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CN111575348B - 宏基因组文库及建库方法和应用 - Google Patents

宏基因组文库及建库方法和应用 Download PDF

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CN111575348B CN202010425415.9A CN202010425415A CN111575348B CN 111575348 B CN111575348 B CN 111575348B CN 202010425415 A CN202010425415 A CN 202010425415A CN 111575348 B CN111575348 B CN 111575348B
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Abstract

本发明涉及一种宏基因组文库及建库方法和应用，属于感染病原诊断技术领域。该方法包括以下步骤：S1：提取待测样本中的基因组核酸；S2：在片段化缓冲液体系中加入按照活性单位比1:6‑8的量加入基因组核酸和转座酶复合体，进行片段化和加接头反应；所述片段化缓冲液中包括数均分子量≥20,000的拥挤分子；S3：在S2步骤得到的溶液中直接加入引物和扩增试剂，对文库进行扩增；S4：对扩增后的文库进行纯化，即得。该方法适用于复杂核酸宏基因组条件，应用于临床感染病原诊断。该方法经过严格系统的优化后得出，不仅操作简便，耗时短，还能够提高文库复杂度，富集临床样本中mcfDNA，提高了检测灵敏度，增加了宏基因组对病原检测的灵敏度。

Description

宏基因组文库及建库方法和应用
技术领域
本发明涉及感染病原诊断技术领域，特别是涉及一种宏基因组文库及建库方法和应用。
背景技术
宏基因组(mNGS)技术在发现和转化研究的诸多方面已逐渐成为一种被广泛采用的技术，在急难危重感染性疾病的病原诊断分析中有重要应用，能够对样本中的所有核酸进行无偏向测序，包括人源和微生物的核酸。
在感染条件下，宿主免疫系统会发起对病原微生物的攻击，吞噬并片段化微生物的遗传物质。对于全身性感染疾病或中枢神经系统感染，多数情况下，并不能对病灶部位直接采样。非病灶部位的病原微生物丰度低，且主要以cfDNA形式存在。并且，在上述诊断检测环境下，常规的物理超声和内切酶片段化建库方法操作步骤繁琐，时间长。
发明内容
基于此，有必要针对上述问题，提供一种宏基因组文库及建库方法和应用，该建库方法针对复杂核酸宏基因组进行建库，不仅提高了病原检测的灵敏度，还缩短建库时间，达到24小时极致交付目标。
一种宏基因组文库的建库方法，包括以下步骤：
S1：提取待测样本中的基因组核酸；
S2：在片段化缓冲液体系中按照活性单位比1:6-8的量加入基因组核酸和转座酶复合体，进行片段化和加接头反应；所述片段化缓冲液中包括数均分子量≥20,000的拥挤分子；
S3：在S2步骤得到的溶液中直接加入引物和扩增试剂，对文库进行扩增；
S4：对扩增后的文库进行纯化，即得。
临床研究表明，cfDNA存在于病灶或非病灶部位的体液中，如脑脊液、血液、肺泡灌洗液、胸腹水、尿液等。血流感染患者血液中cfDNA的含量是正常人的5倍，cfDNA含量变化与传统的全身炎症反应标志物相关，可以作为预后的生物标志物，感染患者体液中增加的cfDNA包含mcfDNA，即检测感染患者体液中的cfDNA，可获得其中病原微生物的mcfDNA，辅助感染诊断。
