CN111363813A - 非小细胞肺癌的生物标志物、检测方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及对于非小细胞肺癌的生物相关联的生物标志物的检测，具体提供了一种非小细胞肺癌生物标志物、检测方法及其应用，生物标志物为BLMH或VAT1，可通过检测生物标志物的蛋白质或蛋白质片段或编码生物标志物的mRNA的表达水平来确定该生物标志物的表达水平，同时还提供了一种能够检测所述的非小细胞肺癌生物标志物存在的物质在制备用于指示对象中非小细胞肺癌的试剂盒或诊断试剂或检测系统中的应用。本发明已鉴定非小细胞肺癌与BLMH或VAT1表达上调之间的关系，BLMH或VAT1作为非小细胞肺癌的特异性生物标志物，具有重要的临床意义。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体的说，本发明涉及非小细胞肺癌的生物标志物、检测 方法及应用。
背景技术
肺癌是发病率和死亡率增长最快，对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。近50年 来许多国家都报道肺癌的发病率和死亡率均明显增高，男性肺癌发病率和死亡率均占所有恶 性肿瘤的第一位，女性发病率占第二位，死亡率占第二位。肺癌的病因至今尚不完全明确， 城市居民肺癌的发病率比农村高，这可能与城市大气污染和烟尘中含有致癌物质有关。
肺癌可以分为小细胞肺癌(SCLC)和非小细胞肺癌(NSCLC)，其中后者占大约80％。非小细胞肺癌又可以分为三类：(i)鳞状细胞癌，其在鳞状细胞中开始，所述鳞状细胞是看起来象鱼鳞的薄的、扁平细胞。鳞状细胞癌也称为表皮样癌；(ii)大细胞癌，其在几个类型的大肺细胞中开始；(iii)腺癌，其在内衬肺的肺泡并且制备物质例如粘液的细胞中开始。其 他较不常见类型的NSCLC包括多形性癌、类癌瘤和未分类的癌。导致肺癌发生的因素有很 多，吸烟、遗传因素，放射性氡气、石棉等都是风险因素。
肺癌的死亡率高，五年生存率不足15％。一个重要的原因是早期诊断率低，不足2％， 80％以上患者就诊时已在晚期。目前的诊断方法有X-射线检查、CT扫描、支气管镜检、痰 细胞学检查以及肺癌生物标志物检测等。这些方法都存在各自的缺陷，如影像学技术难以发 现瘤体较小的肿瘤，早期普查的漏检率较高。已有的肺癌标志物是广谱的，无法确诊肺癌， 因此寻找特异性的肺癌生物标志物具有重要的意义。
到目前为止，肺癌的早期诊断率仍有待提高。此外，在我国传统的肺癌手术加化疗以及 近年来配合使用的多种基因治疗方法仍没有明显提高肺癌患者的生存率，因而寻找新的肺癌 相关基因尤其是肺癌高表达基因对于探讨肺癌的发病机制和早期诊断具有重要意义。
发明内容
本发明目的在于解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点，本发明还有一个目 的是提供非小细胞肺癌的生物标志物、检测方法及应用，该生物标志物为BLMH(博来霉素 水解酶)或VAT1(重组人小泡胺运输蛋白1同源物)，BLMH的HGNC登录号为1059；Entrez Gene登录号为642；Ensembl登录号为ENSG00000108578；OMIM登录号为602403；UniProtKB登录号为Q13867，VAT1的HGNC登录号为16919；Entrez Gene登录号为10493；Ensembl登录号为ENSG00000108828；OMIM登录号为604631；UniProtKB登录号为Q99536。
为了实现上述目的和其他优点，本发明通过筛选在人类非小细胞肺癌组织及相应的癌旁 组织中差异表达的蛋白质，本申请的发明人找到了两种在非小细胞肺癌组织及相应的癌旁组 织中存在差异表达的蛋白质(在癌组织中上调表达)，经质谱鉴定为BLMH和VAT1，可作为非 小细胞肺癌的生物标志物。
作为本发明的一个目的，提供了一种用于检测非小细胞肺癌生物标志物表达的物质在制 备用于指示对象中非小细胞肺癌的试剂或试剂盒或检测系统中的应用。所述的生物标志物即 为BLMH或VAT1。
优选的，试剂或试剂盒或检测系统用于包括如下步骤的方法：(a)检测该对象中生物标 志物的表达水平；(b)将所述对象中的生物标志物的表达水平与生物标志物的参比表达水平 相比较；(c)基于所述比较来指示所述对象中的非小细胞肺癌；(d)所述对象中生物标志物 的表达水平高于生物标志物的临界值时指示所述对象为非小细胞肺癌。
优选的，在获自所述对象的检测样品中检测所述生物标志物的表达水平。
优选的，所述检测样品为对象的血清样品或组织样品。
