CN111735946A - 血清aldh1b1自身抗体定量检测试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种血清ALDH1B1自身抗体定量检测试剂盒及其应用。所述试剂盒包括固相载体、包被于固相载体上的重组ALDH1B1抗原蛋白、酶标二抗、标准品、显色底物、洗涤液和反应终止液。该检测试剂盒可以特异性定量检测血清标本中ALDH1B1抗体的水平，在用于早期筛查及诊断结直肠癌和高级别结直肠腺瘤的敏感性上显著优于目前临床使用的血清标志物CEA。

Description

血清ALDH1B1自身抗体定量检测试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于蛋白标志物检测领域，特别是涉及一种基于血清ALDH1B1自身抗体检测的早期结直肠癌和高级别结直肠腺瘤检测试剂盒。

背景技术

癌症是导致人们死亡的主要原因，每年有大量的癌症确诊病例。据对全球癌症进行估计，2018年新增癌症1810万例，死亡960万例，其中结直肠癌新发病例180万例，死亡88.1万例。其中中国癌症新发病例占24％(430万)，癌症死亡病例占30％(290万)，结直肠癌占恶性肿瘤的12.8％。癌症在中国已成为首要死亡原因。美国的癌症死亡率从1991年215.1/10万的峰值下降到2015年的158.6人，下降率为26％。具体来说，从1970年到2015年，结直肠癌的死亡率降低了52％，死亡率的降低归因于治疗的改善(12％)，危险因素的改变(35％)和筛查(53％)。基于粪便的检测(粪便免疫化学检测、粪便潜血检测、多靶点粪便DNA检测)或直接观察结肠的检测(结肠镜检查或计算机断层结肠检查)，都被推荐用于结直肠癌的筛查。然而，2016年美国联邦健康中心的结直肠癌筛查率为39.9％。至少有40％符合筛查标准的成年人没有遵守筛查指南。粪便免疫化学试验或粪便潜血试验虽然是运用较广泛的检查，但其敏感性仅达70％，使结直肠癌的早期筛查率仍处于较低的水平。针对异常蛋白，mRNA，siRNA，基因突变，表观遗传等研究仍在大规模进行中。2014年10月，美国食品药物管理局首次批准DNA检测用于结直肠癌患病风险的患者进行非侵入性肠道检查，其灵敏度为92％，特异性为87％。但对于高级别癌前病变，DNA检测的敏感性为42.4％，粪便免疫化学检测仅为23.8％。基于DNA的检测虽高于粪便免疫化学检测，但对于癌前病变或原位癌等的应用价值有限。并且各项研究的敏感性和特异性具有较大的差异。一项系统综述揭示了粪便DNA标记对CRC检测的总体敏感性为53％至87％，特异性在76％以上。一组血清蛋白标志物对所有结直肠癌的敏感性和特异性均高于85％。结直肠癌的早期诊断在结直肠癌的治疗和预后发挥巨大影响，然而可用的检测方法的准确性和应用价值仍待提高，因此，发现结直肠癌新的标志物依然具有较高的研究价值和提升空间。

