CN112575036A

CN112575036A - I型单纯疱疹病毒载体及重组溶瘤性i型单纯疱疹病毒

Info

Publication number: CN112575036A
Application number: CN202011050904.7A
Authority: CN
Inventors: 周国瑛; 陈晓庆; 刘贤杰
Original assignee: Immuno Vir Co ltd
Current assignee: Immuno Vir Co ltd
Priority date: 2016-04-22
Filing date: 2016-04-22
Publication date: 2021-03-30
Also published as: AU2016403583B2; US20190083555A1; NZ746916A; KR20210013366A; AU2016403583A1; JP6802275B2; NZ766679A; US10821140B2; CN108350468B; RU2751236C2; US20200405792A1; JP2019512205A; IL262385B1; KR102323872B1; RU2018136481A3; RU2018136481A; AU2020204209B2; EP3380621A1; US11439679B2; CN108350468A

Abstract

本发明提供了一种I型单纯疱疹病毒载体。本发明还提供了一种重组溶瘤性I型单纯疱疹病毒和包含重组溶瘤性I型单纯疱疹病毒的药物组合物。本发明的包含重组溶瘤性I型单纯疱疹病毒的组合物可以用于治疗癌症。

Description

I型单纯疱疹病毒载体及重组溶瘤性I型单纯疱疹病毒

本申请为2018年05月11日进入中国国家阶段、申请号为201680065759.5、申请日为2016年04月22日、发明名称为“用于癌症治疗的溶瘤性单纯疱疹病毒(oHSV)专性载体及其构建体的构建”的发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明大体上涉及使用溶瘤性单纯疱疹病毒(oHSV)治疗癌症。具体地，本发明涉及专性(obligate)HSV载体的制备，该载体可携带并表达多个编码免疫共刺激分子和/或免疫治疗剂的基因。本发明还涉及一种创新设计的基因组，其能够作为用来携带和表达治疗癌症的多种治疗基因的载体。

背景技术

溶瘤性单纯疱疹病毒(oHSV)正被广泛地进行实体瘤治疗的研究。溶瘤性单纯疱疹病毒在整体上相比传统癌症疗法有很多优点(Markert et al., 2000; Russell et al.,2012; Shen and Nemunaitis, 2006)。具体而言，oHSV通常包含突变以使它们易受先天性免疫的抑制。因而，它们能够在癌细胞中复制，而不能在正常细胞中复制，因为在这些癌细胞中，一种或多种对感染的先天免疫响应受损害，而在正常细胞中这些免疫响应是完整的。oHSV通常被直接递送到肿瘤实体中，病毒可以在肿瘤实体中复制。因为病毒被递送至靶组织而不是全身性地给药，所以这种抗癌药不会产生任何副作用。病毒的一个特征是能够诱导获得性免疫响应，这导致它们不能被多次给药。oHSV已被多次给药至肿瘤，但没有证据显示它们的效力丧失或诱导出副反应(如炎症反应)。HSV是大的DNA病毒，其能够将外源DNA加入到它们的基因组中并在给药至肿瘤后调节这些基因的表达。适合与oHSV一起使用的外源基因是那些能够帮助对肿瘤诱导出获得性免疫响应的基因。

克服细胞先天免疫响应的缺陷决定了该病毒作为抗癌剂能够溶瘤的肿瘤范围。缺失的序列越多，能够被治疗的癌细胞的范围就越窄，oHSV的有效性取决于被缺失的病毒基因的功能。大多数新近的oHSV加入了至少一个细胞基因以支持其抗癌活性(Cheema etal., 2013; Goshima et al., 2014; Markert et al., 2012; Walker et al., 2011)。

将oHSV的结构(称为骨架)和适合插入的外源基因单独考虑便于进行研究。如上所述，骨架的结构决定了易感癌症的范围。外源基因导致宿主将癌细胞视为获得性免疫响应的合法靶标。

HSV-1基因组由两个共价连接的成分组成，分别为L和S。每个成分由特有序列(L成分为U_L，S成分为U_S)构成，特有序列的两侧为反向重复序列。L成分的反向重复序列称为ab和b’a’。S成分的反向重复序列称为a’c’和ca。反向重复序列b’a’和a’c’构成内部反向重复区。已知L和S成分的反向重复区包含两份拷贝的五种基因和大量的转录但不编码蛋白质的DNA，这五种基因分别编码蛋白质ICP0、ICP4、ICP34.5、ORF P和OFR O。

现有在癌症患者中测试的病毒分为三大类别。第一种是基于ICP34.5基因的缺失使病毒毒性显著减弱的发现而设计的(Andreansky et al., 1997; Chou et al., 1995;Chou et al., 1990; Chou and Roizman, 1992)。为了确保用于治疗恶性胶质瘤的安全性，G207(首个在患者中测试的病毒)通过在编码病毒核糖核苷酸还原酶的基因中进行进一步突变而被减毒(Mineta et al., 1995)。但是，携带ICP34.5突变和核糖核苷酸还原酶基因突变的G207的毒性太弱，在表达野生型蛋白激酶R的癌细胞中完全停止复制(Smith etal., 2006)。

第二种设计是基于下述事实进行的：如果Us11病毒蛋白在感染早期表达，那么它会部分补偿ICP34.5缺失带来的后果并恢复在表达野生型蛋白激酶R的细胞中生长的能力(Cassady et al., 1998a)。这种病毒的骨架设计遵循Cassady (Cassady et al., 1998b)公开的结果，其Us12基因和Us11的启动子被删除。因此，Us11作为即早期基因（而不是作为晚期基因）被表达。

第三类病毒的骨架最初称为R7020，后更名为NV1020，它是经自发突变修饰形成的，最初被用作减毒病毒活疫苗来测试的(Meignier et al., 1988; Weichselbaum etal., 2012)。该突变缺少内部反向重复区(由b’a’和a’c’构成，编码一个拷贝的基因ICP0、ICP4、ICP34.5、ORF P 和ORF O)和编码U_L56 和U_L24的基因。此外，它具有细菌性序列，并且因为它原先预期用作疫苗，所以还包含编码几种HSV-2糖蛋白的基因。R7020在结肠癌的肝转移病人中进行了大量的测试。此外，它还在头颈上皮鳞状细胞癌、无胸腺裸鼠前列腺癌异种移植物和胆囊肿瘤模型中进行了测试(Cozzi et al., 2002; Cozzi et al., 2001;Currier et al., 2005; Fong et al., 2009; Geevarghese et al., 2010; Kelly etal., 2008; Kemeny et al., 2006; Wong et al., 2001)。

oHSV疗法的成功取决于对癌细胞的破坏程度。在oHSV疗法的早期开发过程中就意识到，HSV无法单独杀死实体瘤中的所有癌细胞，oHSV治疗不太可能可以有效地消除所有癌细胞，在临床试验中，oHSV对肿瘤的破坏必须包括对肿瘤的获得性免疫响应。进一步的研究显示，由受感染的肿瘤细胞碎片引起的抗肿瘤免疫响应可通过加入细胞因子而被放大。无细胞因子基因的oHSV与加入免疫刺激性细胞因子的oHSV的比较结果证实了这种猜想(Andreanski et al.)并且最终导致将GM-CSF加入到oHSV中，用于治疗黑素瘤(Andtbackaet al., 2015)。

oHSV的安全性取决于使病毒的一个或多个阻断宿主对感染的先天性免疫响应的功能失活的基因的缺失情况。对公开数据的分析表明，迄今为止的临床试验中的oHSV都被过度减毒并且可以被改善(Miest and Cattaneo, 2014)。

加入编码免疫刺激性细胞因子的基因可增强对肿瘤的免疫响应，但不会有效地增强由T细胞导致的细胞毒作用，后者对于抗肿瘤作用至关重要。肿瘤通过PD-1和CTLA-4抑制途径来使免疫系统沉默。PD-1在活化的T细胞上以及其他造血细胞上表达，而CTLA-4表达于活化的T细胞，包括调节性T细胞(Fife and Pauken, 2011; Francisco et al., 2010;Keir et al., 2008; Krummel and Allison, 1995; Walunas et al., 1994)。肿瘤使用PD-1和CTLA-4抑制途径来逃避宿主免疫响应。为使抗肿瘤响应最大化，通过PD-1抗体来中和PD-1，在某些情况下中和存在于T细胞表面的CTLA4来活化细胞毒性T细胞是必要的(Topalian et al., 2015)。虽然系统性给予抗PD-1或CTLA4的单链抗体可有效增强oHSV的疗效，但这常常伴随副作用并且无法长期多次给药。

因此，临床上急迫需要开发出一种安全且更加有效的oHSV并将其与免疫治疗剂结合使用。

发明内容

本文的一个方面涉及修饰的I型单纯疱疹病毒(下文也称为HSV-1、专性载体、载体、HSV-1病毒)，其包含修饰的HSV-1基因组。该修饰包含缺失野生型HSV-1基因组的U_L56基因的启动子至U_S1的启动子之间的序列，使得(i)所有双拷贝基因的一个拷贝被缺失，并且(ii)用于表达所述缺失后的病毒DNA中存在的所有开放阅读框(ORF)所需的序列是完整的。

本文的另一个方面提供一种溶瘤I型单纯疱疹病毒(HSV-1)构建体，其包含(i)用于表达病毒基因组中所有单拷贝开放阅读框所需的序列；(ii)病毒基因组中所有双拷贝基因中每一个的单拷贝；和(iii)编码非编码RNA的重复DNA(duplicated DNA)中的单拷贝。