一种检测所述的生物标志物表达水平的方法，通过检测所述生物标志物的蛋白质或编码 生物标志物的mRNA测定。此处所述蛋白质既包括完整的蛋白质分子，也包括肽段。
优选的，所述的肽段的长度为5-50个氨基酸，优选8-30个氨基酸，更优选为8-25个氨 基酸。
优选的，使用能够与所述的生物标志物蛋白质特异性结合的物质测定生物标志物的表达 水平。
优选的，能够与所述的生物标志物蛋白质特异性结合的物质为抗体或与酶分子结合的抗 体。
优选的，所述的抗体为单克隆抗体或多克隆抗体或多特异性抗体(例如双特异性抗体)或 完整分子的片段(例如能够结合响应抗原的Fab和F(ab')2)。此处所述的单克隆抗体包括全 长的单克隆抗体。
采用本发明至少具有如下有益效果：本发明所提供的生物标志物的表达水平的高低可以 为非小细胞肺癌的早期诊断提供更可靠和灵敏的检测依据，有助于提高肺癌的早期诊断率。
本发明的其他优点、目的和特征将通过下面的实施例具体说明体现。
附图说明
图1实施例2 BLMH差异蛋白验证结果图
图2实施例3 VAT1差异蛋白验证结果图
图3实施例4 BLMH差异蛋白进一步验证结果图
图4实施例5 VAT1差异蛋白进一步验证结果图
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明 而非用于限定本发明的范围。
通过筛选在人类肺癌组织及相应的癌旁组织中差异表达的蛋白质，本申请的发明人找到 了两种在肺癌组织及相应的癌旁组织中存在差异表达的蛋白质(在癌组织中上调表达)，经质 谱鉴定为BLMH和VAT1。免疫印迹实验证实，BLMH和VAT1的确在肺癌组织及相应的癌 旁组织中存在差异表达(在癌组织中表达上调)。通过对55对人肺癌的癌组织与癌旁组织进行 的免疫组织化学实验进一步证实了BLMH和VAT1在人类肺癌的癌组织与癌旁组织中存在差 异表达(在癌组织中表达上调)，并且血清的免疫学实验也显示了BLMH和VAT1在人类非小 细胞肺癌患者中高表达。
实施例中，发明人用酶解样品制备法(enzymatic sample preparation,ESP)制备的肺癌的 癌组织与癌旁组织蛋白质样品，以非标记定量的方法鉴定差异蛋白质。结果发现BLMH和 VAT1在肺癌癌组织中高表达。免疫印迹实验和免疫组织化学实验进一步证实BLMH和VAT1 的确在肺癌的癌组织与癌旁组织中存在差异表达。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克 隆:实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制 造厂商所建议的条件。下列实施例中所用组织样品和血清样品均来自临床医生提供。
在本发明的下述实施例中，尿素、3-[(3_胆酰胺丙基)_二乙铵]-1-丙磺酸(CHAPS)、十二 烷基磺酸钠(SDS)、二硫苏糖醇(DTT)、三(羟甲基)氨基乙烷(Tris)、碘代乙酰胺(IAA)购自 Bio-Rad公司；β-巯基乙醇等化学试剂购自Sigma公司；胰蛋白酶(Trypsin,sequencing grade) 购自Promega公司；SCX柱和SAX柱以及pH缓冲液试剂盒购自waters公司。
在本发明的下述实施例中，使用的溶液配方如下:
裂解液:8mol/L尿素、4％CHAPS、40mmol/L Tris和65mmol/L DTT。
TBST：Tris 2.42g/L，氯化钠8g/L,Tween_201ml/L，用HCl调节pH到7.6。
实施例1差异表达蛋白的筛选
(1)非小细胞肺癌的癌组织及癌旁组织蛋白质样品的制备
因此，以BLMH或VAT1作为一个蛋白质分子标记物对它的表达量进行检测可以用于检 测非小细胞肺癌，即BLMH或VAT1可以用作检测非小细胞肺癌的蛋白质分子。
8例肺癌患者的癌组织及癌旁组织，该8例患者，均由2名病理科医生确诊，患有肺癌， 8例患者的病理资料如表1所示。
表1：8例非小细胞肺癌患者的病理资料。
以溶液内酶解样品制备法制备上述8例患者的肺癌的癌组织及癌旁组织蛋白质样品(所用 癌组织及癌旁组织样品均为取自同一肺癌患者的成对样品)，具体过程如下:
手术切除的新鲜组织块迅速置于冰上，快速切成几个肉眼可见、无坏死区域的小块。用 预冷的PBS溶液洗涤组织小块数次后，在液氮中快速研磨成细胞沉淀，然后将细胞沉淀分别 溶于裂解液中，然后于冰浴条件下，使用超声细胞破碎仪(Soniprep 150,英国，MSE公司)间歇 超声破碎2min后，于15000g/min、4℃离心1h，取上清，以改良的Bradford法(见Bio-Rad 公司产品说明书)进行总蛋白质定量。
