CN111936633A - 微生物分离和检测 - Google Patents
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Abstract
用于将含有非微生物细胞的样品中的微生物与非微生物细胞分离的方法包括将所述样品用颗粒孵育以形成颗粒‑微生物复合物，然后将所述颗粒‑微生物复合物与所述非微生物细胞分离。这些方法用于检测也包含非微生物细胞的样品中是否存在微生物。特定的试剂和试剂组合增强混合样品中的微生物的选择性捕获。还提供了对应的组合物和试剂盒。
Description
发明领域
本发明通常涉及在样品中将微生物与非微生物细胞分离的领域和检测样品中是否存在微生物的方法。该方法通常依赖于测量样品中存在的微生物酶活性(如果有)，其中样品还包含酶活性的非微生物来源。本发明依赖于有效隔离酶活性的微生物来源。因此，本发明的方法能够确定样品，例如未纯化的血液、血液培养物和其他体液中是否存在微生物病原体。本发明还涉及包含用于实施所述方法的试剂的试剂盒。
发明背景
在许多情况下，测量与细胞活力相关的某些分子的存在和水平很重要。例如，测量ATP水平在哺乳动物细胞中可用于生长分析和毒理学目的。培养方法可用于检测少量细菌，但这种技术需要几天才能完成，尤其是在尝试检测少量细菌以及检测生长较慢的微生物的时候。
还提出了作为活力指标来检测腺苷酸激酶(Squirrell DJ,Murphy MJ,LeslieRL,Green JCD:A comparison of ATP and adenylate kinase as bacterial cellmarkers:correlation with agar plate counts(作为细菌细胞标记的ATP和腺苷酸激酶的比较：与琼脂板计数的相关性))。WO 96/002665描述了一种确定样品中的微生物和/或其细胞内物质的存在和/或数量的方法，其特征在于通过以下过程评估样品中的腺苷酸激酶的量：将样品中的腺苷酸激酶与二磷酸腺苷(ADP)混合，确定通过来自该ADP的样品产生的三磷酸腺苷(ATP)的量，和将如此产生的ATP的量与腺苷酸激酶的存在/或量以及与微生物和/或其细胞内物质相关联，其中ADP转化为ATP在镁离子的存在下在足以使ADP最大程度地转化为ATP的摩尔浓度下进行。
在WO2009/007719中，NAD依赖性连接酶被描述为样品中的微生物存在的有用指标。连接酶是催化核酸分子连接的酶。根据相关的连接酶，连接反应需要ATP或NAD+作为辅助因子。
WO2011/130584描述了一种基于DNA或RNA聚合酶检测的活微生物检测方法，其中将样品与充当微生物聚合酶底物的核酸底物接触，在适合于来自完整微生物的聚合酶活性的条件下孵育且使用核酸扩增技术例如定量聚合酶链反应，确定任何所得的核酸产物。这样的测定法被称为“ETGA测定法”，其中ETGA代表酶促模板产生和扩增。对于粗样品中的活微生物，ETGA测定法的问题是在微生物外部存在污染聚合酶活性，所述微生物来自宿主(例如人)细胞和死微生物。ETGA测定法无法将微生物聚合酶活性与宿主或死微生物活性区分开。
WO2010/119270描述了一种除去完整微生物外部的DNA连接酶活性的方法。
WO2011/070507描述了使用非离子去污剂和缓冲液选择性裂解动物细胞。
WO/2017/182775描述了一种检测还可以包含非微生物细胞的样品中是否存在微生物的方法，所述方法包括将非微生物细胞选择性裂解，过滤裂解物和检测保持在过滤器内或上的微生物是否存在。
还已知使用包覆有特异性结合部分如抗体的磁珠。这些产物的特异性是由抗体或其他结合配体的特异性定义的，抗体或其他结合配体通常是出于具有高度特异性以允许分离特定微生物的特定目的而选择的。
WO03/102184描述了使用絮凝剂例如多胺或阳离子去污剂浓缩或分离细胞(例如细菌)以与细胞形成复合物从而使其聚集的方法、组合物和试剂盒。聚集细胞的分离可以用能够结合细胞的固相如磁珠来实现。
WO01/53525描述了一种从样品中分离细胞(例如微生物)的方法，该方法包括通过固定在固相支持物上的碳水化合物配体将细胞与固相支持物结合。用于进行此方法的试剂盒由DiaSorin Molecular出售(“Bugs’n BeadsTM”试剂盒)。
其他分离微生物的试剂盒包括ApoH-Technologies Peps6磁珠。珠被合成分子Peps6包覆，该分子由载脂蛋白H蛋白(ApoH)，也称为β-2糖蛋白衍生。
发明内容
本发明人已经认识到，在取自怀疑携带微生物感染的受试者的样品中，有比以前所想象的更多水平的有核血细胞(白细胞)，尽管大多数样品实际上并非来自受感染的受试者。这导致需要从取自针对感染而筛查的患者的血液样品中的血细胞，尤其是白细胞分离潜在的微生物的改进的方法。本发明涉及通过选择性捕获具有形成颗粒-微生物复合物的颗粒(例如磁性颗粒)的微生物和将颗粒-微生物复合物与非微生物细胞分离(例如使用磁场)在样品中将微生物与非微生物细胞分离。这提供了解决上述问题的方法，从而能够检测样品中是否存在微生物。发明人惊奇地发现，可以用未用配体包覆的颗粒(例如磁性颗粒)来实现这种分离。发明人发现，某些试剂在确保微生物与非微生物细胞，特别是在复杂样品如血液、乳和尿液中的良好分离的方法中特别有用。
本发明提供了将含有非微生物细胞的样品中的微生物与非微生物细胞分离的方法，该方法包括：a)将样品用具有外表面的颗粒孵育以形成颗粒-微生物复合物；以及b)将所述颗粒-微生物复合物与所述非微生物细胞分离。
本发明提供了将含有非微生物细胞的样品中的微生物与非微生物细胞分离的方法，该方法包括：a)将所述样品用颗粒孵育以形成颗粒-微生物复合物，其中所述颗粒具有外聚合物表面；以及b)将所述颗粒-微生物复合物与所述非微生物细胞分离。
本发明提供了将含有非微生物细胞的样品中的微生物与非微生物细胞分离的方法，该方法包括：a)将所述样品用颗粒孵育以形成颗粒-微生物复合物，其中所述孵育步骤在聚茴香脑磺酸钠和/或选择性裂解所述样品中的非微生物细胞，同时保持样品中存在的微生物完整的试剂的存在下进行；以及b)将所述颗粒-微生物复合物与所述非微生物细胞分离。
本发明提供了将含有非微生物细胞的样品中的微生物与非微生物细胞分离的方法，该方法包括：a)将所述样品用颗粒孵育以形成颗粒-微生物复合物，其中所述孵育步骤在聚茴香脑磺酸钠和/或去污剂的存在下进行；以及b)将所述颗粒-微生物复合物与所述非微生物细胞分离。
本发明提供了将含有非微生物细胞的样品中的微生物与非微生物细胞分离的方法，该方法包括：a)将所述样品用颗粒孵育以形成颗粒-微生物复合物；以及b)将所述颗粒-微生物复合物与所述非微生物细胞分离；其中所述颗粒具有未被以下中的任何一者包覆的外表面：(i)抗体，(ii)碳水化合物，(iii)由载脂蛋白H蛋白衍生的肽，(iv)甘露糖结合凝集素蛋白。
在该方法中，孵育步骤可以在聚茴香脑磺酸钠和/或选择性裂解样品中的非微生物细胞，同时保持样品中存在的微生物完整的试剂的存在下进行。
在该方法中，孵育步骤可以在聚茴香脑磺酸钠和/或去污剂的存在下进行。去污剂是选择性裂解样品中的非微生物细胞，同时保持样品中存在的微生物完整的试剂的实例。
在该方法中，该方法可以还包括洗涤分离的颗粒-微生物复合物以除去非微生物细胞或裂解物；任选地其中分离的颗粒-微生物复合物用包含去污剂和/或氯化钠的溶液洗涤。
选择性裂解样品中的非微生物细胞，同时保持样品中存在的微生物完整的试剂可以包含去污剂和一种或多种酶的组合。一种或多种酶可包含蛋白酶和/或DNA酶。本文讨论了合适的去污剂和酶。
在该方法中，步骤b)可以通过任何合适的分离方式进行。例如，可以使用磁场吸引颗粒-微生物复合物或离心来实现分离。
在该方法中，步骤b)可以还包括从颗粒-微生物复合物中除去非微生物细胞。
在该方法中，步骤a)之前可以选择性裂解样品中的非微生物细胞，同时保持样品中存在的微生物完整。
在该方法中，选择性裂解样品中的非微生物细胞，同时保持样品中存在的任何微生物完整可以包括冷冻和解冻样品。
在该方法中，选择性裂解样品中的非微生物细胞，同时保持样品中存在的任何微生物完整可以包括加入去污剂。
在该方法中，步骤a)可以在缓冲液存在下进行。缓冲液可以具有在7.4至8.5之间的pH。
在该方法中，步骤a)可以在氯化钠存在下进行。氯化钠可以在50至500mM之间的浓度下存在。优选地，氯化钠可以在约150mM的浓度下存在。
在该方法中，选择性裂解样品中的非微生物细胞，同时保持样品中存在的微生物完整的试剂可以是去污剂。在该方法中，去污剂可以是非离子的。在该方法中，去污剂可以不与能够与微生物形成复合物的颗粒缀合。因此，通常去污剂形成其中加入颗粒的溶液的一部分，而不形成颗粒本身的一部分。
在该方法中，颗粒可以具有在0.1和3μm之间或在0.1和2μm之间的直径。优选地，颗粒具有在0.1至1.0μm之间的直径。
在该方法中，颗粒可以是(且通常是)磁性的。颗粒可以是超顺磁性的。颗粒可包含氧化铁。氧化铁可包括磁体矿和/或磁赤铁矿。氧化铁可以不包含1:1、2:1、3:1或4:1比率的Fe2+和Fe3+。
能够与微生物形成复合物的颗粒的外表面可以包含聚合物；任选地，该聚合物可以是基于碳的。该聚合物可以不包含无机聚合物。该聚合物可以包含聚苯乙烯和/或聚(苯乙烯/二乙烯基苯)。
在该方法中，能够与微生物形成复合物的颗粒的外表面可以包含或包覆有以下中的任何一者或多种：i)羧酸基团；ii)氨基；iii)疏水基团；以及iv)链霉亲和素；任选地，羧酸基团；ii)氨基；iii)疏水基团可能不是多肽的一部分。
在该方法中，微生物可以是病原微生物。例如，病原微生物可以是病原细菌或真菌。
在该方法中，非微生物细胞可以包括红血细胞和/或白血细胞。
在该方法中，样品可包含浓度为每毫升20,000至5百万个细胞的非微生物细胞。样品可包含浓度为每毫升至少约100,000个细胞的非微生物细胞。优选地，样品可包含浓度为每毫升至少约20,000个细胞的非微生物细胞。
样品是一种含有或怀疑含有微生物的样品。样品包含非微生物细胞，当旨在检测是否在样品中存在微生物并潜在地鉴定和/或定量样品中存在的微生物时，这些微生物可以提供不需要的背景。因此，在一些实施方式中，样品可以包含血液、尿液、唾液或乳。血液样品可以是任何含有血细胞的样品。血液样品可以是全血或可以包含全血(例如血培养液(blood broth))。
本发明提供了将含有非微生物细胞的样品中的微生物与非微生物细胞分离的方法，该方法包括：(a)将样品用颗粒(例如磁性颗粒)孵育以形成颗粒-微生物复合物；以及(b)将所述颗粒-微生物复合物与所述非微生物细胞分离(例如使用磁场)。
在该方法中，颗粒(例如磁性颗粒)可具有未用以下中的任何一者包覆的外聚合物表面：(i)抗体，(ii)碳水化合物，(iii)由载脂蛋白H蛋白衍生的肽，(iv)甘露糖结合凝集素，(v)多胺或(vi)阳离子去污剂。
在该方法中，颗粒(例如磁性颗粒)可以具有未用以下中的任何一者包覆的外表面(例如外聚合物表面)：(i)抗体，(ii)碳水化合物或(iii)先天免疫系统蛋白。
在该方法中，颗粒(例如磁性颗粒)可以具有未用以下中的任何一者包覆的外表面(例如外聚合物表面)：(i)抗体，(ii)碳水化合物，(iii)由载脂蛋白H衍生的肽蛋白，(iv)甘露糖结合凝集素，或(v)絮凝剂(例如WO 03/102184中定义的絮凝剂)。
在该方法中，颗粒(例如磁性颗粒)可以具有未用以下中的任何一者包覆的外表面(例如外聚合物表面)：(i)抗体，(ii)碳水化合物，(iii)先天免疫系统蛋白或(iv)絮凝剂(例如WO 03/102184中定义的絮凝剂)。
在该方法中，颗粒(例如磁性颗粒)可以具有未用配体包覆的外表面(例如外聚合物表面)。
在该方法中，颗粒(例如磁性颗粒)可以具有用链霉亲和素包覆而未用配体包覆的外表面(例如外聚合物表面)。
在该方法中，颗粒(例如磁性颗粒)可具有仅用链霉亲和素包覆的外表面(例如外聚合物表面)。
在该方法中，颗粒(例如磁性颗粒)可以具有仅用羧基包覆的外表面(例如外聚合物)表面。
在该方法中，颗粒(例如磁性颗粒)可以具有未用能够结合微生物的任何分子或部分包覆的外表面(例如外聚合物表面)。
在该方法中，颗粒(例如磁性颗粒)可以具有未用任何分子或部分包覆的外表面(例如外聚合物表面)。
“包覆”是指附接到外表面(例如外聚合物表面)。技术人员将知道用于将分子和化学基团附接到颗粒(例如磁性颗粒)的外表面(例如外聚合物表面)的手段。
本发明的分离方法可用于检测是否在还含有非微生物细胞的样品中发现微生物。一旦将微生物从潜在的背景信号源中分离，便可以使用多种技术对它们进行特异性和灵敏的检测。因此，本发明还提供了一种检测样品中是否存在微生物的方法，该样品还可以包含非微生物细胞，该方法包括：a)将所述样品用颗粒孵育以形成颗粒-微生物复合物；b)将所述颗粒-微生物复合物与所述非微生物细胞分离；以及c)检测所述颗粒-微生物复合物中是否存在微生物。
本发明还提供了一种检测样品中是否存在微生物的方法，该样品还可以包含非微生物细胞，该方法包括：a)将所述样品用颗粒孵育以形成颗粒-微生物复合物，其中所述颗粒具有外聚合物表面；b)将所述颗粒-微生物复合物与所述非微生物细胞分离；以及c)检测所述颗粒-微生物复合物中是否存在微生物。
相关地，本发明提供了一种检测样品中是否存在微生物的方法，该样品还可以包含非微生物细胞，该方法包括：a)将所述样品用颗粒孵育以形成颗粒-微生物复合物，其中所述孵育步骤在聚茴香脑磺酸钠和/或选择性裂解所述样品中的非微生物细胞，同时保持样品中存在的微生物完整的试剂的存在下进行；b)将所述颗粒-微生物复合物与所述非微生物细胞分离；以及c)检测所述颗粒-微生物复合物中是否存在微生物。
类似地，本发明提供了一种检测样品中是否存在微生物的方法，该样品还可以包含非微生物细胞，该方法包括：a)将所述样品用颗粒孵育以形成颗粒-微生物复合物，其中所述孵育步骤在聚茴香脑磺酸钠和/或去污剂的存在下进行；b)将所述颗粒-微生物复合物与所述非微生物细胞分离；以及c)检测所述颗粒-微生物复合物中是否存在微生物。
本发明进一步提供了一种检测样品中是否存在微生物的方法，该样品还可以包含非微生物细胞，该方法包括：a)将所述样品用颗粒孵育以形成颗粒-微生物复合物；b)将所述颗粒-微生物复合物与所述非微生物细胞分离；以及c)检测所述颗粒-微生物复合物中是否存在微生物；其中所述颗粒具有未被以下中的任何一者包覆的外表面：(i)抗体，(ii)碳水化合物，(iii)由载脂蛋白H蛋白衍生的肽，(iv)甘露糖结合凝集素蛋白。
在该方法中，孵育步骤可以在聚茴香脑磺酸钠和/或选择性裂解样品中的非微生物细胞，同时保持样品中存在的微生物完整的试剂的存在下进行。在该方法中，步骤c)可包括(i)检测与微生物相关的核酸分子的酶活性；(ii)通过细胞计数或显微术直接检测微生物；(iii)细胞培养后检测微生物；(iv)通过PCR检测微生物，或(v)通过核酸测序检测所述微生物。
在该方法中，步骤c)可以包括以下步骤：i)将所述颗粒-微生物复合物中的微生物裂解；ii)将所述裂解物用核酸分子孵育，所述核酸分子充当用于所述微生物的核酸修饰活性的底物；以及iii)具体确定由底物核酸分子上的核酸修饰酶的作用产生的经修饰的核酸分子是否存在，以指示微生物是否存在。在该方法中，步骤(i)可以包括加入包含底物核酸分子的裂解试剂。在该方法中，核酸修饰酶可以包含DNA或RNA聚合酶，任选地其中所述DNA聚合酶是DNA聚合酶I。
由于微生物是受试者中常见的感染源，因此本发明的方法可用于鉴定通过微生物引起的感染。因此，本发明还提供了一种检测受试者中是否存在微生物感染的方法，该方法包括对来自受试者的样品进行本文所述的任何方法(检测样品中的微生物)。
