CN111699268A

CN111699268A - 通过用探针的快速切换和再杂交进行顺序杂交编条形码来多重标记分子

Info

Publication number: CN111699268A
Application number: CN201880088930.3A
Authority: CN
Inventors: 龙·蔡; 武井洋大
Original assignee: California Institute of Technology
Current assignee: California Institute of Technology
Priority date: 2017-12-08
Filing date: 2018-12-07
Publication date: 2020-09-22
Anticipated expiration: 2038-12-07
Also published as: US20210115504A1; CA3083224A1; JP2021505152A; AU2018379082A1; WO2019113547A1; CN111699268B; EP3720972A1

Abstract

本发明尤其提供了用于检测和/或定量细胞、组织、器官或生物体中的核酸的技术。本发明通过顺序编条形码提供了用于对大量的靶诸如转录物和/或DNA基因座进行高通量谱分析的方法。在一些实施方案中，核酸探针包含经由可裂解接头与结合序列连接的信号部分。

Description

通过用探针的快速切换和再杂交进行顺序杂交编条形码来多重标记分子

相关申请的交叉引用

本申请要求于2017年12月8日提交的美国临时申请序列号62/596,337的权益，在此将该申请通过引用以其整体并入本文。

关于联邦赞助研究或开发的声明

本发明根据由美国国立卫生研究院(National Institute of Health)授予的批准第HD075605号在政府支持下进行。美国政府对本发明享有某些权利。

发明背景

细胞的转录谱分析(profiling)是许多目的必需的。可以在单细胞中分辨多于一种(multiple)mRNA的显微成像可以提供关于转录物丰度和定位的有价值的信息，对理解细胞身份的分子基础和开发疾病治疗是重要的。因此，对通过例如显微成像对细胞中的转录物进行谱分析的新的和改进的方法存在需要。

发明概述

本发明提供了与对细胞尤其是单细胞中的转录物或DNA基因座进行谱分析的现有技术相关的挑战或缺点的某些洞见。此外，本发明提供了用于有效地实现此类谱分析包括单细胞的此类谱分析的新技术。提供的技术是广泛有用的，包括例如用于分离的细胞、组织中的细胞、器官中的细胞和/或生物体中的细胞的谱分析。

例如，本发明提供了以下洞见：现有技术诸如单细胞RNA-seq或qPCR，需要将单细胞分离并且将其放入多孔格式中，这会是成本高昂的、劳动密集的并且倾向产生伪结果(prone to artifacts)的多重步骤的方法。此外，本发明认识到，首先使用酶促反应将mRNA转换成DNA模板的现有原位测序技术可以是非常低效的(例如在mRNA向DNA转化过程中)，因此，通常，只有一小部分的RNA被转化和检测。本发明提供了这样的具体洞见：关于这种低效率(对于RT估计在1％，而对于PLA在10％)的一种主要缺点是它可以在基因表达测量中引入显著的噪音和偏倚。本发明还认识到，利用单分子荧光原位杂交(smFISH)的现有光谱mRNA编条形码技术需要不同的荧光基团用于规模放大，并且可能在可生成的条形码的数量上被限制。smFISH还需要在杂交期间将探针分成编条形码的亚组。因为smFISH通常使用两种或更多种颜色用于靶，其在图像中产生高密度的对象，这可能增加数据分析的复杂性。

本发明尤其提供了用于对例如转录物和/或DNA基因座进行谱分析的新技术，该新技术克服了与本发明之前的方法相关的一种或更多种或所有问题。在一些实施方案中，本发明提供了用于通过允许不同靶的多路复用(multiplexing)的顺序编条形码方案在细胞中检测多个靶(例如转录物或DNA基因座)的方法。

在一些实施方案中，本发明提供了方法，所述方法包括以下步骤：

(a)进行第一接触步骤，所述第一接触步骤包括使包含多于一种(aplurality of)核酸的细胞与第一多于一种可检测地标记的寡核苷酸接触，所述第一多于一种可检测地标记的寡核苷酸的每一种靶向核酸并且被可检测部分标记，因此组合物至少包含：

(i)第一寡核苷酸，所述第一寡核苷酸靶向第一核酸并且被第一可检测部分标记；以及

(ii)第二寡核苷酸，所述第二寡核苷酸靶向第二核酸并且被第二可检测部分标记；

(b)在第一接触步骤之后对细胞成像，以便检测所述第一多于一种可检测地标记的寡核苷酸中的寡核苷酸与其靶的相互作用；

(c)进行第二接触步骤，所述第二接触步骤包括使细胞与第二多于一种可检测地标记的寡核苷酸接触，所述第二多于一种可检测地标记的寡核苷酸包括靶向被所述第一多于一种可检测地标记的寡核苷酸靶向的重叠核酸的寡核苷酸，因此所述第二多于一种可检测地标记的寡核苷酸至少包含：

(i)第三寡核苷酸，所述第三寡核苷酸任选地在序列上与第一寡核苷酸相同，所述第三寡核苷酸靶向第一核酸；和

(ii)第四寡核苷酸，所述第四寡核苷酸任选地在序列上与第二寡核苷酸相同，所述第四寡核苷酸靶向第二核酸，

其中所述第二多于一种可检测地标记的寡核苷酸与所述第一多于一种可检测地标记的寡核苷酸的不同在于，存在于所述第二多于一种可检测地标记的寡核苷酸中的寡核苷酸的至少一种被与所述第一多于一种可检测地标记的寡核苷酸中靶向相同核酸的相应寡核苷酸不同的可检测部分标记，因此在所述第二多于一种可检测地标记的寡核苷酸中：

(iii)第三寡核苷酸被第一可检测部分、第二可检测部分或第三可检测部分标记；并且

(iv)第四寡核苷酸被第一可检测部分、第二可检测部分、第三可检测部分或第四可检测部分标记，

其中第三寡核苷酸被与第一寡核苷酸所用的不同的可检测部分标记，或第四寡核苷酸被与第二寡核苷酸所用的不同的可检测部分标记，或两者；

(d)在第二接触步骤之后对细胞成像，以便检测所述第二多于一种可检测地标记的寡核苷酸中的寡核苷酸与它们的靶的相互作用；以及

(e)任选地重复接触和成像步骤，每次用新的多于一种可检测地标记的寡核苷酸，所述新的多于一种可检测地标记的寡核苷酸包含靶向被所述第一多于一种可检测地标记的寡核苷酸和所述第二多于一种可检测地标记的寡核苷酸靶向的重叠核酸的寡核苷酸，其中由于标记靶向相同核酸的寡核苷酸的可检测部分中的至少一种差异，所利用的每组多于一种可检测地标记的寡核苷酸与所利用的其他各组的多于一种可检测地标记的寡核苷酸不同。

在一些实施方案中，本发明(例如，如在图1中所展示的)，提供了包括以下步骤的方法：

(a)进行第一接触步骤，所述第一接触步骤包括使包含多于一种转录物和DNA基因座的细胞与第一多于一种可检测地标记的寡核苷酸接触，所述第一多于一种可检测地标记的寡核苷酸的每种靶向转录物或DNA基因座并且被可检测部分标记，因此组合物至少包含：

(i)第一寡核苷酸，所述第一寡核苷酸靶向第一转录物或DNA基因座并且被第一可检测部分标记；以及

(ii)第二寡核苷酸，所述第二寡核苷酸靶向第二转录物或DNA基因座并且被第二可检测部分标记；

(b)在第一接触步骤之后对细胞成像，以便检测所述第一多于一种可检测地标记的寡核苷酸的寡核苷酸与它们的靶的识别；

(c)进行第二接触步骤，所述第二接触步骤包括使所述细胞与第二多于一种可检测地标记的寡核苷酸接触，所述第二多于一种可检测地标记的寡核苷酸包含靶向被所述第一多于一种可检测地标记的寡核苷酸靶向的重叠转录物和/或DNA基因座的寡核苷酸，因此所述第二多于一种可检测地标记的寡核苷酸至少包含：

(i)第三寡核苷酸，所述第三寡核苷酸任选地在序列上与所述第一寡核苷酸相同，所述第三寡核苷酸靶向所述第一转录物或DNA基因座；和

(ii)第四寡核苷酸，所述第四寡核苷酸任选地在序列上与所述第二寡核苷酸相同，所述第四寡核苷酸靶向所述第二转录物或DNA基因座，

其中所述第二多于一种可检测地标记的寡核苷酸与第一多于一种可检测地标记的寡核苷酸的不同在于存在于所述第二多于一种可检测地标记的寡核苷酸中的寡核苷酸的至少一种被与所述第一多于一种中靶向相同转录物或DNA基因座的相应寡核苷酸不同的可检测部分标记，因此在所述第二多于一种可检测地标记的寡核苷酸中：

(iii)所述第三寡核苷酸被所述第一可检测部分、所述第二可检测部分或第三可检测部分标记；并且

(iv)所述第四寡核苷酸被所述第一可检测部分、所述第二可检测部分、所述第三可检测部分或第四可检测部分标记，

其中所述第三寡核苷酸被与第一寡核苷酸所用的不同的可检测部分标记，或第四寡核苷酸被与第二寡核苷酸所用的不同的可检测部分标记，或两者；

(d)在所述第二接触步骤之后对细胞成像，以便检测检测所述第二多于一种的寡核苷酸与它们的靶的识别；以及

(e)任选地重复所述接触和成像步骤，每次用新的多于一种可检测地标记的寡核苷酸，所述新的多于一种可检测地标记的寡核苷酸包含靶向被所述第一多于一种可检测地标记的寡核苷酸和第二多于一种可检测地标记的寡核苷酸靶向的重叠转录物或DNA基因座的寡核苷酸，其中由于标记靶向相同转录物或DNA基因座的寡核苷酸的可检测部分上的至少一种差异，所利用的每组多于一种可检测地标记的寡核苷酸与所利用的其他各组的多于一种可检测地标记的寡核苷酸不同。

在一些实施方案中，被可检测地标记的寡核苷酸靶向的核酸是转录物和/或DNA基因座，或包含转录物和/或DNA基因座。在一些实施方案中，被可检测地标记的寡核苷酸靶向的核酸是转录物，或包括转录物。在一些实施方案中，被可检测地标记的寡核苷酸靶向的核酸是转录物。在一些实施方案中，被可检测地标记的寡核苷酸靶向的核酸是DNA基因座，或包括DNA基因座。在一些实施方案中，被可检测地标记的寡核苷酸靶向的核酸是DNA基因座。在一些实施方案中，在接触步骤中使用的可检测地标记的寡核苷酸的每组多于一种可检测地标记的寡核苷酸靶向相同的转录物和/或DNA基因座。

在一些实施方案中，在接触步骤中使用的多于一种可检测地标记的寡核苷酸被称为一组可检测地标记的寡核苷酸。在一些实施方案中，一组可检测地标记的寡核苷酸的靶被称为一组靶。在一些实施方案中，组中的靶是转录物或包括转录物。在一些实施方案中，组中的靶是转录物。在一些实施方案中，组中的每一种靶是转录物或包括转录物。在一些实施方案中，组中的每一种靶是转录物。在一些实施方案中，组中的靶是DNA基因座或包括DNA基因座。在一些实施方案中，组中的靶是DNA基因座。在一些实施方案中，组中的每一种靶是DNA基因座或包括DNA基因座。在一些实施方案中，组中的每一种靶是DNA基因座。

在一些实施方案中，所提供的方法在成像步骤之后任选地包括去除多于一种可检测地标记的寡核苷酸的步骤。在一些实施方案中，提供的方法包括在每个成像步骤之后去除多于一种可检测地标记的寡核苷酸的步骤。在一些实施方案中，去除的步骤包括使多于一种可检测地标记的寡核苷酸与消化可检测地标记的寡核苷酸的酶接触。在一些实施方案中，去除步骤包括使多于一种可检测地标记的寡核苷酸与DNA酶接触。在一些实施方案中，去除步骤包括使多于一种可检测地标记的寡核苷酸与RNA酶接触。在一些实施方案中，去除步骤包括光漂白。

在一些实施方案中，每一组包括靶向相同的转录物和/或DNA基因座的两种或更多种可检测地标记的寡核苷酸。在一些实施方案中，靶向相同的转录物和/或DNA基因座的组中的两种或更多种可检测地标记的寡核苷酸产生相同的可检测的信号。在一些实施方案中，靶向相同的转录物和/或DNA基因座的组中的所有可检测地标记的寡核苷酸产生相同的可检测的信号。在一些实施方案中，其中可检测地标记的寡核苷酸被荧光团标记，可检测的信号是某种颜色。在一些实施方案中，靶向相同的转录物和/或DNA基因座的组中的所有可检测地标记的寡核苷酸被提供相同的可检测的颜色的荧光团标记。

在一些实施方案中，靶向相同的转录物和/或DNA基因座的组中的两种或更多种可检测地标记的寡核苷酸具有相同的可检测的标记。在一些实施方案中，靶向相同的转录物和/或DNA基因座的组中的所有可检测地标记的寡核苷酸具有相同的可检测的标记。在一些实施方案中，靶向相同的转录物和/或DNA基因座的所有可检测地标记的寡核苷酸具有相同的荧光团。

在一些实施方案中，本发明提供了可用于进行所提供的方法的组合物。

在一些实施方案中，本发明提供了包含多于一种可检测地标记的寡核苷酸的组合物，所述可检测地标记的寡核苷酸的每一种靶向核酸并且被可检测部分标记，因此所述组合物至少包含：

(ii)第二寡核苷酸，所述第二寡核苷酸靶向第二核酸并且被第二可检测部分标记。

在一些实施方案中，本发明提供了试剂盒，该试剂盒包含多于一种可检测地标记的寡核苷酸，所述可检测地标记的寡核苷酸的每一种靶向核酸并且被可检测部分标记，因此所述试剂盒至少包含：

(i)第一寡核苷酸，所述第一寡核苷酸靶向第一核酸并且被第一可检测部分标记；

(iii)第三寡核苷酸，所述第三寡核苷酸任选地在序列上与第一寡核苷酸相同，第三寡核苷酸靶向第一核酸并且被第一可检测部分、第二可检测部分或第三可检测部分标记；和

(iv)第四寡核苷酸，所述第四寡核苷酸任选地在序列上与第二寡核苷酸相同，第四寡核苷酸靶向核酸并且被第一可检测部分、第二可检测部分、第三可检测部分或第四可检测部分标记，

其中第三寡核苷酸被与第一寡核苷酸不同的可检测部分标记，或第四寡核苷酸被与第二寡核苷酸不同的可检测部分标记，或两者。

在一些实施方案中，可检测部分是荧光团或包含荧光团。

在一些实施方案中，多于一种可检测地标记的寡核苷酸靶向两种或更多种核酸(“靶”)。在一些实施方案中，靶是转录物或包含转录物。在一些实施方案中，靶是转录物。在一些实施方案中，靶是RNA。在一些实施方案中，靶是mRNA。在一些实施方案中，靶是tRNA。在一些实施方案中，靶是rRNA。在一些实施方案中，靶是非编码RNA。在一些实施方案中，靶是DNA基因座或包含DNA基因座。在一些实施方案中，转录物是DNA基因座。在一些实施方案中，靶是转录物的基因座。在一些实施方案中，DNA序列的不同的转录物，诸如基因的剪接变体，构成不同的靶，其中所述变体中的一种或更多种可以独立地被靶向和检测或定量。在一些实施方案中，本发明提供了检测个体剪接变体的方法、组合物或试剂盒。在一些实施方案中，本发明提供了用于检测单核苷酸多态性(SNP)的方法、组合物或试剂盒。

在一些实施方案中，提供的方法定量靶，例如，转录物或DNA基因座。

在一些实施方案中，靶向相同的靶的寡核苷酸具有相同的序列组，即，当其在不同的步骤被应用时，寡核苷酸之间的差异在部分间而不是序列间。

在一方面中，本文公开了包括多于一种一级探针、第一多于一种桥接探针和第一多于一种读取探针的组合物。

在一些实施方案中，多于一种一级探针中的每种一级探针包含：与靶核酸分子中的互补靶序列结合的一级结合序列，和与一级结合序列的一端连接的第一突出端序列。

在一些实施方案中，第一多于一种桥接探针中的每种桥接探针包含与多于一种一级探针中的一级探针的第一突出端序列的全部或一部分特异性结合的结合序列，以及串联连接并且与结合序列连接的一个或更多个读取结合靶。

在一些实施方案中，第一多于一种读取探针中的每种读取探针包含：与第一多于一种桥接探针中的桥接探针的一个或更多个读取结合靶的第一读取结合靶特异性结合的读取结合序列，以及经由可裂解接头与读取结合序列连接的信号部分。

在这些实施方案中，在来自第一多于一种读取探针的每种读取探针与一个或更多个读取结合靶之一的第一读取结合靶结合后，信号部分能够发射第一可检测视觉信号。

在一些实施方案中，组合物还包括：第二多于一种读取探针，其中每种读取探针包含：与第一多于一种桥接探针中的桥接探针的一个或更多个读取结合靶中的第二读取结合靶特异性结合的读取结合序列，以及经由可裂解接头与读取结合序列连接的信号部分。

在这些实施方案中，在来自第二多于一种读取探针的每种读取探针与一个或更多个读取结合靶中的第二读取结合靶结合后，信号部分能够发射第二可检测视觉信号。

在一些实施方案中，组合物还包括：与一级结合序列的另一端连接的第二突出端序列。

在一些实施方案中，组合物还包括：第二多于一种桥接探针，其中每种桥接探针包含：与多于一种一级探针中的一级探针的第二突出端序列的全部或一部分特异性结合的结合序列，以及串联连接并且与结合序列连接的一个或更多个另外的读取结合靶。

在一些实施方案中，组合物还包括：第三多于一种读取探针，其中每种读取探针包含：与第二多于一种桥接探针中的桥接探针的一个或更多个另外的读取结合靶中的第一另外的读取结合靶特异性结合的读取结合序列，以及经由可裂解接头与读取结合序列连接的信号部分。

在这些实施方案中，在来自第三多于一种读取探针的每种读取探针与一个或更多个另外的读取结合靶中的第一另外的读取结合靶结合后，信号部分能够发射第三可检测视觉信号。

在一些实施方案中，组合物还包括：第四多于一种读取探针。第四多于一种读取探针中的每种读取探针包含：与第二多于一种桥接探针中的桥接探针的一个或更多个另外的读取结合靶中的第二另外的读取结合靶特异性结合的读取结合序列，以及经由可裂解接头与读取结合序列连接的信号部分。

在这些实施方案中，在来自第四多于一种读取探针的每种读取探针与一个或更多个另外的读取结合靶中的第二另外的读取结合靶结合后，信号部分能够发射第四可检测视觉信号。

在一些实施方案中，可裂解接头选自由以下组成的组：酶可裂解接头、亲核/碱敏感接头、还原敏感接头、光可裂解接头、亲电/酸敏感接头、金属辅助的可裂解接头和氧化敏感接头。

在一些实施方案中，可裂解接头是二硫键或核酸限制性位点。在一些实施方案中，一个或更多个读取结合靶包括三个或更多个读取结合靶。

在其中存在第二突出端的一些实施方案中，另外的一个或更多个读取结合靶包括三个或更多个读取结合靶。

在一方面中，本文公开了利用多于一种一级探针、第一多于一种桥接探针和第一多于一种读取探针的顺序杂交方法。在一些实施方案中，所述方法包括以下步骤：a)使靶核酸分子与多于一种一级探针接触，其中每种一级探针包含：与靶核酸分子中的互补靶序列结合的一级结合序列，和与一级结合序列的一端连接的第一突出端序列；

b)在步骤a)之后使靶核酸分子与第一多于一种桥接探针接触，其中每种桥接探针包含：与多于一种一级探针中的一级探针的第一突出端序列的全部或一部分特异性结合的结合序列，以及串联连接并且与结合序列连接的一个或更多个读取结合靶；以及c)在步骤b)之后使靶核酸分子与第一多于一种读取探针接触，其中每种读取探针包含：与多于一种一级探针中的一级探针的一个或更多个读取结合靶中的第一读取结合靶特异性结合的读取结合序列，以及经由可裂解接头与读取结合序列连接的信号部分。

在这些实施方案中，在来自第一多于一种读取探针的每种读取探针与第一多于一种桥接探针中的桥接探针的一个或更多个读取结合靶中的第一读取结合靶结合后，信号部分能够发射第一可检测视觉信号。

在一些实施方案中，所述方法还包括以下步骤：c1)在步骤c)之后对靶核酸分子成像，以便通过第一可检测视觉信号的存在来检测第一多于一种读取探针与一级桥接探针的一个或更多个读取结合靶中的第一读取结合靶之间的相互作用；以及c2)在步骤c1)之后施加裂解剂以裂解接头，从而从第一多于一种读取探针中的每个读取探针消除信号部分。

在一些实施方案中，所述方法还包括：d)在步骤c)之后使靶核酸分子与第二多于一种读取探针接触。每种读取探针包含：与桥接探针的一个或更多个读取结合靶中的第二读取结合靶特异性结合的读取结合序列，以及经由可裂解接头与读取结合序列连接的信号部分。

在这些实施方案中，在来自第二多于一种读取探针的每种读取探针与第一多于一种桥接探针中的桥接探针的一个或更多个读取结合靶中的第二读取结合靶结合后，信号部分能够发射第二可检测视觉信号。

在一些实施方案中，所述方法还包括：d1)在步骤d)之后对靶核酸分子成像，以便通过第二可检测视觉信号的存在来检测第二多于一种读取探针与桥接探针的一个或更多个读取结合靶中的第二读取结合靶之间的相互作用；以及d2)施加裂解剂以裂解接头，从而从第二多于一种读取探针中的每个读取探针消除信号部分。

在一些实施方案中，多于一种一级探针中的每种一级探针还包含：与一级结合序列的另一端连接的第二突出端序列。

在一些实施方案中，所述方法还包括：e)在步骤d)之后使靶核酸分子与第二多于一种桥接探针接触。每种桥接探针包含：与多于一种一级探针中的一级探针的第二突出端序列的全部或一部分特异性结合的结合序列，以及串联连接并且与结合序列连接的一个或更多个另外的读取结合靶。