目前在临床应用较广的血清肿瘤标志物主要是肿瘤相关抗原蛋白。如结肠癌的癌胚抗原(CEA)，肝癌的甲胎蛋白(CEA)，前列腺特异性抗原，胃肠道癌抗原CA19-9，卵巢癌抗原CA-125等，但它们的敏感性和特异性较低，临床应用价值有限。针对肿瘤相关抗原的反应可发生于肿瘤的早期阶段或发生于肿瘤的形成过程，肿瘤相关抗体产生于肿瘤的早期阶段。从20世纪50年代开始，研究人员已开始研究自身抗体和癌症之间的关系。自身抗体可由肿瘤细胞坏死暴露的表面抗原产生。Baldwin等在1966年报道恶性肿瘤中肿瘤相关抗原可释放成百上千的肿瘤自身抗体，自身抗体在肿瘤诊断预后的研究价值得到不断关注。自体抗体被研究作为诊断癌症的生物标记，因为它们的产生可能先于确诊肿瘤数月或数年。研究表明TP53自身抗体与恶性肿瘤的后续发展显著相关，其预测值为0.76，平均诊断时间为3.5年。肿瘤相关的自身抗体是正常组织在向恶性肿瘤转化的过程中被发现。自身抗体在抗原低水平的情况下可呈现高水平状态，因抗体产生过程的级联放大效应。因此，自体抗体被认为是癌症早期诊断的生物标志物，而被广泛研究。Chen等检测了五种联合肿瘤相关自身抗体(p53、c-myc、cyclin B1、cyclin D1和Calnuc)(Int J Oncol,2007,30(5):1137-1144)，结果表明，65.4％的结直肠癌患者和6.1％正常人至少对一种自身抗体发生阳性反应。检测p53、p62、c-myc,imp1和Koc的自身抗体的敏感性为60.9％，特异性为89.7％的特异性。但已报道的标志物仍缺乏在早期结直肠癌以及高级别腺瘤(癌前病变)方面的研究。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于是提供了一种新的用于筛查及早期诊断结直肠癌以及高级别结直肠腺瘤的自身抗体类肿瘤标志物，并提供检测该标志物的定量检测试剂盒。该试剂盒所检测的血清ALDH1B1自身抗体用于诊断结直肠癌和高级别结直肠腺瘤的敏感性显著优于目前临床使用的血清标志物CEA。

为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：

本发明提供了检测ALDH1B1自身抗体的试剂在制备用于早期结直肠癌筛查及诊断和/或高级别结直肠腺瘤筛查及诊断的试剂盒中的应用。

根据本发明的具体实施方式，所述检测ALDH1B1自身抗体的试剂为酶联免疫法检测用试剂。

进一步的，所述检测ALDH1B1自身抗体的试剂为检测人血清中ALDH1B1自身抗体的试剂。

本发明的关键在于，确定了人体血液中ALDH1B1自身抗体的含量与患结直肠癌的风险显著相关，因此可以通过检测人体血液中ALDH1B1自身抗体的含量来判断患结直肠癌的风险。

本发明还提供了一种血清ALDH1B1自身抗体定量检测试剂盒，所述试剂盒包括固相载体、包被于固相载体上的重组ALDH1B1抗原蛋白、酶标二抗、标准品、显色底物、洗涤液和反应终止液。

根据本发明的具体实施方式，所述重组ALDH1B1抗原蛋白为带有His标签的ALDH1B1融合蛋白(ALDH1B1蛋白为全长蛋白，蛋白序列号为P30837)。该融合蛋白是利用DNA体外重组技术，将His标签与ALDH1B1蛋白一起融合表达得到的。通过带有His标签，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。

根据本发明的具体实施方式，所述重组ALDH1B1抗原蛋白的包被浓度为0.5μg/ml。

进一步的，所述酶标抗体为本领域常用的可用于检测的标记抗体，包括但不限于辣根过氧化物酶标记的兔抗人IgG抗体。

进一步的，本发明试剂盒还提供了双重标准品进行质量控制和抗体定量，提高了定量的精准性。所述标准品为重组ALDH1B1抗原蛋白免疫家兔获得的多克隆抗体或人源化ALDH1B1抗体。

上述血清ALDH1B1自身抗体定量检测试剂盒在制备用于早期结直肠癌筛查及诊断产品中的应用，以及在制备用于高级别结直肠腺瘤筛查及诊断产品中的应用也属于本发明的保护范畴。