该方法可以还包括洗涤分离的颗粒-微生物复合物以除去非微生物细胞或裂解物。
在该方法中，步骤(b)可以还包括从颗粒-微生物复合物中除去非微生物细胞。
在该方法中，步骤b)可以通过任何合适的分离方式进行。例如，可以使用磁场吸引颗粒-微生物复合物或离心来实现分离。
在该方法中，步骤b)可以还包括从颗粒-微生物复合物中除去非微生物细胞。
在该方法中，步骤a)之前可以选择性裂解样品中的非微生物细胞，同时保持样品中存在的微生物完整。
在该方法中，选择性裂解样品中的非微生物细胞，同时保持样品中存在的任何微生物完整可以包括冷冻和解冻样品。
在该方法中，选择性裂解样品中的非微生物细胞，同时保持样品中存在的任何微生物完整可以包括加入去污剂。
在该方法中，步骤a)可以在缓冲液存在下进行。缓冲液可以具有在7.4至8.5之间的pH。
在该方法中，步骤a)可以在氯化钠存在下进行。氯化钠可以在50至500mM之间的浓度下存在。优选地，氯化钠可以在约150mM的浓度下存在。
在该方法中，选择性裂解样品中的非微生物细胞，同时保持样品中存在的微生物完整的试剂可以是去污剂。在该方法中，去污剂可以是非离子的。在该方法中，去污剂可以不与能够与微生物形成复合物的颗粒缀合。因此，通常去污剂形成其中加入颗粒的溶液的一部分，而不形成颗粒本身的一部分。
在该方法中，颗粒可以具有在0.1和3μm之间或在0.1和2μm之间的直径。优选地，颗粒具有在0.1和1.0μm之间的直径。
在该方法中，颗粒可以是(且通常是)磁性的。颗粒可以是超顺磁性的。颗粒可包含氧化铁。氧化铁可包括磁体矿和/或磁赤铁矿。氧化铁可以不包含1:1、2:1、3:1或4:1比率的Fe2+和Fe3+。
能够与微生物形成复合物的颗粒的外表面可以包含聚合物；任选地，该聚合物可以是基于碳的。该聚合物可以不包含无机聚合物。该聚合物可以包含聚苯乙烯和/或聚(苯乙烯/二乙烯基苯)。
在该方法中，能够与微生物形成复合物的颗粒的外表面可以包含或包覆有以下中的任何一者或多种：i)羧酸基团；ii)氨基；iii)疏水基团；以及iv)链霉亲和素；任选地，羧酸基团；ii)氨基；iii)疏水基团可能不是多肽的一部分。
在该方法中，微生物可以是病原微生物。例如，病原微生物可以是病原细菌或真菌。
在该方法中，非微生物细胞可以包括红血细胞和/或白血细胞。
在该方法中，样品可包含浓度为每毫升20,000至5百万个细胞的非微生物细胞。样品可以包含浓度为每毫升至少约100,000个细胞的非微生物细胞。优选地，样品可包含浓度为每毫升至少约20,000个细胞的非微生物细胞。
样品是一种含有或怀疑含有微生物的样品。样品包含非微生物细胞，当旨在检测在样品中是否存在微生物并潜在地鉴定和/或定量样品中存在的微生物时，这些微生物可以提供不需要的背景。因此，在一些实施方式中，样品可以包含血液、尿液、唾液或乳。血液样品可以是任何含有血细胞的样品。血液样品可以是全血或可以包含全血(例如血培养液)。
本发明提供了一种检测样品中是否存在微生物的方法，该样品还可以包含非微生物细胞，该方法包括：(a)将该样品用颗粒(例如磁性颗粒)孵育以形成颗粒-微生物复合物；(b)将所述颗粒-微生物复合物与所述非微生物细胞分离(例如使用磁场)；以及(c)检测所述颗粒-微生物复合物中是否存在微生物。
在该方法中，颗粒(例如磁性颗粒)可以具有未用以下中的任何一者包覆的外表面(例如外聚合物表面)：(i)抗体，(ii)碳水化合物，(iii)衍生自载脂蛋白H的肽，(iv)甘露糖结合凝集素蛋白，(v)多胺或(vi)阳离子去污剂。
在该方法中，颗粒(例如磁性颗粒)可具有未用以下中的任何一者包覆的外聚合物表面：(i)抗体，(ii)碳水化合物或(iii)先天免疫系统蛋白。
在该方法中，颗粒(例如磁性颗粒)可具有未用以下中的任何一者包覆的外聚合物表面：(i)抗体，(ii)碳水化合物，(iii)由载脂蛋白H蛋白衍生的肽，(iv)甘露糖结合凝集素，或(v)絮凝剂(例如WO03/102184中定义的絮凝剂)。
在该方法中，颗粒(例如磁性颗粒)可以具有未用配体包覆的外表面(例如外聚合物表面)。
在该方法中，颗粒(例如磁性颗粒)可以具有未用以下中的任何一者包覆的外表面(例如外聚合物表面)：(i)抗体，(ii)碳水化合物，(iii)先天免疫系统蛋白或(iv)絮凝剂(例如WO 03/102184中定义的絮凝剂)。
在该方法中，颗粒(例如磁性颗粒)可以具有用链霉亲和素包覆而未用配体包覆的外表面(例如外聚合物表面)。
在该方法中，颗粒(例如磁性颗粒)可以具有仅用链霉亲和素包覆的外表面(例如外聚合物表面)。
在该方法中，颗粒(例如磁性颗粒)可以具有仅用羧基包覆的外表面(例如外聚合物表面)。
在该方法中，颗粒(例如磁性颗粒)可以具有未用能够结合微生物的任何分子或部分包覆的外表面(例如外聚合物表面)。
在该方法中，颗粒(例如磁性颗粒)可以具有未用任何分子或部分包覆的外表面(例如外聚合物表面)。
在该方法中，步骤(c)可以包括(i)检测与微生物相关的核酸分子的酶活性，(ii)通过细胞计数或显微术直接检测微生物，或(iii)在细胞培养后检测微生物。
根据本发明所有相关方面的在颗粒-微生物复合物中是否存在微生物的检测可以根据任何期望的方法进行。该方法可以包括简单地检测一种或多种微生物是否存在。如果存在的话，它可能涉及对微生物的定量。在一些实施方式中，它也可能涉及微生物性质的表征。因此，可以进行细菌和/或真菌的检测。还可以对革兰氏阳性细菌与革兰氏阴性细菌进行区分。还可以进行生物体的鉴定和抗微生物易感性。
从颗粒-微生物复合物中除去(或回收)微生物后，可以进行检测。回收的微生物可以在检测之前裂解。裂解微生物后可回收完整的微生物或裂解物(如本文进一步详细讨论)。
优选地，在不事先从颗粒-微生物复合物中除去(或回收)微生物的情况下进行检测。该实施方式在将本发明应用于磁珠处理仪器中特别有用。
微生物是否存在的检测可以包括检测酶活性或与微生物相关的核酸分子。通过细胞计数或显微术直接检测微生物；或在细胞培养后检测微生物。
与微生物相关的核酸分子的检测是本领域已知的，且可以在DNA或RNA水平上进行。可以通过任何合适的方法来进行，例如扩增(例如PCR)或测序(尤其是下一代测序)。此类方法可利用微生物与非微生物(例如人，DNA和RNA)之间的序列差异。此类方法可包括裂解微生物(例如以颗粒-微生物复合物形式存在)以释放核酸组分。
直接检测微生物也是已知的。这可能涉及细胞分析，例如通过流式细胞术。它可能涉及使用显微术，例如可视化从颗粒-微生物复合物中回收的微生物或可视化颗粒-微生物复合物中的微生物。
为了扩大微生物数量，还可以在细胞培养后进行微生物检测。因此，在检测之前，可以将最初捕获在颗粒-微生物复合物中的微生物培养设定的时间。培养方法可以直接检测原始样品中的微生物。
然而，在一些优选的实施方式中，检测是否存在微生物可以包括检测与微生物相关的酶活性。合适的酶活性通常是核酸修饰活性，且在本文中有更详细的讨论。
因此，在该方法中，步骤(c)可以包括以下步骤：(i)将所述颗粒-微生物复合物中的微生物裂解；(ii)将所述裂解物用核酸分子孵育，所述核酸分子充当用于所述微生物的核酸修饰活性的底物；(iii)具体确定由底物核酸分子上的核酸修饰酶的作用产生的经修饰的核酸分子是否存在，以指示微生物是否存在。
在该方法中，步骤(i)可以包括加入包含底物核酸分子的裂解试剂。
孵育样品是指在有利于形成颗粒-微生物复合物的条件下使样品与颗粒接触。在一些实施方式中，将样品用颗粒(例如磁性颗粒)孵育的步骤包括在指定温度(例如37℃)下使颗粒(例如磁性颗粒)与样品接触固定时间段(例如30min)。孵育可以在有或没有摇动的情况下进行(例如通过平台摇床，定轨摇床或设置为500-1000rpm的摇动培养器)。
颗粒-微生物复合物中微生物的裂解允许检测微生物内的核酸分子或酶，例如核酸修饰酶。裂解可通过加入裂解混合物来实现。裂解混合物通常可用于本发明的方法。裂解混合物可包括特定的组分混合物，以确保微生物的有效裂解而不会不利地影响细胞内的核酸分子和/或酶活性，例如核酸修饰活性。组分可以选自载体/血清蛋白，例如BSA，表面活性剂/去污剂，金属卤化物盐，缓冲液，螯合剂等。以其基本形式，本发明的裂解混合物可包括以下组分：
1.表面活性剂/去污剂
2.血清蛋白，例如白蛋白(例如BSA)
3.缓冲液
4.核苷酸，例如dNTP
5.核酸分子(在本发明的测定中充当底物)。
合适的裂解混合物如下列出：
L1：在360mL LM中252mL
1.46％(w/v)BSA
0.15％Triton X100
0.15％Tween 20
L2：在360mL LM中36mL
100mM硫酸铵
20mM七水合硫酸镁
100mM氯化钾
200mM Tris-HCl[pH 8.0]
L3：在360mL LM中36mL
0.1μM PTO-AS寡核苷酸
0.1μM PTO-S1寡核苷酸
20mM Tris-HCl[pH 8.5]
10mM氯化钾
10μM EDTA
10mM dNTP：在360mL LM中3.6mL
PTO-IPC储液：在360mL LM中～180μL
H2O：在360mL LM中～32.4mL
“PTO-AS寡核苷酸”是指包含硫代磷酸酯核苷酸的反义寡核苷酸。“PTO-S1寡核苷酸”是指包含硫代磷酸酯核苷酸的正义寡核苷酸。两种寡核苷酸彼此杂交以形成底物核酸分子。
“PTO-IPC”是指包含硫代磷酸酯核苷酸的IPC分子。
合适的底物和IPC分子在本文中进一步详细讨论。
列出了每种组分的实施例性量和浓度，但是可以如本领域技术人员容易理解的那样进行修改。
裂解还可需要破坏细胞。例如，可以使用裂解混合物与物理和/或酶促手段组合来破坏细胞。然而，通常，裂解细胞的方法避免使用物理破坏。在一些实施方式中，物理破坏采用破坏器。破坏器可以结合珠例如玻璃珠以裂解细胞。合适的设备可商购获得，包括Scientific Industries，Inc.制造的Disruptor Genie。可以利用超声处理，例如施加超声喇叭。在一些实施方式中，酶促破坏可能需要使用选自溶葡萄球菌素、溶菌酶和/或裂解酶的一种或多种试剂。
一旦将微生物(如果存在于样品中)裂解，就可以检测释放的核酸和/或酶以指示样品中是否存在微生物。在一些实施方式中，将裂解物用核酸分子孵育，该核酸分子充当(微生物的)核酸修饰活性的底物。然后确定由底物核酸分子上的核酸修饰酶的作用产生的经修饰的核酸分子是否存在，以指示微生物是否存在。根据要检测的核酸修饰活性来设计核酸底物分子。本领域技术人员能够很好地设计合适的底物核酸分子。尽管初始样品包含核酸修饰活性的非微生物来源，本发明的方法防止这种污染活性作用于底物核酸分子。
核酸修饰酶可以包含DNA或RNA聚合酶，任选地其中所述DNA聚合酶是DNA聚合酶I。
核酸修饰酶可以包含连接酶，任选地其中所述核酸修饰酶是NAD依赖性连接酶。
本发明进一步提供了一种检测受试者中是否存在微生物感染的方法，该方法包括对来自受试者的样品进行本文所述的任何方法的方法，任选地其中所述样品包括来自受试者的血液。
该方法可以还包括洗涤分离的颗粒-微生物复合物以除去非微生物细胞或裂解物。洗涤步骤可以除去后续分析的抑制剂，例如PCR抑制剂。洗涤步骤可以在不使颗粒-微生物复合物解离的条件下进行。
根据本发明的方法，可以检测的典型的核酸修饰活性包括聚合酶和/或连接酶活性。在某些实施方式中，核酸修饰酶包括DNA或RNA聚合酶。在一些实施方式中，DNA聚合酶包含或为DNA聚合酶I。在一些实施方式中，核酸修饰酶包含连接酶。在某些实施方式中，核酸修饰酶包含或为NAD依赖性或ATP依赖性连接酶。NAD依赖性连接酶仅在(真)细菌中发现，且因此，检测此类活性可能提供其他水平的特异性。在W02009/007719和WO2010/119270(其相关公开内容并入本文)中进一步讨论。可替代地，可以测量与活力相关的其他核酸修饰活性，例如磷酸酶、激酶和/或核酸酶活性。
在一些实施方式中，核酸修饰活性对底物核酸分子的作用产生延长的核酸分子。这可以通过链延长(聚合酶活性)和/或通过两个核酸分子的连接(连接酶活性)来实现。在一些实施方式中，利用可被聚合酶或连接酶作用的底物，因为任一活性均指示样品中的微生物的存在。在一些实施方式中，可以根据产生的新型核酸分子来区分相关活性。
底物可以是用于微生物的核酸修饰活性的模板。例如，底物可以是DNA或RNA聚合酶的模板，任选地其中所述DNA聚合酶是DNA聚合酶I。
在WO2011/130584、WO2010/119270和WO2009/007719(其相关公开内容通过引用并入本文)中描述了用作微生物的核酸修饰活性的底物的合适核酸分子。在磷酸酶活性的情况下，合适的核酸分子在WO2006/123154中公开，该公开内容通过引用并入本文。
在一些具体的实施方式中，本发明方法中使用的(底物)核酸分子是至少部分双链的并且在互补链中包含尿嘧啶残基，且具体地确定修饰的核酸分子是否存在的步骤包括向样品中加入尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)，以降解互补链中的尿嘧啶残基。
在某些实施方式中，(底物)核酸分子包含DNA。在某些实施方式中，(底物)核酸分子包含DNA且是部分双链的。
在一些实施方式中，(底物)核酸分子包含由正义寡核苷酸(DNA)链和反义寡核苷酸(DNA)链组成的核酸，其中两条链重叠以形成双链区且在存在聚合酶活性的情况下，反义寡核苷酸链的单链部分充当模板，且双链区的正义寡核苷酸链充当引物以产生延长产物；
在某些实施方式中，部分双链(底物)核酸分子的第一链包含(或由其组成)合成核苷酸(例如硫代磷酸酯核苷酸)，而第二(互补)链包含(或由其组成)尿嘧啶残基，且任选地，合成核苷酸(例如硫代磷酸酯核苷酸)。优选地，双链区包含第一和第二(互补)链的3'末端区域。优选地，第二(互补)链在其3'末端包含碱基(例如，双脱氧胞苷)，该碱基阻断DNA聚合酶介导的第二链的延长。这样的部分双链(底物)核酸分子例如描述于Zweitzig等人，2012(新型DNA聚合酶活性测定的表征，使得能够对活菌进行灵敏、定量和通用检测。核酸研究40，14，e109，1-12)。优选地，双链区是至少5个，至少10个，至少15个，至少20个或至少25个核苷酸；任选地，双链区不超过50个核苷酸。如本文所述，第一链可以使用未保护的(或标准)dNTP通过在样品中的微生物的聚合酶活性在孵育步骤中延长，以形成包含未保护的(或标准)核苷酸的延长的第一链。该步骤依赖于使用第二条链作为模板(第一和第二链之间互补区域的上游)。在孵育步骤后，可通过向样品中加入尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)来降解第二(互补)链，从而使延长的第一链成为包含合成核苷酸和未保护的核苷酸的单链分子。在第二链降解之后，可以在扩增步骤中检测(底物)核酸分子的延长的第一链。发明人发现，如上所述使用部分双链(底物)核酸分子改进了样品中的微生物的检测。
在一些实施方式中，底物核酸分子被预修饰以便保护其免受核酸酶活性，即，在将核酸分子加入到测定之前对其进行修饰以使其免受核酸酶活性。发明人已经确定保护底物核酸分子免受核酸酶活性在本发明的测定中是有利的。更具体地，将受保护的核酸分子掺入本发明的方法中改进了检测的灵敏度。为了保护核酸分子免受核酸酶活性，可以采用任何合适的手段。非限制性实例包括将甲基化结合到核酸分子中，末端修饰，例如3'和/或5'末端的保护以及合成核苷酸的掺入。在特定的实施方式中，合成核苷酸包含硫代磷酸酯核苷酸和/或锁定的核酸核苷酸。优选地，合成核苷酸是硫代磷酸酯核苷酸。在某些实施方式中，合成核苷酸取代核酸分子中的至少一个至所有核苷酸。
