CN111321159B - 用于免疫调节的嵌合核酸分子及其应用 - Google Patents
用于免疫调节的嵌合核酸分子及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及用于免疫调节的嵌合核酸分子及其应用。具体而言，本发明的嵌合核酸分子包括具有CpG模体的寡核苷酸及抗淋巴细胞活化基因3(LAG‑3)的适体，可产生活化类铎受体第九型(toll‑like receptor 9，TLR9)的协同效果，可用于启动全身性免疫反应，提高疾病治疗效果。
Description
技术领域
本申请关于用于免疫调节的嵌合核酸分子及其应用。
背景技术
T细胞表达抑制性受体(称为免疫检查点分子)，其抑制T细胞反应。免疫检查点分子的实例包括程序化细胞死亡蛋白1(PD-1)、淋巴细胞活化基因3(LAG-3)和细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白质4(CTLA-4)。这些免疫检查点分子通常在癌症被激活，导致抗肿瘤免疫反应受到抑制。
T细胞还表达刺激性受体，其激活先天免疫反应。刺激性受体的实例包括Toll样受体(TLR)，其会受到嵌入某些侧翼序列的未甲基化的胞嘧啶-鸟苷二核苷酸(CpG)模体激活。
在癌症治疗中，仍有许多病患对现有药物反应不佳，可能原因之一是这些病患的免疫反应受到抑制，以致于无法达到有效治疗。因此，仍有需要提供新的治疗策略，期能更有效抑制肿瘤生长、提高反应率，尤其是达到全身性的免疫保护及治疗效果。
发明内容
本发明不可预期地发现，将具有CpG模体的寡核苷酸及抗LAG-3的适体结合在一起形成的嵌合核酸分子，可产生活化TLR9的协同效果。本发明的嵌合核酸分子可启动全身性免疫反应，达更佳的疾病治疗效果。
因此，在一方面，本发明提供一种嵌合核酸分子，其包含骨架部分及适体部分，其中骨架部分包含CpG序列，适体部分包含结合至淋巴细胞活化基因3(LAG-3)的适体，以及该骨架部分连接于该适体部分。
于一些具体实施例中，该骨架部分包含在其中间部分的该CpG序列，以及侧接于该CpG序列的侧翼核苷酸序列，所述侧翼核苷酸序列包含停泊序列，用于将该骨架部分连接到该适体部分。
于一些具体实施例中，该CpG序列包含回文序列。
于一些具体实施例中，该骨架部分含有两个核酸分子，其包含互补序列并形成双股区域，以及侧接于该互补序列的侧翼核苷酸序列，每个侧翼序列包含停泊序列，用于将该骨架部分连接到该适体部分。
于一些具体实施例中，该适体部分包含第一抗LAG-3适体及第二抗LAG-3适体，该第一抗LAG-3适体包含第一锚定序列及该第二抗LAG-3适体包含第二锚定序列；以及该骨架部分包含第一核酸分子，其包含第一核苷酸序列式5'-X-L1-Y-L2-Z-3'，其中Y是第一CpG序列，L1和L2各自是连接子，X是包含第一停泊序列的核苷酸片段，Z是包含第二停泊序列的核苷酸片段，该第一停泊序列互补于该第一锚定序列，以及该第二停泊序列互补于该第二锚定序列，使得该骨架部分的第一核酸分子与该适体部分的第一抗LAG-3适体及第二抗LAG-3适体相连接。
于一些具体实施例中，该适体部分进一步包含第三抗LAG-3适体及第四抗LAG-3适体，该第三抗LAG-3适体包含第三锚定序列及该第四抗LAG-3适体包含第四锚定序列；该骨架部分进一步包含第二核酸分子，其包含第二核苷酸序列式5'-X'-L1'-Y'-L2'-Z'-3'，其中Y'是第二CpG序列，L1'和L2'各自是连接子，X'是包含第三停泊序列的核苷酸片段，Z'是包含第四停泊序列的核苷酸片段，该第三停泊序列互补于该第三锚定序列，以及该第四停泊序列互补于该第四锚定序列，使得该骨架部分的第二核酸分子与该适体部分的第三抗LAG-3适体及第四抗LAG-3适体相连接；以及在该骨架部分，第一核酸分子的第一CpG序列互补于第二核酸分子的第二CpG序列。
于另一方面，本发明提供一种医药组合物，其包含本文所述的嵌合核酸分子，以及医药上可接受的载剂。
于一些具体实施例中，本发明的医药组合物进一步包含免疫检测点结抗剂。
于另一方面，本发明提供一种调节免疫反应的方法，其中该方法包含将本文所述的嵌合核酸分子或医药组合物投用于有此需要的个体。本发明也提供一种如本文所述的嵌合核酸分子或医药组合物用于制备调节免疫反应的药物的用途。
于一些具体实施例中，该个体是患有、怀疑患有癌症或有患癌风险的人类患者。
于一些具体实施例中，该癌症选自肺癌、黑素瘤、结肠直肠癌、肾细胞癌、尿路上皮癌和霍奇金淋巴瘤所组成的群组。
于一些具体实施例中，该药物是调配成肌肉内或肠内投用的形式。
于以下的描述中阐述了本发明的一或多个具体实施例的细节。本发明的其它特征或优点将从以下附图与数个具体实施例的详细描述，以及从所附的权利要求中变得显而易见。
附图说明