在一些实施方案中，所述方法还包括：f)在步骤e)之后使靶核酸分子与第三多于一种读取探针接触。每种读取探针包含：与第二多于一种桥接探针中的桥接探针的一个或更多个另外的读取结合靶中的第一另外的读取结合靶特异性结合的读取结合序列，以及经由可裂解接头与读取结合序列连接的信号部分。

在这些实施方案中，在来自第三多于一种读取探针的每种读取探针与一个或更多个另外的读取结合靶中的第一另外的读取结合靶结合后，信号部分能够发射第三可检测视觉信号。在一些实施方案中，所述方法还包括：f1)在步骤f)之后对靶核酸分子成像，以便通过第三可检测视觉信号的存在来检测第三多于一种读取探针与第二多于一种桥接探针中的桥接探针的一个或更多个另外的读取结合靶中的第一另外的读取结合靶之间的相互作用；以及f2)施加裂解剂以裂解接头，从而从第三多于一种读取探针中的每个读取探针消除信号部分。

在一些实施方案中，所述方法还包括：g)在步骤f)之后使靶核酸分子与第四多于一种读取探针接触。每种读取探针包含：与第二多于一种桥接探针中的桥接探针的一个或更多个另外的读取结合靶中的第二另外的读取结合靶特异性结合的读取结合序列，以及经由可裂解接头与读取结合序列连接的信号部分。

在一些实施方案中，所述方法还包括：h1)在步骤g)之后对靶核酸分子成像，以便通过第四可检测视觉信号的存在来检测第四多于一种读取探针与第二多于一种桥接探针中的桥接探针的一个或更多个另外的读取结合靶中的第二另外的读取结合靶之间的相互作用；以及h2)施加裂解剂以裂解接头，从而从第四多于一种读取探针中的每个读取探针消除信号部分。

在一些实施方案中，靶核酸分子是mRNA或DNA。在一些实施方案中，靶核酸分子在完整的哺乳动物细胞中。在一些实施方案中，完整的哺乳动物细胞是人类细胞。

在这些实施方案中，可裂解接头选自由以下组成的组：酶可裂解接头、亲核/碱敏感接头、还原敏感接头、光可裂解接头、亲电/酸敏感接头、金属辅助的可裂解接头和氧化敏感接头。在这些实施方案中，可裂解接头是二硫键或核酸限制性位点。在这些实施方案中，一个或更多个读取结合靶包括三个或更多个\读取结合靶。

在其中存在第二突出端的这些实施方案中，另外的一个或更多个读取结合靶包括三个或更多个读取结合靶。

在一方面中，本文公开了包括多于一种一级探针和第一多于一种读取探针的组合物。在这些实施方案中，每种一级探针包含：与靶核酸分子中的互补靶序列结合的一级结合序列，和与一级结合序列的一端连接的第一突出端序列，其中第一突出端序列包含串联连接的一个或更多个读取结合靶。同样在这些实施方案中，每种读取探针包含：与第一突出端序列的一个或更多个读取结合靶中的第一读取结合靶特异性结合的读取结合序列，以及经由可裂解接头与读取结合序列连接的信号部分。在这些实施方案中，在来自第一多于一种读取探针的每种读取探针与一个或更多个读取结合靶之一的第一读取结合靶结合后，信号部分能够发射第一可检测视觉信号。

在一些实施方案中，组合物还包括：第二多于一种读取探针，其中每种读取探针包含：与第一突出端序列中的一个或更多个读取结合靶中的第二读取结合靶特异性结合的读取结合序列，以及经由可裂解接头与读取结合序列连接的信号部分。在这些实施方案中，在来自第二多于一种读取探针的每种读取探针与一个或更多个读取结合靶中的第二读取结合靶结合后，信号部分能够发射第二可检测视觉信号。

在一些实施方案中，一级探针还包含：与一级结合序列的另一端连接的第二突出端序列，其中第二突出端序列包含串联连接的一个或更多个另外的读取结合靶。

在一些实施方案中，组合物还包括第三多于一种读取探针，其中每种读取探针包含：与第二突出端序列中的一个或更多个另外的读取结合靶中的第一另外的读取结合靶特异性结合的读取结合序列，以及经由可裂解接头与读取结合序列连接的信号部分。在这些实施方案中，在来自第三多于一种读取探针的每种读取探针与一个或更多个另外的读取结合靶中的第一另外的读取结合靶结合后，信号部分能够发射第三可检测视觉信号。

在一些实施方案中，组合物还包括第四多于一种读取探针，其中每种读取探针包含：与第二突出端序列中的一个或更多个另外的读取结合靶中的第二另外的读取结合靶特异性结合的读取结合序列，以及经由可裂解接头与读取结合序列连接的信号部分。在这些实施方案中，在来自第四多于一种读取探针的每种读取探针与一个或更多个另外的读取结合靶中的第二另外的读取结合靶结合后，信号部分能够发射第四可检测视觉信号。

在本文公开的任一实施方案中，可裂解接头选自由以下组成的组：酶可裂解接头、亲核/碱敏感接头、还原敏感接头、光可裂解接头、亲电/酸敏感接头、金属辅助的可裂解接头和氧化敏感接头。

在本文公开的任一实施方案中，可裂解接头是二硫键或核酸限制性位点。

在本文公开的任一实施方案中，一个或更多个读取结合靶包括三个或更多个读取结合靶。

在其中存在第二突出端序列的实施方案中，另外的一个或更多个读取结合靶包括三个或更多个读取结合靶。

在一方面中，本文公开了利用多于一种一级探针和第一多于一种读取探针的顺序杂交方法。所述方法包括以下步骤：a)使靶核酸分子与多于一种一级探针接触。每种一级探针包含：与靶核酸分子中的互补靶序列结合的一级结合序列，和与一级结合序列的一端连接的第一突出端序列，其中第一突出端序列包含串联连接的一个或更多个读取结合靶；以及b)在步骤a)之后使靶核酸分子与第一多于一种读取探针接触。每种读取探针包含：与多于一种一级探针中的一级探针的一个或更多个读取结合靶中的第一读取结合靶特异性结合的读取结合序列，以及经由可裂解接头与读取结合序列连接的信号部分。

在一些实施方案中，所述方法还包括以下步骤：b1)在步骤b)之后对靶核酸分子成像，以便通过第一可检测视觉信号的存在来检测第一多于一种读取探针与一级桥接探针的一个或更多个读取结合靶中的第一读取结合靶之间的相互作用；以及b2)施加裂解剂以裂解接头，从而从第一多于一种读取探针中的每个读取探针消除信号部分。

在一些实施方案中，所述方法还包括以下步骤：c)在步骤b)之后使靶核酸分子与第二多于一种读取探针接触。每种读取探针包含：与一级探针的一个或更多个读取结合靶中的第二读取结合靶特异性结合的读取结合序列，以及经由可裂解接头与读取结合序列连接的信号部分。

在一些实施方案中，所述方法还包括以下步骤：c1)在步骤c)之后对靶核酸分子成像，以便通过第二可检测视觉信号的存在来检测第二多于一种读取探针与一级探针的一个或更多个读取结合靶中的第二读取结合靶之间的相互作用；以及c2)施加裂解剂以裂解接头，从而从第二多于一种读取探针中的每个读取探针消除信号部分。

在一些实施方案中，多于一种一级探针中的每种一级探针还包含：与一级结合序列的另一端连接的第二突出端序列，其中第二突出端序列包含串联连接的一个或更多个另外的读取结合靶。

在一些实施方案中，所述方法还包括以下步骤：d)在步骤c)之后使靶核酸分子与第三多于一种读取探针接触。每种读取探针包含：与一级探针的一个或更多个另外的读取结合靶中的第一另外的读取结合靶特异性结合的读取结合序列，以及经由可裂解接头与读取结合序列连接的信号部分。

在这些实施方案中，在来自第三多于一种读取探针的每种读取探针与一个或更多个另外的读取结合靶中的第一另外的读取结合靶结合后，信号部分能够发射第三可检测视觉信号。在一些实施方案中，所述方法还包括以下步骤：d1)在步骤d)之后对靶核酸分子成像，以便通过第二可检测视觉信号的存在来检测第二多于一种读取探针与一级探针的一个或更多个读取结合靶中的第二读取结合靶之间的相互作用；以及d2)施加裂解剂以裂解接头，从而从第二多于一种读取探针中的每个读取探针消除信号部分。

在一些实施方案中，所述方法还包括以下步骤：e)在步骤d)之后使靶核酸分子与第四多于一种读取探针接触。每种读取探针包含：与一级探针的一个或更多个另外的读取结合靶中的第二另外的读取结合靶特异性结合的读取结合序列，以及经由可裂解接头与读取结合序列连接的信号部分。在这些实施方案中，在来自第四多于一种读取探针的每种读取探针与一个或更多个另外的读取结合靶中的第二另外的读取结合靶结合后，信号部分能够发射第四可检测视觉信号。

在一些实施方案中，所述方法还包括以下步骤：e1)在步骤d)之后对mRNA成像，以便通过第四可检测视觉信号的存在来检测第四多于一种读取探针与一级探针的一个或更多个另外的读取结合靶中的第二另外的读取结合靶之间的相互作用；以及e2)施加裂解剂以裂解接头，从而从第四多于一种读取探针中的每个读取探针消除信号部分。

在一些实施方案中，可裂解接头选自由以下组成的组：酶可裂解接头、亲核/碱敏感接头、还原敏感接头、光可裂解接头、亲电/酸敏感接头、金属辅助的可裂解接头和氧化敏感接头。在一些实施方案中，可裂解接头是二硫键或核酸限制性位点。

在一些实施方案中，一个或更多个读取结合靶包括三个或更多个读取结合靶。

在其中存在第二突出端序列的一些实施方案中，另外的一个或更多个读取结合靶包括三个或更多个读取结合靶。在一方面中，本文公开了一种组合物，所述组合物包括第一多于一种核酸检测探针和由第一多于一个延伸探针(extender probe)群体{EP₁、EP₂、…、EP_n}形成的可延伸的信号基序。在一些实施方案中，第一多于一种核酸检测探针中的每种核酸检测探针包含：包含与第一靶序列结合的结合序列的结合区域；和用可裂解接头连接至结合区域的引发序列(initiator sequence)。在一些实施方案中，每个延伸探针群体分别由EP₁、EP₂、…、EP_n表示，其中EP₁中的每种延伸探针包含：与引发序列的全部或一部分结合的结合序列；EP₂和随后的延伸探针群体中的延伸探针的一个或更多个靶序列，以及能够发射第一可检测信号的信号部分。在一些实施方案中，EP₂和随后的延伸探针群体中的每种探针包括：与前一延伸序列的全部或一部分结合的结合序列；随后的延伸探针群体中的探针的一个或更多个靶序列；以及能够发射第一可检测信号的信号部分。

在一些实施方案中，第一靶序列在直接结合靶核酸分子的一级探针内。在一些实施方案中，第一靶序列在与直接结合靶核酸分子的一级探针结合的二级探针内。在一些实施方案中，第一靶序列在结合二级探针的三级探针内，所述二级探针与直接结合靶核酸分子的一级探针结合。

在一些实施方案中，多于一种延伸探针中的每种延伸探针包含与核酸检测探针中的引发序列的全部或一部分互补的结合序列，其中每种延伸探针形成发夹结构，并且其中引发序列的存在引起发夹结构解折叠并且引发杂交链式反应。

在一些实施方案中，组合物还包括第二多于一种核酸检测探针和由第二多于一个延伸探针群体{EP_1’、EP_2’、…、EP_n’}形成的可延伸的信号基序。在一些实施方案中，第二多于一种核酸检测探针中的每种核酸检测探针包含：包含与第二靶序列结合的结合序列的结合区域；和用可裂解接头连接至结合区域的引发序列。在一些实施方案中，每个延伸探针群体分别由EP_1’、EP_2’、…、EP_n’表示，其中EP_1’中的每种延伸探针包含：与引发序列的全部或一部分结合的结合序列；EP_2’和随后的延伸探针群体中的延伸探针的一个或更多个靶序列；以及能够发射第二可检测信号的信号部分。在一些实施方案中，EP_2’和随后的延伸探针群体中的每种探针包括：与前一延伸序列的全部或一部分结合的结合序列；随后的延伸探针群体中的探针的一个或更多个靶序列；以及能够发射第二可检测信号的信号部分。

在一方面中，本文公开了一种顺序杂交方法。所述方法包括以下步骤：a)使靶核酸分子与第一多于一种核酸检测探针接触，以及b)在步骤a)之后使靶核酸分子与第一多于一个延伸探针群体{EP₁、EP₂、…、EP_n}接触。在一些实施方案中，第一多于一种核酸检测探针中的每种核酸检测探针包含：包含与第一靶序列结合的结合序列的结合区域；和用可裂解接头连接至结合区域的引发序列。在一些实施方案中，每个延伸探针群体分别由EP₁、EP₂、…、EP_n表示，其中EP₁中的每种延伸探针包含：与引发序列的全部或一部分结合的结合序列；EP₂和随后的延伸探针群体中的延伸探针的一个或更多个靶序列，以及能够发射第一可检测信号的信号部分。在一些实施方案中，EP₂和随后的延伸探针群体中的每种探针包括：与前一延伸序列的全部或一部分结合的结合序列；随后的延伸探针群体中的探针的一个或更多个靶序列；以及能够发射第一可检测信号的信号部分。

在一些实施方案中，所述方法还包括：b1)在步骤b)之后对靶核酸分子成像，以便通过第一可检测视觉信号的存在来检测第一多于一种核酸检测探针与第一靶序列之间的相互作用；以及b2)施加裂解剂以裂解接头，从而消除可延伸的信号基序。

在一些实施方案中，所述方法还包括：c)使靶核酸分子与第二多于一种核酸检测探针接触。在一些实施方案中，第二多于一种核酸检测探针中的每种核酸检测探针包含：包含与第二靶序列结合的结合序列的结合区域；和用可裂解接头连接至结合区域的引发序列。

在一些实施方案中，所述方法还包括：d)在步骤c)之后使靶核酸分子与第二多于一个延伸探针群体{EP_1’、EP_2’、…、EP_n’}接触，其中每个延伸探针群体分别由EP_1’、EP_2’、…、EP_n’表示。在一些实施方案中，EP_1’中的每种延伸探针包含：与引发序列的全部或一部分结合的结合序列；EP_2’和随后的延伸探针群体中的延伸探针的一个或更多个靶序列；以及能够发射第二可检测信号的信号部分。在一些实施方案中，EP_2’和随后的延伸探针群体中的每种探针包括：与前一延伸序列的全部或一部分结合的结合序列；随后的延伸探针群体中的探针的一个或更多个靶序列；以及能够发射第二可检测信号的信号部分。

在一些实施方案中，所述方法还包括：d1)在步骤d)之后对靶核酸分子成像，以便通过第二可检测视觉信号的存在来检测第二多于一种核酸检测探针与第二靶序列之间的相互作用；以及d2)施加裂解剂以裂解接头，从而消除可延伸的信号基序。

在一些实施方案中，第二靶序列在直接结合靶核酸分子的一级探针内。在一些实施方案中，第二靶序列在与直接结合靶核酸分子的一级探针结合的二级探针内。在一些实施方案中，第二靶序列在结合二级探针的三级探针内，所述二级探针与直接结合靶核酸分子的一级探针结合。

还提供了一种顺序杂交方法，所述方法包括以下步骤：

a)使靶分子与多于一种一级抗体接触，其中每种一级抗体包含串联连接并且与一级抗体连接的一个或更多个结合靶；

b)使靶分子与第一多于一种读取探针接触，其中每种读取探针包含信号部分，并且其中每种读取探针与多于一种一级抗体中的一级抗体的一个或更多个结合靶中的第一结合靶相互作用，

其中在来自第一多于一种读取探针的每种读取探针与多于一种一级抗体中的一级抗体的第一结合靶相互作用后，信号部分能够发射第一可检测视觉信号；

c)在步骤b)之后对靶分子成像，以便通过第一可检测视觉信号的存在来检测第一多于一种读取探针与多于一种一级抗体之间的相互作用；

d)使靶分子、多于一种一级抗体和第一多于一种读取探针与包含变性剂的溶液接触，其中溶液与靶分子、多于一种一级抗体和第一多于一种读取探针的接触不破坏多于一种一级抗体与靶分子之间的相互作用；

e)使靶分子和多于一种一级抗体与第二多于一种读取探针接触，其中每种读取探针包含信号部分，并且其中每种读取探针与多于一种一级抗体中的一级抗体的第二结合靶相互作用，

其中在每种读取探针与多于一种一级抗体中的一级抗体的第二结合靶相互作用后，信号部分能够发射第二可检测视觉信号；并且

f)在步骤e)之后对靶核酸分子成像，以便通过第二可检测视觉信号的存在来检测第二多于一种读取探针与多于一种一级抗体之间的相互作用。

在一些实施方案中，所述方法还包括以下步骤：

g)使靶分子、多于一种一级抗体和第二多于一种读取探针与包含变性剂的溶液接触，其中溶液与靶分子、多于一种一级抗体和第二多于一种读取探针的接触不破坏多于一种一级抗体与靶分子之间的相互作用；

h)使靶分子和多于一种一级抗体与第三多于一种读取探针接触，其中每种读取探针包含信号部分，并且其中每种读取探针与多于一种一级抗体中的一级抗体的第三结合靶相互作用，

其中在来自第三多于一种读取探针的每种读取探针与多于一种一级抗体中的一级抗体的第三结合靶相互作用后，信号部分能够发射第三可检测视觉信号；并且

i)在步骤h)之后对靶核酸分子成像，以便通过第三可检测视觉信号的存在来检测第三多于一种读取探针与多于一种一级抗体之间的相互作用。

在一些实施方案中，任何的多于一种读取探针中的每种读取探针通过与其在多于一种一级抗体中的一级抗体中的结合靶杂交而与其结合靶相互作用。在一些实施方案中，任何的多于一种读取探针中的每种读取探针通过与桥接探针杂交而与其结合靶相互作用，所述桥接探针包含：(i)与多于一种一级抗体中的一级抗体的一个或更多个结合靶互补的序列，和(ii)读取探针结合的序列。

在一些实施方案中，靶分子是RNA、DNA或蛋白。

在一些实施方案中，靶分子在完整的细胞中。完整的细胞可以是原核细胞、真核细胞、哺乳动物细胞或人类细胞。

还提供了一种顺序杂交方法，所述方法包括以下步骤：

a)使靶核酸分子与多于一种一级探针接触，其中每种一级探针包含：(i)与靶核酸分子中的互补靶序列结合的一级结合序列，和(ii)与一级结合序列的一端连接的第一突出端序列，所述第一突出端序列包含串联连接并且与一级结合序列连接的一个或更多个结合靶；

b)使靶核酸分子与第一多于一种读取探针接触，其中每种读取探针包含信号部分，并且其中每种读取探针与多于一种一级探针中的一级探针的一个或更多个结合靶中的第一结合靶相互作用，

其中在来自第一多于一种读取探针的每种读取探针与多于一种一级探针中的一级探针的一个或更多个结合靶中的第一结合靶相互作用后，信号部分能够发射第一可检测视觉信号；

c)在步骤b)之后对靶核酸分子成像，以便通过第一可检测视觉信号的存在来检测第一多于一种读取探针与多于一种一级探针之间的相互作用；

d)使靶核酸分子、多于一种一级探针和第一多于一种读取探针与包含变性剂的溶液接触，其中溶液与靶核酸分子、多于一种一级探针和第一多于一种读取探针的接触不破坏多于一种一级探针与靶核酸分子之间的相互作用；

e)使靶核酸分子与第二多于一种读取探针接触，其中每种读取探针包含信号部分，并且其中每种读取探针与一级探针的一个或更多个结合靶中的第二结合靶相互作用，

其中在来自第二多于一种读取探针的每种读取探针与多于一种一级探针中的一级探针的一个或更多个结合靶中的第二结合靶相互作用后，信号部分能够发射第二可检测视觉信号；并且

f)在步骤e)之后对靶核酸分子成像，以便通过第二可检测视觉信号的存在来检测第二多于一种读取探针与多于一种一级探针之间的相互作用。

在一些实施方案中，所述方法还包括以下步骤：

g)使靶核酸分子、多于一种一级桥接探针和第二多于一种读取探针与包含变性剂的溶液接触，其中溶液与靶核酸分子、多于一种一级探针和第二多于一种读取探针的接触不破坏多于一种一级探针与靶核酸分子之间的相互作用；

h)使靶核酸分子与第三多于一种读取探针接触，其中每种读取探针包含信号部分，并且其中每种读取探针与一级探针的一个或更多个结合靶中的第三结合靶相互作用，

其中在来自第三多于一种读取探针的每种读取探针与多于一种一级探针中的一级探针的一个或更多个结合靶中的第三结合靶相互作用后，信号部分能够发射第三可检测视觉信号；并且

i)在步骤h)之后对靶核酸分子成像，以便通过第三可检测视觉信号的存在来检测第三多于一种读取探针与多于一种一级探针之间的相互作用。

在一些实施方案中，多于一种一级探针中的每种一级探针还包含：与一级结合序列的另一端连接的第二突出端序列，所述第二突出端序列包含串联连接并且与一级结合序列连接的一个或更多个另外的结合靶。

在一些实施方案中，所述方法还包括以下步骤：

c1)在步骤c)之后使靶核酸分子与第四多于一种读取探针接触，其中每种读取探针包含信号部分，并且其中每种读取探针与多于一种一级探针中的一级探针的第二突出端序列的第一另外的结合靶相互作用；并且

c2)在步骤c1)之后对靶核酸分子成像，以便通过第四可检测视觉信号的存在来检测第四多于一种读取探针与多于一种一级探针中的一级探针的第二突出端序列之间的相互作用；

其中步骤c1)至c2)在所述方法的步骤d)之前进行。

在一些实施方案中，所述方法还包括以下步骤：

e1)在步骤e)之后使靶核酸分子与第五多于一种读取探针接触，其中每种读取探针包含信号部分，并且其中每种读取探针与多于一种一级探针中的一级探针的第二突出端序列的第二另外的结合靶相互作用；并且

e2)在步骤e1)之后对靶核酸分子成像，以便通过第五可检测视觉信号的存在来检测第五多于一种读取探针与多于一种一级探针中的一级探针的第二突出端序列之间的相互作用。

在前述方法的一些实例中，任何的多于一种读取探针中的每种读取探针通过与其在多于一种一级探针中的一级探针中的结合靶杂交而与其结合靶相互作用。在前述方法的一些实例中，任何的多于一种读取探针中的每种读取探针通过与桥接探针杂交而与其结合靶相互作用，所述桥接探针包含：(i)与多于一种一级探针中的一级探针的第一突出端序列的全部或一部分互补的序列，和(ii)读取探针结合的序列。

