KR0148265B1 - 자가-지속 서열 복제 시스템 - Google Patents

Abstract

내용 없음.

Description

[발명의 명칭]

자가-지속 서열 복제 시스템

[관련 출원]

1987년 6월 19일 출원된 미합중국 특허 출원 일련 번호 제07/064141호, 및 1988년 6월 6일에 출원되고 PCT 국제 공개 WO 88/10315호로서 발간된 이의 계속 출원 미합중국 일련 번호 제07/202978호가 본원에서 참고로 인용된다.

[발명 분야]

본 발명은 일반적으로 분자 생물학 및 재조합체 DNA 기술에 있어서의 진보에 관련된다.

보다 특히, 본 발명은 시험관내 또는 생체밖의 세팅에서 생물학적 샘플내 타겟(target) 핵산 서열, 또는 상응하는 타겟 DNA 서열로부터 외삽된 RNA 서열 및 RNA (DNA) 서열이 암호화하는 상응하는 폴리펩타이드(추론에 의함)의 존재 유무를 검출하기 위한, 필수 시약 및 수단을 함유하는 분석 및 제약학적 키트(kits)를 비롯하여 방법 및 수단에 관한 것이다.

본 발명은, 타겟 핵산 서열의 증폭이 임의의 자가-복제의 능력을 갖는 다중 전사체 산물의 제조에 의해 달성되는, 시험관 시스템 내에서 자가-지속된( self-sustained) 단일-포트(single-pot) 내 상기 특정 핵산 타겟 서열의 증폭을 제공하는 것을 특징으로 한다. 이런 자가-지속 증폭 시스템은 온도 사이클을 요구하는 핵산 듀플렉스(duplex)의 반복된 변성을 필요로 하지 않는다. 본 발명은 단일 반응 세팅에서 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 증폭된 생성물 또는 증폭된 형태로서 검출하기에 적절한 생성물을 형성하는데 필요한 모든 시약들을 신규한 방식으로 조합한다.

본 발명이 발견한 적용 중에서 용도는, 필수적인 타겟 핵산 서열(들)을 함유하는 신체 유체 및 조직을 시험관내 또는 생체밖 핵산 프로브 하이브리드화 분석을 함으로써, 특별하거나 일반적인 병원성 질병 또는 상태의 특징적 RNA 서열, 또는 외삽에 의한, DNA 서열을 분석함에 있다.

[발명의 배경]

당분야의 목적은 해당 서열, 소위 타겟 핵산이 RNA, DNA 또는 둘 다를 포함하는 다양한 다른 핵산 종들에 대해 그 양이 소량으로 존재하는 생물학적 샘플 내에서 다양한 핵산 서열을 검출하는 것이다. 즉, 예컨대 인간 면역 결핍 바이러스(HIV-1)의 것에 관련된 핵산과 같이, 병리학적 질병 또는 상태와 연관될 수 있는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 검출하는 것이 바람직하다. 이런 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산의 검출에 덧붙여, 혈우병에서 예시된 결함이 있는 인간, 베타글로빈 유전자의 검출의 경우에서와 같이, 결합이 있는 유전자와 같은 병리학적 질병 또는 상태의 다른 핵산 특징을 검출하는 것이 바람직하다.

특징적으로, 상기와 연관된 핵산은, 있다고 하더라도, 시험하고자 하는 주어진 개체의 혁액 또는 다른 신체 유체 또는 조직 샘플과 같이, 제공된 생물학적 샘플 내에서 총 핵산에 대해 매우 소량으로 존재한다. 이런 핵산 종들의 검출은 환경적으로 함께 연관되는 다양한 다른 핵산 종들로부터 검출가능하고 측정가능한 그런 특이성을 필요로 한다(존재한다면). 하지만, 몇몇 종들은 적어도 분리된 단편에서 타겟 핵산과 밀접한 동질성을 가질 수 있다. 게다가, 상기와 같이, 이런 타겟 핵산 종들은 시험하고자 하는 생물학적 샘플내에서 대개의 경우에 매우 미세한 양으로만 발견된다. 그럼에도, 기초가 되는 질병 상태의 적절한 진단을 위해서는, 심지어 소량의 이런 타겟 핵산이라 할지라도 분석 시스템의 신빙성을 가지고 명료하게 검출할 수 있는 것이 필요하다.

당분야의 목적을 수행하기 위한 여러 가지 방법들이 진전되어 왔다. 여기에서, 샘플 내 핵산의 양은 변경되거나 영향을 받지않는다. 대신, 리포터(reporter) 시스템이 개발됨으로써 핵산 타겟에 상응하는 다량의 검출가능한 분자가 검출 및 측정이 용이하게 생산된다. 상기 리포터 시스템은 타겟 서열의 분자수를 대표하는 검출가능한 시그널을 생산하는 타겟 핵산과 관련되 시그널-발생 시스템이다.

타겟 핵산 서열 그 자체의 복사 수를 증가시키는 것을 수반한다는 점에서 기본적으로 상이한 또 다른 방법이 개발되었다. 이는 타겟 핵산 서열의 선택적 증폭에 의해 행해질 수 있다. 어떻게해서든지 타겟 핵산 서열이 다른 서열보다 우선적으로 증폭되도록 샘플의 배양 기술을 정제할 수 있다. 이러한 기술은 성가시고 시가시고 시간이 소비되며 시행 착오를 거치게 된다.

이런 방법의 또 다른 예는 소위중합효소 연홰 반응(PCR)에서 타겟 핵산 서열의 증폭이다. 이 기술은 문헌(Saiki et al., Science, 230 1350(1985) and Mulli set al., 유럽 특허출원 공고 번호 제200362호 및 제201184호(또한 미합중국 특허 제4683195 및 제4683202호 참조)]에 기록되어 있으며, 특히 (1) 타겟 핵산 서열의 단편에 프라이머(primer)를 하이브리드 화시키고, (2) 상기 프라이머를 중합효소로 확장시키고 (3) 단일 스트랜드를 프라이머 확장 반응에 의하여 듀플렉스가 되게 하는 것을 수반한다. 이런 절차는 기초가 되는 타겟 핵산 서열을 증폭하기 위해서 많는 사이클에 걸쳐서 반복될 수 있다.

개선된, 신규 방법은 미합중국 특허 일련 번호 제07/064141호 및 제07/202978)호 및 상기 PCT 국제 출원 번호 WO 88/10315에 자세하게 기술되어 있다. 이는 프로모터에 조작적으로 연결된 타겟 서열의 합성된 이중-스트랜드 cDNA 복사체와 연관되어 이로부터 유도되는 신규 RNA 전사체 생산 단계를 사용하는 것이다. 신규성의 우세한 측면인 전사 단계에 의해, 이것을 전사-기제 증폭 시스템(TAS)로서 편리하게 부른다.

즉, 상기 발명은, i) RNA-중합효소 프로모터에 조작적으로 연결된, 타겟 서열에 상응하는 서열을 함유하는 이중-스트랜드 핵산을 제조하고, ii) 이중-스트랜드 핵산 템플레이트로서 상기 이중-스트랜드 핵산을 사용하여 이로부터 다수의 RNA 전사체를 제조하고(여기에서, 각각은 상기 타겟 서열에 상응하는 RNA 서열을 가진다), iii) 상기 RNA 서열의 존재를 검출함으로써, 타겟 서열의 존재를 유추하는 방법으로 이루어지는, 핵산을 함유하는 샘플 내에서 적어도 하나의 특정 핵산 서열(타겟 서열 또는 분절)의 시험관내 또는 생체밖 검출을 수반한다.