先前发明内容，以及以下的本发明的详细说明，可搭配所附的图式阅读，以得到更佳的了解。本发明于图式所呈现的较佳具体实施例仅用于阐述的目的。应明了的是，本发明并不局限于所示的所述精确的排列及手段。
于图式中：
图1显示本发明的嵌合核酸分子的设计简图。
图2显示本发明的嵌合核酸分子的序列结构(C695FL_B+B4_SL3_P16、C695d8_B+B4_SL3_P16、C695d8'_B+B4_SL3_P16)。
图3显示本发明的嵌合核酸分子的电泳分析。第1、2、3道的样本为骨架部分(C695FL_B、C695d8_B、C695d8'_B)，第4、5、6道为包含骨架部分及适体部分的嵌合核酸分子(C695FL_B+B4_SL3_P16、C695d8_B+B4_SL3_P16、C695d8'_B+B4_SL3_P16)。结果显示，三种骨架均能稳定进行分子间结合成双元体(均接近100bp)，加入B4_SL3_P16的适体后则呈现靠近于250bp位置的多元体。
图4A至4C显示本发明的嵌合核酸分子的高效能液相层析法分析，包括：图4A为单独C695序列(C695FL_B)及C695序列与抗LAG-3适体的组合(C695FL_B+B4_SL3_P16)；图4B为单独C695序列(C695d8_B)及C695序列与抗LAG-3适体的组合(C695d8_B+B4_SL3_P16)；以及图4C为单独C695序列(C695d'_B)及C695序列与抗LAG-3适体的组合(C695d8'_B+B4_SL3_P16)。结果显示，本发明的嵌合核酸分子结合效率及稳定度佳。
图5显示本发明的嵌合核酸分子的TLR9活化能力分析。结果显示，本发明的嵌合核酸分子产生不可预期的活化TLR9的协同效果，优于骨架部分的C695序列本身或其它的C695序列。
图6显示本发明的嵌合核酸分子的LAG-3阻抗分析。结果显示，单独骨架部分时，冷光数值均接近背景值，表示没有产生LAG-3阻抗效果；骨架部分加入B4_SL3_P16适体形成嵌合核酸分子后，冷光值则是随着浓度增加而增加(特别是从80nM开始显著增加)，表示嵌合核酸分子可产生LAG-3阻抗效果。阳性对照组为LAG-3抗体(200nM)。IC50分析显示，C695d8_B+B4_SL3_P16的IC50最佳，达102nM。
具体实施方式
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的相同的含义。
如本文所描述的，定冠词“一(a)”与“一(an)”是指物品的语法对象中的一个或多于一个(即至少一个)。作为示例，“一元素”是指一个元素或多于一个元素。
如本文所描述的，“包含(comprise)”或“包含(comprising)”等词通常被用在包括(include)/包括(including)的意义上，其是表示允许存在一个或多个特征、成分或组分。“包含(comprise)”或“包含(comprisin)”等词包括“组成(consists)”或“由...组成(consisting of)”
如本文所描述的，“多核苷酸”或“核酸”等词可指由核苷酸单元组成的聚合物，包括天然存在的核酸，如脱氧核糖核酸(“DNA”)与核糖核酸(“RNA”)，以及核酸类似物，包括彼等具有非天然存在的核苷酸者。多核苷酸的合成可利用，例如，自动化DNA合成仪。应理解到，当核苷酸序列以DNA序列(亦即，A、T、G、C)表示时，其亦包括相应的RNA序列(亦即，A、U、G、C)，其中“U”代替“T”。此处所述的“多核苷酸”或“核酸”包括单股或双股形式。
如本文所描述的，“互补”一词意指二多核苷酸的拓扑兼容性或作用表面相匹配。因此，二个分子可描述为互补，此外，接触面特征彼此互补。若第一聚核苷酸的核苷酸序列与第二聚核苷酸的聚核苷酸结合配偶体的核苷酸序列相同，则第一多核苷酸与第二多核苷酸互补。因此，序列为5′-TATAC-3′的多核苷酸互补于序列为5′-GTATA-3′的多核苷酸。
如本文所描述的，“实质上相同”一词意指二序列具有超过85％、较佳为85％、更佳为90％、及最佳为95％或100％相同性。可以使用本领域已知的数学算法(例如BLAST和Gapped BLAST程序、NBLAST和XBLAST程序，或ALIGN程序)来确定两个序列之间的相同性或相似度的百分比。
如本文所描述的，“嵌合核酸分子”一词包括具有非天然连接在一起的序列的多核苷酸或核酸。连接方式可以是经由共价键(例如，磷酸二酯键连)或碱基配对将不同的核酸片段组合在一起。“嵌合核酸分子”一词包括单元体(monomer，由单一多核苷酸组成)或多元体(multimer，由多段多核苷酸组成，例如，由二段多核苷酸组成的二元体，由三段多核苷酸组成的三元体，或由四段多核苷酸组成的四元体，依此类推)。
如本文所描述的，“回文序列”，也称为反向逆转序列，是指一段核苷酸序列(从5'到3'正向)与其互补序列序列从5'到3'读取的序列相同。回文序列倾向于自行组装形成茎环(发夹)结构。
