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CN111542344A - 包含单分子量聚肌氨酸的配体-药物-缀合物 - Google Patents

包含单分子量聚肌氨酸的配体-药物-缀合物 Download PDF

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CN111542344A CN201880068932.6A CN201880068932A CN111542344A CN 111542344 A CN111542344 A CN 111542344A CN 201880068932 A CN201880068932 A CN 201880068932A CN 111542344 A CN111542344 A CN 111542344A
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Abstract

本发明涉及包含单分子量均聚物，特别是单分子量聚肌氨酸的配体‑药物‑缀合物(LDC)。

Description

包含单分子量聚肌氨酸的配体-药物-缀合物
技术领域
本发明涉及单分子量均聚物，制备该均聚物的方法及其尤其在缀合技术中的用途。
本发明还涉及包含单分子量均聚物，特别是单分子量聚肌氨酸的配体-药物-缀合物(LDC)。
背景技术
配体-药物-缀合物(LDC)由至少一个作为经由合成接头与至少一个治疗的、诊断的或标记分子(以下称为药物或D)共价连接的多肽或蛋白质的配体单元组成。该合成接头可包含一个或几个用于连接配体单元和药物单元的二价臂，其可选自间隔基、连接体和可裂解部分。所述接头还可以带有可以改进LDC性能(诸如储存稳定性、血浆稳定性或药代动力学特性)的任何单价部分。蛋白质或多肽通常是靶向单元，但可以具有内在的治疗特性。当缀合物的配体单元是抗体或抗体片段并且与细胞毒性或化学疗法药物相关时，通常使用术语抗体-药物-缀合物(ADCs)。
ADC的设计涉及众多不同因素的考虑：(i)用于在配体上缀合的合成接头的性质、数量、整体疏水性和位置；(ii)药物的性质和作用机理；(iii)负责在细胞内化后和细胞内运输期间药物释放的结构要素；(iv)单克隆抗体(mAb)和所选抗原靶标的特性。最近的方法学已经解决了可用ADC的一些缺点，诸如异构药物负载(具有不同药理特性的ADC亚种)、有限的mAb-接头或药物-接头稳定性以及次佳的药代动力学特性(Beck et al.,Nat.Rev.Drug.Discov.,2017,16(5),315-337)。
设计缀合物时要考虑的另一个重要因素是药物比率(或ADCs的药物-抗体-比率(DAR))，其是缀合至抗体的药物单元的平均数目。最新发现的结果是，ADC领域的实际趋势是生成具有低至中度DAR(通常为2-4)的均质缀合物并将其引入临床。然而，最近出现了新的接头-药物技术，其旨在克服高负荷ADC的缺点(不利的药代动力学特性和形成聚集体的趋势，从而使缀合物的制备变得复杂)。此类技术有潜力将具有改进的功效、改进的药代动力学特性、改进的治疗指标的下一代ADC引入临床并能够靶向靶标表达低、内在化缓慢或细胞内加工无效的肿瘤。为了在不牺牲药代动力学特性和制剂稳定性的情况下实现如此高的有效载荷负载，需要开发旨在掩盖细胞毒性有效载荷的表观疏水性的新型接头-药物设计方法。
在WO2014/093394A1中，报道了显示出高的药物负载和与靶抗原的强结合的蛋白质-聚合物-药物缀合物。该缀合物涉及可生物降解且生物相容性的聚[1-羟甲基乙烯羟甲基甲醛]聚合物实体，该聚合物实体允许每个mAb缀合约12-25个细胞毒性分子，并具有良好的药代动力学特性。这种方法的主要缺点是最终缀合物的极端多分散性，这是由于(i)接头的多分散性特性，(ii)每个聚合物臂的细胞毒性分子的异质数目和(iii)每个mAb接枝的聚合物臂的异质数目。
在WO2015/057699A2和WO2016/059377A1中，报道了通过在接头设计中包含正交聚乙二醇(PEG)部分来配制负载8-36种药物的ADC。众所周知，PEG由于其亲水性、生物相容性和高水合壳，可改进小药物、蛋白质、生物缀合物和纳米颗粒的亲水性、稳定性和循环时间。但是，由于某些健康个体表达的抗PEG抗体，PEG不能免除诸如非生物降解性、导致超敏性的可能的补体激活和尚不清楚的药代动力学等缺点。
需要结合以下方面的配体-药物-缀合物：(i)高载药量，同时保持良好的药代动力学和稳定性，(ii)在药物接头水平(化学单分散药物接头)和缀合物水平(均相负载的缀合物)上，缀合物完全均质，和(iii)基于可生物降解的亲水均聚物作为疏水掩蔽部分。
聚肌氨酸(聚-N-甲基甘氨酸或PSAR)可以替代PEG，并可用于设计具有改进特性的新型蛋白质缀合物。PSAR是高度亲水的、可生物降解的、非免疫原性且水溶性的聚合物，其已用于若干种用于药物或诊断的递送系统中。迄今为止，PSAR仅以多分散体形式提供，因为它是经由肌氨酸N-羧酸酐(NCA)或肌氨酸N-硫代羧酸酐(NTA)的缩合开环聚合反应获得的。尽管相对较好地定义了可接受的分散度(具有多分散性指数>1的分子量高斯分布)，但是这些多分散PSAR不能用于某些需要使用具有一致长度(唯一和特定分子量)的较短均聚物化合物并因此绝对均质的应用领域。
使用离散的单分散PSAR进行大分子修饰是开发具有绝对化学均质性的缀合物的要求。这种均质缀合物具有共享完全相同的药理特性(药代动力学和药效)的优点、更直接地表征、允许对制备过程的可重复性进行更好的控制以及满足对生物缀合物越来越严格的法规要求的要求。
发明内容
根据本发明，已经使用逐步的树脂上亚单体方法获得了具有定义的链长的离散的单分散PSAR均聚物。该方法廉价、易于大规模生产、并能赋予终产品可接受的收率和优异的单体纯度。这些单分散PSAR均聚物用于蛋白质缀合物技术，从而为配体-药物-缀合物(LDC)提供改进的载药能力、药代动力学和治疗功效。
因此，本发明提供单分子量单官能均聚物，其满足上述要求以被用于缀合物技术，特别是LDC中。
这种均聚物具有下式(I)
Figure BDA0002462220130000031
其中
R1和R2不同，并且
R1和R2中的一个是H或惰性基团，R1和R2中的另一个是官能化反应性基团，在所述惰性基团是非反应性的反应条件下，所述基团对共价结合可结合基团具有反应性，
相同或不同的Z1和Z2是任选的间隔基，并且
n为1或更大和k为2或更大。
在详细公开本发明之前，下面给出本文中使用的术语的定义。
定义
根据本发明，任何化合物(诸如反应物、产物、单体、均聚物、单元)可以是盐的形式，包括酸加成盐、碱加成盐、金属盐以及铵和烷基化铵盐。这种盐是本领域技术人员众所周知的。考虑到本发明均聚物的预期用途，它们优选为药学上可接受的盐的形式。
单分子量均聚物是指具有独特且特定的集中于平均分子量的分子量的均聚物，其与相同性质但具有尺寸和分子量分布的均聚物的混合物相反。单分子量均聚物可以用具有绝对数目的原子的一个绝对分子式定义。
与传统上通过一锅法聚合方法获得且PDI＞1的多分散均聚物相反，该单分子量均聚物也可以被称为多分散性指数(PDI)等于1的“单分散”。在本说明书中通常承认，术语“单分散”和“离散”是可互换的，两者均定义了具有独特且绝对的分子量、分子式和分子结构的均聚物，尽管术语“单分散”不准确反映产物的制备过程。
惰性基团或封端基团是指终止均聚物的一端的任何化学非反应性基团，与确定的反应条件下终止该均聚物的另一端的官能化反应性基团相比，所述基团是非反应性的。所得均聚物以某种方式被该惰性基团封端，并且在使用时，特别是在LDC技术中，不旨在被共价连接。在一个实施方案中，该基团仅在其共价结合均聚物的一端后才变为惰性。
惰性基团的非详尽列表包括：酰基，尤其是乙酰基、酰胺基、烷基，尤其是C1-20烷基、烷基醚基、烷基酯基、烷基原酸酯基、烯基、炔基、芳基、芳基酯基、叔胺基、羟基、醛基。所述惰性基团也可以选自与定义官能化反应性基团的基团的相同列表(参见下述官能化反应性基团的定义)。
官能化反应性基团是指对共价结合可结合基团具有反应性的任何化学部分，在确定的反应条件下，当与惰性基团相比时，所述基团是反应性的。特别地，它可以结合以下基团：羧酸；伯胺；仲胺；叔胺；羟基；卤素；活化酯，诸如N-羟基琥珀酰亚胺酯、全氟化酯、硝基苯酯、氮杂-苯并三唑和苯并三唑活化酯、酰脲；炔基；烯基；叠氮化物；异氰酸酯；异硫氰酸酯；醛；硫醇反应性部分，诸如马来酰亚胺、卤代马来酰亚胺、卤代乙酰基、吡啶基二硫化物；硫醇；丙烯酸酯；甲磺酸酯；甲苯磺酸酯；三氟甲磺酸酯；羟胺；氯磺酰基；硼酸-B(OR’)2衍生物，其中R’是氢或烷基。
官能化反应性基团的非详尽列表包括：羧酸；伯胺；仲胺；叔胺；羟基；卤素；活化酯，诸如N-羟基琥珀酰亚胺酯、全氟化酯、硝基苯酯、氮杂-苯并三唑和苯并三唑活化酯、酰脲；炔基；烯基；叠氮化物；异氰酸酯；异硫氰酸酯；醛；硫醇反应性部分，诸如马来酰亚胺、卤代马来酰亚胺、卤代乙酰基、吡啶基二硫化物；硫醇；丙烯酸酯；甲磺酸酯；甲苯磺酸酯；三氟甲磺酸酯；羟胺；氯磺酰基；硼酸-B(OR’)2衍生物，其中R’是氢或烷基。
应当提及的是，分别用于惰性基团和官能化反应性基团的术语“惰性”和“官能化反应性”是相互依存的。这意味着，在由式(I)、(II)和(III)中任一项定义的本发明的均聚物的确定的反应条件下，惰性基团将不反应，而官能化反应性基团将反应以共价结合反应物。因此，式(I)、(II)和(III)中任一项的均聚物中的所述惰性基团和官能化反应性基团是不同的，但是它们可以整体选自相同的基团列表。
根据本发明的官能化反应性基团或惰性基团中的术语“基团”应理解为在确定的反应条件下，除了分别能够共价结合反应物或保持惰性以外，不具有任何其他功能的基团。
例如，单独或作为烷基醚或烷基酯的一部分使用的烷基是指具有1-20个，优选1-12个，更优选1-6个，尤其是1-4个碳原子的饱和的直链或支链的烃基。
烯基和炔基是指具有2-20个，优选2-12个，更优选2-6个，尤其是2-4个碳原子的至少部分不饱和的直链或支链烃基。
例如，单独或作为芳基酯的一部分使用的芳基是指具有一个或多个含有6-14个，优选6-10个，尤其是6个环碳原子的环的芳族基团。
例如，单独或作为亚烷基二醇的一部分使用的亚烷基是指具有1-20个，优选1-12个，更优选1-6个，尤其是1-4个碳原子的二价饱和的直链或支链烃基。
亚芳基是指如上文所定义的二价芳基。
杂烷基是指由1-20或1-10个碳原子和1-10个，优选1-3个选自下组的杂原子组成的直链或支链烃链：O、N、Si和S，其中氮和硫原子可任选被氧化并且氮杂原子可任选被季铵化。杂原子O、N和S可位于杂烷基的任何内部位置或烷基与分子其余部分连接的位置。
杂亚烷基是指如上文所定义的二价杂烷基。对于杂亚烷基基团，杂原子也可以占据链末端中的一个或两个。
C3-C8碳环型基(carbocycle)是指3、4、5、6、7或8元一价、取代或未取代的、饱和或不饱和的非芳族单环或双环碳环型的环。
C3-C8碳环基(carbocyclo)是指如上文所定义的二价C3-C8碳环型基。
C3-C8杂环型基(heterocycle)是指具有3-8个碳原子(也称为环成员)和1-4个独立地选自N、O、P或S的杂原子环成员的单价取代或未取代的芳族或非芳族单环或双环体系。杂环中的一个或多个N、C或S原子可以被氧化。包括杂原子的环可以是芳族或非芳族的。除非另有说明，否则杂环在其形成稳定结构的任何杂原子或碳原子处连接至其侧基。
C3-C8杂环基(heterocyclo)是指如上文所定义的二价C3-C8杂环型基。
此外，术语烷基、烯基、炔基、芳基、亚烷基、亚芳基、杂烷基、杂亚烷基、C3-C8碳环型基、C3-C8碳环基、C3-C8杂环型基、C3-C8杂环基是指任选被一个或多个选自以下的取代基取代的基团：-X、-R’、-O-、-OR’、＝O、-SR’、-S-、-NR’2、-NR’3、＝NR’、-CX3、-CN、-OCN、-SCN、-N＝C＝O、-NCS、-NO、-NO2、＝N2、-N3、-NRC(＝O)R’、-C(＝O)R’、-C(＝O)NR’2、-SO3 -、-SO3H、-S(＝O)2R’、-OS(＝O)2OR’、-S(＝O)2NR’、-S(＝O)R’、-OP(＝O)(OR’)2、-P(＝O)(OR’)2、-PO3 -、-PO3H2、-C(＝O)R’、-C(＝O)X、-C(＝S)R’、-CO2R’、-CO2、-C(＝S)OR’、C(＝O)SR’、C(＝S)SR’、C(＝O)NR’2、C(＝S)NR’2和C(＝NR’)NR’2，其中每个X独立地是卤素：-F、-Cl、-Br或-I；并且每个R’独立地是-H、-C1C20烷基、-C6-C20芳基或-C3-C14杂环型基。
酰基基团是指-CO-烷基，其中烷基如上文所定义。
单官能均聚物包括单一类型的单体(例如用于聚肌氨酸的N-甲基甘氨酸单体)，其一端带有如上文所定义的官能化反应性基团，另一端带有H或如上文所定义的惰性基团。
用于固相肽合成的载体(SPPS)是指通常用于SPPS的载体，SPPS是众所周知的方法，其中通过连续添加Fmoc-或Boc-保护的氨基酸，经由重复的脱保护-洗涤-偶联-洗涤循环，来组装锚定至载体(不溶性聚合物)的肽。每一氨基酸添加是指以下循环：(i)Nα-保护基的裂解，(ii)洗涤步骤，(iii)使用偶联剂和非亲核碱偶联芴基甲氧羰基-(Fmoc-)或叔丁氧羰基-(Boc-)保护的氨基酸，(iv)洗涤步骤。由于生长链结合所述载体，可以通过简单的过滤去除过量的试剂和可溶性副产物。因为与用受阻的Fmoc-或Boc-保护的N-甲基化氨基酸的重复偶联反应很困难，并且通常次优，因此用该技术预期获得低粗品纯度、难纯化和低收率。所述载体的实例是Wang树脂、Rink酰胺树脂、三苯甲基和2-氯三苯甲基树脂、PAM树脂、PAL树脂、Sieber酰胺树脂、MBHA树脂、HMPB树脂、HMBA树脂，它们可商购并且肽直接或间接结合在其上。
术语“正交连接体”是指将配体连接至均聚物单元和药物单元的支链接头单元组件，以使均聚物单元相对于药物单元处于平行构型(与串联构型相反)。正交连接体是带有用于配体-药物-缀合物的组件(即配体、均聚物和药物单元)的连接位点的支架。术语“平行”用于表示配体-药物-缀合物(LDC)的两个组件的支化，但不用于表示两个组件在空间上必须非常接近或在它们之间具有相同的距离。
具有相对于药物单元平行(即支化)取向的均聚物(例如聚肌氨酸)单元的LDC的示例性图形表示如下：
Figure BDA0002462220130000081
其中(L)是正交连接体单元，w为1或更大，典型地为1-5，优选为1-4，更优选为1-3，甚至为1和2。该正交结构不应与线性结构混淆。具有相对于药物单元连续(即线性)取向的均聚物(例如聚肌氨酸)单元的LDC的示例性图形表示如下：
配体—均聚物—药物
正交连接体的非详尽列表包括：天然或非天然氨基酸，例如赖氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、硒代半胱氨酸、甘氨酸、高丙氨酸；氨基醇；氨基醛；多胺或其任何组合。根据其知识，本领域技术人员能够选择适合于预期的LDC化合物的正交连接体。有利地，L是一种或多种天然或非天然氨基酸。在一个实施方案中，L选自谷氨酸、赖氨酸和甘氨酸。
间隔基是共价结合配体-药物-缀合物的两个组件的二价线性臂，诸如：
-配体单元和正交连接体单元，
-正交连接体单元和均聚物单元，
-正交连接体和可裂解部分，
-可裂解部分和药物，或
-正交连接体和药物。
例如，间隔基为二价线性亚烷基，优选为(CH2)4。
间隔基单元的非详尽列表包括：亚烷基、杂亚烷基(即被选自Si、N、O和S的至少一个杂原子中断的亚烷基)；烷氧基；聚醚，诸如聚亚烷基二醇，典型地为聚乙二醇；一种或多种天然或非天然氨基酸，诸如甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸、N-甲基甘氨酸；C3-C8杂环基；C3-C8碳环基；亚芳基及其任何组合。当存在于可裂解部分和药物单元之间或正交连接体与药物单元之间时，间隔基可以与一个或多个药物单元连接。例如，间隔基可以连接至1-4个药物单元，优选1-2个药物单元。在一个实施方案中，可裂解部分和药物单元之间的间隔基是(4-氨基-1,3-亚苯基)二甲醇。
在一种实施方案中，间隔基单元为式(XVII)、(XVIII)、(XIX)、(XX)、(XXI)或(XXII)，
Figure BDA0002462220130000091
其中波浪键代表连接点并且R6是–C1-C10亚烷基-、–C1-C10杂亚烷基-、-C3-C8碳环基-、-O-(C1 C8烷基)-、-亚芳基-、–C1-C10亚烷基-亚芳基-、-亚芳基-C1-C10亚烷基-、–C1-C10亚烷基-(C3-C8碳环基)-、-(C3-C8碳环基)-C1-C10亚烷基-、-C3-C8杂环基-、–C1-C10亚烷基-(C3-C8杂环基)-、-(C3-C8杂环基)–C1-C10亚烷基-、–C1-C10亚烷基-C(＝O)-、–C1-C10杂亚烷基-C(＝O)-、-C3-C8碳环基-C(＝O)-、-O-(C1-C8烷基)-C(＝O)-、-亚芳基-C(＝O)-、-C1-C10亚烷基-亚芳基-C(＝O)-、-亚芳基-C1-C10亚烷基-C(＝O)-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8碳环基)-C(＝O)-、-(C3-C8碳环基)-C1-C10亚烷基-C(＝O)-、-C3-C8杂环基-C(＝O)-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8杂环基)-C(＝O)-、-(C3-C8杂环基)-C1-C10亚烷基-C(＝O)-、-C1-C10亚烷基-NH-、-C1-C10杂亚烷基-NH-、-C3-C8碳环基-NH-、-O-(C1-C8烷基)-NH-、-亚芳基-NH-、-C1-C10亚烷基-亚芳基-NH-、-亚芳基-C1-C10亚烷基-NH-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8碳环基)-NH-、-(C3-C8碳环基)-C1-C10亚烷基-NH-、-C3-C8杂环基-NH-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8杂环基)-NH-、-(C3-C8杂环基)-C1-C10亚烷基-NH-、-C1-C10亚烷基-S-、-C1-C10杂亚烷基-S-、-C3-C8碳环基-S-、-O-(C1-C8烷基)-)-S-、-亚芳基-S-、-C1-C10亚烷基-亚芳基-S-、-亚芳基-C1-C10亚烷基-S-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8碳环基)-S-、-(C3-C8碳环基)-C1-C10亚烷基-S-、-C3-C8杂环基-S-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8杂环基)-S-、-(C3-C8杂环基)-C1-C10亚烷基-S-、–C1-C10亚烷基-O-C(＝O)-、-C3-C8碳环基-O-C(＝O)-、-O-(C1-C8烷基)-O-C(＝O)-、-亚芳基-O-C(＝O)-、-C1-C10亚烷基-亚芳基-O-C(＝O)-、-亚芳基-C1-C10亚烷基-O-C(＝O)-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8碳环基)-O-C(＝O)-,-(C3-C8碳环基)-C1-C10亚烷基-O-C(＝O)-、-C3-C8杂环基-O-C(＝O)-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8杂环基)-O-C(＝O)-、-(C3-C8杂环基)-C1-C10亚烷基-O-C(＝O)-。