本文的另一个方面涉及一种重组溶瘤I型单纯疱疹病毒(HSV-1)，其包含(a)经修饰的HSV-1基因组，其中所述修饰包含在野生型HSV-1基因组的U_L56基因的启动子与U_S1基因的启动子之间的序列缺失，使得(i)所有双拷贝基因的一个拷贝被缺失，并且(ii)用于表达所述缺失后的病毒DNA中存在的所有开放阅读框(ORF)所需的序列是完整的；以及(b)编码免疫刺激剂和/或免疫治疗剂的外源性核酸序列，其中所述外源性核酸序列被稳定地加入到至少是所述经修饰的HSV-1基因组的被缺失的区域。

本文的另一个方面是一种病毒载体，其包含所有开放阅读框(即U_L1至U_L56以及U_S1至 U_S12)的单拷贝并且包含位于基因组末端的“a”序列，所述病毒载体是一种专性载体，即它自身无法在高度易感的Vero细胞中复制。在插入包含(a)细胞DNA编码序列或非编码序列或(b)含非编码序列的病毒DNA的DNA之后，所述载体能够复制。该专性载体能够耐受的总DNA长度为至少15 KB或高达22 KB。

本文的另一个方面涉及一种药物组合物，其包含有效量的本文的重组溶瘤HSV-1以及药学上可接受的载体。该组合物可被配制成用于瘤内施用。

本文的另一个方面涉及一种治疗癌症的方法，所述方法包括向有需要的对象施用有效量的本发明所述的重组溶瘤HSV-1或所述药物组合物。此外，本发明还涉及所述重组溶瘤HSV-1在治疗癌症的方法中的应用。

本发明的再一个方面涉及所述重组溶瘤HSV-1或药物组合物在制备治疗抗癌药物中的应用。

附图说明

本方面的这些方面和优点以及其它方面和其他优点可从下面参考附图的详细描述中明显看出。

图1. HSV-1病毒的示意图。HSV-1，野生型HSV-1基因组结构，显示在bp117005和bp132096之间的内部反向重复区b’a’-a’c’； IMMV201，oHSV-1基因组结构，也称为专性载体；IMMV202，表达鼠IL 12的oHSV-1；IMMV203，表达IL 12的oHSV-1；IMMV303，表达人CTLA-4scFv的oHSV-1；IMMV403，表达人PD-1 scFv的oHSV-1。

图2. 基于专性载体的溶瘤HSV-1病毒的示意图，其表达免疫刺激剂和/或免疫治疗剂。IMMV502，表达人抗PD-1 scFv和鼠IL 12的oHSV-1；IMMV504，表达鼠抗CTLA-4 scFv和鼠IL 12的oHSV-1；IMMV503，表达人抗PD-1 scFv和人IL 12的oHSV-1；IMMV505，表达人抗CTLA-4 scFv和人IL 12的oHSV-1；IMMV507，表达人抗CTLA-4 scFv和人抗PD-1 scFv的oHSV-1；IMMV603，表达人抗CTLA-4 scFv、人抗PD-1 scFv和人IL 12的oHSV-1。

图3. 抗PD-1 scFv从分泌测试构建体中的表达。具有His标签的scFv-anti-PD-1在CMV启动子的驱动下与来自不同天然来源的信号肽编码区一起表达。收集细胞裂解液和上清液，进行SDS-PAGE，并用抗His抗体印迹。泳道1，GM-CSF信号肽；泳道2，Gaussia荧光素酶信号肽；泳道3，Hidden Markov Model 38 (HMM38) 信号肽；泳道4，抗体V基因信号肽。

图4. 靶向PD-1的scFv-anti-PD-1的亲和试验。CMV启动子驱动的带His标签的scFv-anti-PD-1与HMM38信号肽的ELISA试验。收集上清液进行ELISA试验，通过抗His抗体检测。

图5.体外细胞生长存活率试验。(a) T24，人膀胱癌细胞；(b) ECA109，人食管癌细胞；(c) CNE1，人鼻咽癌细胞；(d) HCT116，人结肠癌细胞；(e) Hep2，人喉癌细胞；(f) MD-MB-231，人书腺癌细胞；(g) Hela，人上皮腺癌细胞；(h) A549，人肺癌上皮细胞；(i) H460，人非小细胞肺癌细胞。

具体实施方式

定义

要注意的是，术语“一”或“一个”实体是指该实体中的一个或多个；例如，“重组溶瘤HSV-1”被理解为表示一个或多个重组溶瘤HSV-1病毒。因此，术语“一个”、“一个或多个”和“至少一个”可以在本文中互换使用。

“同源性”或“同一性”或“相似性”是指两个肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性。可以通过比较每个序列中可以比对的位置来确定同源性。当比较序列中的位置被相同的碱基或氨基酸占据时，那么分子在该位置是同源的。序列之间的同源程度与序列共有的匹配或同源位置的数目相关。“不相关的”或“非同源的”序列与本文的其中一个序列共享小于40％的同一性，优选小于25％的同一性。

一个多核苷酸或多核苷酸区域与另一个序列具有特定百分数(例如，60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％)的“序列同一性”是指，当比对时，在比较两个序列时该百分比的碱基(或氨基酸)是相同的。该比对和百分比同源性或序列同一性可以使用本领域已知的软件程序来确定。

如本文所用，“抗体”或“抗原结合多肽”是指特异性识别并结合一种或多种抗原的多肽或多肽复合物。抗体可以是完整抗体及其任何抗原结合片段或其单链。因此，术语“抗体”包括任何具有抗原结合生物学活性的免疫球蛋白分子的至少一部分的蛋白质或肽。这样的实例包括，但不限于，重链或轻链的互补决定区(CDR)或其配体结合部分，重链或轻链可变区，重链或轻链恒定区，框架 (FR)区或其任何部分，或结合蛋白的至少一部分。术语抗体还包括在激活时具有抗原结合能力的多肽或多肽复合物。

如本文所用，术语“抗体片段”或“抗原结合片段”是抗体的一部分，例如F(ab')₂、F(ab)₂、Fab'、Fab、Fv、scFv等等。不管结构如何，抗体片段与完整抗体所识别的相同抗原结合。术语“抗体片段”包括适体、镜像异构体和双抗体。术语“抗体片段”还包括通过与特定抗原结合形成复合物而起到类似抗体的作用的任何合成的或基因工程化的蛋白质。

本文的抗体、抗原结合多肽或其变体或衍生物包括，但不限于，多克隆、单克隆、多特异性、人源、人源化、灵长类化或嵌合的抗体、单链抗体、表位结合片段(例如Fab、Fab'及F(ab')₂)、Fd、Fv、单链Fv (scFv)、单链抗体、二硫键连接的Fv(sdFv)、包含VK或VH结构域的片段、由Fab表达文库产生的片段以及抗独特型(抗-Id)抗体。本文的免疫球蛋白或抗体分子可以是免疫球蛋白分子的任何类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)，或亚类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)。

“特异性结合”或“具有特异性”通常是指抗体经由其抗原结合结构域与表位结合，并且该结合需要抗原结合结构域和表位之间的一些互补性。根据该定义，当抗体通过其抗原结合结构域结合至表位比结合至随机的、不相关的表位时更容易时，则该抗体被认为与表位“特异性结合”。术语“特异性”在本文中用于定量某种抗体与某个表位结合的相对亲和力。例如，可以认为抗体“A”对给定表位具有比抗体“B”更高的特异性，或者抗体“A”可被描述为相比于结合相关表位“D”以更高的特异性结合表位“C”。

如本文所用，如本文中可互换使用的“癌症”或“肿瘤”是指可根据本公开内容治疗并涉及异常细胞生长的一组疾病，其可能侵入或扩散至身体。并非所有的肿瘤都是癌性的；良性肿瘤不会扩散到身体的其他部位。可能的体征和症状包括：新的肿块、不正常的出血、长时间的咳嗽、不明原因的体重减轻和排便改变等等。有超过100种不同的已知癌症影响人类。本公开内容优选适用于实体瘤。肿瘤或癌症的非限制性实例包括胆囊癌、基底细胞瘤、肝外胆管癌、结肠癌、子宫内膜癌、食道癌、尤因肉瘤、前列腺癌、胃癌、神经胶质瘤、肝细胞癌、霍奇金淋巴瘤、喉癌、肝癌、肺癌、黑素瘤、间皮瘤、胰腺癌、直肠癌、肾癌、甲状腺癌、恶性周围神经细胞肿瘤、恶性外周神经鞘瘤(MPNST)、皮肤和丛状神经纤维瘤、平滑肌瘤样瘤、纤维瘤、子宫肌瘤、平滑肌肉瘤、乳头状甲状腺癌、甲状腺未分化癌、甲状腺髓样癌、甲状腺滤泡癌，hurthle细胞癌、甲状腺癌、腹水、恶性腹水、间皮瘤、唾液腺肿瘤、唾液腺粘液表皮样癌、唾液腺腺泡细胞癌、胃肠道基质肿瘤(GIST)、导致身体潜在空间积液的肿瘤、胸腔积液、心包积液、腹膜积液、巨细胞瘤(GCT)、骨GCT、色素沉着绒毛结节性滑膜炎(PVNS)、腱鞘巨细胞瘤(TGCT)、腱鞘的TCGT(TGCT-TS)和其他肉瘤。在优选的实施方式中，本发明用于治疗食管癌、肺癌、前列腺癌或膀胱癌。