如本文所描述的，“免疫检查点分子”是指在免疫细胞上表达并可扮演向下调节免疫反应的分子。免疫检查点分子的实例包括但不限于程序性细胞死亡蛋白-1(PD-1)，程序性死亡配体1(PD-L1)，淋巴细胞活化基因-3(LAG-3)，T-细胞免疫球蛋白和含有粘蛋白结构域的-3(TIM-3)和B和T淋巴细胞衰减剂(BTLA)。
本发明提出具有CpG模体的寡核苷酸及抗LAG-3的适体的结合使用，具体而言，将具有CpG模体的寡核苷酸及抗LAG-3的适体结合在一起形成的嵌合核酸分子，制成具有双重功效的核酸药物，尤其达到活化TLR9的协同效果，有助于活化全身性免疫反应，提高疾病治疗效果。
如本文所描述的，“核酸适体”是指对特定目标分子(例如，LAG-3)具有结合活性的核酸分子(DNA或RNA)。适体可以结合特定的目标分子，从而抑制靶目标分子的活性，例如通过阻断目标分子与其天然配体的结合，引起目标分子的构象变化，和/或阻断目标分子的活性中心。
于一些具体实施例中，本发明的嵌合核酸分子的适体部分包含抗LAG-3适体，其包含GX1GGGX2GGTX3A(SEQ ID NO:11)核苷酸模体，其中X1和X2各自独立地为G，C或不存在，以及X3为T或C。
于一些具体实施例中，本文所描述的抗LAG-3适体可包括如下核苷酸序列，或实质上相同的核苷酸序列：
(i)5'-TGGGGGGGGTTAGTTCAATACATGCGGGCG-3'(SEQ ID NO:12)；
(ii)5'-TGGGGGGGGGTTAGACTTACACTCTTATTCG-3'(SEQ ID NO:13)；
(iii)5'-AGAGGGGGGGGTTAGCTGCTTTAACTCATG-3'(SEQ ID NO:14)；及
(iv)5'-AGGGGGGGGGTTACTGCGCATGTATCTCAG-3'(SEQ ID NO:15)。
于一些具体实施例中，本文所描述的抗LAG-3适体可包括如下核苷酸序列，或实质上相同的核苷酸序列：
(i)
5'-TCCCTACGGCGCTAACTGGGGGGGGTTAGTTCAATACATGCGG GCGGCCACCGTGCTACAAC-3'(SEQ ID NO:16)；
(ii)5'-ACGGCGCTAACTGGGGGGGGTTAGTTCAATACATG-3'(SEQ ID NO:17)；
(iii)5'-GCTAACTGGGGGGGGTTAGTTCAATACATGCGGGC-3'(SEQ ID NO:18)；及
(iv)5'-CTGGGGGGGGTTAGTTCAATACATGCGGGCGGCCA-3'(SEQ ID NO:19)。
如本文所描述的，“CpG”是指通过磷酸键(“p”)连接的5'胞嘧啶(“C”)和3'鸟嘌呤(“G”)。如本文所描述的，“CpG序列”是指任何能够激活免疫细胞(免疫刺激剂)的含CpG的寡核苷酸。至少在5'CpG 3'的C必须是未甲基化的。具有CpG序列的核酸可以通过常规技术的化学合成制备或由商业供应商提供。
于一些具体实施例中，本文所描述的CpG序列包含回文序列。
于一些具体实施例中，本文所描述的CpG序列可包括如下核苷酸序列，或实质上相同的核苷酸序列：
(i)5'-AAC GTT CGA ACG TTC GAA CGT T-3'(C695FL核心部分，回文序列部分)(SEQ ID NO:1)；
(ii)5'-AAC GTT CGA ACG TT-3'(C695d8核心部分，回文序列部分)(SEQ ID NO:2)；以及
(iii)5'-TTC GAA CGT TCG AA-3'(C695d8'核心部分，回文序列部分)(SEQ IDNO:3)。
于一些具体实施例中，本文所描述的CpG序列可包括如下核苷酸序列，或实质上相同的核苷酸序列：
(i)5'-TCG AAC GTT CGA ACG TTC GAA CGT T TTT-3'(C695FL)(SEQ ID NO:4)；
(ii)5'-TCG AAC GTT CGA ACG TT TTT-3'(C695d8)(SEQ ID NO:5)；以及
(iii)5'-TCG TTC GAA CGT TCG AA TTT-3'(C695d8')(SEQ ID NO:6)。
根据本发明，嵌合核酸分子是将包含CpG序列的骨架部分与包含抗LAG-3适体的适体部分连接在一起而形成。连接方式可以是经由共价键(例如，磷酸二酯键连)或碱基配对将骨架部分与适体部分组合在一起。
于一些具体实施例中，适体部分的适体包含锚定序列，用于将适体连接至所述骨架部分。例如，锚定序列包含5'-GCC ACC GTG CTA CAA C-3'(SEQ ID NO:21)。
