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CN112662611B - 培养基组合物 - Google Patents

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CN112662611B
CN112662611B CN202011601891.8A CN202011601891A CN112662611B CN 112662611 B CN112662611 B CN 112662611B CN 202011601891 A CN202011601891 A CN 202011601891A CN 112662611 B CN112662611 B CN 112662611B
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猿桥康一郎
西野泰斗
岩间武久
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Abstract

本申请涉及培养基组合物。本发明提供一种细胞及/或组织的培养方法，其特征在于，使用下述培养基组合物以悬浮状态培养细胞及/或组织，所述培养基组合物在液体培养基中添加纳米纤维，该纳米纤维在该溶液中均匀地分散，在不实质地提高该溶液的粘度的情况下实质地保持细胞及/或组织，从而具有防止其沉淀的效果。

Description

培养基组合物
本申请是申请日为2015年1月23日、发明名称为“培养基组合物”的中国发明专利申请No.201580005644.2(国际申请号为PCT/JP2015/051787)的分案申请。
技术领域
本发明涉及培养基组合物及其用途，所述培养基组合物用于使用多糖类等纳米纤维(提高了向水中的分散性)、特别是以三维或悬浮状态培养动植物细胞及/或组织。
背景技术
近年，用于对在动物和植物机体内发挥不同作用的多种器官、组织和细胞进行体外增殖或维持的技术在不断发展。对这些器官、组织进行的体外增殖或维持分别被称为器官培养、组织培养，对从器官、组织分离的细胞进行的体外增殖、分化或维持则被称为细胞培养。细胞培养是将经分离的细胞在培养基中进行体外增殖、分化或维持的技术，是为了详细分析生物体内各种器官、组织和细胞的功能和结构而必不可少的技术。此外，通过该技术培养的细胞和/或组织被用于以下多个领域：化学物质、药品等的药效和毒性评价；酶、细胞生长因子、抗体等有用物质的大规模生产；对因疾病、肢体欠损而失去的器官、组织、细胞加以弥补的再生医疗；植物品种改良；基因重组作物的制造等。
来自动物的细胞基于其性状被大体分为悬浮细胞和粘附细胞两大类。悬浮细胞是生长和增殖不需要支持物的细胞，粘附细胞是生长和增殖需要支持物的细胞，构成生物体的大部分细胞是后者即粘附细胞。作为粘附细胞的培养方法，已知有单层培养、分散培养、包埋培养(embedded culture)、微载体培养、及球体培养(sphere culture)等。
单层培养是将培养容器(由玻璃或各种经过表面处理的合成高分子材料制成)或者被称为饲养细胞(feeder cell)的辅助细胞作为支持物、对目标细胞进行单层状培养的方法，是最广为常见的。已经开发了利用各种形状或性状的培养容器的培养方法，所述培养容器例如为：对聚苯乙烯实施了各种表面处理(等离子体处理、电晕处理等)的培养容器，涂布有胶原蛋白、纤连蛋白、多聚赖氨酸等细胞粘附因子的培养容器，或者预先接种了饲养细胞的培养容器等。然而，单层培养存在如下问题：由于其二维培养环境与生物体内环境完全不同，所以无法长期维持细胞在生物体内具有的特异性功能，无法重构与生物体内同样的组织；由于相对一定面积而言的细胞数存在限度，所以不适合于细胞的大量培养；等等(专利文献1)。此外，在饲养细胞上培养目标细胞的方法会有饲养细胞与目标细胞的分离成为问题的情况(非专利文献1)。
分散培养是下述这样的培养方法：在培养基中接种细胞后，在实施了阻碍细胞附着的表面处理的培养容器中连续搅拌其培养液，由此阻碍细胞向培养容器的粘附，以悬浮状态培养粘附细胞。然而，对被以该方法培养的粘附细胞而言，向支持物的粘附是无法实现的，因此，该方法不能应用于为进行细胞增殖而必须粘附于支持物的细胞。另外，还有可能由于时常因剪切力而破碎导致无法发挥出本来的细胞功能，所以无法对具有功能的细胞进行大量培养的情况(非专利文献2)。
包埋培养是在琼脂、甲基纤维素、胶原凝胶、明胶、纤维蛋白、琼脂糖、藻酸盐等固体或半固体的凝胶基材中包埋细胞、将其固定来进行培养的方法。该方法由于能够以近似生物体内的状态三维培养细胞，并且有时凝胶基材自身也能促进细胞的增殖和分化，所以，与单层培养、分散培养相比，该方法能够以维持细胞功能的状态高密度地培养细胞(专利文献2、3)。此外，也开发了下述培养细胞的方法：以将细胞包埋于这些凝胶基材中的状态制成大小为100～300μm的微囊，在使该微囊分散的状态下在水溶液培养基中培养细胞(非专利文献3)。然而，这些方法具有如下问题：凝胶基材不透过可见光时无法进行对培养细胞的连续观察；由于含有凝胶基材的培养基、微囊具有高粘度，所以为了从培养基中回收细胞需要酶处理(例如，在胶原凝胶的情况下，胶原酶处理)等复杂且对细胞造成损害的操作；长期培养时所必需的培养基更换工作难于进行，等等。近年，已经开发了通过热、剪切力等处理使得细胞能够从凝胶基材中回收的技术，然而，热、剪切力等有可能对细胞功能产生不良影响，而且，该凝胶基材对生物体的安全性尚未明确(专利文献4、5，非专利文献4、5、6、7)。此外，在食品领域已经开发了溶胶状食品(以使切成小块的水果、蔬菜等粒状食品均匀分散、悬浮，并防止其沉淀、漂浮)，但是，对这类溶胶状食品而言未考虑过将分散的粒状食品回收的问题，没有研究过细胞、组织能否以悬浮状态进行培养的问题(专利文件6)。已知水溶液中的胶凝糖(Gellan)在钙离子的作用下凝胶化，形成微细结构(非专利文献8)
微载体培养是下述这样的方法：在比水稍重的微粒(下文也称为微载体)的表面上使细胞进行单层增殖，在烧瓶等培养容器内搅拌该微粒，进行悬浮状态下的培养。通常，该方法中使用的微载体是直径100～300μm、表面积3000～6000cm2/g、比重1.03～1.05的球状粒子，由葡聚糖、明胶、藻酸或聚苯乙烯等材料构成。在微载体的表面也可以赋予胶原蛋白、明胶或二甲基氨基乙基等带电基团以使细胞易于附着。由于该方法可以极大地增加培养面积，所以能应用于细胞的大量培养(专利文献7、8)。然而，产生如下问题：难以使目标细胞以近乎均匀的方式附着至所有微载体上，另外，在搅拌中剪切力的作用下细胞从微载体上脱离，细胞受到损害，等等(非专利文献9)。
球体培养是下述这样的培养方法：使目标细胞形成由数十～数百个细胞构成的聚集体(下文中也称为球体(sphere))，之后在培养基中对该聚集体以静置或振荡进行培养的方法。球体中，细胞密度高、与生物体内环境近似的细胞-细胞相互作用和细胞结构体得以被重构，与单层培养、分散培养方法相比更能以长期维持细胞功能的状态进行培养，这是已知的(非专利文献10、11)。然而，对于球体培养而言，在球体的大小过大时，球体内部的营养成分的供给和残屑废物的排出困难，因此，无法形成大的球体。另外，由于形成的球体需要在培养容器的底面以分散状态进行培养，所以难以增加相对一定体积而言的球体数，不适于大量培养。此外，作为球体的制作方法，已知有悬滴培养、在细胞非粘附表面上培养、微孔内培养、旋转培养、利用细胞支持物的培养，通过离心力、超声波、电场·磁场进行的凝聚等，但是这些方法的问题在于：操作复杂，球体的回收困难，大小控制和大规模生产困难，对细胞的影响未知，需要特殊的专用容器、设备，等等(专利文献9)。
另一方面，对于植物而言，也可以以无菌状态对细胞、除去了细胞壁的原生质体或植物的叶、茎、根、生长点、种子、胚、花粉等器官、组织、愈伤组织(callus)进行培养、增殖。使用这样的植物的组织、细胞的培养技术，植物的品种改良、有用物质的生产也成为可能。作为用于在短时间内大量增殖植物细胞、组织的方法，已知有将植物细胞、组织在液体培养基中进行悬浊培养的方法(非专利文献12)。为了实现其良好的增殖，供应足够的氧、维持均匀的混合状态、以及防止细胞破损等是重要的。关于向培养液中供氧以及对细胞、组织的悬浊，存在将通气和机械搅拌组合进行的方式，以及仅通过通气来进行的方式，但是，对于前者而言，存在因搅拌导致的细胞、组织破损而引起增殖不良的情况，另一方面，对于后者而言，虽然对细胞、组织的剪切较少，但存在如下问题：在高密度培养中有时难以维持均匀的混合状态，因此细胞、组织沉积，增殖效率降低，等等。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2001－128660号公报
专利文献2：日本特开昭62－171680号公报
专利文献3：日本特开昭63－209581号公报
专利文献4：日本特开2009－29967号公报
专利文献5：日本特开2005－60570号公报
专利文献6：日本特开平8－23893号公报
专利文献7：日本特开2004－236553号公报
专利文献8：国际公开第2010/059775号
专利文献9：日本特开2012－65555号公报
非专利文献
非专利文献1：Klimanskaya等,Lancet 2005,365:1636-1641
非专利文献2：King等,Curr Opin Chem Biol.2007,11:394-398
非专利文献3：Murua等,J.of Controlled Release 2008,132:76-83
非专利文献4：Mendes,Chemical Society Reviews 2008,37:2512-2529
非专利文献5：Moon等,Chemical Society Reviews 2012,41:4860-4883
非专利文献6：Pek等,Nature Nanotechnol.2008,3:671-675
非专利文献7：Liu等,Soft Matter 2011,7:5430-5436
非专利文献8：Perez－Campos等，Food Hydrocolloids 2012，28：291-300
非专利文献9：Leung等,Tissue Engineering 2011,17:165-172
非专利文献10：Stahl等,Biochem.Biophys.Res.Comm.2004,322:684-692
非专利文献11：Lin等,Biotechnol J.2008,3:1172-1184
非专利文献12：Weathers等,Appl Microbiol Biotechnol 2010,85:1339-1351
发明内容
发明所要解决的技术课题
本发明的目的在于解决上述现有技术的问题，提供用于特别是以三维或悬浮状态培养动植物细胞及/或组织的培养基组合物，并且提供使用该培养基组合物的动植物细胞及/或组织的培养方法。
用于解决课题的技术手段
本申请的发明人经过潜心研究，结果发现：通过在液体培养基中混合由纤维素、甲壳质等多糖类形成的纳米纤维，能够在不实质性地提高该液体培养基的粘度的情况下以将动植物细胞及/或组织静置的状态对其进行悬浮培养；通过使用此培养基组合物进行培养，细胞的增殖活性加剧。另外发现，不仅纤维素等非水溶性多糖类，而且脱酰基结冷胶等水溶性多糖类也能够在液体培养基中形成纤维状结构体，它们可以在不实质性地提高液体培养基的粘度的情况下以将动植物细胞及/或组织静置的状态对其进行悬浮培养。进而也发现，能够容易地从这些培养基组合物中回收所培养的细胞及/或组织。基于以上发现，通过进一步探讨，从而完成了本发明。
即，本发明如下所示：
[1]一种培养基组合物，其特征在于，所述培养基组合物能使细胞或组织悬浮进行培养，所述培养基组合物含有纳米纤维。
[2]如[1]所述的培养基组合物，其中，在培养时的培养基组合物的更换处理及培养结束后，可以回收细胞或组织。
[3]如[1]所述的培养基组合物，其中，在回收细胞或组织时，温度改变、化学处理、酶处理及剪切力均不需要。
[4]如[1]所述的培养基组合物，其特征在于，粘度为8mPa·s以下。
[5]如[1]所述的培养基组合物，其特征在于，所述纳米纤维的平均纤维直径为0.001～1.00μm，平均纤维长度(L)相对于平均纤维直径(D)的比(L/D)为2～500。
[6]如[1]所述的培养基组合物，其特征在于，所述纳米纤维由高分子化合物构成。
[7]如[6]所述的培养基组合物，其特征在于，所述高分子化合物为多糖类。
[8]如[7]所述的培养基组合物，其中，所述多糖类包括：
选自由纤维素、甲壳质及壳聚糖组成的组中的任意的非水溶性多糖类；或者
选自由透明质酸、结冷胶、脱酰基结冷胶、鼠李聚糖胶(rhamsan gum)、迪特胶(diutan gum)、黄原胶(xanthan gum)、卡拉胶、汉生胶(zanthan gum)、已糖醛酸(hexuronic acid)、岩藻多糖(fucoidan)、果胶、果胶酸(pectin acid)、果胶酯酸(pectinic acid)、硫酸乙酰肝素(heparan sulfate)、肝素、硫酸类肝素(heparitinsulfate)、硫酸角质(keratosulfate)、硫酸软骨素(chondroitin sulfate)、硫酸皮肤素(dermatan sulfate)、硫酸鼠李聚糖(rhamnan sulfate)、藻酸及它们的盐组成的组中的水溶性多糖类。
[9]如[8]所述的培养基组合物，其中，所述多糖类包含纤维素或者甲壳质。
[10]如[9]所述的培养基组合物，其特征在于，所述纳米纤维是通过粉碎得到的。
[11]如[1]至[10]中任一项所述的培养基组合物，用于细胞培养。
[12]如[11]所述的培养基组合物，其特征在于，所述细胞为粘附细胞或悬浮细胞。
[13]如[12]所述的培养基组合物，其特征在于，所述粘附细胞为球体。
[14]一种细胞或者组织培养物，其含有细胞或者组织，并且含有如[1]至[13]中任一项所述的培养基组合物。
[15]一种细胞或者组织的培养方法，其特征在于，在[1]至[13]中任一项所述的培养基组合物中培养细胞或组织。
[16]一种细胞或者组织的回收方法，其特征在于，从[14]所述的培养物中分离细胞或组织。
[17]如[16]所述的回收方法，其特征在于，所述分离采用离心分离进行。
[18]一种球体的制造方法，其特征在于，在[1]至[13]中任一项所述的培养基组合物中培养粘附细胞。
[19]一种培养基添加剂，其特征在于，所述培养基添加剂用于配制[1]至[13]中任一项所述的培养基组合物，所述培养基添加剂含有该纳米纤维或构成该纳米纤维的水溶性高分子化合物。
[20]一种培养基组合物的制造方法，其特征在于，将[19]所述的培养基添加剂与培养基混合。
[21]一种培养基组合物的制造方法，其特征在于，是[1]至[13]中任一项所述的培养基组合物的制造方法，将该纳米纤维或构成该纳米纤维的水溶性高分子化合物与培养基混合。
[22]一种细胞或者组织的保存方法，其特征在于，在[1]至[13]中任一项所述的培养基组合物中保存细胞或组织。
[23]一种细胞或者组织的输送方法，其特征在于，在[1]至[13]中任一项所述的培养基组合物中输送细胞或组织。
[24]一种细胞或者组织的增殖方法，其特征在于，在[1]至[13]中任一项所述的培养基组合物中培养细胞或组织。
[25]一种粘附细胞的传代培养方法，包括以下步骤：
(1)在[1]至[13]中任一项所述的培养基组合物中悬浮培养粘附细胞；以及
(2)不进行从培养容器中剥离细胞的操作，(i)在通过步骤(1)的悬浮培养而得到的含有粘附细胞的培养物中添加新鲜的[1]至[13]中任一项所述的培养基组合物、或者(ii)向新鲜的[1]至[13]中任一项所述的培养基组合物中添加全部或一部分的通过步骤(1)的悬浮培养而得到的含有粘附细胞的培养物。
[26]一种粘附细胞的增殖方法，包括如下步骤：在含有甲壳质纳米纤维的培养基组合物中，以粘附细胞附着于该甲壳质纳米纤维的状态进行悬浮培养。
[27]如[26]所述的方法，其中，培养基组合物中的甲壳质纳米纤维的含量为0.0001％(重量/容量)以上、且0.1％(重量/容量)以下。
发明效果
本发明提供一种含有纳米纤维、特别是由多糖类形成的纳米纤维的培养基组合物。使用该培养基组合物时，能够以悬浮状态培养细胞及/或组织，且不伴有存在引起细胞、组织损害、功能丧失的风险的如振荡、旋转等操作。并且，使用该培养基组合物时，在培养时能够容易地更换培养基，且也能够容易地回收所培养的细胞及/或组织。将该培养方法适用于从动物体或植物体采取的细胞及/或组织，能够不损伤其功能地大量配制目标细胞及/或组织。而且，在进行化学物质、药品等的药效及毒性评价、酶、细胞生长因子、抗体等有用物质的大量生产、对因疾病、肢体欠损而失去的器官、组织、细胞加以弥补的再生性医疗等时，能够利用由该培养方法得到的细胞及/或组织。
另外，使用本发明的培养基组合物时，由于能够在与生物体内接近的环境中维持细胞或组织，所以在细胞、组织的保存及输送中有用。例如，在培养板上对细胞进行粘附培养、并以此状态将其输送时，有时由于输送中的振动，细胞从培养板上剥离等，细胞具有的本来的功能降低，但对于本发明的培养基组合物来说，由于纳米纤维形成三维的网，通过其支撑细胞，能够在使细胞悬浮的状态下保持细胞，因此，能够避免由因输送中的振动引起的从板上的剥离等所导致的细胞损伤，从而在维持细胞本来功能的状态下保存及输送细胞。
附图说明
[图1]该图表示在培养基组合物中培养HepG2细胞的球体时球体被均匀地分散、且能够以悬浮状态进行培养。
[图2]该图表示在培养基组合物中培养HeLa细胞的球体时球体被均匀地分散、且能够以悬浮状态进行培养。
[图3]该图表示在培养基组合物中培养HeLa细胞的球体，对该球体进行显微镜观察时，与现有培养基相比球体之间的聚集被抑制。
[图4]该图表示在培养基组合物中培养附着了HepG2细胞的微载体时，HepG2细胞能够在微载体上增殖。
[图5]该图表示在培养基组合物中添加HeLa细胞的球体时球体被均匀地分散、且处于悬浮状态。
[图6]该图表示利用培养基组合物形成HeLa细胞的球体。
[图7]该图表示为结构体一实施方案的膜。培养基组合物中脱酰基结冷胶的浓度为0.02％(重量/容量)。
[图8]该图表示利用培养基组合物形成HepG2细胞的球体。
[图9]该图表示将附着了HepG2细胞的层粘连蛋白涂布GEM在培养基组合物中进行培养时的悬浮状态。
[图10]该图表示将包埋有HepG2细胞的藻酸珠在培养基组合物中进行培养时的悬浮状态。
[图11]该图表示将包埋有HepG2细胞的胶原蛋白凝胶胶囊在培养基组合物中进行培养时的悬浮状态。
[图12]该图表示在培养基组合物中培养来自水稻的愈伤组织时的悬浮状态。
[图13]表示25℃时的各培养基组合物的粘度。
[图14]表示实施例1的含有MNC的培养基组合物的扫描电子显微镜照片。
[图15]表示实施例2的含有PNC的培养基组合物的扫描电子显微镜照片。
[图16]表示实施例3的含有CT的培养基组合物的扫描电子显微镜照片。
[图17]表示实施例4的含有DAG的培养基组合物的扫描电子显微镜照片。
[图18]表示实施例5的含有Car的培养基组合物的扫描电子显微镜照片。于室温干燥。
[图19]表示实施例5的含有Car的培养基组合物的扫描电子显微镜照片。于110℃干燥。
[图20]表示比较例3的含有Xan的培养基组合物的扫描电子显微镜照片。
[图21]表示比较例4的含有DU的培养基组合物的扫描电子显微镜照片。
[图22]表示在实施例1的含有MNC的培养基组合物中将HepG2细胞的球体悬浮培养6天后的、球体分散状态的观察结果。从左侧开始，MNC浓度依次为0.01、0.03、0.05、0.07及0.1w/v％。
[图23]表示在实施例2的含有PNC的培养基组合物中将HepG2细胞的球体悬浮培养6天后的、球体分散状态的观察结果。从左侧开始，PNC浓度依次为0.01、0.03、0.05、0.07及0.1w/v％。
[图24]表示在实施例3的含有CT的培养基组合物中将HepG2细胞的球体悬浮培养6天后的、球体分散状态的观察结果。从左侧开始CT浓度依次为0.01、0.03、0.05、0.07及0.1w/v％。
[图25]表示在实施例4的含有DAG的培养基组合物中将HepG2细胞的球体悬浮培养6天后的、球体分散状态的观察结果。从左侧开始，DAG浓度依次为0.01、0.03、0.05、0.07及0.1w/v％。
[图26]表示在实施例5的含有Car的培养基组合物中将HepG2细胞的球体悬浮培养6天后的、球体分散状态的观察结果。从左侧开始，Car浓度依次为0.01、0.03、0.05、0.07及0.1w/v％。
[图27]表示在实施例5的含有Xan的培养基组合物中将HepG2细胞的球体悬浮培养6天后的、球体分散状态的观察结果。从左侧开始，Xan浓度依次为0.01、0.03、0.05、0.07及0.1w/v％。
[图28]表示在比较例4的含有DU的培养基组合物中将HepG2细胞的球体悬浮培养6天后的、球体分散状态的观察结果。从左侧开始，DU浓度依次为0.01、0.03、0.05、0.07及0.1w/v％。
[图29]表示在比较例5的含有Alg的培养基组合物中将HepG2细胞的球体悬浮培养6天后的、球体分散状态的观察结果。从左侧开始，Alg浓度依次为0.01、0.03、0.05、0.07及0.1w/v％。
[图30]表示在实施例1’及比较例5’的培养基组合物中将MCF7细胞开始进行悬浮培养后的第6天的RLU值。
[图31]表示在实施例2’及3’的培养基组合物中将MCF7细胞开始进行悬浮培养后的第6天的RLU值。
[图32]表示在实施例4’及实施例5’的培养基组合物中将MCF7细胞开始进行悬浮培养后的第6天的RLU值。
[图33]表示在比较例3’及4’的培养基组合物中将MCF7细胞开始进行悬浮培养后的第6天的RLU值。
[图34]表示在实施例1’及比较例5’的培养基组合物中将A375细胞开始进行悬浮培养后的第6天的RLU值。
[图35]表示在实施例2’及3’的培养基组合物中将A375细胞开始进行悬浮培养后的第6天的RLU值。
[图36]表示在实施例4’及实施例5’的培养基组合物中将A375细胞开始进行悬浮培养后的第6天的RLU值。
[图37]表示在比较例3’及4’的培养基组合物中将A375细胞开始进行悬浮培养后的第6天的RLU值。
[图38]是对悬浮培养开始第2天的、各培养基组合物中的MCF7细胞的分散状态进行显微镜观察的结果。
[图39]是对悬浮培养开始第2天的、各培养基组合物中的A375细胞的分散状态进行显微镜观察的结果。
[图40]是对悬浮培养开始第4天的、各培养基组合物中的MDCK细胞的分散状态进行显微镜观察的结果。
具体实施方式
以下，更详细地说明本发明。
本说明书中所使用的用语如下定义。