在一些实施方案中，第二突出端序列的一个或更多个另外的结合靶与来自第四多于一种读取探针中的读取探针相互作用，或者与来自第五多于一种读取探针中的读取探针相互作用。在一些实施方案中，分析了来自第四多于一种读取探针或第五多于一种读取探针中的读取探针之间的相互作用。

在一些实施方案中，靶核酸分子是RNA或DNA分子。

在一些实施方案中，靶核酸分子在完整的细胞中。完整的细胞可以是原核细胞、真核细胞、哺乳动物细胞或人类细胞。

在一些实施方案中，一个或更多个结合靶包括三个或更多个结合靶。在一些实施方案中，另外的一个或更多个结合靶包括三个或更多个读取结合靶。

在一些实施方案中，变性剂是甲酰胺。在一些实施方案中，甲酰胺以60％(v/v)的浓度百分比存在于溶液中。在一些实施方案中，甲酰胺以少于60％(v/v)的浓度百分比存在于溶液中。在一些实施方案中，甲酰胺以约30％和60％(v/v)之间的浓度百分比存在于溶液中。

在一些实施方案中，读取探针的长度为少于17个核苷酸。在一些实施方案中，读取探针的长度为10个和17个核苷酸之间。在一些实施方案中，读取探针的长度为少于10个核苷酸。在一些实施方案中，读取探针的长度为5个和10个核苷酸之间。

本文公开的组合物和方法可以用于顺序杂交，以在完整的细胞内或在体外环境中鉴定任何合适的细胞靶。在一些实施方案中，细胞靶可以是mRNA或DNA。在一些实施方案中，细胞靶可以是蛋白。例如，初始靶结合一级探针可以是与用于随后结合的核酸序列缀合的抗体。

本领域技术人员将理解，本文公开的实施方案在可应用时可以在任何方面被应用或组合。

定义

动物：如本文使用的，术语“动物”是指动物界的任何成员。在一些实施方案中，“动物”是指处于任何发育阶段的人类。在一些实施方案中，“动物”是指处于任何发育阶段的非人类动物。在某些实施方案中，非人类动物是哺乳动物(例如，啮齿动物、小鼠、大鼠、兔、猴、狗、猫、绵羊、牛、灵长类和/或猪)。在一些实施方案中，动物包括，但不限于：哺乳动物、鸟类、爬行类、两栖类、鱼类和/或蠕虫。在一些实施方案中，动物可以是转基因动物、遗传工程化的动物和/或无性系。

约：如本文使用的，述及数字的术语“约(approximately)”或“约(about)”通常被采用以包括落入数字的任一方向(多于或少于)的5％、10％、15％或20％的范围内的数字，除非另有说明或另外从上下文明显(除非这样的数字将小于可能值的0％或超过100％)。在一些实施方案中，述及剂量的术语“约”的使用意指±5mg/kg/天。

同源性：“同源性”或“同一性”或“相似性”是指两个核酸分子之间的序列相似性。同源性和同一性各自可以通过比较每个序列中可以为了比较目的而被对齐的的位置而被确定。当相比较的序列中相当的位置被相同碱基占据时，则分子在该位置处是相同的；当相当的位点被相同的或相似的核酸残基(例如，在空间性质和/或电子性质方面相似)占据时，则分子可以被称为在该位置处同源(相似)。表示为同源性/相似性或同一性的百分比是指在相比较的序列共有的位置处相同的或相似的核酸的数目的函数。“无关”或“非同源”的序列与本文描述的序列共有少于40％的同一性、少于35％的同一性、少于30％的同一性或少于25％的同一性。在两个序列的比较中，残基(氨基酸或核酸)的不存在或额外残基的存在也降低同一性和同源性/相似性。

在一些实施方案中，术语“同源性”描述基于数学的序列相似性的比较，其被用于鉴定具有相似功能或基序的基因。本文描述的核酸序列可以被用作“查询序列”来针对公开数据库进行检索，例如，来鉴定其他家族成员、相关序列或同源物。在一些实施方案中，这样的检索可以使用Altschul,等人(1990)J.Mol.Biol.215:403-410的NBLAST和XBLAST程序(版本2.0)来进行。在一些实施方案中，可以用NBLAST程序，评分＝100，字长＝12进行BLAST核苷酸检索，来获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。在一些实施方案中，为了获得用于比较目的的有缺口的比对，可以利用如Altschul等人,(1997)Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402中描述的Gapped BLASAT。当利用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用各程序(例如，XBLAST和BLAST)的默认参数(参见www.ncbi.nlm.nih.gov)。

同一性：如本文使用的，“同一性”意指当序列被比对至最大序列匹配时，即，考虑到缺口和插入，在两个或更多个序列中对应位置处的相同的核苷酸残基的百分比。同一性可以通过已知的方法来容易地计算，所述方法包括但不限于以下中描述的那些(Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.,编著,Oxford University Press,NewYork,1988；Biocomputing:Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.,编著,Academic Press,New York,1993；Computer Analysis of Sequence Data,Part I,Griffin,A.M.,和Griffin,H.G.,编著,Humana Press,New Jersey,1994；SequenceAnalysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,Academic Press,1987；和SequenceAnalysis Primer,Gribskov,M.和Devereux,J.,编著,M Stockton Press,NewYork,1991；和Carillo,H.和Lipman,D.,SIAM J.Applied Math.,48:1073(1988)。确定同一性的方法被设计来给出被测试的序列之间的最大匹配。此外，确定同一性的方法被编入公开可得的计算机程序中。确定两个序列之间的同一性的计算机程序方法包括，但不限于，GCG程序包(Devereux,J.等人,Nucleic Acids Research 12(1):387(1984))、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul,S.F.等人,J.Molec.Biol.215:403-410(1990)和Altschul等人Nuc.AcidsRes.25:3389-3402(1997))。BLAST X程序是从NCBI和其他来源公众可得的(BLAST Manual,Altschul,S.等人,NCBI NLM NIHBethesda,Md.20894；Altschul,S.等人,J.Mol.Biol.215:403-410(1990))。还可以使用熟知的Smith Waterman算法来确定同一性。

体外：如本文使用的，术语“体外”是指发生在人工环境中的事件，例如，在试管或反应容器中，在细胞培养物中，等等，而不是在生物体(例如，动物、植物和/或微生物)内。

体内：如本文使用的，术语“体内”是指发生在生物体(例如，动物、植物和/或微生物)内的事件。

寡核苷酸：术语“寡核苷酸”是指核苷酸单体的聚合物或寡聚物，含有核酸碱基、被修饰的核酸碱基、糖类、被修饰的糖类、磷酸键或被修饰的键的任何组合。如本文公开的寡核苷酸可以是各种长度的。在具体的实施方案中，寡核苷酸的长度可以在从约2个至约200个核苷酸的范围内。在多种相关的实施方案中，单链的、双链的和三链的寡核苷酸的长度可以在从约4个至约10个核苷酸、从约10个至约50个核苷酸、从约20个核苷酸至约50个核苷酸、从约15个至约30个核苷酸、从约20个至约30个核苷酸的范围内。在一些实施方案中，寡核苷酸的长度为从约9个至约39个核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸的长度为至少4个核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸的长度为至少5个核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸的长度为至少6个核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸的长度为至少7个核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸的长度为至少8个核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸的长度为至少9个核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸的长度为至少10个核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸的长度为至少11个核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸的长度为至少12个核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸的长度为至少15个核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸的长度为至少20个核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸的长度为至少25个核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸的长度为至少30个核苷酸。在一些实施方案中，寡核苷酸是长度为至少18个核苷酸的互补链的双链体。在一些实施方案中，寡核苷酸是长度为至少21个核苷酸的互补链的双链体。

预先确定的：预先确定的意指有意地选择，例如，与随机地发生或实现相对。可能包含如下的某些个体寡核苷酸的组合物不是“预先确定的”组合物：它们是通过不能被控制来有意地产生特定寡核苷酸的过程偶然产生的个体寡核苷酸。在一些实施方案中，预先确定的组合物是可以被有意地重现的组合物(例如，通过重复受控的过程)。

样品：如本文使用的，术语“样品”是指从如本文描述的感兴趣的来源获得或衍生的生物样品。在一些实施方案中，感兴趣的来源包括生物体，诸如动物或人类。在一些实施方案中，生物样品包括生物组织或生物流体。在一些实施方案中，生物样品是或包括骨髓；血液；血细胞；腹水；组织或细针穿刺活检样品；包含细胞的体液；游离核酸；痰；唾液；尿液；脑脊液、腹腔积液；胸腔积液；粪便；淋巴；妇科液；皮肤拭样；阴道拭样；口腔拭样；鼻拭样；洗涤或灌洗液诸如导管灌洗液或支气管肺泡灌洗液；抽吸物；刮涂物(scraping)；骨髓样本；组织活检样本；手术样本；粪便、其他体液、分泌物和/或排泄物；和/或来自其的细胞等。在一些实施方案中，生物样品是从个体获得的细胞或包括从个体获得的细胞。在一些实施方案中，样品是通过任何适当手段从感兴趣的来源直接获得的“原始样品”。例如，在一些实施方案中，通过选自由活检(例如，细针抽吸或组织活检)、手术、体液(例如，血液、淋巴、粪便等)的集合等组成的组的方法获得原始生物样品。在一些实施方案中，如从上下文中将明确的，术语“样品”是指通过处理(例如，通过去除原始样品的一种或更多种组分和/或通过添加一种或更多种试剂至)原始样品获得的制备物。例如，使用半透膜过滤。这样的“处理的样品”可以包括，例如从样品提取的或通过使原始样品经受诸如mRNA的扩增或反转录、某些组分的分离和/或纯化等的技术获得的核酸或蛋白。

受试者：如本文使用的，术语“受试者”或“测试受试者”是指为了例如实验、诊断、预防和/或治疗目的，所提供的化合物或组合物依照本文所公开的方法被施用至的任何生物体。典型的受试者包括动物(例如，哺乳动物诸如小鼠、大鼠、兔、非人类灵长类动物、和人类；昆虫；蠕虫等)和植物。在一些实施方案中，受试者可能患有疾病、紊乱和/或状况或对疾病、紊乱和/或状况易感。

基本上：如本文使用的，术语“基本上”是指表现感兴趣的特征或性质的总的或接近总的范围或程度的定性条件。生物领域中普通技术人员将理解的是，生物和化学现象很少(若存在)进行完全和/或进行至完备或达到或避免绝对的结果。因此术语“基本上”在本文被用以捕获许多生物和/或化学现象中固有的完整性的潜在缺乏。

患有：“患有”疾病、紊乱和/或状况的个体已被诊断为具有和/或展示疾病、紊乱和/或状况的一种或更多种症状。

易感：对疾病、紊乱和/或状况“易感”的个体，是与一般公众的成员相比具有发展疾病、紊乱、和/或状况的较高风险的个体。在一些实施方案中，对疾病、紊乱和/或状况易感的个体可以未被诊断患有疾病、紊乱和/或状况。在一些实施方案中，对疾病、紊乱和/或状况易感的个体可显示疾病、紊乱和/或状况的症状。在一些实施方案中，对疾病、紊乱和/或状况易感的个体可以未表现出疾病、紊乱和/或状况的症状。在一些实施方案中，对疾病、紊乱和/或状况易感的个体将会发展疾病、紊乱和/或状况。在一些实施方案中，对疾病、紊乱和/或状况易感的个体将不会发展疾病、紊乱和/或状况。

治疗：如本文使用的，术语“治疗(treat)”、“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”是指用于部分地或完全地减轻、改善、缓解、抑制、预防、延迟特定的疾病、紊乱和/或状况的一种或更多种症状或特征的发作、降低其严重程度和/或降低其发生率的任何方法。治疗可以对未表现出疾病、紊乱和/或状况迹象的受试者施用。在一些实施方案中，为了例如减少发展与疾病、紊乱、和/或状况相关的病理学的风险的目的，治疗可以对仅表现出疾病、紊乱和/或状况的早期迹象的受试者施用。

野生型：如本文使用的，术语“野生型”具有其领域内理解的含义，是指具有如同在自然界中发现的处于“正常”(与突变、患病、改变等相对)状态或环境中的结构和/或活性的实体。本领域普通技术人员将领会的是，野生型的基因和多肽通常以多种不同的形式(例如，等位基因)存在。

附图简述

本专利或申请文件包含至少一幅以彩色展示的图。具有彩色附图的本专利或专利申请公布的副本将在依请求和支付必要费用后由主管局提供。

本领域技术人员将理解，以下所描述的附图仅用于说明性目的。附图并不意图以任何方式限制本教导的范围。

图1展示由本公开内容提供的方法的示意图。

图2.所提供的方法的示例性顺序编条形码。(a)顺序编条形码的示意图。在每一轮杂交中，多于一个(multiple)探针(例如，24种)被杂交在每一个转录物上，成像并且随后通过DNA酶I处理来剥离。可以在不同轮的杂交中使用相同的探针序列，但是探针与不同的荧光团偶联。(b)来自在多个酵母细胞上3轮杂交的复合四色FISH数据。十二个基因被2轮杂交编码，第三轮杂交使用与杂交1相同的探针。加框的区域在每个图像的右下角被放大。示出了匹配的点并且提取了条形码。不意图受理论限制，非共定位的点可能是由于探针在细胞中的非特异性结合以及错误杂交所致。每个条形码的数目被定量来提供单细胞中对应的转录物的丰度。(c)示例性条形码。mRNA 1：黄色-蓝色-黄色；mRNA 2：绿色-紫色-绿色；mRNA3：紫色-蓝色-紫色；和mRNA 4：蓝色-紫色-蓝色。

图3.顺序杂交和编条形码的示意图。(a)顺序杂交和编条形码的示意图。(b)细胞的FISH图像的示意图。在每一轮杂交中，检测相同的点，但是与转录物相缔合的染料变化了。mRNA的身份被编码在杂交的染料的时间层序(temporal sequence)中。

图4.示例性寡核苷酸制备。原始寡核苷酸(如在本图中示例的，探针)文库包含若干个探针亚文库。每个亚文库具有特定的引物组，其可以被用于使用PCR扩增亚文库。在期望的亚文库被扩增后，将产物与切口酶一起孵育。酶在探针链上的识别位点处裂解磷酸二酯键。将所得产物变性，并且将其在变性凝胶上运行，允许所期望的探针序列被释放。然后可以从凝胶中切出探针条带并且进行提取。所提取的产物可以用于杂交。

图5示出了用于合成通过可裂解的二硫化物接头与染料缀合的DNA探针的示例性反应方案。

图6A是说明使用基因特异性一级探针、二级桥接探针和三级读取探针的顺序编条形码方法的示例性实施方案的示意图。

图6B说明了使用具有两个突出端序列的一级探针的顺序编条形码方法的示例性实施方案。

图7A说明了根据现有技术方法进行的示例性杂交链式反应(HCR)。

图7B说明了示例性读取探针。

图7C说明了基于具有可裂解接头的读取探针的示例性杂交链式反应。

图8是用于靶向感兴趣的核酸分子的示例性再杂交方案的示意图。

图9是用于靶向感兴趣的蛋白分子的示例性再杂交方案的示意图。

图10是说明如本文描述的顺序杂交并且去除读取探针的一组代表性的共聚焦图像。

图11是说明如本文描述的使用寡核苷酸缀合的抗体来检测靶分子并且在杂交的轮次之间移除读取探针的顺序杂交方案的一组代表性的共聚焦图像。

某些实施方案的详细描述

实施方案涉及用于对细胞中的核酸(例如，转录物和/或DNA基因座)进行谱分析的新的方法、组合物和/或试剂盒。

在一些实施方案中，本文提供了用于对细胞中的核酸(例如，转录物和/或DNA基因座)进行谱分析的方法。在一些实施方案中，提供的方法对单一细胞中的多个靶进行谱分析。所提供的方法尤其可以通过顺序编条形码用有限数目的可检测标记对大量靶(转录物、DNA基因座或其组合)进行谱分析。

图1描绘了根据本文公开的实施方案的方法。如图1中描绘的，本文提供了这样的方法，其中用标记的探针的多轮杂交(接触步骤)检测细胞中存在的靶分子(例如，mRNA)。例如，如图1中描绘的，提供了与细胞中的核酸靶杂交的探针的组，其中在单个组内标记探针(即，可检测地标记与不同的靶杂交的寡核苷酸)，并且此外，在不同的组中至少一种探针被不同地标记。

在一些实施方案中，例如，如图1中展示的，本文提供了包括以下步骤的方法：

(b)在第一接触步骤之后对细胞成像，检测所述第一多于一种寡核苷酸与其靶的杂交；

其中所述第二多于一种可检测地标记的寡核苷酸与第一多于一种可检测地标记的寡核苷酸的不同在于存在于所述第二多于一种可检测地标记的寡核苷酸中的寡核苷酸的至少一种被与所述第一多于一种可检测地标记的寡核苷酸中靶向相同转录物或DNA基因座的相应寡核苷酸不同的可检测部分标记，因此在所述第二多于一种可检测地标记的寡核苷酸中：

(d)在所述第二接触步骤之后对细胞成像，以便检测所述第二多于一种的寡核苷酸与其靶的杂交；以及

(e)任选地重复所述接触和成像步骤，每次用新的多于一种可检测地标记的寡核苷酸，所述新的多于一种可检测地标记的寡核苷酸包含靶向被所述第一多于一种和第二多于一种靶向的重叠转录物或DNA基因座的寡核苷酸，其中由于标记靶向相同转录物或DNA基因座的核苷酸的可检测部分上的至少一种差异，所利用的每组多于一种可检测地标记的寡核苷酸与所利用的其他各组的多于一种可检测地标记的寡核苷酸不同。

在前述实施方案中，所述方法还包括以下步骤：

(f)进行接触步骤，所述接触步骤包括使包含多于一种核酸的细胞与多于一种中间寡核苷酸接触，所述多于一种中间寡核苷酸的每种：

(i)靶向核酸并任选地被可检测部分标记；并且

(ii)在与靶杂交后包含突出端序列；以及

(g)任选地对细胞成像，以便检测中间寡核苷酸与其靶之间的相互作用。

在一些实施方案中，步骤(f)和任选的步骤(g)在步骤(a)之前进行。在一些实施方案中，步骤(f)在步骤(a)之进行。在一些实施方案中，去除步骤保留中间寡核苷酸。

本文还提供了一种顺序杂交方法，所述方法包括以下步骤：

a)使靶分子与多于一种一级抗体接触，其中每种一级抗体包含串联连接并且与该一级抗体连接的一个或更多个结合靶；

在前述实施方案中，靶分子可以是核酸或蛋白。例如，在一些实施方案中，靶分子是DNA序列。在一些实施方案中，靶分子是RNA序列。在一些实施方案中，靶分子是RNA转录物。在一些实施方案中，靶分子是蛋白。

另外，本文提供了一种顺序杂交方法，所述方法包括以下步骤：

在前述实施方案中，靶核酸分子可以是DNA序列或RNA序列，包括，例如，RNA转录物。

在本文公开的实施方案中，可检测地标记的寡核苷酸被可检测部分标记。在一些实施方案中，可检测地标记的寡核苷酸包含一个可检测部分。在一些实施方案中，可检测地标记的寡核苷酸包含两个或更多个可检测部分。在一些实施方案中，可检测地标记的寡核苷酸具有一个可检测部分。在一些实施方案中，可检测地标记的寡核苷酸具有两个或更多个可检测部分。

在本文公开的实施方案中，具有信号部分的探针被信号部分标记或与信号部分连接。在一些实施方案中，具有信号部分的探针包含一个信号部分。在一些实施方案中，具有信号部分的探针包含两个或更多个信号部分。在一些实施方案中，具有信号部分的探针具有一个信号部分。在一些实施方案中，具有信号部分的探针具有两个或更多个信号部分。

在一些实施方案中，可检测部分或信号部分是荧光团或包含荧光团。示例性的可检测地标记的寡核苷酸或具有信号部分的探针可以被荧光团标记，并且包括但不限于用于荧光原位杂交(FISH)的探针。如本领域普通技术人员所广泛已知并实践的，FISH被用于尤其是检测和定位特定DNA序列或RNA靶的存在或不存在。用于设计和制备标记的可检测地标记的寡核苷酸的方法是本领域广泛已知的，包括但不限于在例如美国专利申请公布第2012-0142014号中描述的那些。但是，由于诸如荧光团可得性的限制，FISH仅能够被用于对给定的实验中的有限数目的靶进行谱分析。通过对多重(multiplex)不同的靶顺序编条形码，本文公开的方法能够对多达F^N的大数目的靶进行谱分析，其中F是可检测部分(在FISH的情况中，荧光团)的类型的数目，而N是接触步骤(在FISH的情况中，杂交)的数目。例如，当F为4而N为8时，几乎整个转录组(4⁸＝65,536)可以被谱分析。在一些实施方案中，F至少为2。在一些实施方案中，F为3。在一些实施方案中，F为4。在一些实施方案中，F为5。在一些实施方案中，F为6。在一些实施方案中，F为7。在一些实施方案中，F为8。在一些实施方案中，F为9。在一些实施方案中，F为10。在一些实施方案中，F为11。在一些实施方案中，F为12。在一些实施方案中，F为13。在一些实施方案中，F为14。在一些实施方案中，F为15。在一些实施方案中，F大于15。在一些实施方案中，N为2。在一些实施方案中，N大于2。在一些实施方案中，N为3。在一些实施方案中，N大于3。在一些实施方案中，N为4。在一些实施方案中，N大于4。在一些实施方案中，N为5。在一些实施方案中，N大于5。在一些实施方案中，N为6。在一些实施方案中，N大于6。在一些实施方案中，N为7。在一些实施方案中，N大于7。在一些实施方案中，N为8。在一些实施方案中，N大于8。在一些实施方案中，N为9。在一些实施方案中，N大于9。在一些实施方案中，N为10。在一些实施方案中，N大于10。在一些实施方案中，多于一种可检测地标记的寡核苷酸靶向至少100种靶。

