CN111732579B - 一种聚醚聚酮类化合物polydecalinmycin及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种聚醚聚酮类化合物polydecalinmycin及其制备方法和应用。所述的化合物polydecalinmycin的结构如式(I)所示。本发明的化合物polydecalinmycin是从链霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 03032的spmO基因缺失突变株SPM257的发酵培养物中分离纯化得到的，是一个具有新颖骨架结构的聚醚聚酮类化合物。聚醚聚酮类化合物是一类具有多种优良生物活性的复杂分子，进一步对polydecalinmycin进行生物活性的筛选和研究，有望开发新型的药物先导化合物。
Description
技术领域
本发明涉及工业微生物领域，具体涉及一种聚醚聚酮类化合物polydecalinmycin及其制备方法和在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
聚醚聚酮类(Polyether polyketides)化合物是一类含有羧酸基团以及多个五元或六元醚环的复杂聚酮类化合物，这一家族的化合物结构多样，一般具有长链及多个连续的手性中心，并具有抗菌、抗肿瘤、抗氧化等多种生物活性。Polydecalinmycin是首次发现的具有萘烷(decalin)骨架结构的聚醚聚酮类化合物。我们前期研究发现链霉菌Streptomyces sp.SCSIO03032主要产生spiroindimicins类次级代谢产物并鉴定了该类化合物的生物合成基因簇spm，其中spmO(色氨酸氧化酶)基因是合成spiroindimicins类的关键基因，敲除spmO基因可得到不产spiroindimicins的spmO基因缺失突变株SPM257。Polydecalinmycin即是通过敲除spiroindimicins主产物生物合成基因以激活菌株中其他代谢途径从而发现原来野生型菌株中不含或含量很少的化合物的研究策略发现的新颖化合物。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种新的聚醚聚酮类化合物polydecalinmycin或其药用盐。
本发明的一种新的聚醚聚酮类化合物polydecalinmycin，其结构如式(I)所示：
化合物polydecalinmycin，分子式为C43H70O8，其特征是具有一个萘烷(decalin)环，一个四氢呋喃连四氢吡喃环和一个末端羧基，其C-8和C-9间为顺式双键的烯醇式，C-20和C-21间为反式双键，C-2为S构型，C-3为R构型，C-6为S构型，C-22为S构型，C-23为S构型，C-25为S构型，C-28为S构型，C-29为R构型，C-32为R构型，C-33为R构型。
本发明的第二个目的是提供一种新的聚醚聚酮类化合物polydecalinmycin的制备方法。所述的化合物polydecalinmycin是从链霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 03032的spmO基因缺失突变株SPM257的发酵培养物中分离纯化得到的。
具体的，所述的制备方法包括以下步骤：
a、制备spmO基因缺失突变株SPM257的发酵培养物，将活化的突变株SPM257接入种子培养基，28℃，200rpm，培养72h，得种子液，将种子液以10％v/v的接种量接入到发酵培养基中，28℃，200rpm振荡培养5天后，往培养基中加入灭菌的Amberlite XAD-16大孔树脂，继续培养2天后，将吸附有发酵代谢产物的大孔树脂同发酵液和菌丝体分离开，大孔树脂再经丙酮洗脱，洗脱液蒸馏浓缩后得到水混合液，该水混合液再用丁酮进行萃取，丁酮萃取层浓缩后得到总提取物。所述的种子培养基组成为可溶性淀粉10g，酵母提取粉4g，细菌学蛋白胨2g，海盐30g，加水定容至1L，pH 7.0；所述的发酵培养基组成为可溶性淀粉10g，K2HPO41g，MgSO4·7H2O 1g，(NH4)2SO4 2g，CaCO3 2g，微量元素适量，加水定容至1L，pH 7.0。
b、将总提取物经硅胶柱层析，用氯仿/甲醇作为洗脱剂，从体积比100:0～0:100进行梯度洗脱，收集氯仿/甲醇体积比92:8梯度洗脱下来的流分Fr.1，后经葡聚糖凝胶柱SephadexLH-20，以氯仿/甲醇体积比1:1作为流动相洗脱并浓缩后得到含有polydecalinmycin的流份Fr.1-1，流份Fr.1-1再经Sephadex LH-20柱分离纯化，以甲醇作为流动相洗脱，得到化合物polydecalinmycin。
本发明的第三个目的是提供一种上述的化合物polydecalinmycin或其药用盐在制备抗肿瘤药物中的应用。
优选，所述的化合物polydecalinmycin在制备治疗人神经癌药物中的应用。