本发明中，细胞表示构成动物或植物的最基本的单元，作为其要素，在细胞膜的内部具有细胞质和各种细胞器。此时，包封DNA的核可以包含在细胞内部、也可以不包含在细胞内部。例如，本发明中的来自动物的细胞包括：精子、卵子等生殖细胞；构成生物体的体细胞；干细胞；祖细胞(progenitor cell)；从生物体分离的癌细胞；从生物体分离的、获得了永生能力并在体外被稳定地维持的细胞(细胞株)；从生物体分离的、且人工地进行了基因改变的细胞；从生物体分离的、且人工地进行了细胞核交换的细胞；等。作为构成生物体的体细胞的例子，包括：成纤维细胞、骨髓细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞、中性粒细胞、红细胞、血小板、巨噬细胞、单核细胞、骨细胞、骨髓细胞、周细胞、树突状细胞、角化细胞、脂肪细胞、间质细胞、上皮细胞、表皮细胞、内皮细胞、血管内皮细胞、肝细胞、软骨细胞、卵丘细胞、神经系统细胞、神经胶质细胞、神经元、少突胶质细胞、小胶质细胞、星形胶质细胞、心细胞、食管细胞、肌细胞(例如，平滑肌细胞或骨骼肌细胞)、胰腺β细胞、黑色素细胞、造血祖细胞及单核细胞等，但并不限定于此。该体细胞包括：例如从皮肤、肾、脾、肾上腺、肝、肺、卵巢、胰腺、子宫、胃、结肠、小肠、大肠、脾脏、膀胱、前列腺、睾丸、胸腺、肌肉、结缔组织、骨骼、关节、血管组织、血液、心脏、眼、脑或神经组织等任意组织采集的细胞。干细胞是同时具有自我复制能力和分化为其他多系统细胞的能力的细胞，作为其例子，包括：胚胎干细胞(ES细胞)、胚胎瘤细胞、胚胎生殖干细胞、人工多能干细胞(iPS细胞)、神经干细胞、造血干细胞、间充质干细胞、肝干细胞、胰腺干细胞、肌干细胞、生殖干细胞、肠干细胞、癌症干细胞、毛囊干细胞等，但并不限定于此。所谓祖细胞，是指处于从上述干细胞分化为特定的体细胞、生殖细胞的中途阶段的细胞。所谓癌细胞，是指由体细胞衍生并获得了无限增殖能力的细胞。所谓细胞株，是指通过在生物体外的人工操作获得了无限增殖能力的细胞，作为其例，包括：CHO(中国仓鼠的卵巣细胞株)、HCT116、Huh7、HEK293(人胎儿肾细胞)、HeLa(人子宫癌细胞株)、HepG2(人肝癌细胞株)、UT7/TPO(人白血病细胞株)、MDCK、MDBK、BHK、C－33A、HT－29、AE－1、3D9、Ns0/1、Jurkat、NIH3T3、PC12、S2、Sf9、Sf21、High Five(注册商标)、Vero等，但不限于此。
本发明中的来自植物的细胞，包括从植物体的各组织分离的细胞，也包括从该细胞中人工地除去细胞壁而得的原生质体。
本发明中的组织，是指几种具有不同特性、功能的细胞以一定方式集合而成的结构单元，作为动物组织的例子，包括上皮组织、结缔组织、肌肉组织、神经组织等。作为植物组织的例子，包括分裂组织、表皮组织、同化组织、叶肉组织、输导组织、机械组织、薄壁组织、去分化的细胞块(愈伤组织)等。
培养细胞及/或组织时，培养的细胞及/或组织可以从上文所述的细胞及/或组织中任意选择进行培养。细胞及/或组织可以直接从动物或植物体采取。细胞及/或组织也可以通过施加特定处理由动物或植物体衍生、生长或转化后采取。此时，该处理可以是生物体内的处理也可以是生物体外的处理。作为动物，例如可以举出鱼类、两栖动物类、爬行动物类、鸟类、泛甲壳动物类、六足类(Hexapoda)、哺乳动物等。作为哺乳动物的例子，可以举出大鼠、小鼠、兔、豚鼠、松鼠、仓鼠、田鼠、鸭嘴兽、海豚、鲸、犬、猫、山羊、牛、马、绵羊、猪、大象、普通狨、松鼠猴、猕猴、黑猩猩和人，但不限于此。作为植物，只要所采集的细胞及/或组织可以液体培养即可，没有特殊限制。例如，可以举出：生产药材类(例如，皂苷、生物碱、小檗碱、东莨菪苷、植物甾醇等)的植物(例如，人参、长春花、莨菪、黄连、颠茄等)；生产用作化妆品·食品原料的色素、多糖体(例如，花色素苷、红花色素、茜草色素、藏红花色素、黄酮等)的植物(例如，蓝莓、红花、茜草、藏红花等)；或产生药物原体的植物；等等，但并不限定于此。
本发明中，所谓细胞及/或组织的悬浮，是指细胞及/或组织不粘附于培养容器的状态(非粘附)。此外，在本发明中，使细胞及/或组织增殖、分化或维持时，在不伴有相对于液体培养基组合物而言的来自外部的压力、振动或者不伴有在该组合物中的振荡、旋转操作等的情况下，细胞及/或组织在该液体培养基组合物中均匀地分散并处于悬浮状态，将上述状态称为“悬浮静置”，将在该状态下培养细胞和/或组织称为“悬浮静置培养”。作为在“悬浮静置”中能够使其悬浮的时间，至少为5分钟以上，优选为1小时以上、24小时以上、48小时以上、6天以上、21天以上，但只要能够保持悬浮状态，就不限于上述时间。
在优选方案中，本发明的培养基组合物在能够维持、培养细胞及组织的温度范围(例如，0～40℃)的至少1点处，能够使细胞及/或组织悬浮静置。本发明的培养基组合物，优选在25～37℃的温度范围的至少1点处、最优选在37℃处，能够使细胞及/或组织悬浮静置。
能否实现悬浮静置可以如下评价：例如，使聚苯乙烯珠(尺寸500－600μm、Polysciences Inc.制)均匀地分散至评价对象的培养基组合物中，在25℃下静置，观察该细胞的悬浮状态能否维持至少5分钟以上(优选24小时以上、48小时以上)。
本发明的培养基组合物是含有纳米纤维和培养基的组合物，所述纳米纤维能够使细胞或组织悬浮进行培养(优选能够悬浮静置培养)。
该培养基组合物优选为在培养时的培养基组合物的更换处理及培养结束后可以回收细胞或组织的组合物，更优选为在回收细胞或组织时不需要任何的温度改变、化学处理、酶处理及剪切力的组合物。
[纳米纤维]
本发明的培养基组合物中含有的纳米纤维，具有使细胞及/或组织在液体培养基中均匀地悬浮的效果。更详细而言，作为本发明的培养基组合物中所含的纳米纤维，可以举出：低分子化合物、高分子化合物通过共价键、离子键、静电相互作用、疎水性相互作用、范德华力等聚集及自组织化从而在液体培养基中形成的纳米纤维；或者通过利用高压处理等将由高分子化合物构成的较大的纤维结构体进行微细化而得到的纳米纤维等。虽然理论上没有限制，但在本发明的培养基组合物中纳米纤维形成三维的网，其支撑细胞、组织，由此能够维持细胞、组织的悬浮状态。
在本说明书中，所谓纳米纤维，是指平均纤维直径(D)为0.001至1.00μm的纤维。本发明中使用的纳米纤维的平均纤维直径优选为0.005至0.50μm、更优选0.01至0.05μm、进一步优选0.01至0.02μm。如果平均纤维直径不足0.001μm，则有可能因纳米纤维过于微细，而无法获得悬浮效果，有可能无法改善含有其的培养基组合物的特性。
本发明中使用的纳米纤维的纵横比(L/D)由平均纤维长度/平均纤维直径得到，通常为2～500，优选为5～300，更优选为10～250。纵横比低于2时，在培养基组合物中的分散性欠缺，恐怕无法充分地获得悬浮作用。超过500时，意味着纤维长度变得极大，因此通过使该组合物的粘度提高，有可能阻碍培养基更换等传代操作。另外，培养基组合物变得难以透过可见光，因此导致透明性降低，难以对培养细胞进行经时观察，有可能对使用吸光·荧光·发光等的细胞评价产生阻碍。
需要说明的是，本说明书中，纳米纤维的平均纤维直径(D)如下求出。首先，将应研商事(株)制胶棉支持膜在日本电子(株)制Ion Cleaner(JIC－410)中实施3分钟亲水化处理，滴数滴为评价对象的纳米纤维分散液(用超纯水稀释)，室温干燥。将其用(株)日立制作所制穿透式电子显微镜(TEM、H－8000)(10,000倍)以加速电压200kV进行观察，使用所得的图像，针对样品数为200～250根的纳米纤维，测量一根一根的纤维直径，将其数平均值作为平均纤维直径(D)。
另外，平均纤维长度(L)如下求出。用纯水稀释为评价对象的纳米纤维分散液使其为100ppm，使用超声波清洗机使纳米纤维均匀地分散。将该纳米纤维分散液至于预先使用浓硫酸对表面进行了亲水化处理的硅片上，于110℃使其干燥1小时，制成试样。使用所得试样的通过日本电子(株)制扫描型电子显微镜(SEM、JSM－7400F)(2,000倍)观察到的图像，针对样品数为150～250根的纳米纤维，测量一根一根的纤维长度，将其数平均值作为平均纤维长度(L)。
本发明中使用的纳米纤维具有如下效果：与液体培养基混合时，在保持一次纤维径的同时该纳米纤维在该液体中均匀地分散，在不实质地提高该液体的粘度的情况下实质地保持细胞及/或组织，防止其沉淀。所谓不实质地提高液体的粘度，是指液体的粘度不超过8mPa·s。此时的该液体的粘度(即，通过本发明的制造方法制造的培养基组合物的粘度)为8mPa·s以下，优选为4mPa·s，更优选为2mPa·s以下。进而，只要具有下述效果，即，在使该纳米纤维分散在液体培养基中时在不实质地提高该液体的粘度的情况下使细胞及/或组织均匀地悬浮(优选使其悬浮静置)的效果，则纳米纤维的化学结构、分子量、物性等没有任何限制。
含有纳米纤维的液体的粘度，例如能够采用下述实施例中记载的方法进行测定。具体而言，可以在25℃条件下采用音叉振动式粘度测定(SV－1A、A&D Company Ltd.)进行评价。
作为构成纳米纤维的原料的例子，没有特别的限制，可以举出低分子化合物、高分子化合物。
作为本发明中使用的低分子化合物的优选具体例，没有特别的限制，例如可以举出L－异亮氨酸衍生物、L－缬氨酸衍生物、L－赖氨酸衍生物等氨基酸衍生物、反式－1，2－二氨基环己烷二酰胺衍生物等环己烷二胺衍生物、5-氨基间苯二甲酸衍生物、R－12－羟基硬脂酸、1，3，5－苯三酰亚胺、顺式－1，3，5－环己烷三酰胺、2，4－二亚苄基－D－山梨醇、N－月桂酰基－L－谷氨酸－α，γ－二－正丁基酰胺、脱氢松香酸钙等低分子凝胶化剂。
作为本发明中使用的高分子化合物的优选具体例，没有特别的限制，例如可以举出多糖类、多肽等。
所谓多糖类是指10个以上单糖类(例如，三碳糖、四碳糖、五碳糖、六碳糖、七碳糖等)聚合而成的糖聚合物。多糖类包括非水溶性多糖类及水溶性多糖类。
作为非水溶性多糖类，可以举出纤维素、半纤维素等纤维素类；甲壳质、壳聚糖等壳质等，但不限定于此。
作为水溶性多糖类，可以举出具有阴离子性官能团的酸性多糖类。作为具有阴离子性官能团的酸性多糖类，没有特殊的限制，例如可以举出：结构中具有糖醛酸(例如，葡糖醛酸、艾杜糖醛酸、半乳糖醛酸、甘露糖醛酸)的多糖类；结构中具有硫酸或者磷酸的多糖类、或具有其两者结构的多糖类等。更具体而言，可以例举出由选自透明质酸、结冷胶、脱酰基结冷胶(DAG)、鼠李聚糖胶、迪特胶、黄原胶、卡拉胶、汉生胶、已糖醛酸、岩藻多糖、果胶、果胶酸、果胶酯酸、硫酸乙酰肝素、肝素、硫酸类肝素、硫酸角质、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸鼠李聚糖、藻酸及它们的盐中的1种或者2种以上构成的物质。
作为此处所谓的盐，可以举出锂、钠、钾这样的碱金属的盐；钙、钡、镁这样的碱土类金属的盐；铝、锌、铜、铁等的盐；铵盐；四乙基铵、四丁基铵、甲基三丁基铵、十六烷基三甲基铵、苄基甲基己基癸基铵、胆碱等季铵盐；吡啶、三乙基胺、二异丙基胺、乙醇胺、二乙醇胺、三羟甲基氨基甲烷(tromethamine)、葡甲胺、普鲁卡因、氯普鲁卡因等有机胺的盐；甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸等氨基酸的盐等。
作为多肽，可以举出在生物体中构成纤维的多肽。具体而言，可以举出胶原蛋白、弹性蛋白(elastin)、肌球蛋白、角蛋白、淀粉样蛋白(amyloids)、蚕丝蛋白、肌动蛋白、微管蛋白等，但不限于此。
作为构成本发明所使用的纳米纤维的原料，不仅包括来自天然的物质，还包括由微生物产生的物质、通过基因工程产生的物质、或着使用酶、化学反应人工地合成的物质。构成本发明所使用的纳米纤维的原料，优选来自天然的物质(即，由天然萃取的物质)、或者将其通过化学反应或酶反应进行修饰而得到的物质。
在一实施方案中，多糖类为非水溶性多糖类。作为优选的非水溶性多糖类可以举出纤维素；甲壳质、壳聚糖等壳质。考虑到能够降低培养基组合物的粘度以及易于回收细胞或组织，最优选纤维素及甲壳质。
所谓纤维素，是指葡萄糖的6元环即D－吡喃型葡萄糖通过β－1、4糖苷键键合而成的天然高分子化合物。作为原料，例如可以使用木材、竹、麻、黄麻、槿麻、棉花、农作物·食物残渣等来自植物的纤维素、或者细菌纤维素、刚毛藻(cladophora)、灰色植物(glaucocystis)、法囊藻(valonia)、海鞘纤维素(tunicin)等由微生物产生的或者动物产生的纤维素。对于来自植物的纤维素来说，被称为微原纤维的非常细的纤维进一步成束、与原纤维、薄片、纤维细胞阶段地形成高级结构。另外，对于细菌纤维素而言，由菌细胞分泌的纤维素的微原纤维以其原来的粗细形成微细网结构。
本发明中，棉花、细菌纤维素等高纯度的纤维素原料能够以原料状态直接使用，但除此以外的来自植物的纤维素等，优选使用经过提纯分离·精制的物质。本发明中优选使用的纤维素为棉花纤维素、细菌纤维素、牛皮纸浆纤维素、微晶纤维素等。特别是，由于具有高悬浮作用，所以优选使用牛皮纸浆纤维素。
所谓壳质，是指选自由甲壳质及壳聚糖组成的组中的1种以上的糖质。构成甲壳质及壳聚糖的主要糖单元分别为N－乙酰基葡糖胺及葡糖胺，一般情况下，N－乙酰基葡糖胺的含量多、对酸性水溶液为难溶性的为甲壳质，葡糖胺的含量多、对酸性水溶液为可溶性的为壳聚糖。本说明书中，为了方便，将结构糖中N－乙酰基葡糖胺所占的比例为50％以上的称为甲壳质，低于50％的称为壳聚糖。从实现高悬浮作用的观点考虑，构成甲壳质的糖单元中N－乙酰基葡糖胺所占的比例越高越优选。构成甲壳质的糖单元中N－乙酰基葡糖胺所占的比例优选为80％以上、更优选为90％以上、进一步优选为98％以上、最优选为100％。
作为甲壳质的原料，可以使用例如虾、蟹、昆虫、贝、蘑菇等很多生物资源。本发明中使用的甲壳质可以是来自蟹壳、虾壳的甲壳质等具有α型结晶结构的甲壳质，也可以是来自乌贼甲壳的甲壳质等具有β型结晶结构的甲壳质。蟹、虾的外壳多作为产业废弃物被处理，从容易获得且有效利用的观点考虑，优选作为原料，但为了除去以杂质的形式含有的蛋白质、灰分等，需要脱蛋白工序及脱灰工序。因此，在本发明中，优选使用已经进行了脱基体处理的精制甲壳质。精制甲壳质被市售。
在一实施方案中，多糖类为水溶性多糖类。作为优选的水溶性多糖类，可以举出脱酰基结冷胶、卡拉胶等。从实现高悬浮作用的观点考虑，最优选脱酰基结冷胶。
所谓脱酰基结冷胶，是以4分子的糖(1－3键合的葡萄糖、1－4键合的葡糖醛酸、1－4键合的葡萄糖及1－4键合的鼠李糖)为结构单元的直链状高分子多糖类，是下述通式(I)(式中，R1、R2均为氢原子，n为2以上的整数)所示的多糖类。其中，R1可以含有甘油基，R2可以含有乙酰基，乙酰基及甘油基的含量优选为10％以下、更优选为1％以下。
作为结冷胶的制造方法，在发酵培养基中对生产微生物进行培养，将在菌体外产生的粘膜物采用通常纯化方法回收，可以在干燥、粉碎等工序后制成粉末状。另外，对于脱酰基结冷胶而言，在发酵培养基中培养生产结冷胶的微生物，回收在菌体外产生的粘膜物。此时，可以对粘膜物实施碱处理，将与1－3键合的葡萄糖残基键合的甘油基和乙酰基脱酰基化后进行回收。从回收的粘膜物中纯化脱酰基结冷胶可以通过单独地或以任意顺序组合使用下述方法、或反复使用下述方法来实施，所述方法例如为：液－液萃取、分级沉淀、结晶化、各种离子交换色谱法、使用Sephadex LH－20等的凝胶渗透色谱法、基于利用活性炭、硅胶等进行的吸附层析法或薄层层析法的活性物质的吸脱处理、或使用反向柱的高效液相色谱法等。作为结冷胶的生产微生物的例子，可以举出多沼鞘氨醇单胞菌(Sphingomonaselodea)及改变该微生物基因而得到的微生物，但并不限定于此。
而且，为脱酰基结冷胶的情况下，可以使用市售物，例如三晶株式会社制“KELCOGEL(CP Kelco公司的注册商标)CG－LA”、三荣源F·F·I株式会社制“KELCOGEL(CPKelco公司的注册商标)”等。
本发明中使用的高分子化合物的重均分子量优选为1,000至50,000,000，更优选为10,000至20,000,000，进一步优选为100,000至10,000,000。例如，该分子量可以通过利用凝胶渗透色谱法(GPC)的聚乙二醇或茁霉多糖(pullulan)换算、水溶液粘度等来进行估算。
本发明中，可以组合使用多种(优选2种)上述高分子化合物。关于高分子化合物的组合的种类，只要能够在培养基组合物中形成纳米纤维或以纳米纤维的形式分散、且在不实质地提高该液体培养基粘度的情况下使细胞及/或组织悬浮(优选使其悬浮静置)即可，没有特殊限制，但优选该组合至少含有纤维素、甲壳质、胶原蛋白或脱酰基结冷胶。即，优选的高分子化合物的组合中包含：纤维素、甲壳质、胶原蛋白或脱酰基结冷胶；及除此以外的高分子化合物(例如，黄原胶、藻酸、卡拉胶、迪特胶、甲基纤维素、刺槐豆胶(Locust BeanGum)或者它们的盐)。
[纳米纤维的配制]
本发明的培养基组合物含有由上述原料配制的纳米纤维。对于纳米纤维的配制方法来说，在作为原料使用非水溶性的高分子化合物(例如，纤维素、甲壳质等非水溶性多糖类)时、与在作为原料使用水溶性高分子化合物(例如，脱酰基结冷胶等水溶性多糖类)时是不同的。
纳米纤维的原料为非水溶性的高分子化合物(例如，纤维素、甲壳质等非水溶性多糖类)的情况下，通常通过将该原料粉碎得到纳米纤维。粉碎方法没有限制，但为了微细化至与本发明目的相适的下述纤维直径·纤维长度，优选高压均化器、研磨机(石磨)或球磨机等介质搅拌磨这样的能够获得强剪切力的方法。
其中，优选使用高压均化器进行微细化，例如期望使用日本特开2005－270891号公报、专利第5232976号中公开的湿式粉碎法进行微细化(粉碎化)。具体而言，可以通过使用下述装置来实施，即，在高压下从一对喷嘴分别将分散有原料的分散液喷射出、使其碰撞由此将原料粉碎的装置，例如Starburst System((株)SUGINO MACHINE制的高压粉碎装置)、Nanovater(吉田机械兴业(株)的高压粉碎装置)。
使用上述高压均化器将原料微细化(粉碎化)时，微细化、均质化的程度依赖于向高压均化器的超高压室所压送的压力、超高压室中所通过的次数(处理次数)及水分散液中原料的浓度。压送压力(处理压力)通常为50～250MPa，优选为150～245MPa。压送压力不足50MPa时，纳米纤维的微细化变得不充分，有可能无法获得通过微细化所期待的效果。
另外，微细化处理时的水分散液中的原料的浓度为0.1质量％～30质量％、优选为1质量％～10质量％。如果水分散液中的原料的浓度不足0.1质量％，则生产率低，如果浓度高于30质量％，则粉碎效率低，无法得到所期望的纳米纤维。微细化(粉碎化)的处理次数没有特殊的限定，虽然也取决于所述水分散液中的原料的浓度，但原料的浓度为0.1～1质量％时，处理次数为10～100次左右即可充分地微细化，浓度为1～10质量％时，则需要10～1000次左右。另外，为超过30质量％的高浓度时，由于处理次数需要达数千次以上，高粘度化进行至对处理产生阻碍的程度，所以从工业的观点考虑，是不现实的。
纳米纤维的原料使用水溶性的高分子化合物(例如，脱酰基结冷胶等水溶性多糖类)的情况下，将该物质添加至培养基中时，该物质通过培养基中的金属阳离子而聚集，在培养基中形成纳米纤维，其构筑成三维网结构，由此，其结果形成使细胞或组织悬浮进行培养的纳米纤维。
对于本发明的培养基组合物中的纳米纤维的浓度而言，可以对其进行适当的设定使得在不实质地提高培养基的粘度的情况下使细胞及/或组织悬浮(优选使其悬浮静置)，通常为0.0001％至1.0％(重量/容量)，例如为0.0005％至1.0％(重量/容量)，优选为0.001％至0.5％(重量/容量)，较优选为0.005％至0.1％(重量/容量)，进一步优选在0.005％至0.05％(重量/容量)的范围内。
例如，为纤维素纳米纤维的情况下，通常可以以0.0001％至1.0％(重量/容量)、例如0.0005％至1.0％(重量/容量)、优选0.001％至0.5％(重量/容量)、较优选0.01％至0.1％(重量/容量)、更优选0.01％至0.05％(重量/容量)的浓度添加到培养基中。
为纤维素纳米纤维中的纸浆纤维素纳米纤维的情况下，其在培养基中的浓度的下限值，从呈现悬浮作用的观点及可以进行悬浮静置培养的观点考虑，优选为0.01％(重量/容量)以上、0.015％(重量/容量)以上、0.02％(重量/容量)以上、0.025％(重量/容量)以上、或者0.03％(重量/容量)以上。另外，为纸浆纤维素纳米纤维的情况下，其在培养基中的浓度的上限值从不实质地提高培养基粘度的观点考虑，优选为0.1％(重量/容量)以下或0.04％(重量/容量)以下。
为微结晶纤维素纳米纤维的情况下，其在培养基中的浓度的下限值从呈现悬浮作用的观点考虑，优选为0.01％(重量/容量)以上、0.03％(重量/容量)以上、或0.05％(重量/容量)以上。从可以进行悬浮静置培养的观点考虑，培养基中的微结晶纤维素纳米纤维浓度的下限值，优选为0.03％(重量/容量)以上或者0.05％(重量/容量)以上。另外，为微结晶纤维素纳米纤维的情况下，其在培养基中的浓度的上限值优选为0.1％(重量/容量)以下。
为甲壳质纳米纤维的情况下，通常可以以0.0001％至1.0％(重量/容量)，例如0.0005％至1.0％(重量/容量)、优选0.001％至0.5％(重量/容量)、较优选0.01％至0.1％(重量/容量)、最优选0.03％至0.07％(重量/容量)的浓度添加至培养基中。从呈现悬浮作用的观点考虑，在培养基中的甲壳质纳米纤维浓度的下限值优选为0.0001％(重量/容量)以上、0.0003％(重量/容量)以上、0.0005％(重量/容量)以上或者0.001％(重量/容量)以上。从可以进行悬浮静置培养的观点考虑，培养基中的甲壳质纳米纤维的下限值优选为0.03％(重量/容量)以上。培养基中的甲壳质纳米纤维浓度的上限值优选为0.1％(重量/容量)以下。
对于纤维素纳米纤维、甲壳质纳米纤维等非水溶性的纳米纤维而言，通常只要为0.1％(重量/容量)以下的浓度，即可不实质地提高培养基组合物的粘度。
为卡拉胶的情况下，可以以0.0005％至1.0％(重量/容量)、优选0.001％至0.5％(重量/容量)、较优选0.01％至0.1％(重量/容量)、最优选0.02％至0.1％(重量/容量)的浓度添加到培养基中。从呈现悬浮作用的观点及可以进行悬浮静置培养的观点考虑，培养基中的卡拉胶浓度的下限值优选为0.01％以上。培养基中的卡拉胶浓度的上限值优选为0.1％(重量/容量)以下。从不实质地提高培养基粘度的观点考虑，另外也优选将卡拉胶的上限值设定为0.04％(重量/容量)以下。
为脱酰基结冷胶的情况下，通常可以以0.001％至1.0％(重量/容量)、例如0.005％至1.0％(重量/容量)、优选0.003％至0.5％(重量/容量)、较优选0.01％至0.1％(重量/容量)、更优选0.01至0.05％(重量/容量)、最优选0.01％至0.02％(重量/容量)的浓度添加至培养基中。从呈现悬浮作用的观点考虑，培养基中的脱酰基结冷胶浓度的下限值优选为0.005％(重量/容量)以上或者0.01％以上。从可以进行悬浮静置培养的观点考虑，培养基中的脱酰基结冷胶浓度的下限值优选为0.01％(重量/容量)以上。从不实质地提高培养基粘度的观点考虑，培养基中的脱酰基结冷胶浓度的上限值为0.05％(重量/容量)以下。从不实质地提高培养基的粘度的观点考虑，另外也优选将脱酰基结冷胶的上限值设定为0.04(重量/容量)％以下。
[多糖类的并用]
除了上述纳米纤维之外，还可以组合多种(优选2种)多糖类进行使用。对于多糖类的浓度而言，可以在能够不实质地提高该液体培养基的粘度且使细胞及/或组织均匀地悬浮(优选使其悬浮静置)的范围内适当地设定。例如，组合使用纳米纤维和多糖类的情况下，作为纳米纤维的浓度，可以例举0.005～0.1％(重量/容量)、优选0.01～0.07％(重量/容量)，作为多糖类的浓度，可以例举0.005～0.4％(重量/容量)、优选0.1～0.4％(重量/容量)。作为具体的浓度范围的组合，以下给出例子。
纤维素或甲壳质纳米纤维：0.005～0.1％(优选0.01～0.07％)(重量/容量)
多糖类
黄原胶：0.1～0.4％(重量/容量)
藻酸钠：0.1～0.4％(重量/容量)(优选0.0001～0.4％(重量/容量))
刺槐豆胶：0.1～0.4％(重量/容量)
甲基纤维素：0.1～0.4％(重量/容量)(优选0.2～0.4％(重量/容量))
卡拉胶：0.05～0.1％(重量/容量)
迪特胶：0.05～0.1％(重量/容量)