常规的NGS检测方法包括核酸提取、片段化、文库扩增和测序分析等四部分，在临床感染病原检测中，由于目标主要是针对微生物基因组和cfDNA片段进行测序和鉴定，即针对复杂核酸样本中的微量成分进行检测。本发明对比了常规物理超声片段法和转座酶法进行建库，按照常规方法，超声片段法具有检测灵敏度高的优势，但其具有步骤繁琐，耗时长的缺陷；而转座酶法虽然所耗费较短，但灵敏度较低。
经过反复试验和探究，发明人发现，目前商业化转座酶方法建议对长度>500bp的片段进行建库，且转座酶的用量是针对长片段(>500bp)进行建库，而在感染病原检测中，待测样本中核酸的类型为人源和微生物的完整基因组或cfDNA；其中cfDNA包括宿主的cfDNA(human cfDNA，hcfDNA)和mcfDNA。hcfDNA为宿主细胞凋亡、溶解或坏死、细胞活性释放和巨噬细胞吞噬缺氧/坏死细胞及随后释放其DNA，片段大小集中于160bp-180bp。mcfDNA为免疫细胞对病原微生物吞噬后产生，片段长度在35bp-400bp不等，主峰为60bp-90bp。虽然不同症状临床样本的cfDNA长度不同，其变化取决于细胞凋亡和坏死的频率，以及细胞外不同的代谢过程，但其cfDNA长度均较短，小于500bp。进而限制了对mcfDNA的有效检测。
本发明人还发现，转座酶建库方法中，转座酶和核酸的投入比例是决定核酸片段化范围的主要因素，在适当条件下，转座酶占比越高，获得的核酸片段越小。因此，基于转座酶的建库片段大小与转座酶和核酸投入量相关，而准确的投入量与核酸准确定量相关，核酸的准确定量与核酸的纯度相关。在此研究基础上，本发明人对建库实验参数进行了优化，使mcfDNA被有效富集。通过提高片段化缓冲液中拥挤剂的分子量，调整核酸分子与转座酶的比例，使临床样本中的mcfDNA片段被有效建库，提高临床感染病原检测的灵敏度。
可以理解的，上述基因组核酸和转座酶复合体之间的用量以活性单位计，如按照活性单位计，理论上，与1份核酸片段文库反应需要2份转座酶复合体，则加入6份转座酶复合体。所述转座酶复合体指Tn5转座酶与19-bp转座子末端序列5’-AGATGTGTATAAGAGACAG-3’的复合物。
并且，在S3的文库扩增步骤中，可将S2步骤片段缓冲液体系中包含的拥挤分子也一起进入PCR体系，可显著提高文库扩增效率，缩减PCR的扩增延伸时长，降低长片段文库扩增的效率，提高短片段文库的富集效率，最终取得mcfDNA富集的效果。
在其中一个实施例中，所述S1步骤中，所述基因组核酸纯度以吸光度比值计，达到OD260/OD280＝1.8-2.0。由于核酸的准确投入量与核酸纯度相关，为了确保有效建库，应严格控制投入核酸的纯度，本发明人发现，以Nanodrop仪器检测核酸吸光值OD，当OD260/OD280＝1.8-2.0方能符合要求。如不符合要求，则需对核酸进一步进行过柱纯化以达到后续建库要求。
在其中一个实施例中，所述S1步骤中，采用下述方法提取待测样本中的基因组核酸：
样本裂解：将待测样本加入裂解液中，混合均匀，离心后65℃-70℃孵育10min-15min，再次离心后冷却至室温；
DNA纯化：将裂解后的裂解液全部转移到吸附柱中，离心弃去废液，加入缓冲液，离心去除结合在核酸上的蛋白质，加入缓冲液离心去除吸附在吸附柱上的离子，该步骤重复1-3次；
DNA干燥：将吸附柱置于离心管中，10000-13000r/min离心3min，空甩，再将吸附柱晾干3min-5min；
DNA溶解：在吸附柱中加入40-70μL TB缓冲液，放置3-6min，10000-13000r/min离心1-3min，收集DNA液体，即得。
通过上述方法提取、纯化核酸，可提高核酸纯度，确保后续建库效果。