이중-스트랜드 핵산 템플레이트는, 차례로 i) 타겟 서열의 분절에 상응하는 서열에 조작적으로 연결된 프로모터 서열을 함유하는 제1 핵산 프라이머 또는 프로브를 제공하고, ii) 적절한 조건하에 핵산 함유하는 샘플 내에서 상기 제1 핵산 프라이머와 타겟 서열을 하이브리드화시키고, iii) 상흥하는 듀플렉스 핵산을 형성하기 위해 중합효소 확장 반응에 의하여 타겟을 서열에 상보적으로 하이브리드화된 상기 제1 핵산 프라이머를 확장시키고, iv) 상기 듀플렉스의 스트랜드를 분리시키고, v) 적절한 조건 하에 상기 프로모터의 반대편 말단에서 제2 핵산 프라이머를 분리된 프로머터를 함유하는 서열 스트랜드에 하이브리드화시키고, vi) 중합효소 확장 반응에 의하여 하이브리드화된 상기 제2 핵산 프라이며를 상기 프로머터를 함유하는 서열에 상보적으로 확장시킴으로써 제조된다.

이리하여, 상기 발명은, 타겟 핵산에 상응하는 서열을 갖는 그형성을 방지하기 위해 측정이 수행되지 않을 때, 단일-스트랜드 RNA 전사체 또는 이로부터 형성된 RNA-DNA 듀플렉스를 얻는다. 단일-스트랜드 RNA 전사체 산물은 다소 연속적으로 전사되며, 성가시며 실수의 경향이 있는 PCR 사이클의 반복 및 스트랜드 분리를 필요로 하지 않는, 타겟 단편의 직접 검출을 제공한다. 이러한 장점은 허용가능한 증폭 정도에 도달하는데 필요한 다수의 반복된 사이클 후 및 검출 전에만 분리되는 것을 필요로 하는 이중-스트랜드 DNA(타겟 분절로 구성되는 한 스트랜드 및 타겟 단편의 상보물로 구성되는 다른 스트랜드)를 얻는 PCR 기술에 의해서는 제공되지 않는다.

선택적인 실시양태로서 본 발명의 목적은, 타겟 핵산 서열의 검출을 위해 용이한 증폭을 위한 기초 복제 방법, 즉 온도 사이클을 필요로 하지 않으며 시약 첨가등의 관점에서 증폭 반응의 경로를 달리 모니터링 하지 않아도 되는 추가 잇점을 얻는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 상응하는 타겟 핵산을 검출하고 측정하기 위한 수단으로서 전자 및 확장 산물 절차의 잇점을 신규한 방식으로 조합시키는 것이다.

본 발명의 기본적 목적은 핵산 타겟 서열에 프라이머를 하이브리드화 시킨 다음 프라이머 확장에 의해 형성된 RNA/DNA 듀플렉스의 RNA 스트랜드의 서택적인 효소적 분해를, 또 다른 하이브리드화에 이 프라이머 확장을 위한 템플레이트로서 DNA 스트랜드를 제공하기 위한 수단으로 이용하는 것이다. 이중-스트랜드 DNA 듀플렉스 산물은 DNA-의조성 RNA 중합효소에 의해 인식가능한 적어도 하나의 프로모터 서열을 함유하므로 이 전사체는 다수의 전사체의 생산을 위한 템플레이트로서 사용되며 타겟 핵산 서열을 검출하고 측정하는 수단에 의해 궁극적으로 검출되고 측정된다. 본 목적은 DNA-의존성 RNA 중합효소에 의해 인식가능한 프로머터를 조작적으로 함유하는 적어도 하나의 프라이머 및 (세개의) 적절한 효소적 활성을 함유하는 단일 반응 혼합물에서 온도 사이클의 필요성 없이 자가-지속되는 타겟 서열 증폭의 잇점을 제공하는 것이다.

이리하여, 본 발명의 전체 목적은 당분야에 의해 열거된 목적은 만족시키고 타겟 핵산 서열의 증폭을 더 유리하게 하기위한 선택적 수단을 제공하는 것이다. 공지 시약의 편의를 이용하고 일관된 과학적 결과를 얻는데 필요한 정밀도를 갖는, 등온 반응 시스템에서, 허용가느아게 짧은 기간의 시간 내에 복제하도록 사용될 수 있는 간단한 기술을 추가로 제공하며; 실험실/임상 분석용 키트에서 사용하기 위해 적응된 복제가능한 분석 세팅에서 상용될 수있다.

[발명의 개요]

본 발명은 RNA 중합효소 결합 서열(PBS)을 함유하는 올리고뉴클레오리드와의 하이브리드화에 뒤따른 프라이머 확장이 다수의 상응하는 RNA 전사체(타겟 핵산 서열의 존재 유무를 위한 연역 분석법으로서 검출 및 측정에 사용될 수 있다)의 제조를 위한 템플레이트로서 사용될 수 있는 DNA 듀플렉스를 형성하도록 하기 위해 RNA/DNA 듀플렉스의 DNA 스트랜드를 자유롭게 하한스트랜드-분리 수단의 사용에 대해 서술하고 있다. 그 다음에 RNA/DNA 듀플렉스는 프로모터 서열을 조작적으로 함유하는 DNA 프라이머의 RNA 타겟에 대한 하이브리드화에 뒤따른 프라이머 확장에 의해 차례로 생성된다.

본 발명의 스트랜드-분리 수단은 추가 반응을 위해 DNA 스트랜드를 자유롭게 하기 위하여 듀플렉스 RNA 스트랜드를 선택적으로 및 우선적으로 분해시킬, RNase H 와 같은 RNase H- 유사 활성을 갖는 효소의 사용을 수반한다. 이런 효소의 사용은 상기 듀플렉스를 변성시키기 위해 온도 사이클의 사용을 필요로 하지 않는다.

핵산 타겟 서열은 핵산 샘플에서와 같이 고유적으로 존재하는 것이거나, 상응하는 DNA 타겟 서열 외삽 산물일 수도 있다. 외삽 산물은 이주-스트랜드 DNA 타겟 서열을 변성시키고, 조작적으로 연관된 프로모터 서열을 갖는 프라이머 서열을 하이브리드화시킨 다음 프라이머 확장 반응을 시켜 DNA 듀플렉스를 형성시킴에 의해 제조된다. i) 이런 DNA/DNA 듀플렉스는 변성되고 ii) 프로모터 서열을 함유하는 스트랜드는 프로머터의 말단 반대편에서 제2 프라이머와 하이브리드화된 다음 프라이머 확장이 뒤따라서 DNA 듀플렉스를 형성하고 iii) 이는 DNA-의존성 RNA 중합효소와 접촉시, 상응하는 전사체, 외삽 산물을 차례로 생성한다. 그런 다음 RNA는 본 발명의 목적을 위한 타겟 핵산 서열로서 사용된다.

그 근원이 무엇이든지간에 핵산 타겟 서열이 제공된 후에, 본 발명에 따라, 이는 DNA 스트랜드의 5'-말단에서 프로모너 서열을 함유하는 RNA/DNA 듀플렉스를 생산하기 위해, 프로모터 시열과 조작적으로 연관된 프라이머 서열과 하이브리드화된 다음 프라이머 확장이 뒤따른다. 프라이머 확장 반응은 역전사효소와 같은 임의의 적합한 중합효소와 함께 수행될 수 있다. 그런 다음, 본 발명의 기본적인 측면은 RNase H와 같은, RNA 스트랜드를 선택적으로 분해하는 효소로 RNA/DNA 듀플렉스를 처리함으로써 RNA/DNA 듀플렉스의 DNA 스트랜드를 자유롭게 하는데 사용된다. 이렇게 자유롭게 된 DNA 스트랜드는 1) 이전의 선택적 분해로부터 생선된 RNA 프라이머를 통하여 자생적 프라이머 확장에 놓이거나 2) 조작적으로 프로머터 서열을 임의로 갖는 외부적으로 유도된 올리고뉴클레오리드 프라이머와 하이브리드화된다. 프라이머 확장은 한 두 개의 프로모터 서열을 함유하는 이중 스트랜드 DNA 듀플렉스를 생성시키며, 이는 다수의 전사체를 제공하기 위하여 DNA-의존성 RNA 중합효소 전사 유도에 대한 템플레이트로써 사용된다.