于一些具体实施例中，骨架部分包含在其中间部分的该CpG序列，以及侧接于该CpG序列的侧翼核苷酸序列，所述侧翼核苷酸序列包含停泊序列，用于将该骨架部分连接到该适体部分。例如，停泊序列包含5'-GTT GTA GCA CGG TGG C-3'(SEQ ID NO:20)。
于一些具体实施例中，骨架部分含有两个核酸分子，其包含互补序列并形成双股区域(CpG序列)，以及侧接于该互补序列的侧翼核苷酸序列，每个侧翼序列包含停泊序列，用于将该骨架部分连接到该适体部分。
于一些具体实施例中，适体部分包含第一抗LAG-3适体及第二抗LAG-3适体，第一抗LAG-3适体包含第一锚定序列及该第二抗LAG-3适体包含第二锚定序列；以及骨架部分包含第一核酸分子，其包含第一核苷酸序列式5'-X-L1-Y-L2-Z-3'，其中Y是第一CpG序列，L1和L2各自是连接子，X是包含第一停泊序列的核苷酸片段，Z是包含第二停泊序列的核苷酸片段，该第一停泊序列互补于该第一锚定序列，以及该第二停泊序列互补于该第二锚定序列，使得该骨架部分的第一核酸分子与该适体部分的第一抗LAG-3适体及第二抗LAG-3适体相连接。
于一些具体实施例中，适体部分进一步包含第三抗LAG-3适体及第四抗LAG-3适体，该第三抗LAG-3适体包含第三锚定序列及该第四抗LAG-3适体包含第四锚定序列；该骨架部分进一步包含第二核酸分子，其包含第二核苷酸序列式5'-X'-L1'-Y'-L2'-Z'-3'，其中Y'是第二CpG序列，L1'和L2'各自是连接子，X'是包含第三停泊序列的核苷酸片段，Z'是包含第四停泊序列的核苷酸片段，该第三停泊序列互补于该第三锚定序列，以及该第四停泊序列互补于该第四锚定序列，使得该骨架部分的第二核酸分子与该适体部分的第三抗LAG-3适体及第四抗LAG-3适体相连接；以及在该骨架部分，第一核酸分子的第一CpG序列互补于第二核酸分子的第二CpG序列。
于一些具体实施例中，适体部分包含 (SEQ ID NO:22，粗体部分是锚定序列)。
于一些具体实施例中，该骨架部分包括第一核酸分子，其包含核苷酸序列为 (5'-X-L1-C695FL-L2-Z-3')(SEQ ID NO:7，粗体部分是停泊序列)，及/或该骨架部分包括第二核酸分子，其包含核苷酸序列为/> (5'-X-L1-C695FL-L2-Z-3')(SEQ ID NO:7，粗体部分是停泊序列)；或
该骨架部分包括第一核酸分子，其包含核苷酸序列为 (5'-X-L1-C695d8-L2-Z-3'，粗体部分是停泊序列)(SEQ ID NO:8)，及/或该骨架部分包括第二核酸分子，其包含核苷酸序列为 (5'-X-L1-C695d8-L2-Z-3')(SEQ ID NO:8，粗体部分是停泊序列)；或
该骨架部分包括第一核酸分子，其包含核苷酸序列为 (5'-X-L1-C695d8'-L2-Z-3')(SEQ ID NO:9，粗体部分是停泊序列)，及/或该骨架部分包括第二核酸分子，其包含核苷酸序列为 (5'-X-L1-C695d8'-L2-Z-3')(SEQ ID NO:9，粗体部分是停泊序列)。
于一些具体实施例中，适体部分包含另外的适体，其结合至不同于LAG-3的其它免疫检测点分子。免疫检查点分子的其它实例包括但不限于程序性细胞死亡蛋白-1(PD-1)，程序性死亡配体1(PD-L1)，T-细胞免疫球蛋白和含有粘蛋白结构域的-3(TIM-3)和B和T淋巴细胞衰减剂(BTLA)。
依据本发明，有效量的活性成分(本发明的嵌合核酸分子)可以与医药上可接受载体(carrier)配制成适当形式的组合物，用于递送与吸收。本发明组合物具体而言包含约0.1重量％至约100重量％的活性成分，其中重量百分比基于整个组合物的重量计算。在一些具体实施例中，本发明组合物可为用于治疗的医药组合物或药剂。
本文中使用的“医药上可接受”意指载体兼容于组合物的活性成分，且较佳地可稳定该活性成分，且对接受个体而言是安全的。所述载体可以是活性成分的稀释剂、载剂、赋形剂或基质。适当赋形剂的一些实例包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖、甘露糖、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、黄蓍胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、无菌水、糖浆和甲基纤维素。组合物还可以包含润滑剂，例如滑石、硬脂酸镁和矿物油；润湿剂；乳化剂和悬浮剂；防腐剂，如羟基苯甲酸甲酯和丙酯；甜味剂和调味剂。本发明的组合物可以在投与患者后提供活性成分快速、持续或延迟释放的效果。
于一些具体实施例中，本发明的组合物包含其他活性成分，例如，进一步包含免疫检测点结抗剂。
在另一方面，本发明提供一种调节免疫反应的方法，包含将本文所描述的嵌合核酸分子或组合物投用于有此需要的个体。本发明也提供本文所描述的嵌合核酸分子或组合物用于制备调节免疫反应的药物的用途。本发明的方法可用于治疗癌症。