如本文所用，术语“治疗”是指治疗性治疗和预防性措施，目的是预防或减缓(减轻)不希望的生理变化或紊乱，例如癌症的进展。有益的或期望的临床结果包括，但不限于，缓解症状、减少疾病程度、稳定(即不恶化)疾病状态、延缓或减缓疾病进展、改善或缓解疾病状态、以及症状消失(无论是部分还是全部)，无论是可检测的还是无法检测的。“治疗”也意味着与不接受治疗时所预期的生存期相比延长生存期。需要治疗的病人包括那些已经患有疾病或病症的人，以及那些容易患有疾病或病症的人，或那些预防疾病或病症的人。

“对象”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物”是指期望进行诊断、预后或治疗的任何对象，特别是哺乳动物对象。哺乳动物对象包括人、家畜、农场动物和动物园动物、竞技动物或宠物，如狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、牛、奶牛等。

如本文所使用的，诸如“需要治疗的患者”或“需要治疗的对象”等短语包括受益于施用本公开的用于例如检测、诊断程序和/或治疗的抗体或组合物的对象，例如哺乳动物对象。

本领域普通技术人员还应该理解，可以修饰如本文所公开的修饰的基因组，使得它们在核苷酸序列上与它们所衍生出的修饰的多核苷酸不同。例如，从指定的DNA序列衍生的多核苷酸或核苷酸序列可以是相似的，例如与起始序列具有一定的百分比同一性，例如它可以与起始序列60%、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％相同。

此外，可以进行核苷酸或氨基酸取代、缺失或插入，以在“非必需”区域进行保守取代或改变。例如，衍生自指定蛋白质的多肽或氨基酸序列，除了一个或多个单独的氨基酸取代、插入或缺失(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或更多个单个氨基酸取代、插入或缺失)之外，其余部分可以与起始序列相同。在某些实施方案中，衍生自指定蛋白的多肽或氨基酸序列相对于起始序列具有1至5个、1至10个、1至15个或1至20个单独的氨基酸取代、插入或缺失。

抗体可通过将其偶联至化学发光化合物而被可检测地标记。然后通过检测在化学反应过程中出现的发光的存在来确定化学发光标记的抗原结合多肽的存在。特别有用的化学发光标记化合物的实例是鲁米诺、异鲁米诺、芳香吖啶鎓酯、咪唑、吖啶鎓盐和草酸酯。

经修饰的HSV-1专性载体

一方面，本发明提供了包含修饰的HSV-1基因组的HSV-1病毒，也称为HSV-1专性载体。HSV-1基因组由两个共价连接的组分(称为L和S)组成。每个组分由独特序列组成(L组分为U_L，S组分为U_S)，两侧是反向重复序列。L组分的反向重复序列称为ab和b'a'。S组分的反向重复序列称为a'c'和ca。反向重复区含有双拷贝的转录单元。本领域已知有至少5个具有双拷贝的开放阅读框，其蛋白分别被命名为ICP0、ICP4、ICP34.5、ORF P和ORF O。反向重复序列b'a'和a'c'(b'a'-a'c')结合形成内部反向重复区。相对地，反向重复序列ab和ca在本文中被称为外部重复区。

在本发明的一个实施方式中，所述修饰包含野生型HSV-1基因组的U_L56基因的启动子和U_S1基因的启动子之间的序列缺失。实际上，所缺失的序列包括：

(a) 编码至少5种蛋白(ICP0、ICP4、ICP34.5、ORF-O及ORF-P)的转录单元的单拷贝，保留所有其他开放阅读框；

(b) 整体被包含在b’a’-a’c’序列内的转录单元；

(c) 开始于独特区域但延伸至所缺失的区域的转录单元。

在本文中，以精确的方式进行所述缺失，以确保缺失后病毒DNA中所有存在的开放阅读框(ORF)的表达所需的序列是完整的。在这种情况下，“所有存在的开放阅读框的表达所需的序列”包括ORF本身和表达每个ORF所需的调节序列(例如启动子和增强子)，以确保ORF的表达是成功的，并且所翻译的蛋白质是功能性的。“完整”意味着如此定义的序列至少是功能性的，但并不意味着序列必须与天然存在的序列100％相同。通过在“非必需”区域包含例如保守性取代或变化，该序列可以与天然存在的序列相比具有核苷酸序列的稍微变化。在这种情况下，该序列可以与天然存在的序列具有90％、95％、98％或99％的同一性。

本领域技术人员将会理解，本发明的被缺失的核苷酸的确切起始位置和终止位置取决于HSV-1病毒的菌株和基因组异构体，并且可以容易地通过本领域已知的技术确定。应该理解的是，本公开内容并非意在限于任何特定的基因组异构体或HSV-1病毒的毒株。在一个实施方案中，缺失导致基因组中核苷酸117005至132096的切除。本领域技术人员还将理解，其他菌株也可用于本发明，只要其基因组DNA被测序。测序技术很容易在文献和市场上获得。例如，在另一个实施方案中，可以在HSV-1毒株17上进行缺失，其基因组可以通过GenBank登录号NC_001806.2获得。在另一个实施方案中，可以在KOS 1.1毒株上进行缺失，其基因组可以通过GenBank登录号KT899744获得。在又一个实施方案中，可以在毒株F上进行缺失，其基因组可以通过GenBank登录号GU734771.1获得。

在一些实施方案中，在预定位置处精确地进行缺失，从而将从L组分中的最后一个已知基因(例如U_L56)的启动子开始到S组分中第一个已知基因(如U_S1)的启动子序列结束的一段DNA片段切除。这样，U_L组分中的U_L1到U_L56基因和U_S组分中U_S1到U_S12的所有ORF以及这些ORF表达所需的序列都是完整的。所述精确切除以及缺失之后病毒DNA中所有存在的开放阅读框(ORF)的表达所需的序列的保留具有诸多优点。“保留”是指修饰的载体包含独特序列(U_L和U_S)中的所有基因以及所有双拷贝基因(例如ICP0、ICP4、ICP34.5、ORF P和ORF O的基因)的仅一个拷贝。应当指出，大部分被缺失的序列不编码蛋白质，而是占据在所缺失的区域中的重复的非编码序列(例如，ICP0的内含子、LAT结构域、“a”序列等)。本发明的专性载体也意在包括所述重复的非编码序列的仅一个拷贝。

所有ORF的保留提供了更强健的病毒，无论是在插入外源基因之前或之后，即最大程度上抵抗诸如温度、压力、UV光等的环境因素。它还使得所述溶瘤HSV-1的抗癌范围最大化。

本领域已知的各种基因操作方法可以被用来获得如本公开所述的修饰的HSV-1载体。例如，使用细菌人工染色体(BAC)技术。参见例如Horsburgh BC, Hubinette MM, QiangD, et al. Allele replacement: an application that permits rapid manipulationof herpes simplex virus type 1 genome. Gene Ther, 1999, 6(5):922-30。作为另一个例子，COS质粒可以用于本发明。参见例如van Zijl M., Quint W, Briaire J, et al.Regeneration of herpes viruses from molecularly cloned subgenomic fragments.J Virol, 1988, 62(6):2191-5。

本文描述的构建体的一个关键特性是它充当专性载体。适用于这种构建体的定义是它们不在易感细胞中繁殖，而是在插入病毒或细胞DNA序列之后进行繁殖，因此作为插入到载体序列中的基因的表达的载体。

重组溶瘤HSV-1病毒

可被插入到野生型病毒中的外源DNA序列的量是有限的，因为它干扰了DNA包装成病毒粒子。在指定区域中的精确缺失为外源DNA序列的插入提供了理想的空间。根据本公开的一个实施方案，所述缺失去除了溶瘤病毒载体的至少15 Kbp，使得可以容纳相似量的外源DNA序列。其他研究表明，野生型基因组可再耐受7 KB的DNA。

因此，另一方面，本公开内容提供了重组溶瘤性1型单纯疱疹病毒(HSV-1)，其包含(a)经修饰的HSV-1基因组，其中所述修饰包含在野生型HSV-1基因组的U_L56基因的启动子与U_S1基因的启动子之间的序列缺失，使得(i)所有双拷贝基因的一个拷贝被缺失，并且(ii)用于表达所述缺失后的病毒DNA中存在的所有开放阅读框(ORF)所需的序列是完整的；以及(b)编码免疫刺激剂和/或免疫治疗剂的外源性核酸序列，其中所述外源性核酸序列被稳定地加入到至少是所述经修饰的HSV-1基因组的被缺失的区域。

在一个实施方案中，重组溶瘤性HSV-1包含编码免疫刺激剂的外源性核酸序列。在一些实施方案中，所述免疫刺激剂选自GM-CSF、IL 2、IL 5、IL 12、IL 15、IL 24和IL 27。在一个实施方案中，所述免疫刺激剂是IL 12。在一个实施方案中，所述免疫刺激剂是人IL 12或人源化的IL 12。在一个实施方案中，所述免疫刺激剂是鼠IL 12。在另一个实施方案中，所述免疫刺激剂是IL 15。

在一个实施方案中，重组溶瘤性HSV-1包含编码免疫治疗剂的外源性核酸序列。在一些实施方案中，所述免疫治疗剂选自抗PD-1剂和抗CTLA-4剂。在一个实施方案中，所述免疫治疗剂是抗PD-1剂。在另一个实施方案中，所述免疫治疗剂是抗CTLA-4剂。

当只有一个编码免疫刺激剂或免疫治疗剂的外源性核酸序列被插入时，该外源性核酸序列优选被整合到基因组的被缺失的区域中。在一个实施方案中，该外源性核酸序列具有与被缺失的区域相似的长度。在一个实施方案中，该外源性核酸序列的长度比被缺失的区域的长度长或短20％。在另一个实施方案中，该外源性核酸序列的长度比被缺失的区域长或短15％、10％、5％、4％、3％、2％或1％。

