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CN115336678A - 一种人体蠕形螨体外培养原液及其培养液和复合培养液 - Google Patents

一种人体蠕形螨体外培养原液及其培养液和复合培养液 Download PDF

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CN115336678A CN202210955154.0A CN202210955154A CN115336678A CN 115336678 A CN115336678 A CN 115336678A CN 202210955154 A CN202210955154 A CN 202210955154A CN 115336678 A CN115336678 A CN 115336678A
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湛孝东
谷生丽
汪海波
张大存
牛雪彬
蒋峰
刘婷
汪婧璇
曹佳诚
李麟豪
夏钰婷
吴宇炀
付晓
陶畅
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Shandong Jiuxin Biotechnology Co ltd
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Dongping Jiuxin Biochemical Co ltd
Shandong Jiuxin Biotechnology Co ltd
Shandong Jiuxin Daily Chemical Co ltd
Wannan Medical College
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Abstract

本发明公开了一种人体蠕形螨体外培养原液，其原料按质量百分比包括：甘油三酯40‑50％，胆固醇22‑26％，角鲨烯16‑20％，甘油二酯8‑12％，蜡脂1‑3％，余量为吐温‑80。本发明公开了一种人体蠕形螨体外培养液，包括：上述人体蠕形螨体外培养原液和生理盐水，上述人体蠕形螨体外培养原液和生理盐水的体积比为0.5‑1.5：100。本发明公开了一种人体蠕形螨复合培养液，包括：上述述人体蠕形螨体外培养液和改良RPMI‑1640培养液，上述人体蠕形螨体外培养液和改良RPMI‑1640培养液的体积比为10：1‑6。本发明公开了上述人体蠕形螨复合培养液制备方法。本发明公开了一种人体蠕形螨的培养方法。

Description

一种人体蠕形螨体外培养原液及其培养液和复合培养液
技术领域
本发明涉及蠕形螨培养技术领域，尤其涉及一种人体蠕形螨体外培养原液，及一种人体蠕形螨体外培养液，及一种人体蠕形螨复合培养液及其制备方法，及一种人体蠕形螨的培养方法。
背景技术
蠕形螨(demodicidmite)是一类在人体寄生的螨类，主要有毛囊蠕形螨(Demodexfolliculorum)和皮脂蠕形螨(Demodexbrevis)两种。以往认为蠕形螨是不致病或低致病性的，因为绝大多数人体蠕形螨感染者无自觉症状，表现为无症状的带虫者，或仅有轻微痒感或烧灼感。所表现的临床症状因患者的免疫状态、营养状况、寄生的虫种及感染度等因素有关。