如本文所描述的，“个体”、“个人”以及“患者”等词在本文中可互换使用，而且是指被评估用于治疗及/或被治疗的哺乳动物。个体可为人类，但亦包括其他哺乳动物，特别是可用作人类疾病实验室模型的那些哺乳动物，例如，小鼠、大鼠、兔、狗等。
如本文所描述的，欲利用本文所述方法治疗的个体可为哺乳类动物，更佳地为人类。哺乳类动物包括但不局限于，农场动物、运动动物、宠物、灵长类动物、马、狗、猫、小鼠、及大鼠。
于一些具体实施例中，需要治疗的个体可为患有风险或疑似患有目标疾病/病症(如癌症)的人类病患。疑似患有此目标疾病/病症任一者的个体可能显示该疾病/病症的一或多个症状。患有疾病/病症风险的个体可为具有该疾病/病症的一或多个危险因子的个体。
如本文所用，“治疗”一词是指将包括一或多种活性剂的组合物应用或施用于一个体，该个体患有目标疾病或病症、疾病/病症的症状，或对该疾病/病症的倾向，且其目的为治愈、治疗、缓解、减轻、改变、补救、改善、增进，或影响疾病、疾病症状，或对该疾病或病症的倾向。
于一些具体实施例中，需要治疗的个体是患有、怀疑患有癌症或有患癌风险的人类患者。
于一些具体实施例中，该癌症为肺癌、黑素瘤、结肠直肠癌、肾细胞癌、尿路上皮癌或霍奇金淋巴瘤。
本发明的组合物可经由生理上可接受途径递送。例如经口、非经口(如肌肉、静脉、皮下、及腹膜)。关于非经口投予，较佳地系以无菌水溶液形式使用，其可包含其他物质，如盐或葡萄糖，足以使溶液与血液等张。水溶液可视需求适当缓冲(如采用pH值3至9)。无菌条件下适用非经口组合物的制备，可以本领域技术人员习知标准药理学技术完成。
于一些具体实施例中，本发明的组合物经由肿瘤内注射(intratumoralinjection)给药。依肿瘤体积大小决定给药量，例如，50mm3的肿瘤给予总共50μg、100μg或200μg的活性成分。例如，可于相对较短的时间(例如，一周内)，隔一天施打一次，共三次或多次。
透过以下实施例进一步说明本发明，这些实施例是为了演示而不是为了限制目的而提供的。鉴于本案，本领域技术人员应该理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以在所公开的具体实施例中进行许多改变，并且仍然获得类似或相似的结果。
实施例
在本发明中，我们设计一种嵌合核酸分子，将具有CpG模体的寡核苷酸及抗LAG-3的适体结合在一起，形成多元体双效核酸药物。本发明的嵌合核酸分子，可同时活化TLR9及抑制LAG-3，尤其产生活化TLR9的协同效果，优于单独使用具有CpG模体的寡核苷酸的效果。本发明的嵌合核酸分子可用于启动全身性免疫反应，有利于疾病治疗。
1.材料和方法
1.1.核酸
核酸从百力生物科技股份有限公司或Integrated DNA Technologies购得。TLR9活性试剂盒从InvivoGen购得(HEK-BlueTM hTLR9,Catalog:hkb-htlr9.HEK-BlueTMDetection,Catalog:hb-det3)。LAG-3 blockade试剂盒从Promega购得(LAG-3 BlockageBioassay,Catalog#:CS194823)。
表1：核酸的序列内容
粗体序列是锚定序列或停泊序列。
1.2嵌合核酸分子的设计及合成
本试验使用三种C695核酸分子(C695FL_B、C695d8_B、C695d8’_B)，各自与抗LAG-3适体，组合在一起，形成嵌合核酸分子。该适体在一端包含锚定序列，使该适体可连接至该C695核酸分子。该C695核酸分子各自在中间部位具有多对互补回文序列(C695序列)及侧翼序列，可与另一相同的C695核酸分子，以碱基配对原则，在相应的中间部位形成分子间(inter-molecule)键结而产生双股结构(桥体)，以及该侧翼序列包含停泊序列，其与该适体的锚定序列互补，使得该C695核酸分子连接到该适体。一份双股的C695核酸分子最终可接上4个适体，形成多元体双效核酸药物。图1显示本发明的嵌合核酸分子的设计。图1显示本发明的嵌合核酸分子的序列结构。
各DNA核酸序列皆回溶于缓冲溶液，含有40mM HEPES、111mM NaCl、5mM KCl、1mMCaCl2、1mM MgCl2，pH值为7.5。最终浓度为终产物嵌合核酸分子的浓度，可依反应前的桥体与适体浓度做调整。反应16小时后利用3％琼脂凝胶进行电泳分析，再以紫外光照射测结果。
1.3高效能液相层析法分析
样品皆使用Waters Alliance e2695液相层析系统分析，搭配Shodex的PROTEINKW-802.5分子筛管柱(Catalog#:F6989000)。移动相的缓冲溶液配方为40mM HEPES、111mMNaCl、5mM KCl、1mM CaCl2、1mM MgCl2，pH值为7.5。每个样品以每分钟流速1ml的等位冲提(isocratic elution)模式冲提15分钟，最终用Empower 3软件分析层析结果。