(2)癌组织及癌旁组织的差异表达蛋白的筛选
采用非标记定量技术(参照Tu C et al.J Proteome Res.2018 Sep 7；17(9):2963-2977.；Ma Det al.J Proteome Res.2018 Mar 2；17(3):1300-1308.)结合溶液内酶解技术与液相色谱串联质谱技术 (参照Tu C et al.J Proteome Res.2018 Sep 7；17(9):2963-2977.；Ma Det al.J Proteome Res.2018 Mar 2；17(3):1300-1308.)进行差异表达蛋白的筛选。
取步骤(1)中获得的8对肺癌组织及癌旁组织蛋白质样品各100ug，运用溶液内酶解技 术将其酶解成肽段，除去样品中的盐等杂质。肽段混合物用完全自动化的多维液相色谱串联 质谱仪LTQTMFusionTM(购自Thermo Fisher公司)进行分析，得到的原始数据采用IonStar软 件(美国纽约州立大学)进行数据库搜索和定量分析，定量结果如表3所示。
所述肽段应当与样品中的蛋白或其经过酶解(如胰蛋白酶酶解)后得到的片段的序列完全 一致。为方便操作，所述肽段的长度宜为5-50个氨基酸，优选8-30个氨基酸，更优选为8-25 个氨基酸。此外，所述肽段的最佳Transition应有较好的信噪比。所述宜经过重同位素(例如 13C，14N)标记，以便将其与未经标记的样品相区分。本实施例所述检测的肽段序列如表2 所示。
表2所采用的BLMH或VAT1肽段序列
对患有肺癌患者进行早期检测的步骤包括将一定量的经过重同位素标记的片段加入经酶 (如胰蛋白酶)消化的患者血清样品中，用定量蛋白质组学的技术检测患者血清中所述片段的 水平，从而确定血清中生物标志物的水平；将所测得的水平与根据正常人的水平确定的临界 值比较，如果所测得的水平高于临界值，则表示该对象患有非小细胞肺癌。
所述临界值可以由本领域技术人员根据常规手段来确定。例如，本领域技术人员可以根 据测得的正常人(组)的血清蛋白质含量数据来绘制受试者工作特征曲线(ROC曲线)，随后确定 临界值(cut-off)。
当然，定量蛋白质组学技术可以和以合成肽段为基础的绝对定量技术(absolutequantification analysis,AQUA)相结合，这样就可以直接对多个样品中的生物标志物直接进行 绝对含量的检测。将所测得的水平与正常对照血清的水平比较，如果所测得的水平高于正常 对照血清的水平，则表示该对象患有肺癌。
表3：肺癌组织及癌旁组织中BLMH和VAT1的定量结果：
根据表3的结果，BLMH和VAT1在非小细胞肺癌组织中的表达含量与癌旁组织相比，在非小细胞肺癌组织中高表达2倍以上，非小细胞肺癌组织中表达明显上调。
实施例2 BLMH差异表达蛋白的验证
另取6对肺癌组织及相应的癌旁组织的蛋白质样品，其病理资料如表4所示。
表4：6例肺癌标本的病理资料
使用购买的BLMH抗体对上述6对肺癌组织及相应的癌旁组织的蛋白质样品进行免疫 印迹分析，过程如下：
每个样品取20ug蛋白质样品用12％SDS-PAGE分离，转移至PVDF膜(购自GEHealthcare 公司)上；
一抗使用兔抗人BLMH多克隆抗体(购自Abcam公司，1:1000稀释)，4℃孵育过夜，用TBST洗涤三次，每次5分钟；
二抗为抗兔抗体(购自Santa Cruz公司，I:10000稀释)，室温孵育I小时，再用TBST洗 涤三次，每次10分钟；
加入ECL plus试剂(购自GE Healthcare公司)反应5分钟后，以X-光片曝光检测。
对免疫印迹图谱采用Gel-Pro Analyzer凝胶定量分析软件(Media Cybernetic公司)进行数 据分析，得出蛋白质表达量的相对分布图，结果如图1所示。
图1结果显示，BLMH在肺癌组织中的表达量明显高于相应的癌旁组织，其平均比值为2.8，P值(配对t检验)小于0.001。
根据图1结果显示，BLMH在肺癌组织存在高表达，该结果与质谱结果一致。
实施例3VAT1差异表达蛋白的验证
使用购买的VAT1抗体对上述实施例2中6对肺癌组织及相应的癌旁组织的蛋白质样品 进行免疫印迹分析，过程与上述BLMH抗体免疫印迹实验步骤相同，但将一抗中的BLMH多克隆抗体替换为VAT1多克隆抗体(购自Santa Cruz公司，1:200稀释)，同样的对免疫印迹图谱采用Gel-Pro Analyzer凝胶定量分析软件(Media Cybernetic公司)进行数据分析，得出蛋白 质表达量的相对分布图，结果如图2所示。