天然结冷胶：0.0001～0.4％(重量/容量)
需要说明的是，该浓度可以采用下式算出。
浓度(％)＝纳米纤维的重量(g)/培养基组合物的容量(ml)×100
[金属阳离子]
在一实施方案中，在本发明的培养基组合物中含有金属阳离子、例如2价的金属阳离子(钙离子、镁离子、锌离子、铁离子及铜离子等)、优选钙离子。特别是，本发明的培养基组合物中所含的纳米纤维由水溶性的高分子化合物(例如，脱酰基结冷胶等水溶性多糖类)构成时，本发明的培养基组合物优选含有上述金属阳离子。其原因在于，通过含有金属阳离子，该水溶性的高分子化合物(例如，脱酰基结冷胶等水溶性多糖类)经由金属阳离子聚集，在培养基组合物中形成纳米纤维，其构筑三维网结构，由此，结果形成能够使细胞或组织悬浮进行培养的纳米纤维。
[培养基]
作为本发明的培养基组合物中所含的培养基，例如可以举出Dulbecco’sModified Eagles’s Medium(DMEM)、Ham F12培养基(Ham’s Nutrient Mixture F12)、DMEM/F12培养基、McCoy 5A培养基(McCoy’s5A Medium)、Eagles MEM培养基(Eagles’sMinimum Essential Medium；EMEM)、αMEM培养基(alpha Modified Eagles’s MinimumEssential Medium；αMEM)、MEM培养基(Minimum Essential Medium)、RPMI1640培养基、Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium(IMDM)、MCDB131培养基、William培养基E、IPL41培养基、Fischer’s培养基、StemPro34(Invitrogen公司制)、X-VIVO 10(Cambrex公司制)、X-VIVO 15(Cambrex公司制)、HPGM(Cambrex公司制)、StemSpan H3000(STEMCELLTechnologies公司制)、StemSpanSFEM(STEMCELL Technologies公司制)、StemlineII(Sigma Aldrich公司制)、QBSF－60(Qualitybiological公司制)、StemProhESCSFM(Invitrogen公司制)、mTeSR1或2培养基(STEMCELL Technologies公司制)、Sf－900II(Invitrogen公司制)、Opti－Pro(Invitrogen公司制)等。
细胞及/或组织来自植物时，作为培养基可以举出如下培养基：植物组织培养通常使用的Murashige Skoog(MS)培养基、Linsmaier Skoog(LS)培养基、White培养基、Gamborg’s B5培养基、Niche培养基、Hela培养基、Morel培养基等基本培养基、或在将上述培养基成分改良至最适浓度的改良培养基(例如，使氨态氮浓度为半量等)中以适当浓度添加生长素类及根据需要的细胞分裂素类等植物生长调节物质(植物激素)而得到的培养基。这些培养基中，根据需要可以进一步补充酪蛋白降解酶、玉米浆、维生素类等。作为生长素类，例如可以举出3－吲哚乙酸(IAA)、3－吲哚丁酸(IBA)、1－萘乙酸(NAA)、2，4－二氯苯氧乙酸(2，4－D)等，但并不限定于此。生长素类例如可以以约0.1～约10ppm的浓度添加到培养基中。作为细胞分裂素类，例如可以举出激动素、苄基腺嘌呤(BA)、玉米素等，但不限于此。细胞分裂素类例如可以以约0.1～约10ppm的浓度添加到培养基中。
本领域技术人员可以根据目的在上述培养基中自由地添加钠、钾、钙、镁、磷、氯、各种氨基酸、各种维生素、抗生素、血清、脂肪酸、糖等。培养来自动物的细胞及/或组织时，本领域技术人员也可以根据目的组合添加一种以上的其他化学成分或生物体成分。作为在来自动物的细胞及/或组织的培养基中所添加的成分，可以举出胎牛血清、人血清、马血清、胰岛素、转铁蛋白、乳铁蛋白、胆固醇、乙醇胺、亚硒酸钠、硫代甘油、2-巯基乙醇、牛血清白蛋白、丙酮酸钠、聚乙二醇、各种维生素、各种氨基酸、琼脂、琼脂糖、胶原、甲基纤维素、各种细胞因子、各种激素、各种增殖因子、各种胞外基质、各种细胞粘附分子等。作为可以添加至培养基中的细胞因子，例如可以举出白细胞介素－1(IL－1)、白细胞介素－2(IL－2)、白细胞介素－3(IL－3)、白细胞介素－4(IL－4)、白细胞介素－5(IL－5)、白细胞介素－6(IL－6)、白细胞介素－7(IL－7)、白细胞介素－8(IL－8)、白细胞介素－9(IL－9)、白细胞介素－10(IL－10)、白细胞介素－11(IL－11)、白细胞介素－12(IL－12)、白细胞介素－13(IL－13)、白细胞介素－14(IL－14)、白细胞介素－15(IL－15)、白细胞介素－18(IL－18)、白细胞介素－21(IL－21)、干扰素α(IFN－α)、干扰素β(IFN－β)、干扰素γ(IFN－γ)、粒细胞集落刺激因子(G－CSF)、单核细胞集落刺激剂(M－CSF)、粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子(GM－CSF)、干细胞因子(SCF)、flk2/flt3配体(FL)、白血病细胞阻害因子(LIF)、制瘤素M(OM)、促红细胞生成素(EPO)、促血小板生成素(TPO)等，但并不限定于此。
作为可以添加至培养基中的激素，可以举出褪黑激素、血清素、甲状腺素、三碘甲状腺氨酸、肾上腺素、去甲肾上腺素、多巴胺、抗穆勒氏管激素、脂联素、促肾上腺皮质激素、血管紧张素原及血管紧张素、抗利尿激素、心房钠尿肽、降钙素、缩胆囊素、促肾上腺皮质激素释放激素、促红细胞生成素、卵泡刺激素、促胃液素、生长素释放肽、胰高血糖素、促性腺激素释放激素、生长激素释放激素、人绒毛膜促性腺激素、人胎盘催乳素、生长激素、抑制素、胰岛素、胰岛素样生长因子、瘦素、促黄体激素、黑素细胞刺激素、催产素、甲状旁腺激素、催乳素、胃泌素释放肽、促生长素抑制素、血小板生成素、甲状腺刺激激素、促甲状腺激素释放激素、皮质醇、醛固酮、睾酮、脱氢表雄酮、雄烯二酮、双氢睾酮、雌二醇、雌酮、雌三醇、黄体酮、骨化三醇、骨化二醇、前列腺素、白三烯、前列环素、血栓素、催乳激素释放激素、促脂素、脑钠肽、神经肽Y、组胺、内皮素、胰多肽、肾素及脑啡肽，但并不限定于此。
作为在培养基中添加的生长因子，可以举出转化生长因子－α(TGF－α)、转化生长因子－β(TGF－β)、巨噬细胞炎性蛋白－1α(MIP－1α)、上皮细胞生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子－1、2、3、4、5、6、7、8或9(FGF－1、2、3、4、5、6、7、8、9)、神经细胞生长因子(NGF)肝细胞生长因子(HGF)、白血病抑制因子(LIF)、蛋白酶连接蛋白I、蛋白酶连接蛋白II、血小板衍生的生长因子(PDGF)、胆碱能分化因子(CDF)、趋化因子、Notch配体(Deltal等)、Wnt蛋白、血管生成素样蛋白2、3、5或7(Angpt 2、3、5、7)、胰岛素样生长因子(IGF)、胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP)、多效蛋白(Pleiotrophin)等，但并不限定于此。
另外，也可以添加通过基因重组技术人工改变这些细胞因子、生长因子的氨基酸配列而得到的物质。作为其例，可以举出IL－6/可溶性IL－6受体复合体或Hyper IL－6(IL－6与可溶性IL－6受体的融合蛋白)等。
作为各种细胞外基质、各种细胞粘附分子的例子，可以举出胶原蛋白I至XIX、纤连蛋白、玻连蛋白、层粘连蛋白－1至12、Nitogen(日语：ニトジェン)、腱生蛋白、血小板反应蛋白，Von Willebrand因子、骨桥蛋白、纤维蛋白原、各种弹性蛋白、各种蛋白聚糖、各种钙粘素、桥粒糖蛋白(desmocollin)、桥粒芯糖蛋白(desmogleins)、各种整联蛋白、E-选择蛋白、P-选择蛋白、L-选择蛋白、免疫球蛋白超家族、Matrigel、聚-D-赖氨酸、聚-L-赖氨酸、甲壳质、壳聚糖、琼脂糖、透明质酸、藻酸凝胶、各种水凝胶、以及它们的切割断片等。
作为可以添加至培养基中的抗生素的例子，可以举出磺胺类制剂、青霉素、苯氧乙基青霉素、甲氧西林、苯唑西林、氯唑西林、双氯西林、氟氯西林、萘夫西林、氨苄青霉素、青霉素、阿莫西林、环己西林、羧苄西林、替卡西林、哌拉西林、阿洛西林、美洛西林、美西林、阿德诺西林(Amdinocillin)、头孢菌素及其衍生物、奥索利酸、氨氟沙星、替马沙星、萘啶酸、吡咯米酸、环丙沙星、西诺沙星、诺氟沙星、甲氟哌酸、Rosaxacin、氧氟沙星、依诺沙星、吡哌酸、舒巴坦、克拉维酸、β-溴青霉烷酸(β-bromopenicillanic acid)、β-氯青霉烷酸(β-chloropenicillanic acid)、6-乙酰基亚甲基-青霉烷酸、头孢噁唑、Sultampicillin、Adinoshirin及舒巴坦甲醛水合物酯(sulbactam formaldehyde hudrate ester)、他佐巴坦、氨曲南(Aztreonam)、Sulfazethin、Isosulfazethin、Norcardicin、间羧基苯基、苯乙酰氨基膦酸甲酯(phenylacetamidophosphonic acid methyl)、氯四环素、土霉素、四环素、地美环素、多西环素、美他环素和米诺环素。
[培养基组合物的制造方法]
将上述纳米纤维与培养细胞及/或组织时所用的培养基混合，使其成为能够在不实质地提高液体培养基的粘度的情况下使细胞及/或组织均匀地悬浮(优选使其悬浮静置)的浓度，由此能够制造上述本发明的培养基组合物。本发明也提供上述本发明的培养基组合物的制造方法。
关于该纳米纤维的形状，可以为粉末、片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂这样的被制剂化的固体、适当的生理性水性介质中的分散液这样的液体、或者为与基板、单体结合的状态。作为制剂化时的添加物，可以举出对羟基苯甲酸酯类等的防腐剂；乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇等赋形剂；硬脂酸镁、滑石等润滑剂；聚乙烯醇、羟丙基纤维素、明胶等粘合剂；脂肪酸酯等表面活性剂；甘油等增塑剂等。这些添加物并不限定于上述物质，只要本领域技术人员可以利用即可，可以自由地选择。灭菌方法没有特别限制，例如可以举出放射线灭菌、环氧乙烷气体灭菌、高压釜灭菌、过滤灭菌等。
在优选方案中，通过将上述纳米纤维的在生理性水性介质中的分散液与液体培养基混合，配制本发明的培养基组合物。该分散液可以被灭菌(高压釜、γ射线灭菌等)。或者，也可以在将该分散液与液体培养基(培养基的水溶液)(将粉末培养基溶于水而配制得到的)混合后，灭菌进行使用。该分散液和液体培养基的灭菌可以在混合前分别地进行。作为水性介质的例子，可以举出水、二甲基亚砜(DMSO)等，但并不限定于此。作为水性介质，优选水。在水性介质中可以含有适当的缓冲剂、盐。上述纳米纤维的分散液作为用于配制本发明的培养基组合物的培养基添加剂是有用的。本发明也提供该培养基添加剂。
对于混合比率而言，纳米纤维的分散液：液体培养基(培养基的水溶液)通常为1：99～99：1，优选为10：90～90：10，较优选为20：80～80：20。
需要说明的是，纳米纤维由水溶性高分子化合物(例如，脱酰基结冷胶等水溶性多糖类)构成时，代替将该纳米纤维与培养基混合，而是将该水溶性的高分子化合物(例如，脱酰基结冷胶等水溶性多糖类)与培养基混合，在该培养基中使其形成纳米纤维，由此也可以制造本发明的培养基组合物。该高分子化合物的形状可以是：粉末、片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂这样的被制剂化而成的固体；在适当的介质以及溶解剂中溶解而成的溶液或混悬液这样的液体；或者与基板、载体结合的状态。作为制剂化时的添加物，可以举出对羟基苯甲酸酯类等防腐剂；乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇等赋形剂；硬脂酸镁、滑石等润滑剂；聚乙烯醇、羟丙基纤维素、明胶等粘合剂；脂肪酸酯等表面活性剂；甘油等增塑剂等。这些添加物并不限定于此，只要本领域技术人员能够利用即可，可以自由地选择。
另外，上述高分子化合物也可以根据需要实施灭菌处理。灭菌方法没有特别限制，例如可以举出放射线灭菌、环氧乙烷气体灭菌、高压釜灭菌、过滤灭菌等。
在优选方案中，水溶性的高分子化合物(例如，脱酰基结冷胶等水溶性多糖类)的水溶液(将其作为培养基添加剂2。)可以用于本发明的制造方法。该水溶液可以通过将水溶性的高分子化合物的固体(例如，粉末)溶解于生理性水性介质而得到。作为水性介质的例子可以举出水、二甲基亚砜(DMSO)等，但并不限定于此。作为水性介质优选水。
在水性介质中，可以含有适当的缓冲剂、盐。该水性介质中可以含有也可以不含2价金属阳离子，但在优选方案中不含2价金属阳离子。其原因在于，水性介质中不含2价金属阳离子时，在该水溶液中水溶性高分子化合物(例如，脱酰基结冷胶等水溶性多糖类)难以形成能够将细胞或组织悬浮进行培养的纳米纤维，在溶解于水中的状态下能够稳定保存。
上述培养基添加剂中也可以进一步添加提高纳米纤维效果、降低使用时的浓度这样的添加物。作为上述添加剂的例子，可以混合1种以上的瓜尔胶、罗望子胶(tamarindgum)、藻酸丙二醇酯、刺槐豆胶、阿拉伯树胶、刺云实胶(tara gum)、罗望子胶、甲基纤维素等多糖类。
举例说明本发明的培养基组合物的制造方法，但本发明并不限定于此。将纳米纤维添加至离子交换水或超纯水中。而且，于室温搅拌直至分散至整体均匀的状态后，进行灭菌(例如，于121℃高压釜灭菌20分钟)。一边将静置培养中使用的任意培养基进行搅拌(例如，均相混合机(homomixer)等)，一边向该培养基中添加上述灭菌后的纳米纤维分散液，与该培养基混合使其均匀。将该水溶液与培养基进行混合的方法没有特别的限制，例如可以举出吸液(Pipetting)等采用手动进行的混合、使用磁力搅拌器、机械搅拌器、均相混合机、均化器等设备进行的混合。
例如，使用纤维素纳米纤维配制培养基组合物时，向离子交换水或超纯水中添加纤维素纳米纤维使其为0.0001％至5.0％(重量/容量)、优选0.001％至1.0％(重量/容量)、较优选0.01％至0.6％(重量/容量)。进而，于室温搅拌直至成为整体均匀的状态后，进行灭菌(例如，于121℃下高压釜灭菌20分钟)。将例如DMEM培养基等液体培养基用均相混合机等搅拌，一边向该培养基中添加该水溶液将其均匀地混合，使其成为所期望的最终浓度(例如，最终浓度为0.03％时，0.6％水溶液：培养基的比率为1：20)。或者，采用吸液管向该水溶液中添加DMEM培养基等液体培养基通过吸液均匀地混合，使其成为所期望的最终浓度(例如最终浓度为0.03％时0.6％水溶液：培养基的比率为1：20)。该水分散液与培养基的混合方法没有特殊的限制，例如可以举出吸液等采用手动进行的混合、使用磁力搅拌器、机械搅拌器、均相混合机、均化器等设备进行的混合。
[培养方法]
本发明也提供：使用上述本发明的培养基组合物使细胞或者组织增殖的培养方法；将所得的细胞或者组织通过例如过滤、离心分离或者磁性分离进行回收的方法；使用本发明的培养基组合物制造球体的方法。
本发明中使用的纳米纤维具有如下效果：在生物体外培养细胞及/或组织时使该细胞及/或组织悬浮在含有该纳米纤维的液体中的效果(优选使其悬浮静置的效果)。通过该悬浮效果，与单层培养相比可以增加每一定体积内的细胞及/或组织进行培养。另外，在现有的悬浮培养方法中伴有旋转、振荡操作时，针对细胞及/或组织的剪切力发挥作用，因此，存在细胞及/或组织的增殖率、回收率低、或细胞功能受损的情况，但通过使用本发明的含有纳米纤维的培养基组合物，在不进行振荡等操作的情况下使细胞及/或组织均匀地分散，因此，能够不损害细胞功能地、容易且大量地获取作为目标的细胞及/或组织。另外，在现有的含有凝胶基材的培养基中悬浮培养细胞及/或组织时，存在细胞及/或组织的观察、回收困难、回收时损害其功能的情况，但通过使用本发明的含有纳米纤维的培养基组合物，能够悬浮培养细胞及/或组织、不损害其功能地进行观察、回收。另外，现有的含有凝胶基材的培养基有时粘度高、培养基的更换困难，但本发明的含有纳米纤维的培养基组合物由于为低粘度所以使用吸液管、泵等能够容易地更换培养基。
采用本发明的方法所培养的来自人的细胞及/或组织，能够基于治疗目的移植至患有疾病、障碍的患者。此时，对于为治疗对象的疾病、障碍的种类、前处置方法以及细胞移植方法可以基于当事人适当地选择。对于被移植的细胞在受体中的成活以及由疾病、障碍状态的恢复、伴随移植的副作用的有无、治疗的效果而言，可以通过移植治疗中的通常方法进行适当的检查、判断。
进而，由于细胞及/或组织被高效地增殖，所以本发明的培养基组合物可以作为细胞的研究用药物样品使用。例如，在研究用于调节细胞、组织的分化、增殖的因子时，对使细胞和目标因子共存进行培养时的细胞数量及种类、细胞表面分化标志、表达基因的变化进行解析，此时，通过使用本发明的培养基组合物，不仅能够将作为解析对象的细胞的数量高效地扩增，而且能够高效地回收。对目标因子进行研究时的培养条件、培养装置、培养基的种类、本发明纳米纤维的种类、纳米纤维的含量、添加物的种类、添加物的含量、培养时间、培养温度等，可以由当事人从本说明书记载的范围中适当选择。通过培养而增殖或呈现出的细胞，可以采用该领域中的标准的显微镜进行观察。此时，针对所培养的细胞，也可以使用特异抗体进行染色。对于因目标因子而变化的表达基因，可以通过从所培养的细胞中提取RNA(核糖核酸)采用Northern印迹法、RT－PCR法等检测。另外，细胞表面分化标志可以使用特异抗体通过ELISA、流式细胞术检测，观察由目标因子所产生的对分化、增殖的效果。
另外，使用本发明的培养基组合物时，细胞及/或组织被高效地增殖，因此，本发明的培养方法作为细胞及/或组织的增殖方法或者细胞及/或组织的增殖促进方法十分优异。使用本发明的培养基组合物培养细胞及/或组织时，细胞及/或组织不粘附在培养容器上、且不会不均地仅存在于培养容器的底面、而是能够以三维的展宽进行分散，促进增殖。特别是，作为纳米纤维使用甲壳质纳米纤维时，细胞附着于甲壳质纳米纤维，以此为支持物可强力地增殖，其结果，所增殖的细胞、细胞块(球体等)及/或组织，形成以葡萄的串状连接在纳米纤维上的状态。为了此增殖促进效果，只要在培养基组合物中含有对于使细胞及/或组织悬浮(即，避免细胞、组织粘附于培养容器)而言充分的浓度的纳米纤维即可，不必须进行悬浮静置(即，在不伴有来自外部的压力、振动、振荡、旋转操作等的情况下细胞及/或组织在液体培养基组合物中均匀地分散、且处于悬浮状态)。例如，为甲壳质纳米纤维的情况下，只要为对于呈现悬浮作用而言充分的0.0001％(重量/容量)以上的浓度即可，即使为比可以实现稳定的悬浮静置培养的浓度0.03％(重量/容量)低的浓度(例如，0.025％(重量/容量)以下、0.02％(重量/容量)以下)，也可以发挥增殖促进效果。为微结晶纤维素纳米纤维的情况下，只要为对于呈现悬浮作用而言的充分的0.01％(重量/容量)以上即可，即使为比可以实现稳定的悬浮静置培养的浓度0.03％(重量/容量)低的浓度(例如，0.025％(重量/容量)以下、0.02％(重量/容量)以下)，也能够发挥增殖促进效果。为脱酰基结冷胶的情况下，只要为对于呈现悬浮作用而言充分的0.005％(重量/容量)以上即可，即使为比可实现稳定的悬浮静置培养的浓度0.01％(重量/容量)低的浓度(例如，0.009％(重量/容量)以下、0.008％(重量/容量)以下)，也能够发挥增殖促进效果。
纳米纤维中、特别是甲壳质纳米纤维具有优异的细胞增殖促进效果。
本发明的培养方法中，悬浮细胞及粘附细胞的任意细胞均可使用。粘附细胞是生长·增殖需要支持物的细胞。悬浮细胞是生长·增殖不需要支持物的细胞。在本发明的培养方法中，优选使用粘附细胞。本发明的方法中，使用粘附细胞时，粘附细胞不粘附在培养容器的底面上，不会不均地仅存在于培养容器的底面，而是以三维的展宽进行分散，以粘附于纳米纤维的状态、或以球体的状态增殖。特别是，作为纳米纤维使用甲壳质纳米纤维时，细胞附着于甲壳质纳米纤维，以此为支持物强力地增殖，其结果，所增殖的细胞、细胞块(球体等)形成以葡萄的串状连接于纳米纤维上的状态。因此，粘附细胞的悬浮培养成为可能。另外，其结果，与以粘附于培养容器底面的状态进行培养的情况相比，能够促进粘附细胞的增殖。另外，与以粘附于培养容器底面的状态进行培养的情况相比，能够以高密度培养粘附细胞。
本发明的培养方法中，可以实现粘附细胞的悬浮培养，因此，通过本发明的培养方法对粘附细胞进行悬浮培养后，不需要从培养容器剥离细胞的操作，仅仅通过仅将新鲜的本发明的培养基组合物添加至培养后的培养物中、或仅仅通过向新鲜的本发明的培养基组合物中添加全部或部分的培养后的培养物，即可将粘附细胞传代。本发明也提供上述粘附细胞的传代培养方法。因此，通过使用本发明的传代培养方法，可以不进行从培养容器上剥离细胞的操作，即可对粘附细胞进行传代培养。另外，通过使用本发明的传代培养方法，可以在不进行从培养容器上剥离细胞的操作的情况下扩大粘附细胞的培养规模。作为从培养容器上剥离细胞的操作，可以举出利用螯合剂(例如，EDTA)及/或蛋白分解酶(例如，胰蛋白酶、胶原酶)进行的处理。本发明的传代培养方法，对于对从培养容器上剥离细胞的操作敏感性高的粘附细胞(例如，由于剥离操作而生存性降低的粘附细胞、由于剥离操作而易于变质的粘附细胞)的传代培养是有利的。作为对从培养容器上剥离细胞的操作敏感性高的粘附细胞，可以举出人多能性干细胞；人祖细胞；肝细胞、肾细胞、软骨细胞、血管细胞及脂肪细胞等由组织配制的原代细胞；MDCK细胞、HEK293细胞及CHO细胞等生物药物(药物用蛋白质)的生产细胞等，但不限于此。
使用本发明的培养基组合物时，能够以高密度培养粘附细胞，另外，能够高效地增殖细胞及/或组织，因此，本发明的培养方法在通过体外细胞培养生产有用物质中是有用的。将生产有用物质的细胞在本发明的培养基组合物中悬浮培养，从培养物中分离有用物质，由此能够得到该有用物质。作为有用物质，可以举出抗体、酶(尿激酶等)、激素(胰岛素等)、细胞因子(干扰素、白细胞介素、肿瘤坏死因子、集落刺激因子、生长因子等)、疫苗的抗原、其它的生理活性物质(蛋白质、肽等)，但不限于此。产生有用物质的细胞，包括皮肤细胞、软骨细胞、肝细胞、胰细胞、肾细胞等非转换细胞、导入了编码有用物质的基因、参与有用物质生物合成的基因的转化转化细胞。产生有用物质的细胞可以是粘附细胞也可以是悬浮细胞，但优选为粘附细胞。产生有用物质的细胞优选为向细胞外分泌有用物质的细胞。作为产生有用物质的细胞，具体而言，可以举出导入了编码有用物质的基因或参与有用物质生物合成的基因的、HEK293，CHO－K1、BHK－21、MDCK、Vero、HepG2、MCF－7等，但不限于此。重组蛋白等有用物质的生产中所使用的细胞是本领域技术人员所公知的，在本发明的方法中可以使用这些细胞。扩大培养规模时，使用上述本发明的传代培养方法，不需要进行从培养容器剥离细胞的操作，可以将新鲜的本发明的培养基组合物添加到培养后的培养物中，或者也可以向新鲜的本发明的培养基组合物添加全部或部分的培养后的培养物。从培养物中分离有用物质时，需要从培养物中除去细胞，但本发明的培养基组合物，通过添加纳米纤维而不实质地提高粘度，另外由于细胞在培养基组合物中悬浮，所以能够采用离心分离、过滤处理等简单的方法除去细胞。另外，培养基组合物中的纳米纤维也能够采用离心分离、过滤处理等简单的方法除去。从培养物分离有用物质的方法对于本领域技术人员来说是公知的，例如可以适用色谱法(例如，离子交换色谱法、疎水性色谱法、亲和色谱法、逆相色谱法等色谱法)等的、生理活性物质的生化学分离纯化方法。