在一个实施方案中，该外源性核酸序列具有小于约18Kbp、约17Kbp或约16Kbp的长度。在一个实施方案中，该外源性核酸序列具有大于约10Kbp、11Kbp、12Kbp、13Kbp或14Kbp的长度。在一个实施方案中，该外源性核酸序列的长度在约14Kbp至约16Kbp之间。在一个实施方案中，该外源性核酸序列具有约15Kbp的长度。

在一些实施方案中，重组溶瘤性HSV-1包含至少两种编码免疫刺激剂和/或免疫治疗剂的外源性核酸序列。在一些实施方案中，重组溶瘤性HSV-1包含编码两种不同免疫刺激剂的外源性核酸序列。例如，在一个实施方案中，重组溶瘤性HSV-1包含编码IL-12和GM-CSF的外源性核酸序列。在另一个实施方案中，重组溶瘤性HSV-1包含编码IL-15和GM-CSF的外源性核酸序列。在另一个实施方案中，重组溶瘤性HSV-1包含编码IL12和IL15的外源性核酸序列。

在一些实施方案中，重组溶瘤性HSV-1包含编码两种不同免疫治疗剂的外源性核酸序列。在一个实施方案中，例如，重组溶瘤性HSV-1包含编码抗PD-1剂和抗CTLA-4剂的外源性核酸序列。

在一些实施方案中，重组溶瘤性HSV-1包含编码三种不同免疫刺激剂和/或免疫治疗剂的外源性核酸序列。例如，在一个实施方案中，重组溶瘤性HSV-1包含编码IL12、抗-CTLA4剂和抗PD-1剂的外源性核酸序列。

当引入多于一种的编码免疫刺激剂和/或免疫治疗剂的外源性核酸序列时，优选将第一外源性核酸序列插入到基因组的缺失区域中。第二个或另外的外源性核酸序列可被插入到基因组的L组分中。在一个实施方案中，将第二外源性核酸序列插入L组分的U_L3和U_L4基因之间。在一个实施方案中，将第二外源性核酸序列插入在L组分的U_L37和U_L38基因之间。

在一个实施方案中，将第一外源性核酸序列插入基因组的缺失区域，并将第二外源性核酸序列插入U_L3和U_L4基因之间。在一个实施方案中，将第一外源性核酸序列插入到基因组的缺失的内部反向重复区中，并将第二外源性核酸序列插入L组分的U_L37和U_L38基因之间。在一个实施方案中，将第一外源性核酸序列插入到基因组的缺失的内部反向重复区中，将第二外源性核酸序列插入U_L3基因和U_L4基因之间，并将第三外源性核酸序列插入到L组分的U_L37基因和U_L38基因之间。

在一个实施方案中，第一外源核酸序列编码IL 12。在一个实施方案中，第二外源核酸序列编码抗-CTLA4剂或抗PD-1剂。在一个实施方案中，第三种外源核酸序列编码抗PD-1剂或抗CTLA4剂。

可以理解的是，将一个或多个外源核酸序列插入到溶瘤HSV-1基因组中并不干扰天然HSV-1基因的表达，并且外源核酸序列被稳定地整合到修饰的HSV-1基因组，使得可以预期外源核酸序列的功能性表达。

编码免疫刺激剂和/或免疫治疗剂的重组基因含有编码蛋白质的核酸以及用于蛋白质表达的调节元件。通常，存在于重组基因中调控元件与待表达的核酸序列可操作地连接，并且基于待用于表达的宿主细胞来选择，可包括转录启动子、核糖体结合位点和终止子。在重组表达载体内，“可操作地连接”旨在表示感兴趣的核苷酸序列以允许核苷酸序列表达(例如在体外转录/翻译系统中表达，或当病毒被引入宿主细胞时在宿主细胞中表达)的方式与调节序列连接。术语“调节序列”旨在包括启动子、增强子和其他表达调控元件(例如聚腺苷酸化信号)。调节序列包括在许多类型的宿主细胞中指导核苷酸序列的组成性表达的那些调节序列，以及仅在某些宿主细胞中指导核苷酸序列表达的调节序列(例如，组织特异性调节序列)。

一种新发现的调节序列是绝缘子(insulator)，其包括在细胞染色体上发现的一类DNA元件，其保护染色体的一个区域中的基因免受另一个区域的调节影响。Amelio等人在LAT区域中发现了含有一簇CTCF基序的1.5-kb区域，该区域具有绝缘子活性，特别是增强子阻断和沉默作用(Amelio et al.. A Chromatin Insulator-Like Element in theHerpes Simplex Virus Type 1 Latency-Associated Transcript RegionBinds CCCTC-Binding Factor and Displays Enhancer-Blocking and Silencing Activities.Journal of Virology, Vol. 80, No. 5, Mar. 2006, p. 2358-2368)。

启动子是指导RNA聚合酶结合DNA并启动RNA合成的DNA序列。一个强大的启动子能够引起mRNA的高频率启动。用于在真核细胞中加工的合适元件是聚腺苷酸化信号。也可能存在抗体相关的内含子。用于抗体或抗体片段生产的表达盒的实例在本领域中是公知的(例如，Persic et al., 1997, Gene 187:9-18; Boel et al., 2000, J Immunol. Methods 239:153-166; Liang et al., 2001, J. Immunol. Methods 247:1 19-130;Tsurushita et al., 2005, Methods 36:69-83.)。

本领域普通技术人员可以基于例如期望的组织特异性和表达水平来选择合适的调节元件。例如，细胞类型特异性或肿瘤特异性启动子可用于将基因产物的表达限制至特定的细胞类型。除了使用组织特异性启动子之外，病毒的局部施用可实现局部的表达和效应。可以使用的非组织特异性启动子的实例包括早期巨细胞病毒(CMV)启动子(美国专利号 4,168,062)和劳氏肉瘤病毒启动子。而且，可以使用HSV启动子，例如HSV-1E启动子。在一些实施方案中，启动子选自下表中的启动子。

启动子	肿瘤或组织靶标
		B-myb	神经胶质瘤肝转移
巢蛋白	神经胶质瘤
		CEA (癌胚抗原)	结肠癌
白蛋白	肝癌
		DF3/MUC1 (Mucin 1)	胰腺癌
Caponin	平滑肌肉瘤

例如，可用于本技术的组织特异性启动子的实例包括前列腺特异性抗原(PSA)启动子，其对前列腺细胞是特异的；肌间线蛋白启动子，其对肌细胞是特异性的；烯醇化酶启动子，其对神经元是特异性的；β球蛋白启动子，其对红系细胞是特异性的；tau-globin启动子，其对红系细胞也是特异性的；生长激素启动子，其对垂体细胞是特异性的；胰岛素启动子，其对胰腺β细胞具有特异性；胶质纤维酸性蛋白启动子，其对星形胶质细胞是特异性的；酪氨酸羟化酶启动子，其对儿茶酚胺能神经元是特异性的；

淀粉样前体蛋白启动子，其对神经元是特异性的；多巴胺β-羟化酶启动子，其对去甲肾上腺素能和肾上腺素能神经元是特异性的；色氨酸羟化酶启动子，对5-羟色胺/松果体细胞具有特异性；胆碱乙酰转移酶启动子，其对胆碱能神经元是特异性的；芳香族L-氨基酸脱羧酶(AADC)启动子，其对儿茶酚胺能/5-HT/D型细胞是特异性的；脑啡肽原启动子，其对神经元/生精附睾细胞是特异性的；reg(胰结石蛋白)启动子，其对结肠和直肠肿瘤以及胰腺和肾细胞是特异性的；和甲状旁腺激素相关肽(PTHrP)启动子，其对肝和盲肠肿瘤以及神经鞘瘤、肾细胞、胰腺细胞和肾上腺细胞是特异性的。

在肿瘤细胞中特异性起作用的启动子的实例包括对乳腺癌细胞特异的基质溶素3启动子；对非小细胞肺癌细胞特异的表面活性蛋白A启动子；表达SLPI的癌特异性的分泌性白细胞蛋白酶抑制剂(SLPI)启动子；对黑素瘤细胞特异的酪氨酸酶启动子；对纤维肉瘤/致瘤细胞特异的应激诱导的grp78/BiP启动子；对脂肪细胞特异的AP2脂肪增强子；对肝细胞特异的α-1抗胰蛋白酶转甲状腺素蛋白启动子；对多形性成胶质细胞瘤特异的白细胞介素-10启动子；对胰腺、乳腺、胃、卵巢和非小细胞肺细胞特异的c-erbB-2启动子；对脑肿瘤细胞是特异性的α-B-晶状体蛋白/热休克蛋白27启动子；对神经胶质瘤和脑膜瘤细胞特异的碱性成纤维细胞生长因子启动子；对鳞状细胞癌、神经胶质瘤和乳腺肿瘤细胞具有特异性的表皮生长因子受体启动子；对乳腺癌细胞具有特异性的粘蛋白样糖蛋白(DF3、MUC1)启动子；对于转移性肿瘤是特异性的mts1启动子；对小细胞肺癌细胞特异的NSE启动子；对小细胞肺癌细胞特异的生长抑素受体启动子；对乳腺癌细胞特异的c-erbB-3和c-erbB-2启动子；对乳腺癌和胃癌特异的c-erbB4启动子；对甲状腺癌细胞特异的甲状腺球蛋白启动子；对肝癌细胞特异的甲胎蛋白(AFP)启动子；对胃癌细胞特异的villin启动子；和对肝癌细胞特异的白蛋白启动子。在另一个实施方案中，使用TERT启动子或存活蛋白(survivin)启动子。