在其中一个实施例中，所述S2步骤中，在55±1℃的条件下孵育10±2min进行片段化和加接头；所述拥挤分子选自：体积百分浓度为4-8％(优选6％)的PEG35000和/或PVPK25。拥挤分子是一类具有不同分子量的高聚物，如聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、葡聚糖70和聚蔗糖70等，生化反应缓冲体系中加入适量的拥挤剂可提高生化反应的效率，采用PEG和PVP作为拥挤分子，具有稳定，均分分散液体，提高酶促反应效率的优点。
按照上述参数条件进行片段化和加接头，获得的文库片段主峰位于220bp处，且峰值高于其它条件。
在其中一个实施例中，所述S3步骤中，所述扩增中温度条件为：72℃保持3min，98℃保持30sec，按照预定循环温度进行17±2个循环，72℃保持5min，所述循环温度为98℃保持15sec，60℃保持30sec，72℃保持30sec；所述引物工作浓度为10±1pM；
所述S4步骤中，首先以0.8×PEG浓度缓冲液磁珠比例进行纯化，去除长片段，再以0.3×PEG浓度缓冲液磁珠比例进行纯化，去除残留接头。
上述S3步骤中，将片段化缓冲液中包含的拥挤分子也一起带入PCR体系，可显著提高文库扩增效率，PCR扩增延伸时长可由3min变为30s，降低长片段文库扩增的效率，提高短片段文库的富集效率，不仅取得mcfDNA富集的效果，同时，还在每循环节约2.5min，17个循环节约42.5min，缩短了建库时间。将引物工作浓度控制在上述范围内，获得的文库主峰位于220bp处，峰值高于其它条件，且引物残留量最低。
并在S4步骤中，通过片段分选条件和2次优化策略，获得的文库主峰位于220bp处，峰值高于其它条件，且引物残留量最低。
上述磁珠指商品化磁珠(贝克曼)，体系中包含磁珠、PEG以及盐离子等，在一定浓度的PEG和盐离子环境中，DNA可吸附到羧基修饰的高分子磁珠表面，该过程是可逆的，在低盐条件下，DNA可被洗脱。磁珠对DNA片段大小的筛选很大程度依赖于PEG，筛选体系中PEG浓度也高，对DNA片段的筛选作用越小。上述0.8×PEG缓冲液磁珠指磁珠的工作液中PEG浓度为商品化产品浓度80％的缓冲液，同理，0.3×PEG缓冲液磁珠指磁珠的工作液中PEG浓度为商品化产品浓度30％的缓冲液。
在其中一个实施例中，所述待测样本为脑脊液、血液、肺泡灌洗液、胸腹水或尿液。
本发明还公开了上述的宏基因组文库的建库方法得到的宏基因组文库。
本发明还公开了上述的宏基因组文库在非诊断用途的病原检测中的应用。
本发明还公开了一种非诊断用途的病原检测方法，包括上述的宏基因组文库的建库方法，还包括以下步骤：
S5：对构建得到的文库以Illumina平台测序；
S6：以生物信息学分析方法去除宿主序列，获得病原基因信息。
上述方法在建库之后，还包括测序和序列分析步骤，以获得待测目标的序列信息，其中测序步骤按照Illumina平台常规方法即可，分析方法也可参照常规方法。
本发明还公开了一种病原检测试剂盒，包括：
片段化及接头试剂：包括组装好接头的转座酶复合体、片段化缓冲液、片段化中止液，所述转座酶复合体的工作用量为6-8倍活性单位的基因组核酸量，所述片段化缓冲液中包括数均分子量≥20,000的拥挤分子；
扩增试剂：包括PCR扩增酶、扩增缓冲液以及扩增引物；
纯化试剂：包括0.8×PEG缓冲液磁珠，0.3×PEG的缓冲液磁珠，体积百分浓度为80％的乙醇水溶液。
该病原检测试剂盒适用于复杂核酸宏基因组条件下建库，可应用于临床感染病原诊断，具有检测灵敏度高，建库时间短的优点。
在其中一个实施例中，所述片段化缓冲液中包括体积百分浓度为4-8％(优选6％)的PEG35000和/或PVP K25，所述扩增引物的工作浓度为10±1pM。