本文中“ALDH1B1自身抗体”，指的是“ALDH1B1蛋白自身抗体”。

本发明检测试剂盒采用酶联免疫法测定，抗体检测反应板为包被有重组ALDH1B1抗原蛋白的固相载体，例如包被有重组ALDH1B1抗原蛋白的酶标板，待测血清或标准品中的特异性ALDH1B1抗体能够与酶标板微孔中的ALDH1B1蛋白特异性结合而吸附于微孔内，加入酶标二抗孵育，充分洗涤后加入显色底物，终止反应后用酶标仪测定各微孔的吸光度即OD值，其OD值与ALDH1B1抗体水平呈正比。通过标准品的检测绘制标准曲线并对各血清标本中的ALDH1B1抗体水平进行定量。

本发明的有益效果如下：

发明人前期已通过血清免疫蛋白质组学方法筛选出一批在早期结直肠癌以及高级别腺瘤存在较高水平血清学水平的抗原蛋白，通过购买或重组这些抗原蛋白制成蛋白芯片，大通量验证相应血清自身抗体的水平，筛选出能够检测早期结直肠癌以及高级别腺瘤的血清自身抗体。研究发现乙醛脱氢酶1亚基B1(aldehyde dehydrogenase 1B1,ALDH1B1)自身抗体区分检测价值最高。ALDH1B1抗体区分结直肠癌与健康对照的AUC为0.70，区分高级别结直肠腺瘤的AUC为0.75；ALDH1B1检测自身抗体检测早期结直肠癌的阳性率为62.7％，灵敏度为和特异度分别为62.31％和73.87％，而CEA检测早期结直肠癌的阳性率为38.6％，可见ALDH1B1自身抗体诊断早期结直肠癌的敏感性显著高于目前常用的指标CEA，显示出ALDH1B1自身抗体在结直肠癌早期诊断方面具有潜在价值。值得注意的是，我们发现在CEA阴性的结直肠癌患者中，有62.0％的患者ALDH1B1自身抗体为阳性，显示出ALDH1B1自身抗体对CEA阴性的结直肠癌患者有潜在的诊断价值。

附图说明

图1ALDH1B1重组蛋白的SDS-PAGE图。1.marker；2.未诱导大肠杆菌；3.IPTG诱导大肠杆菌；4.超声裂解菌液上清；5.超声裂解菌液沉淀；6.HIS柱虑过液；7.杂蛋白洗脱液；8.重组蛋白洗脱液。

图2ALDH1B1重组蛋白的western blot反应图。a.高级别腺瘤血清；b.结直肠癌血清；c.健康对照血清；+.ALDH1B1抗体；M.marker。

图3CEA和ALDH1B1自身抗体诊断结直肠癌的阳性率。1-4分别代表肿瘤分期I-IV期。

图4ALDH1B1自身抗体检测结直肠癌和高级别腺瘤的散点图。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。

实施例1重组ALDH1B1抗原蛋白的制备

一、材料

DNA marker(100-2000bp)和彩虹预染蛋白marker(14-120KD)均购自北京天根生化科技有限公司；化学发光蛋白Marker(20-90KD)购自北京全式金生物技术有限公司；大肠杆菌Origammi2和BL21(DE3)为本实验室保存；Fast Taq Mastermix、BamHI、XhoI、T4 DNA连接酶均购自NEB公司；DNA电泳凝胶回收试剂盒购自Axygen公司；异丙基硫代卢-D-半乳糖苷(IPTG)为Amresco产品；ALDH1B1抗体购自碧云天生物技术研究所；HRP标记的山羊抗人IgG购自美国Earthox公司；引物合成及DNA序列测定由上海生工生物工程有限公司完成。其他试剂均为国产分析纯。