这些年研究发现，人体蠕形螨成虫具有坚硬的螯肢、须肢、带刺的4对足等，它们在皮肤内活动时对上皮细胞和腺细胞造成机械性破坏，使毛囊、皮脂腺失去正常的结构和功能，引起毛囊扩张，上皮变性。当寄生虫体较多时，可引起角化过度或角化不全，皮脂腺分泌阻塞及真皮层毛细血管增生并扩张等病变；虫体的机械刺激和其分泌物、代谢物的化学刺激可引起皮肤组织的炎症反应，导致宿主局部皮肤的非细菌性炎症反应。此外，虫体代谢物可引起变态反应，虫体的进出活动携带其他病原生物进入毛囊或皮脂腺可致继发感染，引起毛囊周围细胞浸润，纤维组织增生。临床上常见的症状有患处皮肤轻度潮红和异常油腻，继而出现弥漫性潮红、充血，继发性红斑湿疹或散在的针尖至粟粒大小不等的红色痤疮状丘疹、脓疮、结痂及脱屑，皮脂异常渗出、毛囊口扩大，表面粗糙，皮肤有瘙痒感及烧灼感等。此外，酒渣鼻、毛囊炎、痤疮、脂溢性皮炎和睑缘炎等皮肤病患者的蠕形螨感染率及感染度均显著高于健康人及一般皮肤病患者，表明这些现象可能与蠕形螨的感染有关。
正因为蠕形螨的致病性越来越被肯定，所以对于蠕形螨病的防治也成为研究热点，特别是对杀蠕形螨具有抑杀作用的药物(或日化品)这些年大量出现涌现。我们在确定一种药物(或日化品)是否对蠕形螨具有杀灭作用时，要进行体外实验。即通过挤压刮拭法或者透明胶纸法将蠕形螨采集到后，加入待测样品，计算杀螨率。但是蠕形螨一旦离开人体后很快就会自行死亡，这给蠕形螨药物(或日化品)体外杀螨效果的验证带来很大困难，因为无法知道是因为药物作用的死亡还是因为蠕形螨自行的死亡。
为了解决这个问题，目前发现有技术利用培养细胞的方法对蠕形螨进行培养，即用RPMI-1640细胞培养液(含胎牛血清)作为营养液培养蠕形螨，该方法虽然延长了蠕形螨的体外存活时间，26℃条件下，蠕形螨的平均存活时间在96小时左右，存活时间还不够理想，无法满足体外试验要求。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种人体蠕形螨体外培养原液，及一种人体蠕形螨体外培养液，及一种人体蠕形螨复合培养液及其制备方法，及一种人体蠕形螨的培养方法。
一种人体蠕形螨体外培养原液，其原料按质量百分比包括：甘油三酯40-50％，胆固醇22-26％，角鲨烯16-20％，甘油二酯8-12％，蜡脂1-3％，余量为吐温-80。
基于蠕形螨以人体的皮脂分泌物为食物，因此本发明采用特定比例的甘油三酯、胆固醇、角鲨烯、甘油二酯、蜡脂配伍，可明显延长蠕形螨的体外存活时间。但角鲨烯是由6个异戊二烯构成的无环三萜烯，分子中的六个双键俱为反式，是一种非环三萜结构，由于其含六个双键，极不稳定，容易氧化，因此形成的皮脂液中由于角鲨烯易氧化，导致配比无法满足蠕形螨的营养需求。
一种人体蠕形螨体外培养液，包括：上述人体蠕形螨体外培养原液和生理盐水，上述人体蠕形螨体外培养原液和生理盐水的体积比为0.5-1.5：100。
优选地，还包括：增稳角鲨烯，增稳角鲨烯与上述人体蠕形螨体外培养液的体积比为0.4-0.8：0.5-1.5。
优选地，增稳角鲨烯采用如下具体步骤制取：将1,2-丙二醇加入生理盐水混合均匀得到预混料；将吐温-80、胶原蛋白加入角鲨烯中搅拌均匀，然后滴加至预制料中得到增稳角鲨烯。
增稳角鲨烯中生理盐水的用量为适量，该部分生理盐水应纳入人体蠕形螨体外培养液中所用生理盐水总量。
本发明采用低能乳化法，将角鲨烯包覆在水相中并形成纳米乳结构，不仅可有效隔绝与氧气接触，而且配合人体蠕形螨体外培养原液制备人体蠕形螨体外培养液，即使分散在体系中的角鲨烯全部被氧化，增稳角鲨烯也能缓慢释放其中的角鲨烯以补充该部分氧化的角鲨烯。本发明通过控制人体蠕形螨体外培养原液与增稳角鲨烯比例，可有效保证人体蠕形螨体外培养液中有效角鲨烯的含量，保证蠕形螨的正常机体活力，有效延长蠕形螨的体外存活时间；而在增稳角鲨烯制备过程中，采用胶原蛋白与角鲨烯结合并缓释至体系中，在保证角鲨烯稳定性的前提下，更易于被蠕形螨吸食，增强蠕形螨活力。
优选地，1,2-丙二醇、吐温-80、胶原蛋白、角鲨烯的质量比为1-5：1-2：1-3：20-25。