可以理解的，上述浓度指其中所有拥挤分子浓度，如同时添加PEG35000和PVPK25，则是二者的浓度和。而扩增引物的工作浓度按照常规实验设计即可，本发明中采用10±1pmol/L(pM)，具有较佳的效果。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的宏基因组文库的建库方法，针对物理超声和内切酶片段化建库方法操作繁琐，耗时长的问题，以及商业化转座酶酶切方法要求片段>500bp等问题，提供一种宏基因组文库的建库方法，适用于复杂核酸宏基因组条件，应用于临床感染病原诊断。该方法经过严格系统的优化后得出，不仅操作简便，耗时短，还能够提高文库复杂度，富集临床样本中mcfDNA，提高了检测灵敏度，使mcfDNA的检出比例可达1‰。
据此，本发明的宏基因组文库及建库方法可应用在非诊断用途的病原检测中，能够实现无损检测，且提高了检测灵敏度，降低了假阴性的发生率。
附图说明
图1为实施例1中构建得到文库的片段分布图；
图2为实施例2中构建得到文库的片段分布图；
图3为实施例3中构建得到文库的片段分布图；
图4为对比例1中构建得到文库的片段分布图；
图5为对比例2中构建得到文库的片段分布图；
图6为对比例3中构建得到文库的片段分布图；
图7为对比例4中构建得到文库的片段分布图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
以下实施例所用原料，如非特别说明，均为市售可得。
实施例1
一种感染病原检测方法。
一、样本来源。
实验样本为自制阳性企业参考品，以2×105cell/mL的Hela细胞模拟临床样本中宿主细胞量，掺入约1×104cfu总量的无乳链球菌和隐球菌的经超声片段化为60bp-90bp大小的核酸。
二、方法。
S1：用高纯度核酸提取方法提取临床样本中的全部核酸，具体方法如下：
S1.1、样本裂解：
将待测样本加入裂解液中，混合均匀，离心后70℃孵育15min，再次离心后冷却至室温。
S1.2、DNA纯化：
将裂解后的裂解液全部转移到吸附柱中，离心弃去废液，加入缓冲液，离心去除结合在核酸上的蛋白质，加入缓冲液离心去除吸附在吸附柱上的离子，该步骤重复1-3次。
S1.3、DNA干燥：
将吸附柱置于离心管中，12000r/min离心3min，空甩，再将吸附柱晾干3min-5min。
S1.4、DNA溶解：
在吸附柱中加入70μL TB缓冲液，放置5min，12000r/min离心2min，收集DNA液体，即得。
S2：片段化、加接头：
在片段化缓冲液体系中，按活性单位比为1:6-8的量加入基因组核酸和转座酶复合体，55℃孵育10min，进行片段化和加接头，反应体系成分见下表。
表1.片段化加接头反应体系
试剂/纯度 总量
核酸 OD260/OD280＝1.98 1.2ng
转座酶复合体(诺唯赞，S111) / 0.17μg
PVP/PEG 分析纯 6％体积占比
5×Tagment Buffer(诺唯赞，S111) / 4μL
S3：加入片段化终止液，室温放置5min。
S4：以10pmol/L的扩增引物和其他扩增模块试剂，按照下述PCR扩增程序进行文库扩增，置于4℃保存。
表2.扩增反应体系
试剂/纯度 总量或浓度
Hifi taq酶 / 1U
5×PCR扩增buffer / 10μL
扩增引物 PAGE 10pmol/L
表3.文库扩增程序
S5：以0.8×和0.3×PEG缓冲液磁珠对扩增文库进行2轮纯化，第一轮去除长片段，第二轮去除残留接头。
上述磁珠选用Beckman的Agencourt AMPure XP磁珠。
S6：对纯化后的文库进行定量、上机测序和常规生信分析，输出病原体信息。
三、结果
对所建文库进行检测，浓度检测方法依据InvitrogenTM的1X dsDNA HS Assay Kit操作说明书进行，片段大小依据Bioptic Qsep1片段分析仪的操作方法进行检测。