例如，在一些实施方案中，外源核酸序列可操作地连接至启动子，例如CMV启动子或Egr启动子。在一个实施方案中，编码mIL12的核苷酸序列可操作地连接至Egr启动子。在另一个实施方案中，编码scFv-抗-hPD1的核苷酸序列可操作地连接至CMV启动子。

免疫刺激剂或免疫抑制剂

在某些实施方案中，本公开内容的oHSV-1编码一种或多种免疫刺激剂(也称为免疫刺激分子)，包括细胞因子(如IL-2、IL4、IL-12、GM-CSF、IFNγ)、趋化因子(如MIP-1、MCP-1、IL-8)和生长因子(如FLT3配体)。

作为选择或此外，本公开内容的oHSV-1编码一种或多种免疫治疗剂，例如PD-1结合剂(或抗PD-1剂)或CTLA-4结合剂( 或抗-CTLA-4剂)，包括抗体或其片段，例如特异性结合PD-1的抗PD1抗体或特异性结合CTLA-4的抗CTLA-4抗体。抗PD-1抗体可以是拮抗PD-1活性的单链抗体。在其他实施方案中，溶瘤病毒表达拮抗PD-1配体与受体的结合的试剂，例如抗PD-L1抗体和/或PD-L2抗体、PD-L1和/或PD-L2诱饵、或可溶性PD-1受体。

PD-1信号传导途径在肿瘤相关免疫功能障碍中起重要作用。肿瘤细胞的感染和裂解可以引发高度特异性的抗肿瘤免疫应答，其杀死接种肿瘤的细胞以及远处已建立的未接种的肿瘤细胞。肿瘤及其微环境已经形成了逃避、抑制和灭活天然抗肿瘤免疫应答的机制。例如，肿瘤可能下调目标受体，将其自身包裹在纤维性细胞外基质中或上调参与调节性免疫细胞活化或募集的宿主受体或配体。天然和/或适应性T调节细胞(Treg)参与肿瘤介导的免疫抑制。不希望受理论限制，PD-1阻断可抑制Treg活性并改善肿瘤反应性CTL的功效。该技术的其他方面将在下面进一步详细描述。PD-1阻断还可以通过阻断T细胞(CTL和辅助细胞)和B细胞的失活来刺激抗肿瘤免疫应答。

一方面，本技术提供携带编码PD-1结合剂的基因的溶瘤病毒。程序性细胞死亡1(PD-1)是最初通过经历细胞凋亡的小鼠T细胞系的消减杂交鉴定的50-55 kDa I型跨膜受体(Ishida et al., 1992, Embo J. 11:3887-95)。CD28基因家族的成员PD-1在激活的T细胞、B细胞和骨髓谱系细胞上表达(Greenwald et al., 2005, Annu. Rev. Immunol. 23:515-48; Sharpe et al., 2007, Nat. Immunol. 8:239-45)。人和鼠PD-1具有约60％的氨基酸同一性，具有四个潜在的N-糖基化位点和定义Ig-V结构域的残基的保守性。已经鉴定了PD-1的两种配体PD配体1(PD-L1)和配体2(PD-L2)，都属于B7超家族。PD-L1在许多细胞类型上表达，包括T细胞、B细胞、内皮细胞和上皮细胞以及抗原呈递细胞。相反，PD-L2仅在专职抗原呈递细胞(如树突状细胞和巨噬细胞)上表达。

PD-1负调节T细胞活化，并且该抑制功能与其胞质结构域的基于免疫受体酪氨酸的抑制性基序(ITIM)相关(Parry et al., 2005, Mol. Cell. Biol. 25:9543-53)。破坏PD-1的这种抑制功能可以导致自身免疫。相反的情况也可能是有害的。在许多病理情况下，如肿瘤免疫逃逸和慢性病毒感染，PD-1持续的负信号参与了T细胞功能障碍。

宿主抗肿瘤免疫性主要受肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)影响(Galore et al., 2006,Science 313:1960-4)。多条证据表明，TIL受到PD-1的抑制性调节。首先，在许多人和小鼠肿瘤系中证实了PD-L1的表达，并且该表达可以在体外通过IFN-γ进一步上调(Dong et al., 2002, Nat. Med. 8:793-800)。其次，肿瘤细胞表达的PD-L1直接与其体外抗肿瘤T细胞的溶解抗性有关(Blank et al., 2004, Cancer Res. 64:1 140-5)。第三，PD-1敲除小鼠对肿瘤攻击具有抗性(Iwai et al., 2005, Int. Immunol. 17:133-44)，来自PD-1敲除小鼠的T细胞在过继转移至荷瘤小鼠时在肿瘤排斥中高度有效(Blank等人，同上)。第四，通过单克隆抗体阻断PD-1抑制性信号可以增强小鼠中的宿主抗肿瘤免疫性(Iwai et al.,supra; Hirano et al., 2005, Cancer Res. 65:1089-96)。第五，肿瘤中高度的PD-L1表达(通过免疫组织化学染色检测)与许多人癌症类型的不良预后相关(Hamanishi et al. ,2007, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104:3360-5)。

溶瘤病毒疗法是通过扩增肿瘤特异性抗原(溶瘤后释放)特异性的T或B细胞群而形成宿主免疫系统的有效方法。肿瘤特异性抗原的免疫原性很大程度上取决于宿主免疫受体(B细胞受体或T细胞受体)对抗原表位的亲和力和宿主耐受阈值。高亲和力的相互作用将通过多轮增殖和分化驱动宿主免疫细胞变成长效记忆细胞。宿主耐受机制将抵消这种增殖和扩张，以最小化局部免疫激活导致的潜在组织损伤。PD-1抑制信号是这种宿主耐受机制的一部分，这从以下证据中可以得到支持。首先，在活跃增殖的T细胞中PD-1表达升高，特别是具有末端分化表型(效应子表型)的T细胞中。效应细胞通常与有效的细胞毒功能和细胞因子产生有关。其次，PD-L1对于保持外围耐受性和局部地限制过度活跃的T细胞是重要的。因此，使用在肿瘤微环境中表达的PD-1结合剂进行PD-1抑制可以是增加TIL的活性并刺激有效和持久的抗肿瘤免疫应答的有效策略。

细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)是免疫球蛋白(Ig)蛋白超家族的成员。Ig超家族是一组具有Ig分子的可变(V)或恒定(C)结构域的关键结构特征的蛋白质。Ig超家族的成员包括但不限于免疫球蛋白本身、主要组织相容性复合体(MHC)类分子(即I类和II类MHC)和TCR分子。T细胞需要来自抗原呈递细胞(APC)的两种类型的信号用于激活和随后分化为效应器功能。首先，存在由T细胞上的TCR与呈递APC上的肽的MHC分子之间的相互作用产生的抗原特异性信号。其次，存在由CD28与B7家族(B7-1(CD80)或B7-2(CD86))成员相互作用介导的抗原非依赖性信号。CTLA-4融入免疫反应的环境最初正好是回避的(evasive)。小鼠CTLA-4首先被Brunet等作为寻求优先在细胞毒性T淋巴细胞上表达的分子的一部分被鉴定和克隆(Brunet et al. Nature 328:267-270 (1987))。Dariavach等人发现人类CTLA-4并且不久就克隆出来(Dariavach et al. Eur. J. Immunol. 18:1901-1905 (1988))。鼠和人CTLA-4分子具有大约76％的总体序列同源性并且在其胞质结构域中具有接近完全的序列同一性(Dariavach et al. Eur. J. Immunol. 18:1901-1905 (1988))。

研究人员从1993年开始并于1995年达到顶峰描绘了CTLA-4在T细胞刺激中的作用。通过使用抗CTLA-4的单克隆抗体，Walunas等人(Walunas et al. Immunity 1:405-13(1994))首先提供了CTLA-4可以作为T细胞活化的负调节剂的证据。

在癌症方面，Kwon et al. PNAS USA 94:8099-103 (1997)建立了同基因小鼠前列腺癌模型，并检查了旨在通过增强的T细胞共刺激引发抗前列腺癌应答的两种不同操作：(i)通过转导表达B7.1配体的前列腺癌细胞提供直接共刺激和(ii)T细胞CTLA-4的体内抗体介导的阻断，其阻止T细胞下调。已经证明CTLA-4的体内抗体介导的阻断增强了抗前列腺癌免疫应答。此外，Yang et al. Cancer Res 57:4036-41 (1997)研究了CTLA-4功能的阻断是否导致在肿瘤生长的不同阶段增强抗肿瘤T细胞应答。基于体外和体内结果，他们发现荷瘤个体中的CTLA-4阻断增强了产生抗肿瘤T细胞应答的能力，但是这种增强作用的表现在其模型中局限于肿瘤生长的早期阶段。此外，Hurwitz et al. Proc Natl Acad Sci USA95:10067-71 (1998)研究了T细胞介导的抗肿瘤应答的产生依赖于主要组织相容性复合物/抗原的T细胞受体接合以及B7与CD28的连接。某些肿瘤(如SM1乳腺癌)难以通过抗CTLA-4免疫法来治疗。因此，通过使用CTLA-4阻断剂和由表达粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的SM1细胞组成的疫苗的联合疗法，观察到亲本SM1肿瘤的消退，但单独治疗无效。这种联合疗法对SM1具有持久的免疫力，并依赖于CD4(+)和CD8(+) T细胞。这些发现提示CTLA-4阻断在宿主来源的抗原呈递细胞的水平起作用。