(底物)核酸分子可包括任何天然核酸和天然或合成类似物，所述天然或合成或类似物能够通过核酸修饰活性作用以产生(新的可检测的)核酸分子。在特定的实施方式中，底物可以延长和/或连接。在一些实施方式中，核酸底物分子的组合可用于允许检测聚合酶和连接酶活性。
核酸底物可以以相对于样品中核酸修饰活性(由微生物提供)过量存在，且特别是以大摩尔过量存在。因为可以检测到新的延长或连接的核酸分子，所以只有在样品中存在该分子对有效地进行检测方法才是必需的。因此，如果样品中存在其他核酸分子，例如来自待检测的微生物或来自哺乳动物或其他可能发现于待检测样品中的来源，则对本发明的方法无害。
发明人先前已经在其方法的背景下研究了内部阳性对照(IPC)分子的使用。因此，根据所有方面，本发明可以依赖于包含IPC分子。在一些实施方式中，IPC包括在底物核酸分子中，以使IPC暴露于相同条件。在一些实施方式中，对IPC分子进行预修饰以保护其免受核酸酶活性，即在将核酸分子加入到测定之前对其进行修饰以使其免受核酸酶活性。发明人已经确定在本发明的测定的背景下保护IPC分子免受核酸酶活性是有利的。为了保护核酸分子免受核酸酶活性，可以采用任何合适的手段。非限制性实例包括将甲基化结合到核酸分子中，末端修饰，例如3'和/或5'末端的保护以及合成核苷酸的掺入。在特定的实施方式中，合成核苷酸包含硫代磷酸酯核苷酸和/或锁定的核酸核苷酸。优选地，合成核苷酸是硫代磷酸酯核苷酸。在某些实施方式中，合成核苷酸取代IPC分子中的至少一个至所有核苷酸。优选地，以相同的方式修饰底物和IPC分子，由于这对它们在本发明的测定中表现类似是有利地。
在一些实施方式中，内部阳性对照(IPC)核酸分子包含与底物核酸分子相同的引物结合位点，使得在包含核酸分子和IPC二者的核酸扩增反应中竞争引物结合。
在本发明的所有方法中，具体确定修饰的核酸分子是否存在可以包括，基本上由以下组成或由以下组成：核酸扩增步骤。这用于使本发明的方法最大程度地灵敏。这样的扩增技术在本领域中是众所周知的，且包括诸如PCR、NASBA(Compton，1991)、3SR(Fahy等，1991)、滚环复制、转录介导扩增(TMA)、链置换扩增(SDA)Clinical Chemistry 45：777-784，1999，US6261846(通过引用并入本文)的DNA寡聚物自组装过程、连接酶链反应(LCR)(Barringer等人，1990)、选择性扩增靶多核苷酸序列(US 6410276)、任意引发的PCR(WO90/06995)、共有序列引发的PCR(US 4437975)、入侵者技术、链置换技术和切口置换扩增(WO2004/067726)的方法。上面的列表并不旨在穷举。可以使用任何核酸扩增技术，前提是特异性扩增适当的核酸产物。
类似地，在一些实施方式中可以采用基于测序的方法，以包括任何范围的下一代测序平台，例如通过合成克隆扩增的序列测序(Illumina)，焦磷酸测序，454测序(Roche)，纳米孔测序(例如Oxford Nanopore)，离子激流(ThermoFisher)和单分子实时(SMRT)测序(Pacific Biosystems)。产生新的核酸分子的事实意味着测序方法可以证实修饰的核酸分子是否存在，且还提供该分子的定量。
通过使用对要检测的修饰的核酸分子的序列具有特异性的扩增引物来实现扩增。为了提供对核酸分子的特异性，可以选择对应于序列的合适区域的引物结合位点。本领域读者将理解，核酸分子还可包含除引物结合位点以外的序列，所述引物结合位点是检测样品中修饰活性所产生的新型核酸分子所需的引物结合位点，例如RNA聚合酶结合位点或启动子序列可为等温扩增技术(例如NASBA、3SR和TMA)所需。
一个或多个引物结合位点可以桥接底物核酸分子的连接/延长边界，使得只有发生连接/延长才产生扩增产物。可替代地，引物可结合连接/延长边界的任一侧并跨边界直接扩增，使得只有形成连接/延长的核酸分子才(指数地)产生扩增产物。引物和底物核酸分子可以被设计以避免非特异性扩增(例如样品中的基因组DNA)。
引物可以适当地掺入合成核苷酸类似物，或可以是例如基于RNA或PNA的或其混合物。取决于所采用的检测方式，例如可以用荧光标记和/或FRET对标记引物。
可以使用探针，还可以根据需要标记探针。该检测方法可能需要使用引物以外的核苷酸探针，或作为引物的替代物。例如，在一些实施方式中可以采用不需要使用引物的分支DNA测定法。
在某些方面，本发明的方法使用核酸扩增技术进行，以便检测修饰的核酸分子，该修饰的核酸分子作为核酸修饰活性对底物核酸分子作用的直接结果而产生，这表明样品中存在微生物。在某些实施方式中，所使用的技术选自PCR、NASBA、3SR、TMA、SDA和DNA寡聚物自组装。
扩增产物的检测可以通过常规方法，例如凝胶电泳，但是在一些实施方式中，使用实时或终点检测方法进行。
实时或终点检测扩增反应的产物的多种技术是本领域已知的。这些包括使用插入式荧光染料，例如SYBR Green I(Sambrook和Russell，分子克隆-实验手册，第三版)，其可根据产生的荧光量估算扩增的DNA的产量。许多实时检测方法产生荧光读数，其可被连续监控。具体实例包括分子信标和荧光共振能量转移探针。实时和终点技术是有利的，因为它们将反应保持在“单管”中。这意味着无需下游分析即可获得结果，从而可以更快地获得结果。此外，将反应保持在“单管”环境中降低了交叉污染的风险，并允许本发明的方法的定量输出。这在本发明的情况下尤其重要，其中对健康和安全的关注可以是至关重要的(例如在检测患者样品中潜在的微生物感染中)。
可以使用
系统(Applied Biosystems)完成PCR反应的实时和终点定量，参见Holland等人，通过利用水生栖热菌DNA聚合酶的5'-3'核酸外切酶活性检测特异性聚合酶链反应产物，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88，7276-7280(1991)；Gelmini等人，用荧光探针以测量C-Erb-2癌基因扩增的基于定量聚合酶链反应的均相测定，Clin.Chem.43,752-758(1997)，和Livak等人，走向全自动的全基因组多态性筛选，Nat.Genet.9，341-342(19995)(通过引用并入本文)。这种类型的探针通常可以称为水解探针。还提供了用于实时或终点检测的合适的水解/Taqman探针。探针可以被适当地标记，例如使用下面详述的标记。
在分子信标系统中，参阅Tyagi和Kramer，杂交后发出荧光的分子信标-探针，Nat.Biotechnol.14，303-308(1996)和Tyagi等人，用于区分等位基因的多色分子信标，Nat.Biotechnol.16，49-53(1998)(通过引用并入本文)，信标是具有内部淬灭的荧光团的发夹形探针，当内部淬灭的荧光团结合至其靶标时其荧光得以恢复。这些探针可以被称为发夹探针。
可以结合在本发明的方法中的另一基于实时荧光的系统是Scorpion系统，参见使用自探测扩增子和荧光的PCR产物的检测，Whitcombe等人，Nature Biotechnology 17，804-807(1999年8月1日)。本领域技术人员众所周知且可商购的其他实时或终点检测技术包括
技术、
引物技术、DzyNA引物(Todd等人，临床化学46：5，625-630(2000))或PlexorTMqPCR和qRT-PCR系统。
因此，在本发明的其他方面，使用实时或终点技术来检测核酸扩增的产物。在本发明的特定实施方式中，实时技术包括使用以下中的任何一种：水解探针(
系统)、FRET探针(
系统)、发夹引物(
系统)、发夹探针(分子信标系统)、掺入到引物中的发夹探针(
探针系统)、掺入DNAzyme和可切割的荧光DNAzyme底物(DzYNA)的互补序列的引物、Plexor qPCR和寡核苷酸封闭系统。
可以对扩增产物进行定量，以给出样品中的微生物核酸修饰活性的近似值，且因此给出样品中的微生物水平。因此，“是否存在”旨在涵盖样品中的微生物水平的定量。
发明人进一步发现用于测量微生物的核酸修饰活性的最佳温度可能与用于微生物裂解的最佳温度不同。因此，在一些实施方式中，微生物裂解在比将裂解物用充当用于所述微生物的核酸修饰活性的底物的核酸分子孵育的步骤更低的温度下进行。如已经讨论的，在本发明的一些实施方式中，底物核酸分子被包括在用于裂解微生物的裂解试剂中。这样的实施方式与不同的温度偏好一致。因此，即使底物核酸分子可以包含在裂解试剂中，初始的较低温度也不会不利地影响随后在较高温度下的孵育，在该温度下底物被从微生物释放的核酸修饰活性修饰。因此，在一些实施方式中，该方法包括裂解微生物的步骤，其中裂解试剂包含充当用于所述微生物的核酸修饰活性的底物的核酸分子。该步骤在比将裂解物用底物核酸分子孵育的随后步骤更低的温度下进行，以使从微生物释放的酶具有活性。因此，将底物暴露于最初的较低温度，然后暴露于较高的温度下，在该温度下酶活性得到增强。
在一些实施方式中，将裂解物用充当用于所述微生物的核酸修饰活性的底物的核酸分子孵育的步骤在至少约30℃的温度下进行。温度可以任选地在约30℃和40℃之间或在约32℃和37℃之间，例如约37℃。
在另外的或可替代的实施方式中，微生物的裂解步骤在不超过约30℃，任选地在约15℃和30℃之间或在约18℃和25℃之间，例如约18、19、20、21、22、23、24或25℃的温度下进行。在一些实施方式中，在将裂解物用充当微生物的核酸修饰活性的底物的核酸分子孵育之前的所有步骤均在不超过约30℃的温度下进行。温度可以任选地在约15℃至30℃之间或在约18℃至25℃之间，例如约18、19、20、21、22、23、24或25℃。
这种方法可以结合关于本发明的各个方面描述的任何一个或多个直至所有的实施方式。
在一些实施方式中，该方法的特征还在于，将裂解物用底物核酸分子孵育的步骤在至少约30℃，任选地在约30℃和40℃之间或在约32℃和37℃之间，例如约37℃的温度下进行。
在另外的或可替代的实施方式中，将裂解物用底物核酸分子孵育之前的每个步骤在不超过约30℃，任选地在约15℃和30℃之间或在约18℃和25℃之间，例如18、19、20、21、22、23、24或25℃的温度下进行。
在将样品用磁性颗粒孵育以形成颗粒-微生物复合物的步骤之前(即在步骤(a)之前)，该方法可以包括选择性裂解样品中的非微生物细胞，同时保持样品中存在的微生物完整。
选择性裂解样品中的非微生物细胞，同时保持样品中存在的微生物完整的步骤可包括向样品中加入去污剂和一种或多种酶的组合。一种或多种酶可以包含蛋白酶和/或DNA酶，任选地其中所述蛋白酶是蛋白酶K。
选择性裂解样品中的非微生物细胞，同时保持样品中存在的任何微生物完整的步骤，可能会阻止来自非微生物细胞(如白细胞)的酶活性，错误地表明了样品中的微生物的存在。可以通过本文进一步讨论的任何合适的手段来实现这种选择性裂解。可以使用任何可裂解样品中存在的非微生物特别是哺乳动物细胞但不裂解样品中的微生物的试剂。在一些实施方式中，试剂可以包括表面活性剂或去污剂，例如非离子去污剂。合适的实例包括例如5％w/v的聚乙二醇脱水山梨糖醇单月桂酸酯(Tween 20)。该试剂可以包括例如5％w/v的皂苷。该试剂可以包括例如8.5g/l的金属卤化物盐，例如氯化钠。该试剂可以包括所有三种组分的混合物。该样品可以在合适的条件下与试剂混合，以确保非微生物细胞，特别是哺乳动物细胞(如果样品中存在)裂解，但是微生物(如果样品中存在)不(不显著)裂解。样品可以暴露于试剂约5至30min，例如5、10、15、20、25或30min的时间段。该步骤可以在任何合适的温度，例如在15和30摄氏度之间或在室温下进行。
在一些实施方式中，根据本发明的所有方面，样品中的非微生物细胞选择性裂解同时保持样品中存在的任何完整微生物包括向样品中加入去污剂和一种或多种酶的组合。不希望受任何特定理论的束缚，去污剂选择性渗透非微生物细胞膜，而微生物由于其细胞壁而受到保护。该酶可用于分解释放的细胞内物质和其他细胞碎片，并可有助于防止释放的酶活性继续存在。在一些实施方式中，一种或多种酶包含蛋白酶和/或核酸酶。合适的蛋白酶包括蛋白酶K。合适的核酸酶包括DNA酶。在一个实施方式中，用于选择性裂解非微生物细胞的试剂包括triton X-100和蛋白酶K的组合。更具体地，裂解试剂可以包括0.25％Triton X-100和4.8μg/mL蛋白酶K。
如果非微生物细胞被裂解，则使释放的任何相关酶活性失活很重要。发明人设计了利用高pH条件以确保酶活性的有效失活的方法。微生物细胞通常保持完整，至少在一些处理期间，且高pH处理不会明显不利地影响细胞内酶活性。另外，发明人先前已经表明，在任何情况下，微生物酶都对高pH处理更有抵抗力。
因此，在选择性裂解样品中的非微生物细胞，同时保持样品中存在的任何微生物完整的步骤之后，该方法可以包括将裂解物暴露于高pH条件。暴露于高pH条件的持续时间通常少于20分钟，且可以不超过10、9、8、7、6或5min，且可以为约5、6、7、8、9或10分钟。在一些实施方式中，治疗进行约2至15min，例如约5min。“约”是指正负30秒。
为了提供高pH条件，可以使用任何合适的试剂。在具体的实施方式中，高pH条件包括使样品与碱或缓冲液接触。在具体的实施方式中，使用NaOH或Na2CO3。在特定的实施方式中，NaOH或Na2CO3的浓度为约5mM或更高。缓冲液可以具有大于9的pKa值。合适的缓冲液的实例包括硼酸盐、碳酸盐和焦磷酸盐缓冲液。
高pH条件通常抑制包括来自非微生物来源例如哺乳动物细胞的ATP依赖性连接酶和聚合酶的核酸修饰酶的活性，但不抑制微生物连接酶或聚合酶的活性。这主要归因于该方法中采用的差异裂解条件，以确保仅将非微生物酶暴露于高pH条件。然而，这还可以是由于微生物酶对这些条件的抵抗力更大。“高pH”通常是至少约10，例如约10、11、12、13或14的pH。“低pH”通常是小于或等于约4，例如约4、3、2或1的pH。“约”是指所陈述的值的任一侧的pH单位的0.5。如本领域技术人员将容易理解的，可以使用任何合适的手段来实现样品pH的改变。微生物酶例如聚合酶和连接酶可能对极端的pH有抵抗力，而相应的哺乳动物酶可能在相同的pH条件下失活。这有助于选择性检测包含哺乳动物细胞和微生物细胞的样品中的微生物酶活性。在特定的实施方式中，抑制来自哺乳动物细胞的非微生物核酸修饰活性例如ATP依赖性连接酶的活性但不抑制核酸修饰活性例如微生物连接酶的微生物来源的活性的条件包括用氢氧化钠(NaOH)或碳酸钠(Na2CO3)处理样品。如本文所示，此类试剂可容易地用于将样品的pH增加入到高pH，从而使非微生物酶活性失活，同时使微生物(真菌和细菌)酶保持活性。合适的试剂的合适的浓度和体积可以由技术人员应用。然而，在某些实施方式中，NaOH为至少约5mM NaOH。在一些实施方式中，碱浓度为不超过10mM，例如5、6、7、8、9或10mM。
在另一些实施方式中，pH为约12以使哺乳动物核酸修饰活性(例如聚合酶和/或ATP依赖性连接酶活性)，而不是微生物核酸修饰活性(例如聚合酶和/或连接酶活性)失活。在特定的实施方式中，pH条件可以增加入到至少约11或至少11.2。在一定时间段后，该处理可能导致样品中的微生物的裂解，且因此导致核酸修饰活性(例如聚合酶和/或连接酶)释放到样品中。因此，在一些实施方式中，通过高pH处理来实现微生物的裂解。这允许检测样品中源自微生物的核酸修饰活性(例如聚合酶和/或连接酶)，而无需单独的细胞裂解步骤。在这些条件下，哺乳动物连接酶(例如血液ATP依赖性连接酶)被失活。然而，如本文更详细讨论的，通常，该方法包括用于裂解样品中的微生物的单独步骤。