二、人ALDH1B1原核表达载体的构建及鉴定

本发明重组表达的蛋白为ALDH1B1全蛋白，蛋白序号为P30837，并在其末端加上His标签。分子量为61.9KD。

采用化学合成的方法合成基因，构建ALDH1B1-pET 28a(+)载体。取5ul转化到感受态大肠杆菌BL21(DE3)内，涂布于LB(含Amp抗生素)平板，37℃倒置培养过夜。挑取6个菌落分别接种于3ml液体LB培养基(含Amp)中，37℃振荡培养过夜。用碱裂解法提取质粒DNA。然后进行PCR扩增和测序鉴定，ALDH1B1上游引物：5’-GGAACCAGAACCCAAGCGT-3’；下游引物：5’-TGTCTGGGTTCAGAATGGGG-3’。其基因序列与GeneBank上公布的基因序列(序列号:M63967)一致。

三、His-ALDH1B1融合蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)菌株内的诱导表达

测序正确地重组表达质粒转化到感受态大肠杆菌BL21(DE3)细胞内，挑取单个菌落放入液体LB培养基(含Amp)内，37℃振荡培养过夜。次日，按7％的比例将上述菌液加入到液体LB培养基中，37℃振荡培养50min，测得OD600值为1.0，然后加入IPTG至终浓度为1mmol/L，16℃振荡培养3h。对照组不加IPTG诱导，于16℃振荡培养过夜。收集菌液到1.5ml离心管中，12000r/min离心10min后弃上清保留沉淀。用蒸馏水重悬沉淀，加入上样缓冲液煮沸10min，吸取少量菌液后，剩余菌液10000r/min离心5min后分别留取上清和沉淀，进行10％SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色观察融合蛋白的表达情况，结果见附图1。

四、His-ALDH1B1融合蛋白的大规模表达、纯化与免疫原性鉴定

挑取含重组质粒的BL21(DE3)单菌落置100ml液体LB培养基(含Amp)中37℃震荡培养过夜。次日，按7％的比例将上述菌液加入到1000ml液体LB培养基(含Amp)中，37℃振荡培养至OD600值为1.0，加入IPTG使终浓度为1.0mmol/L，16℃振荡培养3h，按上述同样方法收集菌体，用缓冲液PBS(PH 7.0)+0.01mmol/LEDTA悬浮菌体，进行超声破碎30min，12000r/min离心取沉淀。包涵体沉淀洗涤后经His亲和层析柱进行亲和纯化纯化，然后通过透析复性。纯化后通过电泳检测纯度，通过Western blots检测免疫原性。结果见附图2。

实施例2标准品和酶标板的制备

一、材料

96孔酶标板购自美国Thermo公司；重组ALDH1B1抗原蛋白为按照实施例1的方法制备；BSA购自北京环亚泰克生物医学技术有限公司；TMB显色液及终止液均购自北京索莱宝科技有限公司；HRP标记的兔抗人IgG购自美国Sigma公司；其他试剂均为国产分析纯。

二、检测试剂盒中标准品的制备

通过将实施例1制备的重组ALDH1B1抗原蛋白免疫家兔获得兔抗人ALDH1B1的多克隆抗体，并将获得的血清抗体通过亲和层析进一步纯化后用做试剂盒的定量标准品。此外，参照张金龙等的方法，通过构建人源化ALDH1B1抗体载体ALDH1B1-PATX1，通过CHO细胞表达人源化ALDH1B1抗体(生物技术通讯，2014，25(6)：817-820，等)，作为本检测试剂盒的另一种标准品进行质量控制和抗体定量。

上述标准品通过梯度稀释，可以用于本检测试剂盒的质量控制和检测时的血清抗体定量。

三、酶标板包被浓度的确定

1.酶标板的包被

采用棋盘法确定酶标板的最佳包被浓度。用PBS(0.01mol/L,pH 7.2-7.4)稀释ALDH1B1蛋白至不同浓度(0.25-2ug/ml)进行包被，每个浓度重复两列，各反应孔加入上述蛋白100ul置于4℃冰箱过夜；然后甩掉液体，各反应孔加入300ul洗涤液PBS-T(0.01mol/LPBS,pH 7.2-7.4,0.05％Tween 20)，在实验台上适度晃动酶标板后甩掉洗涤液，重复3次后在吸水纸上拍干酶标板。

