超微结构进行扫描，观察其聚集状态及粒径分布；
步骤2、Pt-Pd 合金纳米颗粒标记最适缓冲体系的确定：分别取磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液和碳酸盐缓冲液配制Pt-Pd 合金纳米颗粒溶液，观察，继续搅拌 20 min，再观察Pt-Pd 合金纳米颗粒的稳定性以及是否会发生聚沉；
步骤3、Pt-Pd 合金纳米颗粒标记抗原量的优化：选择最适条件的 Pt-Pd 合金纳米颗粒溶液，组装试纸条，比较试纸条跑条结果，以确定 Pt-Pd 合金纳米颗粒标记抗原时的最佳抗体量；
步骤4、Pt-Pd 合金纳米颗粒试纸条的制备：将最佳标记量的 FMDV 抗原超离部分加入Pt-Pd合金纳米颗粒溶液中，磁力搅拌之后离心，将沉淀用相应缓冲液重悬喷涂于玻璃纤维制成合金标记垫；将纯化好的 FMDV-146S 与 FMDV-146S-Ab 倍比稀释后确定最佳包被量并分别标记于 NC 膜的 T 线与C 线，按顺序装配，即制成新冠病毒SARS-CoV-2中和抗体Pt-Pd 合金纳米颗粒试纸条。
7.如权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述新冠病毒SARS-CoV-2中和抗体 Pt-Pd 合金纳米颗粒试纸条在制备新型冠状病毒SARS-CoV-2引起的肺炎诊断试剂盒中的应用。
8.如权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述新冠病毒SARS-CoV-2中和抗体 Pt-Pd 合金纳米颗粒试纸条在制备用于新型冠状病毒引起的肺炎的诊断的新型冠状病毒SARS-CoV-2中和抗体检测试剂盒中的用途。
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