采用本发明的培养方法培养细胞及/或组织时，可以采用在细胞培养中通常使用的培养皿、烧瓶、塑料袋、Teflon(注册商标)袋、皿、陪替氏培养皿(Petri Dish)、组织培养用皿、多皿、微量培养板、微孔板、多板、多孔板、腔室载玻片(chamber slide)、管、盘、培养袋、滚瓶等培养器材进行培养。这些培养器材的材质没有特殊的限制，例如可以举出玻璃、聚氯乙烯、纤维素系聚合物、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯、聚砜、聚氨酯、聚酯、聚酰胺、聚苯乙烯、聚丙烯等塑料等。另外，也可以对这些塑料实施各种表面处理(例如，等离子体处理、电晕处理等)。进而，针对这些培养器材也可以预先涂布细胞外基质、细胞粘附分子等。作为这样的涂布材料，可以举出胶原蛋白I至XIX、纤连蛋白、玻璃粘连蛋白、层粘连蛋白－1至12、Nitogen、腱生蛋白，血小板反应蛋白(thrombospondin)，von Willebrand因子、骨桥蛋白、纤维蛋白原、各种弹性蛋白、各种蛋白聚糖、各种钙粘附蛋白、桥粒芯胶粘蛋白(desmocollin)、桥粒芯糖蛋白(desmoglein)、各种整联蛋白、E－选择蛋白、P－选择蛋白、L－选择蛋白、免疫球蛋白、透明质酸、超家族(super-family)、基质胶、聚－D－赖氨酸、聚－L－赖氨酸、甲壳质、壳聚糖、琼脂糖、藻酸凝胶、水凝胶、以及它们的切断断片等。这些涂布材料也可以使用通过基因重组技术将氨基酸序列人工改变而得到的物质。另外，也可以使用用于阻碍细胞及/或组织粘附于培养器材的涂布材料。作为这样的涂布材料，可以举出硅、聚(甲基丙烯酸2－羟基甲酯)、聚(2－甲基丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱)等，但并不限定于此。
关于细胞及/或组织的培养，也可以在机械控制下于封闭环境中自动地实施细胞接种、培养基更换、细胞图像获取、培养细胞回收，控制pH、温度、氧浓度等，同时利用能够实现高密度培养的生物反应器、自动培养装置进行。作为使用这些装置在培养中补充新的培养基、将所要求的物质适量地供给至细胞及/或组织中的方法，有流加培养、连续培养及灌流培养，但任意的方法均可用于本发明的培养方法。
对于采用本发明的方法培养的细胞及/或组织的形态、状态，本领域技术人员可以任意地选择。作为其优选具体例，没有特殊的限制，可以举出细胞及/或组织单独地在培养基组合物中分散的状态、细胞及/或组织粘附在载体表面上的状态、细胞及/或组织包埋于载体内部的状态、多个细胞聚集形成细胞块(球体)的状态、或2种以上细胞聚集形成细胞块(球体)的状态等，较优选细胞及/或组织粘附在载体表面上的状态、细胞及/或组织包埋于载体内部的状态、多个细胞聚集形成细胞块(球体)的状态、或2种以上细胞聚集形成细胞块(球体)的状态，进一步优选细胞及/或组织粘附于载体表面上的状态、多个细胞聚集形成细胞块(球体)的状态、或2种以上细胞聚集形成细胞块(球体)的状态。这些状态中，作为采用本发明的方法进行培养的最优选的状态，可以举出形成了细胞块(球体)的状态，其原因在于，与生物体内环境近似的细胞－细胞间相互作用及细胞结构体被重构，以能够长时间地维持细胞功能的状态进行培养，另外细胞的回收比较容易。
作为使细胞及/或组织载持于表面上的载体，可以举出由各种高分子构成的微载体、玻璃珠、陶瓷珠等。作为该高分子的例子，可以使用乙烯基树脂、聚氨酯树脂、环氧树脂、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯聚酯、聚酰胺、聚酰亚胺、硅树脂、酚醛树脂、三聚氰胺树脂、尿素树脂、苯胺树脂、离聚物树脂、聚碳酸酯、胶原蛋白、葡聚糖、明胶、纤维素、藻酸盐及它们的混合物等。也可以用下述化合物涂布该载体，所述化合物能够提高细胞的粘附、或者提高物质从细胞中的放出。作为上述涂布材料的例子，可以举出聚(单硬脂酰甘油酯琥珀酸)、聚－D，L－丙交酯－co－乙交酯、透明质酸钠、N－异丙基丙烯酰胺、胶原蛋白I至XIX、纤连蛋白、玻璃粘连蛋白、层粘连蛋白－1至12、Nitogen、腱生蛋白、血小板反应蛋白、VonWillebrand因子、骨桥蛋白、纤维蛋白原、各种弹性蛋白、各种蛋白聚糖、各种钙粘附蛋白、桥粒芯胶粘蛋白、桥粒芯糖蛋白、各种整联蛋白、E－选择蛋白、P－选择蛋白、L－选择蛋白、免疫球蛋白超家族、基质胶、聚－D－赖氨酸、聚－L－赖氨酸、甲壳质、壳聚糖、琼脂糖、藻酸凝胶、各种水凝胶、以及它们的切断断片等。此时，也可以组合2种以上涂布材料。另外，也可以进一步向在表面上载持有细胞及/或组织的载体的培养中所使用的培养基中，混合1种以上的瓜尔胶、罗望子胶、刺槐豆胶、阿拉伯树胶、刺云实胶、罗望子胶、甲基纤维素等多糖类。另外，该载体也可以含有磁性体材料，例如铁氧体。该载体的直径为数10μm至数100μm，较优选为100μm至200μm，其比重优选接近1，较优选为0.9～1.2，特别优选为约1.0。作为该载体的例子，可以举出Cytodex1(注册商标)、Cytodex 3(注册商标)、Cytoline1(注册商标)、Cytoline2(注册商标)、Cytopore1(注册商标)、Cytopore2(注册商标)、(以上、GEHealthcare Life Sciences)、Biosilon(注册商标)(NUNC)、Cultispher－G(注册商标)、Cultispher－S(注册商标)(以上、Thermo SCIENTIFIC)、HILLEXCT(注册商标)、ProNectinF-COATED(注册商标)、及HILLEXII(注册商标)(SoloHill Engineering)等，但并不限定于此。根据需要，该载体也可以实施灭菌处理。灭菌方法没有特别的限制，例如可以举出放射线灭菌、环氧乙烷气体灭菌、高压釜灭菌及干热灭菌等。作为使用该载体来培养动物细胞的方法，没有特殊的限制，可以采用通常的使用流動層型培养槽或者充填層型培养槽的培养方法等。此时，在表面上载持有细胞及/或组织的载体，通过使用本发明的含有纳米纤维的培养基组合物能够在不进行振荡等操作的情况下均匀地分散，因此，能够不损伤细胞功能地培养目标细胞及/或组织。采用该法培养的细胞及/或组织，可以在培养后以载持在载体上的状态进行离心分离、过滤处理，由此进行回收。此时，也可以在添加了所使用的液体培养基后，进行离心分离、过滤处理。例如，离心分离时的重力加速度(G)为100至400G，过滤处理时使用的过滤器的微孔的大小为10μm至100μm，但并不限定于此。另外，使载体中内包有铁氧体等具有磁性的材料时，能够通过磁力回收所培养的载体。通过该法培养的细胞及/或组织可以通过使用各种螯合剂、热处理、酶从载体上剥离来进行回收。
在载体内部包埋细胞及/或组织时，作为载体可以选择由各种高分子构成的材料。作为上述高分子的例子，可以举出胶原蛋白、明胶、藻酸盐、壳聚糖、琼脂糖、聚乙醇酸、聚乳酸、纤维蛋白粘附剂、聚乳酸·聚乙醇酸共聚物、蛋白聚糖、糖胺聚糖、聚氨酯泡沫等海绵、DseA―3D(注册商标)、聚N－取代丙烯酰胺衍生物、聚N－取代甲基丙烯酰胺衍生物及它们的共聚物、聚乙烯基甲基醚、聚环氧丙烷、聚环氧乙烷、聚乙烯醇部分醋化物等温度敏感性高分子、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、甲基纤维素、硝酸纤维素、丁酸纤维素、聚环氧乙烷、聚(甲基丙烯酸2－羟乙酯)/聚己内脂等水凝胶。另外，也可以使用2种以上上述高分子制作用于包埋细胞的载体。进而，该载体中除了这些高分子以外也可以具有生理活性物质。作为该生理活性物质的例子，可以举出细胞生长因子、分化誘導因子、细胞粘附因子、抗体、酶、细胞因子、激素、凝集素、或者细胞外基质等，也可以含有多种上述物质。另外，可以进一步地向包埋有细胞及/或组织的载体的培养所使用的培养基中，混合1种以上瓜尔胶、罗望子胶、藻酸丙二醇酯、刺槐豆胶、阿拉伯树胶、刺云实胶、甲基纤维素等增粘剂。
使上述载体包埋细胞及/或组织的方法，没有特殊的限制，例如，可以采用如下方法：将细胞与上述高分子的混合液抽吸至注射器中、通过25G～19G程度的注射針滴入培养基中、或使用微量吸液管滴入培养基中等方法。此处形成的珠状载体的尺寸，取决于将细胞与上述高分子混合液滴下时所使用的器具前端的形状，优选为数10μm至数1000μm，较优选为100μm至2000μm。能够采用珠状载体进行培养的细胞数没有特殊的限制，可以与该珠尺寸相应地自由地选择。例如，为直径约2000μm的珠状载体时，能够在该尺寸的珠状载体中包埋直至500万个细胞。另外，细胞可以在载体内一个一个地分散、也可以形成数个细胞聚集而成的细胞块。此时，包埋有细胞及/或组织的载体，通过使用本发明的含有纳米纤维的培养基组合物能够在不进行搅拌等操作的情况下均匀地分散，因此，能够不损失细胞功能地培养目标细胞及/或组织。对于利用该法培养的细胞及/或组织，在培养后能够通过以包埋于载体中的状态进行离心分离、过滤处理从而进行回收。此时，也可以在加入所用的液体培养基后进行离心分离、过滤处理。例如，离心分离时的重力加速度(G)为100至400G，进行过滤处理时使用的过滤器的微孔的大小为10μm至100μm，但并不限定于此。采用该法培养成的细胞及/或组织可以通过使用各种螯合剂、热、酶等处理来分解载体从而使其分散、进行回收。
形成细胞凝集块(球体)的方法，没有特别的限定，本领域技术人员可以适当地选择。作为其例，可以举出：使用具有细胞非粘附表面的容器的方法、悬滴法、旋转培养法、三维支架法、离心法、采用利用电场、磁场形成的凝集的方法等。例如，对于使用具有细胞非粘附表面的容器的方法，可以在实施了阻碍细胞粘附的表面处理的培养容器中培养目标细胞，使其形成球体。使用该细胞非粘附性培养容器时，首先，在采集目标细胞后配制其细胞混悬液，接种至该培养容器中进行培养。持续培养约一周时，细胞自发地形成球体。作为此时使用的细胞非粘附性表面，可以使用在通常所用的培养皿等培养容器的表面涂布了阻碍细胞粘附的物质而得到的细胞非粘附性表面等。作为上述物质，可以举出琼脂糖、琼脂、聚－HEMA(聚－(甲基丙烯酸2－羟基乙基酯))2－甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱与其他单体(例如，甲基丙烯酸丁基酯等)形成的共聚物等，只要没有细胞毒性，则不限定于此。
另外，作为形成细胞凝集块(球体)的方法，也可以采用NATURE BIOTECHNOLOGY,VOL.28,NO.4,APRIL 2010,361-366,NATURE PROTOCOLS,VOL.6,NO.5,2011,689-700,NATURE PROTOCOLS,VOL.6,NO.5,2011,572-579,Stem Cell Research,7,2011,97-111,Stem Cell Rev and Rep,6,2010,248-259等中记载的方法。
另外，在使球体形成的培养时所使用的培养基中，也可以含有加速球体形成或促进其维持的成分。作为具有上述效果的成分的例子，可以举出二甲基亚砜、超氧化物歧化酶、铜蓝蛋白、过氧化氢酶、过氧化物酶、L－抗坏血酸、L－抗坏血酸磷酸酯、生育酚、类黄酮、尿酸、胆红素、含硒化合物、转铁蛋白、不饱和脂肪酸、白蛋白、茶碱、毛喉素、胰高血糖素、二丁酰cAMP、Y27632、Fasudil(HA1077)、H－1152、Wf－536等ROCK抑制剂等。作为含硒化合物，可以举出亚硒酸钠、硒酸钠、二甲基硒、硒化氢、硒代蛋氨酸、硒－甲基硒代半胱氨酸、丙氨酸丁氨酸硒醚、硒代半胱氨酸、硒高半胱氨酸、腺苷-5'-磷酰硒酸、硒－腺苷硒代蛋氨酸。另外，为了得到作为目的的尺寸均匀的细胞凝集块，也可以在所使用的细胞非附着性培养容器上导入与目标细胞凝集块具有相同直径的多个凹部。如果这些凹部彼此接触、或在目标细胞凝集块的直径的范围内，则在接种细胞时，所接种的细胞在凹部与凹部之间不形成细胞凝集块，而是确实地在凹部中形成与其容积相应的大小的细胞凝集块，能够得到尺寸均匀的细胞凝集块群。作为此时的凹坑的形状，优选半球或圆锥状。
或者，也可以基于具有细胞粘附性的支持体、形成球体。作为这样的支持体的例子，可以举出胶原蛋白、聚轮烷(polyrotaxane)、聚乳酸(PLA)、聚乳酸乙醇酸共聚物(PLGA)、水凝胶等。
另外，也可以通过与饲养细胞共同培养，来形成球体。作为用于促进球体形成的饲养细胞，可以使用任何的粘附性细胞，但优选与各种细胞相应的饲养细胞。虽然没有限定，但例如在形成来自肝、软骨的细胞的球体时，作为其饲养细胞的例子，可以举出COS－1细胞、血管内皮细胞作为优选的细胞种。
进而，也可以使用本发明的含有纳米纤维的培养组合物形成球体。此时，将该纳米纤维添加到球体形成时所使用的培养基中，使该纳米纤维的浓度为可进行细胞悬浮培养(优选悬浮静置培养)的浓度。例如，可以将该纳米纤维添加至球体形成时所使用的培养基中，使该纳米纤维的浓度通常为0.0001％至1.0％(重量/容量)，例如为0.0005％至1.0％(重量/容量)、优选为0.001％至0.3％(重量/容量)、较优选为0.005％至0.1％(重量/容量)、进一步优选为0.01％至0.05％(重量/容量)。使目标细胞均匀地分散在含有该纳米纤维的培养基中，静置3天至10天进行培养，由此可以配制球体。此处配制的球体可以通过进行离心、过滤处理来回收。例如，离心时的重力加速度(G)为100至400G，过滤处理时所使用的过滤器的微孔的大小为10μm至100μm，但并不限制于此。另外，可以使用磁性微粒(在表面涂布有与目标细胞特异性结合的抗体)，利用磁力回收所培养的球体。作为这样的磁性微粒的例子，可以举出Dynabeads(Veritas公司制)、MACS microbeads(Miltenyi Biotec公司制)、BioMag(Techno Chemical公司制)等。
球体的大小基于细胞种及培养时间的不同而不同，没有特殊的限制，在形成球状或椭球状时直径为20μm至1000μm、优选为40μm至500μm、较优选为50μm至300μm。
上述球体即使以此状态继续进行静置培养，也能在10天以上、优选13天以上、进一步优选30天以上的时间内保持增殖能力，通过进一步在静置培养中定期地进行机械分割，或进一步地进行单细胞化处理和凝集，能够实质地无期限地保持增殖能力。
关于球体培养中所用的培养容器，只要是通常可以进行动物细胞培养的容器即可，没有特别的限定，例如可以举出烧瓶、皿、陪替氏培养皿、组织培养用皿、多皿、微量培养板、微孔板、多板、多孔板、腔室载玻片、培养皿、管、盘、培养袋、滚瓶等。
球体的静置培养中所用的培养基，可以含有细胞粘附因子，作为其例，可以举出基质胶、胶原蛋白凝胶、明胶、聚－L－赖氨酸、聚－D－赖氨酸、层粘连蛋白、纤连蛋白。这些细胞粘附因子也可以组合添加2种以上。另外，进一步地可以向球体培养所用的培养基中混合瓜尔胶、罗望子胶、藻酸丙二醇酯、刺槐豆胶、阿拉伯树胶、刺云实胶、甲基纤维素等增粘剂。
通过使用本发明的含有纳米纤维的培养基组合物，可以在不进行振荡等操作的情况下均匀地分散在培养液中，因此，能够不损害细胞功能地以球体的形式对目标细胞及/或组织进行培养。采用该法静置培养的球体，可以通过在培养后进行离心、过滤处理来进行回收。此时，也可以加入所用的液体培养基后进行离心、过滤处理。例如，离心时的重力加速度(G)为100至400G，进行过滤处理时使用的过滤器的微孔的大小为10μm至100μm，但并不限定于此。另外，可以使用磁性微粒(在表面上涂布了与目标细胞特异性结合的抗体)，利用磁力来回收所培养的球体。作为这样的磁性微粒的例子，可以举出Dynabeads(Veritas公司制)、MACS microbeads(Miltenyi Biotec公司制)、BioMag(Techno Chemical公司制)等。对于被回收的球体，可以进一步地使用各种螯合剂、热、过滤器、酶等处理将其解开，由此能够以单一细胞的形式分散。
作为将来自植物的细胞及/或组织静置培养时的方法，可以培养未分化的植物细胞块即愈伤组织。关于愈伤组织的诱导，可以针对所使用植物种分别采用已知的方法进行。例如，根据需要，使用70％乙醇、1％次氯酸钠溶液等，对已经分化的植物体的一部分的组织(例如，根、茎、叶的切片、种子、生长点、胚、花粉等)表面进行灭菌，然后，使用刀等切成适当大小的组织片(例如，约1～约5mm见方的根切片)，通过使用净化台等的无菌操作，将该组织片接种至预先经过灭菌的愈伤组织诱导培养基，在适当条件下进行无菌培养。此处诱导的愈伤组织，为了立即大量增殖，可以进行液体培养，或也可以采用传代用培养基进行传代培养，由此以品种株系的形式维持。传代培养可以使用任意的液体培养基及固体培养基。
使用本发明的培养基组合物开始进行静置培养时所接种的植物细胞块的量，基于目标细胞的增殖速度、培养方式(回分培养、流加培养、连续培养等)、培养时间等而变化，例如在培养愈伤组织等植物细胞块时，接种至本发明的培养基组合物中，使细胞块相对于本发明的培养基组合物的湿重量为4～8(重量/容积(w/v))％、优选5～7(w/v)％。培养时的植物细胞块的粒径为3mm至40mm、优选3mm至20mm、较优选5mm至15mm。此处所谓“粒径”，例如在植物细胞块为球形时是指其直径，为椭圆球形时是指其长径，在其他形状时同样地是指所得的最大长度。
关于培养细胞及/或组织时的温度，在为动物细胞时通常为25至39℃、优选为33至39℃。在培养气氛中，CO2浓度通常为4至10体积％，优选为4至6体积％。培养时间通常为3至35天，可以根据培养目的自由地设定。植物细胞的培养温度通常为20至30℃，需要光时，可以在照度2000～8000lux的照度条件下进行培养。培养时间通常为3至70天，可以根据培养目的自由地设定。
采用本发明的方法培养细胞及/或组织时，可以向本发明的培养组合物中添加另外配制的细胞及/或组织，进行混合使其均匀地分散。此时的混合方法没有特别的限制，例如可以举出吸液等采用手动进行的混合、使用搅拌器、旋涡混合器(Vortex Mixer)、微孔板混合器、振荡机等设备的混合。在混合后，既可以使培养液为静置状态，也可以根据需要将培养液进行旋转、振荡或搅拌。其转速及频率可以根据本领域技术人员的目的适当地设定。另外，在静置培养的期间需要进行培养基组合物的更换时，可以通过进行离心、过滤处理将细胞及/或组织与培养基组合物分离后，将新的培养基组合物添加至细胞及/或组织中。或者，可以通过进行离心、过滤处理将细胞及/或组织适当浓缩后，将新培养基组合物添加至该浓缩液中。例如，离心时的重力加速度(G)为100至400G，进行过滤处理时使用的过滤器的微孔的大小为10μm至100μm，但并不限定于此。另外，可以使用磁性微粒(在表面上涂布了与目标细胞特异性结合的抗体)利用磁力分离所培养的细胞及/或组织。作为这样的磁性微粒的例子，可以举出Dynabeads(Veritas公司制)、MACS microbeads(Miltenyi Biotec公司制)、BioMag(Techno Chemical公司制)等。这些培养基组合物的更换也可以采用在机械控制下且在封闭环境下可以实施的生物反应器、自动培养装置进行。
[细胞或者组织的保存或者输送方法]
另外，本发明提供使用上述本发明的培养基组合物的、保存细胞或组织的保存方法及输送方法。在本发明的保存或者输送方法中，通过使用本发明的培养基组合物，能够以悬浮状态(优选悬浮静置状态)、保存或者输送细胞、组织。
作为成为保存或者输送对象的细胞及组织，可以举出：作为在使用本发明的培养基组合物进行的培养中所能够使用的细胞及组织在上文所述的物质。
在保存或者输送所使用的本发明的培养基组合物中，除了上述组成之外，在细胞、组织以非冻结状态进行保存时也可以含有具有延长细胞寿命效果的各种成分。作为该成分，可以举出糖类(但不包括多糖类)(例如，单糖类、二糖类)、抗氧化剂(例如，SOD、维生素E或谷胱甘肽)、亲水性聚合物(例如，聚乙烯吡咯烷酮)、螯合剂(例如，EDTA)、糖醇(例如，甘露醇、山梨糖醇)、甘油等。
在本发明的保存或者输送方法中，将所期望的细胞或者组织分散在本发明的培养基组合物中后，放入可密封的容器中。作为该容器，可以举出烧瓶、塑料袋、Teflon(注册商标)袋、管、培养袋等，但不限于此。为了避免在保存或者输送中内容物的漏出、来自外界的细菌等的污染，加入了细胞、组织在本发明的培养基组合物中的分散物的容器，优选被密封。
对于保存或者输送中的温度，只要能够维持细胞或者组织的生存即可，没有特别的限定，通常为37℃以下。温度低时，虽然能够避免在保存或者输送中细胞或者组织的生存性降低，但为了细胞或者组织不冻结，通常，在高于本发明的培养基组合物的融点的温度进行保存或者输送。因此，保存或者输送中的温度通常被维持在－5～42℃、优选1～37℃、更优选4～32℃、进一步优选18～30℃。
为了能够以悬浮静置状态保存或者输送细胞或者组织，保存或者输送中的温度优选为本发明的培养基组合物可以将细胞或者组织悬浮静置的温度。能够将细胞或者组织悬浮静置的温度，可以根据构成纳米纤维的原料的种类适当地设定。
在一实施方案中，作为构成在本发明的保存或者输送方法中所使用的、本发明的培养基组合物中所含的纳米纤维的原料，可以使用卡拉胶(优选κ－卡拉胶)。含有由卡拉胶构成的纳米纤维的本发明的培养基组合物，在25℃以下具有悬浮作用，但另一方面，由于在37℃失去悬浮作用，所以在25℃以下(优选0～25℃)将所期望的细胞或者组织以悬浮静置状态保存或者输送，在保存或者输送完成后，使温度为37℃以上(例如，37～40℃，优选37℃)，由此使已悬浮的细胞或者组织沉淀，从而能够容易地回收细胞或者组织。
关于保存或者输送的时间，只要在本发明的培养基组合物中能够以生存状态维持细胞或者组织的范围内即可，没有特别的限定，通常为1小时以上、10天以内，优选为1～8天、较优选为1～3天。在保存或者输送的期间中，优选细胞或者组织在本发明的培养基组合物中能够维持悬浮静置状态。
采用本发明的保存或者输送方法时，由于能够以悬浮状态保持细胞、组织，所以能够避免由输送中的振动而导致从板上剥离、能够避免由因沉淀而接触的细胞、组织之间的凝集所导致的细胞、组织损伤，能够以维持本来功能的状态保存及输送细胞、组织。
实施例
以下，通过具体地阐述本发明的培养基组合物的实施例，进一步详细地说明本发明。以下实施例中所示的材料、使用量、比例、处理内容及处理顺序只要不脱离本发明的宗旨即可适当地变更。因此，本发明的范围不限于以下所示的具体例。
参考例1经高温加热处理的含有脱酰基结冷胶的培养基的粘度测定及细胞悬浮试 验
含有脱酰基结冷胶的培养基的配制及粘度测定
使脱酰基结冷胶(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社制)混悬在纯水中使其为0.4％(w/v)，之后，于90℃加热搅拌使其溶解。一边搅拌该水溶液一边放冷至室温，于121℃高压釜灭菌20分钟。向300mL高型烧杯中加入2倍浓度的DMEM/F－12培养基(Aldrich公司制)50mL和灭菌水47.5mL，一边在室温下用均相混合机(3000rpm)搅拌一边添加脱酰基结冷胶水溶液2.5mL，以此状态持续搅拌1分钟，由此配制成脱酰基结冷胶最终浓度0.01％的培养基组合物。同样地配制成添加有脱酰基结冷胶水溶液使其最终浓度为0.02、0.03、0.05％(w/v)的培养基组合物。该培养基组合物的粘度在37℃条件下使用E型粘度计(东机产业株式会社制、Viscometer TVE-22L、标准转子1°34’×R24)、以转速100rpm测定5分钟。