제공된 상기 반응 서열은 역전사효소, RNase H 및 DNA-의존성 RNA 중합효소가 제공되는 것과 같은, 세 개의 적절한 효소 활성과의 동시적 혼합물에서 등온적으로 수행될 수 있는데, 예컨대, 상기 방법에서 다양한 단계들이 주어진 시간에 걸쳐 연속적, 동시적 형태로 수행된다. 즉, 종결점으로서 상기 제공된 지점에서, 생산된 전사체는 검출 및 측정되어 출발 타겟 핵산 서열의 존재를 추론할 수 있다. 그러나, 상기 반응들을 수행하는데 필요한 효소 활성의 유일한 단일의 초기 첨가만을 필요로하고 온도 사이클에 무관한 상기 반응 순서의 계속적 및 동시적 특징이 제공되는 경우, 전사체 산물 그 자체는 조작적으로 부가적인 프로모터 서열을 임의로 갖는 프라이머와 하이브리드와에 놓인다. 이런 하이브리드화 복합체는 제2 RNA/DNA 듀플렉스를 생산하기 위해 프라이머 확장 반응이 뒤따른 다음, 이로부터 DNA 스트랜드를 자유롭게 하기 위해 선택적 RNA 분해 효소의 작용을 거치게 된다. 그런 다음, 이것은 제2 DNA 듀플렉스를 생산하기 위하여, 반응 혼합물 내에 존재하는 자생된 RNA 프라이머 또는 조작적으로 프로모터 서열을 임의로 갖는 외부적으로 유도된 올리고뉴클레오타이드 프라이머와 하이브리드화되어 제2 DNA 듀플렉스를 생성시키는데, 이는 초기에 생산된 전사체에 반대되는 센스를 갖는 다수의 전사체를 생산하는 DNA-의존성 RNA 중합효소에 의하여 인식되기 쉽다.

전술한 반응 순서(들)의 메카니즘이 충분하게 설명되지 않은 반면, 이는 반응 혼합물이 세가지 적절한 효소 활성(예컨대, 역전사효소, RNase H 및 DNA-의존성 RNA 중합효소에 의해 제공되는 것처럼)이 중합효소D 의해 인식된 포로모터를 함유하는 적어도 하나의 프라이머와 조합하여 사용되기 때문에, 그리고 반응이 온도 사이클에 무관하기 때문인 것으로 사료되며, 두 개의 프로모터-함유 올리고 뉴클레오타이드 프라이머가 사용되는 경우, 반응은 자발적 및 연속적으로 여러 번의 사이클을 통해 이루어져, 시험된 샘플 안에 조재하는 타겟 핵산 서열의 양의 증폭 분석을 제공하기 위해 다양하게 검출되고 측정될 수 있는 센스 및 안티센스 전사체 둘 다를 생산한다고 생각된다.

본 발명의 요지는 보다 높은 온도와 낮은 온도 사이에서 순환활 필요없이, 효소 또는 다른 시약을 주기적으로 첨가할 필요없이 적당한 온도에서 일정시간 동안 잠재적으로 남아있도록 근본적으로 허용하는 반응 혼합물을 제공함으로써, 프로모터 서열을 조작적으로 갖는 적어도 하나의 프라이머, 및 프로머터의 중합 효소 결합 부위를 인식하는 RNA 중합효소, 역전사효소, RNA가 듀플렉스 형태로 DNAK에 하이브리드화되는 경우 RNA를 선택적으로 분해하는 RNase H 와 같은 효소에 의해 제공되는 것과 같은 효소 활성, 및 RNA 중합효소 및 역전사효소에 대한 필수적인 뉴클레오시드 트리포스페이트 기질의존재 하에 타겟 핵산 서열을 자가-지속 형태로 계속적으로 및 자발적으로 증폭시킨다. 본원에서 정의된 것과 같은 시스템에서, 10⁷만큼 높은 재생가능한 증폭 정도는 예컨대 T7 RNA 중합효소, AMV 역전사효소 및 이.콜라이 RNase H를 사용하여, 약 37℃에서 거의 2시간 내에 얻을 수있다. 약 4℃ 내지 약 50℃, 바람직하게는 대략 40℃ 범위의 온도가 조작가능하다. 바람직한 실시양태에서 핵산 타겟 서열의 크기는 약 250개 보다적은 염기를 함유한다. 사용된 RNA 중합효소, 사용된 역전사효소, pH, 염 농도, 뉴클레오시드 트리포스페이트 농도와 같은 다른 변수들이 증폭의 최적화에 영향을 미칠 수 있다. 이런 변수들은 당업자의 통상의 범위 내이다.

이리하여, 본 발명은 RNA의 이종 수집물을 함유하는 샘플 내에 적어도 하나의 특이한 핵산 타겟 서열의 시험관내 또는 생체밖 검출을 수반한다. 본 발명은 조작적 RNA 중합효소 프로머터를 갖고 타겟 서열에 상응하는 서열을 암호화하는 이중-스트랜드 DNA를 제조하는 것으로 구성되는 방법에 관한 것으로, 여기서 이중-스트랜드 DNA는 차례로, 하이브리드화된 다음 RNA 선택적으로 분해 효소의 작용에 의하여 RNA/DNA 듀플렉스 내 그 RNA 상보물로부터 자유롭게 된 DNA 스트랜드 프라이머 확장에 의해 차례로 제조되며, 상기 RNA/DNA 듀플렉스는 타겟 핵산 서열에 프로모터 서열을 조작적으로 갖는 프라이머와 하이브리드화시킨 다음 프라이머 확장시켜 형성된다. 이중-스트랜드 DNA는 이로부터 다수의 RNA 전사체의 제조를 위한 템플레이트로서 사용되고 각각은 상기 타겟 핵산 서열에 상응하는 RNA 서열을 갖는다. 상기 RNA 서열의 존재는 검출되고 측정되어 타겟 서열의 조재를 추론할 수 있다.

본 발명은 상기 RNA 전사체를 제조하고 사용하기 위한 모든 관련된 방법 및 수단에 관한 것이다. 실시양태에서, 본 발명은 타겟 핵산 서열의 단편에 상응하는 서열에 조작가능하게 연결된 프로모터 서열을 함유하는 제1 핵산 프라이머를 제공하고 상기 제1 핵산 프라이머를 핵산을 함유하는 샘플내 타겟 핵산 서열과 적합한 조건 하에 하이브리드화시키고, 상응하는 RNA/DNA 듀플렉스 핵산을 형성하기 위해 타겟 서열에 상보적으로 중합효소 확장 반응에서 상기 하이브리화된 제1 핵산 프라이머를 확장시키고, 상기 RNA/DNA 듀플렉스의 RNA를 효소적으로 분리시키고, 1) 생성물로부터 유도된 굼 프라이머 또는 2) 여기에 조작적으로 연결된 프로모터 서열을 임의로 함유하는 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 통해 상기 프로모터 서열의 반대편 말단에서 제2 핵산 프라이머를 적합한 조건하에 DNA 서열을 함유하는 자유롭게된 프로모터-함유 DNA 서열 스트랜드에 하이브리드화시키고, 상기 프로모터-함유 서열에 상보적으로 중합효소 확장 반응에서 하이브리드화된 상기 제2 핵산 프라이머를 확장시켜 상기 이중-스트랜드 핵산 템플레이트를 제조하는 임의로 반복적인 방법에 관한 것이다.