R6基团中的任何一个任选地被一个或多个选自以下的取代基取代：-X、-R’、-O-、-OR’、＝O、-SR’、-S-、-NR’2、-NR’3 +、＝NR’、-CX3、-CN、-OCN、-SCN、-N＝C＝O、-NCS、-NO、-NO2、＝N2、-N3、-NR’C(＝O)R’、-C(＝O)R’、-C(＝O)NR’2、-SO3 -、-SO3H、-S(＝O)2R’、-OS(＝O)2OR’、-S(＝O)2NR’、-S(＝O)R’、-OP(＝O)(OR’)2、-P(＝O)(OR’)2、-PO3 -、-PO3H2、-C(＝O)X、-C(＝S)R’、-CO2R’、-CO2、-C(＝S)OR’、C(＝O)SR’、C(＝S)SR’、C(＝O)NR’2、C(＝S)NR’2和C(＝NR’)NR’2，其中每个X独立地是卤素：-F、-Cl、-Br或-I；每个R’独立地是-H、-C1C20烷基、-C6-C20芳基或-C3-C14杂环型基。
有利地，间隔基单元为式(XVII)、(XVIII)、(XIX)、(XX)、(XXI)或(XXII),
Figure BDA0002462220130000111
其中波浪键代表连接点并且R6是–C1-C10亚烷基-、–C1-C10杂亚烷基-、–C1-C10亚烷基-C(＝O)-、–C1-C10杂亚烷基-C(＝O)-、-亚芳基-C1-C10亚烷基-C(＝O)-、-亚芳基-C1-C10亚烷基-O-C(＝O)-。
R6基团中的任何一个任选地被一个或多个＝O取代。
配体是指通常在LDC(例如抗体药物缀合物)技术中使用的任何大分子(多肽、蛋白质、肽、典型地抗体)，或者是可以使用生物缀合技术与本工作的合成接头或药物-接头共价缀合的小分子(诸如叶酸或适配子)(Greg T.Hermanson,Bioconjugate Techniques,3rdEdition,2013,Academic Press)。配体传统上是根据其靶向能力而选择的化合物。配体的非详尽列表包括：蛋白质、多肽、肽、抗体、全长抗体及其抗原结合片段、干扰素、淋巴因子、激素、生长因子、维生素、转铁蛋白或任何其他细胞结合分子或物质。用于制备缀合物的配体的主要类别是抗体。如本文所用，术语“抗体”以最广义使用，并且涵盖单克隆抗体、多克隆抗体、修饰的单克隆和多克隆抗体、单特异性抗体、多特异性抗体(诸如双特异性抗体)、抗体片段和抗体模拟物(Affibody
Figure BDA0002462220130000121
、Affilin
Figure BDA0002462220130000122
、Affimer
Figure BDA0002462220130000123
、Nanofitin
Figure BDA0002462220130000124
、CellPenetrating Alphabody
Figure BDA0002462220130000125
、Anticalin
Figure BDA0002462220130000126
、Avimer
Figure BDA0002462220130000127
、Fynomer
Figure BDA0002462220130000128
、Monobodies或nanoCLAMP
Figure BDA0002462220130000129
)。抗体的示例是曲妥珠单抗。蛋白质的示例是人血清白蛋白。
如本文所用，术语“抗体”包括完整抗体及其任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或其单链。
天然存在的“抗体”是糖蛋白，其包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链。每条重链由重链可变区(本文中缩写为VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3组成。每条轻链由轻链可变区(在本文中缩写为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL区可以进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，其间散布着更为保守的区域，称为框架区(FR)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，其从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)。
如本文所用，抗体的术语“抗原结合部分”(或简称为“抗原部分”)是指抗体的全长或一个或多个片段，其保留特异性结合抗原的能力。已经显示抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段来进行。抗体的术语“抗原结合部分”所涵盖的结合片段的实例包括Fab片段，其是由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；F(ab)2片段，其是包含两个通过铰链区的二硫化物接头连接的Fab片段的二价片段；Fd片段，其由VH和CH1结构域组成；Fv片段，其由抗体单臂的VL和VH结构域组成；dAb片段(Ward et al.,1989Nature 341:544-546)，其由VH结构域组成；和分离的互补决定区(CDR)或包含这种抗原结合部分的任何融合蛋白。
此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由不同的基因编码，但是它们可以使用重组方法通过合成接头连接，从而使它们成为单链蛋白，其中VL和VH区配对以形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；例如，参见Bird et al.,1988Science 242:423-426；和Huston et al.,1988Proc.Natl.Acad.Sci.85:5879-5883)。这种单链抗体也旨在被涵盖在抗体的术语“抗原结合部分”内。这些抗体片段是使用本领域技术人员已知的常规技术获得的，并且以与完整抗体相同的方式对片段进行效用筛选。
在特定实施方案中，LDC的配体是嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
如本文所用，术语“人抗体”旨在包括具有可变区的抗体，其中框架区和CDR区均衍生自人源序列。此外，如果抗体含有恒定区，则恒定区也衍生自此类人序列，例如人种系序列或人种系序列的突变形式，或含有衍生自人框架序列分析的共有构架序列的抗体，例如，如Knappik等(2000.J Mol Biol 296,57-86)所描述的。
人抗体可包括不由人序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。但是，如本文所用，术语“人抗体”不旨在包括其中衍生自另一哺乳动物物种(诸如小鼠)的种系的CDR序列已接枝到人框架序列上的抗体。
术语“人单克隆抗体”是指表现出单一结合特异性的抗体，其具有可变区，其中框架区和CDR区均衍生自人序列。
如本文所用，“同种型”是指由重链恒定区基因提供的抗体类别(例如，IgM、IgE、IgG，诸如IgG1或IgG4)。
短语“识别抗原的抗体”和“对抗原特异的抗体”在本文中可与术语“特异性结合抗原的抗体”互换使用。
可裂解基团(X)，也称为“可释放的组装单元”，将药物单元连接至配体-药物-缀合物的其余部分。可裂解基团的功能是在配体靶向的位点释放药物。因此，该单元能够形成用于药物单元释放的可裂解键，例如在酶处理或二硫化物消除机理时。用于酶处理的识别位点通常是二肽裂解位点(例如Val-Cit、Val-Ala或Phe-Lys)或糖裂解位点(例如葡糖苷酸裂解位点)。例如，可裂解基团是葡糖苷酸基团。该技术对于本领域技术人员是众所周知的，并且根据其知识，他能够选择适合于LDC(例如ADC)化合物的药物的可裂解基团。例如，可裂解基团包括可通过二硫化物交换裂解的含二硫化物的接头、在酸性pH下可裂解的酸不稳定接头以及可通过水解酶(例如，肽酶、酯酶和葡糖醛酸糖苷酶)裂解的接头。可裂解基团可以选自以下
-一种或多种天然或非天然氨基酸，例如包含2-12个氨基酸的可裂解肽，
-经由氧糖苷键连接到自消除基团的糖部分，
-二硫化物接头，和
-在溶酶体中可水解的酸不稳定接头。
有利地，可裂解基团可以选自以下
-一种或多种天然或非天然氨基酸，例如包含2-12个氨基酸的可裂解肽，和
-经由氧糖苷键与自消除基团连接的糖部分，
当使用糖部分时，自消除基团被认为是可裂解基团的一部分。“自消除基团”是能够将三个间隔的化学部分，即糖部分(经由糖苷键)、药物D(经由间隔基Z直接或间接)以及正交连接体L(经由间隔基Z直接或间接)共价连接在一起的三官能化学部分。糖苷键可以是可在靶位点裂解的糖苷键，以引发导致药物释放的自消除反应序列。
当使用二硫化物接头时，裂解发生在二硫化物的两个硫原子之间。各种二硫化物接头在本领域中是已知的并且可以适用于本公开，例如包括可以使用SATA(N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰硫基乙酸酯)、SPDP(N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯)、SPDB(N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯)、SMPT(N-琥珀酰亚胺基-氧羰基)-α-甲基-α-(2-吡啶基-二硫代)甲苯)和SPP(N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基-二硫代)戊酸酯)形成的那些。例如，参见美国专利号4,880,935。
在一些实施方案中，可裂解单元是pH敏感的，并且例如，将包含在可以使用的溶酶体中可水解的酸不稳定接头(例如，腙、半卡巴腙、缩氨硫脲、顺乌头酰胺、原酸酯、乙缩醛或缩酮基团)。(例如，参见美国专利号5,122,368；5,824,805；5,622,929)。这种接头在中性pH条件下(诸如血液中)相对稳定，但是在pH 5.5或5.0(溶酶体的近似pH)下不稳定。
配体药物缀合物(LDC)是指结合如上文所定义的配体和药物并且涉及如上所述的任何手段的任何缀合物，并将在说明书的实施例中予以说明。当配体是抗体时，可以指抗体药物缀合物(ADC)，其是本公开的优选实施方案。
可结合基团是指可以与官能化反应性基团反应以形成共价键的基团。因此，可结合的基团包含反应性基团，其在确定的反应条件下与官能化反应性基团反应。特别地，可结合基团可包含以下基团之一：羧酸；伯胺；仲胺；叔胺；羟基；卤素；活化酯，诸如N-羟基琥珀酰亚胺酯、全氟化酯、硝基苯酯、氮杂-苯并三唑和苯并三唑活化酯、酰脲；炔基；烯基；叠氮化物；异氰酸酯；异硫氰酸酯；醛；硫醇反应性部分，诸如马来酰亚胺、卤代马来酰亚胺、卤代乙酰基、吡啶基二硫化物；硫醇；丙烯酸酯；甲磺酸酯；甲苯磺酸酯；三氟甲磺酸酯；羟胺；氯磺酰基；硼酸-B(OR’)2衍生物，其中R’是氢或烷基。
药物是指任何类型的药物或化合物，例如细胞毒性化合物、细胞生长抑制化合物、免疫抑制化合物、抗炎化合物或抗感染化合物。在细胞毒性化合物中，可以列举卡利奇霉素；尤西拉美辛(uncialamycin)；奥利斯他汀(诸如称为MMAE的单甲基奥利斯他汀E)；微管溶素类似物；美登素；隐藻素；苯二氮卓二聚体(包括称为PBD's的吡咯[2,1-c][1,4]苯二氮卓类)；吲哚并苯二氮卓假二聚体(IGN)；杜卡霉素；蒽环素(诸如阿霉素或PNU159682)；喜树碱类似物(诸如称为SN38的7-乙基-10-羟基喜树碱或依喜替康)；Bcl2和Bcl-xl抑制剂；Thailanstatins；毒伞肽类(包括α-毒伞肽)；纺锤体驱动蛋白(KSP)抑制剂；长春瑞滨；细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制剂；博来霉素；放线菌素或放射性核素及它们的络合剂(诸如DOTA/177Lu)。在抗炎药中，可以列举皮质类固醇，诸如地塞米松或氟替卡松。在抗感染药中，可以列举抗生素，诸如利福平或万古霉素。
现在更详细地公开本发明。尽管参考单分子量的聚肌氨酸均聚物对其进行了更具体的描述，但是应当认识到，其范围扩展至上述式(I)所涵盖的任何单分子量。而且，本发明的益处在LDC技术中得到了明确证明。当然，其优点不限于这种技术，并且在需要单分子量、生物相容性、可生物降解的均聚物的任何领域中，其可以表现出相似或更好的性能。
因此，本发明更特别地涉及肌氨酸的单分子量均聚物，其具有式(II)
Figure BDA0002462220130000161
其中
R1和R2不同，并且
R1和R2中的一个是H或惰性基团，R1和R2中的另一个是官能化反应性基团，在所述惰性基团是非反应性的反应条件下，所述基团对共价结合可结合基团具有反应性，
相同或不同的Z1和Z2是任选的间隔基，并且
k为2或更大。
式(I)的均聚物，特别是式(II)的均聚物的进一步特征在下文给出，其单独或以任何组合使用。
k为至少为2的整数，其优选至多为100，更优选至多为50，特别是2-30，并且更特别是2-24、6-24或12-24。
在式(I)或式(II)中，所述官能化反应性基团R1或R2可以选自以下基团：
-羧酸基团，
-氨基NRR”，其中R和R”各自独立地选自H、任选地被选自O、N和S的至少一个杂原子中断的(C1-C6)烷基，
-羟基，
-卤素原子，
-肼(-NH2-NH2)基，
-硝基，
-羟胺基，
-叠氮基，
-(C2-C6)炔基，
-(C2-C6)烯基，
-硫醇基，
-活化酯基，诸如N-羟基琥珀酰亚胺酯、全氟酯、硝基苯酯、氮杂-苯并三唑和苯并三唑活化酯、酰脲，
-硼酸–B(OR””)2基团，其中R””是氢原子或C1-C6烷基，
-硫醇反应性基团，诸如马来酰亚胺、卤代马来酰亚胺、卤代乙酰基、吡啶基二硫化物，
-甲磺酸酯基，
-甲苯磺酸酯基，
-三氟甲磺酸酯基，
-醛基，
-异氰酸酯基或异硫氰酸酯基，
-氯磺酰基，
-丙烯酸酯基。
如上所述，间隔基Z是任选的，Z1和Z2可以都存在，Z1和Z2中可以仅存在一个，Z1和Z2也可以都不存在。在后一种情况下，并且当本发明的均聚物是肌氨酸的均聚物时，其具有式(III)
Figure BDA0002462220130000171
其中R1、R2和k如上文所定义。
在式(I)、式(II)或式(III)中，R1可以是H或惰性基团，并且R2可以是官能化反应性基团，或者R1可以是官能化反应性基团，并且R2可以是H或惰性基团。
根据一个优选实施方案，官能化反应性基团R1或R2是仲胺，并且惰性基团R1或R2是在最终的LDC结构上保持未反应和未结合的羧酸。
在一个优选实施方案中，在式(I)、式(II)或式(III)中，R1选自OH和NH2，并且
当R1是OH时，R2是COCH3并且
当R1为NH2时，R2是CO—G—COOH，G是CH2CH2、CH2CH2CH2、CH2CH2CH2CH2、CH2OCH2、CH2SCH2、CH2CH(CH3)CH2、CH2C(CH3)2CH2或CH2N(CH3)CH2。
本发明还涉及用于制备式(I)、式(II)或式(III)的单分子量均聚物的方法。通常，每种N-甲基甘氨酸单体由两种亚单体(即卤代乙酸和甲胺)组装在固相载体上。每一单体添加是指以下循环：(i)用卤代乙酸和碳二亚胺或其他合适的羧酸酯活化方法酰化树脂结合的仲胺，(ii)洗涤步骤，(iii)用甲胺亲核取代树脂结合的卤素，(iv)洗涤步骤。
根据本发明的方法，包括以下步骤：
a)使式(IV)化合物与式(V)的酸反应，以获得式(VI)化合物
Figure BDA0002462220130000181
其中R3是肽合成固相载体，并且m为1或更大且小于k，
Figure BDA0002462220130000182
其中Hal是卤素，
Figure BDA0002462220130000191
其中R3、m和Hal如上文所定义，
b)使所述式(VI)化合物与甲胺反应
以获得式(VII)化合物
Figure BDA0002462220130000192
其中R3和m如上文所定义，
c)重复步骤a)和b)，直到获得式(VIII)化合物
Figure BDA0002462220130000193
其中R3和m如上文所定义，
d)使所述化合物(VIII)反应，以获得式(IX)化合物，
Figure BDA0002462220130000194
其中R2为惰性基团，R3如上文所定义且k如上文所定义，
e)裂解反应，以获得如上文所定义的式(III)的单分子量均聚物。
根据该方法的一个实施方案，其包括在步骤a)中，使其中R3为肽合成固相载体且m为3的式(IV)化合物反应，所述化合物通过Fmoc-固相肽合成方法获得。它们是本领域技术人员众所周知的，并且根据其知识，他能够选择任何合适的偶联剂，例如N-[(二甲氨基)-1H-1,2,3-三唑-[4,5-b]吡啶-1-基亚甲基]-N-甲基甲铵六氟磷酸酯N-氧化物(HATU)(N-[(Dimethylamino)-1H-1,2,3-triazolo-[4,5-b]pyridin-1-ylmethylene]-N-methylmethanaminium hexafluorophosphate N-oxide)。