在接触步骤中，可以在可检测地标记的寡核苷酸或具有信号部分的探针与其靶结合之前、同时或之后对其标记。在一些实施方案中，可检测地标记的寡核苷酸或具有信号部分的探针，诸如标记荧光团的寡核苷酸，在其与其靶结合之前被标记。在一些实施方案中，可检测地标记的寡核苷酸或具有信号部分的探针在其与其靶结合的同时被标记。在一些实施方案中，可检测地标记的寡核苷酸或具有信号部分的探针在其与其靶结合之后被标记。在一些实施方案中，可检测地标记的寡核苷酸或具有信号部分的探针在杂交之后通过用杂交链式反应(HCR)正交扩增而被标记(Choi,HM.,Nat Biotechnol.2010Nov；28(11):1208-12)。在一些实施方案中，可检测地标记的寡核苷酸或具有信号部分的探针包含部分，例如核酸序列，能够在成像步骤中提供信号的一个或更多个部分可以直接或间接地与寡核苷酸连接。

在一些实施方案中，可以将相同类型的标记附接至针对不同靶的不同探针或寡核苷酸。在一些实施方案中，在接触步骤中使用的多于一种可检测地标记的探针或寡核苷酸中，针对相同靶的探针或寡核苷酸具有相同的标记(一组可检测地标记的寡核苷酸)。在数轮接触和成像后，每个靶具有其自身独特的标记组合(顺序编条形码)，因此可以获得靶的信息，例如，数量信息和/或空间信息。例如，当荧光团被用于标记可检测地标记的寡核苷酸或具有信号部分的探针时，在N个步骤后，靶将具有顺序条形码F₁F₂……F_N，其中F_n是在第n次成像中用于靶的荧光团的颜色。可以通过一种靶与另一种靶的条形码的差异(例如，红色红色蓝色红色相比于红色红色红色蓝色)而将它们区分开。

在一些实施方案中，本文公开的标记是或包含一种或更多种荧光染料，包括但不限于荧光素、罗丹明、Alexa Fluor类、Dylight Fluor类、ATTO类染料或其任何类似物或衍生物。

在一些实施方案中，本文公开的标记包括但不限于荧光素和荧光素的化学衍生物；曙红；羧基荧光素；异硫氰酸荧光素(FITC)；荧光素酰胺(Fluorescein amidite)(FAM)；赤藓红；玫瑰红；由细菌铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)分泌的荧光素；亚甲基蓝；激光染料、罗丹明类染料(例如，罗丹明、罗丹明6G、罗丹明B、罗丹明123、金胺O、磺酰罗丹明101、磺酰罗丹明B和德克萨斯红)。

在一些实施方案中，本文公开的标记包括但不限于ATTO类染料；吖啶类染料(例如，吖啶橙、吖啶黄)；Alexa Fluor；7-氨基放线菌素D；8-苯胺基萘-l-磺酸盐；金胺-罗丹明染料；苯并蒽酮；5,12-双(苯乙炔基)并四苯；9,10-双(苯乙炔基)蒽；Blacklight paint；Brainbow；钙黄绿素；羧基荧光素；羧基二乙酸荧光素琥珀酰亚胺酯；羧基荧光素琥珀酰亚胺酯；l-氯-9,10-双(苯乙炔基)蒽；2-氯9,10-双(苯乙炔基)蒽；2-氯-9,10-二苯基蒽；香豆素；花菁类染料(例如，花菁诸如Cy3和Cy5、DiOC6、SYBR Green I)；DAPI、Dark quencher、Dylight Fluor、Fluo-4、FluoProbes；荧光酮类染料(例如，钙黄绿素、羧基荧光素、羧基二乙酸荧光素琥珀酰亚胺酯、羧基荧光素琥珀酰亚胺酯、曙红、曙红B、曙红Y、赤藓红、荧光素、异硫氰酸荧光素、荧光素酰胺、印度黄、汞溴红)；Fluoro-Jade染料；Fura-2；Fura-2-乙酰氧基甲酯；绿色荧光蛋白、Hoechst染料、印度黄、Indo-1、荧光黄、萤光素、部花菁、光增白剂、噁嗪类染料(例如，甲酚紫、尼罗蓝、尼罗红)；苝；菲啶类染料(溴化乙锭和碘化丙啶)；焰红染料、藻胆素、藻红蛋白、藻红素、8-羟基-1,3,6-三磺酸芘(Pyranine)、罗丹明、罗丹明123、罗丹明6G、RiboGreen、RoGFP、红荧烯、SYBR Green I、(E)-二苯乙烯、(Z)-二苯乙烯、磺酰罗丹明101、磺酰罗丹明B、Synapto-pHluorin、四苯基丁二烯、四钠三(红菲绕啉二磺酸)钌(II)(Tetrasodium tris(bathophenanthroline disulfonate)ruthenium(II))、德克萨斯红、TSQ、伞形花内酯或黄色荧光蛋白。

在一些实施方案中，本发明的标记包括但不限于荧光染料的Alexa Fluor家族(Molecular Probes，Oregon)。在荧光显微术和细胞生物学中，Alexa Fluor类染料被广泛地用作细胞和组织标记。Alexa Fluor系列的激发和发射光谱覆盖可见光谱并且延伸至红外光谱中。大致地根据该家族的个体成员的最大激发(以nm)将其编号。某些Alexa Fluor类染料通过香豆素、罗丹明、呫吨(诸如荧光素)和花菁类染料的磺化合成。在一些实施方案中，磺化使Alexa Fluor类染料带负电荷并且具亲水性。在一些实施方案中，Alexa Fluor类染料比具有相当的激发和发射的普通染料(例如，荧光素、罗丹明)并且在某种程度上比更新的花菁系列更稳定、更明亮并且对pH更不敏感。示例性Alexa Fluor类染料包括但不限于Alexa-350、Alexa405、Alexa-430、Alexa-488、Alexa-500、Alexa-514、Alexa-532、Alexa-546、Alexa-555、Alexa-568、Alexa-594、Alexa-610、Alexa-633、Alexa-647、Alexa-660、Alexa-680、Alexa-700或Alexa-750。

在一些实施方案中，标记可以包括荧光类染料的DyLight Fluor家族(Dyomicsand Thermo Fisher Scientific)中的一种或更多种。示例性DyLight Fluor家族染料包括但不限于DyLight-350、DyLight-405、DyLight488、DyLight-549、DyLight-594、DyLight-633、DyLight-649、DyLight-680、DyLight-750或DyLight-800。

在一些实施方案中，可检测部分或信号部分是纳米材料或包含纳米材料。在一些实施方案中，可检测部分或信号部分是纳米颗粒或包含纳米颗粒。在一些实施方案中，可检测部分或信号部分是量子点或包含量子点。在一些实施方案中，可检测部分或信号部分是量子点。在一些实施方案中，可检测部分或信号部分包含量子点。在一些实施方案中，可检测部分或信号部分是金纳米颗粒或包含金纳米颗粒。在一些实施方案中，可检测部分或信号部分是金纳米颗粒。在一些实施方案中，可检测部分或信号部分包含金纳米颗粒。

本领域技术人员理解，在一些实施方案中，在特定的循环中对针对特定探针或寡核苷酸对标记或信号部分的选择可以基于多种因素来确定，所述多种因素包括，例如，尺寸、所产生的信号的类型、附接至探针或掺入探针中的方式、细胞组分的性质包括细胞组分在细胞内的位置、细胞的特性、被分析的相互作用的类型等。

例如，在一些实施方案中，探针被Cy3或Cy5标记，Cy3或Cy5被合成为携带N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS-酯)反应性基团。由于NHS-酯容易地与脂肪胺基团反应，所以核苷酸可以被氨基烷基基团修饰。这可以通过在合成反应期间掺入氨基烷基修饰的核苷酸进行。在一些实施方案中，每60个碱基使用一个标记以避免猝灭效应。

可检测地标记的寡核苷酸或具有信号部分的探针可以与靶例如转录物或DNA基因座杂交。在一些实施方案中，靶是转录物或包含转录物。在一些实施方案中，靶是转录物。在一些实施方案中，转录物是RNA。在一些实施方案中，转录物是mRNA。在一些实施方案中，转录物是tRNA。在一些实施方案中，转录物是rRNA。在一些实施方案中，转录物是snRNA。在一些实施方案中，RNA是非编码RNA。示例性非编码RNA类型是本领域广泛已知的，包括但不限于长非编码RNA(lncRNA)、微RNA(miRNA)、短干扰RNA(siRNA)、piwi相互作用RNA(piRNA)、核仁小RNA(snoRNA)和其他短RNA。在一些实施方案中，RNA是lncRNA。在一些实施方案中，RNA是miRNA。在一些实施方案中，RNA是piRNA。在一些实施方案中，RNA是snoRNA。

在一些实施方案中，靶是DNA基因座或包含DNA基因座。在一些实施方案中，当靶是DNA基因座时，可检测地标记的寡核苷酸任选地包含一种或更多种RNA核苷酸或RNA区段。可检测地标记的寡核苷酸包含在成像之后可以被选择性地去除(例如，通过RNA特异性的酶消化)而不降解DNA靶的RNA序列。特异性降解RNA而不降解DNA的示例性酶包括但不限于多种RNA酶，诸如RNA酶A和RNA酶H。

在一些实施方案中，可检测地标记的寡核苷酸或具有信号部分的探针与其靶例如转录物或DNA基因座直接杂交。在一些实施方案中，可检测地标记的寡核苷酸或具有信号部分的探针通过与一种或更多种中间物结合或杂交来与其靶特异性相互作用(特异性识别其靶)，所述一种或更多种中间物例如与靶结合、杂交或以其他方式特异性地连接的寡核苷酸。在一些实施方案中，中间寡核苷酸以突出端与其靶杂交，使得具有互补序列的第二寡核苷酸(也被称为“桥接寡核苷酸”、“桥接探针”或“读取探针”)可以与所述中间寡核苷酸结合。例如，在一些实施方案中，中间寡核苷酸(在本文中也被称为“一级探针”)与靶分子杂交，其中中间寡核苷酸包含至少一个突出端序列，使得读取探针可以与中间寡核苷酸结合，所述读取探针包含(i)与中间寡核苷酸的突出端序列的一部分互补的序列和(ii)可检测部分或信号部分。在一些实施方案中，中间寡核苷酸的至少一个突出端序列与桥接探针的序列互补，并且桥接探针包含与读取探针的序列互补的序列，其中读取探针包含(i)与桥接探针的一部分互补的序列和(ii)可检测部分或信号部分。然后，读取探针通过与连接或结合至中间寡核苷酸的桥接探针结合而与中间寡核苷酸相互作用。

在一些实施方案中，中间物靶向核酸并且任选地被可检测部分或信号部分标记，并且在与靶杂交之后包含突出端序列。在一些实施方案中，中间物包含与靶杂交的序列、突出端序列和任选地可检测部分或信号部分。在一些实施方案中，中间物包含与靶杂交的序列和突出端序列。在一些实施方案中，中间物不具有可检测部分或信号部分。在一些实施方案中，第二寡核苷酸是可检测地标记的寡核苷酸。在一些实施方案中，第二可检测地标记的寡核苷酸被染料标记。在一些实施方案中，可检测地标记的寡核苷酸被HCR聚合物标记。在一些实施方案中，贯穿多次接触、去除和/或成像步骤，与靶结合的中间寡核苷酸被保留；在接触和成像步骤中通过可检测标记的组合来提供顺序条形码，所述可检测标记通过桥接探针与中间寡核苷酸连接。例如，当可检测地标记的寡核苷酸被用作读取探针时，通过可检测地标记的寡核苷酸提供条形码，所述可检测地标记的寡核苷酸通过它们的突出端序列与中间寡核苷酸杂交。在成像步骤之后，读取寡核苷酸被任选地如本文描述的去除。在一些实施方案中，读取探针直接与中间寡核苷酸相互作用。在一些实施方案中，读取探针与桥接探针相互作用，所述桥接探针与中间寡核苷酸相互作用或杂交。

在一些实施方案中，对于一个靶采用1个中间寡核苷酸。在一些实施方案中，对于一个靶采用2个或更多个中间寡核苷酸。在一些实施方案中，对于一个靶采用3个或更多个中间寡核苷酸。在一些实施方案中，对于一个靶采用4个或更多个中间寡核苷酸。在一些实施方案中，对于一个靶采用5个或更多个中间寡核苷酸。在一些实施方案中，对于一个靶采用6个或更多个中间寡核苷酸。在一些实施方案中，对于一个靶采用7个或更多个中间寡核苷酸。在一些实施方案中，对于一个靶采用8个或更多个中间寡核苷酸。在一些实施方案中，对于一个靶采用9个或更多个中间寡核苷酸。在一些实施方案中，对于一个靶采用10个或更多个中间寡核苷酸。在一些实施方案中，对于一个靶采用11个或更多个中间寡核苷酸。在一些实施方案中，对于一个靶采用12个或更多个中间寡核苷酸。在一些实施方案中，对于一个靶采用13个或更多个中间寡核苷酸。在一些实施方案中，对于一个靶采用14个或更多个中间寡核苷酸。在一些实施方案中，对于一个靶采用15个或更多个中间寡核苷酸。在一些实施方案中，对于一个靶采用16个或更多个中间寡核苷酸。在一些实施方案中，对于一个靶采用17个或更多个中间寡核苷酸。在一些实施方案中，对于一个靶采用18个或更多个中间寡核苷酸。在一些实施方案中，对于一个靶采用19个或更多个中间寡核苷酸。在一些实施方案中，对于一个靶采用20个或更多个中间寡核苷酸。在一些实施方案中，对于一个靶采用21个或更多个中间寡核苷酸。在一些实施方案中，对于一个靶采用22个或更多个中间寡核苷酸。在一些实施方案中，对于一个靶采用23个或更多个中间寡核苷酸。在一些实施方案中，对于一个靶采用24个或更多个中间寡核苷酸。在一些实施方案中，对于一个靶采用25个或更多个中间寡核苷酸。在一些实施方案中，对于一个靶采用30个或更多个中间寡核苷酸。在一些实施方案中，对于一个靶采用40个或更多个中间寡核苷酸。在一些实施方案中，对于一个靶采用50个或更多个中间寡核苷酸。

在一些实施方案中，每种中间寡核苷酸与靶的一个不同序列杂交。在一些实施方案中，一个靶的每种中间寡核苷酸包含相同的突出端序列。在一些实施方案中，针对一个靶的每种可检测地标记的寡核苷酸包含与该靶的所有中间寡核苷酸共有的相同突出端序列互补的相同的序列。在一些实施方案中，中间寡核苷酸包含与靶互补的序列和与可检测地标记的寡核苷酸互补的序列。

在一些实施方案中，所提供的技术被用于对由于剪接变异、RNA编辑、寡核苷酸修饰或其组合形成的不同转录物进行谱分析。在一些实施方案中，靶是RNA剪接变体。在一些实施方案中，所提供的技术对基因的一种或更多种剪接变体例如基因的一种或更多种剪接变体的位置和数量进行谱分析。在一些实施方案中，所提供的方法或组合物对不同的剪接变体进行谱分析。在一些实施方案中，包含一种或更多种变体的外显子通过顺序杂交和编条形码而被靶向并且编条形码。在一些实施方案中，剪接变体包含由剪接得到的一种或更多种可区分的序列，并且此类序列被靶向。在一些实施方案中，通过靶向外显子和/或可区分的序列，所提供的技术能够对一种或更多种特定的剪接变体或mRNA的整个剪接库(splicing repertoire)进行谱分析。如本领域所广泛已知的，mRNA剪接对许多生物过程和疾病(例如，神经疾病，如孤独症或唐氏综合征)是重要的。负责细胞间细胞粘附和突触发生的分子被剪接并且已知它们的缺陷在脑中产生错误连接(miswiring)并且引起疾病。

在一些实施方案中，可检测地标记的寡核苷酸靶向由序列编辑、化学修饰和/或其组合引起的序列修饰。在一些实施方案中，修饰的核酸靶任选地在转化过程后，与未修饰的靶相比与一种或更多种不同的互补序列杂交，并且使用与修饰的核酸选择性地杂交的一种或更多种寡核苷酸而被谱分析。在一些实施方案中，靶是通过RNA编辑的RNA(Brennicke,A.,A.Marchfelder,等人(1999)."RNA editing".FEMS Microbiol Rev 23(3):297-316)。在一些实施方案中，所提供的技术对通过RNA编辑形成的不同RNA变体进行谱分析。在一些实施方案中，所提供的技术对修饰的寡核苷酸进行谱分析。在一些实施方案中，所提供的技术对甲基化的RNA进行谱分析(Song CX,Yi C,He C.Mapping recently identifiednucleotide variants in the genome and transcriptome.Nat Biotechnol.2012Nov；30(11):1107-16)。在一些实施方案中，所提供的技术对甲基化的DNA进行谱分析。在一些实施方案中，靶是单核苷酸多态性(SNP)。

在一些实施方案中，通过对靶进行谱分析，所提供的技术尤其提供，在一些情况中，在单一细胞、组织、器官或生物体中的靶的数量和/或位置的信息。在一些实施方案中，对转录物的谱分析可以用来定性地和/或定量地界定细胞、组织、器官或生物体内基因表达的时空模式。

在一些实施方案中，一组中的每种可检测地标记的寡核苷酸具有不同的靶，例如，转录物、DNA基因座或蛋白。在一些实施方案中，一组中的两种或更多种可检测地标记的寡核苷酸具有相同的靶。在一些实施方案中，两种或更多种可检测地标记的寡核苷酸靶向相同的转录物。在一些实施方案中，两种或更多种可检测地标记的寡核苷酸靶向相同的DNA基因座。在一些实施方案中，约2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、11种、12种、13种、14种、15种、16种、17种、18种、19种、20种、21种、22种、23种、24种、25种、26种、27种、28种、29种、30种、40种、50种、60种、70种、80种、90种或100种可检测地标记的寡核苷酸靶向相同的靶。在一些实施方案中，2种或更多种可检测地标记的寡核苷酸靶向相同的靶。在一些实施方案中，5种或更多种可检测地标记的寡核苷酸靶向相同的靶。在一些实施方案中，10种或更多种可检测地标记的寡核苷酸靶向相同的靶。在一些实施方案中，15种或更多种可检测地标记的寡核苷酸靶向相同的靶。在一些实施方案中，20种或更多种可检测地标记的寡核苷酸靶向相同的靶。在一些实施方案中，25种或更多种可检测地标记的寡核苷酸靶向相同的靶。在一些实施方案中，30种或更多种可检测地标记的寡核苷酸靶向相同的靶。在一些实施方案中，35种或更多种可检测地标记的寡核苷酸靶向相同的靶。在一些实施方案中，40种或更多种可检测地标记的寡核苷酸靶向相同的靶。在一些实施方案中，45种或更多种可检测地标记的寡核苷酸靶向相同的靶。在一些实施方案中，50种或更多种可检测地标记的寡核苷酸靶向相同的靶。在一些实施方案中，60种或更多种可检测地标记的寡核苷酸靶向相同的靶。在一些实施方案中，70种或更多种可检测地标记的寡核苷酸靶向相同的靶。在一些实施方案中，80种或更多种可检测地标记的寡核苷酸靶向相同的靶。在一些实施方案中，90种或更多种可检测地标记的寡核苷酸靶向相同的靶。在一些实施方案中，100种或更多种可检测地标记的寡核苷酸靶向相同的靶。在一些实施方案中，约1-10种可检测地标记的寡核苷酸靶向相同的靶。在一些实施方案中，约5-15种可检测地标记的寡核苷酸靶向相同的靶。在一些实施方案中，约10-20种可检测地标记的寡核苷酸靶向相同的靶。在一些实施方案中，约15-25种可检测地标记的寡核苷酸靶向相同的靶。在一些实施方案中，约20-30种可检测地标记的寡核苷酸靶向相同的靶。在一些实施方案中，约25-35种可检测地标记的寡核苷酸靶向相同的靶。在一些实施方案中，约30-40种可检测地标记的寡核苷酸靶向相同的靶。在一些实施方案中，约35-45种可检测地标记的寡核苷酸靶向相同的靶。在一些实施方案中，约40-50种可检测地标记的寡核苷酸靶向相同的靶。在一些实施方案中，约45-55种可检测地标记的寡核苷酸靶向相同的靶。在一些实施方案中，约50-70种可检测地标记的寡核苷酸靶向相同的靶。在一些实施方案中，约60-80种可检测地标记的寡核苷酸靶向相同的靶。在一些实施方案中，约70-90种可检测地标记的寡核苷酸靶向相同的靶。在一些实施方案中，约80-100种可检测地标记的寡核苷酸靶向相同的靶。

在一些实施方案中，对相同的靶使用多于一种可检测地标记的寡核苷酸增加了信号强度。在一些实施方案中，靶向相同靶的组中的每种可检测地标记的寡核苷酸与靶的不同部分相互作用。

在一些实施方案中，在一组中针对靶的所有可检测地标记的寡核苷酸具有相同的可检测部分。在一些实施方案中，所有可检测地标记的寡核苷酸以相同的方式被标记。在一些实施方案中，针对靶的所有可检测地标记的寡核苷酸具有相同的荧光团。

在一些实施方案中，针对靶的可检测地标记的寡核苷酸定位在靶的被靶向区域内。被靶向区域可以具有多种长度。在一些实施方案中，被靶向区域的长度为约20bp。在一些实施方案中，被靶向区域的长度为约30bp。在一些实施方案中，被靶向区域的长度为约40bp。在一些实施方案中，被靶向区域的长度为约50bp。在一些实施方案中，被靶向区域的长度为约60bp。在一些实施方案中，被靶向区域的长度为约80bp。在一些实施方案中，被靶向区域的长度为约100bp。在一些实施方案中，被靶向区域的长度为约150bp。在一些实施方案中，被靶向区域的长度为约200bp。在一些实施方案中，被靶向区域的长度为约250bp。在一些实施方案中，被靶向区域的长度为约300bp。在一些实施方案中，被靶向区域的长度为约350bp。在一些实施方案中，被靶向区域的长度为约400bp。在一些实施方案中，被靶向区域的长度为约450bp。在一些实施方案中，被靶向区域的长度为约500bp。在一些实施方案中，被靶向区域的长度为约600bp。在一些实施方案中，被靶向区域的长度为约700bp。在一些实施方案中，被靶向区域的长度为约800bp。在一些实施方案中，被靶向区域的长度为约900bp。在一些实施方案中，被靶向区域的长度为约1,000bp。在一些实施方案中，针对靶的可检测地标记的寡核苷酸被定位为在靶上邻近彼此。

