CN111435136A

CN111435136A - 用于检测新型冠状病毒的时间分辨荧光免疫层析试剂盒及其制备方法

Info

Publication number: CN111435136A
Application number: CN202010140032.7A
Authority: CN
Inventors: 李翀
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2020-03-03
Filing date: 2020-03-03
Publication date: 2020-07-21

Abstract

本发明公开了一种用于检测新型冠状病毒的时间分辨荧光免疫层析试剂盒及其制备方法，所述试剂盒包括试纸条和荧光免疫分析仪，其中，所述试纸条包括底板、以及位于所述底板上的样品滤垫、微球标记垫、检测垫和吸水垫；所述检测垫的一端与所述微球标记垫的一端叠压，所述检测垫的另一端与所述吸水纸的一端叠压，所述样品滤垫的一端与所述微球标记垫的另一端叠压。本发明可实现对多种人体样本中新型冠状病毒COVID‑19的定性和定量检测，针对不同的应用场景和需求，使其能够同时满足小批量、易操作的基层社区快速早筛，以及高通量、高准确度的中心医院临床诊断。

Description

用于检测新型冠状病毒的时间分辨荧光免疫层析试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种用于检测新型冠状病毒的时间分辨荧光免疫层析试剂盒及其制备方法。

背景技术

新型冠状病毒，属于冠状病毒β属，有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，常为多形性，直径60-140nm。其基因特征与SARSr-CoV和MERSr-Cov有明显取别，与蝙蝠SARS样冠状病毒(bat-SL-CoVZC45)同源性达85％以上。2020 年1月12日，世界卫生组织将其暂时命名为“2019-nCoV”(2019新型冠状病毒)。2月11日，世卫组织总干事谭德赛在全球研究与创新论坛记者会上宣布，正式将新型冠状病毒命名为“COVID-19”，其中，“Co”代表“冠状病毒”，“Vi”代表“病毒”，“D”代表“疾病”。

冠状病毒属于套式病毒目、冠状病毒科、冠状病毒属，是一类具有囊膜、基因组为线性单股正链的RNA病毒，是自然界广泛存在的一大类病毒。病毒基因组5’端具有甲基化的帽状结构，3’端具有poly(A)尾，基因组全长 27-32kb，是目前已知RNA病毒中基因组最大的病毒。该病毒有4种主要的结构蛋白：刺突蛋白(spike protein，S蛋白)，核衣壳蛋白(nucleocapsid，N蛋白)，膜蛋白(membrane protein，M蛋白)，包膜蛋白(envelopeprotein，E蛋白)。冠状病毒可引起感冒以及中东呼吸综合征(MERS)和严重急性呼吸综合征(SARS)等较严重疾病，而新型冠状病毒是以前从未在人体中发现的冠状病毒新毒株。人感染了冠状病毒后常见体征有呼吸道症状和发热、咳嗽。在严重病例中，感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚至死亡。严重症状有：急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒、出凝血功能障碍等。对心肺疾病患者、免疫力低下人群等影响较严重。

目前，新型冠状病毒导致的肺炎疫情严重，确诊病例及疑似病例呈爆发式发展，亟需效果明确的诊疗及辅助诊疗方法，改善患者症状，提升易感人群免疫力，降低病毒危害。用于检测新型冠状病毒COVID-19的方法主要有 RT-PCR核酸检测等方法，但这些方法应用过程中，检测设备要求高，检测成本高；干扰因素较多，重复性不好，检测时间长。

发明内容

为此，本发明提供一种用于检测新型冠状病毒的时间分辨荧光免疫层析试剂盒及其制备方法。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种用于检测新型冠状病毒的时间分辨荧光免疫层析试剂盒，所述试剂盒包括试纸条和荧光免疫分析仪，其中，所述试纸条包括底板、以及位于所述底板上的样品滤垫、微球标记垫、检测垫和吸水垫；所述检测垫的一端与所述微球标记垫的一端叠压，所述检测垫的另一端与所述吸水纸的一端叠压，所述样品滤垫的一端与所述微球标记垫的另一端叠压；

所述微球标记垫上涂覆有微球标记的COVID-19单克隆抗体涂层，所述检测垫上靠近所述微球标记垫一侧设有检测线，靠近所述吸水垫的一层设有质控线，所述检测线上涂覆有COVID-19N蛋白单克隆抗体涂层。