2.酶标板的封闭

向上述酶标板的各反应孔中加入1％的BSA封闭液100ul，37℃孵育2小时后甩掉封闭液，然后用同样的方法洗板3次。

3.酶标板检测不同浓度的标准品

将标准血清用样本稀释液(0.1％BSA,PBS-T)稀释至不同浓度(1:2,1:4,1:8,1:16,1:32,1:64,1:128)，每一排各反应孔内加入同一浓度的标准品100ul，每一排浓度依次降低，最后一排为空白对照。将酶标板置于微孔板震荡器上500/min，孵育1h。甩掉液体后洗板6次。然后各反应孔加1:8000的HRP-兔抗人IgG100ul，于震荡器上孵育1h后洗板6次。配置TMB显色液(等体积A液+B液)，各反应孔内加入显色液100ul，避光条件下反应10min，然后各反应孔加入终止液50ul以终止反应。在酶标仪450nm条件下测定各反应孔的OD值，结果如下表1所示。

表1棋盘法检测酶标板不同包被浓度反应孔的OD值

4.确定最佳包被浓度

由上述实验初步确定酶标板的包被浓度为0.5ug/ml。

四、检测试剂盒标准曲线的建立

用上述0.5ug/ml包被浓度下检测不同稀释度的标准品所测得的OD值绘制标准曲线。

实施例3ALDH1B1自身抗体在结直肠癌和结直肠高级别腺瘤中的诊断价值

采用试剂盒方法对315例样本，包括110例健康样本血清，75例结直肠高级别腺瘤和130例结直肠癌血清样本进行ALDH1B1自身抗体检测，利用ROC曲线和AUC值评估诊断价值。

结果显示，ALDH1B1自身抗体在结直肠高级别腺瘤和结直肠癌的AUC值分别为0.74和0.70，敏感性和特异性分别为75.68％，62.31％和63.06％，73.87％；相比较于CEA对早期结直肠癌的阳性率仅为38.6％，ALDH1B1的阳性率分别为62.3％；CEA阴性的早期结直肠癌超过半数ALDH1B1自身抗体阳性。实验结果如图3和图4所示。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (10)

1.检测ALDH1B1自身抗体的试剂在制备用于早期结直肠癌和/或高级别结直肠腺瘤筛查及诊断的试剂盒中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测ALDH1B1自身抗体的试剂为酶联免疫法检测用试剂。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测ALDH1B1自身抗体的试剂为检测人血清中ALDH1B1自身抗体的试剂。

4.一种血清ALDH1B1自身抗体定量检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括固相载体、包被于固相载体上的重组ALDH1B1抗原蛋白、酶标二抗、标准品、显色底物、洗涤液和反应终止液。

5.根据权利要求4所述的血清ALDH1B1自身抗体定量检测试剂盒，其特征在于，所述重组ALDH1B1抗原蛋白为带有His标签的ALDH1B1融合蛋白。

6.根据权利要求4或5所述的血清ALDH1B1自身抗体定量检测试剂盒，其特征在于，所述重组ALDH1B1抗原蛋白的包被浓度为0.5μg/ml。

7.根据权利要求4或5所述的血清ALDH1B1自身抗体定量检测试剂盒，其特征在于，所述酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的兔抗人IgG抗体。

8.根据权利要求4或5所述的血清ALDH1B1自身抗体定量检测试剂盒，其特征在于，所述标准品为重组ALDH1B1抗原蛋白免疫家兔获得的多克隆抗体或人源化ALDH1B1抗体。

9.权利要求4-8所述的血清ALDH1B1自身抗体定量检测试剂盒在制备用于早期结直肠癌筛查及诊断产品中的应用。

10.权利要求4-8所述的血清ALDH1B1自身抗体定量检测试剂盒在制备用于高级别结直肠腺瘤筛查及诊断产品中的应用。

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