一种人体蠕形螨复合培养液，包括：上述人体蠕形螨体外培养液和改良RPMI-1640培养液，上述人体蠕形螨体外培养液和改良RPMI-1640培养液的体积比为10：1-6；改良RPMI-1640培养液包括：RPMI-1640基础培养液5-15g/L，胎牛血清1-5g/L，葡萄糖1-5g/L，白蛋白5-15g/L，L-谷氨酰胺0.1-0.5g/L，岩藻多糖0.1-0.2g/L，HEPES2-10g/L，亚硒酸钠0.1-0.2g/L，维生素C1-2g/L，青霉素0.01-0.1g/L，ATP6-15mg/L，碳酸氢钠1-5g/L。
上述人体蠕形螨复合培养液制备方法，包括如下步骤：
(1)向RPMI-1640基础培养液中加入胎牛血清、葡萄糖、白蛋白、L-谷氨酰胺、岩藻多糖、HEPES、亚硒酸钠、维生素C、青霉素、碳酸氢钠混合均匀，过滤，在使用前加入ATP，得到改良RPMI-1640培养液；
(2)向上述人体蠕形螨体外培养液中加入改良RPMI-1640培养液混合均匀，接着采用低剂量电子束辐照灭菌，然后采用γ射线辐照灭菌得到人体蠕形螨复合培养液。
优选地，步骤(2)中，低剂量电子束辐照灭菌的辐照剂量为0.5-1.2kGy。
优选地，步骤(2)中，γ射线辐照灭菌的辐照剂量为0.2-0.8kGy。
优选地，步骤(2)中，γ射线辐照灭菌的辐照剂量为0.2-0.8kGy。
本发明采用人体蠕形螨体外培养液与改良RPMI-1640培养液复配，不仅可有效稳定复合培养液的pH，使体系处于蠕形螨合适的pH环境，而且可为蠕形螨提供充足的能量，改善并提高蠕形螨细胞酶的代谢功能，促使蠕形螨具有极佳的生理活性。
现有技术中采用饱和蒸汽灭菌，蒸汽冷凝释放大量潜热，具有极大的穿透能力，极容易导致蛋白质变性，造成营养物质被破坏，而终端辐照灭菌，虽然灭菌效果好，但是其对于糖分子有水解和氧化降解作用。
本发明采用低剂量电子束辐照灭菌配合γ射线辐照灭菌，不仅可有效避免营养物质被破坏，保证培养液组分配比的前提下，灭菌彻底，安全可靠。
本发明安全可靠，方法简单，解决了蠕形螨体外不能长时间存活的难题，为杀蠕形螨的药物(或日化品)的研究提供了重要保障。
一种人体蠕形螨的培养方法，其特征在于，包括以下任一种：
a、取位于人体面部皮肤的蠕形螨，加入至上述人体蠕形螨体外培养液中，置于4-26℃恒温箱中，控制恒温箱湿度为50-80％，监控蠕形螨存活率；
b、取位于人体面部皮肤的蠕形螨，加入至上述人体蠕形螨复合培养液中，置于4-26℃恒温箱中，控制恒温箱湿度为50-80％，监控蠕形螨存活率。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步解说。
实施例1
一种人体蠕形螨体外培养原液，其原料按质量百分比包括：甘油三酯50％，胆固醇22％，角鲨烯16％，甘油二酯8％，蜡脂1％，余量为吐温-80。
一种人体蠕形螨体外培养液，由上述人体蠕形螨体外培养原液和生理盐水按体积比为0.5：100组成。
实施例2
一种人体蠕形螨体外培养原液，其原料按质量百分比包括：甘油三酯40％，胆固醇25％，角鲨烯20％，甘油二酯12％，蜡脂2％，余量为吐温-80。
一种人体蠕形螨体外培养液，由上述人体蠕形螨体外培养原液和生理盐水按体积比为1.5：100组成。
实施例3
一种人体蠕形螨体外培养原液，其原料按质量百分比包括：甘油三酯45％，胆固醇24％，角鲨烯18％，甘油二酯10％，蜡脂2％，余量为吐温-80。
一种人体蠕形螨体外培养液，由上述人体蠕形螨体外培养原液和生理盐水按体积比为1：100组成。
实施例4
一种人体蠕形螨体外培养液，由上述人体蠕形螨体外培养原液、增稳角鲨烯和生理盐水按体积比为1：0.6：100组成。
上述人体蠕形螨体外培养原液，其原料按质量百分比包括：甘油三酯45％，胆固醇24％，角鲨烯18％，甘油二酯10％，蜡脂2％，余量为吐温-80。