本发明的一个实施例中，所述质控线上涂覆有羊抗小鼠IgG涂层。

本发明的一个实施例中，所述微球标记垫的宽度为6-8mm；

所述检测线距微球标记垫距离为4-6mm，所述检测线和质控线之间的间距为4-6mm。

本发明的一个实施例中，所述检测垫为硝酸纤维素膜。

本发明的一个实施例中，所述试纸条还包括上壳体以及与所述上壳体配合的下壳体，所述上壳体和所述下壳体形成可容纳所述试纸条的空间，所述上壳体上对应所述样品滤垫设有加样孔，对应所述检测垫处设有视窗。

本发明的一个实施例中，所述检测试剂盒还包括用于计算新型冠状病毒检测浓度的标准曲线卡。

本发明还提供一种制备所述的用于检测新型冠状病毒的时间分辨荧光免疫层析试剂盒的方法，其包括：

用时间分辨荧光微球标记COVID-19单克隆抗体，将标记的荧光微球涂覆于微球标记垫上；

将COVID-19N蛋白单克隆抗体和羊抗小鼠IgG用含有1％蔗糖的 10mmol/L PBS缓冲液分别至稀释浓度0.5-1.5mg/ml，分别涂覆于检测垫上形成检测线和质控线；

将所述样品滤垫、微球标记垫、检测垫和吸水垫依次端部压接形成试纸条；

荧光免疫分析仪与所述试纸条配合使用，形成所述时间分辨荧光免疫层析试剂盒。

本发明的一个实施例中，所述用时间分辨荧光微球标记COVID-19单克隆抗体的方法为：

1)时间分辨荧光微球预标记

取0.1mg的时间分辨荧光微球，超声分散1-2min，18000rpm低温离心 15min，去除上清，用pH为6.0，浓度为50-100mmol/L的MES缓冲液洗涤，重悬沉淀物；加入0.1-0.2mg/ml的碳二亚胺和琥珀酰亚胺，室温反应15-30min 后，18000rpm，低温离心15min，去除上清，用pH为6.0，浓度为50-100 mmol/L的MES缓冲液洗涤，重悬沉淀物至1ml，得到预标记的时间分辨荧光微球；

2)将预标记的荧光微球涂覆于微球标记垫上

取1ml所述预标记的时间分辨荧光微球，加入0.1-0.2mg COVID-19单克隆抗体，室温旋转反应2-2.5h；然后加入pH 8.0，含质量分数为1-2％BSA的 50mmol/L的PBS封闭液，室温旋转反应2h；18000rpm，低温离心15min，去除上清，用含0.5-1％BSA、0.2-0.3％Tween20、0.1％NaN₃的10-50mmol/L、pH为8.0的PBS保存液洗涤并重悬至1ml，置于4℃避光保存，获得标记 COVID-19单克隆抗体的时间分辨荧光微球。

本发明的一个实施例中，所述微球标记垫制备方法包括：

将所述标记COVID-19单克隆抗体的时间分辨荧光微球，18000rpm，低温离心15min，去除上清，用0.1-0.2ml含质量分数为0.5-1％BSA、0.2-0.3％ Tween20、10％蔗糖的10-50mmol/L、pH为8.0的PBS微球重悬液重悬，得到标记COVID-19单克隆抗体的时时间分辨荧光微球重悬液，将所述重悬液通过喷涂装置以3-5μl/cm喷涂后，于35-38℃避光烘干得到COVID-19单克隆抗体喷涂的时间分辨荧光微球喷涂微球标记垫。

本发明的一个实施例中，所述试纸条装设于所述上壳体和下壳体形成的容置空间内。

本发明中，硝酸纤维素又称硝化纤维素、纤维素硝酸酯，为纤维素与硝酸酯化反应的产物。以棉纤维为原料的硝酸纤维素称为硝化棉。硝酸纤维素是一种白色纤维状聚合物，耐水、耐稀酸、耐弱碱和各种油类。尤其适于作为本发明检测垫的基底膜材质，可以使得所获得的检测垫的理论层析速度达到 15min左右。