优选，所述的化合物polydecalinmycin在制备治疗人乳腺癌细胞药物中的应用。
优选，所述的化合物polydecalinmycin在制备治疗人肝癌药物中的应用。
优选，所述的化合物polydecalinmycin在制备治疗人肺癌药物中的应用。
优选，所述的化合物polydecalinmycin在制备治疗人结直肠癌药物中的应用。
优选，所述的化合物polydecalinmycin在制备治疗人急性淋巴白血病药物中的应用。
本发明的第四个目的是提供一种抗肿瘤药物，所述的抗肿瘤药物含有有效量的上述的化合物polydecalinmycin或其药用盐作为活性成分。
本发明的第五个目的是提供上述的链霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 03032的spmO基因缺失突变株SPM257在制备上述的化合物polydecalinmycin中的应用。
本发明的有益效果为：
本发明提供了一种新的聚醚聚酮类化合物polydecalinmycin及其制备方法。经试验证明，化合物polydecalinmycin对多种人肿瘤细胞都具有较好的细胞毒活性，并且在部分肿瘤细胞株上的活性优于临床使用的阳性药阿奇霉素(adriamycin)和5-氟尿嘧啶(5-FU)。化合物polydecalinmycin有望开发成为抗肿瘤新药。
本发明的链霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 03032，于2011年7月18日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉市武汉大学，其保藏编号为CCTCCNO.M2011258，并公开于专利申请号为CN 201210087537.7，发明名称为：链霉菌、抗肿瘤化合物Spiro-Indimycin A-D及其制备方法和应用的中国发明专利中。
本发明涉及的spmO基因缺失突变株SPM257是通过对链霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 03032的spmO(色氨酸氧化酶)基因进行敲除后获得，具体方法公开于文献：LiangMa,Wenjun Zhang,Yiguang Zhu,Guangtao Zhang,Haibo Zhang,Qingbo Zhang,LipingZhang,Chengshan Yuan,Changsheng Zhang*.Identification and Characterization ofa Biosynthetic Gene Cluster for Tryptophan Dimers in Deep Sea-DerivedStreptomyces sp.SCSIO 03032.Applied Microbiology and Biotechnology.2017,101(15):6123-6136。该菌株本申请人也持有，保证自20年内向公众提供。
附图说明
图1是链霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 03032的spmO基因缺失突变株SPM257总提取物和野生型(WT)总提取物的高效液相色谱图。
图2是化合物polydecalinmycin关键的1H-1H COSY和HMBC相关信号及化学结构。
图3是化合物polydecalinmycin的1H NMR谱图。
图4是化合物polydecalinmycin的DEPT135和13C NMR谱图。
图5是化合物polydecalinmycin的的1H-1H COSY谱图。
图6是化合物polydecalinmycin的HSQC谱图。
图7是化合物polydecalinmycin的HMBC谱图。
图8是化合物polydecalinmycin的ROESY谱图。
图9是化合物polydecalinmycin的HRESIMS谱图。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：Polydecalinmycin的分离、制备、结构鉴定和抗肿瘤活性测试
1、链霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 03032的spmO基因缺失突变株SPM257的制备
申请人团队前期测序获得了链霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 03032的全基因组信息，并建立了该菌株的遗传操作体系，从中鉴定了色氨酸氧化酶基因spmO，通过运用PCR-targeting的技术获得spmO基因缺失突变株SPM257。具体方法公开于文献：Liang Ma,Wenjun Zhang,Yiguang Zhu,Guangtao Zhang,Haibo Zhang,Qingbo Zhang,LipingZhang,Chengshan Yuan,Changsheng Zhang*.Identification and Characterization ofa Biosynthetic Gene Cluster for Tryptophan Dimers in Deep Sea-DerivedStreptomyces sp.SCSIO 03032.Applied Microbiology and Biotechnology.2017,101(15):6123-6136。