图2结果显示，VAT1在肺癌组织中的表达量明显高于相应的癌旁组织，其在肺癌组织中 的平均比值为3.56，P值(配对t检验)小于0.001。
根据图3的结果显示，VAT1在肺癌组织中存在高表达，该结果与质谱结果一致。
实施例4BLMH差异表达蛋白的进一步验证
随机选取35例肺癌患者的血清和35例正常人血清样本，进行酶联免疫吸附测定，其中， 选取的样本的具体资料分别如表5所示。具体步骤如下：购自Abcam公司的Elisa试剂盒预 处理，然后加入稀释过的血清4℃过夜，洗涤缓冲液(含0.05％吐温-20)洗3次，每次5分 钟，加入显色液反应1小时，洗涤缓冲液(含0.05％吐温-20)洗3次，每次5分钟，分析结果。
表5选取样本的具体资料
根据酶联免疫吸附测定的结果得到图3:统计发现，BLMH在肺癌的患者血清中高表达， P值(配对t检验)小于0.001，具有统计学意义。该结果与前面的质谱结果、免疫印迹结果以 及免疫组化结果相一致。
实施例5VAT1差异表达蛋白的进一步验证
采取上述表5中随机选取的35例肺癌患者的血清和35例正常人血清样本，进行酶联免 疫吸附测定，具体步骤如下：购自Abcam公司的Elisa试剂盒预处理，然后加入稀释过的血 清4℃过夜，洗涤缓冲液(含0.05％吐温-20)洗3次，每次5分钟，加入显色液反应1小时， 洗涤缓冲液(含0.05％吐温-20)洗3次，每次5分钟，分析结果。
根据酶联免疫吸附测定的结果得到图4:统计发现，VAT1在肺癌的患者血清中高表达，P 值(配对t检验)小于0.001，具有统计学意义。该结果与前面的质谱结果、免疫印迹结果以及 免疫组化结果相一致。
综上所述，BLMH和VAT1在肺癌的癌组织和癌旁组织中存在明显的差异表达，并且在 肺癌患者的血清中表达升高，与肺癌的发生发展有着密切的相关性，因此它的表达量可以用 于检测肺癌。相应的，特异性BLMH或VAT1的抗体，包括各种BLMH或VAT1的单克隆抗 体和多克隆抗体，由于其能够用于检测BLMH或VAT1的表达量，因而可以用于检测肺癌， 或者用于制备检测肺癌的制剂或试剂盒，这对于本领域的技术人员来说是显而易见的。
当然还可以通过测定生物标志物的编码mRNA的表达水平，从而测定生物标志物的表达 水平。具体可采用qPCR等方法。
本实施方式中虽列举了几种具体的免疫实验方式，但并不排除其他检测的免疫实验也落 入本发明保护范围。
Claims (10)
1.非小细胞肺癌生物标志物，其中所述的生物标志物为BLMH或VAT1。
2.一种能够检测权利要求1所述的非小细胞肺癌生物标志物存在的物质在制备用于指示对象中非小细胞肺癌的试剂或试剂盒或检测系统中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述试剂或试剂盒或检测系统用于包括如下步骤的方法：
(a)检测对象中生物标志物的表达水平；
(b)将所述的对象中生物标志物的表达水平与生物标志物的临界值相比较；和
(c)基于所述比较来指示所述对象中的非小细胞肺癌；
(d)所述对象中生物标志物的表达水平高于生物标志物的临界值时指示所述对象为非小细胞肺癌。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的生物标志物将在对象的检测样品中被检测。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述检测样品是所述对象的血清样品或组织样品。
6.一种检测权利要求1所述的生物标志物表达水平的方法，通过检测所述生物标志物的蛋白质或编码生物标志物的mRNA测定。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的蛋白质采用蛋白的片段，所述片段的长度为5-50个氨基酸，优选8-30个氨基酸，更优选为8-25个氨基酸。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，使用能够与权利要求1所述的生物标志物的蛋白质特异性结合的物质测定生物标志物的表达水平。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的能够与权利要求1所述的生物标志物蛋白质特异性结合的物质为抗体或与酶分子结合的抗体。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的抗体为单克隆抗体或多克隆抗体或多特异性抗体或完整分子的片段。
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