在本发明方法的替代实施方案中，制备单分子量均聚物包括以下步骤：
a)使式(X)化合物与式(V)的酸反应，以获得式(XI)化合物
Figure BDA0002462220130000201
其中R3为肽合成固相，并且m为1或更大且小于k，
Figure BDA0002462220130000202
其中Hal是卤素，
Figure BDA0002462220130000203
其中R3、m和Hal如上文所定义，
b)使所述式(XI)化合物与甲胺反应，以获得式(XII)化合物
Figure BDA0002462220130000204
其中R3和m如上文所定义，
c)重复步骤a)和b)，直到获得式(XIII)化合物，
Figure BDA0002462220130000205
其中R3和k如上文所定义，
d)裂解反应，以获得式(XIV)化合物
Figure BDA0002462220130000206
其中k如上文所定义，
e)使所述化合物(XIV)与琥珀酸酐、戊二酸酐、己二酸酐、二乙醇酸酐、硫代二乙醇酸酐、3-甲基戊二酸酐、3-3-二甲基戊二酸酐或4-甲基吗啉-2,6-二酮中的至少一种反应，以获得如上文所定义的式(III)的单分子量均聚物。
如前文所述，本发明的均聚物可用于LDC技术，而不限于该技术。
因此，本发明还涉及具有下式(XV)的配体-药物-缀合物(LDC)
Figure BDA0002462220130000211
其中，
L是允许(HPSMW)相对于(X-D)处于正交方向的正交连接体，
HPSMW是由如上文所述的本发明的单分子量均聚物共价结合到所述正交连接体L产生的，
D是药物，特别是细胞毒性药物，诸如单甲基奥利斯他汀E(MMAE)或SN38，
X是用于释放D的任选的可裂解部分，
Z是任选的间隔基，并且
a为1或更大，b为1或更大和m为1或更大。
与不包含平行接枝的单分子量均聚物的配体-药物-缀合物相比，当相对于药物单元以平行(即正交)取向接枝时，单分子量均聚物，特别是单分子量聚肌氨酸提供了缀合物的有效的疏水性掩盖性能、降低的表观疏水性、更好的药代动力学性能以及改进的体内活性。
在一个替代实施方案中，D选自下组：生物活性分子、治疗性分子(诸如抗癌药)、显像剂和荧光团。
根据本发明的替代实施方案：
a为至少1，优选至多6，更优选至多3，具体为2，并且更具体为1的整数，和/或
b为至少1，优选至多6，更优选至多3，具体为2，并且更具体为1的整数，和/或
m为至少1，优选至多30，更优选至多15，具体为8，并且更具体为4的整数。
有利地，单分子量均聚物是聚肌氨酸。
在一个实施方案中，在L和配体之间，和/或在L和HPSMW之间，和/或在L和X之间，和/或在X和D之间，存在间隔基Z。
典型地，正交连接体通过一个或多个接头单元组件连接可释放的组装药物单元(XD)或药物单元(D)，以此方式使(XD)或(D)单元相对于均聚物单元处于平行构型(与串联构型相反)。
本发明还涉及具有式(XVI)的中间体化合物
Figure BDA0002462220130000221
其中
L是正交连接体，
HPSMW是由本发明的单分子量均聚物共价结合到所述正交连接体L产生的，
D是细胞毒性药物，
X是用于释放D的任选的可裂解部分，
Z是任选的间隔基，所述间隔基能够结合配体，并且
a为1或更大和b为0、1或更大。
本公开还涉及具有式(XXIII)的化合物
Figure BDA0002462220130000222
其中，如上文所定义的，
R6是–C1-C10亚烷基-、–C1-C10杂亚烷基-、-C3-C8碳环基-、-O-(C1C8烷基)-、-亚芳基-、–C1-C10亚烷基-亚芳基-、-亚芳基-C1-C10亚烷基-、–C1-C10亚烷基-(C3-C8碳环基)-、-(C3-C8碳环基)-C1-C10亚烷基-、-C3-C8杂环基-、–C1-C10亚烷基-(C3-C8杂环基)-、-(C3-C8杂环基)–C1-C10亚烷基-、–C1-C10亚烷基-C(＝O)-、–C1-C10杂亚烷基-C(＝O)-、-C3-C8碳环基-C(＝O)-、-O-(C1-C8烷基)-C(＝O)-、-亚芳基-C(＝O)-、-C1-C10亚烷基-亚芳基-C(＝O)-、-亚芳基-C1-C10亚烷基-C(＝O)-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8碳环基)-C(＝O)-、-(C3-C8碳环基)-C1-C10亚烷基-C(＝O)-、-C3-C8杂环基-C(＝O)-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8杂环基)-C(＝O)-、-(C3-C8杂环基)-C1-C10亚烷基-C(＝O)-、-C1-C10亚烷基-NH-、-C1-C10杂亚烷基-NH-、-C3-C8碳环基-NH-、-O-(C1-C8烷基)-NH-、-亚芳基-NH-、-C1-C10亚烷基-亚芳基-NH-、-亚芳基-C1-C10亚烷基-NH-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8碳环基)-NH-、-(C3-C8碳环基)-C1-C10亚烷基-NH-、-C3-C8杂环基-NH-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8杂环基)-NH-、-(C3-C8杂环基)-C1-C10亚烷基-NH-、-C1-C10亚烷基-S-、-C1-C10杂亚烷基-S-、-C3-C8碳环基-S-、-O-(C1-C8烷基)-)-S-、-亚芳基-S-、-C1-C10亚烷基-亚芳基-S-、-亚芳基-C1-C10亚烷基-S-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8碳环基)-S-、-(C3-C8碳环基)-C1-C10亚烷基-S-、-C3-C8杂环基-S-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8杂环基)-S-、-(C3-C8杂环基)-C1-C10亚烷基-S-、–C1-C10亚烷基-O-C(＝O)-、-C3-C8碳环基-O-C(＝O)-、-O-(C1-C8烷基)-O-C(＝O)-、-亚芳基-O-C(＝O)-、-C1-C10亚烷基-亚芳基-O-C(＝O)-、-亚芳基-C1-C10亚烷基-O-C(＝O)-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8碳环基)-O-C(＝O)-、-(C3-C8碳环基)-C1-C10亚烷基-O-C(＝O)-、-C3-C8杂环基-O-C(＝O)-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8杂环基)-O-C(＝O)-、-(C3-C8杂环基)-C1-C10亚烷基-O-C(＝O)-，
R6基团中的任何一个任选地被一个或多个选自以下的取代基取代：-X、-R’、-O-、-OR’、＝O、-SR’、-S-、-NR’2、-NR’3 +、＝NR’、-CX3、-CN、-OCN、-SCN、-N＝C＝O、-NCS、-NO、-NO2、＝N2、-N3、-NR’C(＝O)R’、-C(＝O)R’、-C(＝O)NR’2、-SO3 -、-SO3H、-S(＝O)2R’、-OS(＝O)2OR’、-S(＝O)2NR’、-S(＝O)R’、-OP(＝O)(OR’)2、-P(＝O)(OR’)2、-PO3 -、-PO3H2、-C(＝O)X、-C(＝S)R’、-CO2R’、-CO2、-C(＝S)OR’、C(＝O)SR’、C(＝S)SR’、C(＝O)NR’2、C(＝S)NR’2和C(＝NR’)NR’2，其中每个X独立地是卤素:-F、-CI、-Br、或–I；并且每个R’独立地是-H、-C1C20烷基、-C6-C20芳基、或-C3-C14杂环型基，
Z是任选的间隔基，
L是正交连接体，
X是用于释放D的任选的可裂解部分，
D是细胞毒性药物，
a为1或更大和b为0、1或更大，并且
HPSMW是由本发明的单分子量均聚物共价结合到所述正交连接体L产生的。
根据优选实施方案，HPSMW是由本发明的聚肌氨酸均聚物共价结合到所述正交连接体L产生的。在这种情况下，在式(XV)、(XVI)和(XXIII)中，HPSMW代表
Figure BDA0002462220130000241
其中，波浪键代表与L或间隔基Z的连接点(如果存在的话)，
k为2或更大，优选k为2-50，并且
R4代表封端基团。
有利地，R4代表-R’、-O-、-OR’、-SR’、-S-、-NR’2、-NR’3 +、＝NR’、-CX3、-CN、-NRC(＝O)R’、-C(＝O)R’、-C(＝O)NR’2、-SO3 -、-SO3H、-S(＝O)2R’、-OS(＝O)2OR’、-S(＝O)2NR’、-S(＝O)R’、-OP(＝O)(OR’)2、-P(＝O)(OR’)2、-PO3 -、-PO3H2、-C(＝O)X、-C(＝S)R’、-CO2R’、-CO2、-C(＝S)OR’、C(＝O)SR’、C(＝S)SR’、C(＝O)NR’2、C(＝S)NR’2或C(＝NR’)NR’2，其中每个X独立地是卤素:-F、-CI、-Br、或–I；并且每个R’独立地是-H、-C1C20烷基、-C6-C20芳基、或-C3-C14杂环型基。典型地，R4是-OR’、-NR’2或-C(＝O)R’。
在一个实施方案中，本发明还涉及具有下式(XV)的配体-药物-缀合物(LDC)
Figure BDA0002462220130000251
其中
配体是抗体，
L是允许HPSMW相对于(X-D)处于正交方向的正交连接体，其选自天然或非天然氨基酸；氨基醇；氨基醛；多胺或其任何组合，
HPSMW代表
Figure BDA0002462220130000252
其中，波浪键代表与L或间隔基Z的连接点(如果存在的话)，
k为2或更大，优选k为2-50，并且
R4代表封端基团。
D是药物，特别是细胞毒性药物，诸如单甲基奥利斯他汀E(MMAE)或SN38，
X是用于释放D的任选的可裂解部分，其选自
o一个或多个天然或非天然氨基酸，例如包含2-12个氨基酸的可裂解肽，
o经由氧糖苷键连接到自消除基团的糖部分，
o二硫化物接头，和
o在溶酶体中可水解的酸不稳定接头，
Z是任选的间隔基，其也可以存在于L和X之间，和/或X和D之间，和/或L和HPSMW之间，并且选自亚烷基、杂亚烷基；烷氧基；聚醚；一种或多种天然或非天然氨基酸；C3-C8杂环基；C3-C8碳环基；亚芳基及其任何组合，
a为1或更大，b为1或更大，和m为1或更大。
本发明还涉及包含至少一种本发明的LDC化合物和药学上可接受的载体的药物组合物。
本公开还涉及如上文所述的LDC化合物作为药物的用途。
式(XXIII)化合物可以不包含配体而原样使用，因为马来酰亚胺部分可以与蛋白质(如血清白蛋白)在体内反应，然后成为配体。因此，本公开还涉及如上文所述的式(XXIII)化合物作为药物用途。
附图简要说明
图1代表根据实施例12的疏水作用色谱图。
图2代表根据实施例13的疏水作用色谱图。
图3代表根据实施例14的小鼠中的药代动力学曲线。
图4A代表根据实施例15的随时间变化的肿瘤体积。图4B代表根据实施例15的小鼠的存活百分比。
图5代表根据实施例16的小鼠的药代动力学曲线。
图6代表根据实施例17的随时间变化的肿瘤体积。
具体实施方式
材料和一般方法
除非另有说明，所有溶剂和试剂均获自商业来源(Sigma-Aldrich，Alfa Aesar，Fluorochem，Thermo Fisher，Carbosynth)，无需进一步纯化即可使用。无水DMF和DCM购自Sigma-Aldrich。Fmoc-氨基酸、2-氯三苯甲基和Rink酰胺树脂购自Novabiochem。单甲基奥利斯他汀E(MMAE)和7-乙基-10-羟基喜树碱(SN38)购自DCChemicals。PNU159682购自KeruiBiotechnology Co.Ltd.且依喜替康甲磺酸酯购自Angene Chemical。人白蛋白(目录号A3782)购自Sigma-Aldrich。抗CD19和抗CD22抗体购自Euromedex。曲妥珠单抗(Herceptin
Figure BDA0002462220130000271
IV)购自Roche。树脂上合成是在装有20μm聚乙烯玻璃料(Sigma-Aldrich)的空SPE塑料管中进行的。使用Titramax 101水平式振荡器(Heidolph)进行搅拌。除非另有说明，所有化学反应均在室温下、在惰性氩气气氛下进行。
在Bruker Fourier 300HD光谱仪上记录液体核磁共振光谱，使用残留溶剂峰进行校准。由Claude Bernard Lyon 1大学的UMR5246CNRS研究所的Commun de Spectrométriede Masse中心(CCSM)进行质谱分析。
使用Interchim(球形HP 50μm)或Biotage
Figure BDA0002462220130000272
ZIP
Figure BDA0002462220130000273
(50μm)二氧化硅柱在TeledyneIsco CombiFlash
Figure BDA0002462220130000274
Companion
Figure BDA0002462220130000275
设备或Teledyne IscoCombiFlash
Figure BDA0002462220130000276
Rf200设备上进行正相快速色谱法。使用Biotage
Figure BDA0002462220130000277
SNAPUltra C18(25μm)柱或Interchim PuriFlash RP-AQ(30μm)柱进行反相色谱法。使用预涂的40-63μm硅胶(Macherey-Nagel)、HPLC-UV(Agilent1050)或UHPLC-UV/MS(配备了Bruker Impact IITM Q-ToF质谱仪的Thermo UltiMate 3000UHPLC系统或配备了Bruker MicrOTOF-QII质谱仪的Agilent 1260HPLC系统)通过薄层色谱法分别监测和分析了化学反应和化合物表征。
HPLC方法1：配备了DAD检测器的Agilent 1050。流动相A是水，流动相B是乙腈。色谱柱为Agilent Zorbax SB-Aq 4.6x150mm5μm(室温)。20分钟内梯度从5％B到95％B，然后，保持在95％B 5分钟。流速为1.5mL/min。在214nm处监测UV检测。
HPLC方法2：配备了DAD检测器的Agilent 1050。流动相A是水，流动相B是乙腈。色谱柱为Agilent Zorbax SB-Aq 4.6x150mm5μm(室温)。30分钟内梯度从0％B到50％B，然后，保持在50％B 5分钟。流速为1.0mL/min。在214nm处监测UV检测。
HPLC方法3：与HPLC方法1相同，但在流动相A中含有0.1％TFA。
HPLC方法4：与HPLC方法2相同，但在流动相A中含有0.1％TFA。
UHPLC方法5：Thermo UltiMate 3000UHPLC系统+Bruker Impact IITM Q-ToF质谱仪。流动相A为水+0.1％甲酸，流动相B为乙腈+0.1％甲酸。色谱柱为Agilent PLRP-S1000
Figure BDA0002462220130000282
2.1x150mm8μm(80℃)。25分钟内梯度从10％B到50％B。流速为0.4mL/min。在280nm处监测UV检测。Q-ToF质谱仪的m/z范围为500-3500(ESI+)。使用BrukerCompass
Figure BDA0002462220130000283
软件中包括的MaxEnt算法对数据进行反卷积。
HPLC方法6：配备了DAD检测器的Agilent 1050。流动相A为水+5mM甲酸铵，流动相B为乙腈。色谱柱为Agilent Poroshell 120EC-C183.0x50mm 2.7μm(室温)。10分钟内梯度从5％B到90％B，然后，保持在90％B 2分钟。流速为0.8mL/min。在214nm处监测UV检测。
下面的实施例1-4说明了本发明的单分子量聚肌氨酸的合成，该合成是本发明的一部分，涉及不同的固相合成方法。
实施例1：聚肌氨酸化合物的合成(树脂上合成方法1)
反应方案如下。
Figure BDA0002462220130000281
1.1)一般方法
树脂上合成是在装有20μm聚乙烯玻璃料(Sigma-Aldrich)的空SPE塑料管中进行的。使用Titramax 101水平式振荡器(Heidolph)进行搅拌。报道的所有合成收率均基于0.63mmol/g的初始理论树脂负载量(制造商指示的标记范围)。除非另有说明，否则所有反应均在室温下进行。
1.2)树脂负载
典型地，将500mg NovaGELTM Rink Amide珠(0.63mmol/g，Novabiochem)在5mL DMF中溶胀15分钟。通过在室温下、在5mL DMF中使10当量溴乙酸与13当量二异丙基碳二亚胺(Sigma-Aldrich)反应60分钟来添加第一单体，然后用DMF充分洗涤(5次5mL)。在水平式振荡器上，用5mL的40％(wt)甲胺水溶液(Sigma-Aldrich)将溴乙酰化树脂温育30分钟，然后，用DMF(5次5mL)和DCM(5次5mL)充分洗涤。所获得的树脂准备延伸。
1.3)肌氨酸化合物的延伸
通过交替进行溴乙酰化和胺置换步骤，进行聚肌氨酸低聚物的延伸直至获得所需的长度。通过在5mL DMF中添加10当量溴乙酸和13当量二异丙基碳二亚胺进行溴乙酰化步骤。将混合物搅拌30分钟，排干并用DMF洗涤(4次5mL)。对于胺置换步骤，添加5mL的40％(wt)甲胺水溶液(Sigma-Aldrich)，将容器摇动30分钟，排干并用DMF(4次5mL)和DCM(4次5mL)洗涤。
1.4)从树脂裂解
在搅拌下、室温下使用5mL的TFA/三异丙基硅烷(95:5)溶液进行聚肌氨酸低聚物的裂解。过滤树脂，并将获得的溶液减压蒸发，以得到油状透明材料。
在此阶段，将PSARn-N(CH3)H溶于水中进行纯化(见下文)或进行最终官能化。
1.5)最终官能化
为了获得PSARn-CH2-CH2-COOH化合物，使用2.5当量的琥珀酸酐和10当量的在无水乙腈中的DIPEA将低聚物的N-末端官能化。将混合物在室温搅拌1小时，并在减压下去除挥发物。
1.6纯化
在Interchim
Figure BDA0002462220130000302