含有脱酰基结冷胶的培养基的细胞悬浮试验
将人子宫颈癌细胞株HeLa(DS PHARMA BIOMEDICAL公司制)混悬在含有10％(v/v)胎牛血清的EMEM培养基(WAKO公司制)中使其为250000个/mL，将10mL该混悬液接种至EZSPHERE(旭硝子公司制)后，在CO2培养箱(5％CO2)内培养3天。将此处所得的球体(直径100～200μm)的混悬液10mL进行离心处理(200G、5分钟)使球体沉淀，除去上清，由此配制成球体混悬液1.0mL。接着，将每1.0mL的上述配制的含有脱酰基结冷胶的培养基加入到1.5mL的Eppendorf管中，进而加入HeLa细胞球体混悬液10μL。通过轻敲使细胞块分散，于37℃培养，目视观察1小时后的细胞分散状态。
[表1]
参者比较例会有甲基纤维素、胶原蛋白的培养基的配制
含有甲基纤维素的培养基的配制
向200mL茄型烧瓶中加入100mL DMEM/F-12培养基(Aldrich公司制)，加入0.1g甲基纤维素(M0387、Aldrich公司制)。一边用冰浴进行冷却一边搅拌，使甲基纤维素溶解。使用该溶液配制添加有甲基纤维素水溶液使其最终浓度为0.1、0.3、0.6、1.0％(w/v)的培养基组合物。
含有胶原蛋白的培养基的配制
向6.5mL的0.3％Cellmatrix Type I-A(新田明胶公司制)中加入10倍浓度的DMEM/F-12培养基(Aldrich公司制)1mL、重构用缓冲液(新田明胶公司制)1mL及纯水1.5mL，在冰中一边搅拌一边配制0.2％的含有胶原蛋白的培养基。同样地配制成添加有胶原蛋白使最终浓度为0.01、0.05、0.1、0.2％(w/v)的培养基组合物。
对于上述配制的培养基组合物，也可以与含有脱酰基结冷胶的培养基相同地实施HeLa细胞球体的悬浮试验及粘度测定。其中，基于装置的测定范围，以50rpm测定1.0％(w/v)甲基纤维素的粘度。
[表2]
[表3]
参考试验例
在以下的参考试验例中，CO2培养箱中的CO2的浓度(％)以气氛中的CO2的体积％表示。另外，PBS表示磷酸缓冲生理盐水(Sigma Aldrich Japan公司制)，FBS表示胎牛血清(Biological Industries公司制)。另外，(w/v)表示每1体积的重量。
参考试验例1：使单一细胞分散时的细胞增殖试验
将脱酰基结冷胶(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社制)混悬于超纯水(Milli-Q水)中使其为0.3％(w/v)后，于90℃通过一边加热一边搅拌而溶解，将该水溶液于121℃高压釜灭菌20分钟。使用该溶液配制培养基组合物，该培养基组合物在含有10％(v/v)胎牛血清及10ng/mL促血小板生成素(WAKO公司制)的IMDM培养基(Gibco公司制)中添加有最终浓度0.015％(w/v)的脱酰基结冷胶。接着，将人白血病细胞株UT7/TPO接种至上述添加有脱酰基结冷胶的培养基组合物中使其为20000个细胞/mL，然后以每1孔5mL分注到6孔平底微量培养板(Corning公司制)的孔中。同样地，将人子宫颈癌细胞株HeLa(DS PHARMA BIOMEDICAL公司制)以20000个细胞/mL的量接种至培养基组合物(该培养基组合物在含有10％(v/v)胎牛血清的EMEM培养基(WAKO公司制)中添加有0.015％(w/v)的脱酰基结冷胶(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社制))中，然后，以每1孔5mL分注到6孔平底微量培养板(Corning公司制)的孔中。将这些细胞混悬液在CO2培养箱(5％CO2)内以静置状态培养3天。然后，将一部分的培养液回收，添加相同量的台盼蓝染色液(Invitrogen公司制)后，用血细胞计数仪(ERMAINC.制)测定活细胞数。
其结果可以确认，UT7/TPO细胞及HeLa细胞通过使用上述培养基组合物而能够以悬浮状态均匀地培养，在该培养基组合物中增殖。悬浮静置培养3天后的UT7/TPO细胞及HeLa细胞的细胞数如表4所示。
[表4]
UT7/TPO细胞 HeLa细胞
细胞数(×10000/mL) 38 40
参考试验例2：培养来自细胞株的球体时的细胞增殖试验
将人肝癌细胞株HepG2(DS PHARMA BIOMEDICAL公司制)混悬在含有10％(v/v)胎牛血清的DMEM培养基(WAKO公司制)中使其为250000个/mL，将该混悬液10mL接种至EZSPHERE(旭硝子公司制)后，在CO2培养箱(5％CO2)内培养7天。同样地，将人子宫颈癌细胞株HeLa(DS PHARMA BIOMEDICAL公司制)混悬在含有10％(v/v)胎牛血清的EMEM培养基(WAKO公司制)中使其为250000个/mL，将10mL该混悬液接种至EZ SPHERE(旭硝子公司制)后，在CO2培养箱(5％CO2)内培养7天。将此处所得的各个细胞株的球体(直径100～200μm)的混悬液2.5mL进行离心处理(200G、5分钟)，使球体沉淀除去上清。接着，向该球体(约800个)中添加上述培养基10mL使其混悬后，移至平底管(BM EQUIPMENT公司制)中。同样地，使用向上述培养基中添加有0.015％(w/v)的脱酰基结冷胶(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社制)的培养基组合物，制作球体的混悬液，移至平底管(BM EQUIPMENT公司制)中。需要说明的是，添加了0.015％(w/v)的脱酰基结冷胶的培养基组合物可以如下配制：首先将脱酰基结冷胶(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社制)混悬在超纯水(Milli-Q水)中使其为0.3％(w/v)，然后，于90℃通过一边加热一边搅拌而溶解，将该水溶液于121℃高压釜灭菌20分钟后，以1/20稀释，添加到含有10％(v/v)胎牛血清的DMEM培养基中，由此进行配制。
于37℃在CO2培养箱(5％CO2)内将上述球体混悬液静置培养3天后，添加2倍容量的培养基进行离心处理(200G、5分钟)，由此使球体沉淀、除去上清。此处，分取一部分球体，用光学显微镜(OLYMPUS公司制、CK30－F100)观察其形状。接着，用10mL PBS将所回收的球体清洗1次后，添加1mL的胰蛋白酶－EDTA(乙二胺四乙酸)溶液(WAKO公司制)，于37℃保温5分钟。添加9mL上述培养基后，通过离心处理(200G、5分钟)回收细胞。向此处所得的细胞混悬液2mL的一部分中添加相同量的台盼蓝染色液(Invitrogen公司制)后，采用血细胞计数仪(ERMA INC.制)测定活细胞及死细胞的数量。
其结果确认：HepG2细胞及HeLa细胞的球体通过使用上述培养基组合物能够以悬浮状态进行培养，采用该培养基组合物，细胞高效地增殖。并且确认：该培养基组合物与现有的培养基相比在使细胞增殖时死细胞的比例少、细胞增殖的促进效果优异。此时，在现有的培养基中培养的球体沉淀至培养容器的底面。进而，采用光学显微镜观察所培养的球体的形状，结果在该培养基组合物中未发现球体之间的缔合，相对于此，在现有的培养基中观察到球体之间的缔合。
关于HepG2细胞及HeLa细胞，将采用不含脱酰基结冷胶的培养基进行培养时的细胞数作为1，将此时的相对细胞数示于表5。另外，将采用不含脱酰基结冷胶的培养基进行培养时的死细胞率(死细胞数/活细胞数)作为1，将此时的相对死细胞率示于表6。另外，在该培养基组合物中培养HepG2细胞及HeLa细胞的球体时的悬浮状态，分别如图1及图2所示。进而，所培养的HeLa细胞的球体的形状如图3所示。
[表5]
脱酰基结冷胶 HepG2细胞 HeLa细胞
无 相对细胞数 1.0 1.0
有 相对细胞数 1.7 1.5
[表6]
脱酰基结冷胶 HepG2细胞 HeLa细胞
无 相对死细胞率 1.0 1.0
有 相对死细胞率 0.5 0.5
参考试验例3：将附着在微载体上的细胞株进行培养时的细胞增殖试验
将微载体Cytodex(注册商标)1(GE Healthcare Life Sciences公司制)混悬在PBS中使其为0.02g/mL，静置1晩后，弃去上清，用新的PBS将该微载体清洗2次。然后，再次在PBS中混悬使其为0.02g/mL，于121℃高压釜灭菌20分钟。接着，将该微载体用70％乙醇清洗2次、用PBS清洗3次，然后，混悬在含有10％(v/v)胎牛血清的DMEM培养基(WAKO公司制)中使其为0.02g/mL。使用该微载体混悬液配制含有120mg的Cytodex(注册商标)1及4000000个HepG2细胞的DMEM培养基(含有10％(v/v)胎牛血清)20mL，在预先用硅涂布剂(AsahiTechno Glass公司制)处理的烧杯中将该细胞混悬液于37℃一边用搅拌器搅拌(100rpm)6小时一边进行培养。此处，采用显微镜确认到HepG2细胞粘附在微载体上。接着，将粘附有细胞的微载体用含有10％(v/v)胎牛血清的DMEM培养基清洗2次，混悬在3mL相同培养基中。
在含有10％(v/v)胎牛血清的DMEM培养基20mL或在向该培养基中添加了0.015％(w/v)的脱酰基结冷胶(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社制)而得到的培养基组合物中，分别添加上述微载体混悬液300μL，于37℃培养3天。此时，不含脱酰基结冷胶的培养液一边用搅拌器搅拌(100rpm)一边进行培养。培养后，用显微镜确认了细胞在微载体上的附着状态后，通过离心处理(200G、5分钟)使微载体沉淀。用10mL的PBS清洗该微载体后，添加1mL的胰蛋白酶－EDTA(乙二胺四乙酸)溶液(WAKO公司制)，于37℃保温5分钟。进而，添加含有10％(v/v)胎牛血清的DMEM培养基9mL后，使用网尺寸70μm的细胞筛网(BD FALCON公司制)除去微载体。通过离心处理(200G、5分钟)从此处所得的滤液中回收细胞。将该细胞混悬在500μL的培养基中，向其一部分中添加相同量的台盼蓝染色液(Invitrogen公司制)后，采用血细胞计数仪(ERMA INC.制)测定活细胞数。其结果，不含脱酰基结冷胶的培养液含有123,000个细胞，含有脱酰基结冷胶的培养液含有1,320,000个细胞。如上所述，对于含有该特定化合物的结构体的培养基组合物，可以确认到即使使用微载体进行细胞培养，也可以获得比现有培养基优异的细胞增殖促进效果。使用含有该特定化合物的结构体的培养基组合物、微载体培养3天时的HepG2细胞的附着状态如图4所示。
参考试验例4：使用来自细胞株的球体的细胞悬浮试验
将黄原胶(KELTROL CG、三晶株式会社制)混悬在超纯水(Milli-Q水)中使其浓度为1％(w/v)后，于90℃通过一边加热一边搅拌而溶解。使用该水溶液，配制黄原胶的最终浓度为0.1、0.15、0.2％(w/v)的DMEM/F－12培养基组合物。另外，将含有0.2％(w/v)的κ－卡拉胶(GENUGEL WR-80-J、三晶株式会社制)及0.2％(w/v)的刺槐豆胶(GENUGUM RL-200-J、三晶株式会社制)的水溶液加热至90℃进行配制，使用该水溶液配制含有0.03、0.04、0.05％(w/v)的κ－卡拉胶和刺槐豆胶的DMEM/F－12培养基(Sigma公司制)组合物。
使用与参考试验例2相同的方法，制作HeLa细胞的球体，向上述配制的培养基1mL中分别添加数十个球体后，于37℃静置1小时，目视观察球体细胞的悬浮状态。其结果确认到，在上述全部培养基组合物中，HeLa细胞的球体均以悬浮状态维持。进而确认到，向该细胞混悬液中添加等量的培养基后，通过离心处理(300至400G、5分钟)，HeLa细胞的球体沉淀，能够被回收。在该培养基组合物中培养HeLa细胞的球体时的悬浮状态分别如图5所示。另外，采用与分析例1相同的方法测定的粘度如表7、8所示。
[表7]
[表8]
[表8]
参考试验例5：使用经过滤器过滤的培养基组合物的细胞悬浮试验使用与参考试验例2相同的方法，配制含有0.015％脱酰基结冷胶(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社制)的DMEM/F-12培养基组合物。接着，将1mL该培养基组合物分别使用70μm、40μm的过滤器(BDFALCON公司制)、30μm、20μm的过滤器(AS ONE公司制)、10μm的过滤器(Partec公司制)、5μm、1.2μm、0.45μm、0.2μm的过滤器(Sartorius Stedim Japan公司制)进行过滤。向上述滤液中添加约数十个使用与参考试验例2相同的方法制作的HepG2细胞的球体，然后，于37℃静置1小时，目视观察球体细胞的悬浮状态。其结果确认，HepG2细胞的球体能够在透过10μm以上的过滤器的培养基组合物中维持悬浮状态，但在透过5μm以下过滤器的培养基组合物中沉淀。进而确认，此处处于悬浮状态的HepG2细胞的球体通过在室温下进行300G、5分钟的离心处理、或者通过在加入等量培养基后在室温下进行200G、5分钟的离心处理，使其沉淀，从而能够被回收。
参考试验例6：球体形成试验
采用与参考试验例2相同的方法，配制含有0.01％的脱酰基结冷胶(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社制)及10％(v/v)胎牛血清的EMEM培养基(WAKO公司制)的组合物。接着，添加HeLa细胞使其浓度为1000个/mL后，分注到24孔培养板(Corning公司制)中。将该培养板于37℃悬浮静置培养9天后，采用显微镜确认球体形成。进而，通过300G、5分钟的离心处理使球体细胞沉淀，用5mL的PBS清洗1次后，添加100μL的胰蛋白酶－EDTA(乙二胺四乙酸)溶液(WAKO公司制)，于37℃保温5分钟。向此处所得的细胞混悬液100μL中添加100μL含有10％(v/v)胎牛血清的EMEM培养基，向其一部分的细胞混悬液中添加相同量的台盼蓝染色液(Invitrogen公司制)后，采用血细胞计数仪(ERMA INC.制)测定活细胞数。其结果确认HeLa细胞增加至170000个/mL。采用该培养基组合物形成的HeLa细胞的球体如图6所示。
参考试验例7：结构体的光学显微镜观察
将脱酰基结冷胶(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社制)混悬在纯水中使其浓度为0.4％(w/v)后，于90℃加热搅拌使其溶解。向300mL高型烧杯中加入2倍浓度的DMEM/F－12培养基(Aldrich公司制)95mL，于室温一边用磁力搅拌器搅拌一边添加脱酰基结冷胶水溶液5mL，以此状态持续搅拌5分钟，由此配制得到脱酰基结冷胶最终浓度为0.02％的培养基组合物。进而采用均相混合机(3000rpm)将该培养基组合物搅拌5分钟。通过光学显微镜(KEYENCE公司、BIOREVO BZ-9000)观察所配制的培养基组合物。所观察到的结构体如图7所示。
参考试验例8：粉末培养基和DAG通过混合加热进行的配制
将脱酰基结冷胶(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社制)20mg和DMEM/F－12培养基(Life Technologies公司制)1.58g加入到200mL锥形瓶中，注入纯水100mL。于121℃高压釜灭菌20分钟，配制得到脱酰基结冷胶浓度为0.02％的DMEM/F－12培养基组合物。向配制的培养基中添加葡聚糖珠Cytodex1(大小200μm、GE Healthcare Life Sciences公司制)，目视确认珠的分散状态。以悬浮分散状态为○、部分沉淀/分散状态为△、沉淀状态为×，进行评价。结果如表9所示。
[表9]
脱酰基结冷胶浓度％(w/v) 状态 Cytodex1分散
0.05 液体 ○
0.02 液体 ○
0.01 液体 ○
参考试验例9：混合有多糖类的培养基组合物的配制
将黄原胶(KELTROL CG、三晶株式会社制)混悬在纯水中使其浓度为0.5％(w/v)后，于90℃通过一边加热一边搅拌而溶解。同样地，针对藻酸钠(Duck alginic acidNSPM,、FOOD CHEMIFA公司制)、刺槐豆胶(GENUGUM RL-200-J、三晶株式会社制)、κ－卡拉胶(GENUGEL WR-80-J、三晶株式会社制)、迪特胶(KELCO CRETE DG-F、三晶株式会社制)，制作0.5％(w/v)的水溶液。
将该水溶液、0.2或0.1％(w/v)脱酰基结冷胶溶液和10倍浓度的DMEM/F－12培养基混合，于80℃加热30分钟。放置冷却至室温后，添加7.5％碳酸氢钠水溶液，配制含有最终浓度为0.01、0.02％(w/v)的脱酰基结冷胶和最终浓度为0.1、0.2、0.3、0.4％(w/v)的其它多糖的DMEM/F－12培养基组合物。另外，与上述相同地配制含有脱酰基结冷胶的培养基后，添加甲基纤维素(cP400、WAKO株式会社制)的粉末。在冰浴中搅拌，使甲基纤维素溶解，配制得到含有最终浓度为0.01、0.02％(w/v)的脱酰基结冷胶和最终浓度为0.1、0.2、0.3、0.4％(w/v)的其它甲基纤维素的DMEM/F－12培养基组合物。
向上述配制的培养基中添加聚苯乙烯珠(大小500－600μm，Polysciences Inc.制)，目视确认珠的分散状态。以悬浮分散状态为○、部分沉淀/分散状态为△、沉淀状态为×，进行评价。结果如表10所示。
[表10]
参考试验例10：混合有多糖类的培养基组合物的粘度测定
采用与参考试验例9的多糖混合体系相同的方法，配制含有最终浓度为0.005、0.01％(w/v)的脱酰基结冷胶和其他多糖的DMEM/F-12培养基。多糖配制成：黄原胶、藻酸钠、刺槐豆胶的最终浓度为0.1％(w/v)、甲基纤维素的最终浓度为0.2％(w/v)、κ-卡拉胶和迪特胶的最终浓度为0.05％(w/v)。各个培养基组合物的状态以及采用与分析例1相同的方法测定的粘度如表11～16所示。
[表11]
黄原胶浓度％(w/v) 脱酰基结冷胶浓度％(w/v) 状态 粘度(mPa·s)
0.1 0.005 液体 4.36
0.1 0.010 液体 4.59
[表12]
藻酸钠浓度％(w/v) 脱酰基结冷胶浓度％(w/v) 状态 粘度(mPa·s)
0.1 0.005 液体 1.53
0.1 0.010 液体 1.75
[表13]
刺槐豆胶浓度％(w/v) 脱酰基结冷胶浓度％(w/v) 状态 粘度(mPa·s)
0.1 0.005 液体 1.92
0.1 0.010 液体 2.36
[表14]
[表15]
[表16]
参考试验例11：改变了2价金属阳离子浓度的培养基组合物的配制
使用不含氯化钙、硫酸镁、氯化镁的DMEM/F－12(D9785、Aldrich制)，与参考试验例8的方法相同地配制含有0.02％(w/v)的脱酰基结冷胶的DMEM/F－12培养基组合物。另外，配制添加有氯化钙或添加有硫酸镁、氯化镁的DMEM/F－12培养基组合物使最终浓度为DMEM/F－12培养基的规定量。根据DMEM/F－12培养基的规定组成，将各个最终浓度设定为：氯化钙0.116g/L、硫酸镁0.049g/L、氯化镁0.061g/L。
向配制的培养基组合物中加入葡聚糖珠Cytodex1(GE Healthcare LifeSciences公司制)，在2天后通过目视确认珠的分散。以悬浮分散状态为○、部分沉淀/分散状态为△、沉淀状态为×，进行评价。结果如表17所示。
[表17]
参考试验例12：随后添加了2价金属阳离子的培养基组合物的配制
将0.1％(w/v)脱酰基结冷胶溶液、5倍浓度的DMEM/F-12培养基(不含氯化钙、硫酸镁、氯化镁；D9785；Aldrich制)、氯化钙1167mg、硫酸镁489mg、氯化镁287mg溶解于300mL纯水中，配制盐溶液。向200mL的高型烧杯中加入脱酰基结冷胶水溶液和纯水，使用锚型搅拌叶片以200rpm搅拌溶液。添加将培养基液和水混合而成的A液，以此状态搅拌10分钟。接下来，添加盐溶液，进而添加7.5％碳酸氢钠水溶液1.6mL，配制含有最终浓度为0.02％的脱酰基结冷胶的DMEM/F-12培养基组合物。各液的混合量如表所示。配制4小时后，对6个培养基组合物进行聚苯乙烯珠和Cytodexl的分散评价。结果如表18、19所示。
[表18]
[表19]
参考试验例13：各种培养基组合物的配制
配制0.1％(w/v)脱酰基结冷胶溶液和高浓度的培养基液。作为高浓度的培养基液，配制10倍浓度的MEM(M0268、Aldrich制)、RPMI-1640(R6504，Aldrich制)和5倍浓度的DMEM(高压灭菌相应的培养基、Nissui制)。将0.1％(w/v)脱酰基结冷胶溶液、各高浓度培养基用浓度调节用纯水混合，于80℃加热30分钟。放置冷却至室温后，添加7.5％碳酸氢钠水溶液，分别配制含有最终浓度为0.01、0.02、0.03％(w/v)的脱酰基结冷胶的培养基组合物。
对所配制的6个培养基组合物进行评价，将聚苯乙烯珠和葡聚糖珠Cytodexl的悬浮分散状态设定为○、部分沉淀/分散状态设定为△、沉淀状态设定为×。结果如表20、21所示。
[表20]
[表21]
参考试验例14：含有脱酰基结冷胶的培养基组合物的粒度分布测定
根据参考例1，配制含有0.038％(w/v)的脱酰基结冷胶的DMEM/F-12培养基组合物。使用均相混合机以3000rpm和6000rpm搅拌1分钟，配制培养基。使用Beckman Coulte(株)制Multisizer 4(根据库尔特原理的精密粒度分布测定装置)测定该培养基组合物的粒度分布，求出体积标准粒度分布的中值粒径(d50)。结果如表22所示。
[表22]
培养基配制时的均相混合机转速 d50(μm)
3000rpm 1.709
6000rpm 1.499
参考试验例15：脱酰基结冷胶的磷酸化
秤量脱酰基结冷胶1g和纯水40mL置于玻璃制的100mL试验管中，于100℃加热30分钟，配制混悬液。向该混悬液中添加磷酸水溶液(85％)1g，加热回流5小时。然后，一边搅拌12小时一边放置冷却至室温，将由此得到的白色混悬液注入99％乙醇(500mL)中。将产生的绵状白色固体过滤后使其干燥，由此得到淡褐色固体(0.4g)，为脱酰基结冷胶的磷酸化物。可以通过傅里叶变换红外光谱分析(株式会社岛津制作所制、IR-Prestage21)确认了已导入磷酸基(1700cm-1；P-OH、1296cm-1、1265cm-1；P＝O)。通过微波加热分解装置(ETHOS TC，Milestone General制)将淡褐色固体分解后，采用电感耦合等离子体发射光谱分析仪(ICP-OES)(SPS 5520，SII NanoTechnology公司制)测定磷原子的含有率，其结果为3.5wt％(n＝2)。
参考试验例16：含有磷酸化的脱酰基结冷胶的培养基组合物的配制
将任意量的磷酸化的脱酰基结冷胶(30mg)和DMEM/F－12培养基(LifeTechnologies公司制)1.56g加入200mL锥形瓶中，注入纯水100mL。于121℃高压釜灭菌20分钟，配制脱酰基结冷胶浓度为0.03％的DMEM/F－12培养基组合物。向所配制的培养基中添加葡聚糖珠Cytodex1(GE HEALTHCARE BIOSCIENCES公司制)，目视确认珠的分散状态。在0.03％(w/v)的磷酸化的脱酰基结冷胶浓度下，确认到珠的分散状态。
参考试验例17：含有脱酰基结冷胶的培养基组合物的配制