또 다른, 실시양태에서 본 발명은 그 프로모터를 인식하는 DNA-의존성 RNA 중합효소에 의해 촉매화된 반응에서 이로부터 다수의 전사체를 제조하기 위한 템플레이트로서, 상기 이주-스트랜드 핵산 등을 사용하고, 상기와 같이 또 다른 임의 순환 수에, 상기 RNA 전사체의 존재를 검출하고 측정하기 위한 방법 및 수단에 관한 것이다.

또 다른 실시양태에서 본 발명은, i) 조작적으로 연결된 프로모터 서열을 갖는 DNA 프라이머를 타겟 서열과 하이브리드화 시킨 다음, ii) 프라이머 확장시켜 상응하는 RNA/DNA 듀플렉스를 제공하고, iii) 프로머터 서열 반대편 말단에서 제2 프라이머와 상기 듀플렉스의 프로모터 서열을 갖는 자유롭게 된 DNA 확장 산물을 하이브리드화시킨 다음, iv) 프라이머 확장에 의해 이중-스트랜드 DNA 템플레이트를 형성하고, v) 이로부터 임의로 복제가능한 RNA 전사체(이 자체로 검출되거나 재순환된다)를 제조하는 단계들로 구성되는, 타겟 DNA 서열로부터 외삽 산물로서 또는 그 자체로서 생겨난 타겟 핵산 서열을 증폭시키는 방법에 있어서의 개선점에 관한 것이다. 개선점은 상기 RNA/DNA 듀플렉스의 RNA 스트랜드의 선택적 효소적 분해에 의해 상기 RNA/DNA 듀플렉스 프라이머의 프로모터 서열을 갖는 확장 산물 DNA 스트랜드를 자유롭게 하는 것을 포함한다.

실시양태에서, 본 발명은 DNA 서열의 5'-말단에서 연결된 프로모터 서열을 갖는, RNA/DNA 듀플렉스 RNA를 선택적으로 RNA 분해 효소로 처리한 반응 산물에 관한 것이다.

또 다른 실시양태에서, 본 발명은 상기 정의된 방법 및 수단을 사용하여, RNA를 함유하는 샘플 내 적어도 하나의 특정 핵산 타겟 서열의 시험관내 또는 생체밖 검출에서 유용한 필수 시약 및 연관된 수단으로 구성된 키트에 관한 것이다.

[발명의 상세한 설명]

[도면의 간단한 설명]

제1도는 본 발명의 실시양태의 도식적 표현을 나타낸다. 도식적인 표현은 그 바람직한 측면에서 제공된 조작가능한 온도 및 타겟 서열과 함께 반응 혼합물에서 필수적인 세가지 효소의 존재에 따른 연속적인 자가 지속단계들로 기술되는 총 12 단계를 제공한다. 세가지 효소들, 예컨대, 프라이머 확장 반응을 위해 사용된 역전사효소(RT), 본 발명의 기본적 측면을 나타내는 선택적 RNA 분해 효소인 RNase H, 및 DNA 듀플렉스 템플레이트로부터 전사체를 제조하는데 유용한 효소의 예로서 T7 TNA 중합효소가 기록된다. 상기와 같은 본 발명의 근본적 성질은 단계 3의 도식적 표현에 의해 표시되며 단계 6의 RNA 전사체 생성물이 그 자체로서 검출되고 측정될 수 있거나 RNA 전사체의 안티센스 스트랜드를 형성하기 위해 단계 7에서 단계 12에 기록된 연속 반응에 놓일 수 있다는 사실이 이해되고 생각된다. 생겨난 RNA 전사체는 타겟 핵산 서열의 존재의 수반되는 결과로서 검출되고 측정된다. PBS는 프로모터 서열의 중합효소 결합 부위를 나타낸다. TCS는 타겟 상보적 서열을 나타낸다.

[일반 방법 및 정의]

프라이머 또는 프로브로서 사용하기 위하여 그 자체로 또는 다른 DNA에 연결될 때 적합하게 하기 위한, DNA 합성, 또는 제한 효소 절단을 통한 천연 근원으로부터 서열의 분리 및 이의 테일러링(tailoring)을 포함하는 DNA 프로브 또는 프라이머 제조; 하이브리드화시 사용하기 위한 다른 기능적 서열을 갖는 올리고 뉴클레오타이드의 제조; 타겟 DNA 서열에 대한 프라이머의 동종성 정도에 따른 다소의 하이브리드화 확실성을 나타내기 우한 엄격한 조건에 있어서의 변화를 포함하는 하이브리드화 방법론; 프로모터의 확인, 분리 또는 제조, 또는 보다 특히, 박테리오파지 DNA-의존성 RNA 중합효소 및 박테리오파지 RNA-의존성 RNA 중합효소에 의해 인식되거나 바이러스 DNA- 및 RNA-의존성 RNA 중합효소, 예컨대, 아데노바이러스-암호화된 RNA 중합효소 및 브롬 모자이크 바이러스 RNA 중합효소의 진핵 생물 시스템에서 사용되는 프로모터 또는 부위의 확인, 분리 또는 제조; 상기 프로모터를 인식할 수 있거나 프라이머 확장 반응시킬 수 있는 RNA 중합효소의 확인, 분리 또는 제조; 소위 전사-인핸서 서열을 포함하는, RNA 전사체의 생산에 도움이 되는 조건; DNA 의존성 중합효소 및 dNTPs 의 사용을 포함하는 프라이머 확장 반응의 개시 및 유지에 도움이 되는 조건;

(유도된) 복제를 위한 메카니즘 및 방법론 등과 같은 본 발명의 기본 기술을 수행하기 위한 정의 및 방법 및 수단을 포함하는 분자 생물학의 기본 교과가 언급되어 있다.

예컨대, 마니아티스 일동., 분자 클로닝 : 실험실 편람, 콜드 스프링 하버 실험실, 뉴욕 1982), 및 콜로위크 일동., 효소학 방법 Vol 152, 아케데믹 프레스, Inc. (1987), 및 여기 인용된 다양한 참고물; 홍, 생물과학 레포트 1, 243(1981); 쿡 일동., J. Biol, Chem, 255 6502(1980); 및 솔러 일동., 효소학 방법 100, 468-500(1983); 크레아 일동., 핵산 연구 8, 2331(1980); 나랑 일동., Meth Enzyme. 68, 90(1979); 뷰케이지 일동., 테트라헤드론 레터 22, 1859(1981); 브라운 일동., Meth. Enaym. 68, 109(1979); 카루더스 일동., Meth. Enzym. 154, 287(1985); 히쯔맨 일동., J. Biol. Chem. 255, 2073(1980); 리일동. 과학 239, 1288(1988); 밀리간 일동., 핵산 연구 15, 8783(1987); 밀러 일동., 바이러스학 125, 236(1983), 알퀴스트 일동., J. Mol Biol. 153, 23(1981); 밀러 일동., 세미쳐 313, 68(1985); 알퀴스트 일동., J. Mol. Biol. 172, 369(1984); 알퀴스트 일동., 플랜트 Mol. Biol. 3, 37(1984); 오우 일동., PNAS 79, 5235(1982); 추 일동., 핵산 연구 14,5591(1986); 유럽특허 출원 출판 제(EKPA) 194809 호; 마위 일동., 포지티스 스트랜드 RNA 바이러스, p. 327-336, 알란 R, 리스(publ.,; 뉴욕) 1987; UCIA 심포지움의 회의록(1986); 밀러 일동, J. Mol. Biol. 187, 537(1986); 스토플레트 일동., 과학 239, 491(1988); 크래머 일동., J. Mol. Biol. 89, 719(1974); 사리스일동., 핵산 Res. 10, 4831(1982); 브레서 일동., PNAS 80, 6523(1983); 추일동., 핵산 연구 16, 3671(1988), 구브러 일동., 유전자 25, 263(1983) 및 디알레시오 일동., 핵산 연구 16,1999(1988) 뿐만 아니라 여기 인용된 참고물을 본다.