RP-AQ(30μm)柱上纯化PSAR化合物。流动相A为水+0.05％TFA，流动相B为乙腈+0.05％TFA。梯度范围从0至30％B。
1.7)单分子量聚肌氨酸化合物
下表1列出了所得的PSAR化合物。
表1
Figure BDA0002462220130000301
实施例2：聚肌氨酸化合物的合成(树脂上合成方法2)
反应方案如下。
Figure BDA0002462220130000311
2.1)一般方法
树脂上合成是在装有20μm聚乙烯玻璃料(Sigma-Aldrich)的空SPE塑料管中进行的。使用Titramax 101水平式振荡器(Heidolph)进行搅拌。报道的所有合成收率均基于1.1mmol/g的初始树脂负载量(制造商指示的标记范围)。除非另有说明，否则所有反应均在室温下进行。
2.2)Fmoc-Sar-Sar-OH的合成
Figure BDA0002462220130000312
2.2.1)Fmoc-Sar-Sar-OtBu的合成
在圆底烧瓶中，将Fmoc-Sar-OH(2000mg/6.42mmol)和HATU(2443mg/6.42mmol)溶于28mL无水DMF中。添加DIPEA(2491mg/19.27mmol)，并将混合物在室温搅拌3分钟。然后，添加肌氨酸叔丁酯盐酸盐(1167mg/6.42mmol)，并将反应混合物在室温搅拌90分钟。在真空下去除挥发物，并将残余物用水稀释并用EtOAc萃取3次。有机相经MgSO4干燥，过滤并真空蒸发，得到固体粗品。将粗品吸收于EtOAc/DCM 80:20(v/v)中，并经由过滤去除白色不溶物。通过硅胶色谱法纯化滤液(石油醚/EtOAc，梯度从60:40至20:80)，得到白色固体状Fmoc-Sar-Sar-OtBu(2310mg/82％)。HRMSm/z(ESI+)：计算值[M+H]+＝439.2227；实验值[M+H]+＝439.2234；误差＝-1.5ppm。HPLC方法1保留时间＝13.3分钟。用100％EtOAc洗脱的TLC：Rf＝0.8。
2.2.2)叔丁酯的去除
将Fmoc-Sar-Sar-OtBu(2310mg/5.27mmol)溶于20mL DCM中，并缓慢添加8.5mLTFA。将该溶液在室温下搅拌直至通过HPLC观察到整个叔丁酯脱保护(约2小时)。然后，在真空下去除挥发物，并将残余物用乙醚研磨，得到白色固体状Fmoc-Sar-Sar-OH(1690mg/84％)。1H NMR(500MHz,DMSO-d6,100℃)δ(ppm)2.84(s,3H),2.93(s,3H),4.01(s,2H),4.05(s,2H),4.25(t,J＝4.3Hz,1H),4.34(d,J＝6.4Hz,2H),7.33(t,J＝7.4Hz,2H),7.41(t,J＝7.4Hz,2H),7.63(d,J＝7.4Hz,2H),7.85(d,J＝7.5Hz,2H).HRMS m/z(ESI+):计算值[M+H]+＝383.1601；实验值[M+H]+＝383.1602；误差＝0.0ppm。HPLC方法1保留时间＝6.2分钟。用DCM/MeOH 85:15(v/v)洗脱的TLC：Rf＝0.65。
2.3)树脂负载
典型地，将1000mg 2-氯三苯甲基氯树脂珠粒(100-200目，1％DVB，1.1mmol/g，Novabiochem)在10mL DCM中溶胀10分钟。将预先溶于10mL干燥DCM中的Fmoc-Sar-OH(1.2当量)添加到树脂上。添加DIPEA(5当量)，并将反应容器在室温下搅拌2小时。排干后，用DCM(3次)、DMF(2次)、DCM(3次)和MeOH(2次)洗涤树脂。将该树脂在高真空下干燥过夜。从树脂的增重和/或从Fmoc裂解试验(在301nm处吸光度测量)评估取代水平，并发现其是准定量的(通常为0.95-1.1mmol/g)。将树脂储存在-20℃直到进一步使用。
2.4)Fmoc-Sar-Sar-OH偶联程序
在室温下，将树脂用在DMF中的20％哌啶(每100mg树脂1mL)处理2次，15分钟。然后，将树脂用DMF(4次)和DCM(4次)洗涤。向树脂中添加Fmoc-Sar-Sar-OH(3当量)、HATU(2.85当量)和DIPEA(6当量)的DMF溶液(每100mg树脂1mL)。将反应容器搅拌2小时，并用DMF(5次)和DCM(5次)充分洗涤树脂。将该树脂在真空下干燥并在-20℃下储存直至进一步使用。
2.5)聚肌氨酸化合物的延伸
在室温下，将树脂用在DMF中的20％哌啶(每100mg树脂1mL)处理2次，15分钟。然后，用DMF(4次)和DCM(4次)洗涤树脂。
通过交替进行溴乙酰化和胺置换步骤，进行聚肌氨酸低聚物的延伸直至获得所需的长度。通过添加在DMF中的10当量的溴乙酸和13当量的二异丙基碳二亚胺(每100mg树脂2mL)进行溴乙酰化步骤。将混合物搅拌30分钟，排干并用DMF洗涤(4次)。对于胺置换步骤，添加40％(wt)甲胺水溶液(每100mg树脂1.5mL)，将容器摇动30分钟，排干并用DMF(4次)和DCM(4次)洗涤。
2.6)最终乙酰化
当获得所需的低聚物长度时，使用乙酸酐/DIPEA/DMF(1:2:3v/v)制成的封端溶液将N末端乙酰化(将容器摇动30分钟)。排干溶液，并用新鲜的封端溶液重复反应一次。用DMF(4次)和DCM(4次)洗涤树脂。
2.7)树脂裂解
在搅拌下用HFIP/DCM(20:80v/v)溶液从树脂裂解聚肌氨酸低聚物，进行30分钟。过滤树脂，并在减压下去除挥发物，以得到固体粗品。
2.8)纯化
在Interchim
Figure BDA0002462220130000331
RP-AQ(30μm)柱上纯化PSAR化合物。流动相A为水+0.1％TFA，流动相B为乙腈+0.1％TFA。
2.9)单分子量聚肌氨酸化合物
下表2列出了所得的PSAR化合物
表2
Figure BDA0002462220130000341
实施例3：带有一个或几个叠氮基官能化正交连接体的聚肌氨酸化合物的合成(树 脂上合成方法3)
反应方案如下。
Figure BDA0002462220130000342
3.1)一般方法
树脂上合成是在装有20μm聚乙烯玻璃料(Sigma-Aldrich)的空SPE塑料管中进行的。使用Titramax 101水平式振荡器(Heidolph)进行搅拌。报道的所有合成收率均基于1.1mmol/g的初始树脂负载量(制造商指示的标记范围)。除非另有说明，否则所有反应均在室温下进行。如以上实施例2所述获得起始原料。
3.2)步骤(1)
添加3摩尔的2-叠氮基乙-1-胺的DMF溶液(每100mg树脂1mL)，将容器摇动45分钟，排干并用DMF(4次)和DCM(4次)洗涤。
3.3)步骤(2)
向树脂中添加市售的2-[4-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)苯基]乙酸(5当量)、COMU(4.9当量)和DIPEA(4.9当量)的DMF溶液(每100mg树脂1mL)。将反应容器搅拌90分钟，并用DMF(3次)和DCM(3次)洗涤树脂。
3.4)步骤(3)
在搅拌下使用1％TFA的DCM(v/v)溶液从树脂裂解目标化合物，进行5分钟(重复两次)。过滤树脂，并减压去除挥发物，得到固体粗品，使用以上实施例2中所述的方案将其纯化。
3.5)步骤(4)
通过添加在DMF中的10当量的溴乙酸和13当量的二异丙基碳二亚胺(每100mg树脂2mL)进行溴乙酰化步骤。将混合物搅拌30分钟，排干并用DMF洗涤(4次)。对于胺置换步骤，添加30％(wt)的氨水溶液(每100mg树脂2mL)，将容器摇动30分钟，排干并用DMF(4次)和DCM(4次)洗涤。在这一阶段，将化合物从树脂裂解(如步骤(3)中所述)，并使用以上实施例2中所述的方案进行纯化。
3.6)步骤(5)
通过添加在DMF中的10当量的溴乙酸和13当量的二异丙基碳二亚胺(每100mg树脂2mL)进行最终的溴乙酰化步骤。将混合物搅拌30分钟，排干并用DMF(4次)和DCM(4次)洗涤。在这一阶段，将化合物从树脂裂解(如步骤(3)中所述)，并使用以上实施例2中所述的方案进行纯化。
3.7)步骤(6)
通过添加在DMF中的10当量的溴乙酸和13当量的二异丙基碳二亚胺(每100mg树脂2mL)进行溴乙酰化步骤。将混合物搅拌30分钟，排干并用DMF洗涤(4次)。对于胺置换步骤，添加40％(wt)甲胺水溶液(每100mg树脂1.5mL)，将容器摇动30分钟，排干并用DMF(4次)和DCM(4次)洗涤。
3.8)步骤(7)
通过添加在DMF中的10当量的溴乙酸和13当量的二异丙基碳二亚胺(每100mg树脂2mL)进行溴乙酰化步骤。将混合物搅拌30分钟，排干并用DMF洗涤(4次)。对于胺置换步骤，添加3摩尔2-叠氮基乙-1-胺的DMF溶液(每100mg树脂1mL)，将容器摇动45分钟，排干并用DMF(4次)和DCM(4次)洗涤。
3.9)步骤(8)
向树脂中添加市售的2-[4-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)苯基]乙酸(5当量)、COMU(4.9当量)和DIPEA(4.9当量)(每100mg树脂1mL)的DMF溶液。将反应容器搅拌90分钟，并用DMF(3次)和DCM(3次)洗涤树脂。在这一阶段，将化合物从树脂裂解(如步骤(3)中所述)，并使用以上实施例2中所述的方案进行纯化。
3.10)单分子量聚肌氨酸化合物
下表3列出了所得的PSAR化合物。
表3
Figure BDA0002462220130000361
Figure BDA0002462220130000371
Figure BDA0002462220130000381
实施例4：带有末端非正交叠氮基官能化连接体的聚肌氨酸化合物的合成(树脂上 合成方法4)
反应方案如下。
Figure BDA0002462220130000382
4.1)一般方法
树脂上合成是在装有20μm聚乙烯玻璃料(Sigma-Aldrich)的空SPE塑料管中进行的。使用Titramax 101水平式振荡器(Heidolph)进行搅拌。报道的所有合成收率均基于0.47mmol/g的初始理论树脂负载量(制造商指示的标记范围)。除非另有说明，否则所有反应均在室温下进行。
4.2)树脂负载
典型地，将500mg Ramage ChemMatrix
Figure BDA0002462220130000383
珠(0.47mmol/g，Sigma-Aldrich)在5mLDCM中溶胀15分钟。在室温下，用在DMF中的20％哌啶(每100mg树脂1mL)处理树脂2次，15分钟。然后，用DMF(4次)和DCM(4次)洗涤树脂。向该树脂中添加Fmoc-L-γ-叠氮高丙氨酸-OH(3当量)、HATU(2.9当量)和DIPEA(6当量)的DMF溶液(每100mg树脂1mL)。搅拌反应容器1.5小时，并用DMF(5次)和DCM(5次)充分洗涤树脂。使用乙酸酐/DIPEA/DMF(1:2:3v/v)制成的封端溶液将未反应的位点乙酰化(将容器摇动30分钟)。排干溶液，并用DMF(4次)和DCM(4次)洗涤树脂。在室温下，将树脂用在DMF中的20％哌啶(每100mg树脂1mL)处理2次，15分钟。然后，用DMF(4次)和DCM(4次)洗涤树脂。
4.3)Fmoc-Sar-Sar-OH偶联程序
向该树脂中添加Fmoc-Sar-Sar-OH(4当量)、HATU(3.9当量)和DIPEA(8当量)的DMF溶液(每100mg树脂1mL)。将反应容器搅拌2小时，并用DMF(4次)和DCM(4次)充分洗涤树脂。在室温下，用在DMF中的20％哌啶(每100mg树脂1mL)处理树脂2次，15分钟。然后，用DMF(4次)和DCM(4次)洗涤树脂。
4.4)聚肌氨酸化合物的延伸
通过交替进行溴乙酰化和胺置换步骤，进行聚肌氨酸低聚物的延伸直至获得所需的长度。通过添加在DMF中的10当量的溴乙酸和13当量的二异丙基碳二亚胺(每100mg树脂2mL)进行溴乙酰化步骤。将混合物搅拌30分钟，排干并用DMF洗涤(4次)。对于胺置换步骤，添加40％(wt)甲胺水溶液(每100mg树脂1.5mL)，将容器摇动30分钟，排干并用DMF(4次)和DCM(4次)洗涤。
4.5)步骤(6)
向树脂中添加市售的2-[4-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)苯基]乙酸(5当量)、COMU(4.9当量)和DIPEA(4.9当量)的DMF溶液(每100mg树脂1mL)。将反应容器搅拌90分钟，并用DMF(3次)和DCM(3次)洗涤树脂。
4.5)从树脂裂解并纯化
在室温下、搅拌下使用5mL的TFA/DCM(50:50)溶液从树脂裂解低聚物，进行30分钟。重复该过程一次，并将合并的滤液减压蒸发，得到固体粗品，如以上实施例2所述将其纯化。
4.6)单分子量聚肌氨酸化合物
下表4列出了所得的PSAR化合物。
表4
Figure BDA0002462220130000401
实施例5：带有叠氮基官能化正交连接体的聚乙二醇(PEG)化合物的合成(树脂上 合成方法5)
反应方案如下。
Figure BDA0002462220130000402
5.1)一般方法
树脂上合成是在装有20μm聚乙烯玻璃料(Sigma-Aldrich)的空SPE塑料管中进行的。使用Titramax 101水平式振荡器(Heidolph)进行搅拌。报道的所有合成收率均基于1.1mmol/g的初始树脂负载量(制造商指示的标记范围)。除非另有说明，否则所有反应均在室温下进行。
5.2)树脂负载
典型地，将200mg 2-氯三苯甲基氯树脂珠粒(100-200目，1％DVB，1.1mmol/g，Novabiochem)在4mL DCM中溶胀10分钟。将预先溶于2mL干燥DCM中的Fmoc-PEG12-CH2CH2COOH(PurePEGTM，1.2当量)添加到树脂上。添加DIPEA(3当量)，并将反应容器在室温下搅拌1小时。添加300μL的MeOH以淬灭未反应的树脂。摇动10分钟后，排干溶液，并用DMF(3次)和DCM(3次)洗涤树脂。将树脂在高真空下干燥。
5.2)步骤(1)
在室温下，将树脂用在DMF中的20％哌啶(每100mg树脂1mL)处理2次，15分钟。然后，用DMF(4次)和DCM(4次)洗涤树脂。通过添加在DMF中的10当量的溴乙酸和13当量的二异丙基碳二亚胺(每100mg树脂2mL)来进行溴乙酰化步骤。将混合物搅拌30分钟，排干并用DMF洗涤(4次)。对于胺置换步骤，添加3摩尔2-叠氮基乙-1-胺的DMF溶液(每100mg树脂1mL)，将容器摇动45分钟，排干并用DMF(4次)和DCM(4次)洗涤。
5.3)步骤(2)
如以上实施例3中所述进行2-[4-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)苯基]乙酸的偶联步骤并从树脂裂解。如以上实施例2中所述进行化合物的纯化。
5.4)单分子量PEG化合物
下表5列出了所得的PEG化合物。
表5
Figure BDA0002462220130000411
Figure BDA0002462220130000421
实施例6：基于MMAE、SN38、依喜替康和PNU159682的中间化合物的合成
6.1)化合物炔-葡糖苷酸-MMAE的合成
Figure BDA0002462220130000422
在0℃下，将110.8mg(0.087mmol)的起始原料(如Renoux et al.,Chem.Sci.,2017,8(5),3427-3433中所述合成)溶解于MeOH(10mL)中。将LiOH一水合物(36.7mg/0.87mmol)溶于水(1mL)中，并缓慢地添加到反应容器中。在0℃下搅拌70分钟后，将混合物用乙酸(68.2mg/1.14mmol)中和并在减压下浓缩。将得到的材料吸收于水/MeOH/DMF溶液(1:1:1v/v)中，并在30g Biotage
Figure BDA0002462220130000423
SNAP Ultra C18(25μm)柱上纯化。流动相A为水+0.05％TFA，流动相B为乙腈+0.05％TFA。梯度范围从10％至60％B。
获得白色固体状化合物炔-葡糖苷酸-MMAE(两种非对映异构体的混合物)(95mg/96％)。LC-HRMS m/z(ESI+):计算值[M+H]+＝1127.5758；实验值[M+H]+＝1127.5757；误差＝0.1ppm。HPLC方法3保留时间＝10.3分钟。
6.2)化合物炔-葡糖苷酸-(MMAE)2的合成
Figure BDA0002462220130000431
6.2.1)化合物炔-葡糖苷酸-(PNP)2的合成
将165mg(0.240mmol)的起始原料(按Renoux et al.,Chem.Sci.,2017,8(5),3427-3433中所述的方法合成)、64.2mg(0.419mmol)的市售4-氨基-3-(羟甲基)苯基甲醇和40.7mg(0.300mmol)的HOBt溶于无水DMF中。在50℃下搅拌3小时后，将挥发物蒸发并通过硅胶色谱法纯化残余物(石油醚/EtOAc，梯度从40∶60至0∶100)，得到黄色泡沫状中间体二醇化合物。
将无水吡啶(4摩尔当量)滴加到冷却的4-硝基苯基氯甲酸酯(4摩尔当量)的无水DCM溶液中(0℃)。将混合物在0℃下搅拌15分钟。添加先前的中间体二醇化合物(1摩尔当量)的DCM溶液，并将混合物在室温搅拌1小时。用饱和NaCl溶液淬灭反应，并用DCM萃取3次。有机相经MgSO4干燥，过滤并真空蒸发，得到固体粗品，通过硅胶色谱法将其纯化(石油醚/EtOAc，梯度从60:40至30:70)，得到白色固体状化合物炔-葡糖苷酸-(PNP)2(经过两步为52mg/21％)。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ(ppm)2.04(s,3H),2.06(s,3H),2.11(d,J＝2.0Hz,3H),2.71-2.92(m,2H),3.72(s,3H),4.11(q,J＝7.1Hz,1H),4.22(d,J＝8.6Hz,1H),5.18-5.41(m,8H),5.87(t,J＝6.5Hz,1H),7.31-7.41(m,5H),7.45-7.55(m,2H),7.56-7.71(m,2H),7.83(d,J＝8.2Hz,1H),7.89(s,1H),8.21-8.32(m,4H).HRMS m/z(ESI+):计算值[M+Na]+＝1055.1925；实验值[M+Na]+＝1055.1955；误差＝-2.9ppm.