按照下表所示的比例添加脱酰基结冷胶水溶液和培养基溶液，进行混合，配制脱酰基结冷胶浓度为0.02％的DMEM/F－12培养基组合物，对此时的聚苯乙烯珠(大小500－600μm、Polysciences Inc.制)的分散状态进行评价。结果如表23、24所示。通过静置1天以上，在所有的条件下苯乙烯珠均分散。
[表23]
脱酰基结冷胶/纯水 DMEM/F12粉末培养基/纯水 放置时间
20mg/10mL 1.56g/90mL 5分钟
20mg/20mL 1.56g/80mL 5分钟
20mg/30mL 1.56g/70mL 5分钟
20mg/40mL 1.56g/60mL 6小时
20mg/50mL 1.56g/50mL 6小时
20mg/60mL 1.56g/40mL 6小时
20mg/70mL 1.56g/30mL 6小时
20mg/80mL 1.56g/20mL 1天
20mg/90mL 1.56g/10mL 1天
将“DMEM/F12粉末培养基/纯水”加入到“脱酰基结冷胶/纯水”中。
[表24]
将“脱酰基结冷胶/纯水”加入到“DMEM/F12粉末培养基/纯水”中。
参考试验例18：使用过滤器的培养基组合物的配制
将脱酰基结冷胶(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社制)混悬在超纯水(Milli-Q水)中使其最终浓度为0.02或0.04％(w/v)后，于90℃加热30分钟或者于121℃加热20分钟，由此使其溶解。进而，将该水溶液100mL用孔径为0.22μm的聚醚砜制膜过滤器(Corning公司制)过滤。接着，将该滤液与2至4倍浓度的DMEM/F－12培养基(Sigma Aldrich公司制)混合后，用Mild Mixer(SI－24、TAITEC公司制)振荡1小时，分别配制含有最终浓度为0.01或0.015％(w/v)的脱酰基结冷胶的培养基组合物(例如，将0.02％(w/v)脱酰基结冷胶水溶液和2倍浓度的DMEM/F－12培养基各25mL进行混合，配制0.01％(w/v)的脱酰基结冷胶培养基组合物50mL)。采用与参考试验例2相同的方法制作HepG2细胞的球体，向上述配制的培养基1mL中分别添加数十个球体后，于37℃静置，目视观察1小时及1晚后的球体细胞的悬浮状态。其结果确认，HepG2细胞的球体在上述全部的培养基组合物中均能维持悬浮状态。进而，在全部培养基组合物中确认到：通过添加2倍容量的培养基后将该细胞混悬液进行离心处理(500G、5分钟)，由此，HepG2细胞的球体沉淀，细胞能够回收。通过目视确认1晩后的球体的分散状态时，将悬浮分散状态设定为○、将部分沉淀/分散状态设定为△、将沉淀状态设定为×，进行评价，其结果如表25所示。
[表25]
参考试验例19：培养来自细胞株的球体时的细胞增殖试验
将人胚肾细胞株HEK293(DS PHARMA BIOMEDICAL公司制)混悬在含有10％(v/v)胎牛血清的EMEM培养基(WAKO公司制)中使其浓度为250000个/mL，将该混悬液10mL接种至EZSPHERE(旭硝子公司制)，然后，在CO2培养箱(5％CO2)内培养2天。将此处所得的HEK293细胞的球体(直径100～200μm)的混悬液10mL进行离心处理(200G、5分钟)，使球体沉淀除去上清后，混悬于1mL中。接着，向该球体混悬液200μL(细胞数约200000个)中添加上述培养基10mL使其混悬后，移至平底管(BM EQUIPMENT公司制)中。同样地，使用在上述培养基中添加有0.015％(w/v)的脱酰基结冷胶(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社制)的培养基组合物，制作球体的混悬液，移至平底管(BM EQUIPMENT公司制)。需要说明的是，添加有0.015％(w/v)的脱酰基结冷胶的培养基组合物如下配制：首先将脱酰基结冷胶(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社制)混悬在超纯水(Milli-Q水)中使其为0.3％(w/v)后，于90℃通过一边加热一边搅拌而溶解，将该水溶液于121℃高压釜灭菌20分钟后，以1/20稀释，添加到含有10％(v/v)胎牛血清的EMEM培养基中，由此配制而成。
于37℃在CO2培养箱(5％CO2)内将上述球体混悬液静置培养5天后，添加2倍容量的培养基进行离心处理(500G、5分钟)，由此使球体沉淀，除去上清。接着，将所回收的球体用10mL的PBS清洗1次后，添加1mL的胰蛋白酶－EDTA(乙二胺四乙酸)溶液(WAKO公司制)，于37℃保温5分钟。添加9mL上述培养基后，通过离心处理(500G、5分钟)回收细胞。向此处所得的细胞混悬液2mL的一部分中添加相同量的台盼蓝染色液(Invitrogen公司制)后，采用血细胞计数仪(ERMA INC.制)测定活细胞及死细胞的数量。需要说明的是，作为对照，制作不含脱酰基结冷胶的培养基组合物，进行相同的实验。
其结果确认，HEK293细胞的球体，通过使用该培养基组合物能够以悬浮状态培养，在该培养基组合物中细胞高效地增殖。并且确定了：与不含脱酰基结冷胶的培养基组合物相比，该培养基组合物在使细胞增殖时死细胞的比例较少，细胞增殖的促进效果优异。此时，采用现有的培养基培养的球体沉淀至培养容器的底面。
关于HEK293细胞，将采用不含脱酰基结冷胶的培养基培养时的细胞数作为1，将此时的相对细胞数示于表26。另外，将采用不含脱酰基结冷胶的培养基培养时的死细胞率(死细胞数/活细胞数)作为1，将此时的相对死细胞率示于表27。
[表26]
脱酰基结冷胶 HEK293细胞
无 相对细胞数 1.0
有 相对细胞数 1.6
[表27]
脱酰基结冷胶 HEK293细胞
无 相对死细胞率 1.0
有 相对死细胞率 0.3
参考试验例20：培养昆虫细胞时的细胞增殖试验
将脱酰基结冷胶(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社制)混悬于超纯水(Milli-Q水)中使其浓度为0.3％(w/v)后，于90℃通过一边加热一边搅拌而溶解，将该水溶液于121℃高压釜灭菌20分钟。使用该溶液，配制在Sf-900(注册商标)III SFM培养基(Gibco公司制)中添加最终浓度0.015％(w/v)的脱酰基结冷胶而成的培养基组合物。接着，将来自草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)的Sf9细胞(Gibco公司制)接种至上述添加有脱酰基结冷胶的培养基组合物中使其为100000个细胞/mL，然后，以每1孔1mL分注到24孔平底微量培养板(Corning公司制)的孔中。将这些细胞混悬液在培养箱内于25℃静置培养5天。然后，将一部分培养液回收，添加相同量的台盼蓝染色液(Invitrogen公司制)后，采用血细胞计数仪(ERMA INC.制)测定活细胞的数量。需要说明的是，作为对照制作不含脱酰基结冷胶的培养基组合物，进行相同的实验。
其结果确认：Sf9细胞可以通过使用该培养基组合物以悬浮状态均匀地培养，且在该培养基组合物中增殖。进而确认，与不含脱酰基结冷胶的培养基组合物相比，该培养基组合物在使细胞增殖时具有优异的细胞增殖促进效果。悬浮静置培养5天后的Sf9细胞的细胞数如表28所示。
[表28]
脱酰基结冷胶 Sf9细胞数(×10000)
无 33.5
有 47.4
参考试验例21：培养CD34阳性细胞时的细胞增殖试验
将脱酰基结冷胶(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社制)混悬在超纯水(Milli-Q水)中使其浓度为0.3％(w/v)后，于90℃通过一边加热一边搅拌而溶解，将该水溶液于121℃高压釜灭菌20分钟。使用该溶液，配制在StemSpan SFEM培养基(StemCell Technologies公司制)中添加了最终浓度0.015％(w/v)的脱酰基结冷胶、20ng/mL的促血小板生成素(WAKO公司制)及100ng/mL的干细胞因子(SCF、WAKO公司制)的培养基组合物。接着，将来自人脐带血的CD34阳性细胞(Lonza公司制)以10000个细胞/mL的量接种至上述的添加了脱酰基结冷胶的培养基组合物中，然后，以每1孔1mL分注至24孔平底微量培养板(Corning公司制)的孔中。将这些细胞混悬液在37℃下在CO2培养箱(5％CO2)内静置培养7天。然后，回收一部分培养液，添加相同量的台盼蓝染色液(Invitrogen公司制)后，采用血细胞计数仪(ERMA INC.制)测定活细胞的数量。另外，向剩余的培养液中添加3倍容量的培养基进行离心处理(500G、5分钟)，由此使全部的细胞沉淀。需要说明的是，作为对照制作不含脱酰基结冷胶的培养基组合物，进行相同的实验。
其结果确认，CD34阳性细胞通过使用该培养基组合物能够以悬浮状态均匀地培养，在该培养基组合物中增殖。进而确认，与不含脱酰基结冷胶的现有培养基相比，该培养基组合物具有同等以上的细胞增殖促进效果。另外确认，通过离心处理，细胞沉淀，细胞能够回收。将采用不含脱酰基结冷胶的培养基培养时的细胞数作为1时，悬浮静置培养7天后从CD34阳性细胞增殖的细胞的相对细胞数如表29所示。
[表29]
脱酰基结冷胶 相对细胞数
无 1.0
有 1.2
参考试验例22：球体形成试验
采用与参考试验例2相同的方法，配制含有0.015％的脱酰基结冷胶(KELCOGELCG-LA、三晶株式会社制)及10％(v/v)胎牛血清的DMEM培养基(WAKO公司制)组合物。接着，添加HepG2细胞使细胞浓度为15000个/mL后，向24孔培养板(Corning公司制)中分注1mL。将该培养板于37℃悬浮静置培养7天后，采用显微镜确认球体形成。进而，通过400G、5分钟的离心处理使球体细胞沉淀，采用5mL PBS清洗1次后，添加100μL的胰蛋白酶－EDTA(乙二胺四乙酸)溶液(WAKO公司制)，于37℃保温5分钟。向此处所得的细胞混悬液100μL中添加含有10％(v/v)胎牛血清的DMEM培养基100μL，向一部分的细胞混悬液中添加相同量的台盼蓝染色液(Invitrogen公司制)后，采用血细胞计数仪(ERMA INC.制)测定活细胞的数量。其结果确认，HepG2细胞采用该培养基组合物形成球体，另外细胞数也增加至80800个/mL。采用该培养基组合物形成的HepG2细胞的球体如图8所示。
参考试验例23：使用来自细胞株的球体的细胞悬浮试验
将迪特胶(KELKO-CRETE DG、三晶株式会社制)混悬在超纯水(Milli-Q水)中使其浓度为0.3％(w/v)后，于90℃通过一边加热一边搅拌而溶解。使用该水溶液配制迪特胶的最终浓度为0.1％(w/v)的DMEM/F－12培养基组合物。另外，通过于90℃加热来配制含有0.5％(w/v)的天然型结冷胶(KELCO GEL HT、San-Ei Gen F.F.I.株式会社制)的水溶液，使用该水溶液配制含有0.05、0.1％(w/v)的天然型结冷胶的DMEM/F－12培养基(Sigma公司制)组合物。
采用与参考试验例2相同的方法制作HeLa细胞的球体，向上述配制的培养基1mL中分别添加数十个球体后，于37℃静置1小时，目视观察球体细胞的悬浮状态。其结果确认，HeLa细胞的球体在上述全部的培养基组合物中均能够维持在悬浮状态。进而确认，通过对含有0.1％(w/v)的迪特胶的该细胞混悬液进行离心处理(200G、5分钟)，HeLa细胞的球体沉淀，细胞能够回收。
参考试验例24：使用具有细胞粘附能力的磁珠的细胞悬浮试验1
将用层粘连蛋白或纤连蛋白涂布过的GEM(注册商标、Global EukaryoticMicrocarrier、GL Sciences株式会社制)的混悬溶液以500μL分注至1.5mL容量的微型试管(Eppendorf公司制)中，使用磁力架(TA4899N12、多摩川精机株式会社制)从上述GEM混悬溶液中集聚GEM并除去介质。进而，利用含有10％(v/v)胎牛血清的DMEM培养基(WAKO公司制)500μL将GEM清洗2次后，混悬至相同培养基500μL中。将该混悬液分注至细胞低粘附板即Sumilon细胞紧密板(cell tight plate)24F(SUMITOMO BAKELITE株式会社制)中每1孔50μL。接着，添加另外配制的HepG2细胞使其为250000个细胞/mL，采用相同培养基使最终容量为500μL/孔。采用手动搅拌该细胞混悬液后，将该板在CO2培养箱(5％CO2)内静置一晚。采用显微镜确认细胞粘附在GEM上，然后，将细胞混悬液移至1.5mL容量的微型试管(Eppendorf公司制)中，使用上述磁力架集聚附着有细胞的GEM、除去上清。
采用与参考试验例2相同的方法，配制含有0.015％的脱酰基结冷胶(KELCOGELCG-LA、三晶株式会社制)及10％(v/v)胎牛血清的DMEM培养基(WAKO公司制)的组合物。向上述配制的附着有HepG2细胞的GEM(涂布层粘连蛋白或纤连蛋白)中添加该培养基组合物1mL或不含脱酰基结冷胶的相同培养基1mL，使其混悬后，移至Sumilon细胞紧密板24F。接着，将该板在CO2培养箱(5％CO2)内静置6天，将细胞培养液移至1.5mL容量的微型试管(Eppendorf公司制)中，一边在上述磁力架上缓缓地吸液一边使附着有细胞的GEM集聚，除去上清。用1mL PBS将该GEM清洗1次，添加200μL的胰蛋白酶-EDTA(乙二胺四乙酸)溶液(WAKO公司制)，于37℃保温10分钟。向此处所得的细胞混悬液200μL中添加含有10％(v/v)胎牛血清的DMEM培养基800μL，向其一部分的细胞混悬液中添加相同量的台盼蓝染色液(Invitrogen公司制)后，采用血细胞计数仪(ERMA INC.制)测定活细胞的数量。
其结果确认，粘附有HepG2细胞的GEM通过使用该培养基组合物能够以悬浮状态培养，在该培养基组合物中细胞高效地增殖。并且确认了，与不含脱酰基结冷胶的现有培养基相比，该培养基组合物具有优异的细胞增殖促进效果。另外确认，通过使用磁力能够从该培养基组合物中集聚附着有HepG2细胞的GEM，进而能够从该GEM中回收HepG2细胞。
采用含有或不含脱酰基结冷胶的培养基将HepG2细胞在GEM上培养6天，此时的细胞数如表30所示。另外，将附着有HepG2细胞的层粘连蛋白涂布GEM在该培养基组合物中培养时的悬浮状态如图9所示。
[表30]
参考试验例25：使用具有细胞粘附能力的磁珠的细胞悬浮试验2
与参考试验例24相同地，将用纤连蛋白涂布的GEM(注册商标、Global EukaryoticMicrocarrier、GL Sciences株式会社制)混悬在MF－Medium(注册商标)间充质干细胞增殖培养基(東洋纺株式会社制)中。将该混悬液以每1孔50μL分注至细胞低粘附板即Sumilon细胞紧密板24F(SUMITOMO BAKELITE株式会社制)中。接着，添加另外配制的来自人骨髄的间充质干细胞(Cell Applications公司制)使其浓度为250000个细胞/mL，与参考试验例24相同地使该板在CO2培养箱(5％CO2)内静置一晚，配制粘附了间充质干细胞的GEM。
采用与参考试验例2相同的方法，配制含有0.015％的脱酰基结冷胶(KELCOGELCG-LA、三晶株式会社制)的MF－Medium(注册商标)间充质干细胞增殖培养基(東洋纺株式会社制)的组合物。向上述配制的付着有间充质干细胞的GEM(纤连蛋白涂布)中添加该培养基组合物或不含脱酰基结冷胶的相同培养基各1mL，使其混悬后，移至Sumilon细胞紧密板24F。接着，将该板在CO2培养箱(5％CO2)内静置4天后，将细胞培养液移至1.5mL容量的微型试管(Eppendorf公司制)中，在上述磁力架上一边缓缓地吸液一边使附着细胞的GEM集聚，除去上清。用1mL PBS将该GEM清洗1次，添加200μL的胰蛋白酶－EDTA(乙二胺四乙酸)溶液(WAKO公司制)，于37℃保温10分钟。向此处所得的细胞混悬液200μL中添加含有10％(v/v)胎牛血清的DMEM培养基800μL，向其一部分的细胞混悬液中添加相同量的台盼蓝染色液(Invitrogen公司制)后，采用血细胞计数仪(ERMA INC.制)测定活细胞的数量。
其结果可以确认，粘合有间充质干细胞的GEM通过使用该培养基组合物能够以悬浮状态培养，在该培养基组合物中细胞高效地增殖。并且可以确认，与不含脱酰基结冷胶的现有培养基相比，该培养基组合物具有优异的细胞增殖促进效果。另外确认，通过使用磁力，能够从该培养基组合物将附着有间充质干细胞的GEM集聚，进而能够从该GEM回收间充质干细胞。
在含有或不含脱酰基结冷胶的培养基中将间充质干细胞在GEM上培养4天时的细胞数如表31所示。
[表31]
脱酰基结冷胶 间充质干细胞数(×10000/mL)
无 11.3
有 20.9
参考试验例26：使用藻酸珠的细胞悬浮试验
以下试验，基于株式会社PG RESEARCH制藻酸三维培养试剂盒的方法实施。将另外配制的HepG2细胞添加至藻酸钠溶液(株式会社PG RESEARCH制)2.5mL中使其为400000个细胞/mL，进而以5μg/mL的量添加人重组层粘连蛋白511(株式会社Veritas制)，配制细胞混悬液。对于该细胞混悬液用装有探针的5mL注射器(泰尔茂株式会社制)回收后，向该注射器上安装22G注射針(泰尔茂株式会社制)。接着，向各添加有2mL氯化钙水溶液(株式会社PGRESEARCH制)的24孔平底微量培养板(株式会社PG RESEARCH制)的孔中，分别添加10滴该细胞混悬液。于室温静置在10分钟后确认形成藻酸珠，然后，除去氯化钙溶液，添加2mL PBS，于室温静置15分钟。进而，除去PBS后，添加含有10％(v/v)胎牛血清的DMEM培养基(WAKO公司制)2mL，于室温静置15分钟。除去培养基后，向各孔中分别添加1mL的采用与参考试验例2相同的方法配制的含有0.03％的脱酰基结冷胶(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社制)及10％(v/v)胎牛血清的DMEM培养基(WAKO公司制)的培养基组合物或者不含脱酰基结冷胶的上述培养基，在CO2培养箱(5％CO2)内静置培养8天。需要说明的是，在培养第四天进行培养基更换。
使用1mL容量的吸头(チップ)将培养的藻酸珠移至1.5mL容量的微型试管(Eppendorf公司制)后，向各管中添加柠檬酸钠溶液(株式会社PG RESEARCH制)1mL，于室温搅拌15分钟，使藻酸珠。接着，通过300G、3分钟的离心处理使细胞沉淀，除去上清。向该细胞中添加200μL的胰蛋白酶－EDTA(乙二胺四乙酸)溶液(WAKO公司制，于37℃保温5分钟。向此处所得的细胞混悬液200μL中添加含有10％(v/v)胎牛血清的DMEM培养基800μL，向其一部分的细胞混悬液中添加相同量的台盼蓝染色液(Invitrogen公司制)后，采用血细胞计数仪(ERMA INC.制)测定活细胞的数量。
其结果确认，包埋有HepG2细胞的藻酸珠通过使用该培养基组合物能够以悬浮状态进行培养，在该培养基组合物中细胞高效地增殖。并且确认，与不含脱酰基结冷胶的现有培养基相比，该培养基组合物具有优异的细胞增殖促进效果。
采用含有或不含脱酰基结冷胶的培养基在藻酸珠内培养HepG2细胞8天时的细胞数，如表32所示。另外，在该培养基组合物中培养包埋有HepG2细胞的藻酸珠时的悬浮状态，如图10所示。
[表32]
脱酰基结冷胶 HepG2细胞数(×10000/mL)
无 34.9
有 51.8
参考试验例27：使用胶原蛋白凝胶胶囊的细胞悬浮试验
将A：组织培养用胶原蛋白细胞基质(注册商标)类型I-A(细胞基质，新田明胶株式会社制)、B：10倍浓度的DMEM/F－12培养基(Aldrich公司制)、C：重构用缓冲液(向0.05N氢氧化钠溶液100mL中加入碳酸氢钠2.2g、HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸))4.77g、过滤灭菌而得到的)分别地一边在冰中冷却一边进行混合使其比例为A：B：C＝8：1：1。进而，以5μg/mL添加人重组层粘连蛋白511(株式会社Veritas制)，配制胶原蛋白混合溶液500μL。向该混合溶液中以200000个细胞/mL添加另外配制的HepG2细胞，使用安装有25G注射針(泰尔茂株式会社制)的1.5mL注射器(泰尔茂株式会社制)将其全部量回收。接着，使用上述注射器，向预先保温在37℃的添加有含有10％(v/v)胎牛血清的DMEM培养基(WAKO公司制)10mL的平底管(BM EQUIPMENT公司制)中，逐滴地滴下细胞混悬液。于37℃在水浴中保温10分钟，确认形成直径为2mm左右的无定形的胶原蛋白凝胶胶囊，然后，采用与参考试验例2相同的方法添加脱酰基结冷胶(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社制)使其最终浓度为0.04％，轻轻地搅拌，使上述胶囊悬浮。接着，在CO2培养箱(5％CO2)内将该管静置培养5天。
向含有胶原蛋白凝胶胶囊的培养液中添加25mL PBS，通过400G、5分钟的离心处理使胶原蛋白凝胶胶囊沉淀，除去上清。再次加入25mL的PBS进行离心处理，除去上清使残量为5mL。向该液中加入1％(W/V)的胶原酶L(新田明胶株式会社制)20μL后，于37℃振荡2小时。确认胶原蛋白凝胶溶解后，加入10mL 的PBS，通过400G、5分钟的离心处理使细胞沉淀，除去上清。向该细胞中添加1mL的胰蛋白酶－EDTA(乙二胺四乙酸)溶液(WAKO公司制)，于37℃保温5分钟。向此处所得的细胞混悬液中添加含有10％(v/v)胎牛血清的DMEM培养基4mL，通过400G、5分钟的离心处理使细胞沉淀，除去上清。将所得细胞混悬在2mL的与上述相同的培养基中，向其一部分中添加相同量的台盼蓝染色液(Invitrogen公司制)后，采用血细胞计数仪(ERMA INC.制)测定活细胞的数量。
其结果确认，包埋有HepG2细胞的胶原蛋白凝胶胶囊通过使用该培养基组合物能够以悬浮状态培养，在该培养基组合物中细胞高效地增殖。并且确认，与不含脱酰基结冷胶的现有培养基相比，该培养基组合物具有优异的细胞增殖促进效果。
采用含有或不含脱酰基结冷胶的培养基在胶原蛋白凝胶胶囊内培养HepG2细胞5天时的胞数如表33所示。另外，在该培养基组合物中培养包埋有HepG2细胞的胶原蛋白凝胶胶囊时的悬浮状态如图11所示。
[表33]
脱酰基结冷胶 HepG2细胞数(×10000/mL)
无 62.4
有 106.0
参考试验例28：使用过滤器的球体的回收试验
采用与参考试验例2相同的方法，配制含有0.015％的脱酰基结冷胶(KELCOGELCG-LA、三晶株式会社制)及10％(v/v)胎牛血清的DMEM培养基(WAKO公司制)的组合物。另外，作为对照，配制不含脱酰基结冷胶的与上述同样的培养基。采用与参考试验例2相同的方法制作HepG2细胞的球体，向上述配制的培养基1mL分别添加球体使细胞数为86000个后，于37℃静置1小时，目视观察球体细胞的悬浮状态。进而，在网尺寸为40μm的细胞筛网(Becton·Dickinson and Company制)上添加该细胞混悬液，将球体捕捉至过滤器上。接着，通过从过滤器的内面流入10mL的PBS，将球体回收至15mL管中，通过300G、5分钟的离心处理使球体沉淀。除去上清后，向球体中添加500μL的胰蛋白酶－EDTA(乙二胺四乙酸)溶液(WAKO公司制)，于37℃保温5分钟。向此处所得的细胞混悬液中添加含有10％(v/v)胎牛血清的DMEM培养基1mL，向其一部分中添加相同量的台盼蓝染色液(Invitrogen公司制)后，采用血细胞计数仪(ERMA INC.制)测定活细胞的数量。其结果确认，HepG2细胞的球体能够在上述培养基组合物中以悬浮状态维持。进而确认，通过对含有0.015％的脱酰基结冷胶的该球体混悬液进行过滤器处理，对于HepG2细胞的球体而言，能够以与不含脱酰基结冷胶的培养基相同的回收率回收细胞。将使用不含脱酰基结冷胶的培养基采用过滤器回收的HepG2细胞数设为1时的、从含有脱酰基结冷胶的培养基回收的相对的细胞数如表34所示。
