CN111388649B

CN111388649B - 一种富血小板血浆胎盘多肽组合物及其应用

Info

Publication number: CN111388649B
Application number: CN202010194940.4A
Authority: CN
Inventors: 吕敏
Original assignee: Hangzhou Sanjiang Shangyu Biotechnology Co ltd
Current assignee: Hangzhou Sanjiang Shangyu Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-03-19
Filing date: 2020-03-19
Publication date: 2023-09-12
Anticipated expiration: 2040-03-19
Also published as: CN111388649A

Abstract

本发明公开了一种富血小板血浆胎盘多肽组合物及其在制备免疫调节剂中应用，所述组合物由富血小板血浆与胎盘多肽以体积比1:1‑4混合而成。本发明富血小板血浆胎盘多肽组合物可以显著降低IL‑4和IL‑5，提高IFN‑γ达到治疗哮喘的目的，且效果比单用组更加明显，能够达到更好的增强免疫力效果。

Description

一种富血小板血浆胎盘多肽组合物及其应用

(一)技术领域

本发明涉及一种多肽组合物，特别涉及一种注射用富血小板血浆胎盘多肽组合物及其制备方法与应用。

(二)背景技术

目前已有较为成熟的胎盘多肽的提取技术(专利申请号201510995668.9)，胎盘多肽含有多种活性成分，尤其是细胞因子、生长因子，对于抗氧化、延缓衰老、抗肿瘤、抗感染、修复损伤组织、调节内分泌及治疗各类妇科病具有明显疗效，胎盘多肽还具有抑制机体的过氧化反应，可以消除自由基达到抗衰老的目的。

富血小板血浆(platelet-richplasma,PRP)是指全血经过离心、分离而得到的高度浓缩的产物，其血小板水平通常为正常全血的4～5倍以上。PRP中含有血小板源生长因子、β-转化生长因子、血管内皮生长因子、表皮生长因子、类胰岛素生长因子、成纤维细胞生长因子等各种生长因子。目前已有临床结果表明，注射PRP可以治疗骨关节炎，促进血管生成，外科修复等。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种富血小板血浆胎盘多肽组合物及制备方法，解决目前单用胎盘多肽注射液或者PRP功效单一、且效果不稳定的问题，使治疗效果更加明显且提高免疫力。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种富血小板血浆胎盘多肽组合物，所述组合物由富血小板血浆与胎盘多肽以体积比1:1-4混合而成。

进一步，所述富血小板血浆按如下方法制备：

(1)将含体积浓度10％抗凝剂的全血(优选外周血)，加入水平离心机中离心，获得上清液和沉淀，分别记为上清液A和沉淀B；所述抗凝剂为枸橼酸钠；

(2)用生理盐水以体积比1：1的比例稀释沉淀B，离心，收集上清液，记为上清液C；

(3)将上清液A和上清液C混合均匀后，置于4℃冰箱25分钟，得到混合液，记为混合液D；

(4)将混合液D离心，收集上清液，即获得富血小板血浆。

进一步，步骤(1)和步骤(2)离心条件均为1000rpm、4℃下离心10分钟。

进一步，步骤(4)离心条件为2000rpm、4℃下离心5分钟。

进一步，所述胎盘多肽为胎盘多肽注射液，优选购自贵州泰邦生物制品有限公司生产的胎盘多肽注射液，产品批号为201803014。

本发明还提供一种所述富血小板血浆胎盘多肽组合物在制备免疫调节剂中的应用，所述调节剂为降低IL-4或IL-5表达的制剂；所述调节剂为提高IFN-γ表达的制剂；所述调节剂为提高IgG、IgE、IgM或IgA表达的制剂。

与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：本发明富血小板血浆胎盘多肽组合物可以显著降低IL-4和IL-5表达，提高IFN-γ表达，达到治疗哮喘的目的，且效果比单用组更加明显，能够达到更好的增强免疫力效果。

(四)附图说明

图1：治疗前后免疫球蛋白变化情况比较采用LSD单因素方差多重比较，字母差异代表显著性差异。

图2：治疗前后免疫球蛋白变化情况比较采用LSD单因素方差多重比较，字母差异代表显著性差异。

图3：治疗前后免疫球蛋白变化情况比较采用LSD单因素方差多重比较，字母差异代表显著性差异。

图4：各组大鼠血清IL-4、IL-5、IFN-γ含量比较(x±s)(pg/ml)。采用LSD 单因素方差多重比较，字母差异代表显著性差异。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：

1、富血小板血浆的制备：

(1)将含体积浓度10％枸橼酸钠(抗凝剂)的外周血全血30ml，加入水平离心机中，在离心条件为1000rpm、4℃下离心10分钟，获得8ml上清液(记为上清液A)， 22ml沉淀(记为沉淀B)；