本发明中，时间分辨荧光免疫层析法检测新型冠状病毒COVID-19的试剂盒的检测原理是双抗体夹心法。其中，微球标记垫标记了时间分辨荧光微球的新型冠状病毒COVID-19单克隆抗体；检测线包被有小鼠抗人新型冠状病毒COVID-19N蛋白单克隆抗体；质控线包被有羊抗小鼠IgG抗体。测试时，在样品滤垫上滴加待检测样本稀释液，通过层析作用，待检测样本向吸水垫端移动，流经微球标记垫时，将时间分辨荧光微球标记的新型冠状病毒COVID-19单克隆抗体复溶，若待检测样本中含有待测抗原，即形成微球抗体-抗原复合物，移至检测线时形成微球抗体-抗原-抗体复合物，微球抗体被固定下来，多余的微球标记抗体移至质控线被羊抗小鼠抗体捕获。避光反应结束后，定量检测试剂盒用干式荧光免疫分析仪检测，得到检测线和质控线荧光强度的强弱及其比值，仪器软件结合标准曲线卡中信息，将实际检测值代入预设的标准曲线中即可分析出样品中待测物的浓度。另一方面，避光反应结束后，定性检测试剂盒采用便携式紫外检测笔进行检测，通过试纸条在检测窗的外露部分，观察检测线和对照线在紫外检测笔下的荧光显示，定性判别检测结果若检测线和质控线有荧光显示样品判定为阳性，若检测线无荧光显示，质控线有荧光显示，样品判定为阴性，若质控线无荧光显示，则试纸条无效，需重新测试。

本发明中，时间分辨荧光免疫层析法(time-resolved fluorescenceImmunoassay，TRFIA)用镧系元素(三价稀土离子及其螯合物)作为示踪物，标记抗原或抗体，免疫反应发生时，用时间分辨荧光分析仪测定免疫反应最后产物的荧光强度，再根据荧光强度和相对荧光强度比值，判断反应体系中分析物的浓度，达到定量分析的目的。TRFIA的灵敏度高达10^-18mol/L；特异性强，通过时间延迟，将特异性荧光与非特异性荧光分辨开来，使理论本底达到0；荧光寿命极长，极长的荧光衰退时间，发光效率高，非常稳定；发射光谱带较窄，激发光谱带较宽，Strokes位移大，因此干扰少，灵敏度高，结果准确度高。

本发明具有如下优点：

本发明分别采用便携式紫外检测笔和干式荧光仪，可实现对多种人体样本(呼吸道、血液、眼角膜、大便等样本)中新型冠状病毒COVID-19的定性和定量检测，针对不同的应用场景和需求，使其能够同时满足小批量、易操作的基层社区快速早筛，以及高通量、高准确度的中心医院临床诊断。

本发明利用时间分辨荧光层析技术，可避免样本本身的荧光干扰，具有特异性强、灵敏度高、准确度高等特点，检测样本量小，检测操作便捷、检测结果准确可靠等特点。

附图说明

为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。

图1为本发明的用于检测新型冠状病毒的时间分辨荧光免疫层析试剂盒中的试纸条的结构示意图，其中：1-底板；2-样品滤垫；3-微球标记垫；4-吸水垫；5-检测垫；6-检测线；7-质控线；

图2为本发明的用于检测新型冠状病毒的时间分辨荧光免疫层析试剂盒中的试纸条的正面结构示意图；

图3为本发明的定量检测新型冠状病毒COVID-19的标准曲线卡中存储的标准曲线图；

图4为本发明的试纸条定性检测新型冠状病毒COVID-19检测结果示意图。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明中，所采用的抗原和抗体均购自北京义翘神州科技有限公司，其中，新型冠状病毒抗原货号：40588-V08B，包被用的COVID-19N蛋白抗体货号为 40143-R019；标记用的COVID-19抗体货号为40143-T62。羊抗小鼠IgG货号为SSA021。

本发明中，低温是指温度在-4℃至4℃之间的温度。

本发明中，所采用的时间分辨荧光微球采购自美国Bangs Lab公司。

实施例1、用于检测新型冠状病毒的时间分辨荧光免疫层析试剂盒的制备

用于检测型冠状病毒COVID-19的时间分辨荧光免疫层析试剂盒，试纸条采用双抗夹心法免疫层析原理，检测人体样本(呼吸道、血液、眼角膜、大便等样本)中新型冠状病毒COVID-19的含量。试剂盒由时间分辨荧光免疫层析法检测新型冠状病毒COVID-19的试纸条、样本缓冲液和含有新型冠状病毒COVID-19标准曲线的ID卡组成。