抗PD-1剂和抗CTLA-4剂

一方面，本技术提供了包含编码抗PD-1剂和/或抗CTLA-4剂的外源核酸的溶瘤病毒。在一些实施方案中，抗PD-1剂或抗CTLA-4剂含有提供特异性结合PD-1或CTLA-4表位的抗体可变区。抗体可变区可以存在于例如完整抗体、抗体片段和抗体或抗体片段的重组衍生物中。术语“抗体”是指一种免疫球蛋白，可以是天然的、部分合成的或全部合成的。因此，本技术的抗PD-1剂或抗CTLA-4剂包括具有特异性结合至PD-1或CTLA-4表位的结合结构域的任何多肽或蛋白质。

不同种类的抗体具有不同的结构。可以参考IgG来说明不同的抗体区域。IgG分子含有四条多肽链，两条较长的重链和两条通过二硫键相互连接的较短的轻链。重链和轻链各自包含恒定区和可变区。重链由重链可变区(V_H)和重链恒定区(CH1、CH2和CH3)组成。轻链由轻链可变区(V_L)和轻链恒定区(C_L)组成。在可变区内有三个负责抗原特异性的高变区。(参见例如Breitling et al., Recombinant Antibodies, John Wiley & Sons, Inc.and Spektrum Akademischer Verlag, 1999; and Lewin, Genes IV, OxfordUniversity Press and Cell Press, 1990.)

高变区通常被称为互补决定区(“CDR”)，并位于被称为框架区(“FW”)的更保守的侧翼区之间。从NH2末端到COOH末端有四个(4)FW区和三个(3)CDR：FW1，CDR1，FW2，CDR2，FW3，CDR3，FW4。与框架区和CDR相关的氨基酸可以通过Kabat et al., Sequences ofProteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and HumanServices, 1991; C. Chothia and A. M. Lesk, J Mol Biol 196(4):901 (1987); orB. Al-Lazikani, et al., J Mol Biol 273(4): 27, 1997描述的方法来编号和比对。例如，框架区和CDR可以考虑Kabat和Chothia定义来鉴定。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。两个重链羧基区是通过二硫键连接以产生Fc区的恒定区。Fc区对于提供效应器功能是重要的。(Presta, Advanced Drug Delivery Reviews 58:640-656,2006.)。构成Fc区的两条重链中的每一条通过铰链区延伸到不同的Fab区。

抗PD-1剂或抗CTLA-4剂通常含有抗体可变区。这样的抗体片段包括但不限于(i)Fab片段，由V_H、V_L、C_H和C_L结构域组成的单价片段; (ii)Fab₂片段，其包含在铰链区由二硫键连接的两个Fab片段的二价片段; (iii)由V_H和C_H1结构域组成的Fd片段; (iv)由抗体单臂的V_H和V_L结构域组成的Fv片段; (v)dAb片段，其包含V_H或V_L结构域; (vi)scAb，含有V_H和V_L以及C₁或C_H1的抗体片段，以及(vii)基于蛋白质支架的人工抗体，包括但不限于纤连蛋白III型多肽抗体(例如参见美国专利号6,703,199)。此外，虽然Fv片段的两个结构域V_L和V_H由单独的基因编码，但是它们可以使用重组方法通过合成接头连接，使得它们能够制成单一蛋白质链，其中V_L和V_H区域配对形成单价分子，称为单链Fv(scFv)。因此，抗体可变区可以存在于重组衍生物中。重组衍生物的例子包括单链抗体、双抗体、三体抗体、四抗体和微小抗体。抗PD-1剂或抗CTLA-4剂也可以含有一个或多个识别相同或不同表位的可变区。

在一些实施方案中，抗PD-1剂或抗CTLA-4剂由使用重组核酸技术产生的溶瘤病毒编码。可通过不同的技术产生不同的抗PD-1药剂，包括例如包含通过接头序列连接的VH区和VL区的单链蛋白(如scFv)以及其抗体或其片段；和在分开的多肽上含有V_H和V_L区的多链蛋白。重组核酸技术涉及构建用于蛋白质合成的核酸模板。合适的重组核酸技术在本领域中是公知的。(参见例如Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, JohnWiley, 2005; Harlow et al., Antibodies, A Laboratory Manual, Cold SpringHarbor Laboratory, 1988)。编码抗PD-1抗体或抗CTLA-4抗体的重组核酸可以在已被溶瘤病毒感染的细胞中表达，并在病毒裂解后释放到肿瘤微环境中。细胞实际上作为编码蛋白质的工厂。

包含编码抗PD-1或抗CTLA-4剂V_H区或V_L区中任一个或两个的一个或多个重组基因的核酸可用于产生与PD- 1 / CTLA-4结合的完整蛋白质/多肽。例如，使用单个基因来编码包含通过接头连接的V_H区和V_L区的单链蛋白(如scFv)，或使用多个重组区来产生 V_H区和V_L区，从而提供完整的结合剂。

可用于本公开的示例性抗PD-1抗体或抗CTLA-4抗体或其片段或衍生物在本领域中是可得到的。参见例如WO 2006/121168、WO 2014/055648、WO 2008/156712、US 2014/0234296或美国专利号6,984,720。

在本公开内容中重组的oHSV-1精确地在需要它们的肿瘤中递送免疫增强蛋白质(而不是全身性地递送)。此外，通过减少肿瘤中的蛋白质的生产，并且很可能也减少蛋白质的摄取，细胞毒性表现可能大大降低或不存在。

示例性的抗PD-1 scFv和抗CTLA-4 scFv序列

组合物

溶瘤病毒可以在合适的药学上可接受的载体或赋形剂中制备。在通常的储存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物的生长。适于注射使用的药物形式包括无菌水溶液或分散液和用于临时制备无菌注射溶液或分散液的无菌粉末(美国专利号5,466,468)。在所有情况下，制剂必须是无菌的，并且必须是流体以便容易注射。在生产和储存条件下必须稳定，并且必须防止细菌和真菌等微生物的污染。

载体可以是包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物和/或植物油的溶剂或分散介质。例如通过使用诸如卵磷脂的包衣，通过在分散的情况下维持所需的粒度和通过使用表面活性剂来保持适当的流动性。可以通过各种抗菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等来预防微生物的作用。在许多情况下，优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。可以通过在组合物中使用延长吸收的试剂(例如单硬脂酸铝和明胶)来延长可注射组合物的吸收。

对于在水溶液中的肠胃外给药，例如，溶液应适当地缓冲(如果需要的话)，并且首先用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。这些特定的水溶液特别适用于静脉内、肌内、皮下、肿瘤内和腹膜内给药。就此而言，根据本公开内容，可以使用的无菌水性介质将是本领域技术人员已知的。例如，可以将一个剂量溶解在1mL的等渗NaCl溶液中，并且将其添加到1000mL的皮下灌注液中，或者在所建议的输注位置注射(参见例如"Remington'sPharmaceutical Sciences" 15th Edition, pages 1035-1038 and 1570-1580)。根据所治疗的受试者的状况剂量必然会发生一些变化。无论如何，负责给药的人员将确定个体受试者的适当剂量。此外，对于人体给药，制剂应满足FDA生物制品标准所要求的无菌性、无热原性、一般安全性和纯度标准。

通过将活性化合物以需要的量与上面列举的各种其它成分按需要合并在合适的溶剂中，然后过滤灭菌来制备无菌可注射溶液。通常，通过将各种灭菌的活性成分掺入含有基本分散介质和来自上面列举的所需其它成分的无菌载体中来制备分散液。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其从先前无菌过滤的溶液中生产出包含活性成分及任何另外的所需成分的粉末。

本文公开的组合物可以配制成中性或盐形式。药学上可接受的盐包括酸加成盐(与蛋白质的游离氨基形成酸加成盐)，包括与无机酸(如盐酸或磷酸)或有机酸(如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等)形成的盐。与游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱，例如钠、钾、铵、钙或氢氧化铁，以及有机碱如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等。在配制时，溶液将以与剂量配方相容的方式以及治疗上有效的量施用。该制剂易于以各种剂型(如可注射溶液、药物释放胶囊)等给药。

如本文所用，“载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、载体、包衣、稀释剂、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂、缓冲剂、载体溶液、混悬剂、胶体等。用于药物活性物质的样的介质和药剂在本领域是公知的。除了与活性成分不相容的任何常规的介质或试剂之外，预期其他介质或试剂可以用于所述治疗组合物中。补充的活性成分也可以掺入组合物中。

短语“药学上可接受的”是指当施用于人时不产生过敏或类似的不良反应的分子实体和成分。含有蛋白质作为活性成分的水性组合物的制备在本领域中是充分理解的。典型地，这样的组合物被制备成注射剂，无论作为液体溶液或混悬液；也可以制备适于在注射之前溶解或悬浮于液体中的固体形式。

疗法

本公开的另一方面提供了治疗或缓解癌症的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的重组溶瘤HSV-1病毒或包含如上所述的重组溶瘤HSV-1病毒的药物组合物。同样地，本公开提供了如上所述的用于治疗或缓解癌症的方法的溶瘤HSV-1病毒。

在某些实施方案中，所述重组溶瘤HSV-1病毒或药物组合物以瘤内方式施用。在一个实施方案中，将HSV-1病毒或药物组合物以可注射溶液的形式直接注射到肿瘤块。

在一些实施方案中，可将携带编码免疫刺激剂和/或免疫治疗剂的基因的溶瘤病毒与有效治疗癌症的其他药剂组合。例如，癌症的治疗可以用溶瘤病毒和其它抗癌疗法(例如抗癌剂或手术)来实施。在本技术中，预期溶瘤病毒疗法可以与化学治疗剂、放射治疗剂、免疫治疗剂或其他生物学干预联合使用。