1.4TLR9活化能力分析
将各个待测试的样品吸取20μl置于96孔盘中，后吸取细胞浓度为4.5x105细胞/ml共180μl加入96孔盘中，使成最终200μl的反应体积。接着放置于37℃恒温培养箱反应16小时。反应完后再吸取各孔中的上清液20μl加入180μl的Quanti-Blue检测试剂成色，使用分光亮度计以655nm吸收光模式侦测8小时(每小时收一次数据)。数据呈现由GraphPad Prism6作图而得。
1.5LAG-3阻抗能力分析
试验第一天，解冻MHCⅡ抗原提呈细胞(antigen presenting cell，APC)并加入TCR活化抗原，接着将细胞种植在试剂盒附的96孔盘中(100μl/孔)，培养18小时于37℃恒温培养箱。
实验第二天，将含有MHCⅡAPC细胞的96孔盘中移除培养液(95μl/孔)，再加入40μl/孔待测样品与LAG-3作用细胞(effector cells)于其中，接着反应6小时于37℃培养箱。6小时后，将反应盘放置于室温15分钟回温。再加入80μl的反应剂于各反应孔中，呈色15分钟后使用GloMax Discover System侦测其各反应的冷光值。数据呈现由GraphPad Prism 6作图而得。
2.结果
2.1嵌合核酸分子的产生
图3显示嵌合核酸分子的电泳分析。结果显示，三种单独C695骨架(桥体)部分均能稳定进行分子间结合成双元体(均接近100bp)(第1、2、3道)，加入B4_SL3_P16抗LAG-3适体后形成嵌合核酸分子，分子量接近250bp，表示形成多元体，100bp位置无产物，表示嵌合效率高，几乎没有残留单独骨架(桥体)部分。此外，进一步以高效能液相层析法分析，结果显示，单独骨架部分的分子筛管柱的滞留时间平均约7.89分钟，加入B4_SL3_P16抗LAG-3适体后，滞留时间平均约6.77分钟，表示分子量整体变大，而7.89分钟处无冲提产物，表示本发明的嵌合核酸分子结合效率及稳定度佳。
2.2本发明的嵌合核酸分子产生活化TLR9的协同效果
图5显示本发明的嵌合核酸分子展现优异的TLR9活化能力。相较于习知的C695(长度为25个核苷酸)或加上硫代磷酸酯键修饰的C695-PS，本发明的嵌合核酸分子活化TLR9能力达2.5-3倍以上。相较于单独骨架部分的C695序列本身，本发明的嵌合核酸分子(结合适体部分)也达到提升活化TLR9能力的趋势，约1.1至1.5倍。结果显示，本发明的嵌合核酸分子产生不可预期的活化TLR9的协同效果。
2.3本发明的嵌合核酸分子具有LAG-3阻抗能力
图6显示本发明的嵌合核酸分子可呈现LAG-3阻抗能力。结果显示，单独骨架部分未显示LAG-3阻抗能力，表示C695序列本身不提供LAG-3阻抗能力。相较之下，本发明的嵌合核酸分子(骨架部分加上抗LAG-3适体)可产生LAG-3阻抗能力，表示本发明的嵌合核酸分子的结构不影响抗LAG-3适体的功能，相当于阳性对照组的LAG-3抗体的效果。IC50分析显示，C695d8_B+B4_SL3_P16的IC50最佳，达102nM。
3.结论
本发明提出的嵌合核酸分子，结合CpG序列及抗LAG-3的适体，结构稳定且保留原本CpG序列及抗LAG-3的适体的活性(TLR9活化能力及LAG-3阻抗能力)。尤其，本发明的嵌合核酸分子产生不可预期的活化TLR9的协同效果，优于嵌合核酸分子中单独的CpG序列(骨架部分)。本发明的嵌合核酸分子达双重功效，有助于启动全身性免疫反应，提高疾病治疗效果(例如，提高癌症病患对治疗的反应率，达到全身性的免疫保护及治疗效果)。
序列表
<110> 中天(上海)生物科技有限公司
<120> 用于免疫调节的嵌合核酸分子及其应用
<130> FB0007CN
<160> 22
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C695FL 核心
<400> 1
aacgttcgaa cgttcgaacg tt 22
<210> 2
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C695d8 核心
<400> 2
aacgttcgaa cgtt 14
<210> 3
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C695d8' 核心
<400> 3
ttcgaacgtt cgaa 14
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C695FL
<400> 4