具体的，本发明的试纸条如图1和图2所示，PVC底板1上依次搭接样品滤垫2、微球标记垫3、检测垫5和吸水垫4；检测垫为硝酸纤维素膜作为基底膜，微球标记垫3上有微球标记的COVID-19单克隆抗体涂层；检测垫3 上有检测线(T)6和质控线(C)7；样品滤垫2作为加样区，用于吸取待检样本。本实施例中，微球标记垫上采用时间分辨免疫荧光微球偶联的小鼠抗人新型冠状病毒COVID-19单克隆抗体，COVID-19单克隆抗体作为标记抗体。微球浓度为1mg/ml，平微球的均粒径为200nm，激发波长360nm，发射波长 615nm；包被浓度为抗体：荧光微球＝1:10(W:W)。微球标记垫用喷金划膜仪以3μl/cm喷量，喷涂于微球标记垫，微球标记垫采用玻璃纤维膜。检测线(T) 中小鼠抗人新型冠状病毒COVID-19N蛋白单克隆抗体包被浓度为 1.5mg/ml；质控线中羊抗小鼠IgG抗体包被浓度为1mg/ml。检测线和质控线用喷金划膜仪以1μl/cm喷量，喷涂于检测垫上。

本发明中用于检测型冠状病毒COVID-19的时间分辨荧光免疫层析试纸条的制备方法如下：

(1)预标记时间分辨荧光微球

取0.1mg的时间分辨荧光微球，超声分散1min，18000rpm低温离心 15min，去除上清，取50mmol/L(pH 6.0)的MES缓冲液1ml，洗涤、重悬沉淀物；加入碳二亚胺和琥珀酰亚胺，使二者终浓度均为0.1mg/ml，室温旋转反应30min后，18000rpm低温离心15min，去除上清，用50mmol/L(pH 6.0)的MES缓冲液洗涤，重悬沉淀物至1ml，即得预标记的时间分辨荧光微球；

(2)时间分辨荧光微球标记的新型冠状病毒COVID-19单克隆抗体的制备

取上述预标记的时间分辨荧光微球1ml溶液，加入0.1mg新型冠状病毒 COVID-19单克隆抗体，室温旋转反应2h；然后加入含BSA的50mmol/L(pH 8.0)的PBS封闭液，至BSA质量浓度2％，室温旋转反应2小时；18000rpm 低温离心×5min，去除上清，用含质量分数0.1％BSA、0.2％Tween20、0.1％ NaN₃的50mmol/L(pH 8.0)的PBS保存液洗涤，并重悬至1ml，置于4℃避光保存，获得时间分辨荧光微球标记的新型冠状病毒COVID-19单克隆抗体；

(3)微球标记垫的制备

取上述时间分辨荧光微球标记的新型冠状病毒COVID-19单克隆抗体溶液0.1ml，18000rpm，低温离心15min，去除上清，用0.1ml含质量分数为0.5％ BSA、0.2％Tween20、10％蔗糖的50mmol/L(pH 8.0)的PBS微球重悬液重悬,用喷金划膜仪将重悬液以3μl/cm的喷量，在微球标记垫上喷涂时间分辨荧光微球标记的新型冠状病毒COVID-19单克隆抗体涂层，喷涂后的微球标记垫放入烘箱，35-38℃避光烘干，得到时间分辨荧光微球标记的新型冠状病毒 COVID-19单克隆抗体的微球标记垫，微球标记垫形成4-6mm带状，加入干燥剂封存备用。

(4)检测垫的制备

小鼠抗人新型冠状病毒COVID-19N蛋白单克隆抗体和羊抗小鼠IgG分别用含有1％蔗糖的50mmol/L PBS(pH 8.0)缓冲液分别至稀释浓度1.5mg/ml 和1.0mg/ml；用喷金划膜仪以1μl/cm的量在硝酸纤维素膜上间隔4mm平行喷涂质控线涂层和检测线涂层，得到检测垫，将检测垫放入烘箱，35-38℃避光烘干，加入干燥剂封存备用；

(4)试纸条的组装

在PVC底板上依次相互交错1.9-2.2mm搭接粘贴样品滤垫，该样品滤垫的材质为玻璃纤维材质、微球标记垫的材质为玻璃纤维材质，检测垫材质为硝酸纤维素材质和吸水垫，其中检测线靠近微球标记垫一侧，质控线靠近吸水垫一侧，得到试纸板，进一步将试纸板切割成宽度为4mm的试纸条。