在一些实施方式中，通过加入降低pH的试剂来停止在高pH条件下的处理。这是在裂解微生物之前完成的。合适的试剂包括缓冲液和/或酸。因此，可以通过加入中和缓冲液来降低pH。在特定的实施方式中，缓冲液包含Tris-HCl缓冲液(例如pH 7.2或8)。用于降低pH的其他合适的试剂包括酸，例如盐酸(HCl)和硫酸(H2SO4)。如本领域技术人员将容易理解的，可以将这些(和其他)酸掺入缓冲液中。在pH升高后可用于处理样品的一种特定试剂包括硫酸铵、七水合硫酸镁、氯化钾和Tris-HCl的组合。更具体地，试剂可以包含10mM硫酸铵、2mM七水合硫酸镁、10mM氯化钾和20mM Tris-HCl[pH 8.0]。
步骤(b)可以还包括从颗粒-微生物复合物中除去非微生物细胞，例如通过吸气。
在本发明的上下文中，“样品”是含有非微生物细胞且期望测试表达核酸修饰活性的微生物例如真菌(例如酵母)和/或细菌的存在的样品。因此，样品可以包括，基本上由以下组成或由以下组成：临床样品，例如血液样品(包括全血，血浆，血清和含血样品，例如血液培养物或血培养液)。本发明的方法特别适用于快速确定阴性(和阳性)血液培养物。因此，样品可以包括来自怀疑患有血流感染或正接受血流感染筛选的患者的血培养样品(或血培养液样品)。样品可以是任何合适的体积，例如1至10ml，优选1ml血液培养样品。
使用的样品将取决于多种因素，例如可用性、便利性和要测试的条件。可以使用但不意图限制本发明的典型样品包括取自患者，最优选人类患者的全血、血清、血浆、血小板、关节液和尿液样品等。可能会怀疑患者患有血液感染或正在接受血液感染筛选。该患者可以是住院患者。样品可取自每毫升血液包含超过5、10或1500万个白血细胞(WBC)的受试者。本发明的方法代表体外测试。它们是对从受试者取出的样品进行的。然而，在不太优选的实施方式中，该方法可以另外包括从受试者获得样品的步骤。从受试者获得合适样品的方法是本领域众所周知的。然而，通常，该方法可以从已经在单独的程序中从患者中分离的样品开始进行。所述方法将最优选地在来自人的样品上进行，但是本发明的方法可用于许多动物。
本发明的方法可以用于补充任何已经可用的诊断技术，有可能作为确认初始诊断的方法。可替代地，由于所述方法提供了快速且方便的诊断手段，所述方法本身可以用作初步诊断方法。此外，由于其固有的灵敏性，本发明的方法仅需要最少的样品，从而防止了不必要的侵入性手术。另外，大的但未浓缩的样品还可以根据本发明的方法有效地测试。
在根据本发明所有方面的特定实施方式中，可以在样品中检测到的微生物是病原微生物，例如病原细菌或真菌/酵母。细菌可以是能够在受试者，优选人类受试者中引起感染或疾病的任何细菌。在一个实施方式中，细菌包括或基本上由以下一种或多种组成或由以下一种或多种组成：葡萄球菌(Staphylococcus)物种，包括表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(且优选耐甲氧西林的菌株)，肠球菌(Enterococcus)物种，链球菌(Streptococcus)物种，分枝杆菌(Mycobacterium)物种，特别是结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)，弧菌(Vibrio)物种，特别是霍乱弧菌(Vibrio cholerae)，沙门氏菌(Salmonella)和/或大肠埃希氏菌(Escherichia coli)等。在某些实施方式中，细菌可以包括，基本上由以下组成或由以下组成：梭菌(Clostridium)物种，且特别是艰难梭菌(C.difficile)。艰难梭菌是抗生素相关的腹泻和结肠炎的主要原因，抗生素相关的腹泻和结肠炎是医疗相关的肠道感染，主要影响患有其他潜在疾病的老年患者。可以检测到念珠菌(Candida)物种，例如白色念珠菌(C.albicans)，副念珠菌(C.parapsilosis)和光滑念珠菌(C.glabrata)。可以检测到隐球菌(Cryptococcus)物种，例如新孢隐球菌(C.neoformans)。使用本发明可以检测到(是否存在)真菌血症，例如念珠菌血症。优选地(尽管不是必需的)通过其酶活性指示微生物。因此，这些方法提供了样品中存活的或最近的微生物的指示。在一段时间后，如果微生物不能存活，则酶活性会从样品中消失。这代表了使用酶活性相对于使用核酸分子，特别是DNA(可以持续更长时间)来作为样品中的微生物的指示剂的优势。
一旦在样品中检测到微生物的阳性存在，本发明的方法可以涉及鉴定感染的性质。可以将任何合适的方法用于该进一步的鉴定步骤。
磁性颗粒可以是超顺磁性颗粒。
所述颗粒(例如磁性颗粒)对微生物的亲和力可能大于对非微生物细胞的亲和力。磁性颗粒可能会通过非特异性结合结合到微生物。
颗粒(例如磁性颗粒)可具有包含聚苯乙烯和/或聚(苯乙烯/二乙烯基苯)的外聚合物表面。
磁性颗粒可包含氧化铁。优选地，氧化铁被外聚合物表面包封。颗粒可以是氧化铁和聚合物的汞齐。颗粒可以被外聚合物表面部分包封。该聚合物可以包括聚苯乙烯。
颗粒(例如磁性颗粒)可以具有在0.05和1μm之间，0.1和0.5μm之间，0.2和0.3μm之间的直径。优选地，磁性颗粒可以具有在0.2至0.3μm之间的直径。颗粒(例如磁性颗粒)可以具有在0.1和3μm或0.1和2μm之间的直径。更优选地，颗粒具有在0.1和1.0μm之间的直径。
颗粒(例如磁性颗粒)可具有外聚合物表面。磁性颗粒的外聚合物表面不得包覆有以下中的任何一者：(i)抗体，(ii)碳水化合物，(iii)由载脂蛋白H蛋白衍生的肽，(iv)甘露糖结合凝集素蛋白，(v)多胺或(vi)阳离子去污剂。
甘露糖结合凝集素(MBL)蛋白可以是基于MBL的基因工程蛋白。例如，它可以是包含与免疫球蛋白的Fc区融合的MBL(即FcMBL)的病原体结合部分的基因工程蛋白。
颗粒(例如磁性颗粒)的外表面(例如外聚合物表面)可以未包覆有以下中的任何一者：(i)抗体，(ii)碳水化合物或(iii)先天免疫系统蛋白。
颗粒(例如磁性颗粒)的外表面(例如外聚合物表面)可以未包覆有以下中的任何一者：(i)抗体，(ii)碳水化合物，(iii)由载脂蛋白H蛋白衍生的肽，(iv)甘露糖结合凝集素，或(v)絮凝剂(例如WO03/102184中定义的絮凝剂)。
颗粒(例如磁性颗粒)的外表面(例如外聚合物表面)可以未包覆有以下中的任何一者：(i)抗体，(ii)碳水化合物，(iii)先天免疫系统蛋白或(iv)絮凝剂(例如，WO 03/102184中定义的絮凝剂)。
抗体可以是保持抗原特异性结合功能的抗体的片段或衍生物。这样的片段和衍生物包括Fab片段、ScFv、单结构域抗体、纳米抗体、重链抗体等。
碳水化合物可以是单糖、寡糖(例如二糖或三糖)、多糖和/或其衍生物。
颗粒(例如磁性颗粒)的外表面(例如外聚合物表面)可以未用配体包覆。颗粒(例如磁性颗粒)的外表面(例如外聚合物表面)可以未用非特异性配体(例如WO01/53525中所述的非特异性配体)包覆。颗粒(例如磁性颗粒)的外表面(例如外聚合物表面)可以未用非蛋白质配体(例如WO01/53525中所述的非蛋白质配体)包覆。
颗粒(例如磁性颗粒)的外表面(例如外聚合物表面)可以被羧化。颗粒(例如磁性颗粒)的外表面(例如外聚合物表面)可以只用羧基包覆。
颗粒(例如磁性颗粒)的外表面(例如外聚合物表面)可以用链霉亲和素包覆。颗粒(例如磁性颗粒)的外表面(例如外聚合物表面)可以用链霉亲和素包覆而未用配体包覆。颗粒(例如磁性颗粒)的外表面(例如外聚合物表面)可以仅用链霉亲和素包覆。
颗粒(例如磁性颗粒)的外表面(例如外聚合物表面)可以不被包覆。
微生物可以是病原微生物，任选地其中所述病原微生物是病原细菌或真菌。
非微生物细胞可以包括红血细胞和/或白血细胞。
本发明进一步提供了一种组合物。本文提供的组合物可以用于进行本文描述的任何方法。相对于本发明的方法描述的所有方面和实施方式均作必要修改后适用于相关组合物。
该组合物可包含：i)能够与微生物形成复合物的颗粒，其中所述颗粒具有外表面；ii)聚茴香脑磺酸钠；以及iii)至少一种选择性裂解样品中的非微生物细胞，同时保持样品中存在的微生物完整的试剂。
该组合物可包含：i)能够与微生物形成复合物的颗粒，其中所述颗粒具有外表面；ii)聚茴香脑磺酸钠；以及iii)去污剂。去污剂是选择性裂解样品中的非微生物细胞，同时保持样品中存在的微生物完整的试剂的实例。
该组合物可以还包含微生物细胞和/或非微生物细胞。该组合物可以包含怀疑含有微生物细胞且已知含有非微生物细胞的样品。
该组合物可以还包含缓冲液和/或氯化钠。
在该组合物中，选择性裂解样品中的非微生物细胞，同时保持样品中存在的微生物完整的试剂可以是去污剂。任选地其中所述去污剂是非离子的。在该组合物中，去污剂可以不与能够与微生物形成复合物的颗粒缀合。因此，通常去污剂形成其中加入颗粒的溶液的一部分，而不形成颗粒本身的一部分。
在该组合物中，颗粒可以具有在0.1和3μm之间，或在0.1和2μm之间的直径。优选地，颗粒具有在0.1和1.0μm之间的直径。
在该组合物中，颗粒可以是(且通常是)磁性的。在该方法中，颗粒可以是超顺磁性的。颗粒可包含氧化铁。氧化铁可包括磁体矿和/或磁赤铁矿。氧化铁可以不包含1:1、2:1、3:1或4:1比率的Fe2+和Fe3+。
在该组合物中，能够与微生物形成复合物的颗粒的外表面可以包含聚合物；任选地，聚合物可以是基于碳的。该聚合物可以不包含无机聚合物。该聚合物可以包含聚苯乙烯和/或聚(苯乙烯/二乙烯基苯)。
在该组合物中，能够与微生物形成复合物的颗粒的外表面可以包含或包覆有以下中的任何一者或多种：i)羧酸基团；ii)氨基；iii)疏水基团；以及iv)链霉亲和素；任选地，羧酸基团；ii)氨基；iii)疏水基团可能不是多肽的一部分。
在该组合物中，微生物可以是病原微生物。例如，病原微生物可以是病原细菌或真菌。
在该组合物中，非微生物细胞可以包括红血细胞和/或白血细胞。
在该组合物中，样品可以包含血液、尿液、唾液或乳，任选地其中所述样品是全血。
本发明进一步提供了用于进行本文描述的任何方法的试剂盒。关于本发明的方法描述的所有方面和实施方式在细节上作必要修改后都适用于相关试剂盒。
所述试剂盒可包含：i)能够与微生物形成复合物的颗粒，其中所述颗粒具有外表面；ii)聚茴香脑磺酸钠；以及iii)至少一种选择性裂解样品中的非微生物细胞，同时保持样品中存在的微生物完整的试剂。
所述试剂盒可包含：i)能够与微生物形成复合物的颗粒，其中所述颗粒具有外表面；ii)聚茴香脑磺酸钠；以及iii)去污剂。所述去污剂是选择性裂解样品中的非微生物细胞，同时保持样品中存在的微生物完整的实例。
所述去污剂可以是非离子的。所述去污剂可以不与能够与微生物形成复合物的颗粒缀合。因此，通常去污剂形成其中加入颗粒的溶液的一部分，而不形成颗粒本身的一部分。
在该试剂盒中，颗粒可以具有在0.1和3μm之间或在0.1和2μm之间的直径。优选地，颗粒具有在0.1和1.0μm之间的直径。
在该试剂盒中，颗粒可以是(且通常是)磁性的。颗粒可以是超顺磁性的。颗粒可包含氧化铁。氧化铁可包括磁体矿和/或磁赤铁矿。氧化铁可以不包含1:1、2:1、3:1或4:1比率的Fe2+和Fe3+。
该颗粒的外表面可包含聚合物；优选地，该聚合物可包含聚合物。任选地，该聚合物可以是基于碳的。该聚合物可以不包含无机聚合物。该聚合物可以包含聚苯乙烯和/或聚(苯乙烯/二乙烯基苯)。
在该方法中，能够与微生物形成复合物的颗粒的外表面可以包含或包覆有以下中的任何一者或多种：i)羧酸基团；ii)氨基；iii)疏水基团；以及iv)链霉亲和素；任选地，羧酸基团；ii)氨基；iii)疏水基团可能不是多肽的一部分。
该试剂盒可包含：a)能够与微生物形成复合物的颗粒；b)聚茴香脑磺酸钠；c)至少一种可选择性裂解样品中的非微生物细胞，同时保持样品中存在的微生物完整的试剂；以及d)用于检测颗粒-微生物复合物中是否存在微生物的检测工具，其中所述检测工具包含充当用于所述微生物的核酸修饰活性的底物的核酸分子，且其中所述核酸分子至少部分是双链的并且在互补链中包含尿嘧啶残基。
该试剂盒可包含：a)能够与微生物形成复合物的颗粒；b)聚茴香脑磺酸钠；c)去污剂；以及d)用于检测颗粒-微生物复合物中是否存在微生物的检测工具，其中所述检测工具包含充当用于所述微生物的核酸修饰活性的底物的核酸分子，且其中所述核酸分子是至少部分双链的并且在互补链中包含尿嘧啶残基。
该试剂盒可包含：a)能够与微生物形成复合物的颗粒，其中所述颗粒的外表面没有被以下中的任何一者包覆：(i)抗体，(ii)碳水化合物，(iii)由载脂蛋白H衍生的肽，(iv)甘露糖结合凝集素蛋白；以及b)用于检测所述微粒-微生物复合物中是否存在微生物的检测工具，其中所述检测工具包含充当用于所述微生物的核酸修饰活性的底物的核酸分子，且其中所述核酸分子至少部分是双链的并且在互补链中包含尿嘧啶残基。
该试剂盒可还包含选择性裂解样品中的非微生物细胞，同时保持样品中存在的微生物完整的试剂。
该试剂盒可还包含缓冲液和/或氯化钠。
在该试剂盒中，可选择性裂解样品中的非微生物细胞，同时保持样品中存在的微生物完整的试剂可以是去污剂。任选地，去污剂可以是非离子的。在该组合物中，去污剂可以不与能够与微生物形成复合物的颗粒缀合。
在该试剂盒中，颗粒可以具有在0.1和3μm之间，在0.1和2μm之间的直径。优选地，颗粒具有在0.1和1.0μm之间的直径。
在该试剂盒中，颗粒可以是磁性的。在该方法中，颗粒可以是超顺磁性的。
在该试剂盒中，能够与微生物形成复合物的颗粒的外表面可包含聚合物；任选地，聚合物可以是基于碳的。
在该试剂盒中，能够与微生物形成复合物的颗粒的外表面可包含或包覆有以下中的任何一者或多种：i)羧酸基团；ii)氨基；iii)疏水基团；以及iv)链霉亲和素；任选地羧酸基团；ii)氨基；iii)疏水基团可能不是多肽的一部分。
在该试剂盒中，微生物可以是病原微生物，任选地其中所述病原微生物可以是病原细菌或真菌。
在该试剂盒中，所述非微生物细胞可以包括红血细胞和/或白血细胞。
在该试剂盒中，样品可以包含血液、尿液、唾液或乳，任选地其中所述样品是全血。
该试剂盒可包含(a)能够与微生物形成复合物的颗粒(例如磁性颗粒)；以及(b)用于检测所述微粒-微生物复合物中是否存在微生物的检测工具。
可以采用任何合适的检测工具且它们可以代表检测颗粒-微生物复合物中是否存在微生物所需的整套试剂。
在某些实施方式中，检测工具包括或为充当用于所述微生物的核酸修饰活性的底物的核酸分子。
在一些实施方式中，检测工具包含或还包含用于核酸扩增的试剂。用于核酸扩增的试剂可以包含引物对和/或至少一个探针。在一些实施方式中，那些引物和/或探针与微生物核酸分子杂交。因此，它们可以通过检测扩增的微生物核酸分子来检测样品中的微生物。可替代地，引物或探针与充当用于所述微生物的核酸修饰活性的底物的核酸分子杂交。这样的核酸分子在本文中进一步详细描述。
该试剂盒可包含：(a)能够与微生物(选择性)形成复合物(例如，颗粒-微生物复合物)的颗粒(例如磁性颗粒)；以及(b)用于检测颗粒-微生物复合物中是否存在微生物的检测工具。所述检测工具可以包含充当用于所述微生物的核酸修饰活性的底物的核酸分子。核酸分子可以是至少部分双链的，且可以任选地在互补链中包含尿嘧啶残基。互补链可在其3'末端包含碱基(例如，双脱氧胞苷)，该碱基阻断DNA聚合酶介导的第二链的延长。核酸分子可以是本文所述的任何核酸分子。