6.2.2)化合物炔-葡糖苷酸-(MMAE)2的合成
将52mg(0.050mmol)的先前的化合物炔-葡糖苷酸-(PNP)2、13.7mg(0.100mmol)的HOBt和74.1mg(0.103mmol)的单甲基奥利斯他汀E(MMAE)溶于1mL无水DMF/吡啶的8:2(v/v)混合物中。将反应在室温下搅拌24小时，并在减压下蒸发挥发物。通过硅胶色谱法纯化粗残余物(DCM/MeOH梯度从97:3至90:10)，得到77mg(70％)的中间体化合物，其无需广泛表征即可直接用于脱保护步骤。在0℃下，将77mg(0.035mmol)的该化合物溶于MeOH(7mL)中。将LiOH一水合物(14.7mg/0.350mmol)溶解于水(0.7mL)中，并缓慢地添加到反应容器中。在0℃下搅拌60分钟后，用乙酸(27.4mg/0.457mmol)将混合物中和并在减压下浓缩。将得到的物质吸收于水/MeOH/DMF溶液(1：1：1v/v)中，并在30g Biotage
Figure BDA0002462220130000441
SNAP Ultra C18柱上纯化。流动相A为水+0.05％TFA，流动相B为乙腈+0.05％TFA。
获得白色固体状化合物炔-葡糖苷酸-(MMAE)2(两种非对映异构体的混合物)(40mg/56％)。LC-HRMS m/z(ESI+):计算值[M+2H]2+＝1025.5623；实验值[M+2H]2+＝1025.5599；误差＝2.4ppm。HPLC方法3保留时间＝13.0min。
6.3)化合物炔-val-cit-PAB-MMAE的合成
Figure BDA0002462220130000451
将58 mg(0.052 mmol)的起始原料(如Tang et al.,Org.Biomol.Chem.,2016,14(40),9501-9518中所述合成)和15 mg(0.077 mmol)的4-戊酸琥珀酰亚胺酯溶于3mL无水DCM中。添加16.7mg(0.129mmol)的DIPEA，并将该反应在室温和氩气气氛下搅拌16小时。然后，在真空下去除挥发物，将得到的物质吸收于DMF溶液中，并在30gBiotage
Figure BDA0002462220130000453
SNAP UltraC18(25μm)柱上纯化。流动相A为水+0.1％TFA，流动相B为乙腈+0.1％TFA。梯度范围从25％至70％B。
获得白色固体状化合物炔-val-cit-PAB-MMAE(21mg/34％)。ESI+[M+Na]+＝1225.7。HPLC方法3保留时间＝9.0分钟。
6.4化合物炔-SN38的合成
Figure BDA0002462220130000452
将156mg(0.308mmol)的起始原料TBDMS-SN38(按照Moon etal.,J.Med.Chem.,2008,51(21),6916-6926中所述合成)、113mg(0.924mmol)4-(二甲基氨基)吡啶和75mg(0.369mmol)的4-硝基苯基氯甲酸酯溶于8mL的无水DCM中。将溶液在室温搅拌90分钟，用5％乙酸的水溶液稀释，并用DCM萃取3次。有机相经MgSO4干燥，过滤并真空蒸发，得到黄色固体，其无需进一步纯化即可用于下一步。
将175mg(0.261mmol)的该黄色固体溶于4mL无水DMF中，并缓慢添加43mg(0.782mmol)的炔丙基胺。将反应在氩气气氛下于室温搅拌16小时。在真空下去除挥发物，通过硅胶色谱法纯化残余物(石油醚/EtOAc，梯度从40:60至0:100)，得到亮黄色固体状化合物炔-SN38(71mg/56％)。HRMS m/z(ESI+):计算值[M+H]+＝474.1660；实验值[M+H]+＝474.1664；误差＝-0.9ppm。HPLC方法3保留时间＝9.7分钟。用100％EtOAc洗脱的TLC：Rf＝0.15。
6.5化合物炔-葡糖苷酸-SN38的合成
Figure BDA0002462220130000461
在反应容器中称重50mg(0.074mmol)的起始原料TBDMS-SN38-OPNP(如先前第6.4节所述合成)和5mg(0.037mmol)的HOBt。将先前溶于1mL无水DMF/吡啶的8:2(v/v)混合物的58.5(0.223mmol)(2-((2-(2-(2-羟基乙氧基)乙基)氨基)乙基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯(tert-butyl(2-((2-(2-hydroxyethoxy)ethyl)amino)ethyl)(methyl)carbamate)(如WO2011/133039中所述合成)添加到反应容器中。将反应在室温下搅拌16小时，并在减压下蒸发挥发物。通过硅胶色谱法纯化粗残余物(DCM/MeOH梯度从98:2至90:10)，得到48mg(95％)中间体化合物(黄色固体)，其直接用于脱保护步骤。HRMS m/z(ESI+):计算值[M+H]+＝681.3130；实验值[M+H]+＝681.3113；误差＝2.5ppm。
将48mg(0.071mmol)的该化合物溶于2mL DCM，然后添加500μL TFA。将溶液在室温搅拌90分钟，并在减压下去除挥发物。通过硅胶色谱法纯化粗残余物(DCM/MeOH梯度从94:6至80:20)，得到39.8mg(96％)的黄色固体状化合物SN38-甲胺。HRMS m/z(ESI+):计算值[M+H]+＝581.2606；实验值[M+H]+＝581.2601；误差＝0.8ppm。HPLC方法3保留时间＝7.7分钟。
将48mg(0.069mmol)的起始原料(按Renoux et al.,Chem.Sci.,2017,8(5),3427-3433中所述合成)、39.8mg(0.069mmol)的先前化合物SN38-甲胺和9.3mg(0.069mmol)的HOBt用1.5mL无水DMF/吡啶的8:2(v/v)混合物溶解。将反应在室温下搅拌16小时，并在减压下蒸发挥发物。通过硅胶色谱法纯化粗残余物(DCM/MeOH梯度从98:2至95:5)，得到57mg(74％)的中间体化合物(黄色固体)，其直接用于脱保护步骤。ESI+[M+H]+＝1130.4。
在0℃下，将57mg(0.050mmol)的该化合物溶于MeOH(6mL)中。将LiOH一水合物(21.2mg/0.504mmol)溶解于水(0.6mL)中，并缓慢地添加到反应容器中。在0℃下搅拌70分钟后，将混合物用乙酸(39.4mg/0.656mmol)中和并在减压下浓缩。将得到的物质吸收于水/MeOH/DMF溶液(1:1:1v/v)中，并在30g Biotage
Figure BDA0002462220130000471
SNAP Ultra C18(25μm)柱上纯化。流动相A为水+0.05％TFA，流动相B为乙腈+0.05％TFA。梯度范围从10％至60％B。
获得黄色固体状化合物炔-葡糖苷酸-SN38(20.5mg/42％)。LC-HRMS m/z(ESI+):计算值[M+H]+＝990.3251；实验值[M+H]+＝990.3210；误差＝4.1ppm。HPLC方法3保留时间＝8.2分钟。
6.6化合物炔-葡糖苷酸-依喜替康的合成
Figure BDA0002462220130000481
将132.1mg(0.192mmol)的起始原料(按照Renoux et al.,Chem.Sci.,2017,8(5),3427-3433中所述合成)、102mg(0.192mmol)的依喜替康甲磺酸酯和26mg(0.192mmol)的HOBt用1mL无水DMF/吡啶的8:2(v/v)混合物溶解。将反应在室温下搅拌16小时，并在减压下蒸发挥发物。通过硅胶色谱法纯化粗残余物(DCM/MeOH梯度从98:2至90:10)，得到165mg(87％)的中间体化合物(黄色固体)，其直接用于脱保护步骤。ESI+[M+H]+＝985.3。
在0℃下，将165mg(0.168mmol)的该化合物溶于MeOH/THF 1:1v/v(16mL)。将LiOH一水合物(70.3mg/1.675mmol)溶于水(1.6mL)中，并缓慢地添加到反应容器中。在0℃下搅拌70分钟后，将混合物用乙酸(131mg/2.18mmol)中和并在减压下浓缩。将得到的物质吸收于水/MeOH/DMF溶液(1:1:1v/v)中，并在30g Biotage
Figure BDA0002462220130000482
SNAP Ultra C18(25μm)柱上纯化。流动相A为水+0.05％TFA，流动相B为乙腈+0.05％TFA。梯度范围从10％至50％B。
获得黄色固体状化合物炔-葡糖苷酸-依喜替康(98mg/69％)。LC-HRMS m/z(ESI+):计算值[M+H]+＝845.2312；实验值[M+H]+＝845.2360；误差＝-4.8ppm。HPLC方法3保留时间＝8.0分钟。
6.7化合物炔-PNU159682的合成
Figure BDA0002462220130000491
6.7.1)N-(2-((2-氨基乙基)氨基)-2-氧代乙基)丙炔酰胺的合成
将762mg(4.54mmol)的甘氨酸叔丁酯盐酸盐、318.3mg(4.54mmol)的丙酸和61.4mg(0.454mmol)的HOBt溶于5mL无水DMF中。添加1103mg(10.9mmol)的DIPEA，并将溶液在冰(0℃)上搅拌10分钟。将871mg(4.54mmol)的EDC盐酸盐悬浮于12mL的无水DMF中，并添加到反应容器中。将混合物在黑暗中于室温搅拌16小时。然后，在减压下去除挥发物。添加饱和NH4Cl溶液，并用DCM萃取3次。有机相经MgSO4干燥，过滤并蒸发。通过硅胶色谱法纯化粗残余物(石油醚/EtOAc梯度从80:20至50:50)，得到255mg(31％)透明油状丙炔酰基甘氨酸叔丁酯。MS(ESI+):[M+H]+＝184.0。用石油醚/EtOAc(40:60v/v)洗脱并用KMnO4的TLC：Rf＝0.75染色。
将255mg(1.39mmol)的丙炔酰基甘氨酸叔丁酯溶于5mL DCM/TFA(1:1v/v)溶液中。通过TLC分析评估，在室温下搅拌1小时后，脱保护反应完成。减压去除挥发物，得到188mg(105％)油状残留物状的丙炔酰基甘氨酸，其无需纯化即可用于下一步。
将178mg(1.40mmol)的丙炔酰基甘氨酸和504.8mg(1.33mmol)的HATU溶于3mL无水DMF中。添加180.6mg(1.40mmol)的DIPEA，并将反应在室温下搅拌5分钟。然后，添加预先溶于1mL无水DMF中的291mg(1.82mmol)的N-Boc-乙二胺，并且将反应混合物在黑暗中于室温搅拌30分钟。然后，在减压下去除挥发物。添加饱和NH4Cl溶液，并用DCM萃取3次。有机相经MgSO4干燥，过滤并蒸发。通过硅胶色谱法纯化粗残余物(石油醚/EtOAc梯度从20:80至0:100)，得到204mg(54％)淡黄色油状(2-(2-丙炔酰胺基乙酰胺基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(tert-butyl(2-(2-propiolamidoacetamido)ethyl)carbamate)。MS(ESI+):[M+H]+＝270.1；用100％EtOAc洗脱并用KMnO4染色的TLC:Rf＝0.35。
将204mg(0.758mmol)(2-(2-丙炔酰胺基乙酰胺基)乙基)氨基甲酸叔丁酯吸收于5mL的DCM/TFA(7:3v/v)溶液中。通过TLC分析评估，在室温下搅拌45分钟后，脱保护反应完成。在高真空下去除挥发物过夜，得到196mg(92％)淡黄色厚蜡状N-(2-((2-氨基乙基)氨基)-2-氧代乙基)丙炔酰胺TFA盐。1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm)2.84(q,J＝6.2Hz,2H),3.29(q,J＝6.3Hz,2H),3.72(d,J＝6.0Hz,2H),4.20(s,1H),7.78(br.s,3H),8.12(t,J＝5.6Hz,1H),8.94(t,J＝5.9Hz,1H).MS(ESI+):[M+H]+＝170.0。
6.7.2)炔-PNU159682的合成
在圆底烧瓶中，将25mg(0.040mmol)的PNU159692羧酸衍生物(如WO/2016/040825中所述合成的紫色固体，参见上述化学结构)和15.1mg(0.040mmol)的HATU溶于1mL无水DMF中。添加10.2mg(0.080mmol)的DIPEA，并将混合物在室温搅拌2分钟。添加13.4mg(0.047mmol)的N-(2-((2-氨基乙基)氨基)-2-氧代乙基)丙炔酰胺TFA盐(预先溶于500μL无水DMF中)，并将反应混合物在室温搅拌5分钟。在高真空下去除挥发物，并通过硅胶色谱法纯化残余物(DCM/MeOH，梯度从99:1至90:10)，得到14.7mg(49％)红色固体状炔-PNU159682。HRMS m/z(ESI+):计算值[M+H]+＝779.2770；实验值[M+H]+＝779.2758；误差＝1.5ppm。HPLC方法6保留时间＝5.4分钟。
实施例7：使用谷氨酸作为正交部分的基于聚肌氨酸的药物缀合物接头的合成
反应方案如下。
Figure BDA0002462220130000511
7.1)负载乙二胺的树脂
将500mg 2-氯三苯甲基氯树脂珠(100-200目，1％DVB，1.1mmol/g，0.55mmol比例，Novabiochem)在5mL DCM中溶胀10分钟。添加5当量(2.75mmol，165.3mg)的乙二胺(Sigma-Aldrich)，并将混合物在室温下摇动4小时，然后用DCM充分洗涤(5次5mL)。使用DCM/MeOH/DIPEA(17:2:1v/v)溶液将树脂上未反应的位点封端(20分钟处理)。将树脂用DCM(5×5mL)和MeOH(5×5mL)充分洗涤，在真空下干燥并在-20℃下储存直至进一步使用。
7.2)Fmoc-Glu(OAll)-OH偶联
向含有脱保护的N端(1当量)的树脂中添加Fmoc-Glu(OAll)-OH(3当量)、HATU(2.85当量)和DIPEA(6当量)的DMF溶液(每100mg树脂1mL)。搅拌反应容器2小时，并用DMF(5×3mL)和DCM(5×3mL)充分洗涤树脂。通过阴性Kaiser试验证实反应完成。将该树脂在真空下干燥并在-20℃下储存直至进一步使用。
7.3)Alloc保护基去除
将树脂悬浮于DCM中(每100mg树脂4mL)，并通过从玻璃料盘下方引入的氩气流将混合物缓和搅拌。加入苯基硅烷(20当量)，并继续搅拌5分钟，然后添加Pd(PPh3)4(0.25当量)。在避光保护下在室温下在氩气流下继续搅拌混合物30分钟，然后将溶液排干。重复用苯基硅烷和Pd(PPh3)4处理一次，并用DCM(5×5mL)、DMF(5×5mL)和MeOH(5×5mL)彻底洗涤树脂。将该树脂在真空下干燥并在-20℃下储存直至进一步使用。评估树脂负载量(Fmoc裂解测试，在301nm处的吸光度测量)，通常为0.70-0.80mmol/g。
7.4(2R,3R,4R,5S,6R)-6-(2-(3-氨基丙酰胺基)-4-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-仲丁基)-12-(2-(2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧丙基)吡咯烷基-1-基)-2-氧乙基)-5,8-二异丙基-4,10-二甲基-3,6,9-三氧代-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷基)苯氧基)-3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸(NH2-葡糖苷酸-MMAE)偶联步骤
向含有脱保护的羧酸基团(1当量)的树脂中添加HATU(4当量)和DIPEA(4.2当量)的DMF溶液。将反应容器搅拌25分钟，排干并用DMF洗涤树脂(4次5mL)。然后，向树脂中添加在DMF中的1.5当量的化合物(2R,3R,4R,5S,6R)-6-(2-(3-氨基丙酰胺基)-4-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-仲丁基)-12-(2-(2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧丙基)吡咯烷基-1-基)-2-氧乙基)-5,8-二异丙基-4,10-二甲基-3,6,9-三氧代-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷基)苯氧基)-3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸(“NH2-葡糖苷酸-MMAE”；如Jeffrey SC et al.,Bioconjug.Chem.,2006,17(3),831–840中所述合成)和DIPEA(3.2当量)。将反应容器搅拌3小时，排干并用DMF(5次3mL)和DCM(5次3mL)洗涤。将该树脂在真空下干燥并在-20℃下储存直至进一步使用。
7.5)Fmoc脱保护程序
在室温下，将含有Fmoc保护的氨基酸的树脂用在DMF中的20％哌啶(每100mg树脂1mL)处理2次，15分钟。然后，用DMF(5次5mL)和DCM(5次5mL)洗涤树脂。将该树脂在真空下干燥并在-20℃下储存直至进一步使用。
7.6)聚肌氨酸偶联程序
向含有脱保护的伯胺基团(1当量)的树脂中添加聚肌氨酸-CH2-CH2-COOH(2.2当量)，HATU(2当量)和DIPEA(6当量)的DMF溶液。将反应容器搅拌2.5小时，排干并将树脂用DMF(3次5mL)和DCM(3次5mL)洗涤。将该树脂在真空下干燥并在-20℃下储存直至进一步使用。
7.7)从树脂裂解
在室温下搅拌下使用20％(v/v)HFIP的DCM溶液(每100mg树脂2mL)从2-氯三苯甲基树脂进行最终裂解。反应时间为60分钟。过滤树脂，并将所得溶液在氩气流下蒸发。在高真空下干燥最终残留物，并直接用于下一步。
7.8)3-(马来酰亚胺基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯的偶联程序
向溶于无水DMF中的残余物中添加3-(马来酰亚胺基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(8当量)。添加DIPEA(10当量)，并将混合物在室温下搅拌30分钟。用水/TFA(99.5:0.5v/v)淬灭反应混合物，并在30g Biotage