本实施例中，检测新型冠状病毒COVID-19的试纸条组装在由塑料上壳体和塑料下壳体扣合而成的塑料壳中，上壳体上设有加样孔和视窗，加样孔对应于新型冠状病毒COVID-19检测试纸条的样品滤垫2位置处，视窗对应于新型冠状病毒COVID-19检测垫的检测线6和质控线7的位置处。

本实施例的检测试剂盒还包含的样本缓冲液为在pH 8.0的PBS缓冲液中溶入200mmol/L NaCl、0.5％BSA和1％Tween20，以100μl/管分装于离心管中。该样本缓冲液用于层析样品。

实施例2、定量检测新型冠状病毒的时间分辨荧光免疫层析试剂盒

按照实施例1制备好的试纸条中加入不同浓度的人新型冠状病毒 COVID-19抗原校准品(70ng/ml、35ng/ml、14ng/ml、7ng/ml、3.5ng/ml、 0.7ng/ml、0.0ng/ml)共七个浓度，每个浓度设置三个重复，均由0.5mg/ml 人新型冠状病毒COVID-19N蛋白重组抗原用样本缓冲液稀释而成，层析 15min后，通过干式荧光免疫分析仪读取检测线、质控线的荧光强度比值，其中，荧光强度比值＝检测线检测值/质控线检测值。

以新型冠状病毒COVID-19校准品浓度为X轴，以样品检测线荧光强度/ 质控线荧光强度为Y轴建立方程并拟合成标准曲线，标准曲线如图3所示。R 值为0.9974。如表1所示，新型冠状病毒COVID-19N蛋白重组抗原校准品浓度检测。

表1

该过程具体包括下列步骤：

(1)将待检测样本及检测试剂放至室温，待温度平衡；

(2)取100μl待测样本加入100μl样本缓冲液中，如前所述，样本缓冲液已分装成100μl/管，混匀，获得混合样本；

(3)吸取上述混合样本100μl，加入到试纸条的加样孔中，室温避光反应15min；

(4)开启干式荧光免疫分析仪，初始化自检完毕后，插入对应检测新型冠状病毒COVID-19的ID卡；

(5)将试纸条插入仪器的试纸条插口中，运行仪器，通过分析软件自动计算出待检测样本中的新型冠状病毒COVID-19浓度。

本实施例中的检测试剂盒中，均匹配一个含有新型冠状病毒COVID-19 标准曲线的ID卡，相同批次的产品标准曲线相同，通过所述新型冠状病毒 COVID-19试纸条测定不同浓度的校准品，以校准品浓度为X轴，检测线、质控线荧光强度的比值为Y轴，绘制成标准曲线，写入并生成相应条码信息存储在ID卡中，并打印出匹配的条码粘贴在试纸条外壳上。检测浓度时，ID卡插入仪器ID卡插口，干式荧光免疫分析仪读取试纸条外壳上对应的条码信息，获取相应的标准曲线。

实施例3、定性检测新型冠状病毒的时间分辨荧光免疫层析试剂盒

按本发明实施例1制备试纸条，设置四种不同浓度的人新型冠状病毒 COVID-19抗原校准品：70ng/ml、7ng/ml、0.7ng/ml、0.0ng/ml。

按照下列步骤进行定性检测：

(1)将待检测样本及检测试剂放至室温，待温度平衡；

(2)取100μl待测样本加入100μl样本缓冲液中，混匀，获得混合样本；

(3)吸取上述混合样本100μl，加入到试纸条的加样孔中，室温避光反应10-15min；

(4)打开便携式紫外检测笔，照射检测试纸条通过检测窗外露部分，观察检测性和对照线在紫外检测笔下的荧光显示，定性判别检测结果。

结果见图4所示，0ng/ml样品，检测线T线无荧光显示，质控线C线有荧光显示；0.7ng/ml、7ng/ml、70ng/ml样品，检测线T线、质控线C线均有荧光显示，且随浓度的上升，检测线T线荧光亮度依次增强。