在该试剂盒中，颗粒(例如磁性颗粒)的外表面(例如外聚合物表面)可以未包覆有以下中的任何一者：(i)抗体，(ii)碳水化合物，(iii)由载脂蛋白H衍生的肽，(iv)甘露糖结合凝集素蛋白，(v)多胺或(vi)阳离子去污剂。
在该试剂盒中，颗粒(例如磁性颗粒)的外表面(例如外聚合物表面)可以未包覆有以下中的任何一者：(i)抗体，(ii)碳水化合物或(iii)先天免疫系统蛋白。
在该试剂盒中，颗粒(例如磁性颗粒)的外表面(例如外聚合物表面)可以未包覆有以下中的任何一者：(i)抗体，(ii)碳水化合物，(iii)由载脂蛋白H衍生的肽，(iv)甘露糖结合凝集素，或(v)絮凝剂(例如，WO 03/102184中定义的絮凝剂)。
在该试剂盒中，颗粒(例如磁性颗粒)的外表面(例如外聚合物表面)可以未包覆有以下中的任何一者：(i)抗体，(ii)碳水化合物，(iii)先天免疫系统蛋白或(iv)絮凝剂(例如WO 03/102184中定义的絮凝剂)。
在该试剂盒中，颗粒(例如磁性颗粒)可以具有未用配体包覆的外表面(例如外聚合物表面)。
在该试剂盒中，颗粒(例如磁性颗粒)可以具有用链霉亲和素包覆而未用配体包覆的外表面(例如外聚合物表面)。
在该试剂盒中，颗粒(例如磁性颗粒)可具有仅用链霉亲和素包覆的外表面(例如外聚合物表面)。
在该试剂盒中，颗粒(例如磁性颗粒)可以具有仅用羧基包覆的外表面(例如外聚合物表面)。
在该试剂盒中，颗粒(例如磁性颗粒)可具有未用任何能够结合微生物的分子或部分包覆的外表面(例如外聚合物表面)。
在该方法中，颗粒(例如磁性颗粒)可以具有未用任何分子或部分包覆的外表面(例如外聚合物表面)。
可以基于核酸修饰酶包含DNA或RNA聚合酶来设计(底物)核酸分子。在一些实施方式中，DNA聚合酶是DNA聚合酶I。在其他或替代的实施方式中，核酸修饰酶包含连接酶，例如ATP或NAD依赖性连接酶。
所述检测工具可以还包括用于核酸扩增的试剂，任选地其中用于核酸扩增的试剂包括引物对和/或与所述核酸分子杂交的至少一种探针。
该试剂盒可还包含能够裂解颗粒-微生物复合物中的微生物的试剂，任选地其中能够裂解颗粒-微生物复合物中的微生物的试剂包含充当用于所述微生物的核酸修饰活性的底物的核酸分子。
该试剂盒可还包含选择性裂解样品中的非微生物细胞，同时保持样品中存在的微生物完整的试剂。
选择性裂解样品中的非微生物细胞，同时保持样品中存在的微生物完整的试剂可以包含去污剂和一种或多种酶的组合，其中所述一种或多种酶任选地包含蛋白酶和/或DNA酶。本文讨论了合适的去污剂和酶。
该试剂盒可还包含高pH试剂，例如碱或缓冲液。这可以是例如NaOH，例如5mMNaOH。本文描述了其他合适的试剂。
该试剂盒可还包含中和缓冲液。该中和缓冲液可能能够在高pH处理后恢复样品的pH。在本文中描述合适的试剂。
该核酸修饰酶可包含：(a)DNA或RNA聚合酶，任选地其中所述DNA聚合酶是DNA聚合酶I；以及/或(b)连接酶，任选地其中所述连接酶是ATP和/或NAD依赖性连接酶。
根据本发明的所有相关方面和实施方式，术语“聚茴香脑磺酸钠”旨在涵盖所有功能上等价的衍生物及其盐形式(例如，聚茴香脑磺酸钾，聚茴香脑磺酸镁等)。
在整个公开内容中，术语“颗粒”和“珠”可以互换使用。
本发明还可以由以下条款定义：
1.一种在含非微生物细胞的样品中将微生物与非微生物细胞分离的方法，所述方法包括：
a)将样品用磁性颗粒孵育以形成颗粒-微生物复合物；以及
b)使用磁场将所述颗粒-微生物复合物与所述非微生物细胞分离，其中所述磁性颗粒具有未用以下中的任何一者包覆的外聚合物表面：(i)抗体，(ii)碳水化合物，(iii)由载脂蛋白H蛋白衍生的肽，(iv)甘露糖结合凝集素蛋白，(v)多胺或(vi)阳离子去污剂。
2.一种检测还可以包含非微生物细胞的样品中是否存在微生物的方法，包括：
a)将所述样品用磁性颗粒孵育以形成颗粒-微生物复合物；
b)使用磁场将所述颗粒-微生物复合物与所述非微生物细胞分离；以及
c)检测所述颗粒-微生物复合物中是否存在微生物
其中所述磁性颗粒具有未用以下中的任何一者包覆的外聚合物表面：(i)抗体，(ii)碳水化合物，(iii)由载脂蛋白H蛋白衍生的肽，(iv)甘露糖结合凝集素蛋白，(v)多胺或(vi)阳离子去污剂。
3.条款2的方法，其中步骤(c)包括(i)检测与所述微生物相关的核酸分子的酶活性，(ii)通过细胞计数或显微术直接检测所述微生物，或(iii)细胞培养后检测所述微生物。
4.条款2或条款3的方法，其中步骤(c)包括以下步骤：
i.将所述颗粒-微生物复合物中的微生物裂解；
ii.用充当用于所述微生物的核酸修饰活性的底物的核酸分子孵育所述裂解物；以及
iii.具体确定所述底物核酸分子上的核酸修饰酶的作用产生的经修饰的核酸分子是否存在，以指示微生物是否存在。
5.条款4的方法，其中步骤(i)包括加入含有底物核酸分子的裂解试剂。
6.根据条款4或条款5的方法，其中所述核酸修饰酶包含DNA或RNA聚合酶，任选地其中所述DNA聚合酶是DNA聚合酶I。
7.根据条款4至6中任一项的方法，其中所述核酸修饰酶包括连接酶，任选地其中所述核酸修饰酶是NAD依赖性连接酶。
8.一种检测受试者中是否存在微生物感染的方法，其包括对来自受试者的样品进行条款2至7中任一项的方法。
9.前述条款中任一项的方法，其中所述方法还包括洗涤分离的颗粒-微生物复合物以除去非微生物细胞或裂解物。
10.前述条款中任一项的方法，其中在步骤(a)之前，所述方法包括选择性裂解样品中的非微生物细胞，同时保持样品中存在的微生物完整。
11.条款10的方法，其中选择性裂解样品中的非微生物细胞，同时保持样品中存在的任何微生物完整，包括向样品中加入去污剂和一种或多种酶的组合；其中所述一种或多种酶包含蛋白酶和/或DNA酶，任选地其中所述蛋白酶是蛋白酶K。
12.前述条款中任一项的方法，其中步骤(b)还包括从所述颗粒-微生物复合物中除去所述非微生物细胞。
13.前述条款中任一项的方法，其中所述样品包括血液。
14.一种用于进行条款4至13中任一项的方法的试剂盒，包含：
a)能够与微生物形成复合物的磁性颗粒，其中所述磁性颗粒的外聚合物表面未包覆有以下中的任何一者：(i)抗体，(ii)碳水化合物，(iii)由载脂蛋白H蛋白衍生的肽，(iv)甘露糖结合凝集素蛋白，(v)多胺或(vi)阳离子去污剂；以及
b)用于检测颗粒-微生物复合物中是否存在微生物的检测工具，其中所述检测工具包含充当用于所述微生物的核酸修饰活性的底物的核酸分子，且其中所述核酸分子至少部分是双链的并且在互补链中包含尿嘧啶残基。
15.条款14的试剂盒，其中所述检测工具还包括用于核酸扩增的试剂，任选地其中所述用于核酸扩增的试剂包括引物对和/或与所述核酸分子杂交的至少一种探针。
16.条款14或条款15的试剂盒，还包含能够裂解颗粒-微生物复合物中的微生物的试剂，任选地其中所述能够裂解颗粒-微生物复合物中的微生物的试剂包含充当用于所述微生物的核酸修饰活性的底物的核酸分子。
17.条款14至16中任一项的试剂盒，还包含选择性裂解样品中的非微生物细胞，同时保持样品中存在的微生物完整的试剂。
18.条款17的试剂盒，其中所述选择性裂解样品中的非微生物细胞，同时保持样品中存在的微生物完整的试剂包括去污剂和一种或多种酶的组合，其中所述一种或多种酶任选地包含蛋白酶和/或DNA酶。
19.条款14至18中任一项的试剂盒，还包含：
a)高pH试剂；以及/或
b)中和缓冲液。
20.条款14至19中任一项的试剂盒，其中所述样品包含血液。
21.条款14至20中任一项的试剂盒，其中所述核酸修饰酶包含：
a)DNA或RNA聚合酶，任选地其中所述DNA聚合酶是DNA聚合酶I；以及/或
b)连接酶，任选地其中所述连接酶是ATP和/或NAD依赖性的连接酶。
22.条款1至13中任一项的方法，或条款14至21中任一项的试剂盒，其中所述磁性颗粒是超顺磁性颗粒。
23.条款1至13或22中任一项的方法，或条款14至22中任一项的试剂盒，其中所述外聚合物表面包含聚苯乙烯。
24.条款1至13或条款22或23中任一项的方法，或条款14至23中任一项的试剂盒，其中所述磁性颗粒包含氧化铁。
25.条款1至13或条款22至24中任一项的方法，或条款14至24中任一项的试剂盒，其中所述磁性颗粒具有在0.1至0.5μm之间的直径。
26.条款1至13或条款22至25中任一项的方法，或条款14至25中任一项的试剂盒，其中所述磁性颗粒的外聚合物表面用链霉亲和素包覆。
27.条款1至13或条款22至26中任一项的方法，或条款14至26中任一项的试剂盒，其中所述磁性颗粒的外聚合物表面被羧化。
28.条款26的方法或试剂盒，其中所述磁性颗粒的外聚合物表面用链霉亲和素包覆而未用配体包覆。
29.条款1至13或条款22至27中任一项的方法，或条款14至27中任一项的试剂盒，其中所述磁性颗粒的外聚合物表面未被配体包覆。
30.条款1至13或条款22至29中任一项的方法，或条款14至29中任一项的试剂盒，其中所述微生物是病原微生物，任选地其中所述病原微生物是病原细菌或真菌。
31.条款1至13或条款22至30中任一项的方法，或条款14至30中任一项的试剂盒，其中所述非微生物细胞包括红血细胞和/或白血细胞。
附图说明
图1是血液样品的图像且显示每个样品组的血液裂解程度：E-BUF，尿素，Tris+NaCl，冷冻(从左到右)(参见实施例8)。
图2是PCR设置之前最终样品输出的图像。该图像提供SPS对在血液中带有磁珠的样品处理的益处的直观展示：SPS似乎能够更彻底地除去血液组分，如存在SPS时较少的红色洗脱液所示。注意，用于血液培养液样品组的BacTec PLUS需氧培养液还包含SPS(参见实施例9)。
针对以下非限制性实施例将理解本发明：
实验部分
缩写和定义：
5th％ 第五百分比阈值计算以确定5％FPR(式＝PERCENTILE.INC(数组，0.05))
BO 仅培养液
BB 血培养液
Cfu 菌落形成单位
确认 根据革兰氏状况针对微生物DNA的PCR多重检测(革兰氏阴性，革兰氏阳性或念珠菌)
CPD 柠檬酸磷酸葡萄糖
Ct 循环阈值
CV 临界值(cfu)：基于cfu值和ΔCt的理论检出限值，使用式：样品cfu÷2ΔCt
D1.. 稀释点(10倍系列)
E*cfu 使用稀释系列中最高可计数TVC的稀释点外推的cfu值
EC 大肠杆菌
ETGA 酶模板产生和扩增
IPC 内部过程控制：LM中存在PCR模板，以展示正确的样品处理并验证ETGA阴性样品中的PCR扩增
LAWN 融合微生物生长
LM 包含去污剂和微生物裂解酶的混合物的微生物裂解混合物
MM 主体混合物(Master Mix)
无Ct 50次循环后，没有超过阈值荧光的扩增
NSC 无掺入物(Spike)对照
O/n 过夜
PC 聚合酶-掺入物对照
PCR 聚合酶链反应
Pt 根据NSC/NC结果计算的正性阈值
qPCR 定量聚合酶链反应
RT 室温(+19至+20℃)
s/n 上清液
SPS 聚茴香脑磺酸钠
TNTC 多到难以计数
TVC 总可行计数
WB 洗涤缓冲液(包含Tris-HCl+氯化钠+Igepal+脱氧胆酸钠+Tergitol，除非另有说明)；或其中注明的全血。
ΔCt 两个Ct值之间的差(通常为NSC Ct-阳性样品Ct)
实施例1
以手动形式，两种珠类型(Merck Bio-Estapor(链霉亲和素缀合的)300nm珠(产品-BE-M08/03；“Bio-Estapor”)和ademtech Bio-Adembeads Streptavidin Plus 200nm珠(产品编号03222；“Bio-Ademtech”))与ApoH Technologies Peps6珠(参考-MP20006；“ApoHPeps6”)进行比较。
在实验1A中，比较等分的Bio-Estapor珠(25uL)和等分的ApoH Pep6珠(10uL)的结合。Bio-Estapor的体积越大，表明与ApoH材料相比在提供的材料中每毫升珠的数量越少。测试三种生物：大肠杆菌(革兰氏阴性细菌)、表皮葡萄球菌(革兰氏阳性细菌)和白色念珠菌(酵母)。0.5mL生物体悬浮液暴露于在ApoH Peps6试剂盒(“Peps6 Captobac”，参考MP10031-50T)中提供的0.5mL“TTGB”微生物结合缓冲液中的磁珠。
在使生物体结合30min后，通过施加磁场浓缩珠并用移液管除去上清液，将珠样品与液体上清液分离。用三等分的洗涤缓冲液(50mM Tris pH 8，1％v/v Igepal CA-630，150mM NaCl，0.25％v/v Tergitol 15-S-9)轻轻洗涤珠，且保留的上清液和洗涤的珠通过两种方法分析活生物体；琼脂培养皿上的菌落计数和通过酶促模板生成和扩增(ETGA)测试检测微生物DNA(如Zweitzig等人，2012，可对活菌进行灵敏、定量和通用检测的新型DNA聚合酶活性测定的表征，核酸研究40，14，e109，1-12；以及WO2011/130584、WO2013/103744和WO2016/005768所述)。
表1A中的板计数表明，对于Bio-Estapor珠和大肠杆菌，从珠(33CFU)与上清液(2CFU)发现大部分的生长，且这与ApoH Peps6的结果类似。对于表皮葡萄球菌未发现生长，且该微生物似乎在原始培养液中未生长。对于Bio-Estapor和ApoH Peps6二者，白色念珠菌显示上清液中约10％的CFU和90％结合。这些结果表明，在测试条件下，Bio-Estapor珠似乎在与商购的生物体结合珠Peps6相当的比率下结合生物体。灵敏的ETGA测试支持该结果，但表明表皮葡萄球菌与Peps6相比更好地结合到Bio-Estapor，如通过较低的Cq值所示。
表1A
实验1B展示在与实验1A类似的条件下大肠杆菌的结合，尽管在1B中省略了洗涤步骤。实验1B表明，另一种珠Bio-Ademtech也结合生物体，尽管以较低水平(参见表1B)。此处，板计数表明约三分之一的活计数已经结合到珠。更加灵敏的ETGA DNA聚合酶测定表明，一半的生物体保留在珠上，因为珠和上清液的Cq大致相等。
表1B
实施例2
在实验2中，比较具有羧化表面的ApoH Peps6、Bio-Estapor和Estapor珠(产品MI-030/40；“Estapor COOH”)。使用荧光ATP测定法(BacTiter-Glo微生物细胞活力测定法；Promega Corporation，G8230)测量大肠杆菌与珠结合30min后上清液中保留的生物体数量。尽管这是一种间接测试，因为它不能直接检测珠上存在生物体，但它对于基于配体的珠(ApoH Peps6)和本发明的非配体珠(Bio-Estapor和Estapor COOH)是有用的可比测试。在针对来自磷酸盐盐水缓冲液的30mL结合1mL 104CFU/mL大肠杆菌后，使用BacTiter-Glo测定法测定上清液的等分试样的ATP，作为生物体含量的量度。表2中的结果表明，使用此技术测量时，Peps6珠、Bio-Estapor和Estapor COOH的上清液中生物体水平的降低分别为33％、27％和24％。
表2
实施例3
实施例3显示在通过自动化实施例1中所述的磁性分离的方法进行的稀释系列中测试大肠杆菌(EC)、金黄色葡萄球菌(SA)和白色念珠菌(CA)的结果。该测定法使用直径300nm的Bio-Estapor珠作为具有含有0.25％Tergitol的TTGB的结合缓冲液的捕获介质。由于将三种生物体各自稀释10倍，因此记录Ct的连续变化，从而构建了剂量响应曲线。
表3
以下实施例说明了在Momentum’s Magnitor测试中通过磁珠对微生物的普遍微生物捕获。Magnitor测试包括两个微生物检测读数：