모든 인용된 출판물은 분명히 본원에서 참조로 인용된다.

프로모터란 용어는 인식된 서열에 결합되어 전사 과정을 개시하므로써 RNA 전사체가 생산되는 RNA 중합효소에 의해 특히하게 인식되는 핵산 서열(자연적으로 생겨나거나 합성적으로 생산된 또는 제한 효소 분해 산물)을 의미한다. 이늘 분해 과정에 대한 부가적인 안정성을 부여한다고 생각되는, 실제 인식 부분을 넘어 확장되는 뉴클레오타이드 염기들을 임의로 함유할 수 있으며, 또한 전사 개시 부분에 인접한 부가적인 플러스(+) 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 원칙적으로, 임의 프로모터 서열이 사용될 수 있으며 이것에 대해 개시 서열을 인식할 수 있는 공지된 유용한 중합효소가 있다. 전형적인, 공지된 유용한 프로모터는 박테리오파지 T3, T7 또는 SP6과 같은 특정한 박테리오파지 중합효소에 의해 인식되는 것들이다.[참조: Siebenlist et al., Cell 20, 269 (1980)]. 이런 것들은 관련된 프로모터 서열과 관련되어 본 발명의 실행시 사용될 수 있는 그건 중합효소의 예일 뿐이다.

RNA 전사체는 프로모터 서열(상기 참고)의 RNA 중합효소 인식에 뒤따른 전사 개시 후에 생산된 리보핵산 서열이다. 이런 전사체의 생산은 존재하는 중합효소의 양에 따라 부분적으로 다소 연속적이다.

분문에서 프로브 또는 프라이머란 용어는 적합한 하이브리드화 조건 하에 적절한(타겟) 사열에 하이브리드화될 수 있는, 즉 결합할 수 있는 그런 타겟 서열에 충분한 상보성을 갖는 단일-스트랜드 핵산 서열(자연적으로 생기거나합성적으로 생산되거나 또는 제한 효소 분해 산물)을 의미한다. 전형적인 프로브 또는 프라이머는 적어도 약 10개의 뉴클레오타이드 길이보다 바람직하게는 거의 20개 이상의 뉴클레오타이드 염기 길이이며, 가장 바람직한 실시양태에서, 이는 적절한(타겟) 서열과 동일성 또는 매우 높은 상보성을 공유한다[참조: EPA 128042(publd. 84. 12월 12일)]. 이런 프로브 또는 프라이머는 적절한 시약 및 조건 하에 프라이머 확장 반응의 목적을 위해 상보 서열에 하이브리드화될 그런 것이다.

특히 RNA 암호화 DNA 서열 내 프로모터 서열의 연결과 연관되어, 조작적으로 연결된, 또는 연관된 또는 이의 문법상의 변화는 프로모터가 적합한 중합효소(상기 참고)에 의해 인식되는 경우 상응하는 RNA 전사체를 생산할 때 그 기능성을 말하는 것이다.

색소 유전자에 민감한 효소를 사용하여 방사능 라벨링 또는 색소 유전자 수단을 통하는 것과 같은 검출 양호를 형성하는 기술 또는 또한 당분야에 잘 알려지고 증명되어 있다.

본 발명의 분석 방법이 수행되는 샘플은 혈청 또는 다른 신체 유체, 조직 배양 배치 또는 식품 원료와 같은 생물학적 물질의 원료 표본일 수 있다 보다 전형적으로, 방법은 친화성 분자의 비-특이적 결합을 일으키는 것과 같은, 타겟의 검출을 방해할 물질을 제거시키기 위해 다양한 처리에 의해 원료 견본으로부터 유도된, 가공처리된 견본인 샘플 위에서 수행된다. 본 발명의 분석 방법에 보다적합한 샘플을 얻기 위해 원료 샘플을 가공처리하는 방법이 당분야에 잘 알려져 있다.

전사체(RNA)는 많은 다른 방법들에 의해 검출될 수 있다:

검출은 예컨대, 접촉 사진인쇄 방법[참고문헌: Kutateladze et al., Anal. Biochem. 100, 129(1979)]에서와 같은 RNA의 자외선 흡수에 의할 수 있다.

반응에서 방사성으로 라벨링된 리보뉴클레오시드- 5'-트리포스페이트(예컨대,³H-라벨링되거나 알파-³²PO₄-라벨링된)를 사용함으로써, RNA는 방사성이므로, 수많은 임의 공지된 절차에 의해, 그 방사능에 의해 검출될 수 있다.

비오틴 또는 아미노 비오틴은 RNA에 함입될 수 있으며, 그런 다음 RNA-결합된 비오틴에 결합되어 편리하게 검출가능한 색소원의 생산을 촉매화하는, 효소-아비딘 또는 효소-스트렙트 아비딘 부가물로 공지된 기술에 의해 검출될 수 있다. 비오틴 또는 이미노비오틴의 함입은 복제 반응에서 레플리카제(replicase)에 대한 기질로서 우라실 부분의 탄소-5에 대한 스페이서를 통해 비오틴화되는 UTP를 사용함으로써 수행될 수 있다. 이런 UTP's는 공지된 화합물이다. 게다가, 이런 UTP's는 QB 레플리카제에 대한 기질이며, 그 합성에서 상기 UTP's 의 사요에 기인하여, 탄소-5 위치에 결합된 스페이서 그룹을 통해 비오틴화된 우라실을 포함하는 RNA가 QB 레플리카제 촉매화된 복제를 위한 템플레이트인 사실이 공지되어 있다.

RNA 는 복제 RNA의 3'-말단에 대해 형광성으로 개질된 뉴클레오타이드를 부가하기 위한 T4 RNA 리가아제 촉매화된 반응을 사용함으로써 형광성으로 만들어질 수 있다[참조: Cosstick et al., Nucl. Acids Res., 12, 1791(1984)]. 결과 형성된 RNA의 형광성은 임의 여러 기본 기술에 의해 RNA를 검출하기 위해 사용될 수 있다.

RNA를 검출하기 위해 사용될 수 있는 추가 다른 방법들 중에는 핵산과 특이하게 결합되는 리포터 물질이 복제가 일어나는 시스템, 또는 복제된 RNA가 분리되는, ECTEOLA 종이와 같이 양으로 전하된 지지체와 같은, 매체에 첨가되고 리포터 물질로부터의 시그널이 측정되는 것들이다. 이런 물질로는 모든 것을 염색하는 것과 같은 색소원 염료(달버그 일동., J. Mol. Biol. 41, 139(1969); 메틸렌 블루(딩만 일동., 생화학 7, 659(968), 및 실버 염색(삼몬 일동., 전기영동 2, 135(1981); 이글로이, Anel. Biochem. 134, 184(1983); RNA에 결합하는 형광발생 화합물-예컨대 브롬화 에리듐(샤프 일동., 생화학 12, 3055(1973); 베일리 일동., Anal. Biochem. 70, 75(1976); 및 QB 레폴리카제에 의한 복제에 대한 템플레이트인 RNAs에 특이하게 결합되는 형광발행 화합물 - 예컨대 QB 레폴리카제의 바이러스 서브유니트에 결합된 피코빌리 단백질(오이 일동., J. Cell Biol. 93, 981(1982); 스트리어 일동., 미합중국 특허 제4,520,110호)을 포함한다.