tcgaacgttc gaacgttcga acgttttt 28
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C695d8
<400> 5
tcgaacgttc gaacgttttt 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C695d8'
<400> 6
tcgttcgaac gttcgaattt 20
<210> 7
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> X-L1-C695FL-L2-Z
<400> 7
gttgtagcac ggtggctcga acgttcgaac gttcgaacgt ttttgttgta gcacggtggc 60
<210> 8
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> X-L1-C695d8-L2-Z
<400> 8
gttgtagcac ggtggctcga acgttcgaac gtttttgttg tagcacggtg gc 52
<210> 9
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> X-L1-C695d8'-L2-Z
<400> 9
gttgtagcac ggtggctcgt tcgaacgttc gaatttgttg tagcacggtg gc 52
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> C695 (25 mers)
<400> 10
tcgaacgttc gaacgttcga acgtt 25
<210> 11
<211> 11
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> LAG-3 模体
<400> 11
gsgggsggty a 11
<210> 12
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗LAG-3适体(12)
<400> 12
tggggggggt tagttcaata catgcgggcg 30
<210> 13
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗LAG-3适体 (13)
<400> 13
tggggggggg ttagacttac actcttattc g 31
<210> 14
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗LAG-3适体 (14)
<400> 14
agaggggggg gttagctgct ttaactcatg 30
<210> 15
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗LAG-3适体 (15)
<400> 15
aggggggggg ttactgcgca tgtatctcag 30
<210> 16
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗LAG-3适体 (16)
<400> 16
tccctacggc gctaactggg gggggttagt tcaatacatg cgggcggcca ccgtgctaca 60
ac 62
<210> 17
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗LAG-3适体 (17)
<400> 17
acggcgctaa ctgggggggg ttagttcaat acatg 35
<210> 18
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗LAG-3适体 (18)
<400> 18
gctaactggg gggggttagt tcaatacatg cgggc 35
<210> 19
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗LAG-3适体 (19)
<400> 19
ctgggggggg ttagttcaat acatgcgggc ggcca 35
<210> 20
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 停泊序列
<400> 20
gttgtagcac ggtggc 16
<210> 21
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 锚定序列