[表34]
脱酰基结冷胶 相对的HepG2细胞数
无 1.0
有 1.1
参考试验例29：使用各种多糖类的混合剂的球体细胞悬浮试验
采用与参考试验例9相同的方法，将黄原胶(KELTROL CG、三晶株式会社制)、藻酸钠(Duck alginic acid NSPM,、FOOD CHEMIFA公司制)、刺槐豆胶(GENUGUM RL-200-J、三晶株式会社制)、甲基纤维素(cP400、WAKO株式会社制)、κ－卡拉胶(GENUGEL WR-80-J、三晶株式会社制)、果胶(GENU pectin LM-102AS、三晶株式会社制)或迪特胶(KELCO CRETE DG-F、三晶株式会社制)与脱酰基结冷胶(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社制)组合进行混合，配制DMEM/F-12培养基组合物。采用与参考试验例2相同的方法制作HepG2细胞的球体，向上述配制的培养基1mL分别添加数十个球体后，于37℃静置，目视观察1小时及1晚后的球体细胞的悬浮状态。其结果确认，HepG2细胞的球体在上述全部的培养基组合物中能够以悬浮状态维持。进而确认，在全部的培养基组合物中，通过在添加2倍容量的培养基后对该细胞混悬液进行离心处理(500G、5分钟)，HepG2细胞的球体沉淀，能够回收细胞。目视确认1晚后的球体的分散状态时，以悬浮分散状态为○、以部分沉淀/分散状态为△、以沉淀状态为×进行评价，其结果如表35及表36所示。需要说明的是，表中的-表示未实施。
[表35]
[表36]
珠与细胞的分散性比较1
针对上述(比较例)配制的含有脱酰基结冷胶的培养基和含有甲基纤维素的培养基，将葡聚糖珠Cytodex(注册商标)1(GE Healthcare Life Sciences公司制)与HeLa细胞球体的分散状态进行比较。结果如表(表37及38)所示。由于Cytodex1与HeLa细胞球体的分散状态密切相关，所以能够将Cytodexl作为细胞球体模型使用。
[表37]
[表38]
珠与细胞的分散性比较2
针对采用参考试验例9配制的含有多糖及脱酰基结冷胶的培养基，将聚苯乙烯珠(大小500-600μm、Polysciences Inc.制)与HepG2细胞球体的分散状态进行比较。将悬浮分散状态设为○、将部分沉淀/分散状态设为△、将沉淀状态设为×，进行评价。结果如表(表39)所示。由于聚苯乙烯珠与HepG2细胞球体的分散状态密切相关，所以能够将聚苯乙烯珠用作细胞球体模型。
[表39]
参考试验例30：来自水稻的植物愈伤组织的悬浮培养试验
将通过盐水选择而精选出的50粒完全成熟的日本晴稻种(购自湖东农业协同组合)移至50mL聚苯乙烯管(BD FALCON公司制)，用50mL灭菌水进行清洗后，在30mL的70％乙醇水中搅拌1分钟。除去乙醇水后，添加30mL的Kitchen Haiter(花王株式会社制)，搅拌1小时。将Kitchen Haiter除去后，用50mL灭菌水清洗4次。将此处已灭菌的种子以1.5mL/孔(24孔平底微量培养板(Corning公司制))播种(日语：“置床”)至含有2μg/mL的2，4－二氯苯氧乙酸(Sigma Aldrich公司制)及琼脂的Murashige Skoog基础培养基(M9274、SigmaAldrich公司制)上。在30℃、16小时暗处/8小时暗处的条件下培养3周，收取在种子的胚囊上增殖的奶油色的愈伤组织(1～2mm)。
将脱酰基结冷胶(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社制)混悬至超纯水(Milli-Q水)中使其为0.3％(w/v)后，于90℃一边加热一边搅拌而溶解，将该水溶液于121℃高压釜灭菌20分钟。使用该溶液，在含有2μg/mL的2，4－二氯苯氧乙酸(Sigma Aldrich公司制)的Murashige Skoog基础培养基(M9274、Sigma Aldrich公司制)中添加最终浓度为0.03％(w/v)的脱酰基结冷胶，配制成培养基组合物。将15个上述配制的愈伤组织添加至10mL/平底管的该培养基组合物中(BM EQUIPMENT公司制)，于25℃振荡培养7天。其结果可以确认，来自水稻的愈伤组织通过使用该培养基组合物能够以悬浮状态进行培养，在该培养基组合物中愈伤组织能被维持。在该培养基组合物中培养来自水稻的愈伤组织时的悬浮状态如图12所示。
[制造例1：来自结晶纤维素的纤维素纳米纤维的制造]
向4质量份市售结晶纤维素(旭化成化学株式会社制PH－101)中加入396质量份纯水使其分散后，使用(株)SUGINO MACHINE制高压粉碎装置(Starburst System)以220MPa进行100次粉碎处理，得到来自结晶纤维素的纤维素纳米纤维的水分散液(MNC)。称取所得的分散液至于培养皿，于110℃干燥1小时，除去水分测定残渣的量，测定浓度。其结果，水中的纤维素浓度(固态成分浓度)为1.0质量％。将该水分散液于121℃高压釜处理20分钟，进行灭菌。
[制造例2：来自纸浆的纤维素纳米纤维的制造]
向5质量份市售牛皮纸浆(Oji F-Tex株式会社制LBKP、固态成分89质量％)中加入145质量份纯水使其分散后，使用增幸产业株式会社制石磨式粉碎装置(MASSCOLLOIDER)以1500rpm进行9次粉碎处理，制作纸浆浆料。上述纸浆浆料用株式会社SUGINO MACHINE公司制高压粉碎装置(Starburst System)以220MPa处理300次，由此得到纳米纤维素的水分散液(PNC)。称取所得的分散液至于培养皿，于110℃干燥1小时，除去水分测定残渣的量，测定浓度。其结果，水中的纤维素浓度(固态成分浓度)为1.6质量％。将该水分散液于121℃高压釜处理20分钟，进行灭菌。
[制造例3：甲壳质纳米纤维的制造]
向20质量份市售甲壳质粉末(Koyo Chemical株式会社制)中加入980质量份纯水使其分散后，使用(株)SUGINO MACHINE制高压粉碎装置(Starburst System)于245MPa进行粉碎处理200次，得到甲壳质纳米纤维的水分散液(CT)。称取所得的分散液至于培养皿，于110℃干燥1小时，除去水分测定残渣的量，测定浓度。其结果，水中的甲壳质浓度(固态成分浓度)为2.0质量％。将该水分散液于121℃高压釜处理20分钟，进行灭菌。
[试验例1：平均纤维直径D及平均纤维长度L的测定]
纳米纤维的平均纤维直径(D)如下求出。首先，将应研商事(株)制胶棉支持膜用日本电子(株)制Ion Cleaner(JIC－410)进行亲水化处理3分钟，滴入数滴在制造例1～3中制作的纳米纤维分散液(用超纯水稀释)，室温干燥。在加速电压200kV下使用(株)日立制作所制穿透式电子显微镜(TEM、H－8000)(10,000倍)对其进行观察，使用所得的图像，针对样品数200～250根的纳米纤维，测量一根一根的纤维直径，将其数平均值作为平均纤维直径(D)。
另外，平均纤维长度(L)如下求出，将制造例中制作的纳米纤维分散液用纯水进行稀释使其为100ppm，使用超声波清洗机使纳米纤维均匀地分散。将该纳米纤维分散液至于预先使用浓硫酸将表面进行了亲水化处理的硅片上，于110℃干燥1小时，制成试样。采用将所得试样用日本电子(株)制扫描型电子显微镜(SEM、JSM－7400F)(2,000倍)观察所得的图像，针对样品数150～250根的纳米纤维，测量一根一根的纤维长度，将其数平均值作为平均纤维长度(L)。
求出制造例1至制造例3中得到的纳米纤维的平均纤维直径D及平均纤维长度L，基于上述值求出纵横比L/D。所得的结果如表40所示。
[表40]
[实施例1至实施例4]
使用上述制造例1至制造例3中配制的纳米纤维分散液及脱酰基结冷胶水溶液，配制下表41中记载的培养基组合物。
首先，向制造例1至制造例3中配制的纤维素纳米纤维MNC、PNC及甲壳质纳米纤维中加入灭菌水，由此分别稀释成1％(w/v)水分散液。另一方面，向1质量份脱酰基结冷胶(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社制：DAG)加入99体积份的灭菌水，于121℃高压釜处理20分钟，由此使其溶解并进行灭菌，配制成脱酰基结冷胶1％(w/v)水溶液。
取上述1％(w/v)分散液或水溶液1体积份置于50mL圆锥管中，加入49体积份的灭菌水，进行吸液直至其均匀。向其中添加通过0.22μm过滤器进行了灭菌过滤的2倍浓度的DMEM(high glucose、Aldrich公司制、含有规定量的碳酸氢钠)50体积份，通过吸液进行混合，调制纳米纤维浓度为0.01％(w/v)的培养基组合物。
同样地，配制培养基组合物，其中添加有纳米纤维分散液或脱酰基结冷胶水溶液使为所期望浓度，即最终浓度0.01～0.1％(w/v)。
[实施例5及比较例2至比较例5]
向κ-卡拉胶(GENUGEL WR-80-J、三晶株式会社制：Car)(实施例5)、刺槐豆胶(GENUGUM RL-200-J、三晶株式会社制：LBG)(比较例2)、黄原胶(KELTROL CG、三晶株式会社制：Xan)(比较例3)、迪特胶(KELCO CRETE DG-F、三晶株式会社制：DU)(比较例4)、藻酸Na(Duck alginic acid NSPM,、FOOD CHEMIFA公司制：Alg)(比较例5)1质量份中加入99质量份灭菌水，于121℃高压釜处理20分钟，由此使其溶解且灭菌。
对于由上述配制的多糖溶液，通过与实施例1至4相同的操作，配制添加有多糖溶液使最终浓度为0.03、0.05、0.07、0.1％(w/v)的培养基组合物。
[试验例2：悬浮作用的评价1]
向实施例1～5及比较例2～5的培养基组合物中，添加聚苯乙烯珠(PolysciencesInc.公司制、200－300μm)，确认到通过Vortex搅拌在培养基组合物中珠均匀地分散，然后，于室温(25℃)静置一天，目视确认珠的分散状态。将在培养基组合物中珠均匀地悬浮的状态设为◎、产生部分上清的状态设为○、沉淀状态设为×，进行评价。结果如表41所示。
其结果，实施例1至实施例4的培养基组合物显示出使珠悬浮的作用。另外，实施例5中，虽然于室温呈现出珠的悬浮作用，但加热至37℃致使珠沉淀，在细胞培养条件下不能得到悬浮作用。在比较例2至比较例5中珠完全沉淀至底面。
[表41]
＊实施例5的κ－卡拉胶(Car)虽然在25℃下呈现出悬浮作用，但在与细胞培养条件同等的37℃下立即丧失悬浮作用，发生沉淀。对于其他培养基，在37℃及25℃下能够得到相同的结果。
[试验例3：悬浮作用的评价2]
与试验例2相同地，针对实施例2、4及5以及比较例2的培养基组合物，详细地评价低浓度区域(0.01～0.04％(w/v))中的悬浮作用。添加聚苯乙烯珠，静置2天后，目视确认珠的分散状态。将悬浮分散状态设为○、沉淀状态设为×，进行评价。针对部分沉淀/分散状态，基于10mL圆锥管内的悬浮区域的高度计算珠悬浮率。结果如表42所示。
[表42]
※表示珠悬浮率。PNC在0.015％(w/v)以上的浓度显示出悬浮作用，实施例4的培养基组合物在0.015％(w/v)以上的浓度显示出悬浮作用。实施例2的培养基组合物伴随着浓度增加，悬浮作用阶段性地提高。实施例5的培养基组合物在浓度0.02％以上时于25℃显示出悬浮作用，但是于37℃立即丧失悬浮作用、沉淀(＊)。对于其他的培养基，在37℃及25℃得到相同的结果。
[试验例4：培养基组合物的粘度]
在25℃的条件下采用音叉振动式粘度测定(SV－1A、A&D Company Ltd..)对实施例1～5及比较例2～5的培养基组合物的粘度进行评价。结果如图13所示。其结果，本发明的培养基组合物由于纳米纤维或增粘性多糖的含量极少，所以与一般的培养基的粘度相比，未呈现出显著的粘度增加。基于与试验例2的结果的比较，未确认粘度与悬浮作用之间的相关性。
[试验例5：培养基组合物的扫描型电子显微镜观察]
将实施例1至5、比较例3至4中配制的培养基组合物置于预先使用浓硫酸对表面进行了亲水化处理的硅片上，于110℃(仅比较例1中于室温)干燥1小时后，用纯水清洗、除去多余的盐分等后，再次于110℃干燥1小时，以此状态作为试样。将上述试样用日本电子(株)制扫描型电子显微镜(SEM、JSM－7400F、10，000倍)观察。实施例1至4及比较例3至4的培养基组合物的观察结果如图14至21所示。
观察结果为：在实施例1至4以及于室温干燥的实施例5中，观察到多个纤维，相对于此，于110℃干燥的实施例5及比较例3至4中，完全未观察到纤维。需要说明的是，观察图像中观察到的多个球状物体是在培养基中盐成分析出的物体。该结果教导了培养基组合物中含有的纤维结构有可能有助于悬浮作用。
[试验例7：球体的悬浮作用]
将人肝癌细胞株HepG2(DS PHARMA BIOMEDICAL公司制)以50000个/mL混悬在含有10％(v/v)胎牛血清的DMEM培养基(WAKO公司制)中，将10mL上述混悬液接种至EZ SPHERE(旭硝子公司制)后，在CO2培养箱(5％CO2)内培养2天。将此处所得的球体的混悬液80mL进行离心处理(800rpm、5分钟)，使球体沉淀、除去上清，由此配制4.5mL球体混悬液。接着，每15mL圆锥管中分别加入10mL实施例1至4及比较例1、比较例3至5的培养基组合物，进而加入HepG2细胞的球体混悬液100μL。通过吸液使球体分散，于37℃培养5天，目视观察培养基组合物中的球体的分散状态。将培养基组合物中球体均匀地悬浮的状态设为◎、产生上清的状态设为○、沉淀状态设为×，进行评价。实施例1至5、比较例3至5的培养基组合物的观察结果如表43及图22至29所示。
其结果，在实施例1至实施例4中，培养基组合物中6天培养后也为悬浮状态。另一方面，实施例5及比较例3至比较例5的培养基组合物中，球体全部沉淀，并且球体之间凝集。
[表43]
[实施例1’至实施例4’]
向制造例1至制造例3中配制的纤维素纳米纤维MNC、PNC及甲壳质纳米纤维中加入灭菌水，由此分别配制成1％(w/v)水分散液。另一方面，向1质量份脱酰基结冷胶(KELCOGELCG-LA、三晶株式会社制：DAG)中加入99体积份的灭菌水，于121℃高压釜处理20分钟，由此使其溶解并进行灭菌，配制成1％(w/v)水溶液。使用上述配制的1％(w/v)纤维分散液或脱酰基结冷胶水溶液，添加至含有10％(v/v)胎牛血清的DMEM培养基(日水制药公司制、high-glucose)中使其最终浓度为0.01％、0.03％、0.06％及0.1％(w/v)，配制成培养基组合物。
[实施例5’、及比较例3’至比较例5’]
向κ-卡拉胶(GENUGEL WR-80-J、三晶株式会社制：Car)、黄原胶(KELTROL CG、三晶株式会社制：Xan)、迪特胶(KELCO CRETE DG-F、三晶株式会社制：DU)、藻酸Na(Duckalginic acid NSPM,、FOOD CHEMIFA公司制：Alg)1质量份中加入99体积份的灭菌水，于121℃高压釜处理20分钟，由此使其溶解并灭菌，分别配制成1％(w/v)多糖水溶液。针对上述配制的各多糖水溶液，通过与实施例5至8相同的操作，向含有10％(v/v)胎牛血清的DMEM培养基(日水制药公司制)中添加多糖水溶液使最终浓度为0.01％、0.03％、0.06％及0.1％(w/v)，配制成培养基组合物。
[试验例8：细胞增殖试验]
将人乳癌细胞株MCF－7(DS PHARMA BIOMEDICAL公司制)及人黑色素瘤细胞株A375(ATCC制)以33333细胞/mL接种至实施例1’至实施例5’及比较例3’至比较例5’配制的培养基组合物中，然后，以每1孔150μL分注至96孔平底超低粘附表面微板(Corning公司制、#3474)的孔中。需要说明的是，作为阴性对照，分注在不含纳米纤维或多糖的同上培养基中混悬MCF7细胞或A375细胞而成的物质。接着，将该板在CO2培养箱(37℃、5％CO2)内以静置状态培养最多6天。向培养2天及6天后的培养液中添加ATP试药150μL(CellTiter-GloTMLuminescent Cell Viability Assay，Promega公司制)使其混悬，于室温静置约10分钟后，采用FlexStation3(Molecular Devices公司制)测定发光强度(RLU值)，减去仅培养基的发光值，由此测定活细胞数。
其结果确认，在含有PNC、MNC、NANOCHITIN(日文为“ナノキチン”)的该培养基组合物中，能够以细胞凝集块的大小适当地、均匀地分散的状态进行培养，高效地增殖。另一方面，在含有藻酸钠的该培养基组合物中未见增殖促进效果。MCF7细胞静置培养2天及6天后的RLU值(ATP测定、发光强度)如表44至表47所示，6天后的RLU值如图30至图33所示，A375细胞的结果如表48至表51所示，6天后的RLU值如图34至图37所示。培养2天的凝集块的显微镜观察中，MCF7细胞的结果如图38所示，A375细胞的结果如图39所示。
[表44]
[表45]
[表46]
[表47]
[表48]
[表49]
[表50]
[表51]
[试验例9：使用3T3－L1细胞的保存试验]
使用含有10％FBS的DMEM培养基将小鼠前体脂肪细胞株3T3－L1(ATCC公司制)接种至10cm聚苯乙烯培养皿上，在设定为5％CO2、37℃的培养箱内培养。在3T3－L1细胞汇集的状态下，抽吸除去培养基，用D－PBS(和光纯药公司制)去除FBS，将含有0.25％胰蛋白酶及1mM EDTA的液体1mL(和光纯药公司制)添加至上述聚苯乙烯培养皿中。确认细胞剥离后，添加含有10体积％FBS的DMEM培养基，从培养皿中回收细胞，移至离心分离管中。以300×g离心分离后，去除上清。作为约100×104细胞/mL的细胞混悬液，向1.5mL微型管(microtube)中添加100μL细胞混悬液，分别添加已预先配制成含有10％(v/v)FBS的实施例1至实施例2、实施例4至实施例5、比较例3及比较例5的培养基组合物100μL，通过吸液，制作成细胞混悬液。
在密闭状态下，于室温以静置状态保存10天，将经过3天、10天后的细胞混悬液的一部分用含有10％FBS的DMEM培养基以1/10稀释，向经稀释的细胞混悬液100μL中添加ATP试药100μL(CellTiter-GloTM Luminescent Cell Viability Assay，Promega公司制)，使其混悬，于室温静置15分钟后，用FlexStation3(Molecular Devices公司制)测定发光强度(RLU值)，减去仅培养基的发光值，由此测定活细胞数。阴性对照仅仅是不含多糖的培养基的样品。
其结果，对于阴性对照或比较例3及比较例5的培养基组合物的各细胞生存率来说，在室温保持3至10天时ATP值显著降低，相对于此，对于实施例1至实施例2及实施例4的培养基组合物来说，ATP值的降低被抑制，具有细胞保护效果。活细胞数的结果如表52所示。
[表52]
[试验例10：使用CHO－K1细胞的保存试验]
使用含有10％FBS的F12培养基将中国仓鼠卵巣株CHO－K1－hIFNβ细胞(北九州高等专門学校、由川原教授转让)接种至10cm聚苯乙烯培养皿上，在设定为5％CO2、37℃的培养箱内培养。在CHO－K1－hIFNβ细胞汇集的状态下，抽吸除去培养基，用D－PBS(和光纯药公司制)去除FBS，将含有0.25％胰蛋白酶及1mM EDTA的液体1mL(和光纯药公司制)添加至上述聚苯乙烯培养皿中。确认细胞剥离后，添加含有10％FBS的F12培养基，从培养皿中回收细胞，移至离心分离管中。以300Xg离心分离后，去除上清。作为约5x106细胞/mL的细胞混悬液，向1.5mL微型管中添加25μL细胞混悬液，分别添加已预先配制成含有10％(v/v)FBS的实施例2、实施例4的培养基组合物25μL，通过吸液，制作细胞混悬液。将在密闭状态下于室温下保存1天后的细胞混悬液的一部分用含有10％FBS的F12培养基以1/10稀释，向经稀释的细胞混悬液100μL中添加ATP试药100μL(CellTiter-GloTMLuminescent Cell ViabilityAssay，Promega公司制)使其混悬，于室温静置约10分钟后，用FlexStation3(MolecularDevices公司制)测定发光强度(RLU值)，减去仅培养基的发光值，由此测定活细胞数。阴性对照为仅有不含多糖的培养基的样品。
其结果，对于阴性对照中的各细胞生存率而言，于室温保存1天时ATP值降低，相对于此，对于实施例2及实施例4的培养基组合物而言，具有接种时的水平的ATP值，具有细胞保护效果。活细胞数的结果如表53所示。
[表53]
[试验例11：使用3T3－L1细胞的保存试验、多糖类的浓度变化]
使用含有10％FBS的DMEM培养基，将小鼠前体脂肪细胞株3T3－L1(ATCC公司制)接种至10cm聚苯乙烯培养皿上，在设定为5％CO2、37℃的培养箱内培养。在3T3－L1细胞达到40％汇集的状态下，抽吸除去培养基，用D－PBS(和光纯药公司制)去除FBS，将含有0.25％胰蛋白酶及1mM EDTA的液体1mL(和光纯药公司制)添加至上述聚苯乙烯培养皿中。确认细胞剥离后，添加含有10体积％FBS的DMEM培养基，从培养皿中回收细胞，移至离心分离管中。以300×g离心分离后，去除上清。作为约100×104细胞/mL的细胞混悬液，向1.5mL微型管中添加100μL细胞混悬液，分别添加已预先配制成含有10％(v/v)FBS的实施例2及实施例4、比较例5的多糖类浓度不同的培养基组合物100μL，通过吸液，制作细胞混悬液。
在密闭状态下于室温下以静置状态保存8天，将经过0天、5天、8天后的细胞混悬液的一部分用含有10％FBS的DMEM培养基以1/5稀释，向经稀释的细胞混悬液100μL中添加ATP试药100μL(CellTiter-GloTM Luminescent Cell Viability Assay，Promega公司制)使其混悬，于室温静置15分钟后，用FlexStation3(Molecular Devices公司制)测定发光强度(RLU值)，减去仅培养基的发光值，由此测定活细胞数。阴性对照仅仅为不含多糖的培养基的样品。
其结果，对于阴性对照或比较例5的培养基组合物的各细胞生存率而言，在室温保存5至8天时ATP值显著降低，相对于此，在实施例2及实施例4的培养基组合物中，ATP值的降低被抑制，具有细胞保护效果。活细胞数的结果如表54所示。
[表54]
[试验例12：MDCK细胞的对细胞生存作用的效果]
将脱酰基结冷胶(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社制)以0.3％(w/v)的浓度混悬在超纯水(Milli-Q水)中后，于90℃通过一边加热一边搅拌而溶解，将该水溶液于121℃高压釜灭菌20分钟。使用该溶液，配制在含有10％(v/v)胎牛血清的EMEM培养基(和光纯药公司制)中添加有最终浓度为0.005％(w/v)及0.015％的脱酰基结冷胶的培养基组合物、或者不含脱酰基结冷胶的未添加培养基组合物。接着，将在除去了血清的培养基中培养1昼夜的(饥饿处理)犬肾脏肾小管上皮细胞株MDCK(DS PHARMA BIOMEDICAL公司制)以100000个细胞/mL的量接种至上述的添加了脱酰基结冷胶的培养基组合物中，然后，以每1孔100μL分注到96孔平底超低粘附表面微板(Corning公司制、#3474)的孔中。各板在CO2培养箱(37℃、5％CO2)内以静置状态培养，持续15天。向第2、6、9、12、15天的培养液中添加ATP试药100μL(CellTiter-GloTM Luminescent Cell Viability Assay，Promega公司制)使其混悬，于室温静置约10分钟后，用FlexStation3(Molecular Devices公司制)测定发光强度(RLU值)，减去仅培养基的发光值，由此测定活细胞数。