2、配制培养基
种子培养基配制：可溶性淀粉10g，酵母提取粉4g，细菌学蛋白胨2g，海盐30g，加水定容至1L，pH 7.0，115℃，灭菌30min，备用；
发酵培养基配制：可溶性淀粉10g，K2HPO4 1g，MgSO4·7H2O 1g，(NH4)2SO4 2g，CaCO32g，微量元素适量，加水定容至1L，pH 7.0，115℃，灭菌30min，备用。
以上对应的固体培养基加入2wt％的琼脂粉。
3、发酵培养
种子培养：将在平板培养基上活化的spmO基因缺失突变株SPM257接入液体种子培养基(1000mL)中，28℃，200rpm，培养72h制得种子液；
规模发酵培养：将种子液以10％v/v的接种量接入到发酵培养基中(10L)，28℃，200rpm，振荡培养5天后，加入灭菌的Amberlite XAD-16大孔树脂，再发酵2天后开始收集发酵液中吸附有次级代谢产物的大孔树脂。
4、提取总提取物
将发酵液过滤，得到吸附次级代谢产物的大孔树脂部分，并用清水洗去残留的菌体和菌液，滤干后用丙酮洗脱大孔树脂部分，洗脱液蒸馏浓缩后得到水混合液，该水混合液再用丁酮进行萃取，浓缩丁酮萃取层后得到总提取物(约5g)。
采用高效液相色谱(HPLC)法对链霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 03032的spmO基因缺失突变株SPM257总提取物和野生型(WT)总提取物(即是链霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 03032按上述步骤发酵获得的总提取物)进行检测，HPLC检测条件：色谱柱为Phenomenex kinetex C18(250×4.6mm,5μm)，流动相包括A相和B相，流动相A相：10％(体积分数)乙腈加0.08％(体积分数)的三氟乙酸，溶剂为水，流动B相：90％(体积分数)的乙腈，溶剂为水；进样程序：0-20min，流动相比例为A相/B相(体积比)：95:5-0:100；20-25min，流动相比例为A相/B相(体积比)：0:100；25-26min，流动相比例为A相/B相(体积比)：0:100-95:5；26-30min，流动相比例为A相/B相(体积比)：95:5，检测波长为280nm，流速1mL/min，其中24.8min出现的峰1为化合物polydecalinmycin，结果见图1。
5、化合物的分离和纯化
将总提取物经硅胶柱层析，用氯仿/甲醇作为洗脱剂，从体积比100:0～0:100进行梯度洗脱，通过高效液相色谱法追踪目标化合物，收集氯仿/甲醇体积比92:8梯度洗脱下来的流分Fr.1，后经葡聚糖凝胶柱Sephadex LH-20，以氯仿/甲醇体积比1:1作为流动相洗脱并浓缩后，得到含有polydecalinmycin的流份Fr.1-1，流份Fr.1-1再经Sephadex LH-20柱分离纯化，以甲醇作为流动相洗脱，得到纯的单体化合物polydecalinmycin(30mg)。
6、化合物的鉴定
对从链霉菌SCSIO 03032的spmO基因缺失突变株SPM257发酵培养物中制备得到的化合物polydecalinmycin(式(I))进行核磁共振(NMR)和高分辨质谱(HRESIMS)的测试，并进行数据分析和结构鉴定，其鉴定结果如下：
化合物polydecalinmycin：淡黄色胶状，UV(CH3OH)λmax(logε)282nm(4.99)；
109.16(c 0.8,CH3OH)；1H NMR(500MHz,CDCl3)和13C NMR(125MHz,CDCl3)的归属数据见表1，HRMS(ESI-TOF)m/z:715.5141[M+H]+,Calcd for C43H71O8,715.5143.1D和2D NMR以及HRESIMS见图3-9；
表1化合物polydecalinmycin的1H和13C NMR数据(δin ppm,J in Hz)a
a测试溶剂为CDCl3，1H NMR测试于500MHz，13C NMR测试于125MHz，重叠的信号的裂峰和耦合常数均为显示。
化合物polydecalinmycin的UV显示在282nm处有特征的最大吸收峰，HRESIMS得到其准分子离子峰为m/z 715.5141[M+H]+(calcd for C43H71O8,715.5143)，可得到该化合物的分子式为C43H70O8，计算不饱和度为9。分析其1H和13C NMR数据表明该化合物共有43个碳，包括有7个甲基，14个亚甲基，12个sp3杂化的次甲基，5个sp2杂化的次甲基，2个羰基，1个sp2杂化的季碳和2个sp3杂化的季碳。通过2D NMR(1H-1H COSY,HSQC,HMBC,ROESY)的综合解析(图2)，可推导出该化合物的平面结构和部分立体构型，再结合该类化合物生物合成的特征分析，可确定该化合物为首次发现的具有萘烷(decalin)骨架的一个聚醚类聚酮化合物。