<400> 21
gccaccgtgc tacaac 16
<210> 22
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 适体+锚定序列
<400> 22
gctaactggg gggggttagt tcaatacatg cgggcgccac cgtgctacaa c 51
Claims (8)
1.一种嵌合核酸分子，其包含骨架部分及适体部分，其中骨架部分包含CpG序列，适体部分包含结合至淋巴细胞活化基因3（LAG-3）的适体，以及该骨架部分连接于该适体部分，其中
该CpG序列包含回文序列；
该适体部分包含第一抗LAG-3适体及第二抗LAG-3适体，该第一抗LAG-3适体包含第一锚定序列及该第二抗LAG-3适体包含第二锚定序列；以及
该骨架部分包含第一核酸分子，其包含第一核苷酸序列式5'-X-L1-Y-L2-Z-3'，其中Y是第一CpG序列，L1和L2各自是连接子，X是包含第一停泊序列的核苷酸片段，Z是包含第二停泊序列的核苷酸片段，该第一停泊序列互补于该第一锚定序列，以及该第二停泊序列互补于该第二锚定序列，使得该骨架部分的第一核酸分子与该适体部分的第一抗LAG-3适体及第二抗LAG-3适体相连接
其中该第一抗LAG-3适体及该第二抗LAG-3适体分别是由5'- GC TAA CTG GGG GGGGTT AGT TCA ATA CAT GCG GGC GCC ACC GTG CTA CAA C-3'的核苷酸序列所组成；以及
该第一核酸分子是由5'- GTT GTA GCA CGG TGG C TCG AAC GTT CGA ACG TTC GAACGT T TT T GTT GTA GCA CGG TGG C-3'的核苷酸序列所组成；或
该第一核酸分子是由5'- GTT GTA GCA CGG TGG C TCG AAC GTT CGA ACG TT TTTGTT GTA GCA CGG TGG C-3'的核苷酸序列所组成；或
该第一核酸分子是由5'- GTT GTA GCA CGG TGG C TCG TTC GAA CGT TCG AA TTTGTT GTA GCA CGG TGG C -3'的核苷酸序列所组成。
2.如权利要求1所述的嵌合核酸分子，其中
该适体部分进一步包含第三抗LAG-3适体及第四抗LAG-3适体，该第三抗LAG-3适体包含第三锚定序列及该第四抗LAG-3适体包含第四锚定序列；
该骨架部分进一步包含第二核酸分子，其包含第二核苷酸序列式5'-X'-L1'-Y'-L2'-Z'-3'，其中Y'是第二CpG序列，L1'和L2'各自是连接子，X'是包含第三停泊序列的核苷酸片段，Z'是包含第四停泊序列的核苷酸片段，该第三停泊序列互补于该第三锚定序列，以及该第四停泊序列互补于该第四锚定序列，使得该骨架部分的第二核酸分子与该适体部分的第三抗LAG-3适体及第四抗LAG-3适体相连接；以及
在该骨架部分，第一核酸分子的第一CpG序列互补于第二核酸分子的第二CpG序列
其中该第三抗LAG-3适体及该第四抗LAG-3适体分别是由5'- GC TAA CTG GGG GGGGTT AGT TCA ATA CAT GCG GGC GCC ACC GTG CTA CAA C-3'的核苷酸序列所组成；以及
该第二核酸分子是由5'- GTT GTA GCA CGG TGG C TCG AAC GTT CGA ACG TTC GAACGT T TT T GTT GTA GCA CGG TGG C-3'的核苷酸序列所组成；或
该第二核酸分子是由5'- GTT GTA GCA CGG TGG C TCG AAC GTT CGA ACG TT TTTGTT GTA GCA CGG TGG C-3'的核苷酸序列所组成；或
该第二核酸分子是由5'- GTT GTA GCA CGG TGG C TCG TTC GAA CGT TCG AA TTTGTT GTA GCA CGG TGG C -3'的核苷酸序列所组成。
3.一种用于在癌症个体调节免疫反应的医药组合物，其包含如权利要求1或2所述的嵌合核酸分子，以及医药上可接受的载剂。
4.如权利要求3所述的医药组合物，其进一步包含免疫检测点拮抗剂。
5.一种如权利要求1或2所述的嵌合核酸分子或如权利要3或4所述的医药组合物用于制备在癌症个体调节免疫反应的药物的用途。
6.如权利要求5所述的用途，其中个体是患有癌症的人类患者。
7.如权利要求6所述的用途，其该癌症选自肺癌、黑素瘤、结肠直肠癌、肾细胞癌、尿路上皮癌和霍奇金淋巴瘤所组成的群组。
8.如权利要求6所述的用途，其中该药物是调配成肌肉内或肠内投用的形式。
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