其结果表明，使用本发明的培养基组合物将MDCK细胞在低粘附板上培养时，能够抑制活细胞数的減少。各培养中的RLU值(ATP测定、发光强度)如表55所示。
[表55]
培养时间(天) 未添加 脱酰基结冷胶(0.005％) 脱酰基结冷胶(0.015％)
2 23453 25309 26069
6 15839 17643 26602
9 9939 14552 26668
12 9833 12409 26210
15 10374 13152 29512
[试验例13：Vero细胞对细胞生存作用的效果]
将脱酰基结冷胶(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社制)以0.3％(w/v)混悬在超纯水(Milli-Q水)中后，于90℃通过一边加热一边搅拌而溶解，将该水溶液于121℃高压釜灭菌20分钟。使用该溶液，制作在含有5％(v/v)胎牛血清的EMedium199培养基(Sigma公司制)中添加有最终浓度0.005％(w/v)及0.015％的脱酰基结冷胶的培养基组合物、或者不含脱酰基结冷胶的未添加培养基组合物。接着，将在除去了血清的培养基中培养1昼夜的(饥饿处理)猴肾臓上皮细胞株Vero(DS PHARMA BIOMEDICAL公司制)以100000个细胞/mL的量接种至上述添加有脱酰基结冷胶的培养基组合物中，然后，以每1孔100μL分注至96孔平底超低粘附表面微板(Corning公司制、#3474)的孔中。各板在CO2培养箱(37℃、5％CO2)内以静置状态培养，持续15天。向第2、6、9、12、15天的培养液中添加ATP试药100μL(CellTiter-GloTMLuminescent Cell Viability Assay，Promega公司制)使其混悬，于室温静置约10分钟后，用FlexStation3(Molecular Devices公司制)测定发光强度(RLU值)，减去仅培养基的发光值，由此测定活细胞数。
其结果表明，使用本发明的培养基组合物在低粘附板上培养Vero细胞时，能够抑制活细胞数的減少。各培养中的RLU值(ATP测定、发光强度)如表56所示。
[表56]
培养时间(天) 未添加 脱酰基结冷胶(0.005％) 脱酰基结冷胶(0.015％)
2 17518 17870 16940
6 12970 13298 13472
9 9500 12560 13097
12 8702 10039 14053
15 6934 9207 14910
[试验例14：各基材对MDCK细胞增殖作用的效果]
将制造例2中配制的纤维素纳米纤维(PNC)、甲壳质纳米纤维(生物质纳米纤维(Biomass Nano Fiber)BiNFi－S 2质量％、株式会社SUGINO MACHINE)及脱酰基结冷胶(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社制)混悬在超纯水(Milli-Q水)中使其为1％(w/v)，然后，于90℃通过一边加热一边搅拌而溶解，将该水溶液于121℃高压釜灭菌20分钟。配制如下培养基组合物：在无血清培养基KBM220培养基(KOHJIN BIO公司制)中添加最终浓度0.01％(w/v),0.03％,0.1％的纤维素纳米纤维而成的培养基组合物；在无血清培养基KBM220培养基中添加最终浓度0.01％(w/v),0.03％,0.1％的甲壳质纳米纤维而成的培养基组合物；在无血清培养基KBM220培养基(KOHJIN BIO公司制)中添加最终浓度0.005％(w/v),0.015％,0.03％,0.06％,0.1％的脱酰基结冷胶而成的培养基组合物；以及不含上述基材的未添加培养基组合物。接着，将在除去了血清的培养基中培养了1昼夜的(饥饿处理)犬肾脏肾小管上皮细胞株MDCK(DS PHARMA BIOMEDICAL公司制)以100000个细胞/mL的量接种至上述各个添加了基材的培养基组合物中，然后，以每1孔100μL分注到96孔平底超低粘附表面微板(Corning公司制、#3474)的孔中。各板在CO2培养箱(37℃、5％CO2)内以静置状态培养，持续14天。向第3、7、10、14天的培养液中添加ATP试药100μL(CellTiter-GloTM LuminescentCell Viability Assay，Promega公司制)使其混悬，于室温静置约10分钟后，用FlexStation3(Molecular Devices公司制)测定发光强度(RLU值)，减去仅培养基的发光值，由此测定活细胞数。
其结果，使用为本发明的培养基组合物的脱酰基结冷胶、纳米纤维素纤维PNC以及甲壳质纳米纤维，在低粘附板上培养MDCK细胞时，在所有的基材添加中均确认到MDCK细胞的增殖促进作用。其中，甲壳质纳米纤维具有最强的效果。各培养中的RLU值(ATP测定、发光强度)如表57所示。
[表57]
第3天 第7天 第10天 第14天
未添加 6945 7388 7611 10225
脱酰基结冷胶0.005％ 7389 9039 10981 16549
脱酰基结冷胶0.015％ 7735 10467 14369 21255
脱酰基结冷胶0.03％ 7943 21459 30706 38572
脱酰基结冷胶0.06％ 7538 17257 31697 44346
脱酰基结冷胶0.1％ 6696 15065 27092 35897
纳米纤维素PNC 0.01％ 7622 14815 22065 34661
纳米纤维素PNC 0.03％ 7795 17250 29732 44805
纳米纤维素PNC 0.1％ 7406 15408 27157 41852
甲壳质纳米纤维0.01％ 8777 21536 42566 54671
甲壳质纳米纤维0.03％ 8886 28311 44933 58338
甲壳质纳米纤维0.1％ 8621 29025 45074 59755
[试验例15：甲壳质纳米纤维对MDCK增殖作用的效果]
将制造例1中配制的纤维素纳米纤维(PNC)、甲壳质纳米纤维(生物质纳米纤维BiNFi－S 2质量％、株式会社SUGINO MACHINE)及脱酰基结冷胶(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社制)混悬在超纯水(Milli-Q水)中使其为1％(w/v)，然后，于90℃通过一边加热一边搅拌而溶解，将该水溶液于121℃高压釜灭菌20分钟。配制下述培养基组合物：在无血清培养基KBM220培养基中添加最终浓度0.0001％(w/v),0.0003％,0.001％,0.003％,0.01％,0.02％,0.03％的甲壳质纳米纤维的培养基组合物；在无血清培养基KBM220培养基(KOHJINBIO公司制)中添加最终浓度0.005％(w/v),0.015％,0.03％的脱酰基结冷胶的培养基组合物；以及不含上述基材的未添加培养基组合物。接着，将在除去了血清的培养基中培养了1昼夜的(饥饿处理)犬肾脏肾小管上皮细胞株MDCK(DS PHARMA BIOMEDICAL公司制)以100000个细胞/mL的量接种至上述的添加有脱酰基结冷胶或甲壳质纳米纤维的培养基组合物中，然后，以每1孔100μL分注到96孔平底超低粘附表面微板(Corning公司制、#3474)的孔中。各板在CO2培养箱(37℃、5％CO2)内以静置状态培养，持续14天。向第5、9、12、15天的培养液中添加ATP试药100μL(CellTiter-GloTM Luminescent Cell Viability Assay，Promega公司制)使其混悬，于室温静置约10分钟后，用FlexStation3(Molecular Devices公司制)测定发光强度(RLU值)，减去仅培养基的发光值，测定活细胞数，为3点的平均值。
其结果，使用为本发明的培养基组合物的脱酰基结冷胶及甲壳质纳米纤维在低粘附板上培养MDCK细胞时，在两者的基材添加中均确认到MDCK细胞的增殖促进作用。其中，甲壳质纳米纤维在浓度为0.0001％以上时显示增殖促进效果，特别是在浓度为0.001％以上时具有高效果。各培养中的RLU值(ATP测定、发光强度)如表58所示。
[表58]
第5天 第9天 第12天 第15天
未添加 30616 22182 32644 27527
脱酰基结冷胶0.005％ 36600 32749 49935 54224
脱酰基结冷胶0.015％ 44682 54161 71837 85747
脱酰基结冷胶0.03％ 35918 43907 55424 64556
甲壳质纳米纤维0.0001％ 44955 42380 55915 55612
甲壳质纳米纤维0.0003％ 61972 66269 75845 81075
甲壳质纳米纤维0.001％ 72036 93296 114045 122244
甲壳质纳米纤维0.003％ 78232 108468 140210 146761
甲壳质纳米纤维0.01％ 74018 104834 148507 156114
甲壳质纳米纤维0.02％ 84482 113526 160236 168680
甲壳质纳米纤维0.03％ 84062 127656 174498 173008
[试验例16：甲壳质纳米纤维对MDCK细胞增殖作用的效果]
初次培养；
将制造例2中配制的纤维素纳米纤维(PNC)、甲壳质纳米纤维(生物质纳米纤维，BiNFi－S 2质量％，株式会社SUGINO MACHINE)混悬在超纯水(Milli-Q水)中使其为1％(w/v)，然后，于90℃通过一边加热一边搅拌而溶解，将该水溶液于121℃高压釜灭菌20分钟。配制下述培养基组合物：在无血清培养基KBM220培养基中添加最终浓度0.01％(w/v)的甲壳质纳米纤维的培养基组合物；无血清培养基KBM220培养基(KOHJIN BIO公司制)及不含甲壳质纳米纤维的未添加培养基组合物。接着，将在除去了血清的培养基中培养了1昼夜的(饥饿处理)犬肾脏肾小管上皮细胞株MDCK(DS PHARMA BIOMEDICAL公司制)以75000个细胞/mL的量接种至上述的添加有甲壳质纳米纤维的培养基组合物中，然后，以每1烧瓶30mL的量分注至三角烧瓶125mL(Corning公司制、#431405)中。烧瓶在CO2培养箱(37℃、5％CO2)内以静置状态培养，持续6天。将第0、6天的培养液在吸液管中混悬后，在3点分注100μL，分别地添加ATP试药100μL(CellTiter-GloTM Luminescent Cell Viability Assay，Promega公司制)使其混悬，于室温静置约10分钟后，用FlexStation3(Molecular Devices公司制)测定发光强度(RLU值)，减去仅培养基的发光值，由此测定活细胞数。
传代培养；
为了确认对传代培养的效果，使用在含有0.01％甲壳质纳米纤维的培养基中培养MDCK细胞6天的细胞混悬液、进行研究。将混合3mL细胞混悬液与27mL未添加培养基组合物使甲壳质纳米纤维浓度为0.001％的细胞混悬液、和混合3mL细胞混悬液与27mL添加有最终浓度0.01％(w/v)的甲壳质纳米纤维的培养基组合物使甲壳质纳米纤维浓度为0.01％的细胞混悬液、分别地注入125mL三角烧瓶中。烧瓶在CO2培养箱(37℃、5％CO2)内以静置状态培养，持续14天。将第0、7、14天的培养液在吸液管内混悬后，按照每3点进行分注100μL，分别地添加ATP试药100μL(CellTiter-GloTM Luminescent Cell Viability Assay，Promega公司制)使其混悬，于室温静置约10分钟后，用FlexStation3(Molecular Devices公司制)测定发光强度(RLU值)，减去仅培养基的发光值，测定活细胞数，为3点的平均值。
其结果表明，使用为本发明的培养基组合物的甲壳质纳米纤维将MDCK细胞在三角烧瓶上培养时，确认到MDCK细胞的增殖促进作用。进而补充含有甲壳质纳米纤维的培养基时，确认MDCK细胞增殖，能够在无胰蛋白酶等处理的情况下简便地进行传代培养。初次培养时的RLU值(ATP测定、发光强度)如表59所示，传代培养时的RLU值(ATP测定、发光强度)如表60所示。
[表59]
[表60]
[试验例17：各培养基中的甲壳质纳米纤维的MDCK细胞增殖促进作用的比较]
将制造例1中配制的纤维素纳米纤维(PNC)、甲壳质纳米纤维(生物质纳米纤维，BiNFi－S 2质量％，株式会社SUGINO MACHINE)及脱酰基结冷胶(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社制)混悬在超纯水(Milli-Q水)中使其为1％(w/v)后，于90℃通过一边加热一边搅拌而溶解，将该水溶液于121℃高压釜灭菌20分钟。配制下述培养基组合物：在无血清培养基KBM220培养基(KOHJIN BIO公司制)或Cosmedium 012培养基(Cosmo Bio公司制)中添加最终浓度0.001％(w/v)、0.01％的甲壳质纳米纤维的培养基组合物；在无血清培养基KBM220培养基或Cosmedium 012培养基中添加最终浓度0.015％(w/v)、0.03％的脱酰基结冷胶的培养基组合物、以及不含上述基材的未添加培养基组合物。接着，将在除去了血清的培养基中培养了1昼夜的(饥饿处理)犬肾脏肾小管上皮细胞株MDCK(DS PHARMA BIOMEDICAL公司制)以100000个细胞/mL的量接种至上述的添加脱酰基结冷胶或甲壳质纳米纤维的培养基组合物中，然后，以每1孔100μL分注到96孔平底超低粘附表面微板(Corning公司制、#3474)的孔中。各板在CO2培养箱(37℃、5％CO2)内以静置状态培养，持续12天。向第4、8、12天的培养液中添加ATP试药100μL(CellTiter-GloTM Luminescent Cell Viability Assay，Promega公司制)使其混悬，于室温静置约10分钟后，用FlexStation3(Molecular Devices公司制)测定发光强度(RLU值)，减去仅培养基的发光值，测定活细胞数，为3点的平均值。
其结果，使用为本发明的培养基组合物的脱酰基结冷胶及甲壳质纳米纤维将MDCK细胞在低粘附板上培养时，在两者的基材添加中均确认到MDCK细胞增殖促进作用。其中，甲壳质纳米纤维在浓度为0.001％以上时即使在使用Cosmedium012培养基的条件下也显示出高增殖能力。针对第4天的细胞状态进行显微镜观察，其结果仅在使用脱酰基结冷胶的培养基条件下细胞凝集块(球体)分散，但在使用甲壳质纳米纤维的培养基条件下观察到球体及细胞以葡萄的串状增殖。在使用KBM220培养基的培养中的RLU值(ATP测定、发光强度)如表61所示，在使用Cosmedium012培养基的培养中的RLU值(ATP测定、发光强度)如表62所示。4天培养的显微镜观察的结果如图40所示。
[表61]
第4天 第8天 第12天
未添加 23542 23441 30472
脱酰基结冷胶0.015％ 28314 35649 57595
脱酰基结冷胶0.03％ 27360 33025 53464
甲壳质纳米纤维0.001％ 49998 63869 120492
甲壳质纳米纤维0.01％ 55646 70073 131614
[表62]
[试验例18：壳聚糖纳米纤维与甲壳质纳米纤维的MDCK细胞增殖作用的比较]
将壳聚糖纳米纤维(生物质纳米纤维BiNFi－S、1质量％、株式会社SUGINOMACHINE)和甲壳质纳米纤维(生物质纳米纤维BiNFi－S 2质量％、株式会社SUGINOMACHINE)、以及与参考例1相同地将脱酰基结冷胶(KELCOGEL CG-LA、三晶株式会社制)混悬在超纯水(Milli-Q水)中使其为1％(w/v)后、于90℃一边搅拌一边配制成的水溶液，分别于121℃高压釜灭菌20分钟。配制下述培养基组合物：在无血清培养基KBM220培养基(KOHJINBIO公司制)中添加最终浓度0.001％(w/v)、0.003％、0.01％、0.03％的壳聚糖纳米纤维或甲壳质纳米纤维而成的培养基组合物；在无血清培养基KBM220培养基添加最终浓度0.015％(w/v)、0.03％的脱酰基结冷胶而成的培养基组合物；以及不含上述基材的未添加培养基组合物。接着，将在除去了血清的培养基中培养了1昼夜的(饥饿处理)犬肾脏肾小管上皮细胞株MDCK(DS PHARMA BIOMEDICAL公司制)以100000个细胞/mL的量接种至上述的添加有脱酰基结冷胶、壳聚糖纳米纤维或甲壳质纳米纤维的培养基组合物中，然后，以每1孔100μL分注到96孔平底超低粘附表面微板(Corning公司制、#3474)的孔中。各板在CO2培养箱(37℃、5％CO2)内以静置状态培养，持续12天。向第7、11天的培养液中添加ATP试药100μL(CellTiter-GloTM Luminescent Cell Viability Assay，Promega公司制)使其混悬，于室温静置约10分钟后，用FlexStation3(Molecular Devices公司制)测定发光强度(RLU值)，减去仅培养基的发光值，测定活细胞数，为3点的平均值。
其结果，使用为本发明的培养基组合物的壳聚糖纳米纤维及甲壳质纳米纤维将MDCK细胞在低粘附板上培养时，确认到比脱酰基结冷胶高的增殖促进作用。另外，甲壳质纳米纤维即使在0.001％浓度的条件下也具有高增殖能力，但壳聚糖纳米纤维从0.01％的浓度开始具有高增殖能力。RLU值(ATP测定、发光强度)如表63所示。
[表63]
第7天 第11天
未添加 30653 27078
脱酰基结冷胶0.015％ 51436 63794
脱酰基结冷胶0.03％ 41146 51356
甲壳质纳米纤维0.001％ 83013 93642
甲壳质纳米纤维0.003％ 92611 102669
甲壳质纳米纤维0.01％ 91771 106490
甲壳质纳米纤维0.03％ 115710 126305
壳聚糖纳米纤维0.001％ 46009 50525
壳聚糖纳米纤维0.003％ 46103 48083
壳聚糖纳米纤维0.01％ 85922 93831
壳聚糖纳米纤维0.03％ 119566 126395
[试验例19：新鲜的食蟹猴初代肝细胞的保存试验]
将制造例2中配制的纤维素纳米纤维(PNC)及与实施例5相同地制作的κ-卡拉胶(GENUGEL WR-80-J、三晶株式会社制：Car)制作成1质量％(w/v)水溶液进行使用。配制下述培养基组合物：在含有10％FBS的Williams’E培养基(Life Technologies公司制)中添加最终浓度0.03％(w/v)、0.1％的PNC或卡拉胶的培养基组合物；以及不含上述基材的未添加培养基组合物。接着，将新鲜的食蟹猴初代肝细胞(株式会社Ina Research公司制)以2,500,000个细胞/mL的量混合到上述的添加有PNC或卡拉胶的培养基组合物中，然后，分注到细胞冻结用Cryogenic vial(Thermo Scientific公司制)中。需要说明的是，向不含基材的同上培养基中，分注混悬有食蟹猴初代肝细胞的物质。上述操作分两批实施。接着，在冷藏(约4℃)的情况下将该管以静置状态输送2天。对在冷藏的条件下输送2天后的、细胞混悬液，使用台盼蓝试药(Life Technologies公司制)，测定混悬液中的细胞生存率。
其结果，使用为本发明的培养基组合物的PNC在冷藏下输送新鲜的猴初代肝细胞时，具有与未添加的条件下的生存率相比更高的生存率。另一方面，卡拉胶无上述作用。生存率如表10所示。
[表64]
第1批 第2批
生存率(％) 生存率(％)
未添加 48 41
PNC 0.03％ 62 48
PNC 0.1％ 62 56
卡拉胶0.03％ 37 35
卡拉胶0.1％ 42 23
[试验例20：再接种后的增殖性评价]
将小鼠前体脂肪细胞株3T3－L1(ATCC公司制)使用含有10％FBS的DMEM培养基接种至10cm聚苯乙烯培养皿上，在设定为5％CO2、37℃的培养箱内培养。在3T3－L1细胞汇集的状态下，抽吸除去培养基，用D－PBS(和光纯药公司制)去除FBS，将含有0.25％胰蛋白酶及1mM EDTA的液体1mL(和光纯药公司制)添加至上述聚苯乙烯培养皿中。确认细胞剥离后，添加含有10体积％FBS的DMEM培养基，从培养皿中回收细胞，移至离心分离管中。以300×g离心分离后，去除上清。作为约200×104细胞/mL的细胞混悬液，向1.5mL微型管中添加150μL的细胞混悬液，将预先配制成含有10％(v/v)FBS的实施例2(PNC浓度0.06％)至实施例4(DAG浓度0.03％)、比较例5(Alg浓度0.03％)的培养基组合物、以及作为阴性对照的含有10体积％FBS的DMEM培养基各添加150μL，进行吸液，由此制作细胞混悬液(约100×104细胞/mL)。
在密闭状态下于室温下以静置状态保存7天后，将细胞混悬液的一部分用含有10％FBS的DMEM培养基稀释，基于保存7天前的接种浓度，配制约10×104细胞/mL的细胞混悬液。向96孔多板(Corning公司制)中各接种100μL细胞混悬液，在接种当天、1天后及2天后添加ATP试药100μL(CellTiter-GloTM Luminescent Cell Viability Assay，Promega公司制)，于室温静置15分钟后，采用FlexStation3(Molecular Devices公司制)测定发光强度(RLU值)(n＝5)，减去仅培养基的发光值，由此测定活细胞数。
其结果，保存7天后的再接种当天的阴性对照或比较例5的培养基组合物的活细胞数(RLU值)，与实施例2至实施例4的培养基组合物相比显著降低。再接种一天后的活细胞数(RLU值)与实施例2及实施例4的各自的再接种当天相比增加，保存后的细胞也保持有增殖性。活细胞数的结果如表65所示。
[表65]
产业上的可利用性
本发明涉及的培养基组合物具有优异的细胞及/或组织悬浮效果，在将来自动植物的细胞及/或组织一边维持其功能一边大量培养时极其有用。另外，通过本发明的方法培养的细胞及/或组织，在化学物质、药品等的药效及毒性评价、酶、细胞生长因子、抗体等有用物质的大量生产、对因疾病、肢体欠损而失去的器官、组织、细胞加以弥补的再生医疗等领域中，极其有用。
对于此处所述的包括专利及专利申请说明书在内的全部刊物中所记载的内容而言，由于被引用至此，故而与明确记载其全部内容相同程度地记入本说明书中。
本申请以在日本提出申请的特愿2014－010842(申请日：2014年1月23日)、特愿2014－123772(申请日：2014年6月16日)、特愿2014－174574(申请日：2014年8月28日)及特愿2014－217761(申请日：2014年10月24日)为基础，其内容全部包含在本说明书中。

Claims (1)

1.细胞块的制造方法，其特征在于，在以按照重量/容量计为0.0001％以上且0.1％以下的含量含有分散成三维网的甲壳质纳米纤维、且能使细胞或组织分散而以悬浮状态培养的液体培养基组合物中进行培养。
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