如本领域普通技术人员所理解的，不同的技术可以被用于成像步骤。示例性方法包括但不限于落射荧光显微术、共聚焦显微术、不同类型的超分辨率显微术(PALM/STORM、SSIM/GSD/STED)和光片照明显微术(SPIM等)。

示例性超分辨率技术包括但不限于I⁵M和4Pi-显微术、受激发射损耗显微术(STEDM)、基态损耗显微术(GSDM)、空间结构照明显微术(SSIM)、光激活定位显微术(PALM)、可逆饱和光线性荧光跃迁(RESOLFT)、全内反射荧光显微镜(TIRFM)、荧光-PALM(FPALM)、随机光学重建显微术(STORM)、一纳米精度的荧光成像(FIONA)及其组合。例如：Chi,2009"Super-resolution microscopy:breaking the limits,Nature Methods 6(1):15-18；Blow 2008,"New ways to see a smaller world,"Nature 456:825-828；Hell,等人,2007,"Far-Field Optical Nanoscopy,"Science 316:1153；R.Heintzmann和G.Ficz,2006,"Breaking the resolution limit in light microscopy,"Briefings inFunctional Genomics and Proteomics 5(4):289-301；Garini等人,2005,"From microto nano:recent advances in high-resolution microscopy,"Current Opinion inBiotechnology 16:3-12；和Bewersdorf等人,2006,"Comparison of I5M and 4Pi-microscopy,"222(2):105-117；和Wells,2004,"Man the Nanoscopes,"JCB 164(3):337-340。

在一些实施方案中，使用电子显微镜(EM)。

在一些实施方案中，成像步骤检测靶。在一些实施方案中，成像步骤定位靶。在一些实施方案中，成像步骤提供靶的三维空间信息。在一些实施方案中，成像步骤定量靶。通过使用多次接触和成像步骤，所提供的方法能够以出乎意料的高通量对大量的靶提供空间信息和/或数量信息。例如，当使用F种可检测的不同类型的标记时，在N次接触和成像步骤之后可以获得多达F^N个靶的空间信息和/或数量信息。

在一些实施方案中，所提供的方法包括在接触和/或成像步骤之前或之后的另外的步骤。在一些实施方案中，所提供的方法在每个成像步骤之后包括去除多于一种可检测地标记的寡核苷酸的步骤。在一些实施方案中，去除步骤包括降解可检测地标记的寡核苷酸。在一些实施方案中，去除步骤不显著降解靶，使得如果需要，靶可以被用于下一轮接触和/或成像步骤。在一些实施方案中，去除步骤包括使多于一种可检测地标记的寡核苷酸与消化可检测地标记的寡核苷酸的酶接触。在一些实施方案中，去除步骤包括使可检测地标记的寡核苷酸与DNA酶或RNA酶接触。例如，在一些实施方案中，可检测地标记的寡核苷酸包含DNA序列并且DNA酶被用于其的降解；在一些其他的实施方案中，可检测地标记的寡核苷酸包含RNA序列并且RNA酶被用于其的降解。在一些实施方案中，去除步骤包括降解可检测部分。在一些实施方案中，去除步骤包括光漂白。在一些实施方案中，去除步骤包括使多个可检测地标记的寡核苷酸与变性剂接触，以破坏可检测地标记的寡核苷酸与中间探针或靶核酸之间的相互作用。本文公开了变性剂和组合物。

在一些实施方案中，一组可检测地标记的寡核苷酸的靶也是另一组的靶。在一些实施方案中，一组可检测地标记的寡核苷酸的靶与另一组的靶重叠。在一些实施方案中，重叠多于10％。在一些实施方案中，重叠多于20％。在一些实施方案中，重叠多于30％。在一些实施方案中，重叠多于40％。在一些实施方案中，重叠多于50％。在一些实施方案中，重叠多于60％。在一些实施方案中，重叠多于70％。在一些实施方案中，重叠多于80％。在一些实施方案中，重叠多于90％。在一些实施方案中，重叠多于91％。在一些实施方案中，重叠多于92％。在一些实施方案中，重叠多于93％。在一些实施方案中，重叠多于94％。在一些实施方案中，重叠多于90％。在一些实施方案中，重叠多于95％。在一些实施方案中，重叠多于96％。在一些实施方案中，重叠多于97％。在一些实施方案中，重叠多于98％。在一些实施方案中，重叠多于99％。在一些实施方案中，重叠多于99.5％。在一些实施方案中，重叠多于99.6％。在一些实施方案中，重叠多于99.7％。在一些实施方案中，重叠多于99.8％。在一些实施方案中，重叠多于99.9％。在一些实施方案中，重叠为100％。在一些实施方案中，一组可检测地标记的寡核苷酸的靶与另一组的靶相同。在一些实施方案中，每组可检测地标记的寡核苷酸靶向相同的靶。

在一些实施方案中，在第二接触步骤中靶向第一转录物或DNA基因座(第一靶)的第三可检测地标记的寡核苷酸任选地与靶向第一转录物或DNA基因座的第一可检测地标记的寡核苷酸具有相同的序列。在一些实施方案中，序列是相同的。在一些实施方案中，序列是不同的。相似地，在一些实施方案中，在第二接触步骤中靶向第二转录物或DNA基因座(第一靶)的第四可检测地标记的寡核苷酸任选地与靶向第一转录物或DNA基因座的第二可检测地标记的寡核苷酸具有相同的序列。在一些实施方案中，序列是相同的。在一些实施方案中，序列是不同的。

在一些实施方案中，第二多于一种可检测地标记的寡核苷酸与第一多于一种可检测地标记的寡核苷酸的不同在于存在于第二多于一种可检测地标记的寡核苷酸中的至少一种寡核苷酸被与第一多于一种可检测地标记的寡核苷酸中靶向相同的转录物或DNA基因座的相应寡核苷酸不同的可检测部分标记。在一些实施方案中，可检测地标记的寡核苷酸的每组多于一种可检测地标记的寡核苷酸与另一组多于一种可检测地标记的寡核苷酸的不同在于存在于一组多于一种可检测地标记的寡核苷酸中的至少一种寡核苷酸被与在另一组多于一种可检测地标记的寡核苷酸中靶向相同的转录物或DNA基因座的对应寡核苷酸不同的可检测部分标记。

在一些实施方案中，可检测地标记的寡核苷酸具有[S]-[L]结构，其中[S]是寡核苷酸序列，[L]是可检测部分或可检测部分的组合。在一些实施方案中，[L]包含多个单位的可检测标记，例如荧光团，其中每个单位的可检测标记独立地与寡核苷酸序列例如[S]中的一个或更多个核苷酸部分缔合。在一些实施方案中，每种附接至相同的可检测地标记的寡核苷酸的可检测标记提供相同的可检测信号。在一些实施方案中，附接至相同寡核苷酸序列的所有可检测标记是相同的。

在一些实施方案中，在两组或更多组可检测地标记的寡核苷酸之中靶向相同的靶的寡核苷酸具有相同的序列组，即，在可检测地标记的寡核苷酸之间的差异，如果存在，位于可检测部分内，而不是序列内。例如，在一组可检测地标记的寡核苷酸中，靶向第一靶的可检测地标记的寡核苷酸都具有相同的可检测部分或检测部分的组合[L]₁：

[S]₁-[L]₁、[S]₂-[L]₁、……、[S]_n-[L]₁，其中n是针对靶的可检测地标记的寡核苷酸的数目，例如，3-50的整数。

在另一组可检测地标记的寡核苷酸中，其中靶向相同的靶的寡核苷酸被不同地标记，靶向相同靶的寡核苷酸具有相同的寡核苷酸序列组([S]₁、[S]₂、……、[S]_n)，还有一个不同的[L]₂：

[S]₁-[L]₂、[S]₂-[L]₂、……、[S]_n-[L]₂，其中[L]₁与[L]₂在检测上不同。

例如，以下提供了两步骤、双标记、4靶(F^N＝2²＝4)过程，其中靶向每组中的相同靶的所有可检测地标记的寡核苷酸独立地具有相同的可检测部分：

步骤1.使靶与第一多于一种(P1)可检测地标记的寡核苷酸接触：

靶T1：[S]_P1-T1-1[L]₁、[S]_P1-T1-2[L]₁、[S]_P1-T1-3[L]₁、……、[S]_P1-T1-P1T1[L]₁，

其中P1T1是第一多于一种可检测地标记的寡核苷酸中靶向T1的可检测地标记的寡核苷酸的数目，并且[L]₁是第一可检测标记；

靶T2：[S]_P1-T2-1[L]₁、[S]_P1-T2-2[L]₁、[S]_P1-T2-3[L]₁、……、[S]_P1-T2-P1T2[L]₁，

其中P1T2是第一多于一种可检测地标记的寡核苷酸中靶向T2的可检测地标记的寡核苷酸的数目；

靶T3：[S]_P1-T3-1[L]₂、[S]_P1-T3-2[L]₂、[S]_P1-T3-3[L]₂、……、[S]_P1-T3-P1T3[L]₂，

其中P1T3是第一多于一种可检测地标记的寡核苷酸中靶向T3的可检测地标记的寡核苷酸的数目，并且[L]₂是与[L]₁在检测上不同的标记；

靶T4：[S]_P1-T4-1[L]₂、[S]_P1-T4-2[L]₂、[S]_P1-T4-3[L]₂、……、[S]_P1-T4-P1T4[L]₂，

其中P1T4是第一多于一种可检测地标记的寡核苷酸中靶向T4的可检测地标记的寡核苷酸的数目。

步骤2：成像；

步骤3：从靶去除P1；

步骤4：使靶与第二多于一种(P2)可检测地标记的寡核苷酸接触：

靶T1：[S]_P2-T1-1[L]₁、[S]_P2-T1-2[L]₁、[S]_P2-T1-3[L]₁、……、[S]_P2-T1-P2T1[L]₁，

其中P2T1是第二多于一种可检测地标记的寡核苷酸中靶向T1的可检测地标记的寡核苷酸的数目；

靶T2：[S]_P2-T2-1[L]₂、[S]_P2-T2-2[L]₂、[S]_P2-T2-3[L]₂、……、[S]_P2-T2-P2T2[L]₂，

其中P2T2是第二多于一种可检测地标记的寡核苷酸中靶向T2的可检测地标记的寡核苷酸的数目；

靶T3：[S]_P2-T3-1[L]₁、[S]_P2-T3-2[L]₁、[S]_P2-T3-3[L]₁、……、[S]_P2-T3-P2T3[L]₁，

其中P2T3是第二多于一种可检测地标记的寡核苷酸中靶向T3的可检测地标记的寡核苷酸的数目；

靶T4：[S]_P2-T4-1[L]₂、[S]_P2-T4-2[L]₂、[S]_P2-T4-3[L]₂、……、[S]_P2-T4-P2T4[L]₂，

其中P2T4是第二多于一种可检测地标记的寡核苷酸中靶向T4的可检测地标记的寡核苷酸的数目。

步骤5：成像。

在两次成像步骤之后，每种靶具有其自身独特的顺序条形码：

T1：[L]₁[L]₁；

T2：[L]₁[L]₂；

T3：[L]₂[L]₁；并且

T4：[L]₂[L]₂。

在一些实施方案中，也可以使用另外的条形码T1--、Τ2--、--T1、--T2，其中--指示该步骤没有信号。

在以上示例性方法中，P1T1、P1T2、P1T3、P1T4、P2T1、P2T2、P2T3和P2T4中的每一个独立地是自然数(大于0的整数)。在一些实施方案中，P1T1＝P2T1。在一些实施方案中，P1T2＝P2T2。在一些实施方案中，P1T3＝P2T3。在一些实施方案中，P1T4＝P2T4。在一些实施方案中，一种可检测地标记的寡核苷酸被用于靶。在一些实施方案中，两种或更多种可检测地标记的寡核苷酸被用于靶。

在一些实施方案中，在每组多于一种可检测地标记的寡核苷酸中靶向相同靶的可检测地标记的寡核苷酸具有相同的序列组。例如，对于以上实例中的靶T1，[S]_P1-T1-1至[S]_{P1_T1_P1T1}中的每一个独立地具有与[S]_P2-T1-1至[S]_P2-T1-P2T1之一相同的序列，并且[S]_P2-T1-1至[S]_P2-T1-P2T1中的每一个独立地具有与[S]_P1-T1-1至[S]_P1-T1-P1T1之一相同的序列。在一些实施方案中，在每组多于一种可检测地标记的寡核苷酸中靶向相同靶的可检测地标记的寡核苷酸具有不同的序列组。

在一些实施方案中，本文提供的方法任选地包括在成像步骤之后去除多于一种可检测地标记的寡核苷酸的步骤。在一些实施方案中，所提供的方法包括在成像步骤之后的去除步骤。在一些实施方案中，所提供的方法包括在除了最后的成像步骤之外的每个成像步骤之后的去除步骤。在一些实施方案中，所提供的方法包括在每个成像步骤之后的去除步骤。

本文公开的方法中的去除步骤可以达到多种目的中的一种或更多种。在一些实施方案中，去除步骤将多于一种可检测地标记的寡核苷酸从靶去除以便靶可被用于与另一组多于一种可检测地标记的寡核苷酸相互作用。在一些实施方案中，去除步骤去除多于一种可检测地标记的寡核苷酸以便一组多于一种可检测地标记的寡核苷酸的可检测部分不干扰另一组多于一种可检测地标记的寡核苷酸与靶的结合的检测。在一些实施方案中，去除步骤去除至少80％的可检测地标记的寡核苷酸。在一些实施方案中，去除步骤去除至少85％的可检测地标记的寡核苷酸。在一些实施方案中，去除步骤去除至少90％的可检测地标记的寡核苷酸。在一些实施方案中，去除步骤去除至少91％的可检测地标记的寡核苷酸。在一些实施方案中，去除步骤去除至少92％的可检测地标记的寡核苷酸。在一些实施方案中，去除步骤去除至少93％的可检测地标记的寡核苷酸。在一些实施方案中，去除步骤去除至少94％的可检测地标记的寡核苷酸。在一些实施方案中，去除步骤去除至少95％的可检测地标记的寡核苷酸。在一些实施方案中，去除步骤去除至少96％的可检测地标记的寡核苷酸。在一些实施方案中，去除步骤去除至少97％的可检测地标记的寡核苷酸。在一些实施方案中，去除步骤去除至少98％的可检测地标记的寡核苷酸。在一些实施方案中，去除步骤去除至少99％的可检测地标记的寡核苷酸。在一些实施方案中，去除步骤去除至少99.1％的可检测地标记的寡核苷酸。在一些实施方案中，去除步骤去除至少99.2％的可检测地标记的寡核苷酸。在一些实施方案中，去除步骤去除至少99.3％的可检测地标记的寡核苷酸。在一些实施方案中，去除步骤去除至少99.4％的可检测地标记的寡核苷酸。在一些实施方案中，去除步骤去除至少99.5％的可检测地标记的寡核苷酸。在一些实施方案中，去除步骤去除至少80％的可检测信号。在一些实施方案中，去除步骤去除至少85％的可检测信号。在一些实施方案中，去除步骤去除至少90％的可检测信号。在一些实施方案中，去除步骤去除至少91％的可检测信号。在一些实施方案中，去除步骤去除至少92％的可检测信号。在一些实施方案中，去除步骤去除至少93％的可检测信号。在一些实施方案中，去除步骤去除至少94％的可检测信号。在一些实施方案中，去除步骤去除至少95％的可检测信号。在一些实施方案中，去除步骤去除至少96％的可检测信号。在一些实施方案中，去除步骤去除至少97％的可检测信号。在一些实施方案中，去除步骤去除至少98％的可检测信号。在一些实施方案中，去除步骤去除至少99％的可检测信号。在一些实施方案中，去除步骤去除至少99.5％的可检测信号。在一些实施方案中，去除步骤去除100％的可检测信号。在一些实施方案中，在去除步骤之后没有信号可被成像步骤检测出。

去除步骤任选地保留靶(例如，转录物或DNA基因座)用于进一步使用，例如，通过另外的接触和/或成像步骤进一步检测或定量。在一些实施方案中，去除步骤保留至少80％的靶。保留的靶的百分比可以例如通过比较在去除步骤之前和之后采集的数据而被测量出，任选地利用相同的接触和成像方案进行。在一些实施方案中，去除步骤保留至少85％的靶。在一些实施方案中，去除步骤保留至少90％的靶。在一些实施方案中，去除步骤保留至少91％的靶。在一些实施方案中，去除步骤保留至少92％的靶。在一些实施方案中，去除步骤保留至少93％的靶。在一些实施方案中，去除步骤保留至少94％的靶。在一些实施方案中，去除步骤保留至少95％的靶。在一些实施方案中，去除步骤保留至少96％的靶。在一些实施方案中，去除步骤保留至少97％的靶。在一些实施方案中，去除步骤保留至少98％的靶。在一些实施方案中，去除步骤保留至少99％的靶。

用于去除可检测地标记的寡核苷酸的方法可以包括本领域已知的方法。在一些实施方案中，去除步骤包括降解可检测地标记的寡核苷酸。在一些实施方案中，通过酶消化去除可检测地标记的寡核苷酸。在一些实施方案中，去除步骤包括使多于一种可检测地标记的寡核苷酸与消化可检测地标记的寡核苷酸的酶接触。

合适的酶是本领域中广泛使用的。例如，取决于可检测地标记的寡核苷酸和/或靶的类型，可以使用DNA酶或RNA酶。在一些实施方案中，用于检测/定量RNA靶的包含DNA序列的可检测地标记的寡核苷酸被DNA酶例如DNA酶I消化。在一些实施方案中，用于检测/定量DNA靶的包含RNA序列的可检测地标记的寡核苷酸被RNA酶消化。在一些实施方案中，可检测地标记的RNA寡核苷酸被用来靶向DNA基因座。

在一些实施方案中，可检测地标记的寡核苷酸通过与一种或更多种中间物结合或杂交来与其靶相互作用，所述一种或更多种中间物诸如与靶结合、杂交或以其他方式连接的寡核苷酸。在一些实施方案中，可检测地标记的寡核苷酸通过与中间寡核苷酸杂交来与靶相互作用，所述中间寡核苷酸与靶杂交，其中中间寡核苷酸包含与靶互补的序列和与可检测地标记的寡核苷酸互补的序列(突出端)。在一些实施方案中，去除步骤将可检测地标记的寡核苷酸去除，任选地使中间寡核苷酸保持完整。在一些实施方案中，去除步骤将可检测地标记的寡核苷酸去除并且使中间寡核苷酸保持完整。在一些实施方案中，从化学或酶学角度，可检测地标记的寡核苷酸与中间物不同，以使得可检测地标记的寡核苷酸可以被选择性地去除。

在一些实施方案中，去除步骤包括使靶分子、一种或更多种中间物和可检测地标记的寡核苷酸与包含甲酰胺的溶液接触，其中甲酰胺以约60％(v/v)或更小的浓度存在于溶液中。在一些实施方案中，甲酰胺以约60％(v/v)的浓度存在于溶液中。在一些实施方案中，甲酰胺以小于约60％(v/v)的浓度存在于溶液中。在一些实施方案中，甲酰胺以约40％和60％(v/v)之间的浓度存在于溶液中。在一些实施方案中，甲酰胺以约45％和60％(v/v)之间的浓度存在于溶液中。在一些实施方案中，甲酰胺以约50％和60％(v/v)之间的浓度存在于溶液中。在一些实施方案中，甲酰胺以约55％和60％(v/v)之间的浓度存在于溶液中。在一些实施方案中，甲酰胺以约40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％或60％(v/v)的浓度存在于溶液中。

在一些实施方案中，去除步骤包括使靶分子、一种或更多种中间物和可检测地标记的寡核苷酸与包含尿素的溶液接触，其中尿素以约2M至5M的浓度存在于溶液中。在一些实施方案中，尿素以约2M至4M的浓度存在于溶液中。在一些实施方案中，尿素以约2M至3M的浓度存在于溶液中。在一些实施方案中，尿素以约5M、4.5M、4M、3.5M、3M、2.5M或2M的浓度存在于溶液中。

在一些实施方案中，去除步骤(包括使靶分子、一种或更多种中间物和可检测地标记的寡核苷酸与包含甲酰胺的溶液接触)选择性地破坏可检测地标记的寡核苷酸与一种或更多种中间物之间的相互作用。例如，去除步骤可以选择性地破坏可检测地标记的寡核苷酸与一种或更多种中间物之间的相互作用，而不影响靶分子与一种或更多种中间物之间的相互作用。在这样的实施方案中，一种或更多种中间物能够保持与靶分子结合，同时可检测地标记的寡核苷酸被从其与一种或更多种中间物的相互作用中脱离、解离和/或移除。

在一些实施方案中，使用中间DNA寡核苷酸与DNA基因座杂交，所述中间DNA寡核苷酸具有突出端序列(例如，20nt)以使得包含以下的读取探针可以结合：(i)包含与突出端序列互补的序列的核酸序列，和(ii)可检测的信号)。在一些实施方案中，读取探针包含长度为约17个核苷酸或更少的核酸序列。在一些实施方案中，读取探针包含长度为约17个核苷酸的核酸序列。在一些实施方案中，读取探针包含长度少于约17个核苷酸或更少的核酸序列。在一些实施方案中，读取探针包含长度在约10个和17个核苷酸之间的核酸序列。在一些实施方案中，读取探针包含长度在约11个和17个核苷酸之间的核酸序列。在一些实施方案中，读取探针包含长度在约12个和17个核苷酸之间的核酸序列。在一些实施方案中，读取探针包含长度在约13个和17个核苷酸之间的核酸序列。在一些实施方案中，读取探针包含长度在约14个和17个核苷酸之间的核酸序列。在一些实施方案中，读取探针包含长度在约15个和17个核苷酸之间的核酸序列。在一些实施方案中，读取探针包含长度少于约10个核苷酸的核酸序列。在一些实施方案中，读取探针包含长度在约5个和10个核苷酸之间的核酸序列。在一些实施方案中，读取探针包含长度在约6个和9个核苷酸之间的核酸序列。在一些实施方案中，读取探针包含长度在约7个至8个核苷酸之间的核酸序列。在一些实施方案中，读取探针包含长度为约17个、16个、15个、14个、13个、12个、11个、10个、9个、8个、7个、6个或5个核苷酸的核酸序列。