增稳角鲨烯采用如下具体步骤制取：将1g1,2-丙二醇加入适量生理盐水中混合均匀得到预混料；将1g吐温-80、1g胶原蛋白加入20g角鲨烯中搅拌均匀，搅拌状体下滴加至预制料中，搅拌速度为100r/min，得到增稳角鲨烯。
实施例5
一种人体蠕形螨体外培养液，由上述人体蠕形螨体外培养原液、增稳角鲨烯和生理盐水按体积比为1：0.6：100组成。
上述人体蠕形螨体外培养原液，其原料按质量百分比包括：甘油三酯45％，胆固醇24％，角鲨烯18％，甘油二酯10％，蜡脂2％，余量为吐温-80。
增稳角鲨烯采用如下具体步骤制取：将5g1,2-丙二醇加入适量生理盐水中混合均匀得到预混料；将2g吐温-80、3g胶原蛋白加入25g角鲨烯中搅拌均匀，搅拌状体下滴加至预制料中，搅拌速度为500r/min，得到增稳角鲨烯。
实施例6
一种人体蠕形螨体外培养液，由上述人体蠕形螨体外培养原液、增稳角鲨烯和生理盐水按体积比为1：0.6：100组成。
上述人体蠕形螨体外培养原液，其原料按质量百分比包括：甘油三酯45％，胆固醇24％，角鲨烯18％，甘油二酯10％，蜡脂2％，余量为吐温-80。
增稳角鲨烯采用如下具体步骤制取：将3g1,2-丙二醇加入适量生理盐水中混合均匀得到预混料；将1.5.g吐温-80、2g胶原蛋白加入22g角鲨烯中搅拌均匀，搅拌状体下滴加至预制料中，搅拌速度为300r/min，得到增稳角鲨烯。
实施例7
一种人体蠕形螨复合培养液，包括：实施例6所得人体蠕形螨体外培养液和改良RPMI-1640培养液，实施例6所得人体蠕形螨体外培养液和改良RPMI-1640培养液的体积比为10：1。
改良RPMI-1640培养液包括：RPMI-1640基础培养液5g/L，胎牛血清1g/L，葡萄糖1g/L，白蛋白5g/L，L-谷氨酰胺0.1g/L，岩藻多糖0.1g/L，HEPES2g/L，亚硒酸钠0.1g/L，维生素C1g/L，青霉素0.01g/L，ATP6mg/L，碳酸氢钠1g/L。
上述人体蠕形螨复合培养液制备方法，包括如下步骤：
(1)向RPMI-1640基础培养液中加入胎牛血清、葡萄糖、白蛋白、L-谷氨酰胺、岩藻多糖、HEPES、亚硒酸钠、维生素C、青霉素、碳酸氢钠混合均匀，过滤，在使用前加入ATP，得到改良RPMI-1640培养液；
(2)向实施例6所得人体蠕形螨体外培养液中加入改良RPMI-1640培养液混合均匀，接着采用低剂量电子束辐照灭菌，辐照剂量为0.5kGy，然后采用γ射线辐照灭菌，辐照剂量为0.2kGy，得到人体蠕形螨复合培养液。
实施例8
一种人体蠕形螨复合培养液，包括：实施例6所得人体蠕形螨体外培养液和改良RPMI-1640培养液，实施例6所得人体蠕形螨体外培养液和改良RPMI-1640培养液的体积比为10：6。
改良RPMI-1640培养液包括：RPMI-1640基础培养液15g/L，胎牛血清5g/L，葡萄糖5g/L，白蛋白15g/L，L-谷氨酰胺0.5g/L，岩藻多糖00.2g/L，HEPES10g/L，亚硒酸钠0.2g/L，维生素C2g/L，青霉素0.1g/L，ATP15mg/L，碳酸氢钠5g/L。
上述人体蠕形螨复合培养液制备方法，包括如下步骤：
(1)向RPMI-1640基础培养液中加入胎牛血清、葡萄糖、白蛋白、L-谷氨酰胺、岩藻多糖、HEPES、亚硒酸钠、维生素C、青霉素、碳酸氢钠混合均匀，过滤，在使用前加入ATP，得到改良RPMI-1640培养液；
(2)向实施例6所得人体蠕形螨体外培养液中加入改良RPMI-1640培养液混合均匀，接着采用低剂量电子束辐照灭菌，辐照剂量为1.2kGy，然后采用γ射线辐照灭菌，辐照剂量为0.8kGy，得到人体蠕形螨复合培养液。
实施例9