(2)用22ml生理盐水以体积比1：1的比例稀释沉淀B，然后在1000rpm、4℃下离心10分钟，收集10ml上清液，记为上清液C；

(3)将8ml上清液A和10ml上清液C混合均匀后，置于4℃冰箱25分钟，得到18ml混合液，记为混合液D。

(4)将混合液D在2000rpm、4℃下离心5分钟，收集上清液，即获得富血小板血浆16ml。

2、胎盘多肽：

胎盘多肽购自贵州泰邦生物制品有限公司生产的胎盘多肽注射液，产品批号为201803014。

3、富血小板血浆胎盘多肽组合物的制备：

将步骤1制备的富血小板血浆与步骤2的胎盘多肽以体积比为1：1混合即为富血小板血浆胎盘多肽组合物，其中富血小板血浆18ml，胎盘多肽注射液18ml。

哮喘患者取正坐位，每次取2～4穴，皮肤常规消毒，取5ml注射器抽取富血小板血浆胎盘多肽组合物(联合组)2ml左右，在穴位(肺俞、定喘、足三里)上斜刺约10～15mm，缓慢提插至有针感，抽吸针筒无回血后，注入药液(每穴注入药液0.2～ 0.4ml)，隔日一次，6-10次为一疗程，分别于治疗前、治疗后1个月检测免疫球蛋白变化情况，同样条件下以步骤1制备的富血小板血浆(PRP组)和步骤2的胎盘多肽 (胎盘多肽组)为对照，结果见图1所示。四项免疫学指标表明，三种治疗组均在不同程度对免疫球蛋白指标有改善作用。其中PRP组和胎盘多肽组对IgE有显著效果，对其他指标有一定效果但统计学不显著；而联合组对IgG、IgE、IgM以及IgA均有显著效果，效果优于PRP组和胎盘多肽组，体现了联合组的治疗优势。

实施例2：

1、富血小板血浆的制备：

(1)将含体积浓度10％枸橼酸钠抗凝剂的外周血全血20ml，加入水平离心机离心，在离心条件为1000rpm、4℃下离心10分钟，获得6ml上清液(记为上清液A)， 14ml沉淀(记为沉淀B)；

(2)用14ml生理盐水以体积比1：1的比例稀释沉淀B，然后在1000rpm、4℃条件下离心10分钟，收集8ml上清液，记为上清液C；

(3)将6ml上清液A和8ml上清液C混合均匀后，置于4℃冰箱25分钟，得到14ml混合液，记为混合液D。

(4)将混合液D在2000rpm、4℃离心5分钟，收集上清液，获得富血小板血浆 12ml。

2、胎盘多肽：

3、富血小板血浆胎盘多肽组合物的制备：

将步骤1制备的富血小板血浆和步骤2的胎盘多肽以体积比1:2混合即为富血小板血浆胎盘多肽组合物，其中富血小板血浆14ml，胎盘多肽注射液28ml。

哮喘患者取正坐位，每次取2～4穴，皮肤常规消毒，取5ml注射器抽取注射用富血小板血浆胎盘多肽组合物(联合组)2ml左右，在穴位(同实施例1)上斜刺约 10～15mm，缓慢提插至有针感，抽吸针筒无回血后，注入药液(每穴注入药液0.2～ 0.4ml)，隔日一次，6-10次为一疗程。分别于治疗前、治疗后1个月检测免疫球蛋白变化情况，同样条件下以步骤1制备的富血小板血浆(PRP组)和步骤2的胎盘多肽 (胎盘多肽组)为对照，结果见图2所示。四项免疫学指标表明，三种治疗组均在不同程度对免疫球蛋白指标有改善作用。其中PRP组和胎盘多肽组对IgE有显著效果、胎盘多肽组对IgA有显著效果，二者其他指标有一定效果但统计学不显著；联合组对 IgG、IgE、IgM以及IgA均有显著效果，效果优于PRP组和胎盘多肽组，体现了联合组的治疗优势。

实施例3：

1、富血小板血浆的制备：

(1)将含体积浓度10％抗凝剂的外周血全血10ml，加入水平离心机，在离心条件为1000rpm、4℃下离心10分钟，获得3ml上清液(记为上清液A)，7ml沉淀(记为沉淀B)；

(2)用7ml生理盐水以体积比1：1的比例稀释沉淀B，然后在1000rpm4℃条件下离心10分钟，收集5ml上清液，记为上清液C；

(3)将3ml上清液A和5ml上清液C混合均匀后，置于4℃冰箱25分钟，得到8ml混合液，记为混合液D。

(4)将混合液D以2000rpm，4℃离心5分钟，收集上清液，即获得富血小板血浆6ml。

2、胎盘多肽：

3、富血小板血浆胎盘多肽组合物的制备：

将步骤1制备的富血小板血浆和步骤2的胎盘多肽以体积比1：4混合，即制得富血小板血浆胎盘多肽组合物，其中富血小板血浆8ml，胎盘多肽注射液32ml。

哮喘患者取正坐位，每次取2～4穴，皮肤常规消毒，取5ml注射器抽取注射用富血小板血浆胎盘多肽组合物2ml左右，在穴位(同实施例1)上斜刺约10～15mm，缓慢提插至有针感，抽吸针筒无回血后，注入药液(每穴注入药液0.2～0.4ml)，隔日一次，6-10次为一疗程。分别于治疗前、治疗后1个月检测免疫球蛋白变化情况，同样条件下以步骤1制备的富血小板血浆(PRP组)和步骤2的胎盘多肽(胎盘多肽组) 为对照，结果见图3所示。四项免疫学指标表明，三种治疗组均在不同程度对免疫球蛋白指标有改善作用。其中PRP组和胎盘多肽组对IgE有显著效果，二者其他指标有一定效果但统计学不显著；联合组对IgG、IgE、IgM以及IgA均有显著效果，效果优于PRP组和胎盘多肽组，体现了联合组的治疗优势。