在一些实施方案中，使用中间DNA寡核苷酸来与DNA基因座杂交，所述中间DNA寡核苷酸具有突出端(例如，20nt)以使得包含RNA序列并具有互补序列的桥接寡核苷酸(例如，RNA桥接探针)可以结合。可以用染料或HCR聚合物(也可以是DNA)直接标记RNA桥接探针。成像之后，可以使用RNA酶来消化掉RNA桥接探针，同时使杂交在DNA基因座上的DNA探针保持完整。这样的方法提供多种优点。例如，随后的接触步骤仅包括RNA桥接探针与具有突出端DNA寡核苷酸杂交，并且避免使双链DNA解链并与DNA寡核苷酸杂交，这是个困难的过程。此外，可以使靶向相同基因的所有DNA寡核苷酸(例如，20-40个)的突出端相同，以使得每轮杂交每个基因仅需要一种类型的RNA桥接探针。为了针对不同的杂交(接触步骤)切换颜色，技术人员可以用不同的标记或不同的HCR聚合物改变RNA桥接探针。还可以使用这样的DNA桥接探针：可以例如用桥或HCR发夹上的诸如EcoRI的特异性酶限制位点来特异性地去除的DNA桥接探针。将细胞与适当的核酸酶一起孵育可以消化掉所有的可检测部分而不影响DNA基因座和/或其上杂交的探针。

在一些实施方案中，可检测地标记的寡核苷酸包含5'磷酸化并且可以被Lambda核酸外切酶降解，而中间寡核苷酸未被5'磷酸化而不能被Lambda核酸外切酶降解。

在一些实施方案中，可检测地标记的寡核苷酸包含尿嘧啶。在一些实施方案中，可检测地标记的寡核苷酸包含尿嘧啶而可以被USER^TM酶(New England BioLabs,Ipswich,Massachusetts,MA,US)降解，而中间寡核苷酸不包含尿嘧啶而不能被USER^TM酶降解。在一些实施方案中，与中间寡核苷酸的突出端杂交的寡核苷酸在与突出端杂交时具有凹陷的3'-末端。具有凹陷的3'-末端的可检测地标记的寡核苷酸在与中间寡核苷酸杂交时可以被核酸外切酶III选择性地消化。由于核酸外切酶III对不具有凹陷的3'-末端或其3'-末端是RNA-DNA双链体的中间寡核苷酸的活性弱得多，所以它们可以保持完整。

在一些实施方案中，当涉及到酶时，在产生最佳结果的温度进行去除步骤。在一些实施方案中，在约37℃进行去除步骤。在一些实施方案中，在室温进行去除步骤。在一些实施方案中，用Lambda核酸外切酶消化在约37℃进行。在一些实施方案中，用USER^TM酶消化在约37℃进行。在一些实施方案中，用USER^TM酶消化在室温进行。在一些实施方案中，用核酸外切酶III消化在约37℃进行。在一些实施方案中，用核酸外切酶III消化在室温进行。

在一些实施方案中，中间寡核苷酸和用于可检测地标记的寡核苷酸结合的突出端序列的使用提供了多种优点。在一些实施方案中，突出端序列与可检测地标记的寡核苷酸之间的杂交的历程比中间寡核苷酸与靶之间的杂交的历程快。在一些实施方案中，针对一种靶的所有中间寡核苷酸包含相同的突出端序列，并且针对一种靶的所有可检测地标记的寡核苷酸包含用于与相同的突出端序列结合的相同的互补序列。在一些实施方案中，一组可检测地标记的寡核苷酸与一组中间寡核苷酸之间的杂交比一组中间寡核苷酸与一组靶之间的杂交快多达约20-40倍。在一些实施方案中，可检测地标记的寡核苷酸与中间寡核苷酸之间的杂交可以在30分钟内完成，与之相比，在一些情况中，对于中间寡核苷酸与靶之间的杂交长达约12小时。

在一些实施方案中，在去除步骤中使用链置换来去除可检测地标记的寡核苷酸。在一些实施方案中，在去除步骤中利用加热来使可检测地标记的寡核苷酸解离。

在一些实施方案中，去除步骤包括光漂白。在一些实施方案中，光漂白破坏可检测地标记的寡核苷酸的染料，诸如荧光团。

在一些实施方案中，第一组和第二组可检测地标记的寡核苷酸靶向每个靶的不同序列，并且在第一成像步骤之后的去除步骤是任选的。例如，一种策略是用不同的DNA探针(可检测地标记的DNA寡核苷酸)来靶向相同的RNA，以使得第一多于一种探针可以靶向RNA上的一组序列，并且第二多于一种探针靶向相同RNA上的不同的序列组。在第一杂交(接触)时，使用第一多于一种探针。它们随后可以被成像并且任选地被DNA酶或破坏寡核苷酸或染料的其他方法光漂白或消化。第二组探针可以被杂交并且被成像，而不受第一组探针的干扰。

在一些实施方案中，所提供的方法任选地包括HCR、光片照明显微术、CLARITY或其组合。在一些实施方案中，所提供的方法允许对组织、器官或生物体中的靶直接进行谱分析。在一些实施方案中，器官是脑。在一些实施方案中，所提供的方法允许对完整的脑或组织中的转录物直接成像。在一些实施方案中，所提供的方法还包括HCR。在一些实施方案中，所提供的方法还包括光片照明显微术。在一些实施方案中，所提供的方法还包括CLARITY。

本文公开的方法提供了优于现有技术中使用的方法的许多优点。例如，在一些实施方案中，所提供的方法在合理的成本下提供了高通量。在一些实施方案中，所提供的方法提供了靶的直接探测，而不转化靶或扩增靶。在一些实施方案中，所提供的方法使得能够快速规模放大而不需要大量的可检测标记。在一些实施方案中，所提供的方法可以对相同的靶应用多于一种标记并且因此增加信号强度。在一些实施方案中，所提供的方法提供了所述优点的组合。

在一些实施方案中，本文提供了包含多于一种可检测地标记的寡核苷酸的组合物，以例如在所提供的方法中使用的。示例性组合物包括但不限于在本文的示例性方法实施方案中描述的那些组合物。

在一些实施方案中，本文提供了包含多于一种可检测地标记的寡核苷酸的组合物，所述可检测地标记的寡核苷酸中的每一种靶向核酸并且被可检测部分标记，因此所述组合物至少包含：

在一些实施方案中，本文提供了包含多于一种可检测地标记的寡核苷酸的组合物，所述可检测地标记的寡核苷酸中的每一种靶向转录物或DNA基因座并且被可检测部分标记，因此所述组合物至少包含：

(ii)第二寡核苷酸，所述第二寡核苷酸靶向第二转录物或DNA基因座并且被第二可检测部分标记。

在一些实施方案中，本文提供了包含多于一种可检测地标记的寡核苷酸的试剂盒，所述可检测地标记的寡核苷酸中的每一种靶向转录物或DNA基因座并且被可检测部分标记，因此所述试剂盒至少包含：

(i)第一寡核苷酸，所述第一寡核苷酸靶向第一转录物或DNA基因座并且被第一可检测部分标记；

(iii)第三寡核苷酸，所述第三寡核苷酸任选地在序列上与第一寡核苷酸相同，所述第三寡核苷酸靶向第一转录物或DNA基因座并且被第一可检测部分、第二可检测部分或第三可检测部分标记；以及

(iv)第四寡核苷酸，所述第四寡核苷酸任选地在序列上与第二寡核苷酸相同，所述第四寡核苷酸靶向第二转录物或DNA基因座，并且被第一可检测部分、第二可检测部分、第三可检测部分或第四可检测部分标记，

在一些实施方案中，组合物中的靶向相同的靶(转录物或DNA基因座)的可检测地标记的寡核苷酸被提供相同的可检测信号或在成像步骤中无法区分的可检测信号的部分标记。在一些实施方案中，组合物中的靶向相同的靶的可检测地标记的寡核苷酸被相同的可检测部分标记。

在一些实施方案中，可检测部分是荧光团或包含荧光团。在一些实施方案中，可检测部分是荧光团。示例性荧光团是领域内被广泛已知和使用的，例如但不限于荧光素、罗丹明、Alexa Fluor类、Dylight Fluor类、ATTO类染料或其任何类似物或衍生物。

在一些实施方案中，第一可检测地标记的寡核苷酸和第二可检测地标记的寡核苷酸靶向不同的靶。在一些实施方案中，第一可检测地标记的寡核苷酸和第二可检测地标记的寡核苷酸靶向相同的靶。在一些实施方案中，组合物或试剂盒中的可检测地标记的寡核苷酸靶向两种或更多种靶，例如，转录物和/或DNA基因座。在一些实施方案中，组合物或试剂盒中的可检测地标记的寡核苷酸靶向两种或更多种转录物。在一些实施方案中，组合物或试剂盒中的可检测地标记的寡核苷酸靶向两种或更多种DNA基因座。在一些实施方案中，组合物或试剂盒中的可检测地标记的寡核苷酸靶向至少4种靶。在一些实施方案中，组合物或试剂盒中的可检测地标记的寡核苷酸靶向至少9种靶。在一些实施方案中，组合物或试剂盒中的可检测地标记的寡核苷酸靶向至少16种靶。在一些实施方案中，组合物或试剂盒中的可检测地标记的寡核苷酸靶向至少25种靶。在一些实施方案中，组合物或试剂盒中的可检测地标记的寡核苷酸靶向至少36种靶。在一些实施方案中，组合物或试剂盒中的可检测地标记的寡核苷酸靶向至少50种靶。在一些实施方案中，组合物或试剂盒中的可检测地标记的寡核苷酸靶向至少100种靶。在一些实施方案中，组合物或试剂盒中的可检测地标记的寡核苷酸靶向至少200种靶。在一些实施方案中，组合物或试剂盒中的可检测地标记的寡核苷酸靶向至少500种靶。在一些实施方案中，组合物或试剂盒中的可检测地标记的寡核苷酸靶向至少1,000种靶。在一些实施方案中，组合物或试剂盒中的可检测地标记的寡核苷酸靶向至少5,000种靶。在一些实施方案中，组合物或试剂盒中的可检测地标记的寡核苷酸靶向至少10,000种靶。在一些实施方案中，组合物或试剂盒中的可检测地标记的寡核苷酸靶向至少50,000种靶。在一些实施方案中，组合物或试剂盒中的可检测地标记的寡核苷酸靶向至少100,000种靶。在一些实施方案中，组合物或试剂盒中的可检测地标记的寡核苷酸靶向至少1,000,000种靶。

在一些实施方案中，第一寡核苷酸和第二寡核苷酸具有不同的寡核苷酸序列。在一些实施方案中，第一可检测部分和第二可检测部分是不同的。在一些实施方案中，第一可检测部分和第二可检测部分是相同的。

在一些实施方案中，第一寡核苷酸和第二寡核苷酸共有少于5％的序列同一性。在一些实施方案中，第一寡核苷酸和第二寡核苷酸共有少于10％的序列同一性。在一些实施方案中，第一寡核苷酸和第二寡核苷酸共有少于20％的序列同一性。在一些实施方案中，第一寡核苷酸和第二寡核苷酸共有少于30％的序列同一性。在一些实施方案中，第一寡核苷酸和第二寡核苷酸共有少于40％的序列同一性。在一些实施方案中，第一寡核苷酸和第二寡核苷酸共有少于50％的序列同一性。在一些实施方案中，第一寡核苷酸和第二寡核苷酸共有少于60％的序列同一性。在一些实施方案中，第一寡核苷酸和第二寡核苷酸共有少于65％的序列同一性。在一些实施方案中，第一寡核苷酸和第二寡核苷酸共有少于68％的序列同一性。在一些实施方案中，第一寡核苷酸和第二寡核苷酸共有少于70％的序列同一性。在一些实施方案中，第一寡核苷酸和第二寡核苷酸共有少于80％的序列同一性。在一些实施方案中，第一寡核苷酸和第二寡核苷酸共有少于90％的序列同一性。

在一些实施方案中，每种寡核苷酸与任何其他寡核苷酸共有少于5％的序列同一性。在一些实施方案中，每种寡核苷酸与任何其他寡核苷酸共有少于10％的序列同一性。在一些实施方案中，每种寡核苷酸与任何其他寡核苷酸共有少于20％的序列同一性。在一些实施方案中，每种寡核苷酸与任何其他寡核苷酸共有少于30％的序列同一性。在一些实施方案中，每种寡核苷酸与任何其他寡核苷酸共有少于40％的序列同一性。在一些实施方案中，每种寡核苷酸与任何其他寡核苷酸共有少于50％的序列同一性。在一些实施方案中，每种寡核苷酸与任何其他寡核苷酸共有少于55％的序列同一性。在一些实施方案中，每种寡核苷酸与任何其他寡核苷酸共有少于60％的序列同一性。在一些实施方案中，每种寡核苷酸与任何其他寡核苷酸共有少于65％的序列同一性。在一些实施方案中，每种寡核苷酸与任何其他寡核苷酸共有少于68％的序列同一性。在一些实施方案中，每种寡核苷酸与任何其他寡核苷酸共有少于70％的序列同一性。在一些实施方案中，每种寡核苷酸与任何其他寡核苷酸共有少于80％的序列同一性。在一些实施方案中，每种寡核苷酸与任何其他寡核苷酸共有少于90％的序列同一性。

在一些实施方案中，组合物或试剂盒包含靶向相同的靶的两种或更多种可检测地标记的寡核苷酸。在一些实施方案中，5、10、20、30、40、50种或更多种可检测地标记的寡核苷酸靶向相同的靶。

可检测地标记的寡核苷酸可以为多种合适的长度。在一些实施方案中，可检测地标记的寡核苷酸的长度为至少15个碱基对。在一些实施方案中，可检测地标记的寡核苷酸的长度为至少16个碱基对。在一些实施方案中，可检测地标记的寡核苷酸的长度为至少17个碱基对。在一些实施方案中，可检测地标记的寡核苷酸的长度为至少18个碱基对。在一些实施方案中，可检测地标记的寡核苷酸的长度为至少19个碱基对。在一些实施方案中，可检测地标记的寡核苷酸的长度为至少20个碱基对。在一些实施方案中，可检测地标记的寡核苷酸的长度为至少21个碱基对。在一些实施方案中，可检测地标记的寡核苷酸的长度为至少22个碱基对。在一些实施方案中，可检测地标记的寡核苷酸的长度为至少23个碱基对。在一些实施方案中，可检测地标记的寡核苷酸的长度为至少24个碱基对。在一些实施方案中，可检测地标记的寡核苷酸的长度为至少25个碱基对。在一些实施方案中，可检测地标记的寡核苷酸的长度为至少26个碱基对。在一些实施方案中，可检测地标记的寡核苷酸的长度为至少27个碱基对。在一些实施方案中，可检测地标记的寡核苷酸的长度为至少28个碱基对。在一些实施方案中，可检测地标记的寡核苷酸的长度为至少29个碱基对。在一些实施方案中，可检测地标记的寡核苷酸的长度为至少30个碱基对。在一些实施方案中，可检测地标记的寡核苷酸的长度为至少35个碱基对。在一些实施方案中，可检测地标记的寡核苷酸的长度为至少40个碱基对。在一些实施方案中，可检测地标记的寡核苷酸的长度为至少50个碱基对。在一些实施方案中，可检测地标记的寡核苷酸的长度为约15-25个碱基对。在一些实施方案中，可检测地标记的寡核苷酸的长度为约20-30个碱基对。在一些实施方案中，可检测地标记的寡核苷酸的长度为约25-35个碱基对。在一些实施方案中，可检测地标记的寡核苷酸的长度为约30-40个碱基对。在一些实施方案中，可检测地标记的寡核苷酸的长度为约35-45个碱基对。在一些实施方案中，可检测地标记的寡核苷酸的长度为约40-50个碱基对。在一些实施方案中，可检测地标记的寡核苷酸的长度为约15-30个碱基对。在一些实施方案中，可检测地标记的寡核苷酸的长度为约20-30个碱基对。在一些实施方案中，可检测地标记的寡核苷酸的长度为约15-35个碱基对。在一些实施方案中，可检测地标记的寡核苷酸的长度为约20-35个碱基对。

在一些实施方案中，多于一种可检测地标记的寡核苷酸包含两种可检测部分。在一些实施方案中，多于一种可检测地标记的寡核苷酸包含三种可检测部分。在一些实施方案中，多于一种可检测地标记的寡核苷酸包含四种可检测部分。在一些实施方案中，多于一种可检测地标记的寡核苷酸包含五种可检测部分。在一些实施方案中，多于一种可检测地标记的寡核苷酸包含六种可检测部分。在一些实施方案中，多于一种可检测地标记的寡核苷酸包含七种可检测部分。在一些实施方案中，多于一种可检测地标记的寡核苷酸包含八种可检测部分。在一些实施方案中，多于一种可检测地标记的寡核苷酸包含九种可检测部分。在一些实施方案中，多于一种可检测地标记的寡核苷酸包含十种可检测部分。

在一些实施方案中，多于一种可检测地标记的寡核苷酸包含至少两种可检测部分。在一些实施方案中，多于一种可检测地标记的寡核苷酸包含至少三种可检测部分。在一些实施方案中，多于一种可检测地标记的寡核苷酸包含至少四种可检测部分。在一些实施方案中，多于一种可检测地标记的寡核苷酸包含至少五种可检测部分。在一些实施方案中，多于一种可检测地标记的寡核苷酸包含至少六种可检测部分。在一些实施方案中，多于一种可检测地标记的寡核苷酸包含至少七种可检测部分。在一些实施方案中，多于一种可检测地标记的寡核苷酸包含至少八种可检测部分。在一些实施方案中，多于一种可检测地标记的寡核苷酸包含至少九种可检测部分。在一些实施方案中，多于一种可检测地标记的寡核苷酸包含至少十种可检测部分。

在一些实施方案中，组合物还包含：

(iii)第三寡核苷酸，所述第三寡核苷酸任选地在序列上与第一寡核苷酸相同，所述第三寡核苷酸靶向第一转录物或DNA基因座；以及

(iv)第四寡核苷酸，所述第四寡核苷酸任选地在序列上与第二寡核苷酸相同，所述第四寡核苷酸靶向第二转录物或DNA基因座，

在一些实施方案中，第三寡核苷酸在序列上与第一寡核苷酸相同。在一些实施方案中，第三寡核苷酸包含与第一寡核苷酸重叠的序列。在一些实施方案中，第三寡核苷酸与第一寡核苷酸具有少于50％的序列同一性。在一些实施方案中，第三寡核苷酸与第一寡核苷酸具有少于40％的序列同一性。在一些实施方案中，第三寡核苷酸与第一寡核苷酸具有少于30％的序列同一性。在一些实施方案中，第三寡核苷酸与第一寡核苷酸具有少于20％的序列同一性。在一些实施方案中，第三寡核苷酸与第一寡核苷酸具有少于10％的序列同一性。在一些实施方案中，第三寡核苷酸与第一寡核苷酸具有少于5％的序列同一性。

在一些实施方案中，第四寡核苷酸在序列上与第二寡核苷酸相同。在一些实施方案中，第四寡核苷酸包含与第二寡核苷酸重叠的序列。在一些实施方案中，第四寡核苷酸与第二寡核苷酸具有少于50％的序列同一性。在一些实施方案中，第四寡核苷酸与第二寡核苷酸具有少于40％的序列同一性。在一些实施方案中，第四寡核苷酸与第二寡核苷酸具有少于30％的序列同一性。在一些实施方案中，第四寡核苷酸与第二寡核苷酸具有少于20％的序列同一性。在一些实施方案中，第四寡核苷酸与第二寡核苷酸具有少于10％的序列同一性。在一些实施方案中，第四寡核苷酸与第二寡核苷酸具有少于5％的序列同一性。

在一些实施方案中，第三寡核苷酸被与第一寡核苷酸不同的可检测部分标记。在一些实施方案中，第四寡核苷酸被与第二寡核苷酸不同的可检测部分标记。

在一些实施方案中，多于一种可检测地标记的寡核苷酸、组合物、试剂盒或方法中的可检测地标记的寡核苷酸的量是预先确定的。在一些实施方案中，多于一种可检测地标记的寡核苷酸、组合物、试剂盒或方法中的5％的可检测地标记的寡核苷酸的量是预先确定的。在一些实施方案中，多于一种可检测地标记的寡核苷酸、组合物、试剂盒或方法中的10％的可检测地标记的寡核苷酸的量是预先确定的。在一些实施方案中，多于一种可检测地标记的寡核苷酸、组合物、试剂盒或方法中的20％的可检测地标记的寡核苷酸的量是预先确定的。在一些实施方案中，多于一种可检测地标记的寡核苷酸、组合物、试剂盒或方法中的30％的可检测地标记的寡核苷酸的量是预先确定的。在一些实施方案中，多于一种可检测地标记的寡核苷酸、组合物、试剂盒或方法中的40％的可检测地标记的寡核苷酸的量是预先确定的。在一些实施方案中，多于一种可检测地标记的寡核苷酸、组合物、试剂盒或方法中的50％的可检测地标记的寡核苷酸的量是预先确定的。在一些实施方案中，多于一种可检测地标记的寡核苷酸、组合物、试剂盒或方法中的60％的可检测地标记的寡核苷酸的量是预先确定的。在一些实施方案中，多于一种可检测地标记的寡核苷酸、组合物、试剂盒或方法中的70％的可检测地标记的寡核苷酸的量是预先确定的。在一些实施方案中，多于一种可检测地标记的寡核苷酸、组合物、试剂盒或方法中的80％的可检测地标记的寡核苷酸的量是预先确定的。在一些实施方案中，多于一种可检测地标记的寡核苷酸、组合物、试剂盒或方法中的90％的可检测地标记的寡核苷酸的量是预先确定的。