根据上述数据结果，确认化合物polydecalinmycin的结构如式(I)所示：
实施例3：化合物polydecalinmycin抗肿瘤活性测定
采用人神经癌细胞SF-268、人乳腺癌细胞MCF-7、人肝癌细胞HepG-2、人肺癌细胞A549和人结直肠癌细胞株(HCT-116,DLD1,RKO,HT-29,SW480,LOVO,CACO2,SW620,NCI-H716,COLO205)对化合物polydecalinmycin进行了体外细胞毒活性的评价(表2)。具体实验方法为：取对数生长期的肿瘤细胞，按每孔5000个细胞(100μL)加到96孔细胞培养板中在37℃、5％CO2条件下培养24小时后，分别加入不同浓度的化合物polydecalinmycin，阳性对照，DMSO(阴性对照)并培养72小时。然后用30μL的MTT培养基溶液(5mg mL-1PBS)在37℃孵育4小时后，除去MTT培养基，每孔加入100μL的DMSO溶液溶解沉淀并除去气泡。最后用酶标仪测定样品在570nm的吸光值并计算半数抑制浓度(IC50)值。以上实验均独立重复3次。实验结果显示化合物polydecalinmycin对多种人肿瘤细胞都具有较好的细胞毒活性，并且在部分肿瘤细胞株上的活性优于临床使用的阳性药阿奇霉素(adriamycin)和5-氟尿嘧啶(5-FU)。
表2化合物polydecalinmycin对不同肿瘤细胞的体外毒性
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.化合物polydecalinmycin或其药用盐，其结构如式(I)所示：
2.一种权利要求1所述的化合物polydecalinmycin的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
a、制备spmO基因缺失突变株SPM257的发酵培养物，在发酵培养基中加入大孔树脂，培养结束后，将吸附有发酵代谢产物的大孔树脂同发酵液和菌丝体分离开，大孔树脂再经丙酮洗脱，洗脱液蒸馏浓缩后得到水混合液，该水混合液再用丁酮进行萃取，丁酮萃取层浓缩后得到总提取物；
b、将总提取物经硅胶柱层析，用氯仿/甲醇作为洗脱剂，从体积比100:0～0:100进行梯度洗脱，收集氯仿/甲醇体积比92:8梯度洗脱下来的流分Fr.1，后经葡聚糖凝胶柱SephadexLH-20，以氯仿/甲醇体积比1:1作为流动相洗脱并浓缩后得到含有polydecalinmycin的流份Fr.1-1，流份Fr.1-1再经Sephadex LH-20柱分离纯化，以甲醇作为流动相洗脱，得到化合物polydecalinmycin。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的spmO基因缺失突变株SPM257的发酵培养物制备步骤为：将活化的突变株SPM257接入种子培养基，28℃，200rpm，培养72h，得种子液，将种子液以10％v/v的接种量接入到发酵培养基中，28℃，200rpm振荡培养。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的种子培养基组成为可溶性淀粉10g，酵母提取粉4g，细菌学蛋白胨2g，海盐30g，加水定容至1L，pH 7.0。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的发酵培养基组成为可溶性淀粉10g，K2HPO4 1g，MgSO4·7H2O 1g，(NH4)2SO4 2g，CaCO3 2g，微量元素适量，加水定容至1L，pH7.0。
6.权利要求1所述的化合物polydecalinmycin或其药用盐在制备抗肿瘤药物中的应用，所述的抗肿瘤药物为抗神经癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、结直肠癌或急性淋巴白血病药物。
7.一种抗肿瘤药物，其特征在于，含有有效量的权利要求1所述的化合物polydecalinmycin或其药用盐作为活性成分，所述的抗肿瘤药物为抗神经癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、结直肠癌或急性淋巴白血病药物。
8.链霉菌(Streptomyces sp.)SCSIO 03032的spmO基因缺失突变株SPM257在制备权利要求1所述的化合物polydecalinmycin中的应用。
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