“抗癌”剂能够负面地影响受试者中的癌症，例如通过杀死癌细胞、诱导癌细胞凋亡、降低癌细胞生长速率、降低转移发生率或数量、减小肿瘤尺寸、抑制肿瘤生长、减少对肿瘤或癌细胞的血液供应、促进针对癌细胞或肿瘤的免疫应答、预防或抑制癌症进展或增加癌症患者的寿命。抗癌剂包括生物制剂(生物治疗)、化学治疗剂和放射治疗剂。更普遍地，这些其它组合物将以有效杀死或抑制细胞增殖的组合量提供。该过程可能涉及使细胞与表达构建体和试剂或多种因子同时接触。这可以通过使细胞与包含两种药剂的单一组合物或药理学制剂接触，或通过使细胞与两种不同的组合物或制剂同时接触来实现，其中一种组合物包含表达构建体，而另一种包含第二种试剂。

在一些实施方案中，将携带编码免疫刺激剂和/或免疫治疗剂的基因的溶瘤病毒与佐剂组合。在一个实施方案中，佐剂是包含未甲基化的CpG基序的寡核苷酸。细菌脱氧核糖核酸(DNA)中的未甲基化二核苷酸CpG基序具有刺激几种免疫细胞分泌细胞因子以增强先天免疫和适应性免疫的优点。

可以在其他药物治疗之前或之后几分钟到几周的时间间隔内进行病毒疗法。在将其他药剂和溶瘤病毒分别施用于细胞的实施方案中，通常将确保在每次递送时间之间不间隔相当长的一段时间，以使得药剂和病毒仍然能够有利地施加对细胞的联合作用。在这样的情况下，预期可以在彼此间隔约12-24小时之内使细胞与两种疗法接触。但是，在某些情况下，当各施用间隔了几天(2、3、4、5、6或7天)到几周(1、2、3、4、5、6、7或8周)的时间时，可能需要显著延长治疗的时间。

表达免疫刺激基因或免疫治疗基因的oHSV的构建

经修饰的oHSV-1专性载体(IMMV201)的构建

在通过细菌人工染色体(BAC)技术产生专性载体-IMMV201中，将产生3个终止密码子的CMV启动子盒ATGCAGGTGCAGTAATAGTAA的盒插入到T-Easy载体中。使用原型(P)排列的HSV-1。分别通过两组引物(GAAGATCTAATATTTTTATTGCAACTCCCTG，CTAGCTAGCTTATAAAAGGCGCGTCCCGTGG)和(GCTCTAGATTGCGACGCCCCGGCTC，CCTTAATTAAGGTTACCACCCTGTAGCCCCGATGT)从HSV-1病毒基因组PCR扩增下述基因盒：上游侧接核苷酸117005，下游连接核苷酸132096，并插入到含有上述CMV和3个终止密码子的质粒中，然后将该基因置换质粒构建到pKO5中，产生pKO-CMV-STOP。通过将pKO-CMV-STOP电穿孔到携带BAC HSV的大肠杆菌RecA +中来获得IMMV201。

BAC-IMMV201无法在哺乳动物细胞中繁殖病毒

使用OptiMEM agency(Life Technologies, Inc.)按照其说明将如上构建的2-3μg的BAC-IMMV201转染至具有70％融合的Vero细胞中。在37℃，5％CO₂培养箱中孵育4小时。温育后，用4ml新鲜完全生长培养基(5％新生小牛血清/ DMEM)代替。3-4天内没有出现病毒斑块。实验重复三次，没有出现病毒斑块。

构建表达单个免疫刺激或免疫治疗基因的oHSV-1(IMMV202,203,303,403)

驱动免疫刺激基因(鼠IL12、人IL12)或免疫治疗基因(人PD-1 scFV(SEQ ID No.1或3)、人CTLA-4 scFV(SEQ ID No.5)的 CMV启动子基因盒通过将pKO基因盒电穿孔到携带IMMV201的大肠杆菌RecA +中而获得(如图1所示)。

构建表达两种免疫刺激基因或免疫治疗基因的oHSV-1(IMMV502,503,504,505, 507)

将驱动免疫刺激基因(IL12)和免疫治疗基因(PD-1 scFV，CTLA-4 scFV)的CMV启动子盒进一步插入到IMMV202,203,303,403载体中的UL3和UL4基因之间以产生表达免疫刺激基因(IL12)和免疫治疗基因的组合的重组oHSV(图2所示)。

构建表达一种免疫刺激基因和两种免疫治疗基因的oHSV-1(IMMV603)

通过在IMMV503载体(图2中所示)的UL37和UL38基因之间插入CTLA-4 scFV，构建了表达编码人IL12、PD-1 scFV和CTLA-4 scFV的全部三种免疫刺激cDNA和免疫治疗cDNA的IMMV603。

体外试验

PD-1 scFV的表达

在本文描述的一系列实验中，用模拟物或质粒转染的2×10⁶个H293T细胞含有编码由CMV启动子驱动的带有His标记的scFV-抗-PD-1的cDNA以及来自各种天然来源的信号肽编码区。转染后46小时收集细胞裂解物和上清液，然后进行SDS-PAGE并通过抗His抗体进行免疫印迹。将2mL上清液中的40μL，200μL细胞裂解物中的30μL加载到12％的PAGE凝胶上。在细胞培养上清液中累积的PD-1 scFV的量(图3)反映了不同信号肽的效率。

PD-1 scFV与PD-1的结合亲和力

用模拟物或质粒转染的2×10⁶个H293T细胞含有编码由CMV启动子驱动的His-标记的scFV-抗PD-1的cDNA以及HMM38信号肽。转染后46小时收集上清液，然后进行ELISA测定，用抗His抗体检测(图4)。分泌的PD-1 scFV以剂量依赖性方式与PD-1结合。

生长试验的体外细胞活力

使用模拟物(阴性对照)或IMMV507(表达PD-1抗体和CTLA-4抗体的oHSV-1)分别以每个细胞0.01、0.1、1、10、100倍PFU感染接种在96孔板中的5x10³个下列人类肿瘤细胞。通过使用CCK-8试剂盒测量细胞生长力，每24小时测量一次，直至96小时(图5)。通过酶标仪(BiotekEpoch)在450nm处测定吸光度。

这些研究中的肿瘤细胞系：T24，人膀胱癌；ECA109，人食管癌；CNE1，人鼻咽癌；HCT116，人结肠癌；Hep2，人喉癌；MD-MB-231，人乳腺癌；Hela，人类上皮腺癌；A549，人肺癌上皮细胞；H460，人类非小细胞肺癌细胞。

IMMV507以剂量依赖性方式杀死肿瘤细胞。与oHSV-1病毒接触后，肿瘤细胞随时间减少。

本领域技术人员将容易意识到，本发明非常适合于获得所提及以及本文固有的目的和优点。本文中作为目前代表性的优选实施方式描述的方法、变化形式和组合物仅是示例性的，并非对本发明的范围的限制。对本领域技术人员来说，可发生改变和其他用途，但这也被包括在本发明的由权利要求的范围界定的本发明的实质精神内。

本文示例性地描述的发明可适当地在不存在未在本文具体公开的任何一个或多个元素、一个或多个限制条件的情况下实施。所使用的术语和表达方式被用作描述而非限制，并非有意图在使用这些术语和表达方式时将所显示或描述的特征或其一部分的任何等同物排除在外，而要认识到，各种修改都可能在本发明的范围内。因此，要理解的是，虽然本发明已通过优选实施方式和任选的特征被具体公开，但本领域技术人员仍可对本文公开的概念作出修改和变化，而且这些修改和变化被认为在由所附权利要求界定的本发明的范围内。

此外，当本发明的特征或方面以马库什群组或其他替代性群组的形式描述时，本领域技术人员将意识到，本发明也以该马库什群组或其他群组的任何单个成员或子群组成员的形式被描述。

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序列表

<110> 深圳市亦诺微医药科技有限公司

<120> I型单纯疱疹病毒载体及重组溶瘤性I型单纯疱疹病毒

<130> 181017CN2

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 798

<212> DNA

<213> Mouse

<400> 1

atgggatggt catgtatcat cctttttcta gtagcaactg caaccggcgc gcactccgag 60

gtgcagctgg tgcagtctgg gggaggcgtg gttcagcctg ggaggtccct gagactctcc 120

tgtgcagcgt ctggattcac ctttagtagc tattggatga gctgggtccg ccaggctcca 180

gggaaggggc tggagtgggt ctcagctatt agtggtagtg gtggtagcac atactacgca 240

gactccgtga agggccggtt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac gctgtatctg 300

caaatgaaca gcctaagagc cgaggacacg gccgtatatt actgtgcgaa agagaactgg 360

ggatcgtact tcgatctctg ggggcaaggg accacggtca ccgtctcctc aggtggcgga 420

gggtcaggtg gcggagggtc aggtggcgga gggtcaggcg tgcactccga catcgtgatg 480

acccagtctc cttccaccct gtctgcatct gtaggagaca gagtcaccat cacttgccgg 540

gccagtcagg gtattagtag ctggttggcc tggtatcagc agaaaccagg gagagcccct 600

aaggtcttga tctataaggc atctacttta gaaagtgggg tcccatcaag gttcagcggc 660

agtggatctg ggacagattt cactctcacc atcagcagtc tgcaacctga agattttgca 720

acttactact gtcaacagag ttacagtacc ccgtggacgt tcggccaggg gaccaagctg 780

gaaatcaaga gatgataa 798

<210> 2

<211> 264

<212> PRT

<213> Mouse

<400> 2

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly

1 5 10 15

Ala His Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln

20 25 30

Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe

35 40 45

Ser Ser Tyr Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala

65 70 75 80

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn

85 90 95

Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Lys Glu Asn Trp Gly Ser Tyr Phe Asp Leu Trp Gly