·ETGA：检测来自完整微生物细胞的微生物聚合酶
·确认：根据革兰氏状态(革兰氏阴性，革兰氏阳性或念珠菌)检测微生物DNA
主要发现：
·磁珠从简单的缓冲液和各种复杂的生物样本类型中捕获细菌和真菌
·使用多种不同珠尺寸(直径0.2至1.5μm珠)和表面涂层(例如羧化，疏水，胺化等)进行微生物捕获
某些结合缓冲液组分可以改进Magnitor测定法中的微生物检测，例如基于去污剂的血液裂解。
实施例4：微生物的检测取决于磁珠的捕获
目标：
在简单的Tris+NaCl缓冲液(pH用生理食盐浓缩液缓冲以防止仅在水中可以发生的微生物渗透性休克)中评估大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的微生物结合性能。在该实验中还包括“无珠对照”样品组，以证明检测取决于用于微生物捕获的磁珠的存在。
磁珠制备：
Estapor珠(Merck，Cat#M1-30/40)在1X Tris+NaCl缓冲液中洗涤3x 1mL：40μL珠重悬于最终体积400μL 1X Tris+NaCl缓冲液(1％固含量)
方案：
·微生物过夜液体培养物(o/n)设置为BacTec PLUS需氧培养液中的标准物(从琼脂板接种3mL培养液)。第二天(约16小时后)将1.88μL大肠杆菌和金黄色葡萄球菌液体培养物加入到3mL培养液中，且将18.75μL白色念珠菌液体培养物加入到3mL培养液中；且在37℃、500rpm下进行2小时增生。
·在2小时增生后，在1X Tris+NaCl缓冲液(50mM Tris-HCl[pH8.0]+150mM NaCl)中稀释微生物预培养物(DF10)以为每种微生物产生四个稀释点。
·对每种微生物稀释液进行100μL TVC
使用DynaMag-2磁体和手动液体传输进行Magnitor的手动模拟：
·将1mL样品加入到装有15μL预洗珠的2mL管中-注意，未将112μL 1X Tris+NaCl缓冲液加入到带珠的管中(根据标准方案)，因为所有微生物样品均在相同的1X缓冲液中稀释。
·在37℃下摇动30min(1000rpm)
·对DynaMag-2磁化5min
·除去所有s/n
·在RT(1000rpm)下加入1mL洗涤缓冲液(WB)并将管混合2min
·对Dynmag-2磁化3min
·除去所有s/n
·将50μL裂解混合物(LM)加入到离磁体的管中(向每个PC样品管中加入5μL聚合酶对照物(PC))
·进行ETGA反应：在26℃下在1000rpm下5min，然后在800rpm下55min
·用于ETGA的手动qPCR设置和确认(10μL反应)
结果：
TVC(COL/SAB琼脂板)
*E cfu/mL值由最高可计数的TVC板推导
ETGA Ct
内部过程控制(IPC)Ct
ETGA△Ct(平均NSC)
基于平均NSC的临界值(cfu/mL)
确认Ct
正阈值(Pt)≤40Ct
分析：
·“(+)珠”样品的Magnitor结果显示所有三种微生物种类都具有非常强的细胞密度特异性ETGA和确认信号，表明了多种微生物组(GrNeg，GrPos，念珠菌)的珠特异性结合。
·注意念珠菌的结果可能遵循了更好的细胞密度趋势，但是液体培养物粒化相当大，可能影响系列稀释液的质量
·“(-)珠”对照中有一些微生物细胞残留的证据，但这仅需单个洗涤步骤即可预测。
实施例5：通过磁珠从血液中捕获微生物发生在简单和复杂的血液裂解缓冲液中，
并使得微生物检测与通过离心捕获可比
目标：
比较用于开发简单且快速的“快速Magnitor”测试(方案中未包含洗涤步骤)的两种不同稀释模式的两种不同血液裂解缓冲液。
测试条件：
·2X EBB 1mL 2X EBB+1mL样本
·10X EBB 112μL 10X EBB+1mL样本
·2X B-BUF 1mL 2X B-BUF+1mL样本
·10X B-BUF 112μL 10X B-BUF+1mL样本
·10X EBB:500mM Tris-HCl[pH 8.0]+2.5％Tergitol
·10X B-BUF:500mM Tris-HCl[pH 8.0]+1.5M氯化钠+10％Igepal+5％脱氧胆酸钠+2.5％Tergitol
样品设置：
·将大肠杆菌o/n液体培养物1E-3稀释液加到血培养液中(每mL6.25μL o/n：244μL o/n+39mL血培养液)，且在37℃、500rpm下在摇动培养器中进行60分钟增生
·在2小时增生后，通过将1ml样本加入到装有缓冲液(和15μL用于磁珠样品组的BioEstapor珠(Merck，Cat#BE-M 08/0.3))的2mL管中产生样品：每个测试条件一式三份大肠杆菌(EC)和无掺入物对照(NSC)样品
·对NSC和大肠杆菌进行100μL TVC(包括将样本稀释以确保可计数的板)
方案：
如上设置样品，并立即进行旋转或磁珠方案
旋转方案
·样品在9000xg下离心3min(管铰链朝外以追溯丸粒)
·除去上清液
·向样品中加入50μL LM(约10倍移液器混合物以重悬沉淀)
·将样品在900rpm下放置在振荡培养器中5min，且然后在800rpm下55min(26℃)
·在qPCR设置之前，将样品在17000xg下离心1分钟
磁珠方案
·将样品在900rpm下放置在振荡培养器中30min(37℃)
·将样品放置在DynaMag-2磁力架上5min，且然后除去上清液
·向样品中加入50μL LM(约10倍移液器混合物以重悬沉淀)
·将样品在900rpm下放置在振荡培养器中5min，且然后在800rpm下55min(26℃)
·在qPCR设置之前将样品磁化3min
仅针对ETGA主体混合物的手动qPCR设置(10μL反应)
结果：
cfu计算
样品和样品稀释液涂板在COL板上(100μL)
样品来源
ETGA
Ct
汇总数据
分析：
·通过磁珠结合微生物发生在：
ο简单和复杂的血液裂解缓冲液(EBB＝Tris-HCl+Tergitol；B-BUF＝Tris-HCl+氯化钠+Igepal+脱氧胆酸钠+Tergitol)，但是血液衍生的测试信号取决于血液裂解缓冲液组分变化
ο稀释(2X缓冲液：1份血液裂解缓冲液到1份样本)和浓缩(10X缓冲液：1份血液裂解缓冲液到9份样本)样品形式
此外，用于通过磁珠捕获微生物的微生物检测信号与通过离心捕获可比。
实施例6：通过磁珠从血液中捕获微生物不依赖于血液裂解，但是当在裂解血液中
发生微生物结合时下游微生物检测得到改进
目标：
鉴于最近发现多种珠类型/尺寸对微生物系列稀释液和NSC产生类似的Magnitor结果，人们认为Momentum结合缓冲液内的组分可能正在介导/促进这种观察到的普遍微生物结合特性。为了研究这种可能性，对大肠杆菌进行一系列稀释，将标准结合缓冲液(B-BUF)与仅由Tris-HCl[pH8.0]+NaCl组成的无去污剂B-BUF比较，以测试去污剂是否通常对微生物的结合很重要。为血培养液、纯培养液和仅在1X结合缓冲液中制备样品组以比较不同样本类型的结果。
制备：
100mL 10X结合缓冲液新鲜制备：
·B-BUF：500mM Tris-HCl[pH 8.0]+1.5M氯化钠+10％Igepal+5％脱氧胆酸钠+2.5％Tergitol
·Tris+NaCl：500mM Tris-HCl[pH 8.0]+1.5M氯化钠
Estapor珠(Merck，Cat#M1-30/40)在各自的1X缓冲液(稀释的10X B-BUF或10XTris+NaCl)中洗涤3x 1mL：40μL珠重悬于最终体积400μL 1X缓冲液(1％固含量)
方案：
·将大肠杆菌过夜液体培养物设置作为在BacTec PLUS需氧培养液中的标准物，然后在第二天(约16小时后)将1.88μL o/n加入到3mL培养液(相当于以6.25μL/mL加入到培养液中的EC 1E-1稀释液)，且在37℃、500rpm下进行2小时增生。
·在2小时增生后，在预热的血培养液(BB)、纯培养液(BO)或1X缓冲液(B-BUF或Tris+NaCl)中将大肠杆菌预培养物连续稀释(DF10)至EC 1E-6。
·对所有大肠杆菌稀释液和NSC进行100μL TVC
使用DynaMag-2磁体和手动液体传输进行Magnitor的手动模拟：
·将1mL样品加入到装有112μL结合缓冲液(B-BUF或Tris+NaCl：BB和BO样品组为10X；以及缓冲液样品组为1X)+15μL珠(在相应的缓冲液中预洗)的2mL管中
·在37℃下摇动30min(1000rpm)
·对DynaMag-2磁化5min
·除去所有s/n
·在RT(1000rpm)下加入1mL WB并将管混合2min
·对Dynmag-2磁化5min
·除去所有s/n
·将50μL LM加入到离磁体的管中(向每个PC样本管中加入5μL聚合酶对照物(PC))
·进行ETGA反应：在26℃下在1000rpm下5min，然后在800rpm下55min
·用于ETGA的手动qPCR设置和确认(10μL反应)
观察结果：
·如预期的，未观察到Tris+NaCl的血液裂解
·在不存在去污剂的情况下，珠更粒状/团聚
结果：
*Cfu/mL值从最高可计数的TVC外推
ETGA Ct
IPC Ct
ETGA△Ct(平均NSC)
基于平均NSC的临界值(cfu/mL)
确认GrNeR
Ct
正阈值(Pt)≤40Ct；*假阳性
分析：
·去污剂对于在血液的存在下产生良好的ETGA结果很重要(如通过“10X Tris+NaCl与BB”的较差ETGA结果指示)，但是在不存在血液裂解的情况下，微生物捕获/检测仍然很明显(如通过“10X Tris+NaCl与BB”样品组的结果证明)。
·在不存在血液的情况下良好的ETGA结果，表明去污剂作为结合缓冲液的组分对于大肠杆菌与珠的结合不是必需的
·在“10X Tris+NaCl与1X Tris+NaCl”样品组中良好的ETGA结果证明对于微生物结合不需要血液和/或培养液中的生物组分。
·有趣的是，在10X B-BUF与BO和1X B-BUF样品组中B-BUF似乎对ETGA信号有轻微的抑制，但其他地方的最新工作表明脱氧胆酸钠对测定有一定的抑制，因此观察结果并非意外
·确认在“10X Tris+NaCl与1X Tris+NaCl”样品组中表现最佳。所有其他类似的样品组也产生类似的确认GrNeg结果。
·如可以预期，IPC信号被血液的存在稍微抑制。
·这些结果表明，去污剂或生物样品均不是大肠杆菌的微生物结合介体。
实施例7：在不存在血液的情况下，无论是任何pH缓冲或用盐渗透稳定，都会发生
通过磁珠捕获微生物
目标：
为了进一步研究Momentum结合缓冲液在介导微生物结合中的重要性，在干净的系统中(即在不存在任何血液或培养液的情况下)研究了pH缓冲和盐对结合的影响。
10X缓冲液制备：
25mL缓冲液各自新鲜制备：
·BUF-1 500mM Tris-HCl[pH7.4]+1.5M NaCl
·BUF-2 500mM Tris-HCl[pH8.0]+1.5M NaCl
·BUF-3 500mM Tris-HCl[pH8.5]+1.5M NaCl
·BUF-4仅500mM Tris-HCl[pH8.0]
·BUF-5仅1.5M NaCl
·BUF-6仅水
Estapor珠(Merck，Cat M1-30/40)在各自的1X缓冲液(稀释的10X缓冲液)中洗涤3x 1mL：30μL珠重悬于最终体积300μL 1X缓冲液(1％固含量)
方案：
·大肠杆菌o/n液体培养物设置为BacTec PLUS需氧培养液(包含SPS)和营养培养液(不含SPS的NB)中的标准物，然后在第二天(约16小时后)对于每种培养液类型(早晨为NB而下午为PLUS培养液)将1.88μL o/n加入到3mL培养液(相当于以6.25μL/mL加入到培养液中的EC 1E-1稀释液)，且在37℃、500rpm下进行2小时增生孵育。
·对于每个实验(NB和PLUS)，在每个1X缓冲液(BUF-1至BUF-6)中将1E-1大肠杆菌预培养物稀释至大肠杆菌1E-6(DF10)。
·使用在相关培养液(NB或PLUS培养液)中进行的单独的EC稀释液组进行100μLTVC，以防止由不同1X缓冲液导致的板活力不一致
使用DynaMag-2磁体和手动液体传输进行Magnitor的手动模拟：
·将1mL样品加入到装有112μL相应的1X缓冲液+15μL珠(在相应的缓冲液中预洗)的2mL管中
·在37℃下摇动30min(1000rpm)
·对DynaMag-2磁化5min
·除去所有s/n
·在RT(1000rpm)下加入1mL WB并将管混合2min
·对Dynmag-2磁化5min
·除去所有s/n
·将50μL LM加入到离磁体的管中
·进行ETGA反应：在26℃下在1000rpm下5min，然后在800rpm下55min
·用于ETGA的手动qPCR设置和确认(10μL反应)
结果：
NB数据集(即无SPS)-早上实验
所有缓冲液(BUF-1至6)NC TVCs＝0
正阈值(Pt)≤40Ct
PLUS数据集(即具有SPS)-下午实验
所有缓冲液(BUF-1至6)NC TVCs＝0
正阈值(Pt)≤40Ct
分析：
·所有缓冲液(仅包括水)同样表现出对大肠杆菌的良好捕获(如通过类似的ETGA和确认结果所示)-然而，存在仅在水中(BUF-6)在较低细胞密度下，渗透性微生物裂解的一些迹象
·对于所有测试缓冲液，PLUS培养液和NB生长的大肠杆菌均产生非常类似的Magnitor结果，表明SPS在介导大肠杆菌的微生物结合中没有明显作用
·这些结果表明，没有缓冲液组分对于大肠杆菌与Estapor(羧化)珠的结合是必需的
实施例8：可以使用多种不同的血液裂解方法通过磁珠从血液中捕获微生物
目标：
确定采用可替代的血液裂解方法时是否可以发生微生物捕获和检测。
制备：
结合缓冲液如下制备：
·E-BUF＝500mM Tris-HCl[pH 8.0]+1.5M氯化钠+10％Igepal+2.5％Tergitol
·尿素＝83mM Tris-HCl[pH 8.0]+10M尿素
·Tris+NaCl＝500mM Tris-HCl[pH 8.0]+1.5M氯化钠
在使用前将BioEstapor珠(Merck，Cat#BE-M 08/0.3)重悬。
方案：
·金黄色葡萄球菌o/n液体培养物设置为BacTec PLUS需氧培养液中的标准物，然后在第二天(约16小时后)将3.0μL o/n加入到3mL血培养液(1E-3稀释液)且在37℃、500rpm下进行4小时增生。
·在4小时增生后，将金黄色葡萄球菌预培养液在预热的血培养液中连续稀释(DF10)至1E-6。
·对所有金黄色葡萄球菌稀释液和NSC进行100μL TVC
使用DynaMag-2磁体和通过移液器手动液体转移的手动样品处理：
最初设置
·对于使用尿素的样品，将0.25mL样本加入到装有0.75mL尿素+15μL珠的2mL管中
·对于要冷冻的样品，将1mL样本加到2mL管中，然后将管在干冰上速冻5min。将样本在37℃下解冻5min，然后加入112μL Tris+NaCl+15μL珠
·对于使用E-BUF或Tris+NaCl的样品，将1mL样本加入到装有112μL结合缓冲液(E-BUF或Tris+NaCl)+15μL珠的2mL管中
处理所有样品
·在37℃下轨道混合30min(1000rpm)
·对DynaMag-2磁化5min
·除去所有s/n
·在37℃(1000rpm)下加入1mL WB且将管混合3min
·对Dynmag-2磁化5min
·除去所有s/n
·将50μL LM加入到离磁体的管中
·进行ETGA反应：在26℃下在1000rpm下5min，然后在800rpm下55min