一种人体蠕形螨复合培养液，包括：实施例6所得人体蠕形螨体外培养液和改良RPMI-1640培养液，实施例6所得人体蠕形螨体外培养液和改良RPMI-1640培养液的体积比为10：3。
改良RPMI-1640培养液包括：RPMI-1640基础培养液10g/L，胎牛血清3g/L，葡萄糖3g/L，白蛋白10g/L，L-谷氨酰胺0.3g/L，岩藻多糖0.15g/L，HEPES6g/L，亚硒酸钠0.15g/L，维生素C1.5g/L，青霉素0.06g/L，ATP10.5mg/L，碳酸氢钠3g/L。
上述人体蠕形螨复合培养液制备方法，包括如下步骤：
(1)向RPMI-1640基础培养液中加入胎牛血清、葡萄糖、白蛋白、L-谷氨酰胺、岩藻多糖、HEPES、亚硒酸钠、维生素C、青霉素、碳酸氢钠混合均匀，过滤，在使用前加入ATP，得到改良RPMI-1640培养液；
(2)向实施例6所得人体蠕形螨体外培养液中加入改良RPMI-1640培养液混合均匀，接着采用低剂量电子束辐照灭菌，辐照剂量为0.8kGy，然后采用γ射线辐照灭菌，辐照剂量为0.5kGy，得到人体蠕形螨复合培养液。
采用RPMI-1640细胞培养液(含胎牛血清)和生理盐水作为对照组。按本发明提供的人体蠕形螨培养方法进行对比试验，具体如下：
嘱志愿者于睡前彻底洁面，将长6cm，宽1.5cm的透明胶带分别贴于志愿者额、颊、鼻、下巴等部位，并轻轻按压，使胶带与面部充分接触。次日揭下后粘于载玻片上，镜检，将检获的蠕形螨分别加入200μL各组试样(实施例3/6/9所得培养液、对照组所用RPMI-1640细胞培养液和对照组所用生理盐水)中。置入26℃的恒温箱中，控制恒温箱湿度为65％。每4h观察一次蠕形螨的存活情况(判断标准为：在400×光镜下，虫体螯肢或足爪动者为活，不动者为死)，记录存活时间(h)。每组蠕形螨共观察100只，结果取平均值。结果如表1所示：
表1不同培养液中蠕形螨体外平均存活时间(t±s)
组别 平均存活时间(h) P值
RPMI-1640组 93.64±10.25 /
生理盐水组 76.82±8.79 /
实施例3组 127.83±16.14 <0.05(*，**)
实施例6组 139.31±12.42 <0.05(*，**)
实施例9组 163.47±13.59 <0.05(*，**)
注：*表示与RPMI-1640组比较；**表示与生理盐水组比较。
从以上实验结果可知，RPMI-1640组和生理盐水组的存活时间和文献报道的一致，说明本次实验的条件与文献报道中的条件相仿，两次实验结果具有可比性。而实施例3组、实施例6组、实施例9组的平均存活时间分别为127.83±16.14h、139.31±12.42h、163.47±13.59h，明显高于RPMI-1640组和生理盐水组(P<0.05)，具有显著性差异。
同时，实施例6组优于实施例3组，说明本发明采用低能乳化法，将角鲨烯包覆在水相中并形成纳米乳结构，可有效隔绝角鲨烯与氧气接触，而且能缓慢释放其中的角鲨烯，有效保证培养液中有效角鲨烯的含量，保证蠕形螨的正常机体活力，有效延长蠕形螨的体外存活时间。而实施例9组又优于实施例6组，说明本发明采用人体蠕形螨体外培养液与改良RPMI-1640培养液复配，不仅可有效稳定复合培养液的pH，使体系处于蠕形螨合适的pH环境，而且可为蠕形螨提供充足的能量，改善并提高蠕形螨细胞酶的代谢功能，促使蠕形螨具有极佳的生理活性。
嘱志愿者于睡前彻底洁面，将长6cm，宽1.5cm的透明胶带分别贴于志愿者额、颊、鼻、下巴等部位，并轻轻按压，使胶带与面部充分接触。次日揭下后粘于载玻片上，镜检，将检获的蠕形螨加入200μL实施例9所得培养液中。分别置入4℃、26℃、37℃的恒温箱中，控制恒温箱湿度为65％。每天定时观察的虫体存活情况。结果如表2所示：
表2蠕形螨在不同温度的培养液中存活时间