115 120 125

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

130 135 140

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Val His Ser Asp Ile Val Met

145 150 155 160

Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr

165 170 175

Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala Trp Tyr

180 185 190

Gln Gln Lys Pro Gly Arg Ala Pro Lys Val Leu Ile Tyr Lys Ala Ser

195 200 205

Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

210 215 220

Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala

225 230 235 240

Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gln

245 250 255

Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

260

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CMV启动子盒

<400> 3

atgcaggtgc agtaatagta a 21

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 4

gaagatctaa tatttttatt gcaactccct g 31

<210> 5

<211> 783

<212> DNA

<213> Mouse

<400> 5

atgggatggt catgtatcat cctttttcta gtagcaactg caacccagat ccagcttcag 60

gagtcaggac ctggcctggt gaacccctca caatcactgt ccctctcttg ctctgtcact 120

ggttactcca tcaccagtgg ttatggatgg aactggatca ggcagttccc agggcagaag 180

gtggagtgga tgggattcat atattatgag ggtagcacct actacaaccc ttccatcaag 240

agccgcatct ccatcaccag agacacatcg aagaaccagt tcttcctgca ggtgaattct 300

gtgaccactg aggacacagc cacatattac tgtgcgagac aaactgggta ctttgattac 360

tggggccaag gaaccatggt caccgtctcc tcaggtggtg gtggatcagg tggaggcgga 420

agtggaggtg gcggttccga catcatgatg acccagtctc cttcatccct gagtgtgtca 480

gcgggagaga aagccactat cagctgcaag tccagtcaga gtcttttcaa cagtaacgcc 540

aaaacgaact acttgaactg gtatttgcag aaaccagggc agtctcctaa actgctgatc 600

tattatgcat ccactaggca tactggggtc cctgatcgct tcagaggcag tggatctggg 660

acggatttca ctctcaccat cagcagtgtc caggatgaag acctggcatt ttattactgt 720

cagcagtggt atgactaccc atacacgttc ggagctggga ccaaggtgga aatcaaatga 780

taa 783

<210> 6

<211> 259

<212> PRT

<213> Mouse

<400> 6

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gln

1 5 10 15

Ile Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Asn Pro Ser Gln Ser

20 25 30

Leu Ser Leu Ser Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly Tyr

35 40 45

Gly Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Gln Lys Val Glu Trp Met

50 55 60

Gly Phe Ile Tyr Tyr Glu Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Ile Lys

65 70 75 80

Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe Leu

85 90 95

Gln Val Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala

100 105 110

Arg Gln Thr Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr

115 120 125

Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

130 135 140

Gly Ser Asp Ile Met Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Val Ser

145 150 155 160

Ala Gly Glu Lys Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe

165 170 175

Asn Ser Asn Ala Lys Thr Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro

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Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Asp Glu Asp Leu Ala Phe Tyr Tyr Cys

225 230 235 240

Gln Gln Trp Tyr Asp Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val

245 250 255

Glu Ile Lys

<210> 7

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 7

ctagctagct tataaaaggc gcgtcccgtg g 31

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 8

gctctagatt gcgacgcccc ggctc 25

<210> 9

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物

<400> 9

ccttaattaa ggttaccacc ctgtagcccc gatgt 35

Claims

1.一种I型单纯疱疹病毒（HSV-1）载体，其包含经修饰的HSV-1基因组，其中所述修饰包含缺失，所述载体包含：

(a) 所有双拷贝基因中的每一个的仅一份拷贝，

(b) 用于表达HSV-1基因组中所有单拷贝开放阅读框(ORF)所需的序列，以及

(c) 编码非编码RNA的重复DNA的仅一份拷贝，

其中，用于表达HSV-1基因组中所有单拷贝开放阅读框(ORF)所需的序列是完整的，并且包括开放阅读框本身以及表达每个开放阅读框所需的调节序列，并且所述调节序列包括启动子。

2.根据权利要求1所述的HSV-1载体，其中所述双拷贝基因包含编码ICP0、ICP4、ICP34.5、ORF P和ORF O的基因。

3.根据权利要求1所述的HSV-1载体，其中所述HSV-1具有原型(P)基因组异构体。

4.根据权利要求1所述的HSV-1载体，其中所述HSV-1选自F毒株、KOS毒株和17毒株中的一种。

5.根据权利要求4所述的HSV-1载体，其中所述缺失导致F毒株基因组中的核苷酸117005至132096位置的切除。

6.根据权利要求1所述的HSV-1载体，其中所述修饰包括缺失从野生型HSV-1的I_L异构体基因组的UL组分的最后一个基因的启动子至US组分的第一个基因的启动子之间的序列。

7.根据权利要求6所述的HSV-1载体，其中I_L异构体基因组的UL组分的最后一个基因是UL1，并且I_L异构体基因组的US组分的第一个基因是US1。

8.根据权利要求1所述的HSV-1载体，其中所述载体不在易感细胞中繁殖。

9.根据权利要求1所述的HSV-1载体，其中所述载体仅在插入了病毒DNA或细胞DNA序列之后才在易感细胞中繁殖。

10.根据权利要求1所述的HSV-1载体，其中所述编码非编码RNA的重复DNA包括ICP0的内含子、LAT结构域和“a”序列。

11.一种重组溶瘤性I型单纯疱疹病毒(HSV-1)，其包含

(a) 权利要求1至10的任一项所述的I型单纯疱疹病毒（HSV-1）载体；以及

(b) 编码免疫刺激剂和/或免疫治疗剂的外源性核酸序列，其中所述外源性核酸序列被稳定地加入到至少是所述HSV-1载体的被缺失的区域，并且不干扰天然HSV-1基因的表达。

12.根据权利要求11所述的重组溶瘤性HSV-1，其中所述免疫刺激剂选自GM-CSF、IL 2、IL 12、IL 15、IL 24和IL 27。

13.根据权利要求11所述的重组溶瘤性HSV-1，其中所述免疫治疗剂是抗PD-1剂和/或抗CTLA-4剂。

14.根据权利要求11所述的重组溶瘤性HSV-1，其中重组溶瘤性HSV-1包含编码IL-12、抗PD-1剂和/或抗CTLA-4剂的外源性核酸序列。

15.根据权利要求11所述的重组溶瘤性HSV-1，其中所述重组溶瘤性HSV-1包含编码IL-12的第一外源核酸序列和编码抗PD-1剂或抗CTLA-4剂的第二外源核酸序列。

16.根据权利要求11所述的重组溶瘤性HSV-1，其中所述重组溶瘤性HSV-1包含编码抗PD-1剂的第一外源核酸序列和编码抗CTLA-4剂的第二外源核酸序列。

17.根据权利要求11所述的重组溶瘤性HSV-1，其中所述重组溶瘤性HSV-1包含编码IL-12的第一外源核酸序列、编码抗PD-1剂的第二外源核酸序列和编码抗CTLA-4剂的第三外源核酸序列。

18.根据权利要求11所述的重组溶瘤性HSV-1，其中所述重组溶瘤性HSV-1进一步包含可操作地连接至所述外源核酸序列的启动子序列。

19.根据权利要求15或16所述的重组溶瘤性HSV-1，其中所述第一外源核酸序列被插入在所述经修饰的HSV-1基因组的所缺失的区域，并且所述第二外源核酸序列被插入在所述经修饰的HSV-1基因组的UL组分的UL3和UL4基因之间。

20.根据权利要求17所述的重组溶瘤性HSV-1，其中所述第一外源核酸序列被插入在所述经修饰的HSV-1基因组的所缺失的区域，所述第二外源核酸序列被插入在所述经修饰的HSV-1基因组的UL组分的UL3和UL4基因之间，并且第三外源核酸序列被插入在所述经修饰的HSV-1基因组的UL组分的UL37和UL38基因之间。

21.根据权利要求17所述的重组溶瘤性HSV-1，其中所述第一外源核酸序列被插入在所述经修饰的HSV-1基因组的所缺失的区域，所述第二外源核酸序列被插入在所述经修饰的HSV-1基因组的UL组分的UL37和UL38基因之间，并且第三外源核酸序列被插入在所述经修饰的HSV-1基因组的UL组分的UL3和UL4基因之间。

22.根据权利要求18所述的重组溶瘤性HSV-1，其中所述启动子序列是CMV启动子或Egr启动子。

23.根据权利要求11所述的重组溶瘤性HSV-1，其中所述免疫刺激剂和/或免疫治疗剂是人源化的。

24.根据权利要求13所述的重组溶瘤性HSV-1，其中抗PD-1剂或抗CTLA-4剂分别包含提供对PD-1或CTLA-4表位的特异性结合的抗体可变区。

25.根据权利要求13所述的重组溶瘤性HSV-1，其中所述抗PD-1剂或抗CTLA-4剂是完整抗体、抗体片段、或所述抗体或抗体片段的重组衍生物。

26.一种药物组合物，其包含有效量的权利要求11至25的任一项所述的重组溶瘤性HSV-1以及药学上可接受的载体。

27.根据权利要求26所述的药物组合物，其中所述组合物被配制用于瘤内施用。