·用于ETGA的手动qPCR设置和确认(10μL反应)
观察结果：
·观察到解冻后的冷冻样品的血液裂解(见图1)
·观察到血液裂解几乎与尿素同时
·在使用尿素处理样品期间，似乎损失一些珠
·Tris+NaCl样品组未观察到明显的血液裂解(如所预期的)
结果：
*Cfu/mL值从最高可计数的TVC外推
ETGA Ct
ETGA ACt(平均NSC)
基于平均NSC的临界值(cfu/mL)
IPC Ct
确认GrPos
Ct
正阈值(Pt)≤40Ct；*假阳性
图1显示每个样品组的血液裂解程度：E-BUF、尿素、Tris+NaCl、冷冻(左到右)
分析：
·通过磁珠捕获微生物和检测金黄色葡萄球菌与其他裂解方法可比且无血液裂解，如通过确认确定。
然而，由于对降低血液衍生的ETGA信号的影响，通过其他血液裂解方法，通过ETGA检测微生物在不同程度上得到改进。
实施例9：在全血中需要SPS获得最佳的珠性能，样品处理和微生物检测
目标：
确定使用1mL全血样品的Magnitor快速测试的最佳SPS浓度。次要目标是评估如通过TVS确定的SPS对全血中的微生物活力的影响。
测试条件：
对于每个样品组(大肠杆菌和NSC样品)均分装2x 5mL全血或BacTec PLUS需氧血培养液(1:3比率)。然后，SPS如下加入：
然后将5μL大肠杆菌1E-2预培养物加入到每个5mL样本管中，以重新生成标准1E-5稀释样品
方案：
·在营养培养液(NB)中将1.88μL纯净的o/n加入到3mL NB中；且在37℃、500rpm下孵育2小时
·2小时后，将大肠杆菌预培养液在温NB中稀释10倍；且然后向每5mL样本管中加入5μL(按测试条件所示制备)
·立即启动Magnitor测试，并进行TVC，如下详述。
使用DynaMag-2磁体和手动液体传输进行Magnitor的手动模拟：
·预先装载112μL E-BUF(500mM Tris-HCl[pH 8.0]+1.5M氯化钠+10％Igepal+2.5％Tergitol)+15μL珠(BioEstapor,Merck,Cat#BE-M 08/0.3)到每个样品管中，然后将1mL样本加入到样品管
·在37℃下轨道混合30min(1000rpm)
·对DynaMag-2磁化5min
·除去所有s/n
·在RT(1000rpm)下加入1mL WB且将管混合3min
·对Dynmag-2磁化5min
·除去所有s/n
·将50μL LM加入到离磁体的管中
·进行ETGA反应：在26℃下在1000rpm下5min，然后在800rpm下55min
·用于ETGA的手动qPCR设置和确认(10μL反应)
结果：
TVC分析
·零时在COL板上100μL
·样品约含2mL样品，在室温(20.4℃)下搁在工作台上(静态)
·在表中所示时间点进行TVC：在涂板前将样品充分混合
在零时进行的Magnitor快速测试
ETGA结果
注意：无Ct改变到50Ct用于分析；*排除离群值，由于在加工期间显著的丸粒损失
IPC结果
确认GrNeg结果
分析：
·SPS表明基于TVC测定在全血中提供微生物保护/活力的益处；但通常，全血中大肠杆菌活力没有大的问题
·结合SPS改善ETGA和确认读数二者的样品处理效率和微生物检测性能
·0.06％的SPS产生基于TVC的活力、ETGA检测(考虑大肠杆菌和NSC样品Cts的最佳结果)、如通过IPC Ct值指示的PCR抑制的最佳结果。确认GrNeg结果通过加入全血中的SPS还可以得到改进，但是SPS的确切浓度并不那么关键。
实施例10：使用类似尺寸(～300nm直径)的各种可商购的羧化珠产品通过磁珠从
血液中捕获微生物
目标：
使用Momentum’s Magnitor测定比较类似尺寸的可替代的羧化磁珠
测试条件：
方案：
大肠杆菌和化脓性链球菌o/n液体培养物设置为3mL培养液和血培养液(BacTecPLUS需氧)中的标准物，且孵育16-20小时(37℃)
第二天：
·将大肠杆菌液体培养物在血培养液中稀释至1E-3，且然后掺入血培养液中(每毫升血培养液6.25μL)；且预孵育1h 30min(37℃)
·化脓性链球菌液体培养物在血培养液中稀释至1E-1，且然后掺入血培养液中(每毫升血培养液6.25μL)；且预孵育2h 30min(37℃)
早晨进行的大肠杆菌实验
·大肠杆菌1E-3预培养物在血培养液中连续稀释以产生5个稀释点(1E-3至1E-7)
·样品通过向预先装有15μl 1％固体珠+112μL结合缓冲液的2mL管中加入1mL样本设置；且进行Magnitor V4.0测试：每种珠类型5个稀释点+3个NSC(8个样品组)，每种epMotion 5073m上测试三种珠类型
下午进行化脓性链球菌实验
·化脓性链球菌1E-3预培养物在血培养液中连续稀释以产生5个稀释点(1E-1至1E-5)
·样品通过向预先装有15μl 1％固体珠+112μL结合缓冲液的2mL管中加入1mL样本设置；且进行Magnitor V4.0测试：每种珠类型5个稀释点+3个NSC(8个样品组)，每种epMotion 5073m上测试三种珠类型
Magnitor V4.0方案(epMotion 5073m的自动样品处理)
·在37℃下轨道混合30min(1000rpm)
·磁化15min
·除去1mL s/n
·将0.82mL WB加入到管中，同时珠磁化
·除去1mL s/n
·将50μL LM加入到管中，同时珠磁化
·关闭磁化并进行ETGA反应：在26℃下在1000rpm下5min，然后在800rpm下55min
·ETGA的qPCR设置和确认(10μL反应)
结果：
针对每种珠类型使用NSC(n＝6)计算的内部正阈值(Pt)：式＝PERCENTILE.INC(数组，0.05)
注意，Pt(5th％)方法将在n＝6内产生一个假阳性：在下面的主要结果表内以红色字体突出显示
大肠杆菌
确认正阈值(Pt)≤40Ct；假阳性+。
化脓性链球菌
确认正阈值(Pt)≤40Ct；假阳性+。
观察结果：
·珠B在稀释至1％固含量之前很难重悬；且稀释至1％固体后，视觉上看起来更稀
·在处理结束时，将样品放置在DynaMag-2磁力架上，且除以下以外所有珠类型C-G都被磁化：看起来具有重丸粒的珠A；以及具有非常小珠丸粒的珠B
分析：
此处测试的所有羧化磁珠均表现出微生物结合，如通过ETGA和确认读数确定。然而，微生物检测的灵敏度确实稍微有所不同，这取决于血液衍生的ETGA信号的水平和/或测定抑制
实施例11：使用各种不同的珠尺寸和功能性涂层，通过磁珠从血液中捕获微生物
目标：
使用Momentum’Magnitor测试(ETGA和确认技术)，比较不同尺寸和功能性涂层的各种可商购磁珠的微生物捕获性能。进行两个实验，以证明自动(方案1)和手动(方案2)样品处理的微生物捕获。重要的是，方案2包括三次珠重悬洗涤，以更令人信服地证明ETGA/确认信号特定于结合珠的微生物细胞，而不是样品残留(与方案1相反，方案1包括单个珠磁化的洗涤步骤)。
测试条件：
所有珠在1mL 1X E-BUF(50mM Tris-HCl[pH 8.0]+150mM氯化钠+1％Igepal+0.25％Tergitol)中洗涤，并重悬于1X E-BUF中的1％固体样品设置(分别针对在不同日期进行的方案1和方案2进行)：
·大肠杆菌o/n液体培养物设置为3mL培养液(BacTec PLUS需氧)中的标准物，且孵育16-20小时(37℃)
·第二天，将大肠杆菌液体培养物在血培养液中稀释至1E-3，并进行2小时增生孵育(37℃@500rpm)
·在2小时增生孵育后，将大肠杆菌1E-3预培养物在血培养液中连续稀释以产生三个稀释点(EC 1E-6至1E-8)
·将1mL样本(3个大肠杆菌稀释液和3个NSC样品：6个样品组)加入到预先装有112μL 10X E-BUF(500mM Tris-HCl[pH 8.0]+1.5M氯化钠+10％Igepal+2.5％Tergitol)+15μL珠(1％固体)的2mL管中，然后根据方案1或方案2进行Magnitor测试(见下文)：
方案1(epMotion 5073m的自动样品处理)：
·在37℃下轨道混合30min(1000rpm)
·磁化15min
·除去1mL s/n
·将0.82mL WB加入到管中，同时珠磁化
·除去1mL s/n
·将50μL LM加入到管中，同时珠磁化
·关闭磁化并进行ETGA反应：在26℃下在1000rpm下5min，然后在800rpm下55min
·ETGA的qPCR设置和确认(10μL反应)
方案2(使用DynaMag-2磁体和通过移液器手动液体转移的手动样品处理)：
·在37℃下轨道混合30min(1000rpm)
·对DynaMag-2磁化5min
·除去所有s/n
·在RT(1000rpm)下加入1mL WB并将管混合2min
·对Dynmag-2磁化5min
·除去所有s/n
·在RT(1000rpm)下加入1mL WB并将管混合2min
·对Dynmag-2磁化5min
·除去所有s/n
·在RT(1000rpm)下加入1mL WB并将管混合2min
·对Dynmag-2磁化5min
·除去所有s/n
·将50μL LM加入到离磁体的管中
·进行ETGA反应：在26℃下在1000rpm下5min，然后在800rpm下55min
·用于ETGA的手动qPCR设置和确认(10μL反应)
结果：
方案1(epMotion 5073m的自动样品处理)-在20190221进行
正阈值(Pt)≤40Ct；假阳性+。
方案2(使用DynaMag-2磁体和通过移液器手动液体转移的手动样品处理)-在20190228进行
正阈值(Pt)≤40Ct；假阳性+。
分析：
这些结果表明，各种不同的珠尺寸和功能性涂层均可产生可比水平的微生物结合，如通过ETGA和确认读数确定。
实施例12：可以使用不同尺寸和功能性涂层的磁珠从血液中捕获各种微生物(革
兰氏阴性，革兰氏阳性和念珠菌)
目标：
使用Momentum’Magnitor测试(ETGA和确认技术)，比较不同尺寸和功能性涂层的各种可商购磁珠的微生物捕获性能。先前已测试大肠杆菌(珠尺寸和涂层I：来源实验：20190221_WP7_珠-比较_分析和20190228_WP7_珠-比较-3-洗涤_分析)：为扩展此先前的工作，还测试另外三种微生物(金黄色葡萄球菌，肺炎链球菌和白色念珠菌)。
测试条件：
所有珠均在1mL 1X Tris+NaCl中洗涤且重悬至1X Tris+NaCl中的1％固体
方案：
样品设置：
·微生物过夜液体培养物(o/n)(从琼脂板接种3mL培养液)设置在BacTec PLUS需氧培养液中。第二天(约16小时后)，将300μL肺炎链球菌和白色念珠菌液体培养物接种于3mL血培养液(1E-1稀释)中，并将3μL金黄色葡萄球菌液体培养物接种于3mL血培养液(1E-3稀释)；且在37℃、500rpm下进行2小时增生。
·在2小时增生后，将微生物预培养物在血培养液中稀释(DF10)，以为每种微生物产生三个稀释点。
·对每种微生物稀释液进行100μL TVC
使用DynaMag-2磁体和手动液体传输进行Magnitor的手动模拟：
·将1mL样本(每种微生物种类3个稀释液和3个NSC样品：12个样品组)加入到预先装有15μL珠(1％固体)和112μL E-BUF(500mM Tris-HCl[pH 8.0]+1.5M氯化钠+10％Igepal+2.5％Tergitol)的2mL样品管中
·在37℃下轨道混合30min(1000rpm)
·对DynaMag-2磁化5min
·除去所有s/n
·在RT(1000rpm)下加入1mL WB，并将管混合3min
·对Dynmag-2磁化5min
·除去所有s/n
·将50μL LM加入到离磁体的管中
·进行ETGA反应：在26℃下在1000rpm下5min，然后在800rpm下55min
·用于ETGA的手动qPCR设置和确认(10μL反应)
结果：
正阈值(Pt)≤40Ct；*假阳性
分析：
·这些结果表明，各种不同珠尺寸和功能性涂层产生可比水平的微生物结合，如通过ETGA和确认读数确定。
实施例13：不同尺寸和功能性涂层的磁珠可用于从简单的Tris+NaCl缓冲液中捕
获各种微生物(革兰氏阴性，革兰氏阳性和念珠菌)
目标：
使用Momentum’Magnitor测试(ETGA和确认技术)，比较不同尺寸和功能性涂层的各种可商购磁珠的微生物捕获性能。使用简单的缓冲液(50mM Tris-HCl[pH 8.0]+150mMNaCl)作为样本和洗涤缓冲液进行实验，即在加入微生物裂解混合物之前不使用去污剂。
测试条件：
所有珠均在1mL 1X Tris+NaCl(50mM Tris-HCl[pH 8.0]+150mM NaCl)中洗涤，并重悬至1X Tris+NaCl中的1％固体
方案：
样品设置：
·微生物过夜液体培养物(o/n)(从琼脂板接种3mL培养液)设置在BacTec PLUS需氧培养液中。第二天(约16小时后)，将3μL大肠杆菌和金黄色葡萄球菌液体培养物接种到3mL培养液(1E-3稀释液)中，且将300μL白色念珠菌液体培养物接种在3mL培养液(1E-1稀释液)中；在37℃、500rpm下进行2小时增生。
·在2小时增生后，将微生物预培养物在1X Tris+NaCl缓冲液中稀释(DF10)，以为每种微生物产生三个稀释点。
·对每种微生物稀释液进行100μL TVC
使用DynaMag-2磁体和手动液体传输进行Magnitor的手动模拟：
·将1mL样本(每种微生物种类3个稀释液和3个NSC样品：12个样品组)加入到预先装有15μL珠(1％固体)的2mL样本管中
·在37℃下轨道混合30min(1000rpm)
·对DynaMag-2磁化5min
·除去所有s/n
·在RT(1000rpm)下加入1mL WB(1X Tris+NaCl)，并将管混合3min
·对Dynmag-2磁化5min
·除去所有s/n
·将50μL LM加入到离磁体的管中
·进行ETGA反应：在26℃下在1000rpm下5min，然后在800rpm下55min
·用于ETGA的手动qPCR设置和确认(10μL反应)
结果：
正阈值(Pt)≤40Ct；假阳性以红色字体显示
分析：
·这些结果表明，在干净的系统(即简单的Tris+NaCl缓冲液代替生物样本)中，各种不同的珠尺寸和功能性表面(羧化和疏水性)均产生可比水平的微生物结合，如通过ETGA和确认读数确定。
·有趣的是，胺化珠(NH2-1.5)在样本类型中产生非常差的Magnitor结果，表明微生物结合很少/没有。该观察结果与血培养液样本中的情况不同，在后者中，胺化珠产生与其他测试珠相当水平的微生物捕获。
实施例14：不同尺寸和功能性涂层的磁珠可用于捕获各种微生物(革兰氏阴性，革
兰氏阳性和念珠菌)
目标：
使用Momentum’Magnitor测试(ETGA和确认技术)，在不存在血液裂解的情况下(即结合缓冲液中无去污剂)，比较不同尺寸和功能性涂层的各种可商购磁珠的微生物捕获性能
测试条件：
所有珠均在1mL 1X Tris+NaCl(50mM Tris-HCl[pH 8.0]+150mM NaCl)中洗涤，并重悬至1X Tris+NaCl中的1％固体
方案：
样品设置：
·微生物过夜液体培养物(o/n)(从琼脂板接种3mL培养液)设置在BacTec PLUS需氧培养液中。第二天(约16小时后)，将3μL大肠杆菌和金黄色葡萄球菌液体培养物接种在3mL培养液(1E-3稀释液)中，且将300μL白色念珠菌液体培养物接种在3mL培养液(1E-1稀释液)中；且在37℃、500rpm下进行2小时增生。