实施例4

选取6周龄的SPF级雄性BALB/c小鼠40只，体质量(20.50±2.15)g，随机分为 5组(对照组、模型组、胎盘多肽组、PRP组和联合组)，每组各8只，饲养于浙江中医药大学动物中心，正常适应性喂养3天后开始实验。普通饲料，自由饮水。

除对照组外的其余组小鼠建立支气管哮喘模型，方法：分别于第1、4、7、10、 13天腹腔注射浓度为50μg/L的卵清蛋白(OVA)混悬液(氢氧化铝400μg和OVA 100μg 用0.1mol/LPBS配制)，每天1次，每次1ml。第14天开始给予各组(对照组除外) 雾化吸入OVA液50μl(OVA1mg，用0.1mol/L PBS溶解)，每次30min，每天1次，连续激发1周。对照组操作方法同上，但以0.9％氯化钠注射液代替OVA混悬液和 OVA液。

雾化激发后，连续观察小鼠头面部瘙痒情况、呼吸、行为变化10min，以下各项指标均采用叠加量化记分法评分，总分>5分表示动物模型行为学改变，符合过敏性哮喘动物模型的行为学改变。第一、头面部瘙痒情况：无抓痒头面部为0分，轻瘙头面部1-2次为1分，剧烈搔抓头面部为2分；第二、呼吸情况：平稳0分，呼吸急促1分，呼吸困难2分，呼吸困难伴有喘鸣音或黏液分泌3分，呼吸不规则或猝死4分；第三、行动情况：行动自由为0分，安静少动为1分，行动迟滞为2分，俯伏不动为 3分。

胎盘多肽组、PRP组和联合组从第17天开始给药，穴位注射，每次注射2穴点，双肺俞穴和双肾俞穴轮流取穴，单穴点各注射0.4mL实施例1步骤2胎盘多肽 (胎盘多肽组)，0.4mL实施例1制备的富血小板血浆(PRP组)，0.4mL实施例1 制备的富血小板血浆胎盘多肽组合物(联合组)，隔天1次穴注，前后共6次为1疗程，给药结束后，心脏取血，提取血清，用ELISA检测血清中IL-4、IL-5、IFN-γ含量，同样条件下，对照组和模型组采用生理盐水穴注，结果见图4。

支气管哮喘的发作过程主要是多种炎症细胞表面的受体及这些炎症细胞产生的炎症介质和细胞因子通过一系列复杂的抗原递呈过程共同完成的，可称之为哮喘发病的免疫—炎性机制，其中辅助性T细胞1(Th1)/Th2细胞功能失衡是支气管哮喘发病的重要免疫学机制之一，主要表现为Th1细胞功能低下，Th2细胞功能亢进IFN-γ为Th1 细胞的代表性细胞因子，可促进Th1细胞分化，阻碍Th2细胞形成及减少其主要细胞因子IL-4分泌，可降低IgE水平和气道高反应性。而IL-4作为最具有代表性的Th2细胞因子，能够刺激B淋巴细胞的转化与增殖，促进IgE合成，促进EOS的趋化和浸润及肥大细胞释放组胺、白三烯等活性物质。同时，IL-5也能促进嗜碱性粒细胞释放组胺和白三烯等炎症介质。

从图4看PRP和胎盘多肽联合组可以显著降低IL-4和IL-5表达，提高IFN-γ表达，达到治疗哮喘的目的，且效果比单用组更加明显。

Claims

1.一种富血小板血浆胎盘多肽组合物在制备治疗支气管哮喘的免疫调节剂中的应用；

所述富血小板血浆胎盘多肽组合物由富血小板血浆与胎盘多肽以体积比1:1-4混合而成；

所述富血小板血浆按如下方法制备：

(1)将含体积浓度10％抗凝剂的全血，离心，获得上清液和沉淀，分别记为上清液A和沉淀B；

(4)将混合液D离心，收集上清液，即制得富血小板血浆；

所述胎盘多肽为胎盘多肽注射液，为贵州泰邦生物制品有限公司生产。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述调节剂为降低IL-4或IL-5表达的制剂。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述调节剂为提高IFN-γ表达的制剂。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述调节剂为抑制IgE表达，提高IgG、IgM或IgA表达的制剂。

5.如权利要求1所述的应用，其特征在于步骤(1)和步骤(2)离心条件均为1000rpm、4℃下离心10分钟。

6.如权利要求1所述的应用，其特征在于步骤(4)离心条件为2000rpm、4℃下离心5分钟。

7.如权利要求1所述的应用，其特征在于抗凝剂为枸橼酸钠。