所得文库的浓度为8.32ng/μl，图1为实施例1的文库的片段分布图，图中LM为20bp标准品，UM为1000bp标准品，从图中可以看出，文库主峰单一，无接头残留。
在后续测序中，在20M数据量条件下，无乳链球菌检出序列数2468条reads，隐球菌检出36050条reads。
实施例2
一种感染病原检测方法，与实施例1中的方法基本相同，区别仅在于：
在S4步骤中，以1.8×PEG缓冲液磁珠对扩增文库进行纯化。
结果表明，所得文库的浓度为48.25ng/μl，图2为实施例2的文库片段分布图，图中LM为20bp标准品，UM为1000bp标准品，1号曲线为按照实施例1的方法平行操作得到的文库片段分布曲线，2号曲线为本实施例中文库片段分布曲线，如图中2号曲线所示，实施例2的方法所得文库主峰偏大，片段范围过宽。
在后续测序中，在20M数据量条件下，实施例2无乳链球菌检出序列数214条reads，隐球菌检出序列数3740条reads。
实施例3
一种感染病原检测方法，与实施例1中的方法基本相同，区别仅在于：
在S1步骤中，所得核酸纯度为OD260/OD280＝1.62。
结果表明，所得文库的浓度为2.65ng/μl，图3为实施例3的文库分布图，图中LM为20bp标准品，UM为1000bp标准品，1号曲线为按照实施例1的方法平行操作得到的文库片段分布曲线，2号曲线为本实施例中文库片段分布曲线，如图中2号曲线所示，本实施例2的方法所得文库主峰偏大，片段范围过宽。
在后续测序中，在20M数据量条件下，实施例3无乳链球菌检出序列数531条reads，隐球菌检出序列数6414条reads。
对比例1
一种感染病原检测方法。
一、样本来源。
同实施例1。
二、方法。
S1：用高纯度核酸提取方法提取临床样本中的全部核酸，具体同实施例1。
S2：取浓度为2ng/μl DNA 50μl至microtube核酸打断管，于covaris100超声仪进行片段化，在Peak Power(W)：50，Duty Factor：20的设置条件下超声250s；
S3：按商业化建库试剂盒(诺唯赞，N607)进行建库操作，加入末端修复End PrepMix 4试剂，在PCR仪上进行末端修复；
表4末端修复PCR程序
温度 时间 循环
25℃ 15min /
65℃ 15min /
S4：加入接头和连接模块试剂进行加接头反应；
表5接头连接PCR程序
温度 时间 循环
20℃ 15min /
S5：使用0.6×磁珠对加接头后文库进行纯化，以去除残留接头；
S6：以纯化后产物为模板，加入扩增模块试剂，PCR扩增程序进行文库扩增；
表6PCR扩增程序
S7：使用0.9×PEG缓冲液磁珠进行文库纯化，纯化后的文库进行定量、上机测序和常规生信分析，输出病原体信息。
三、结果
按照实施例1的方法对所建文库进行检测。
所得文库的浓度为43.12ng//μl，图4为对比例1的文库片段分布图，图中LM为20bp标准品，UM为1000bp标准品，1号曲线为按照实施例1的方法平行操作得到的文库片段分布曲线，2号曲线为本实施例中文库片段分布曲线，如图中2号曲线所示，本对比例1的超声片段化方法所得文库主峰单一，片段大小约220bp。
在后续测序中，在20M数据量条件下，对比例1无乳链球菌检出序列数2119条reads，隐球菌检出序列数31006条reads。
本对比例说明，超声片段化建库方法可获得的高质量的文库，对微生物的短片段序列的建库效率较高，检出与实施例相当。超声片段化方法单样本建库时长为7.5h，对于多样本实验室，如果超声仪为单通道，每个样本片段化时间为3min，100个样本的不间断片段化时间为5h，即样本量越大，超声片段化建库周期越长，严重影响样本的交付效率。转座酶方法可对样本进行批量操作，人工操作步骤少，利于后续的自动化操作与24h极致交付目标。