본 발명에 따른 분석에서, 분석은 시험 및 대조표준 샘플 둘 다에 대해, 가능한 한 거의 유사한 조건 하에서 동시에 수행된다. 당분야에서 이해되는 것처럼, 대조표준 샘플은 시험 샘플과 유사하지만, 단 타겟 또는 공지된 양의 타겟을 함유하지 않는다고 공지되어 있다. 타겟이 없는 대조표준은 백그라운드를 확립한는데, 백그라운드 이하에서는 타겟을 함유하지 않은 것들로부터 타겟을 함유하는 샘플들을 구분하는 것이 가능하지 않다. 동시에 분석된 대조표준 샘플로 생산된 양 또는 농도와 시험 샘플의 분석에서 생산된 RNA의 양 또는 농도를 비교함으로써, 백그라운드 이상 수준에서의시험 샘플내 타겟의 존재를 결정할 수 있다. 공지된 농도의 타겟을 갖는 대조표준 샘플이 사용되는 경우, 시험 샘플 내 타겟의 농도가 계산될 수 있다.

본 발명의 임의로 복제가능한 RNA 전사체의 복제 유도(자동촉매적)를 위한 레플리카제의 사용은 일반적으로 당분야에 공지되어 있다. 본 발명에서 유용한 이런 레플리카제의 적합한 예로는 제공된 RNA 전사체의 말단에서 특정한 핵산 서열 부분을 인식하는 소위 QB 바이러스 레플리카제 및 소위 브롬 모자이크 바이러스(BMV) 뿐만 아니라 제공된 RNA 전사체의 3' 말단에서 핵산 서열 부위를 인식한다고 생각되는 알파 바이러스 레플리카제를 포함한다. 이런 레플리카제는 그 복사를 배가시키기 위해 RNA 전사체 및 상보물을 복제시키는, 즉 재생시키는데 사용된다. 이런 효소가 전사 과정 동안 반응에 존재할 때, 전사 동안 생산된 다중 전사체가 RNA 전사체 산물의 양을 지수적으로 증가시키기 위해 그 자체가 복제 하에 놓일 수 있다는 사실이 예견될 수 있다.

[실시양태의 자세한 설명]

본 발명의 전형은 열 사이클에 대한 필요 또는 보출 효소의 첨가없이 시험관 내 다수 증폭 순환을 완성시키는 능력이다. 본 명세서에 첨부된 도면은 도식적 형태로 바람직한 실시양태의 개요를 요약하고 있다. 본 발명의 원칙적 시그널 측면은 효소 RNases H의 포함이다. 추가로 이 도면에 의하면, 단계 1 및 2 는 소위 TAS 프로토콜-cf. 특허 출원 및 PCT 국제 출원(본원에서 참조 인용)에서 사용된 것들과 동일하나, 단, 단계 3에서 열 변성 단계 대신에 RNA/DNA 하이브리드 듀플렉스는 RNase H의 사용에 의해 RNA 타겟의 선택적 분해에 의해 스트랜드-분리된다. RNase H 활성은 이것이 RNA/DNA 하이브리드 듀플렉스에 존재하는 경우에만 RNA에 대한 특이성을 갖는다. 이런 분해 산물은 유일한 RNA 올리고머이거나 다중 RNA 올리고머(단계 4)일 수 있으며, 그 다음에, 이런 올리고머는 이런 cDNA 반응(단계 5)의 촉매로서 역전사효소(RT)를 사용하여 DNA 합성에 대한 프라이머로서 작용할 수 있다. 단계 5에서 보여진 이중-스트랜드 DNA 는 T7 RNA 중합효소-지시된 전사(단계 6)에 대한 템플레이트로서 작용할 수있다. 이런 증폭된 RNA 산물은 이제 타겟 서열에 대한 검출 리포터 분자로서 사용되고/되거나 자가-순환 반응(단계 7-12)을 계속하기 위한 부가적인 타겟 분자로서 사용된다.

약 10⁶배 타겟 증폭을 얻는, 가장 성공적인 반응은 세가지 효소 및 T7 RNA 중합효소 결합 서열(PBS)을 함유하는 두 개의 올리고 뉴클레오타이드 프라이머와 기능한다. 필요한 효소는 AMV 역전사효소, T7 RNA 중합효소 및 이. 콜라이 RNase H이다. 반응에서 이. 콜라이 RNase H 의 첨가는 AMV 역전사효소에 존재하는 RNase 활성을 보충하며 높은 정도의 증폭을 얻기 위해 필요한 것으로 보인다. 최적 올리고 뉴클레오타이드 프라이머의 선택은 타겟화된 서열의 길이, 하나 또는 두 개의 프라이머 상의 중합효소 결합 서열의 함입 및 전사 프로모터로서 중합효소 결합 서열-함유 프라이머의 효율 영역에 중점을 두고 있다. 세가지 모두 증폭 정도에 영향을 미친다. 각각 PBS를 함유하는 두가지 올리고 뉴클레오타이드 프라이머의 함입은 단일 PBS-함유 프라이머 및 비-PBS-함유 프라이머의 함입보다 보다 많은 증폭을 초래했다.

첨부된 도면에 의하면; (1) mRVA 타겟 분자는 T7 RNA 중합효소 프로모터 결합 서열을 함입하는 타겟 특이적 합성 올리고 데옥시리보 뉴클레오타이드와 어닐링된다. (2) 상기 프라이머는 제1 cDNA 스트랜드를 합성하기 위해 AMV 역전사효소의 DNA 중합효소 활성에 의해 확장된다. (3) 이. 콜라이 RNase H 및 AMV 역전사효소의 RNase H 활성은 RNA/DNA 하이브리드 듀플렉스의 RNA를 분해하여, 제2 스트랜드 cDNA 합성을 위한 템플레이트로서 유용한 DNA를 만들고, (4) 바람직하게는 T7 RNA 중합효소 프로모터 결합 서열(도면에 나타나지 않음)을 함입하는 합성 올리고 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 RNase H 분해로부터 초래되는 자생된 올리고리보뉴클레오타이드는 제2 스트랜드 cDNA 의 합성을 준비한다. 그런다음 AMV 역전사효소는 프라이머를 확장시켜 조작적으로 T7 RNA 중합효소 프로모터 결합 서열을 함입하는 이중-스트랜드 DNA를 형성한다.

(5) T7 RNA 중합효소는 이주-스트랜드 프로모터 결합 서열에 결합하여 타겟 핵산에 상보적인 RNA 복사체를 전사시킨다.

(6) PBS를 갖는 제2 올리고데옥시 리보뉴클레오타이드 프라이머는 RNA 전사체에 어닐링된다.

(7) AMV 역전사효소는 cDNA 스트랜드의 합성을 촉매화시킨다.

(8) RNase H 는 RNA/DNA 하이브리드 듀플렉스의 RNA를 분해시켜 제2-스트랜드 합성에 대한 템플레이트로서 유용한 DNA를 만든다.

(9) 올리고데옥시 리보뉴클레오타이드 프라이머가 제2-스트랜드 cDNA 에 하이브리드화되고, AMV 역전사효소가 DNA를 합성시킨다. 전사가 일어나고 사이클이 계속된다.

[실시예]

[제1 HIV-1 env 영역의 증폭]

HIV-1 RNA 의 영역은 반응의 끝에 이런 영역의 10 -배 많은 복사체를 생성시키는 등온적 효소 반응에서 증폭된다.

a. 증폭 반응

출발 핵산 물질은 상기 마니아라스 일동에 의해 기술된 구아니디늄 이소티시아네이트-염화 세슘 구배절차에 의해 HIV-1-감염된 CEM 세포(인간의 임파아구종성피진 세포계; 포크 일동, Proc. Matl. Sci. USA 82, 4531(1985))로 부터 추출된 세슘-펠릿화된 RNA 였다. (HIV-1-특이적 서열은 존재하는 총 핵산의 1 내지 10% 인 것으로 계산된다)

0.25 ㎍ 각 프라이밍 올리고뉴클레오타이드(88-211 및 88-347, 아래 참고)을 함유하는(최종 농도) 반응 혼합물(총 부피 100μl) 에 넣었다.