Figure BDA0002462220130000531
SNAP Ultra C18(25μm)柱上纯化。流动相A为水+0.05％TFA，流动相B为乙腈+0.05％TFA。梯度范围从10％至60％B。
获得透明油状化合物MAL-Glu(葡糖苷酸MMAE)-CH2-CH2-PSAR6(5.8mg/14％收率，基于初始树脂负载量)。LC-HRMS m/z(ESI+):计算值[M+2H]2+＝989.5064；实验值[M+2H]2+989.5023；误差＝4.2ppm。HPLC方法1保留时间＝6.7分钟。
获得透明油状化合物MAL-Glu(葡糖苷酸MMAE)-CH2-CH2-PSAR12(4.6mg/20％收率，基于初始树脂负载量)。LC-HRMS m/z(ESI+):计算值[M+2H]2+＝1202.6178；实验值[M+2H]2+1202.6178；误差＝0.0ppm。HPLC方法1保留时间＝6.9分钟。
获得透明油状化合物MAL-Glu(葡糖苷酸MMAE)-CH2-CH2-PSAR18(2.4mg/14％收率，基于初始树脂负载量)。LC-HRMS m/z(ESI+):计算值[M+2H]2+＝1415.7291；实验值[M+2H]2+1415.7282；误差＝0.7ppm。HPLC方法1保留时间＝6.8分钟。
实施例8：使用赖氨酸作为正交部分的基于聚肌氨酸的药物缀合物接头的合成
反应方案如下。
Figure BDA0002462220130000541
8.1)Fmoc-D-Lys(葡糖苷酸MMAE)-NH2的合成
Figure BDA0002462220130000551
将化合物(2R,3R,4R,5S,6R)-6-(2-(3-氨基丙酰胺基)-4-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-仲丁基)-12-(2-(2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧丙基)吡咯烷基-1-基)-2-氧乙基)-5,8-二异丙基-4,10-二甲基-3,6,9-三氧代-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷基)苯氧基)-3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸(“NH2-葡糖苷酸-MMAE”；如Jeffrey SC et al.,Bioconjug.Chem.,2006,17(3),831–840中所述合成)和Fmoc-D-Lys(Boc)-OSu(35mg/0.062mmol)溶于1.2mL无水DMF中。添加DIPEA(24.0mg/0.186mmol)，并将混合物在室温搅拌20小时。真空去除挥发物。将含有淡黄色粗品的烧瓶置于冰浴(0℃)上，并缓慢添加7mL DCM/TFA(7:3v/v)溶液。将溶液在冰上搅拌直至通过HPLC观察到整个Boc脱保护(约2小时)。然后，在真空下去除挥发物，并将残余物吸收于DMF中，以在30g Biotage
Figure BDA0002462220130000552
SNAP UltraC18(25μm)柱上纯化。流动相A为水+0.05％TFA，流动相B为乙腈+0.05％TFA。梯度范围从10％至60％B。获得白色固体状化合物Fmoc-D-Lys(葡糖苷酸MMAE)-NH2(59mg/65％)。LC-HRMS m/z(ESI+):计算值[M+H]+＝1480.7862；实验值[M+H]+＝1480.7890；误差＝-1.9ppm。HPLC方法1保留时间＝10.5分钟
8.2)Fmoc-D-Lys(葡糖苷酸MMAE)-PSARn的合成
Figure BDA0002462220130000561
将化合物PSARn-COOH(2当量；如实施例2中所述获得，并预先以0.15M原液溶于无水DMF中)添加到小瓶中的HATU(1.8当量)中。添加DIPEA(5当量)，并将混合物在室温搅拌3分钟。然后，添加化合物Fmoc-D-Lys(葡糖苷酸MMAE)-NH2(1当量；预先以0.05M原液溶于无水DMF中)。将混合物在室温下搅拌1小时，然后注入30g的Biotage
Figure BDA0002462220130000562
SNAP Ultra C18(25μm)柱中进行纯化。流动相A为水+0.05％TFA，流动相B为乙腈+0.05％TFA。梯度范围从10％至60％B。
获得白色固体状化合物Fmoc-D-Lys(葡糖苷酸MMAE)-PSAR6(9.8mg/38％)。LC-HRMS m/z(ESI+):计算值[M+2H]2+＝975.0133；实验值[M+2H]2+＝975.0088；误差＝4.6ppm。HPLC方法1保留时间＝7.5分钟。
获得白色固体状化合物Fmoc-D-Lys(葡糖苷酸MMAE)-PSAR12(3.6mg/28％)。LC-HRMS m/z(ESI+):计算值[M+2H]2+＝1188.1247；实验值[M+2H]2+＝1188.1233；误差＝1.1ppm。HPLC方法1保留时间＝7.6分钟。
8.3)6-(马来酰亚胺基)己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯的偶联程序
在室温下，将来自先前步骤的化合物Fmoc-D-Lys(葡糖苷酸MMAE)-PSARn用在DMF中的20％哌啶处理5分钟。在高真空下去除挥发物，并将干燥的残余物溶于无水DMF中。然后，添加6-(马来酰亚胺基)己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(8当量)和DIPEA(10当量)，并将混合物在室温下搅拌30分钟。用水/TFA(99.5:0.5v/v)淬灭反应混合物，并在30g Biotage
Figure BDA0002462220130000572
SNAPUltra C18(25μm)cartridge柱上纯化。流动相A为水+0.05％TFA，流动相B为乙腈+0.05％TFA。等度保留10分钟(5％B)后，用40％B等度洗脱目标化合物。
Figure BDA0002462220130000571
获得透明油状化合物MAL-Lys(葡糖苷酸MMAE)-PSAR6(5.0mg/52％)。LC-HRMS m/z(ESI+):计算值[M+2H]2+＝960.5163；实验值[M+2H]2+＝960.5167；误差＝-0.5ppm。HPLC方法1保留时间＝7.1分钟。
获得透明油状化合物MAL-Lys(葡糖苷酸MMAE)-PSAR12(1.8mg/51％)。LC-HRMS m/z(ESI+):计算值[M+2H]2+＝1173.6276；实验值[M+2H]2+1173.6229；误差＝4.0ppm。HPLC方法1保留时间＝7.0分钟。
实施例9：使用甘氨酸作为正交部分的基于聚肌氨酸或基于聚乙二醇的药物缀合 物接头的合成
9.1)化合物溴乙酰胺-Ngly(三唑-葡糖苷酸MMAE)-PSARn
Figure BDA0002462220130000581
将炔-葡糖苷酸-MMAE(1当量；如实施例6中所述获得)、PSARn-N3-溴乙酰胺(1.1当量；如实施例3中所述获得)和四(乙腈)铜(I)六氟磷酸盐(3当量)混合于反应容器中。添加DCM/乙腈1:1(v/v)溶液，以使炔-葡糖苷酸-MMAE的最终浓度为12μmol/mL。将反应在黑暗中在室温下在氩气下搅拌16-20小时。减压去除挥发物后，将残留物吸收于DMF中，并在30gBiotage
Figure BDA0002462220130000582
SNAP Ultra C18(25μm)柱上纯化。流动相A为水+0.1％TFA，流动相B为乙腈+0.1％TFA。梯度范围从10％至50％B。
获得白色固体状化合物溴乙酰胺-Ngly(三唑-葡糖苷酸MMAE)-PSAR12(8.5mg/51％)。LC-HRMS m/z(ESI+):计算值[M+2H]2+＝1151.0179；实验值[M+2H]2+＝1151.0188；误差＝-0.8ppm。HPLC方法3保留时间＝8.5分钟。
9.2)化合物MAL-苯基-Ngly(三唑-葡糖苷酸MMAE)-PSARn
Figure BDA0002462220130000591
使用DCM作为反应溶剂，如上文第9.1节所述使炔-葡糖苷酸-MMAE(如实施例6中所述获得)和PSARn-N3-苯基-MAL(如实施例3中所述获得)反应并纯化。
获得白色固体状化合物MAL-苯基-Ngly(三唑-葡糖苷酸MMAE)-PSAR6(3.3mg/20％)。LC-HRMS m/z(ESI+):计算值[M+2H]2+＝955.9566；实验值[M+2H]2+＝955.9533；误差＝3.4ppm。HPLC方法3保留时间＝9.2分钟。
获得白色固体状化合物MAL-苯基-Ngly(三唑-葡糖苷酸MMAE)-PSAR12(9.0mg/33％)。LC-HRMS m/z(ESI+):计算值[M+2H]2+＝1169.0679；实验值[M+2H]2+＝1169.0621；误差＝4.9ppm。HPLC方法3保留时间＝8.7分钟。
获得白色固体状化合物MAL-苯基-Ngly(三唑-葡糖苷酸MMAE)-PSAR18(11.5mg/40％)。LC-HRMS m/z(ESI+):计算值[M+2H]2+＝1382.1792；实验值[M+2H]2+＝1382.1803；误差＝-0.7ppm。HPLC方法3保留时间＝8.6分钟。
获得白色固体状化合物MAL-苯基-Ngly(三唑-葡糖苷酸MMAE)-PSAR24(15mg/44％)。LC-HRMS m/z(ESI+):计算值[M+4Na]4+＝820.1309；实验值[M+4Na]4+＝820.1324；误差＝-1.8ppm。HPLC方法3保留时间＝8.4分钟。
9.3)化合物MAL-苯基-Ngly(三唑-葡糖苷酸MMAE)-PEGn
Figure BDA0002462220130000601
使用NMP/DCM 2:1(v/v)作为反应溶剂，如上文第9.1节所述使炔-葡糖苷酸-MMAE(如实施例6中所述获得)和PEGn-N3-苯基-MAL(如实施例5中所述获得)反应并纯化。
获得淡黄色油状化合物MAL-苯基-Ngly(三唑-葡糖苷酸MMAE)-PEG12(10.4mg/45％)。LC-HRMS m/z(ESI+):计算值[M+2H]2+＝1042.5211；实验值[M+2H]2+＝1042.5218；误差＝-0.7ppm。HPLC方法3保留时间＝8.0分钟。
9.4)化合物MAL-苯基-Ngly(三唑-葡糖苷酸MMAE)-Ngly(三唑-葡糖苷酸MMAE)-PSARn
Figure BDA0002462220130000611
将炔-葡糖苷酸-MMAE(3当量；如实施例6中所述获得)、PSARn-N3-N3-苯基-MAL(1当量；如实施例3中所述获得)和四(乙腈)铜(I)六氟磷酸盐(5当量)混合于反应容器中。添加DCM，并将反应在室温下在氩气中在黑暗中搅拌16-20小时。减压去除挥发物后，将残留物吸收于DMF中，并在30g Biotage
Figure BDA0002462220130000612
SNAP Ultra C18(25μm)柱上纯化。流动相A为水+0.1％TFA，流动相B为乙腈+0.1％TFA。梯度范围从10％至50％B。
获得白色固体状化合物MAL-苯基-Ngly(三唑-葡糖苷酸MMAE)-Ngly(三唑-葡糖醛酸MMAE)-PSAR18(10.1mg/44％)。LC-HRMS m/z(ESI+):计算值[M+4H]4+＝1022.5082；实验值[M+4H]4+＝1022.5093；误差＝-1.0ppm。HPLC方法3保留时间＝9.5分钟。
9.5)化合物MAL-苯基-Ngly[三唑-葡糖苷酸(MMAE)2]-PSARn
Figure BDA0002462220130000621
使用DCM作为反应溶剂，如上文第9.1节所述使炔-葡糖苷酸-(MMAE)2(如实施例6中所述获得)和PSARn-N3-苯基-MAL(如实施例3中所述获得)反应并纯化。
获得白色固体状化合物MAL-苯基-Ngly[三唑-葡糖苷酸(MMAE)2]-PSAR24(12.5mg/39％)。LC-HRMS m/z(ESI+):计算值[M+3H]3+＝1371.3767；实验值[M+3H]3+＝1371.3818；误差＝-3.8ppm。HPLC方法3保留时间＝10.0分钟。
9.6)化合物MAL-苯基-Ngly[三唑-半乳糖苷(MMAE)2]-PSARn
Figure BDA0002462220130000631
使用DCM作为反应溶剂，如上文第9.1节所述使炔-半乳糖苷-(MMAE)2(如在Alsarraf et al.,Chem.Commun.,2015,51(87),15792-15795中所述合成)和PSARn-N3-苯基-MAL(如实施例3中所述获得)反应并纯化。
获得白色固体状化合物MAL-苯基-Ngly[三唑-半乳糖苷(MMAE)2]-PSAR24(6.5mg/55％)。LC-HRMS m/z(ESI+):计算值[M+4H]4+＝1022.7895；实验值[M+4H]4+＝1022.7903；误差＝0.8ppm。HPLC方法3保留时间＝9.2分钟。
9.7)化合物MAL-苯基-Ngly(三唑-val-cit-PAB-MMAE)-PSARn
Figure BDA0002462220130000641
使用NMP作为反应溶剂，如上文第9.1节所述使炔-val-cit-PAB-MMAE(如实施例6中所述获得)和PSARn-N3-苯基-MAL(如实施例3中所述获得)反应并纯化。
获得白色固体状化合物MAL-苯基-Ngly(三唑-val-cit-PAB-MMAE)-PSAR12(4.5mg/12％)。LC-HRMS m/z(ESI+):计算值[M+2H]2+＝1207.1494；实验值[M+2H]2+＝1207.1535；误差＝-3.5ppm。HPLC方法3保留时间＝8.6分钟。
9.8)化合物MAL-苯基-Ngly(三唑-SN38)-PSARn
Figure BDA0002462220130000651
使用DCM/DMF 2:1(v/v)作为反应溶剂，如上文第9.1节所述使炔-SN38(如实施例6中所述获得)和PSARn-N3-苯基-MAL(如实施例3中所述获得)反应并纯化。
获得亮黄色固体状化合物MAL-苯基-Ngly(三唑-SN38)-PSAR18(4.0mg/20％)。LC-HRMS m/z(ESI+):计算值[M+2Na]2+＝1077.4562；实验值[M+2Na]2+＝1077.4588；误差＝-2.4ppm。HPLC方法3保留时间＝7.5分钟。
9.9)化合物MAL-苯基-Ngly(三唑-SN38)-Ngly(三唑-SN38)-PSARn
Figure BDA0002462220130000661
如上文9.4节所述，使炔-SN38(如实施例6中所述获得)和PSARn-N3-N3-苯基-MAL(如实施例3中所述获得)反应并纯化。
获得黄色固体状化合物MAL-苯基-Ngly(三唑-SN38)-Ngly(三唑-SN38)-PSAR18(5.1mg/43％)。LC-HRMS m/z(ESI+):计算值[M+2Na]2+＝1412.5812；实验值[M+2Na]2+＝1412.5852；误差＝-3.8ppm。HPLC方法3保留时间＝8.4分钟。
9.10)化合物MAL-苯基-Ngly(三唑-葡糖苷酸SN38)-Ngly(三唑-葡糖苷酸SN38)-PSARn
Figure BDA0002462220130000671
使用DCM/MeOH 8:2(v/v)作为反应溶剂，如上文第9.4节所述使炔-葡糖苷酸-SN38(如实施例6中所述获得)和PSARn-N3-N3-苯基-MAL(如实施例3中所述获得)反应并纯化。
获得黄色固体状化合物MAL-苯基-Ngly(三唑-葡糖苷酸SN38)-Ngly(三唑-葡糖苷酸SN38)-PSAR18(7.0mg/30％)。LC-HRMSm/z(ESI+):计算值[M+2H]2+＝1271.5080；实验值[M+2H]2+＝1271.5103；误差＝-1.8ppm。HPLC方法3保留时间＝7.8分钟。
9.11)化合物MAL-苯基-Ngly(三唑-葡糖苷酸-依喜替康)-PSARn
Figure BDA0002462220130000681
使用DCM作为反应溶剂，如上文第9.1节所述使炔-葡糖苷酸-依喜替康(如实施例6中所述获得)和PSARn-N3-苯基-MAL(如实施例3中所述获得)反应并纯化。
获得黄色固体状化合物MAL-苯基-Ngly(三唑-葡糖苷酸-依喜替康)-PSAR18(13.2mg/64％)。LC-HRMS m/z(ESI+):计算值[M+2H]2+＝1241.0069；实验值[M+2H]2+＝1241.0088；误差＝-1.1ppm。HPLC方法3保留时间＝7.1分钟。
9.12)化合物MAL-苯基-Ngly(三唑-PNU159682)-PSARn
Figure BDA0002462220130000691
使用DCM作为反应溶剂并在反相纯化过程中用0.1％甲酸代替流动相中的0.1％TFA添加剂，如上文第9.1节所述使炔-PNU159682(如实施例6中所述获得)和PSARn-N3-苯基-MAL(如实施例3中所述获得)反应并纯化。
获得红色固体状化合物MAL-苯基-Ngly(三唑-PNU159682)-PSAR12(4.8mg/40％)。LC-HRMS m/z(ESI+):计算值[M+2H]2+＝994.9185；实验值[M+2H]2+＝994.9184；误差＝0.1ppm。HPLC方法6保留时间＝5.0min。
获得红色固体状化合物MAL-苯基-Ngly(三唑-PNU159682)-PSAR18(7.2mg/33％)。LC-HRMS m/z(ESI+):计算值[M+2H]2+＝1208.0298；实验值[M+2H]2+＝1208.0295；误差＝0.3ppm。HPLC方法6保留时间＝4.9分钟。
实施例10：阴性对照药物缀合物接头MAL-葡糖苷酸MMAE、MAL-苯基-三唑-葡糖苷 酸MMAE和MAL-苯基-PSARn-三唑-葡糖苷酸MMAE的合成
10.1)化合物MAL-葡糖苷酸MMAE的合成
Figure BDA0002462220130000701