在一些实施方案中，多于一种可检测地标记的寡核苷酸、组合物、试剂盒或方法中的至少5种可检测地标记的寡核苷酸的量是预先确定的。在一些实施方案中，多于一种可检测地标记的寡核苷酸、组合物、试剂盒或方法中的至少10种可检测地标记的寡核苷酸的量是预先确定的。在一些实施方案中，多于一种可检测地标记的寡核苷酸、组合物、试剂盒或方法中的至少20种可检测地标记的寡核苷酸的量是预先确定的。在一些实施方案中，多于一种可检测地标记的寡核苷酸、组合物、试剂盒或方法中的至少30种可检测地标记的寡核苷酸的量是预先确定的。在一些实施方案中，多于一种可检测地标记的寡核苷酸、组合物、试剂盒或方法中的至少40种可检测地标记的寡核苷酸的量是预先确定的。在一些实施方案中，多于一种可检测地标记的寡核苷酸、组合物、试剂盒或方法中的至少50种可检测地标记的寡核苷酸的量是预先确定的。在一些实施方案中，多于一种可检测地标记的寡核苷酸、组合物、试剂盒或方法中的至少60种可检测地标记的寡核苷酸的量是预先确定的。在一些实施方案中，多于一种可检测地标记的寡核苷酸、组合物、试剂盒或方法中的至少70种可检测地标记的寡核苷酸的量是预先确定的。在一些实施方案中，多于一种可检测地标记的寡核苷酸、组合物、试剂盒或方法中的至少80种可检测地标记的寡核苷酸的量是预先确定的。在一些实施方案中，多于一种可检测地标记的寡核苷酸、组合物、试剂盒或方法中的至少90种可检测地标记的寡核苷酸的量是预先确定的。在一些实施方案中，多于一种可检测地标记的寡核苷酸、组合物、试剂盒或方法中的至少每种可检测地标记的寡核苷酸的量是预先确定的。

在一些实施方案中，对于一种靶提供两种或更多种可检测地标记的寡核苷酸。在一些实施方案中，针对一种靶的所有可检测地标记的寡核苷酸的总量是预先确定的。在一些实施方案中，针对一种靶的所有可检测地标记的寡核苷酸的总量是预先确定的，其中针对所述靶的每种可检测地标记的寡核苷酸的量是独立地且任选地预先确定的。在一些实施方案中，针对多于一种靶中的每一种的所有可检测地标记的寡核苷酸的总量是预先确定的。在一些实施方案中，多于一种靶具有至少2种靶。在一些实施方案中，多于一种靶具有至少5种靶。在一些实施方案中，多于一种靶具有至少10种靶。在一些实施方案中，多于一种靶具有至少50种靶。在一些实施方案中，多于一种靶具有至少100种靶。在一些实施方案中，多于一种靶具有至少500种靶。在一些实施方案中，多于一种靶具有至少1,000种靶。

在一些实施方案中，多于一种可检测地标记的寡核苷酸、组合物、试剂盒或方法中的靶是预先确定的。在一些实施方案中，多于一种可检测地标记的寡核苷酸、组合物、试剂盒或方法中的至少10种靶是预先确定的。在一些实施方案中，多于一种可检测地标记的寡核苷酸、组合物、试剂盒或方法中的至少50种靶是预先确定的。在一些实施方案中，多于一种可检测地标记的寡核苷酸、组合物、试剂盒或方法中的至少100种靶是预先确定的。在一些实施方案中，多于一种可检测地标记的寡核苷酸、组合物、试剂盒或方法中的至少1,000种靶是预先确定的。在一些实施方案中，多于一种可检测地标记的寡核苷酸、组合物、试剂盒或方法中的多达F^N种靶是预先确定的，其中F是多于一种可检测地标记的寡核苷酸中的可检测部分的数目，而N是成像步骤的数目。

用于合成可检测地标记的寡核苷酸的方法是在领域广泛已知和实践的，例如，参见Lubeck,E.&Cai,L.Nat.Methods 9,743–48(2012)。寡核苷酸也是从多个供应商商业上可得的。在一些实施方案中，本文公开的方法可以用于制备可检测地标记的寡核苷酸。在一些实施方案中，本文公开的方法可以用于制备中间寡核苷酸。在一些实施方案中，本文公开的方法可以用于制备桥接寡核苷酸。

在一些实施方案中，本发明提供了用于制备具有第一序列的靶核酸的方法，所述方法包括以下步骤：

1)提供包含第一序列的第一核酸，其中第一序列在两个末端处的侧翼为切口核酸内切酶位点；

2)扩增第一核酸或第一核酸的一部分，以提供第二核酸，所述第二核酸包含第一序列和侧翼切口核酸内切酶位点；以及

3)使第二核酸与对应于侧翼切口核酸内切酶位点的一种或更多种切口核酸内切酶接触。

在一些实施方案中，具有第一序列的靶核酸是单链的。在一些实施方案中，扩增步骤包括聚合酶链式反应(PCR)。在一些实施方案中，所提供的方法还包括变性的步骤，其中双链的第二核酸被变性并且双链变成单链的。在一些实施方案中，所提供的方法还包括分离具有第一序列的核酸。在一些实施方案中，在与切口核酸内切酶接触之前，第二核酸任选地被修饰。在一些实施方案中，所提供的方法还包括标记具有第一序列的核酸。

在一些实施方案中，两个侧翼核酸内切酶位点是相同的。在一些实施方案中，使用对应于相同的切口核酸内切酶位点的一种切口核酸内切酶。在一些实施方案中，两个侧翼核酸内切酶位点是不同的。在一些实施方案中，使用两种切口核酸内切酶，所述两种切口核酸内切酶的每种独立地对应于一个切口内切核酸位点。

在一些实施方案中，所提供的技术的寡核苷酸从寡核苷酸池(pool)产生。在一些实施方案中，此类池是商业上可得的。在一些实施方案中，初始DNA寡核苷酸池由被组织成亚组的多达12,000种或更多种单链序列组成。每种序列被设计以使得期望的序列(例如，探针序列)的侧翼为切口核酸内切酶位点以及正向引物序列和反向引物序列。正向引物序列和反向引物序列对所期望的序列所属的亚组特异。引物对可被用于利用聚合酶链式反应(PCR)扩增亚组。PCR反应的产物被分离并通过切口核酸内切酶消化。与切口酶一起孵育的时间基于所使用的酶的量和回收的DNA的量而变化。在一些实施方案中，在约1小时内约10单位的酶消化约1μg的DNA。然后在缓冲液例如2x加载缓冲液(96％甲酰胺/20mM EDTA)和水中纯化和重构样品，以制备最终的加载缓冲液(48％甲酰胺/10mM EDTA)并且变性，例如，通过加热至95℃以使DNA完全变性。纯化变性的DNA并且分离所期望的产物。在一些实施方案中，纯化和/或分离包括电泳。在图25中说明了示例性过程。

在一些实施方案中，本文提供了用于制备具有第一序列的靶核酸的方法，所述方法包括以下步骤：

1)提供包含第一序列或其互补序列的第一核酸，其中第一序列或其互补序的侧翼为至少一个限制性位点；

2)扩增第一核酸或第一核酸的一部分，以提供第二核酸，所述第二核酸包含第一序列和至少一个侧翼限制性位点；以及

3)使第二核酸与对应于至少一个侧翼限制性位点的限制性酶接触，以提供包含凹陷末端的第三核酸；

4)使第三核酸与核酸酶接触，以选择性地消化包含互补序列的链(如果存在)，同时保留包含第一序列的链。

在一些实施方案中，第一序列或其互补序列在每个末端侧翼独立地为限制性位点。

1)提供包含第一序列或其互补序列的第一核酸，其中第一序列或其互补序列在两端侧翼均为限制性位点；

2)扩增第一核酸或第一核酸的一部分，以提供第二核酸，所述第二核酸包含第一序列和侧翼限制性位点；以及

3)使第二核酸与对应于侧翼限制性位点的限制性酶接触，以提供包含凹陷末端的第三核酸；

在一些实施方案中，具有第一序列的靶核酸是单链的。在一些实施方案中，扩增步骤包括PCR。在一些实施方案中，所提供的方法还包括分离具有第一序列的核酸。在一些实施方案中，在与限制性酶接触之前，第二核酸任选地被修饰。在一些实施方案中，在与核酸酶接触之前，第三核酸任选地被修饰。在一些实施方案中，核酸酶是核酸外切酶III，其优先降解带有3'-凹陷末端的链，并且可以保留带有5'-凹陷末端的链。在一些实施方案中，限制性酶产生5'-凹陷末端。在一些实施方案中，限制性酶产生3'-凹陷末端。在一些实施方案中，在限制性消化之后，互补序列具有3'凹陷末端。在一些实施方案中，在限制性消化之后包含互补序列的链具有3'凹陷末端，并且在限制性消化之后包含第一序列的链具有5'凹陷末端。在一些实施方案中，所提供的方法还包括标记具有第一序列的核酸。

在一些实施方案中，单链的寡核苷酸，例如用于seqFISH的探针或中间寡核苷酸，可利用核酸酶消化诸如exoIII核酸酶消化来产生。可以使用两个限制性位点侧接探针和/或适体序列，而不是使用扩增(例如，PCR)产物上的两个切口位点。在一些实施方案中，一个限制性位点留下3'凹陷末端同时另一个留下5'凹陷末端。例如，EcoRI和BamHI留下5'凹陷末端，同时BmtI和PacI留下3'凹陷末端。这样的限制性酶是本领域广泛已知和使用的。核酸外切酶III优先降解3'凹陷末端，而保留链的5'凹陷末端。这提供了利用PCR和限制性核酸酶从寡核苷酸池产生单链探针的另一种机制。

在一些实施方案中，所提供的靶核酸是DNA。在一些实施方案中，靶核酸具有与第一序列相同的序列。在一些实施方案中，靶核酸是中间寡核苷酸，包含与靶杂交的第一序列和与第二寡核苷酸杂交的第二序列，所述靶例如转录物或DNA基因座，所述第二寡核苷酸例如可检测地标记的寡核苷酸。在一些实施方案中，靶核酸是中间寡核苷酸，包含与靶杂交的第一序列和与由HCR标记的可检测地标记的寡核苷酸杂交的第二序列。在一些实施方案中，靶核酸是桥接探针。

在一些实施方案中，所提供的方法被用于诊断疾病，其中所述疾病与转录物或DNA基因座的异常数目有关。在一些实施方案中，所提供的方法被用来选择治疗的受试者。在一些实施方案中，所提供的方法被用来监控治疗方案。在一些实施方案中，所提供的方法中的细胞来自受试者。在一些实施方案中，所提供的方法中的细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，所提供的方法中的细胞是人类细胞。在一些实施方案中，所提供的方法中的细胞来自受试者。在一些实施方案中，所提供的方法中的细胞来自动物。在一些实施方案中，所提供的方法中的细胞来自人类受试者。在一些实施方案中，所提供的方法中的细胞从人类受试者分离。在一些实施方案中，所提供的方法中的细胞来自病变组织或对疾病易感的组织。由于能够同时检测并且定量大量的靶，所提供的方法对诊断、治疗监控和患者分层提供了显著的优势。

在一些实施方案中，所提供的技术任选地包括对蛋白、神经活动和/或结构布置进行谱分析。在一些实施方案中，所提供的方法包括对同一样品中的蛋白进行谱分析。在一些实施方案中，所提供的方法包括对同一样品中的神经活动进行谱分析。在一些实施方案中，所提供的方法包括对结构布置进行谱分析。

在一方面中，本文公开了具有可裂解接头的读取探针。图5描绘了用于合成具有二硫化物接头的读取探针的示例性化学反应。

在一方面中，通过使用经由可裂解接头与信号部分缀合的核酸读取探针进行顺序编条形码FISH(seqFISH)。可以使用任何合适的可裂解接头，包括但不限于酶可裂解接头、亲核/碱敏感接头、还原敏感接头、光可裂解接头、亲电/酸敏感接头、金属辅助的可裂解接头或氧化敏感接头。示例性的接头可见于Leriche等人2012,“Cleavable linkers inchemical biology,”Bioorganic&Medicinal Chemistry 20:571–582中，在此将其以其整体并入本文。

在一些实施方案中，可裂解接头是二硫键(disulfide linkage)。在一些实施方案中，可裂解接头是核酸限制性位点。在一些实施方案中，可裂解接头是蛋白酶裂解位点。

在图6A中示出了利用核酸读取探针的示例性系统。如描绘的，基因特异性一级探针在原位或体外环境下与靶位点例如mRNA分子中的靶位点结合。在图6A中说明的示例性实施方案中，使用基因特异性一级探针、二级桥接探针和三级读取探针进行顺序编条形码。例如，用通过二硫键与染料缀合的DNA读取探针进行顺序编条形码FISH(seqFISH)。所述方法包括基因特异性一级探针的杂交，随后为具有读取结合位点的二级桥接探针的杂交，以及具有二硫化物连接的染料的独特的三级读取探针的杂交。在成像后，可以使用还原剂诸如TCEP/DTT来消除荧光信号。随后的杂交提供了荧光信号，其信号不受来自之前的轮次的杂交的荧光信号的干扰。二级桥接探针可以通过本文公开的去除步骤(例如，甲酰胺溶液)来剥离，并且被新的二级桥接探针组置换。除了结合序列，一级探针还包含在结合序列一端的突出端序列。在一些实施方案中，在结合序列的另一端包含第二突出端序列。

在一些实施方案中，突出端序列包含一种或更多种核酸读取探针结合的一个或更多个靶序列。在一些实施方案中，每个靶序列与一组具有特定读取结合序列的读取探针独特地相互作用。如本文公开的，突出端序列可以包含两个靶序列、三个靶序列、五个或更少的靶序列、七个或更少的靶序列、或十个或更少的靶序列。在一些实施方案中，突出端序列可以包含十个或更多个靶序列。在存在两个突出端序列的情况下，可以实现类似的布置。

在一些实施方案中，如在图6A中描绘的，突出端序列与桥接探针结合，所述桥接探针为一种或更多种读取探针提供结合的靶序列。桥接探针可以可互换地被称为中间桥接探针或二级桥接探针。桥接探针包含与一级探针的突出端序列的全部或一部分结合的结合序列。在一些实施方案中，桥接探针还包含一个或更多个串联连接并且与结合序列连接的读取结合靶。

在一些实施方案中，如在图6B中描绘的，两种桥接探针可以经由两个突出端序列与相同的一级探针结合。例如，在具有两个突出端序列的一级探针中，每个突出端序列可以与包含独特的三级读取探针结合位点的二级桥接探针结合。在该图中，每种二级桥接探针包含三(3)个独特的三级读取探针结合位点。然而，二级桥接探针可以包含任何数目的独特的三级读取探针结合位点，例如，从一个最多到十个或更多个读取探针结合位点。例如，二级桥接探针可以包含1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个或更多个三级读取探针结合位点。在图6B中说明的实例中，采用了四(4)种不同颜色的荧光团。通过采用四种不同的荧光团颜色，人们可以用该设计将条形码的数目规模放大至4⁶＝4096种条形码。

如本文公开的，桥接探针可以包含两个读取结合靶、三个读取结合靶、五个或更少的读取结合靶、七个或更少的读取结合靶、或十个或更少的读取结合靶。在一些实施方案中，突出端序列可以包含十个或更多个读取结合靶。在存在两种与突出端序列结合的桥接探针的情况下，可以实现类似的布置。

在图6A和图6B中说明了利用读取探针的示例性再杂交方案。例如，第一轮再杂交(hyb1)始于基因特异性一级探针与靶mRNA的杂交。每种基因特异性一级探针包含一个或更多个“突出端”序列，二级桥接探针可以与其杂交。二级桥包含两个或更多个三级读取结合位点，这是有效和快速再杂交的关键。在第一次杂交中，与蓝色染料缀合的独特的三级读取探针与它们在二级桥接探针上的独特结合位点杂交。在成像后，将样品用还原剂诸如TCEP或DTT处理，以裂解二硫化物连接的染料。然后，用洗涤缓冲液洗涤样品。在第二轮杂交期间，第二组具有红色染料的独特的三级读取探针与其在二级桥上的独特结合位点杂交。在两轮杂交之后，特定的mRNA然后被以红色和蓝色的颜色条形码编条形码。可以应用另外的轮的杂交来产生更复杂的编条形码序列。在技术上，用这种再杂交方法的seqFISH的比例因子取决于可用的二级桥的数目及其独特的三级探针结合位点的数目。例如，通过掺入具有总计8种独特的三级读取结合位点(N＝8)且具有4种荧光团(F＝4)的2种二级桥，人们可以产生多达多于64,000种独特的条形码(F^N＝4⁸＝65,536)。此外，在使用桥接探针的实施方案中，可以用高浓度的甲酰胺剥离二级桥，并且流入另一组独特的二级桥以继续规模放大过程，这进一步增加了比例因子的上限。

在一方面中，本文公开了基于杂交链式反应(HCR)在顺序杂交反应期间的每一轮杂交期间放大视觉信号的方法和系统。在图7A中说明了HCR的示例性实施方案。在第1轮杂交期间，将具有突出端引发序列的探针添加至核酸靶分子诸如mRNA或DNA。还添加了具有与引发序列的序列互补的序列的发夹核酸探针。引发序列的存在引起发夹核酸探针的解折叠，并且导致产生自我组装延伸的HCR聚合物的链式反应。因为每种发夹核酸探针都带有信号，所以自我组装延伸的HCR聚合物导致信号的放大和对靶位点的更佳的检测。

图7B说明了嵌入有可裂解接头的示例性读取探针。在此，可裂解接头是二硫键。在可裂解接头的一端，如本文公开的读取探针包含允许其与特定核酸靶结合的结合序列。在一些实施方案中，核酸靶是mRNA或DNA。在一些实施方案中，核酸靶在完整的细胞内或为细胞提取物的一部分。在一些实施方案中，核酸靶在直接结合mRNA中的靶位点的一级结合探针内。在一些实施方案中，核酸靶在与一级结合探针结合的二级结合探针内，所述一级结合探针直接结合mRNA中的靶位点。在一些实施方案中，核酸靶在三级或四级结合探针内。本领域技术人员可以将该原理应用于任何水平的结合和相互作用。

在可裂解接头的另一端，如本文公开的读取探针还包含HCR引发序列。当被暴露于具有部分或完全互补序列的发夹核酸时，引发序列可以触发允许由多于一种延伸探针形成信号基序的链式反应。每种延伸探针包含信号部分。多于一种延伸探针的聚集增强了信号检测。

在图7C中说明了用于在顺序杂交过程期间用多于一种延伸探针形成信号基序的示例性方案。在第一轮杂交期间，具有嵌入的可裂解接头的核酸检测探针与核酸靶序列中的第一靶位点结合。在一些实施方案中，在核酸检测探针与第一靶序列初始结合之后添加延伸探针。在一些实施方案中，在聚集的聚合物被添加至反应混合物并且与核酸检测探针中的引发序列结合之前，延伸探针形成聚集体。

在一些实施方案中，延伸探针是标准的发夹探针，每个探针包含与读取探针中的引发序列部分或完全互补的序列。在这些实施方案中，延伸探针彼此非常相似或相同。所得的可延伸的信号基序的尺寸可以通过所添加的延伸探针的浓度或绝对量来控制。

在一些实施方案中，可以使用包含不同类型核酸序列的延伸探针来实现受控的信号扩增。例如，如果使用延伸探针的五个群体：{EP₁、EP₂、EP₃、EP₄和EP₅}，则信号可以被放大五倍。延伸探针的第一群体包含与引发序列的全部或一部分结合的结合序列。延伸探针的第二群体包含与延伸序列的第一群体中的区域结合的结合序列。延伸探针的第三群体包含与延伸序列的第二群体中的区域结合的结合序列。延伸探针的第四群体包含与延伸序列的第三群体中的区域结合的结合序列。延伸探针的第五群体包含与延伸序列的第四群体中的区域结合的结合序列。在这样的线性扩增的实施方案中，所得的可延伸的信号基序的尺寸可以通过所提供的延伸探针的群体的数目来控制。

在一些实施方案中，延伸探针可以包含用于结合随后的延伸探针的多于一个结合位点。例如，除了与引发序列结合之外，EP₁可以包含EP₂的两个或更多个结合位点，从而允许信号的进一步扩大。这种形式的扩大可以发生于任何水平。例如，在以上的实例中，用于随后的或下游的延伸探针的多于一个结合位点可以以EP₁、EP₂、EP₃或EP₄中的任一种或组合来实施。例如，来自EP₂、EP₃或EP₄的延伸探针可以都与EP₁中的靶位点结合，而EP₁与引发序列结合。

在一些实施方案中，扩大发生于多个水平。通常，当存在m个延伸探针群体时，用于随后的或下游的延伸探针的多于一个结合位点可以以EP₁、EP₂、……、或EP_m-1中的任一种或组合来实施。另外，当存在多于一个结合位点时，它们可以串联连接或以非线性方式布置(例如，以支链或环状布置)。取决于结合位点的数目和构型，所得的可延伸的信号基序可以是棒状(stick)、球状(ball)、网状(net)或呈任何其他适用的形式。

本领域技术人员将理解，可以添加延伸探针的任何合适数目的群体，以实现最佳信噪比，以获得最佳成像效果。例如，延伸探针可以包括5个或更少、7个或更少、10个或更少、15个或更少、20个或更少、25个或更少、30个或更少、40个或更少、50个或更少的群体。

在一些实施方案中，将延伸探针混合在一起，然后与具有引发序列的读取探针混合。在一些实施方案中，将延伸探针顺序添加至具有引发序列的读取探针，其中读取探针已经与其核酸靶结合。

如在图7C中示出的，在成像分析之后，可以应用裂解剂来切开结合序列与读取探针中引发物序列之间的接头。然后，扩增的聚合物可以被裂解掉并被洗掉。

在第二轮再杂交期间，应用新的核酸检测探针。新的核酸检测探针包含与核酸靶序列中的第二且不同的靶位点结合的不同的结合序列。新的核酸检测探针还包含可裂解接头和引发序列。引发序列可以与来自前一组核酸检测探针的引发序列相同或不同。