对比例2
一种感染病原检测方法。
一、样本来源。
同实施例1。
二、方法。
S1：用高纯度核酸提取方法提取临床样本中的全部核酸，具体同实施例1。
S2：按商业化转座酶建库操作步骤(诺唯赞，TD501)，投入1ng核酸，TTE Mix V1转座酶复合体5μL，55℃孵育10min，进行片段化和加接头；
S3：加入片段化终止液，室温放置5min。
S4：加入PCR扩增模块试剂，PCR扩增程序(72℃3min；98℃30sec；(98℃15sec，60℃30sec，72℃3min)17cycles；72℃5min；4℃保存)进行文库扩增；
S5：1×磁珠对扩增文库进行纯化；
S6：对纯化后的文库进行定量、上机测序和常规生信分析，输出病原体信息。
三、结果
按照实施例1的方法对所建文库进行检测。
所得文库的浓度为30.14ng//μl，图5为对比例2的文库片段分布图，图中LM为20bp标准品，UM为1000bp标准品，1号曲线为按照实施例1的方法平行操作得到的文库片段分布曲线，2号曲线为本实施例中文库片段分布曲线，如图中2号曲线所示，本对比例2的方法所得文库主峰偏大，片段分布宽。
在后续测序中，在20M数据量条件下，对比例2无乳链球菌检出序列数308条reads，隐球菌检出序列数5256条reads。
对比例3
一种感染病原检测方法，与实施例1中的方法基本相同，区别仅在于：
在S1步骤中，按1/2的转座酶活性单位投入核酸量与组装好接头的转座酶复合体。
结果表明，所得文库的浓度为10.14ng/μl，图6为对比例3的文库片段分布图，图中LM为20bp标准品，UM为1000bp标准品，1号曲线为按照实施例1的方法平行操作得到的文库片段分布曲线，2号曲线为本实施例中文库片段分布曲线，从图中可以看出，本对比例3的方法所得文库由于指示酶切作用位置过少导致片段偏大，主峰偏大，如图中2号曲线所示。
在后续测序中，在20M数据量条件下，对比例3无乳链球菌检出序列数135条reads，隐球菌检出序列数1115条reads。
对比例4
一种感染病原检测方法，与实施例1中的方法基本相同，区别仅在于：
在S1步骤中，按1/10的转座酶活性单位投入核酸量与组装好接头的转座酶复合体。
结果表明，所得文库的浓度为17.68ng/μl，图7为对比例3的文库片段分布图，图中LM为20bp标准品，UM为1000bp标准品，从图中可以看出，本对比例4的方法所得文库由于指示酶切作用位置过多导致片段偏小，如图中2号曲线所示。
在后续测序中，在20M数据量条件下，对比例4无乳链球菌检出序列数1595条reads，隐球菌检出序列数16414条reads。
对比例4说明转座酶比例越高，所获得的文库片段越小。转座酶偏多的方法，会导致部分mcfDNA文库插入片段偏小，在后续的纯化过程中被筛选掉，降低方法学灵敏度。
实验例1
使用隐球菌阳性的脑脊液和无乳链球菌阳性的血液临床样本，对本发明的方法进行验证试验。
对上述临床样本，分别按照实施例1，对比例1和对比例2的方法进行检测。
其中，实施例1和对比例1在20M数据量下，阳性脑脊液临床样本检测到的隐球菌的reads数分别为5732和5296，对比例2仅检测到1326条隐球菌reads；阳性血液临床样本检测到的无乳链球菌的reads数分别为9951和9565，对比例2检测到4296条无乳链球菌reads。
并且，实施例1的方法建库总时长为5h/样本，对比例1建库时长为7.5h/样本，对比例2的建库时长为5.5h/样本。