반응 성분들을 1.5 ml 에펜도르프 튜브안에서 조합시킨 다음 짧고 가볍게 볼텍싱하였다. 수욕 내에서 1분 동안 튜브를 65℃로 가열시켜 타겟 핵산을 변성시켰다. 1분 동안 37℃에서 냉각시킨 후에, 하기 효소들을 첨가시켰다:

이 반응 또 다른 조작 없이 37℃ 에서 3 시간 동안 진행되었다.

[증폭생성물의 검출]

약 1 시간 후에, 증폭된 단편(88-298)내 30개 염기쌍 여역에 상보적인 32 p-라벨링된 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 생성물을 검출했다. 총 부피의 1/40을 나타내는 반응의 분취량을 20분 동안 수욕 내 55℃ 95.0 μl의 7.4% 포름알데히드 및 10 X SSC(상기, 마니아티스 일동) 안에서 변성시켰다. 즉시, 분취량을 얼음-냉각시킨 다음 솔트-블로트(solt-blot) 기구를 통해 니트로 셀루로오스 막 위에 부하시켰다. UV 방사선 조사(254 m)에 의해 핵산을 니트로 셀루로오스에 고정시켰다.

고정시킨 후, 0.5% BSA, 0.5% 폴리비닐피롤리돈, 5 x SSPE(20 X=3.6 M NaCl, 200 mM NaH₂PO₄, 20 mM EDTA, PH 7-8) 및 1% SDS를 함유하는 50-100 μl 완충액/㎠ 필터에서 15분 동안 55℃에서 필터를 예비하이브리드화시켰다. 2-5×10⁶cpm/㎖ 의 포스포릴화된 올리고 뉴클레오타이드 프로브를 함유하는 같은 완충액에서 2시간 동안 55℃에서 하이브리드화가 일어났다. 프로브를 예비 하이브리드화 완충액에 첨가시켰다. 각각 1 ml 완충액/㎠ 필터, 1×SDS를 사용하여 3분 동안 실온에서 세 번, 그런 다음 55℃에서 같은 완충액에서 1 분 동안 필터를 세척했다.

-70℃에서 한번의 강화 스크린으로 필터를 방사선 사진 촬영했다.

pUC19 의 Eco RI 부위에 삽입된 HIV-1 게놈의 cDNA 복사체를 함유하는 플라스미드, 공지된 양의 HIV-1 RNA 또는 pARV7A/2 (루시우 일동, 네이쳐 312, 760 (1984))에 의해 생산된 시그널에 대해 증폭된 생성물에 의해 생산된 시그널의 강도을 비교함으로써 증폭 정도를 평가했다.

상기 실시예에서, 증폭 정도는 1 × 10⁶이 있다. 검출 프로브 88-297 및 88-298을 사용하는 생성물의 노던(Northern) 블로트 및 사우딘(Southern) 블로트 분석으로 이것이 우세한 종으로서의 RNA와 함께, RNA 및 DAN 의 혼합물이라는 사실이 밝혀졌다. 생성물은 좁은 범위(20-40bp) 내에서 별개의크기(∼210pb)를 가졌다.

[제2 HIV-1 env 영역의 증폭]

프라이밍 올리고 뉴클레오타이드 87-284 및 88-347(아래)가 증폭을 의해 사요되는 것을 제외하고, 실시예 1 에 기술된 절차에 따라 제 2 HIV-1 env 영역의 증폭을 수행하고, 검출시키기 위해 검출 올리고뉴클레오타이드 86-272 및 86-273(아래)을 사요했다. 10³-배 증폭시켰다.

[제3 HIV-1 sor 영역의 증폭]

프라이밍 올리고뉴클레오타이드 88-77 및 87-292(아래)가 증폭을 위해 사용되는 것을 제외하고, 실시예 1에 기술된 절차에 따라 HIV-1 sor 영역의 증폭을 수행하고, 검출을 위해 검출 올리고뉴클레오타이드 86-31 및 86-32(아래)를 사용했다. 10³-배 증폭시켰다.

[4. AIDS 환자로부터 혈액의 임상 샘플로 부터 제1 HIV-1- 영역의 증폭]

세가지 HIV-1-감염된 임상 샘플로부터 RNA를 증폭시켰다. RNA를 유기 추출 프로토콜(아래)에 의해 추출시켰다.

프라이ALD 올리고뉴클레오타이드 88-211 및 88-347 (아래) 및 검출 올리고 뉴클레오타이드 88-297 및 88-298(아래)을 사용하여 실시예 1에서와 같이 증폭시켰다.

두가지 샘플은 양성 결과를 보여주였다. 이런 실험에서 반응을 위한 총 증폭은 10⁵배였다. 증폭 후 검출된 시그널이 반응 초기에 존재하는 출발 물질의 양에 직접 비례하기 때문에(실시예 5 참조), 세 번째 임상 샘플은 너무 작은 출발 티켓 HIV-1 서열을 함유하기 때문에 HIV-1-감영으로 확인되지 않았던 것이 가능하다.

[5. 다양한 양의 HIV-1-감염된 CEM 세포와 혼합된 비-감염된 CEM 세포 내 제1 HIV-1 env 영역의 증폭]

프라이밍 올리고 뉴클레오타이드 88-21 및 88-347(아래) 및 검출 올리고 뉴클레오타이드 88-297 및 88-298(아래)을 사용하여 실시예 4에서와 같이 증폭을 수행했다.

10⁶개 비감염된 CEM 세포의 집단에서 10³내지 1개 HIV-1-감염된 CEM 세포로부터 추출된 총 핵산을 사용하는 타겟 증폭(실시예) 7을 본다)은 샘플 안에 존재하는 감염된 세포의 수에 비례하는 시그널을 나타냈다. 음성 대조표준, 10⁶개 비감염된 CEM 세포는 거의 백그라운드를 보여주지 않았다. 이런 백그라운드 시그널은 10개 감염된 CEM 세포 샘플로부터 얻는 시그널보다 상당히 적다.

[6. 시약 및 올리고뉴클레오타이드]

a. 시약 : 뉴클레오타이드 트리포스페이트는 시그마(Sigma)로부터, AMV 역전사효소는 라이프 사이언스(Life Sciences)로부터, T4, RNA 폴리머라제는 스트라겐(Stratagen)으로부터, 이. 콜라이 리보뉴클레아제 H 및 BSA는 베쎄스다 리서어치(Bethesda Research) Labs으로부터 얻는다.

b. 올리고 : Applied Biosystem 380 A를 사용하여 포스포르 아미다이트 화학물질에 의해 올리고뉴클레오타이드를 합성한 다음, HPLC에 의해 정제시켰다. 프라이머 및 프로브로서 사용된 올리고 뉴클레오타이드는 HIV-1에 대해 특이적이며 env 및 sor 영역에 대해서는, 문헌(Ratner at al., Nature 313, 277(1985)]에 의해 기록된 서열에 상응한다.