如上文描述的，使用新的延伸探针来形成扩增的聚合物以增强信号检测。在成像分析之后，新的扩增的聚合物的组可以被裂解掉并被洗掉。通过使用具有不同类型视觉信号的延伸探针，可以为核酸靶建立条形码。取决于核酸靶中靶位点的可用性，可以进行多轮杂交以产生更复杂的条形码。例如，可以进行3轮杂交、4轮杂交、5轮杂交、7轮或更少轮杂交、10轮或更少轮杂交、12轮或更少轮杂交、15轮或更少轮杂交、20或更少轮杂交、30轮或更少轮杂交、40轮或更少轮杂交或50轮或更少轮杂交。

本文公开的方法适用于许多种样品。例如，HCR-seqFISH在脑切片中有效并且SPIM可以粗略地检测CLARITY脑切片中的单一mRNA。在一些实施方案中，所提供的技术可用于对神经退行性疾病的小鼠模型或人类大脑中的靶进行谱分析。在本文公开的方法和组合物之前，没有其他技术能够达到相同质量和数量的数据。

实施例

前述内容已经描述了本发明的某些非限制性实施方案。相应地，应理解本文描述的本发明的实施方案仅仅例证了本发明的原理的应用。本文详细描述的例证性实施方案并非意图限制权利要求的范围。另外的实例被描述于美国专利公布第2016-0369329号中。

实施例1

通过顺序杂交和编条形码对核酸进行原位谱分析

如在本文的非限制性实例中所描述的，通过所提供的方法，通过连续数轮的接触、成像和去除步骤对细胞中的核酸例如mRNA进行谱分析(图2(a)和图3)。由于在细胞中转录物被固定，在多轮杂交期间对应的荧光斑点保持在原位，并且可以被对齐以读取荧光团序列。此顺序条形码被设计以独特地鉴定mRNA。

在每轮杂交期间，每种转录物被一组可检测地标记的寡核苷酸(在该情况中，被单一类型的荧光团标记的FISH探针)靶向。对样品成像并且随后用DNA酶I对其处理以去除FISH探针。在随后的轮次中，使mRNA与具有相同组的寡核苷酸序列但现在被不同的染料标记的FISH探针杂交。可用的条形码的数目规模为F^N，其中F是荧光团的数目且N是杂交轮数。例如，用4种染料，8轮杂交可以覆盖几乎整个转录组(4⁸＝65,536)。

在一些实施方案中，为了区分不同的mRNA种类，利用顺序的杂交轮次用可检测地标记的寡核苷酸诸如FISH探针对mRNA编条形码。在一轮杂交期间，每种转录物被用单一类型的荧光团标记的一组多于一种探针例如24种FISH探针靶向。对样品成像并且通过酶促消化去除FISH探针。然后在随后的轮次中使mRNA与相同的FISH探针(但在一些情况下，现在被不同的染料标记)杂交。由于转录物被固定在细胞中，所以在多轮杂交期间，对应于单一mRNA的荧光点保持在原位，并且可以被对齐以读取颜色序列。因此每种mRNA种类被分配独特的条形码。给定的细胞中的每种转录物的数目可以通过计数对应的条形码的数目来确定。在图1、图2和图3中示出了示例性方法，并且基于本文公开的方法的实践实例被提供于例如美国专利公布第2016-0369329号中。

实施例2

寡核苷酸制备

通过PCR扩增一组序列(图4)。将产物分离，例如，在-20℃使用5体积的沉淀缓冲液(30:1EtOH:1M NaOAc)沉淀至少10分钟。将沉淀混合物离心10分钟。弃去上清液并且在切口酶缓冲液中用适当单位的酶重构寡核苷酸团块，所述适当单位的酶基于在1小时中约10单位的酶消化约1μg的DNA。孵育时间结束后，将样品再次沉淀并在2X加载缓冲液(96％甲酰胺/20mM EDTA)和水中重构以制备最终的加载缓冲液(48％甲酰胺/10mMEDTA)。将样品加热到95℃以使DNA完全变性。然后将变性的DNA加载到变性聚丙烯酰胺凝胶(8M尿素10-12％丙烯酰胺)中。使凝胶在250V运行1小时，或按期望优化。电泳后使用1x sybr gold对凝胶染色15分钟，并且然后可视化。将合适的条带切出、破碎、并且在DI水中孵育2小时。孵育后，将样品再次沉淀，并且然后使用真空柱纯化。用30μL无RNA酶水洗脱柱以得到最终产物，如在图26中示出的。

在一些实施方案中，本文例示的方法可以使用限制性位点而不是切口核酸内切酶位点。与图25中的扩增步骤类似，通过PCR扩增5'-末端侧翼为BamHI位点且3'-末端侧翼为AatII位点的一组序列。在-20℃用5体积的沉淀缓冲液(30:1EtOH:1M NaOAc)沉淀至少10分钟并且分离，随后用BamHI和AatII消化。将产物再次纯化并且进行exo III消化。去除消化的核酸提供产物寡核苷酸。

DNA探针-二硫化物-染料缀合物的合成

用于合成通过二硫键连接的读取探针-染料缀合物的示例性方案。巯基修饰的DNA探针是以其氧化形式从Integrated DNA Technologies订购的。将10纳摩尔巯基修饰的DNA探针在37℃用10mM TCEP处理30分钟。在还原步骤和凝胶柱纯化后，将DNA探针与50当量的3-(2-吡啶基二硫代)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)接头在含有10mM EDTA的1x PBS溶液中混合。允许混合物在室温反应至少2小时。反应后，立即将混合物进行旋转柱纯化，并且重悬于60μL的含有100μg尸胺染料的1x PBS中。允许反应在室温进行至少4小时，然后进行乙醇沉淀纯化和HPLC纯化。使用Nanodrop确定终产物的浓度。

在技术上，任何能连接染料和巯基修饰的DNA探针的异双功能性交联试剂都将适用于该再杂交方案。DNA探针-二硫化物-染料缀合物使用3-(2-吡啶基二硫代)丙酰肼(PDPH)接头和NHS酯染料来合成，它们与先前的缀合物同样有效。

实施例3

使用顺序杂交并在杂交轮次之间选择性地去除读取探针来检测核酸靶分子

在示例性的顺序杂交和编条形码方案中，并入了一种在不影响靶分子或不破坏靶分子与多于一种一级核酸探针之间的相互作用的情况下选择性地去除读取探针的有效方法。在本实施例中，对小鼠胚胎干细胞(mESC)进行顺序杂交和编条形码以检测Rlim mRNA。参见例如，在图8中说明的示例性过程。

用多于一种一级核酸(ssDNA)探针靶向小鼠胚胎干细胞(mESC)中的Rlim mRNA转录物，其中每种一级核酸探针具有与独特的靶mRNA分子杂交的独特序列。在第一轮杂交(hyb 1)中，使长度为15个核苷酸且标记有Cy3B的读取探针与靶mRNA和结合的一级探针接触。在读取探针杂交和成像后，在室温用50％(v/v)甲酰胺溶液洗涤载玻片5分钟。在甲酰胺洗涤后，在第二轮杂交(hyb 2)中，使第二组长度为15个核苷酸且标记有Cy3B的读取探针与固定的细胞接触。在hyb 2成像后，用甲酰胺进行洗涤。在随后的每一轮杂交和成像之后进行甲酰胺洗涤步骤直至hyb 21，在hyb 21中，在20轮杂交、成像和洗涤之后，用与hyb 1中相同的探针靶向相同的细胞。图10说明了用所描述的方案获得的一组代表性的共聚焦图像。图像被显示为具有相同对比度的z堆叠荧光图像的最大强度映射。

实施例4

使用顺序杂交并在杂交轮次之间选择性地去除读取探针来用抗体检测靶分子

使用如本文公开的顺序杂交方法，可以在样品或细胞中检测一种或更多种靶分子。使用标准方案，通过固定来制备样品，并且使样品与特异性检测样品中的靶分子的一级抗体溶液接触。所述一级抗体包含长度为17个核苷酸或更少的核酸读取序列。然后，可以使用本文公开的顺序杂交方法，例如，用可检测地标记的寡核苷酸，诸如用独特的荧光团标记的读取探针，来对带有结合的一级抗体的靶分子进行检测或编条形码。读取探针包含与所述一级抗体上的读取序列互补的序列。在杂交和成像轮次之间，用甲酰胺溶液(例如50％v/v)洗涤样品，以便在随后的杂交轮次中，在与随后的读取探针组杂交之前选择性地去除每轮杂交的读取探针。样品中的一种或更多种靶分子可以是感兴趣的蛋白。参见例如，在图9中说明的示例性过程。

在图11中说明了具体实施例。在本实施例中，将抗体的池与寡核苷酸缀合。抗体1(“AB1”)与寡核苷酸1缀合，抗体2(“AB2”)与寡核苷酸2缀合，依此类推。然后将抗体溶液应用于固定的细胞，并且使用本文公开的顺序杂交方法检测一级抗体。在杂交和成像轮次之间，用30％(v/v)甲酰胺溶液洗涤细胞，以便在随后的杂交轮中，在与随后的读取探针组杂交之前选择性地去除每轮杂交的读取探针。读取探针的长度为12个核苷酸。本实施例说明，顺序杂交不仅可以用单一抗体进行，也可以用多于一种抗体进行，以检测细胞中的靶分子。

等同物

已经描述了本发明的一些例证性实施方案，对于本领域技术人员应当明显的是上述仅仅是例证性的而非限制性的，仅以实例的方式呈现。大量的修改和其他例证性的实施方案在领域普通技术人员的理解范围内并且被构思为落在本发明的范围内。特别地，虽然本文展示的许多实例涉及方法行为或系统元素的特定组合，应理解这些行为和这些元素可以其他方式组合来完成相同的目标。仅结合一个实施方案讨论的行动、元素和特征不意图排斥其他实施方案中的类似角色。此外，对于在以下权利要求中引用的一个或更多个方法加功能限制，方法不意图被局限于在本文中公开的用于执行所述的功能的方法，而是意图在范围上覆盖现在已知或以后开发的用于执行所述的功能的任何方法。

在权利要求中使用序数术语如“第一”、“第二”、“第三”等，来修饰权利要求元件，其自身并不意味着任何优先性、优越性、或一种权利要求相对另一个的顺序或方法的行为被执行的时间顺序，而仅被用作标记以区分具有某个名字的一个权利要求元件和具有相同的名字(但使用了序数术语)的另一个元件，以区分权利要求元件。相似地，在权利要求中，使用的a)、b)等,或i)、ii)等其自身并不意味着权利要求中任何优先性、优越性或步骤的次序。相似地，在说明中使用的这些术语其自身并非具有任何所需的优先性、优越性或次序。

认为上述书面说明足以使本领域技术人员能够实践本发明。本发明不被所提供的实施例的范围限制，因为实施例意图作为本发明的一方面的单个例证并且其他功能上等同的实施方案在本发明的范围内。除了本文显示和描述的那些之外，根据前述说明本发明的多种改变对于本领域技术人员来说将变得明显，并且落入所附权利要求的范围内。本发明的优点和目的不必要被本发明的每个实施方案包括。

Claims

1.一种顺序杂交方法，所述方法包括：

a)使靶核酸分子与多于一种一级探针接触，其中每种一级探针包含：

与所述靶核酸分子中的互补靶序列结合的一级结合序列，和

与所述一级结合序列的一端连接的第一突出端序列，所述第一突出端序列包含一个或更多个结合靶，所述一个或更多个结合靶串联连接并且与所述一级结合序列连接；

b)使所述靶核酸分子与第一多于一种读取探针接触，其中每种读取探针包含信号部分，并且其中每种读取探针与所述多于一种一级探针中的一级探针的一个或更多个结合靶中的第一结合靶相互作用，

其中在来自所述第一多于一种读取探针中的每种读取探针与所述多于一种一级探针中的一级探针的一个或更多个结合靶中的第一结合靶相互作用后，所述信号部分能够发射第一可检测视觉信号；

c)在步骤b)之后对所述靶核酸分子成像，以便通过第一可检测视觉信号的存在来检测所述第一多于一种读取探针与所述多于一种一级探针之间的相互作用；

d)使所述靶核酸分子、所述多于一种一级探针和所述第一多于一种读取探针与包含变性剂的溶液接触，其中所述溶液与所述靶核酸分子、所述多于一种一级探针和所述第一多于一种读取探针的接触不破坏所述多于一种一级探针与所述靶核酸分子之间的相互作用；

e)使所述靶核酸分子与第二多于一种读取探针接触，其中每种读取探针包含信号部分，并且其中每种读取探针与一级探针的一个或更多个结合靶中的第二结合靶相互作用，

其中在来自所述第二多于一种读取探针中的每种读取探针与所述多于一种一级探针中的一级探针的一个或更多个结合靶中的第二结合靶相互作用后，所述信号部分能够发射第二可检测视觉信号；并且

f)在步骤e)之后对所述靶核酸分子成像，以便通过所述第二可检测视觉信号的存在来检测所述第二多于一种读取探针与所述多于一种一级探针之间的相互作用。

2.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括：

g)使所述靶核酸分子、所述多于一种一级桥接探针和所述第二多于一种读取探针与包含变性剂的溶液接触，其中所述溶液与所述靶核酸分子、所述多于一种一级探针和所述第二多于一种读取探针的接触不破坏所述多于一种一级探针与所述靶核酸分子之间的相互作用；

h)使所述靶核酸分子与第三多于一种读取探针接触，其中每种读取探针包含信号部分，并且其中每种读取探针与一级探针的一个或更多个结合靶中的第三结合靶相互作用，

其中在来自所述第三多于一种读取探针的每种读取探针与所述多于一种一级探针中的一级探针的一个或更多个结合靶中的第三结合靶相互作用后，所述信号部分能够发射第三可检测视觉信号；并且

i)在步骤h)之后对所述靶核酸分子成像，以便通过所述第三可检测视觉信号的存在来检测所述第三多于一种读取探针与所述多于一种一级探针之间的相互作用。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述多于一种一级探针中的每种一级探针还包含：

与所述一级结合序列的另一端连接的第二突出端序列，所述第二突出端序列包含一个或更多个另外的结合靶，所述一个或更多个另外的结合靶串联连接并且与所述一级结合序列连接。

4.如权利要求3所述的方法，所述方法还包括：

c1)在步骤c)之后使所述靶核酸分子与第四多于一种读取探针接触，其中每种读取探针包含信号部分，并且其中每种读取探针与所述多于一种一级探针中的一级探针的第二突出端序列的第一另外的结合靶相互作用；并且

c2)在步骤c1)之后对所述靶核酸分子成像，以便通过第四可检测视觉信号的存在来检测所述第四多于一种读取探针与所述多于一种一级探针中的一级探针的第二突出端序列之间的相互作用；

其中步骤c1)至c2)在所述方法的步骤d)之前进行。

5.如权利要求4所述的方法，所述方法还包括：

e1)在步骤e)之后使所述靶核酸分子与第五多于一种读取探针接触，其中每种读取探针包含信号部分，并且其中每种读取探针与所述多于一种一级探针中的一级探针的第二突出端序列的第二另外的结合靶相互作用；并且

e2)在步骤e1)之后对所述靶核酸分子成像，以便通过第五可检测视觉信号的存在来检测所述第五多于一种读取探针与所述多于一种一级探针中的一级探针的第二突出端序列之间的相互作用。

6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中任何的多于一种读取探针中的每种读取探针通过与其在所述多于一种一级探针中的一级探针中的结合靶杂交而与其结合靶相互作用。

7.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中任何的多于一种读取探针中的每种读取探针通过与桥接探针杂交而与其结合靶相互作用，所述桥接探针包含：(i)与所述多于一种一级探针中的一级探针的第一突出端序列的全部或一部分互补的序列，和(ii)所述读取探针结合的序列。

8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述靶核酸分子是RNA或DNA。

9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述靶核酸分子在完整的细胞内。

10.如权利要求9所述的方法，其中所述完整的细胞是原核细胞。

11.如权利要求9所述的方法，其中所述完整的细胞是真核细胞。

12.如权利要求9所述的方法，其中所述完整的细胞是哺乳动物细胞。

13.如权利要求9所述的方法，其中所述完整的细胞是人类细胞。

14.一种顺序杂交方法，所述方法包括：

a)使靶分子与多于一种一级抗体接触，其中每种一级抗体包含一个或更多个结合靶，所述一个或更多个结合靶串联连接并且与所述一级抗体连接；

b)使所述靶分子与第一多于一种读取探针接触，其中每种读取探针包含信号部分，并且其中每种读取探针与所述多于一种一级抗体中的一级抗体的一个或更多个结合靶中的第一结合靶相互作用，

其中在来自所述第一多于一种读取探针中的每种读取探针与所述多于一种一级抗体中的一级抗体的第一结合靶相互作用后，所述信号部分能够发射第一可检测视觉信号；

c)在步骤b)之后对所述靶分子成像，以便通过所述第一可检测视觉信号的存在来检测所述第一多于一种读取探针与所述多于一种一级抗体之间的相互作用；

d)使所述靶分子、所述多于一种一级抗体和所述第一多于一种读取探针与包含变性剂的溶液接触，其中所述溶液与所述靶分子、所述多于一种一级抗体和所述第一多于一种读取探针的接触不破坏所述多于一种一级抗体与所述靶分子之间的相互作用；

e)使所述靶分子和所述多于一种一级抗体与第二多于一种读取探针接触，其中每种读取探针包含信号部分，并且其中每种读取探针与所述多于一种一级抗体中的一级抗体的第二结合靶相互作用，

其中在每种读取探针与所述多于一种一级抗体中的一级抗体的第二结合靶相互作用后，所述信号部分能够发射第二可检测视觉信号；并且

f)在步骤e)之后对所述靶核酸分子成像，以便通过所述第二可检测视觉信号的存在来检测所述第二多于一种读取探针与所述多于一种一级抗体之间的相互作用。

15.如权利要求14所述的方法，所述方法还包括：

g)使所述靶分子、所述多于一种一级抗体和所述第二多于一种读取探针与包含变性剂的溶液接触，其中所述溶液与所述靶分子、所述多于一种一级抗体和所述第二多于一种读取探针的接触不破坏所述多于一种一级抗体与所述靶分子之间的相互作用；

h)使所述靶分子和所述多于一种一级抗体与第三多于一种读取探针接触，其中每种读取探针包含信号部分，并且其中每种读取探针与所述多于一种一级抗体中的一级抗体的第三结合靶相互作用，

其中在来自所述第三多于一种读取探针的每种读取探针与所述多于一种一级抗体中的一级抗体的第三结合靶相互作用后，所述信号部分能够发射第三可检测视觉信号；并且

i)在步骤h)之后对所述靶核酸分子成像，以便通过所述第三可检测视觉信号的存在来检测所述第三多于一种读取探针与所述多于一种一级抗体之间的相互作用。

16.如权利要求14或15所述的方法，其中任何的多于一种读取探针中的每种读取探针通过与其在所述多于一种一级抗体中的一级抗体中的结合靶杂交而与其结合靶相互作用。

17.如权利要求14或15所述的方法，其中任何多于一种读取探针中的每种读取探针通过与桥接探针杂交而与其结合靶相互作用，所述桥接探针包含：(i)与所述多于一种一级抗体中的一级抗体的一个或更多个结合靶互补的序列，和(ii)所述读取探针结合的序列。

18.如权利要求14-17中任一项所述的方法，其中所述靶分子是RNA、DNA或蛋白。

19.如权利要求14-18中任一项所述的方法，其中所述靶分子在完整的细胞内。

20.如权利要求19所述的方法，其中所述完整的细胞是原核细胞。

21.如权利要求19所述的方法，其中所述完整的细胞是真核细胞。

22.如权利要求19所述的方法，其中所述完整的细胞是哺乳动物细胞。

23.如权利要求19所述的方法，其中所述完整的细胞是人类细胞。

24.如权利要求1或权利要求14所述的方法，其中所述一个或更多个结合靶包括三个或更多个结合靶。

25.如权利要求24所述的方法，其中另外的一个或更多个结合靶包括三个或更多个读取结合靶。

26.如权利要求1-25中任一项所述的方法，其中所述变性剂是甲酰胺。

27.如权利要求1-25中任一项所述的方法，其中所述变性剂是尿素。

28.如权利要求26所述的方法，其中所述甲酰胺以60％(v/v)的浓度百分比存在于所述溶液中。

29.如权利要求26所述的方法，其中所述甲酰胺以小于60％(v/v)的浓度百分比存在于所述溶液中。

30.如权利要求26所述的方法，其中所述甲酰胺以约30％和60％(v/v)之间的浓度百分比存在于所述溶液中。

31.如权利要求30所述的方法，其中所述甲酰胺以约35％和60％(v/v)之间的浓度百分比存在。

32.如权利要求31所述的方法，其中所述甲酰胺以约40％和60％(v/v)之间的浓度百分比存在。

33.如权利要求32所述的方法，其中所述甲酰胺以约45％和60％(v/v)之间的浓度百分比存在。

34.如权利要求33所述的方法，其中所述甲酰胺以约50％和60％(v/v)之间的浓度百分比存在。

35.如权利要求34所述的方法，其中所述甲酰胺以约55％和60％(v/v)之间的浓度百分比存在。

36.如权利要求1至35中任一项所述的方法，其中所述读取探针的长度为17个核苷酸。

37.如权利要求1至35中任一项所述的方法，其中所述读取探针的长度为少于17个核苷酸。

38.如权利要求1至35中任一项所述的方法，其中所述读取探针的长度为10个和17个核苷酸之间。

39.如权利要求38所述的方法，其中所述读取探针的长度为11个和17个核苷酸之间。

40.如权利要求39所述的方法，其中所述读取探针的长度为12个和17个核苷酸之间。

41.如权利要求40所述的方法，其中所述读取探针的长度为13个和17个核苷酸之间。

42.如权利要求41所述的方法，其中所述读取探针的长度为14个和17个核苷酸之间。

43.如权利要求42所述的方法，其中所述读取探针的长度为15个和17个核苷酸之间。

44.如权利要求1至35中任一项所述的方法，其中所述读取探针的长度为少于10个核苷酸。

45.如权利要求44所述的方法，其中所述读取探针的长度为5个和10个核苷酸之间。

46.如权利要求45所述的方法，其中所述读取探针的长度为6个和9个核苷酸之间。

47.如权利要求46所述的方法，其中所述读取探针的长度为7-8个核苷酸。