结果说明，本发明的建库方法在建库时长和对mcfDNA检测上具有明显优势，对于降低时间成本，达到24小时极致交付目标以及后续的自动化建库有重要意义。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (7)

1.一种宏基因组文库的建库方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：提取待测样本中的基因组核酸；
S2：在片段化缓冲液体系中按照活性单位比为1:6-8的量加入基因组核酸和转座酶复合体，在55±1℃的条件下孵育10±2min，进行片段化和加接头反应；所述转座酶复合体指Tn5转座酶与19-bp转座子末端序列5’-AGATGTGTATAAGAGACAG-3’的复合物，所述片段化缓冲液中包括数均分子量≥20,000的拥挤分子，所述拥挤分子选自：体积百分浓度为4-8%的PEG35,000和/或PVP K25；所述基因组核酸纯度以吸光度比值计，达到OD260/OD280 = 1.8-2.0；
S3：在S2步骤得到的溶液中直接加入引物和扩增试剂，对文库进行扩增；
S4：对扩增后的文库进行纯化，首先以0.8×PEG缓冲液磁珠进行纯化，去除长片段，再以0.3×PEG缓冲液磁珠进行纯化，去除残留接头，即得。
2.根据权利要求1所述的宏基因组文库的建库方法，其特征在于，所述S1步骤中，采用下述方法提取待测样本中的基因组核酸：
样本裂解：将待测样本加入裂解液中，混合均匀，离心后65℃-70℃孵育10-15min，再次离心后冷却至室温；
DNA纯化：将裂解后的裂解液全部转移到吸附柱中，离心弃去废液，加入缓冲液，离心去除结合在核酸上的蛋白质，加入缓冲液离心去除吸附在吸附柱上的离子，该步骤重复1-3次；
DNA干燥：将吸附柱置于离心管中，10000-13000r/min离心3-5min，空甩，再将吸附柱晾干3 min -5min；
DNA溶解：在吸附柱中加入40-70 μL TB缓冲液，放置3-6min，10000-13000r/min离心1-3min，收集DNA液体，即得。
3. 根据权利要求1所述的宏基因组文库的建库方法，其特征在于，所述S3步骤中，所述扩增中温度条件为：72℃保持3min，98℃保持30sec，按照预定循环温度进行17±2个循环，72℃保持5min，所述循环温度为98℃保持15sec，60℃保持30sec，72℃保持30sec；所述引物工作浓度为10±1 pM。
4.根据权利要求1所述的宏基因组文库的建库方法，其特征在于，所述待测样本为脑脊液、血液、肺泡灌洗液、胸腹水或尿液。
5.权利要求1-4任一项所述的宏基因组文库的建库方法得到的宏基因组文库。
6.一种非疾病诊断用途的病原检测方法，其特征在于，包括权利要求1-4任一项所述的宏基因组文库的建库方法，还包括以下步骤：
S5：对构建得到的文库以Illumina平台测序；
S6：以生物信息学分析方法去除宿主序列，获得病原基因信息。
7.一种病原检测试剂盒，其特征在于，包括：
片段化及接头试剂：包括组装好接头的转座酶复合体、片段化缓冲液、片段化中止液，所述转座酶复合体的工作用量为6-8倍活性单位的基因组核酸量，所述转座酶复合体指Tn5转座酶与19-bp转座子末端序列5’-AGATGTGTATAAGAGACAG-3’的复合物，所述片段化缓冲液中包括数均分子量≥20,000的拥挤分子，所述拥挤分子选自：体积百分浓度为4-8%的PEG35,000和/或PVP K25；
扩增试剂：包括PCR扩增酶、扩增缓冲液以及扩增引物，所述扩增引物的工作浓度为10±1 pM；
纯化试剂：包括0.8×PEG缓冲液磁珠，0.3×PEG缓冲液磁珠，体积百分浓度为80%的乙醇水溶液。
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