88-211 : (프라이밍 올리고 뉴클레이오티드; nt 6450-6479; env)

5'AATTTAATACGACTCACTATAGGGATCTATTGTGCCCCGGCTGTTTGCGATTCTA-3'

99-297 : (검출 올리고 뉴클레오타이드; nt 6560-6531; env)

88-298 : (검출 올리고 뉴클레오타이드; nt 6531-6560; env)

5'ACAGTACAATGTACACATGGAATTAGGCCA-3'

88-347 : (프라이밍 올리고 뉴클레오타이드; nt 6661-6632; env)

5'AATTTAATACGACTCACTATAGGGATGTACTATTATGGTTTTAGCATTGTCTGTGA-3'

88-77 : (NT 5018-4988: sor)프라이밍

5'AATTTAATACGACTCACTATATAGGGACACCTAGGGCTAACTATGTGTCCTAATAAGG-3'

87-292 : (nt 4766-4796 : sor)프라이밍

5'TAATACGACTCACTATAGGGAAAGAATAAGTTCAGAAGTACACATCCCACT-3'

86-31 : (nt 4901-4932; sor) 검출

5'-GCACACAAGTAGACCCTGAACTAGCAGACCA-3'

86-32 : (nt 4932-4901; sor) 검출

5'-TGGTCTGCTAGTTCAGGGTCTACTTGTGTGC-3'

87-284 : (nt 6551-6579; env) 프라이밍

5'-TAATACGACTCACTATAGGGAAATTAGGCCAGTAGTATCAACTCAACT-3'

86-272 : (nt 6591-6620 : env) 검출

5'-TCTAATTACTACCTCTTCTTCTGCTAGACT-3'

86-273 : (nt 6620-6591; env) 검출

5'-AGTCTAGCAGAAGAAGAGGTAGTAATTAGA-3'

각 프라이밍 올리고뉴클레오타이드는 T7 RNA 중합효소 결합 서열(줄친 부분) 및 바람직한 전사개시 부분(굵은 부분)인 5' 말단에서 서열을 함유한다. 나머지 서열은 타겟 서열을 상보적이다.

HVI-1 타겟 서열에 대해,올리고 뉴클레오타이드 88-211, 88-298, 87-292, 86-31, 87-284, 및 86-32, 및 86-272는 양성 스트랜드에 상보적이다.

[7. RNA의 유기 추출]

감염된 세포 샘플에 대한 핵산 제조를 위한 프로토콜:

펠릿세포 : 1 ml 트리스-완충된 염수로부터 10' 동안 5k rpm. 상등액을 빼내서 버려, 펠릿과 함께 50 μl 를 남긴다.

600 μ1용해 완충액 내 펠릿을 재현탁시킨다.

격렬하게 볼텍싱하고 45' 동안 50℃에서 항온처리하고, 10' 마다 10 내지 15초 동안 볼텍싱한다.

600μl 페놀:클로로포름:이소아밀 알콜(50:48:2)을 첨가시킨다. 혼합물을 유화시키기 위해 흔들어 주고 볼텍싱한다. 상들을 분리시키기 위해 2' 동안 14k rpm에서 원심분리시킨다.

수성(상단)상으로부터 525 μl를 빼낸다. (계면에 있을 수 있는 임의 세포 부스러기를 이용시키지 않는다.)

1/10 부피(40 μl) 8M LiCl 을 첨가시킨다. 이 단계에서, 샘플을 가공처리하기 위해 나눌 수 있다.

나누어진 샘플에 3 부피 얼음 냉각된 100% 에탄올을 첨가시킨다. 나누어지지 않은 샘플에는 2.5 부피 얼음 냉각된 100% 에탄올을 첨가시킨다. 잘 혼합시킨다. 밤새 -20℃ 에서, 또는 15 동안 건조한 얼음/에탄올 욕 안에서 침전시킨다.

시약

용해 완충액

20 mM 트리스 pH 7.5

150 mM NaCl

10 mM EDTA

0.2 SDS

200 μg/ml 프로테이나제 K

트리스-완충된 염수

137 mM NaCl

5.1 mM KCl

24.8 mM 트리스 염기

1N HCl 로 pH를 7.4로 조정한다.

오토클레이빙에 의해 살균시킨다.

상기 설명은 본 발명을 실행하기 위해 사용될 수 있는 구체적인 방법을 자세히 설명한다. 그 등온 증폭 시스템을 기술하기 위해 초기에 사용된 구체적인 방법을 자세히 설명하여, 당업자는 등온 단일-포트 세팅에서 유사한 증폭을 초래하고 구체적으로 공개된 것들과 다른 타겟 핵산에 이런 정보를 확장시키기 위한 대안적인 동등한 방법들을 고안하는 방법을 알기에 충분할 것이다. 이처럼, 아무리 자세하게 상기 내용이 본문 내에 보여질 수 있다 할지라도, 그 전체 영역을 제한하는 것으로 생가되어서는 안되며; 오히려, 본 발명의 범위는 첨부된 첨구범위의 타당한 구성에 의해서만 좌우된다.

Claims (6)

1. (a) 타겟 분절의 3'-하위분절의 서열에 충분히 상보적인 서열과 여기에 조작적으로 결합되는 프로모터 서열을 포함하는 단일-스트랜드 DNA인 제1프라이머 및 (b) 타겟 분절의 5'-하위 분절의 일부 서열을 포함하는 단일-스트랜드 DNA 인 제2프라이머; (c) 상기 프로모터를 인식하는 RNA 중합효소 활성을 지닌 효소, (d) DNA 의존성 DNA 중합효소 활성을 지닌 효소, (e) RNA 의존성 DNA 중합효소 활성을 지닌 효소, (f) 리보뉴클레오사이드 및 데옥시리보뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 (g) RNase H 활성을 지닌 효소를 포함하는 반응 혼합물에 타겟 RNA를 접촉시키고 상기 반응 혼합물을 기능적 이중 스트랜드 프로모터와 상기 타겟 RNA 분절의 서열을 포함하는 템플레이트의 형성 및 RNA 중합효소 활성을 지닌 효소에 의하여 상기 프로머터를 포함하는 테플레이트로부터 전사에 의한 RNA의 형성(이렇게 함으로써 전사에 의해 만들어지는 RNA는 RNA 의존성 DNA중합효소 활성, DNA 의존성 DNA 중합효소 활성을 지닌 효소, RNA 중합효소 활성을 지닌 효소 및 두 개의 프라이머를 사용하여 추가 증폭을 위한 타겟으로 사용된다)을 수반하는 반응이 일어나도록 하는 적절한 조건 하에서 유지시키는 것을 포함하는, 핵산 듀플렉스의 임의의 실질적 열 변성을 수반하지 않는 연속 반응인, 중복되지 않은 5'-하위분절 및 3'-하위단편을 포함한 타겟 RNA 분절을 증폭시키는 방법.
2. 제1항에 있어서, RNase H 활성을 지닌 효소가 이. 콜라이 RNase H임을 특징으로 하는 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, DNA-의존성 DNA 중합효소 및 역전사효소 활성 모두가 AMV 및 MMLV로 구성된 군 중에서 선택되는 레트로바이러스의 역전사효소에 의하여 제공되고 RNA 중합효소 활성이 T7, T3 및 SP6로 구성된 군 중 중에서 선택되는 박테리오파지의 RNA 중합효소에 의하여 제공되며 용액 내에는 하나의 RNA 중합효소가 존재함을 특징으로 하는 방법.
4. 제1항 또는 제2항에 있어서,상기 반응 혼합물이 33℃ 내지 46℃ 온도에서 유지됨을 특징으로 하는 방법.
5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 증폭 후에 타겟 RNA 및/또는 상기 타겟 RNA에 상보적인 서열을 지닌 RNA가 핵산 프로브 하이브리드화 분석에 의하여 검출됨을 특징으로 하는 방법.
6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 제2 프라이머가 반응에서 형성된 RNA/DNA 듀플렉스의 RNA 스트랜드의 선택적인 분해 결과인 방법.