称重起始化合物(2R,3R,4R,5S,6R)-6-(2-(3-氨基丙酰胺基)-4-((5S,8S,11S,12R)-11-((S)-仲丁基)-12-(2-(2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-羟基-1-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧丙基)吡咯烷基-1-基)-2-氧乙基)-5,8-二异丙基-4,10-二甲基-3,6,9-三氧代-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷基)苯氧基)-3,4,5-三羟基四氢-2H-吡喃-2-羧酸(“NH2-葡糖苷酸-MMAE”；如Jeffrey SC et al.,Bioconjug.Chem.,2006,17(3),831–840中所述合成)(6.2mg/5μmol)和3-(马来酰亚胺基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(14.6mg/55μmol)，并将其溶于200μL无水DMF中。添加DIPEA(8.5mg/66μmol)，并将混合物在室温下搅拌30分钟。用1.5mL水/TFA(99:1v/v)淬灭反应混合物，并在30g Biotage
Figure BDA0002462220130000712
SNAPUltraC18(25μm)柱上纯化。流动相A为水+0.05％TFA，流动相B为乙腈+0.05％TFA。梯度范围从10％至70％B。
获得白色固体状标题化合物MAL-葡糖苷酸MMAE(4.1mg/59％)。LC-HRMS m/z(ESI+):计算值[M+H]+＝1281.6501；实验值[M+H]+＝1281.6489；误差＝0.9ppm。HPLC方法1保留时间＝7.1分钟。
10.2)化合物MAL-苯基-三唑-葡糖苷酸MMAE的合成
10.2.1)合成全氟苯基2-(4-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)苯基)乙酸酯
Figure BDA0002462220130000711
在反应容器中，将市售的2-[4-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)苯基]乙酸(299mg/1.29mmol)、N,N'-二环己基碳二亚胺(267mg/1.29mmol)和五氟苯酚(238mg/1.29mmol)溶于15mL无水1,2-二甲氧基乙烷中。在室温搅拌2小时后，通过过滤去除不溶物，并通过硅胶色谱法纯化滤液(石油醚/EtOAc，梯度从80:20至20:80)，得到白色固体状标题化合物(400mg/78％)。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ(ppm)4.01(s,2H),6.87(s,2H),7.40(d,J＝8.7Hz,2H),7.47(d,J＝8.7Hz,2H).HRMS m/z(ESI+):计算值[M+H]+＝398.0446；实验值[M+H]+＝398.0448；误差＝-0.4ppm。
10.2.2)N-(2-叠氮基乙基)-2-(4-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)苯基)乙酰胺的合成
Figure BDA0002462220130000721
在反应容器中，将先前的化合物全氟苯基2-(4-(2,5-二氧杂-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)苯基)乙酸酯(78mg/0.20mmol)溶于1mL无水DCM中。添加2-叠氮基乙-1-胺(33.8mg/0.40mmol)，并将反应在室温搅拌1小时。然后，添加1N HCl溶液，混合物用DCM萃取3次。有机相经MgSO4干燥，过滤并真空蒸发，得到固体粗品，将其通过硅胶色谱法纯化(石油醚/EtOAc，梯度从60:40至0：100)，得到白色固体状标题化合物(18mg/31％)。MS(ESI+):[M+H]+＝300.1；HPLC方法1保留时间＝8.4分钟。用100％EtOAc洗脱的TLC：Rf＝0.65。
10.2.3)化合物MAL-苯基-三唑-葡糖苷酸MMAE的合成
Figure BDA0002462220130000722
将实施例6的化合物炔-葡糖苷酸MMAE(17mg/15.1μmol)、四(乙腈)铜(I)六氟磷酸盐(11.2mg/30μmol)和来自先前步骤的N-(2-叠氮基乙基)-2-(4-(2,5-二氧代2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)苯基)乙酰胺(6.3mg/21μmol)混合于HPLC小瓶中。添加800μL无水DCM/乙腈/NMP1:1:1(v/v/v)溶液，并将反应在氩气下于室温搅拌16小时。减压去除挥发物后，将残留物吸收于DMF中，并在30g Biotage
Figure BDA0002462220130000732
SNAP UltraC18(25μm)柱上纯化。流动相A为水+0.1％TFA，流动相B为乙腈+0.1％TFA。梯度范围从10％至60％B。
获得灰白色固体状标题化合物MAL-苯基-三唑-葡糖苷酸MMAE(10.3mg/48％)。LC-HRMS m/z(ESI+):计算值[M+2H]2+＝713.8425；实验值[M+2H]2+＝713.8415；误差＝1.3ppm。HPLC方法3保留时间＝10.2分钟。
10.3)化合物MAL-苯基-PSARn-三唑-葡糖苷酸MMAE的合成
Figure BDA0002462220130000731
将实施例6的化合物炔-葡糖苷酸MMAE(20mg/17.7μmol)、四(乙腈)铜(I)六氟磷酸盐(13.2mg/35μmol)和实施例4的N3-PSARn-苯基-MAL(34.3mg/28μmol)混合于HPLC小瓶中。添加900μL的NMP/DCM 2:1(v/v)溶液，并将反应在室温下在氩气下搅拌16小时。减压去除挥发物后，将残留物吸收于DMF中，并在30gBiotage
Figure BDA0002462220130000741
SNAP Ultra C18(25μm)柱上纯化。流动相A为水+0.1％TFA，流动相B为乙腈+0.1％TFA。梯度范围从10％至60％B。
获得白色固体状标题化合物MAL-苯基-PSARn-三唑-葡糖苷酸MMAE(16.0mg/39％)。LC-HRMS m/z(ESI+):计算值[M+2H]2+＝1168.5759；实验值[M+2H]2+＝1168.5792；误差＝-2.8ppm。HPLC方法3保留时间＝6.8分钟。
实施例11：本发明的LDC化合物的制备
制备并表征了以下LDC化合物：
曲妥珠单抗-Glu(葡糖苷酸MMAE)-CH2-CH2-PSAR6
曲妥珠单抗-Glu(葡糖苷酸MMAE)-CH2-CH2-PSAR12
曲妥珠单抗-Glu(葡糖苷酸MMAE)-CH2-CH2-PSAR18
曲妥珠单抗-Lys(葡糖苷酸MMAE)-PSAR6
曲妥珠单抗-Lys(葡糖苷酸MMAE)-PSAR12
曲妥珠单抗-BAC-Ngly(三唑-葡糖苷酸MMAE)-PSAR12
曲妥珠单抗-MAL-苯基-Ngly(三唑-葡糖苷酸MMAE)-PSAR6
曲妥珠单抗-MAL-苯基-Ngly(三唑-葡糖苷酸MMAE)-PSAR12
曲妥珠单抗-MAL-苯基-Ngly(三唑-val-cit-PAB-MMAE)-PSAR12
曲妥珠单抗-MAL-苯基-Ngly(三唑-葡糖苷酸MMAE)-PSAR18
曲妥珠单抗-MAL-苯基-Ngly(三唑-SN38)-PSAR18
曲妥珠单抗-MAL-苯基-Ngly(三唑-葡糖苷酸-依喜替康)-PSAR18
曲妥珠单抗-MAL-苯基-Ngly(三唑-PNU159682)-PSAR12
曲妥珠单抗-MAL-苯基-Ngly(三唑-PNU159682)-PSAR18
曲妥珠单抗-MAL-苯基-Ngly(三唑-葡糖苷酸MMAE)-PSAR24
CD19-MAL-苯基-Ngly(三唑-葡糖苷酸MMAE)-PSAR24
CD22-MAL-苯基-Ngly(三唑-葡糖苷酸MMAE)-PSAR24
曲妥珠单抗-MAL-苯基-Ngly(三唑-葡糖苷酸MMAE)-Ngly(三唑-葡糖苷酸MMAE)-PSAR18
曲妥珠单抗-MAL-苯基-Ngly[三唑-葡糖苷酸(MMAE)2]-PSAR24
曲妥珠单抗-MAL-苯基-Ngly[三唑-半乳糖苷(MMAE)2]-PSAR24
曲妥珠单抗-MAL-苯基-Ngly(三唑-SN38)-Ngly(三唑-SN38)-PSAR18
曲妥珠单抗-MAL-苯基-Ngly(三唑-葡糖苷酸SN38)-Ngly(三唑-葡糖苷酸SN38)-PSAR18
曲妥珠单抗-MAL-苯基-Ngly(三唑-葡糖苷酸MMAE)-PEG12
曲妥珠单抗-葡糖苷酸MMAE
曲妥珠单抗-MAL-苯基-三唑-葡糖苷酸MMAE
曲妥珠单抗-MAL-苯基-PSAR12-三唑-葡糖苷酸MMAE
人白蛋白-MAL-苯基-Ngly(三唑-葡糖苷酸MMAE)-PSAR24
下表6中描述了它们的结构。
表6
Figure BDA0002462220130000751
Figure BDA0002462220130000761
Figure BDA0002462220130000771
Figure BDA0002462220130000781
Figure BDA0002462220130000791
Figure BDA0002462220130000801
Figure BDA0002462220130000811
Figure BDA0002462220130000821
Figure BDA0002462220130000831
Figure BDA0002462220130000841
11.1)缀合物的制备
11.1.1)抗体-药物缀合物的制备
在37℃下用14摩尔当量的三(2-羧乙基)膦(TCEP)处理抗体溶液(在PBS 7.4+1mMEDTA中10mg/mL)2小时。对于基于马来酰亚胺的偶联，使用Amicon 30K离心过滤器设备(Merck Millipore)通过三轮稀释/离心，将完全还原的抗体与100mM pH 7.4的磷酸钾+1mMEDTA进行缓冲液交换。将10-12摩尔当量的药物-接头(来自12mMDMSO原液)添加到抗体中(残余DMSO<10％v/v)。将该溶液在室温下温育30分钟。对于基于溴乙酰胺的偶联，将完全还原的抗体与50mM pH 8.1的硼酸盐缓冲液+1mM EDTA进行缓冲液交换，并在黑暗中于37℃下于24小时内使用16摩尔当量的药物-接头实现缀合。通过使用Amicon 30K离心过滤器设备进行四轮稀释/离心，用PBS 7.4对缀合物进行缓冲液交换/纯化。或者，使用PDMiniTrapG-25色谱柱(GE Healthcare)对缀合物进行缓冲液交换/纯化，并进行无菌过滤(0.20μmPES过滤器)。将掺入可自水解的马来酰亚胺(MAL-苯基)基团的缀合物在PBS 7.4中以5mg/mL在37℃下温育48h，以确保琥珀酰亚胺基部分完全水解。使用Colibri微量分光光度计设备(Titertek Berthold)在280nm处以分光光度法评估最终蛋白质浓度。
11.1.2)人白蛋白-药物缀合物的制备
向人白蛋白溶液(在磷酸钾100mM pH 7.4+1mM EDTA中10mg/mL)中添加2摩尔当量的药物-接头(来自12mM DMSO原液)。残留DMSO<10％(v/v)。将该溶液在室温下温育4小时。通过使用Amicon 30K离心过滤器设备进行四轮稀释/离心，用PBS 7.4对缀合物进行缓冲液交换/纯化。或者，使用PD MiniTrap G-25色谱柱(GE Healthcare)对缀合物进行缓冲液交换/纯化并进行无菌过滤(0.20μmPES过滤器)。将缀合物在PBS 7.4中以5mg/mL在37℃下温育48h，以确保琥珀酰亚胺基部分完全水解。使用Colibri微量分光光度计设备(TitertekBerthold)在280nm处以分光光度法评估最终蛋白质浓度。
11.2)缀合物的表征
所得缀合物的特征如下：
反相液相色谱-质谱(RPLC-MS)：
使用上述UHPLC方法5进行变性RPLC-QToF分析。简言之，使用水/乙腈+0.1％甲酸(0.4mL/min)的流动相梯度在AgilentPLRP-S1000
Figure BDA0002462220130000851
2.1x150mm8μm(80℃)上洗脱缀合物，并使用BrukerImpact IITM Q-ToF质谱仪扫描500-3500m/z范围(ESI+)检测缀合物。使用BrukerCompass
Figure BDA0002462220130000852
软件中包括的MaxEnt算法对数据进行反卷积。
尺寸排阻色谱法(SEC)：
在Agilent 1050HPLC系统上进行SEC，该系统的柱外体积小于15μL(装有内径为0.12mm的PEEK管和小体积的UV流通池)。色谱柱为Waters AcquityUPLC
Figure BDA0002462220130000853
蛋白BEH SEC200
Figure BDA0002462220130000854
4.6x150mm 1.7μm(保持在室温下)或Agilent AdvanceBio SEC300
Figure BDA0002462220130000855
4.6x150mm 2.7μm(保持在室温下)。流动相为100mM磷酸钠和200mM氯化钠(pH 6.8)。将10％乙腈(v/v)添加到流动相中，以将与固定相的二次疏水相互作用最小化，并防止细菌生长。流速为0.35mL/min。在280nm下监测UV检测。
疏水相互作用色谱法(HIC)：
在Agilent 1050HPLC系统上进行疏水相互作用色谱法(HIC)。色谱柱是TosohTSK-GEL BUTYL-NPR 4.6x35mm 2.5μm(25℃)。流动相A为1.5M(NH4)2SO4+pH 7.0的25mM磷酸钾。流动相B为pH 7.0的25mM磷酸钾+15％异丙醇(v/v)。线性梯度在10分钟内从0％B至100％B，然后在100％B保持3分钟。流速为0.75mL/min。在220和280nm处监测UV检测。
11.3)缀合物表征概述
缀合物在其变性RPLC色谱图上显示出一个LC-1d(带有1个药物-接头的轻链)和一个HC-3d(带有3个药物-接头的重链)吸收峰(DAR8缀合物)。对于重链的质谱分析，报道了主要糖型(曲妥珠单抗的G0F)。缀合物在其HIC色谱图上显示出单个吸收峰。
曲妥珠单抗-Glu(葡糖苷酸MMAE)-CH2-CH2-PSAR6(DAR8)：
反卷积LC-1d计算值：25416；观测值：25417/反卷积HC-3d计算值：56529；Obs：56528
单体纯度：97.2％
HIC保留时间：8.8分钟
曲妥珠单抗-Glu(葡糖苷酸MMAE)-CH2-CH2-PSAR12(DAR8)：
反卷积LC-1d计算值：25844；观测值：25844/反卷积HC-3d计算值：57805；观测值：57805
单体纯度：99.0％
HIC保留时间：8.8分钟
曲妥珠单抗-Glu(葡糖苷酸MMAE)-CH2-CH2-PSAR18(DAR8)：反卷积LC-1d计算值：26270；观测值：26270/反卷积HC-3d计算值：59086；观测值：59086
单体纯度：96.5％
HIC保留时间：8.8分钟
曲妥珠单抗-Lys(葡糖苷酸MMAE)-PSAR6(DAR8)：
反卷积LC-1d计算值：25360；观测值：25360/反卷积HC-3d计算值：56352；观测值：56353
单体纯度：99+％
HIC保留时间：7.6分钟
曲妥珠单抗-Lys(葡糖苷酸MMAE)-PSAR12(DAR8)：
反卷积LC-1d计算值：25786；观测值：25786/反卷积HC-3d计算值：57634；观测值：57632
单体纯度：99+％
HIC保留时间：7.5分钟
曲妥珠单抗-BAC-Ngly(三唑-葡糖苷酸MMAE)-PSAR12(DAR8)
反卷积LC-1d计算值：25661；观测值：25662/反卷积HC-3d计算值：57264；观测值：57262
单体纯度：99+％
HIC保留时间：7.0分钟(DAR8缀合物)。如在HIC色谱图中观察到的，该ADC是异质混合物，其含有
Figure BDA0002462220130000871
20％的DAR6、
Figure BDA0002462220130000872
20％的DAR7和
Figure BDA0002462220130000873
60％的DAR8偶联物。
曲妥珠单抗-MAL-苯基-Ngly(三唑-葡糖苷酸MMAE)-PSAR6(DAR8)(＝ADC-PSAR6)
反卷积LC-1d计算值：25368；观测值：25368/反卷积HC-3d计算值：56382；观测值：56380
单体纯度：99+％
HIC保留时间：7.5分钟
曲妥珠单抗-MAL-苯基-Ngly(三唑-葡糖苷酸MMAE)-PSAR12(DAR8)(＝ADC- PSAR12)
反卷积LC-1d计算值：25794；观测值：25794/反卷积HC-3d计算值：57660；观测值：57660。
单体纯度：99+％
HIC保留时间：7.1分钟
曲妥珠单抗-MAL-苯基-Ngly(三唑-val-cit-PAB-MMAE)-PSAR12(DAR8)
反卷积LC-1d计算值：25871；观测值：25870/反卷积HC-3d计算值：57889；观测值：57888
单体纯度：99+％
HIC保留时间：9.2分钟
曲妥珠单抗-MAL-苯基-Ngly(三唑-葡糖苷酸MMAE)-PSAR18(DAR8)(＝ADC- PSAR18)
反卷积LC-1d计算值：26221；观测值：26221/反卷积HC-3d计算值：58939；观测值：58939
单体纯度：99+％
HIC保留时间：6.8分钟
曲妥珠单抗-MAL-苯基-Ngly(三唑-SN38)-PSAR18(DAR8)
反卷积LC-1d计算值：25567；观测值：25567/反卷积HC-3d计算值：56979；观测值：56977
单体纯度：99+％
HIC保留时间：5.1分钟
曲妥珠单抗-MAL-苯基-Ngly(三唑-葡糖苷酸-依喜替康)-PSAR18(DAR8)
反卷积LC-1d计算值：25938；观测值：25937/反卷积HC-3d计算值：58092；观测值：58089
单体纯度：99+％
HIC保留时间：5.7分钟
曲妥珠单抗-MAL-苯基-Ngly(三唑-PNU159682)-PSAR12(DAR8)
反卷积LC-1d计算值：25446；观测值：25446/反卷积HC-3d计算值：56614；观测值：56612
单体纯度：99+％
HIC保留时间：5.2分钟
曲妥珠单抗-MAL-苯基-Ngly(三唑-PNU159682)-PSAR18(DAR8)
反卷积LC-1d计算值：25872；观测值：25872/反卷积HC-3d计算值：57894；观测值：57892