本发明的荧光免疫分析仪可以为便携式紫外检测笔或干式荧光免疫分析仪。

实验实施例

采集医院检测新型冠状病毒COVID-19的阳性样本10份，用本发明的定性试剂盒检测新型冠状病毒COVID-19的试剂盒进行检测，显示均为阳性；

采集阴性样本20份，用本发明的定性试剂盒检测新型冠状病毒 COVID-19的试剂盒进行检测，显示均为阴性。临床小样本量检测显示，定性符合率100％。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种用于检测新型冠状病毒的时间分辨荧光免疫层析试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括试纸条和荧光免疫分析仪，其中，所述试纸条包括底板、以及位于所述底板上的样品滤垫、微球标记垫、检测垫和吸水垫；所述检测垫的一端与所述微球标记垫的一端叠压，所述检测垫的另一端与所述吸水纸的一端叠压，所述样品滤垫的一端与所述微球标记垫的另一端叠压；

2.如权利要求1所述的用于检测新型冠状病毒的时间分辨荧光免疫层析试剂盒，其特征在于，

所述质控线上涂覆有羊抗小鼠IgG涂层。

3.如权利要求1所述的用于检测新型冠状病毒的时间分辨荧光免疫层析试剂盒，其特征在于，

所述微球标记垫的宽度为6-8mm；

4.如权利要求1所述的用于检测新型冠状病毒的时间分辨荧光免疫层析试剂盒，其特征在于，

所述检测垫为硝酸纤维素膜。

5.如权利要求1所述的用于检测新型冠状病毒的时间分辨荧光免疫层析试剂盒，其特征在于，

所述试纸条还包括上壳体以及与所述上壳体配合的下壳体，所述上壳体和所述下壳体形成可容纳所述试纸条的空间，所述上壳体上对应所述样品滤垫设有加样孔，对应所述检测垫处设有视窗。

6.如权利要求1所述的用于检测新型冠状病毒的时间分辨荧光免疫层析试剂盒，其特征在于，

所述检测试剂盒还包括用于计算新型冠状病毒检测浓度的标准曲线卡。

7.一种制备权利要求1所述的用于检测新型冠状病毒的时间分辨荧光免疫层析试剂盒的方法，其特征在于包括：

将COVID-19N蛋白单克隆抗体和羊抗小鼠IgG用含有1％蔗糖的10mmol/L PBS缓冲液分别至稀释浓度0.5-1.5mg/ml，分别涂覆于检测垫上形成检测线和质控线；

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，

所述用时间分辨荧光微球标记COVID-19单克隆抗体的方法为：

1)时间分辨荧光微球预标记

取0.1mg的时间分辨荧光微球，超声分散1-2min，18000rpm低温离心15min，去除上清，用pH为6.0，浓度为50-100mmol/L的MES缓冲液洗涤，重悬沉淀物；加入0.1-0.2mg/ml的碳二亚胺和琥珀酰亚胺，室温反应15-30min后，18000rpm，低温离心15min，去除上清，用pH为6.0，浓度为50-100mmol/L的MES缓冲液洗涤，重悬沉淀物至1ml，得到预标记的时间分辨荧光微球；

2)将预标记的荧光微球涂覆于微球标记垫上

取1ml所述预标记的时间分辨荧光微球，加入0.1-0.2mg COVID-19单克隆抗体，室温旋转反应2-2.5h；然后加入pH 8.0，含质量分数为1-2％BSA的50mmol/L的PBS封闭液，室温旋转反应2h；18000rpm，低温离心15min，去除上清，用含0.5-1％BSA、0.2-0.3％Tween20、0.1％NaN₃的10-50mmol/L、pH为8.0的PBS保存液洗涤并重悬至1ml，置于4℃避光保存，获得标记COVID-19单克隆抗体的时间分辨荧光微球。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，

所述微球标记垫制备方法包括：

将所述标记COVID-19单克隆抗体的时间分辨荧光微球，18000rpm，低温离心15min，去除上清，用0.1-0.2ml含质量分数为0.5-1％BSA、0.2-0.3％Tween20、10％蔗糖的10-50mmol/L、pH为8.0的PBS微球重悬液重悬，得到标记COVID-19单克隆抗体的时时间分辨荧光微球重悬液，将所述重悬液通过喷涂装置以3-5μl/cm喷涂后，于35-38℃避光烘干得到COVID-19单克隆抗体喷涂的时间分辨荧光微球喷涂微球标记垫。

10.如权利要求7所述的方法，其特征在于，

所述试纸条装设于上壳体和下壳体形成的容置空间内。