Figure BDA0003791023490000121
上表表明，人体蠕形螨具有较强的生活能力，温度对其生存时间有影响，低温条件下存活时间较长，4℃环境中蠕形螨可平均存活7.37天，而在4-26℃范围内，温度对蠕形螨生存时间影响不大。而随着温度继续升高，螨虫存活时间急剧降低。
上述结果提示：采用体外杀螨方式对研究结果进行验证时，应避免由于温度导致杀螨结果出现偏差。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种人体蠕形螨体外培养原液，其特征在于，其原料按质量百分比包括：甘油三酯40-50％，胆固醇22-26％，角鲨烯16-20％，甘油二酯8-12％，蜡脂1-3％，余量为吐温-80。
2.一种人体蠕形螨体外培养液，其特征在于，包括：如权利要求1所述人体蠕形螨体外培养原液和生理盐水，如权利要求1所述人体蠕形螨体外培养原液和生理盐水的体积比为0.5-1.5：100。
3.根据权利要求2所述人体蠕形螨体外培养液，其特征在于，还包括：增稳角鲨烯，增稳角鲨烯与如权利要求1所述人体蠕形螨体外培养液的体积比为0.4-0.8：0.5-1.5。
4.根据权利要求2所述人体蠕形螨体外培养液，其特征在于，增稳角鲨烯采用如下具体步骤制取：将1,2-丙二醇加入生理盐水混合均匀得到预混料；将吐温-80、胶原蛋白加入角鲨烯中搅拌均匀，然后滴加至预制料中得到增稳角鲨烯。
5.根据权利要求4所述人体蠕形螨体外培养液，其特征在于，1,2-丙二醇、吐温-80、胶原蛋白、角鲨烯的质量比为1-5：1-2：1-3：20-25。
6.一种人体蠕形螨复合培养液，其特征在于，包括：如权利要求2-5任一项所述人体蠕形螨体外培养液和改良RPMI-1640培养液，如权利要求2-5任一项所述人体蠕形螨体外培养液和改良RPMI-1640培养液的体积比为10：1-6；
改良RPMI-1640培养液包括：RPMI-1640基础培养液5-15g/L，胎牛血清1-5g/L，葡萄糖1-5g/L，白蛋白5-15g/L，L-谷氨酰胺0.1-0.5g/L，岩藻多糖0.1-0.2g/L，HEPES 2-10g/L，亚硒酸钠0.1-0.2g/L，维生素C1-2g/L，青霉素0.01-0.1g/L，ATP 6-15mg/L，碳酸氢钠1-5g/L。
7.一种如权利要求6所述人体蠕形螨复合培养液制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)向RPMI-1640基础培养液中加入胎牛血清、葡萄糖、白蛋白、L-谷氨酰胺、岩藻多糖、HEPES、亚硒酸钠、维生素C、青霉素、碳酸氢钠混合均匀，过滤，在使用前加入ATP，得到改良RPMI-1640培养液；
(2)向如权利要求2-5任一项所述人体蠕形螨体外培养液中加入改良RPMI-1640培养液混合均匀，接着采用低剂量电子束辐照灭菌，然后采用γ射线辐照灭菌得到人体蠕形螨复合培养液。
8.根据权利要求7所述人体蠕形螨复合培养液制备方法，其特征在于，步骤(2)中，低剂量电子束辐照灭菌的辐照剂量为0.5-1.2kGy。
9.根据权利要求7所述人体蠕形螨复合培养液制备方法，其特征在于，步骤(2)中，γ射线辐照灭菌的辐照剂量为0.2-0.8kGy。
10.一种人体蠕形螨的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：取位于人体面部皮肤的蠕形螨，加入至如权利要求2-5任一项所述人体蠕形螨体外培养液，或，如权利要求6所述人体蠕形螨复合培养液中，置于4-26℃恒温箱中，控制恒温箱湿度为50-80％，监控蠕形螨存活率。
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