单体纯度：99+％
HIC保留时间：5.1分钟
曲妥珠单抗-MAL-苯基-Ngly(三唑-葡糖苷酸MMAE)-PSAR24(DAR8)(＝ADC- PSAR24)
反卷积LC-1d计算值：26647；观测值：26674/反卷积HC-3d计算值：60218；观测值：60218
单体纯度：99+％
HIC保留时间：6.7分钟
CD19-MAL-苯基-Ngly(三唑-葡糖苷酸MMAE)-PSAR24(DAR8)
反卷积LC-1d计算值：27347；观测值：27347/反卷积HC-3d计算值：60137；观测值：60132
单体纯度：92.6％
HIC保留时间：6.8分钟
CD22-MAL-苯基-Ngly(三唑-葡糖苷酸MMAE)-PSAR24(DAR8)
反卷积LC-1d计算值：27341；观测值：27341/反卷积HC-3d计算值：60314；观测值：60311
单体纯度：97.4％
HIC保留时间：6.8分钟
曲妥珠单抗-MAL-苯基-Ngly(三唑-葡糖苷酸MMAE)-Ngly(三唑-葡糖苷酸MMAE)- PSAR18(DAR16)
反卷积LC-1d计算值：27544；观测值：27545/反卷积HC-3d计算值：62910；观测值：62907
单体纯度：98.5％
HIC保留时间：8.7分钟
曲妥珠单抗-MAL-苯基-Ngly[三唑-葡萄糖醛酸(MMAE)2 ]-PSAR24(DAR16)
反卷积LC-1d计算值：27569；观测值：27570/反卷积HC-3d计算值：62985；观测值：62983
单体纯度：98.2％
HIC保留时间：9.9分钟
曲妥珠单抗-MAL-苯基-Ngly[三唑-半乳糖苷(MMAE)2 ]-PSAR24(DAR16)
反卷积LC-1d计算值：27555；观测值：27554/反卷积HC-3d计算值：62943；观测值：62940
单体纯度：99+％
HIC保留时间：10.2分钟
曲妥珠单抗-MAL-苯基-Ngly(三唑-SN38)-Ngly(三唑-SN38)-PSAR18(DAR16)
反卷积LC-1d计算值：26237；观测值：26237/反卷积HC-3d计算值：58989；观测值：58987
单体纯度：99+％
HIC保留时间：6.6分钟
曲妥珠单抗-MAL-苯基-Ngly(三唑-葡糖苷酸SN38)-Ngly(三唑-葡糖苷酸SN38)- PSAR18(DAR16)
反卷积LC-1d计算值：27270；观测值：27270/反卷积HC-3d计算值：62086；观测值：62087
单体纯度：99+％
HIC保留时间：5.7分钟
曲妥珠单抗-MAL-苯基-Ngly(三唑-葡糖苷酸MMAE)-PEG12(DAR8)(＝ADC-PEG12)
反卷积LC-1d计算值：25541；观测值：25541/反卷积HC-3d计算值：56901；观测值：56900
单体纯度：99+％
HIC保留时间：7.4分钟
曲妥珠单抗-葡糖苷酸MMAE(DAR8)：
反卷积LC-1d计算值：24721；观测值：24720/反卷积HC-3d计算值：54439；观测值：54438
单体纯度：95.2％
HIC保留时间：9.2分钟
曲妥珠单抗-MAL-苯基-三唑-葡糖苷酸MMAE(DAR8)(＝ADC-PSAR0)：
反卷积LC-1d计算值：24884；观测值：24884/反卷积HC-3d计算值：54926；观测值：54926
单体纯度：98.5％
HIC保留时间：8.4分钟
曲妥珠单抗-MAL-苯基-PSAR12-三唑-葡糖苷酸MMAE(DAR8)(＝ADC-PSAR12L)：
反卷积LC-1d计算值：25793；观测值：25793/反卷积HC-3d计算值：57657；观测值：57657
单体纯度：99+％
HIC保留时间：8.5分钟
人白蛋白-MAL-苯基-Ngly(三唑-葡糖苷酸MMAE)-PSAR24(DAR1)：
反卷积计算值：69765；观测值：69645
单体纯度：90.8％
HIC保留时间：3.9分钟
曲妥珠单抗：
反卷积LC观测值：23439/反卷积HC观测值：50595
单体纯度：99+％
HIC保留时间：4.7分钟
抗CD19抗体：
反卷积LC观测值：24139/反卷积HC观测值：50517
单体纯度：93.2％
HIC保留时间：4.7分钟
抗CD22抗体：
反卷积LC观测值：24133/反卷积HC观测值：50692
单体纯度：99+％
HIC保留时间：4.8分钟
人白蛋白：
反卷积观测值：66556
单体纯度：92.4％
HIC保留时间：2.5分钟
实施例12：非基于聚肌氨酸的抗体-药物-缀合物(ADC-PSAR0)、具有正交构型的基 于聚肌氨酸的抗体-药物-缀合物(ADC-PSAR12)和具有线性构型的基于聚肌氨酸的抗体-药 物-缀合物(ADC-PSAR12L)的疏水相互作用色谱(HIC)图。
按照实施例11中所述的方法，通过疏水相互作用色谱法(HIC)在Tosoh TSK-GELBUTYL-NPR色谱柱上评估缀合的有效载荷对本体溶剂的相对暴露和基于曲妥珠单抗的DAR8ADC的表观疏水性。结果如图1所示。当聚肌氨酸以相对于药物单元的平行(即正交)方向接枝时，可提供有效的疏水性掩盖特性并降低缀合物(ADC-PSAR12)的表观疏水性。但是，当聚肌氨酸呈线性(即连续)构型时，未观察到缀合物(ADC-PSAR12L)的表观疏水性降低。
实施例13：基于聚肌氨酸和聚乙二醇的抗体-药物-缀合物的疏水相互作用色谱 (HIC)图
按照实施例11中所述的方法，通过疏水相互作用色谱法(HIC)在Tosoh TSK-GELBUTYL-NPR色谱柱上评估缀合的有效载荷对本体溶剂的相对暴露和基于曲妥珠单抗的DAR8ADC的表观疏水性。结果如图2所示。在等长(n＝12个单体单元)的情况下，聚肌氨酸比聚乙二醇具有更好的疏水性掩盖特性(保留时间更短)。
实施例14：在单次静脉注射3m/kg剂量的非基于聚肌氨酸的抗体-药物-缀合物 (ADC-PSAR0)和基于聚肌氨酸的抗体-药物-缀合物(ADC-PSAR12)后，小鼠体内的药代动力 学曲线(随时间的总抗体浓度)
经由尾静脉以3mg/kg的剂量向雄性SCID小鼠(4-6周龄)注射ADC(每剂量组五只动物，随机分配)。在不同的时间点经由眼眶后出血将血液吸入柠檬酸盐管中，并处理成血浆。根据制造商的方案，使用人IgG ELISA试剂盒(StemcellTM Technologies)评估ADC的总浓度。曲妥珠单抗的标准曲线用于定量。通过使用结合了PK功能的
Figure BDA0002462220130000931
软件(由Usansky等人开发，Department ofPharmacokinetics and Drug Metabolism,Allergan,Irvine,USA)通过非隔室分析计算药代动力学参数(清除率和AUC)。结果显示在图3中。与不含聚肌氨酸的ADC相比，包含聚肌氨酸的ADC表现出有利的药代动力学。
实施例15：BT-474乳腺癌异种移植模型中单次静脉给药3mg/kg剂量的非基于聚肌 氨酸的ADC(ADC-PSAR0)和基于聚肌氨酸的ADC(ADC-PSAR12)的肿瘤体积(mm3)和生存曲线
将BT-474乳腺癌细胞皮下植入雌性SCID小鼠(4周龄)中。当肿瘤长至约150mm3时，将以上实施例14的ADC以3mg/kg的剂量单次静脉给药(第20天，每组5只动物，以使各组之间的初始肿瘤体积的差异最小化)。结果示于图4A和4B。通过卡尺装置每3-5天测量一次肿瘤体积，并使用公式(L×W2)/2计算。当肿瘤体积超过1000mm3时，处死小鼠。与不含聚肌氨酸的ADC相比，包含聚肌氨酸的ADC具有改进的体内活性。在治疗的小鼠中未观察到明显的体重变化。
实施例16：在单次静脉给药3mg/kg剂量的基于聚肌氨酸的抗体-药物-缀合物 (ADC-PSAR12)和基于聚(乙二醇)的抗体-药物-缀合物(ADC-PEG12)后，小鼠体内的药代动 力学特征(随时间的总抗体浓度)
根据实施例14中所述的方法，在雄性CD-1小鼠(4-6周龄)中进行实验。结果显示在图5中。与包含聚(乙二醇)的ADC相比，包含聚肌氨酸的ADC具有改进的药代动力学参数。
实施例17：BT-474乳腺癌异种移植模型中的肿瘤体积(mm3)，所述模型单次静脉给 药2.5mg/kg的在正交方向上具有不同PSAR长度的基于聚肌氨酸的抗体-药物-缀合物(ADC- PSAR6、ADC-PSAR12、ADC-PSAR18、ADC-PSAR24)；基于正交聚(乙二醇)的抗体-药物-缀合物 (ADC-PEG12)和基于线性聚肌氨酸的抗体-药物-缀合物(ADC-PSAR12L)
如实施例15中所述进行实验。将BT-474乳腺癌细胞皮下植入雌性SCID小鼠(4周龄)中。当肿瘤长至约150mm3时，以2.5mg/kg的剂量单次静脉给药ADC(第13天，每组6只动物，以使各组之间的初始肿瘤体积差异最小化)。结果显示在图6中。在治疗的小鼠中未观察到明显的体重变化。

Claims (17)

1.具有下式(XV)的配体-药物-缀合物(LDC)
Figure FDA0002462220120000011
其中，
L是允许(HPSMW)相对于(X-D)处于正交方向的正交连接体，
HPSMW是由具有式(I)的单分子量均聚物共价结合到所述正交连接体L产生的
Figure FDA0002462220120000012
其中
R1和R2不同，并且
R1和R2中的一个是H或惰性基团，R1和R2中的另一个是官能化反应性基团，在所述惰性基团是非反应性的反应条件下，所述基团对共价结合可结合基团具有反应性，
相同或不同的Z1和Z2是任选的间隔基，并且
n为1或更大和k为2或更大；
D是细胞毒性药物，
X是用于释放D的任选的可裂解部分，
Z是任选的间隔基，并且
a为1或更大，b为1或更大和m为1或更大。
2.权利要求1的LDC化合物，其中所述单分子量均聚物是聚肌氨酸。
3.权利要求1或2的LDC化合物，其中所述HPSMW是由具有式(II)的单分子量均聚物共价结合到所述正交连接体L产生的。
Figure FDA0002462220120000021
其中
R1、R2、Z1和Z2如权利要求1所定义，并且
K为2-100，优选2-50。
4.权利要求1-3中任一项的LDC化合物，其中R1或R2为官能化反应性基团，并且选自以下基团：
-羧酸基团，
-氨基NRR”，其中R和R”各自独立地选自H、任选地被选自O、N和S的至少一个杂原子中断的(C1-C6)烷基，
-羟基，
-卤素原子，
-肼(-NH2-NH2)基，
-硝基，
-羟胺基，
-叠氮基，
-(C2-C6)炔基，
-(C2-C6)烯基，
-硫醇基，
-活化酯基，诸如N-羟基琥珀酰亚胺酯、全氟酯、硝基苯酯、氮杂-苯并三唑和苯并三唑活化酯、酰脲，
-硼酸–B(OR””)2基团，其中R””是氢原子或C1-C6烷基，
-硫醇反应性基团，诸如马来酰亚胺、卤代马来酰亚胺、卤代乙酰基、吡啶基二硫化物，
-甲磺酸酯基，
-甲苯磺酸酯基，
-三氟甲磺酸酯基，
-醛基，
-异氰酸酯基或异硫氰酸酯基，
-氯磺酰基，
-丙烯酸酯基。
5.权利要求1-4中任一项的LDC化合物，其中所述配体选自下组：多肽、蛋白质、抗体和抗体片段。
6.权利要求1-5中任一项的LDC化合物，其中D选自下组：生物活性分子；治疗性分子，诸如抗癌药；显像剂和荧光团。
7.权利要求1-6中任一项的LDC化合物，其中L是一种或多种天然或非天然氨基酸。
8.权利要求1-7中任一项的LDC化合物，其中L选自谷氨酸、赖氨酸和甘氨酸。
9.权利要求1-8中任一项的LDC化合物，其中X选自
-一种或多种天然或非天然氨基酸，
-经由氧糖苷键连接到自消除基团的糖部分，
-二硫化物接头，和
-在溶酶体中可水解的酸不稳定接头。
10.权利要求1-9中任一项的LDC化合物，其中X选自
-一种或多种天然或非天然氨基酸，和
-经由氧糖苷键连接到自消除基团的糖部分。
11.权利要求1-10中任一项的LDC化合物，其中Z选自亚烷基；杂亚烷基；烷氧基；聚醚；一种或多种天然或非天然氨基酸；C3-C8杂环基；C3-C8碳环基；亚芳基；及其任何组合。
12.权利要求1-11中任一项的LDC化合物，其中Z是式(XVII)、(XVIII)、(XIX)、(XX)、(XXI)或(XXII)，
Figure FDA0002462220120000041
其中波浪键代表连接点并且R6是–C1-C10亚烷基-、–C1-C10杂亚烷基-、–C1-C10亚烷基-C(＝O)-、–C1-C10杂亚烷基-C(＝O)-、-亚芳基-C1-C10亚烷基-C(＝O)-、-亚芳基-C1-C10亚烷基-O-C(＝O)-，并且
R6基团中的任何一个任选地被一个或多个＝O取代。
13.具有式(XVI)的中间体化合物
Figure FDA0002462220120000042
Figure FDA0002462220120000051
其中
L是正交连接体，
HPSMW是由具有式(I)的单分子量均聚物共价结合到所述正交连接体L产生的
Figure FDA0002462220120000052
其中
R1和R2不同，并且
R1和R2中的一个是H或惰性基团，R1和R2中的另一个是官能化反应性基团，在所述惰性基团是非反应性的反应条件下，所述基团对共价结合可结合基团具有反应性，
相同或不同的Z1和Z2是任选的间隔基，并且
n为1或更大和k为2或更大；
D是细胞毒性药物，
X是用于释放D的任选的可裂解部分，
Z是任选的间隔基，并且
a为1或更大和b为0、1或更大。
14.权利要求13的中间体化合物，其中所述单分子量均聚物是聚肌氨酸。
15.权利要求1-12中任一项的LDC，其作为药物的用途。
16.具有式(XXIII)的化合物
Figure FDA0002462220120000053
其中
R6是–C1-C10亚烷基-、–C1-C10杂亚烷基-、-C3-C8碳环基-、-O-(C1 C8烷基)-、-亚芳基-、–C1-C10亚烷基-亚芳基-、-亚芳基-C1-C10亚烷基-、–C1-C10亚烷基-(C3-C8碳环基)-、-(C3-C8碳环基)-C1-C10亚烷基-、-C3-C8杂环基-、–C1-C10亚烷基-(C3-C8杂环基)-、-(C3-C8杂环基)–C1-C10亚烷基-、–C1-C10亚烷基-C(＝O)-、–C1-C10杂亚烷基-C(＝O)-、-C3-C8碳环基-C(＝O)-、-O-(C1-C8烷基)-C(＝O)-、-亚芳基-C(＝O)-、-C1-C10亚烷基-亚芳基-C(＝O)-、-亚芳基-C1-C10亚烷基-C(＝O)-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8碳环基)-C(＝O)-、-(C3-C8碳环基)-C1-C10亚烷基-C(＝O)-、-C3-C8杂环基-C(＝O)-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8杂环基)-C(＝O)-、-(C3-C8杂环基)-C1-C10亚烷基-C(＝O)-、-C1-C10亚烷基-NH-、-C1-C10杂亚烷基-NH-、-C3-C8碳环基-NH-、-O-(C1-C8烷基)-NH-、-亚芳基-NH-、-C1-C10亚烷基-亚芳基-NH-、-亚芳基-C1-C10亚烷基-NH-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8碳环基)-NH-、-(C3-C8碳环基)-C1-C10亚烷基-NH-、-C3-C8杂环基-NH-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8杂环基)-NH-、-(C3-C8杂环基)-C1-C10亚烷基-NH-、-C1-C10亚烷基-S-、-C1-C10杂亚烷基-S-、-C3-C8碳环基-S-、-O-(C1-C8烷基)-)-S-、-亚芳基-S-、-C1-C10亚烷基-亚芳基-S-、-亚芳基-C1-C10亚烷基-S-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8碳环基)-S-、-(C3-C8碳环基)-C1-C10亚烷基-S-、-C3-C8杂环基-S-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8杂环基)-S-、-(C3-C8杂环基)-C1-C10亚烷基-S-、–C1-C10亚烷基-O-C(＝O)-、-C3-C8碳环基-O-C(＝O)-、-O-(C1-C8烷基)-O-C(＝O)-、-亚芳基-O-C(＝O)-、-C1-C10亚烷基-亚芳基-O-C(＝O)-、-亚芳基-C1-C10亚烷基-O-C(＝O)-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8碳环基)-O-C(＝O)-、-(C3-C8碳环基)-C1-C10亚烷基-O-C(＝O)-、-C3-C8杂环基-O-C(＝O)-、-C1-C10亚烷基-(C3-C8杂环基)-O-C(＝O)-、-(C3-C8杂环基)-C1-C10亚烷基-O-C(＝O)-，
R6基团中的任何一个任选地被一个或多个选自以下的取代基取代:-X、-R’、-O-、-OR’、＝O、-SR’、-S-、-NR’2、-NR’3 +、＝NR’、-CX3、-CN、-OCN、-SCN、-N＝C＝O、-NCS、-NO、-NO2、＝N2、-N3、-NR’C(＝O)R’、-C(＝O)R’、-C(＝O)NR’2、-SO3 -、-SO3H、-S(＝O)2R’、-OS(＝O)2OR’、-S(＝O)2NR’、-S(＝O)R’、-OP(＝O)(OR’)2、-P(＝O)(OR’)2、-PO3 -、-PO3H2、-C(＝O)X、-C(＝S)R’、-CO2R’、-CO2、-C(＝S)OR’、C(＝O)SR’、C(＝S)SR’、C(＝O)NR’2、C(＝S)NR’2和C(＝NR’)NR’2，其中每个X独立地是卤素:-F、-CI、-Br、或–I；并且每个R’独立地是-H、-C1C20烷基、-C6-C20芳基、或-C3-C14杂环型基，
Z是任选的间隔基，
L是正交连接体，
X是用于释放D的任选的可裂解部分，
D是细胞毒性药物，
a为1或更大和b为0、1或更大，并且
HPSMW是由具有式(I)的单分子量均聚物共价结合到所述正交连接体L产生的
Figure FDA0002462220120000071
其中
R1和R2不同，并且
R1和R2中的一个是H或惰性基团，R1和R2中的另一个是官能化反应性基团，在所述惰性基团是非反应性的反应条件下，所述基团对共价结合可结合基团具有反应性，
相同或不同的Z1和Z2是任选的间隔基，并且
n为1或更大和k为2或更大。
17.权利要求16的化合物，其中所述单分子量均聚物是聚肌氨酸。
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