·在2小时增生后，将微生物预培养物在血培养液中稀释(DF10)，以为每种微生物产生三个稀释点。
·对每种微生物稀释液均进行100μL TVC
使用DynaMag-2磁体和手动液体传输进行Magnitor的手动模拟：
·将1mL样本(每种微生物种类3个稀释液和3个NSC样品：12个样品组)加入到预先装有15μL珠(1％固体)和112μL结合缓冲液(Tris-HCl+氯化钠)的2ml样品管
·在37℃下轨道混合30min(1000rpm)
·对DynaMag-2磁化5min
·除去所有s/n
·在RT(1000rpm)下加入1mL WB且将管混合3min
·对Dynmag-2磁化5min
·除去所有s/n
·将50μL LM加入到离磁体的管中
·进行ETGA反应：在26℃下在1000rpm下5min，然后在800rpm下55min
·用于ETGA的手动qPCR设置和确认(10μL反应)
结果：
正阈值(Pt)≤40Ct；假阳性以红色字体显示
分析：
·这些结果表明，在不存在血液裂解的情况下，各种不同珠尺寸和功能性涂层都从血液中产生相当水平的微生物结合，如通过ETGA和确认读数确定
·然而，与在微生物结合期间具有血液裂解的先前实验相比，在不存在血液裂解的情况下由于NSC ETGA信号增加，通过ETGA进行的微生物检测大大减少。
实施例15：通过磁珠捕获微生物发生在各种复杂的生物样本类型中
目的：
研究使用磁珠的微生物捕获是否可用于除血液以外的其他复杂生物流体
测试条件：
注意：Tris+NaCl：50mM Tris-HCl[pH 8.0]+150mM氯化钠
方案：
·将大肠杆菌o/n液体培养物设置为BacTec PLUS需氧培养液中的标准物，然后在第二天(约16小时后)将3μL o/n加入到3mL培养液(大肠杆菌1E-3)中，且在37℃、500rpm下进行2小时的增生孵育。
·在2小时增生后，将大肠杆菌1E-3预培养物稀释以在每种样本类型中产生5个连续稀释点(大肠杆菌1E-6至1E-9)。在COL琼脂板上进行100μL TVC。
使用DynaMag-2磁体和手动液体传输进行的Magnitor的手动模拟：
·将1mL样本加入到预先装有112μL结合缓冲液(500mM Tris-HCl[pH 8.0]+1.5M氯化钠+10％Igepal+2.5％Tergitol+0.5％脱氧胆酸钠)+15μL珠(BioEstapor珠；Merck#BE-M08/03(1％固体))的2mL样品管中-注意，Tris+NaCl样品组的样品管未预先装有112μL结合缓冲液(避免加入可能会抑制再生测定的微生物生长的去污剂)
·在37℃下摇动30min(1000rpm)
·对DynaMag-2磁化5min
·除去所有s/n
·在RT(1000rpm)下加入1mL WB并将管混合3min-注意，加入1mL Tris+NaCl缓冲液代替Tris+NaCl样品组的洗涤缓冲液，以避免包含可能会抑制再生测定的微生物生长的去污剂
·对Dynmag-2磁化5min
·除去所有s/n
·将50μL LM加入到离磁体的管中-注意，将珠重悬于100μL Tris+NaCl缓冲液中以进行再生测定
·进行ETGA反应：在26℃下在1000rpm下5min，然后在800rpm下55min
·用于ETGA的手动qPCR设置和确认(10μL反应)
结果：
TVCs(COL板上100μL)
成对的Tris+NaCl样品组的再生测定
1. 100μl涂板/接种的Tris+NaCl样本-“样本”
2. 100μl微生物结合步骤后涂板/接种的上清液-“结合后”
3. 100μl洗涤步骤后涂板/接种的上清液-“洗涤后”
4. 50μl重悬于100μL Tris+NaCl缓冲液中且涂板/接种的珠(即板上的50％材料和接种到液体培养物中的50％材料)-“珠”
板和液体培养物在37℃下孵育过夜
Tris+NaCl样品组
Magnitor结果：
使用式＝PERCENTILE.INC(数组，0.05)针对每种样本类型使用NSC(n＝3)计算正阈值(Pt)
正阈值(Pt)≤40Ct
注意，念珠菌通道中没有可观察到的扩增用于确认
分析：
·这些结果表明，磁珠可用于从各种复杂的生物样本类型中捕获微生物，如通过ETGA和确认读数确定。
·再生测定表明，在结合磁珠后，大肠杆菌可以在琼脂和液体培养物上再生，如通过“珠”样品组的可观察生长确定。
实施例16：在不存在样本裂解的情况下，微生物可以从非血液样本中捕获和检测
目标：
显示使用非裂解结合缓冲液和非裂解洗涤缓冲液在乳和尿液的非血液样本中的微生物捕获和检测。
制备：
·10X Tris+NaCl结合缓冲液＝500mM Tris-HCl[pH 8.0]+1.5M氯化钠
·1X Tris+NaCl洗涤缓冲液＝10X Tris+NaCl结合缓冲液的1/10稀释液
·新鲜(人类)尿液
·半脱脂(巴氏杀菌)牛乳
在使用前将BioEstapor珠(Merck，Cat#BE-M 08/0.3)重悬。
方案：
·将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌和肺炎链球菌o/n液体培养物设置为BacTec PLUS需氧培养液中的标准物
·第二天(约16小时后)，3μL大肠杆菌和金黄色葡萄球菌o/n用于接种新鲜的3mL培养液培养物(1E-3稀释液)，且300μL白色念珠菌和肺炎链球菌用于接种新鲜的3mL培养液培养物(1E-1稀释液)；在37℃、500rpm下进行2小时增生。
·在2小时增生后，将微生物预培养物在预热的新鲜尿液和新鲜乳中连续稀释(DF10)以产生五个稀释点：大肠杆菌1E-5至1E-9；金黄色葡萄球菌1E-5至1E-9；白色念珠菌1E-2至1E-6；以及肺炎链球菌1E-2至1E-6。
·对在乳和尿液中测试的每种微生物稀释液进行100μL TVC；将用于乳和尿液的NSC涂板在三种类型的琼脂板(SAB，COL和CBA)上
·将1mL样本(每种微生物种类五个稀释液和四个NSC样品：每种样本类型24个样品)加入到预先装有112μL结合缓冲液+15μL珠(1％固体)的2mL样本管中，然后启动自动Magnitor测试。
epMotion 5073m的自动样品处理：
·在37℃下轨道混合30min(1000rpm)
·磁化15min
·除去1mL s/n
·将0.82mL WB(1X Tris+NaCl)加入到管中，同时珠磁化
·除去1mL s/n
·将50μL LM加入到管中，同时珠磁化
·关闭磁化并进行ETGA反应：在26℃下在1000rpm下5min，然后在800rpm下55min
·ETGA的qPCR设置和确认(10μL反应)
结果：
*从最高可计数TVC推断的Cfu/mL值
(注意：尿液是非无菌溶液，因此，NSC板上的菌落并不意外)
(注意：巴氏杀菌乳含有微生物，因此，NSC板上应存在菌落)
注意：巴氏杀菌乳含有细菌；这些表现为一致的ETGA Ct～22
确认Ct
正阈值(Pt)≤40Ct
分析：
·这些结果表明，在不存在样本溶解的情况下，通过磁珠捕获微生物可以替代血液(特别是尿液和乳)的其他样本，如通过ETGA和确认读数确定。
·然而，这些样本类型(特别是乳)中存在共生微生物会影响ETGA的背景信号水平并确认读数。
Claims (29)
1.一种将含有非微生物细胞的样品中的微生物与非微生物细胞分离的方法，所述方法包括：
a)将所述样品用颗粒孵育以形成颗粒-微生物复合物，其中所述孵育步骤在聚茴香脑磺酸钠和/或选择性裂解所述样品中的非微生物细胞同时保持所述样品中存在的微生物完整的试剂的存在下进行；以及
b)将所述颗粒-微生物复合物与所述非微生物细胞分离。
2.一种将含有非微生物细胞的样品中的微生物与非微生物细胞分离的方法，所述方法包括：
a)将所述样品用颗粒孵育以形成颗粒-微生物复合物；以及
b)将所述颗粒-微生物复合物与所述非微生物细胞分离；
其中所述颗粒具有未被以下中的任何一者包覆的外表面：(i)抗体，(ii)碳水化合物，(iii)由载脂蛋白H蛋白衍生的肽，(iv)甘露糖结合凝集素蛋白。
3.一种检测也包含非微生物细胞的样品中是否存在微生物的方法，所述方法包括：
a)将所述样品用颗粒孵育以形成颗粒-微生物复合物，其中所述孵育步骤在聚茴香脑磺酸钠和/或选择性裂解所述样品中的非微生物细胞同时保持所述样品中存在的微生物完整的试剂的存在下进行；
b)将所述颗粒-微生物复合物与所述非微生物细胞分离；以及
c)检测所述颗粒-微生物复合物中是否存在微生物。
4.一种检测也包含非微生物细胞的样品中是否存在微生物的方法，所述方法包括：
a)将所述样品用颗粒孵育以形成颗粒-微生物复合物；
b)将所述颗粒-微生物复合物与所述非微生物细胞分离；以及
c)检测所述颗粒-微生物复合物中是否存在微生物；
其中所述颗粒具有未被以下中的任何一者包覆的外表面：(i)抗体，(ii)碳水化合物，(iii)由载脂蛋白H蛋白衍生的肽，(iv)甘露糖结合凝集素蛋白。
5.根据权利要求2或权利要求4所述的方法，其中所述孵育步骤在聚茴香脑磺酸钠和/或选择性裂解所述样品中的非微生物细胞同时保持所述样品中存在的微生物完整的试剂的存在下进行。
6.根据权利要求3至5中任一项所述的方法，其中步骤(c)包括：(i)检测与所述微生物相关的核酸分子的酶活性，(ii)通过细胞计数或显微术直接检测所述微生物，(iii)细胞培养后检测所述微生物，(iv)通过核酸扩增检测所述微生物，或(v)通过核酸测序检测所述微生物。
7.根据权利要求3至5中任一项所述的方法，其中步骤(c)包括以下步骤：
i)将所述颗粒-微生物复合物中的所述微生物裂解；
ii)将裂解物用核酸分子孵育，所述核酸分子充当用于所述微生物的核酸修饰活性的底物；以及
iii)具体确定由所述核酸修饰酶对所述底物核酸分子的作用产生的经修饰的核酸分子是否存在，以指示所述微生物是否存在。
8.根据权利要求7所述的方法，其中步骤(i)包括加入包含所述底物核酸分子的裂解试剂。
9.根据权利要求7或权利要求8所述的方法，其中所述核酸修饰酶包括DNA或RNA聚合酶，任选地其中所述DNA聚合酶为DNA聚合酶I。
10.一种检测受试者中是否存在微生物感染的方法，所述方法包括对来自所述受试者的样品进行权利要求3至9中任一项所述的方法。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括洗涤所述分离的颗粒-微生物复合物以除去非微生物细胞或裂解物。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤b)还包括从所述颗粒-微生物复合物中除去所述非微生物细胞。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤b)使用磁场或离心进行。
14.一种组合物，所述组合物包含：
a)能够与微生物形成复合物的颗粒，其中所述颗粒具有外表面；
b)聚茴香脑磺酸钠；以及
c)至少一种选择性裂解样品中的非微生物细胞同时保持所述样品中存在的微生物完整的试剂。
15.根据权利要求14所述的组合物，其中所述组合物还包含含有非微生物细胞并且可能含有微生物细胞的样品。
16.一种用于进行权利要求1至13中任一项所述的方法的试剂盒，所述试剂盒包含：
a)能够与微生物形成复合物的颗粒，其中所述颗粒具有外表面；
b)聚茴香脑磺酸钠；以及
c)至少一种选择性裂解所述样品中的非微生物细胞同时保持所述样品中存在的微生物完整的试剂。
17.一种用于进行权利要求3至13中任一项所述的方法的试剂盒，所述试剂盒包含：
c)能够与微生物形成复合物的颗粒；
d)聚茴香脑磺酸钠；
e)至少一种选择性裂解所述样品中的非微生物细胞同时保持所述样品中存在的微生物完整的试剂；以及
f)用于检测所述颗粒-微生物复合物中是否存在微生物的检测工具，其中所述检测工具包含充当用于所述微生物的核酸修饰活性的底物的核酸分子(DNA)，并且其中所述核酸分子(DNA)至少部分是双链的并且在互补链中包含尿嘧啶残基。
18.一种用于进行权利要求4至13中任一项所述的方法的试剂盒，所述试剂盒包含：
a)能够与微生物形成复合物的颗粒，其中所述颗粒具有未被以下中的任何一者包覆的外表面：(i)抗体，(ii)碳水化合物，(iii)由载脂蛋白H蛋白衍生的肽；(iv)甘露糖结合凝集素蛋白；以及
b)用于检测所述颗粒-微生物复合物中是否存在微生物的检测工具，其中所述检测工具包含充当用于所述微生物的核酸修饰活性的底物的核酸分子(DNA)，且其中所述核酸分子(DNA)至少部分是双链的并且在互补链中包含尿嘧啶残基。
19.根据权利要求18所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包含选择性裂解所述样品中的非微生物细胞同时保持所述样品中存在的微生物完整的试剂。
20.根据权利要求14或权利要求15所述的组合物，或根据权利要求16至19中任一项所述的试剂盒，其还包含缓冲液和/或氯化钠。
21.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，根据权利要求14、15或20中任一项所述的组合物，或根据权利要求16至20中任一项所述的试剂盒，其中所述选择性裂解所述样品中的非微生物细胞同时保持所述样品中存在的微生物完整的试剂是去污剂；任选地其中所述去污剂是非离子的。
22.根据权利要求21所述的方法，根据权利要求21所述的组合物或根据权利要求21所述的试剂盒，其中所述去污剂不与能够与微生物形成复合物的颗粒缀合。
23.根据权利要求1至13、21或22中任一项所述的方法，根据权利要求14、15或20至22中任一项所述的组合物，或根据权利要求16至22中任一项所述的试剂盒，其中所述颗粒具有在0.1μm与2.0μm之间的直径。
24.根据权利要求1至13或21至23中任一项所述的方法，根据权利要求14、15或20至23中任一项所述的组合物，或根据权利要求16至23中任一项所述的试剂盒，其中所述颗粒是磁性的，任选地其中所述颗粒是超顺磁性的。
25.根据权利要求1至13或21至24中任一项所述的方法，根据权利要求14、15或20至24中任一项所述的组合物，或根据权利要求16至24中任一项所述的试剂盒，其中所述能够与微生物形成复合物的颗粒的外表面包含聚合物，任选地其中所述聚合物是碳基的。
26.根据权利要求1至13或21至25中任一项所述的方法，根据权利要求14、15或20至25中任一项所述的组合物，或根据权利要求16至25中任一项所述的试剂盒，其中所述能够与微生物形成复合物的颗粒的外表面包含或包覆有以下中的任何一者或多者：
i)羧酸基团；
ii)氨基；
iii)疏水基团；以及
iv)链霉亲和素。
27.根据权利要求1至13或21至26中任一项所述的方法，根据权利要求14、15或20至26中任一项所述的组合物，或根据权利要求16至26中任一项所述的试剂盒，其中所述微生物是病原微生物，任选地其中所述病原微生物是病原细菌或真菌。
28.根据权利要求1至13或21至27中任一项所述的方法，根据权利要求14、15或20至27中任一项所述的组合物，或根据权利要求16至27中任一项所述的试剂盒，其中所述非微生物细胞包括红血细胞和/或白血细胞。
29.根据权利要求1至13或21至28中任一项所述的方法，根据权利要求14、15或20至28中任一项所述的组合物，或根据权利要求16至28中任一项所述的试剂盒，其中所述样品包括血液、尿液、唾液或乳，任选地其中所述样品包括全血。
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