CN116670276A - 用于通过多个靶标治疗疼痛的治疗组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供了非阿片类疼痛治疗组合物，这些治疗组合物包含与NaV通道mRNA上的所识别靶标互补的反义寡核苷酸(ASO)。该ASO与其靶RNA杂交并且形成募集RNA酶H以降解该RNA的双链体，由此下调NaV通道合成，这会抑制神经元促进疼痛感知的能力。该ASO靶向特定所识别靶标之一并且可以以包含侧接有经修饰的RNA翼的中心DNA片段的间隙体(gapmer)的形式提供。当该组合物体外递送至背根神经节(DRG)神经元时，这些DRG神经元表现出NaV1.7、NaV1.8或NaV1.9的剂量依赖性敲低。

Description

用于通过多个靶标治疗疼痛的治疗组合物

技术领域

本公开涉及用于治疗疼痛的非阿片类治疗组合物。

背景技术

在美国，疾病控制中心估计有多达1亿人患有慢性疼痛。一种流行的用于治疗疼痛的方法包含使用阿片类药物。虽然阿片类药物是非常有效的疼痛治疗方法，但这些成瘾药物的滥用被认为是流行病问题。然而，有许多常见的医疗病状是痛苦的经历和生活。

一种经常引起严重慢性疼痛的常见医疗病状是骨关节炎。当关节中的软骨破坏或磨损时，就会发生骨关节炎，最终导致关节表面上的暴露的骨头相互摩擦，并且可能碎裂或分裂。许多患有骨关节炎的人都熟悉这种病状带来的持久疼痛。另一种可能引起严重慢性疼痛的常见医疗病状是癌症。美国癌症协会(American Cancer Society)将癌症疼痛归因于癌症本身，而不仅仅是对癌症的炎性应答。研究表明，癌细胞本身驱动感觉神经元的超敏反应。因此，不仅癌症可以表现为肿瘤或扩散到全身，而且癌症本身可以是剧烈疼痛的直接原因。

存在用于治疗疼痛的各种方法，但每种方法都与特定的局限相关联。非处方非甾体抗炎药(NSAID)可能缺乏用于治疗某些形式的疼痛的必要功效。另外，一些人对NSAID无应答或不能耐受对消化系统和肾功能的副作用。阿片类药物被认为对治疗疼痛有效，但会带来巨大的人类和社会成本，并且随时间推移，由于耐受性的发展，可能会失去功效。阿片类药物是成瘾的麻醉剂，并且众所周知与滥用、转移、甚至欺诈和犯罪活动有关。NSAID和阿片类药物治疗的另外的严重缺点包含高死亡率。

发明内容

本发明提供了用于治疗疼痛的治疗组合物，这些治疗组合物不需要或不包含阿片类药物。这些组合物包含短核酸或寡核苷酸，其防止涉及疼痛感知的蛋白质的合成。具体地，某些神经元充当“疼痛感觉(pain-sensing)”神经或伤害感受器。这些疼痛感觉神经元具有充当电压门控钠通道的蛋白质。当对神经末梢的刺激超过阈值电压(V)时，伤害感受器神经元传导钠离子(Na+)穿过细胞膜，这可以使神经元以再生的方式去极化，从而导致作为痛觉基础的传播电信号的“触发(firing)”。本发明的组合物包含寡核苷酸，该寡核苷酸与用于制造能够产生痛觉的钠通道蛋白的信使RNA(mRNA)或前体mRNA(前体mRNA)结合。本发明包含在这些RNA中识别许多特异性有效靶标。寡核苷酸防止了这些蛋白质的产生，从而降低了这些疼痛感觉神经元的敏感性或活性。因为疼痛感觉神经元的活性降低，所以患者经历疼痛要少得多。这些组合物不需要包含任何阿片类药物或其它麻醉剂，并且因此不会形成习惯。这些组合物可以与阿片类药物组合使用，以减少阿片类药物的有效剂量。因此，这些组合物通过下调疼痛感觉神经元中的钠通道来提供长期疼痛缓解。

人类中存在九个电压门控钠通道家族，命名为NaV1.l至NaV1.9。在这九种蛋白质中，NaV1.7、NaV1.8和NaV1.9在伤害感受器背根神经节(DRG)神经元中表达，并促进疼痛感知。

本公开的寡核苷酸被设计成与用于合成NaV1.7蛋白、NaV1.8蛋白和NaV1.9蛋白的RNA中的某些靶标结合。寡核苷酸的结合防止蛋白质合成并下调对应NaV通道的表达。具体地，寡核苷酸具有与NaV通道前体mRNA或mRNA上的一个所识别靶标基本上或完全互补的序列。即，寡核苷酸与所识别靶标是反义的。当反义寡核苷酸(ASO)与其靶RNA杂交时，它们形成双链ASO:RNA双链体，该双链体募集降解双链的双链体的一部分的酶(RNA酶H)。降解ASO:RNA双链体使NaV通道mRNA的神经元耗竭，这减少了由细胞合成的NaV通道的量。下调NaV通道表达干扰了神经元促进疼痛感知的能力。

因此，当向患者施用包含与NaV1.7前体mRNA或mRNA；NaV1.8前体mRNA或mRNA；或NaV 1.9前体mRNA或mRNA中的所识别靶标反义的寡核苷酸的组合物时，患者的疼痛经历将会减轻。因此，本公开的组合物可用于治疗患者的疼痛，而不需要使用阿片类药物，并且还可以最小化或导致阿片类药物的使用量降低。

在某些方面，本公开提供了一种用于治疗疼痛的组合物。该组合物包含寡核苷酸，该寡核苷酸沿着编码钠通道蛋白的前体mRNA或mRNA的与SEQ ID NO:1-141之一至少约75％互补的片段与该RNA杂交，以便由此防止该RNA翻译成该钠通道蛋白。该寡核苷酸可以与以下中的一者或多者杂交并且敲低以下中的一者或多者的表达：NaV1.7前体mRNA或mRNA；NaV1.8前体mRNA或mRNA和NaV1.9前体mRNA或mRNA。优选地，该寡核苷酸中的碱基序列与SEQID NO:1-141之一具有至少80％同一性。例如，该寡核苷酸中的碱基序列可以与SEQ ID NO:1-101之一至少90％或95％相同，并且该寡核苷酸可以与以下杂交并且诱导以下的RNA酶H切割：NaV1.7前体mRNA或mRNA；或NaV1.8前体mRNA或mRNA。该组合物可以包含多个治疗性寡核苷酸，该多个治疗性寡核苷酸各自具有与SEQ ID NO:1-141之一至少80、90、95或100％相同的碱基序列。

本公开的治疗性寡核苷酸可以具有包含侧接有经修饰的RNA翼的中心DNA片段的间隙体结构(gapmer structure)。这种治疗性寡核苷酸可以包含侧接具有DNA碱基(例如，约8个至10个DNA碱基)的中心区的两个翼。优选地，该寡核苷酸的至少一个端部包括经修饰的RNA碱基，例如2'-O-甲氧基乙基RNA(“2'-MOE”)和/或2'-O-甲基RNA(“2'O-Me”)的任何数量或任何组合。另外，本发明的组合物可以被设计成靶向外显子-外显子连接，以便不同地靶向细胞质与细胞核mRNA。因此，本发明的ASO可以被设计成在剪接之前或之后与RNA相互作用，增加了组合物的特异性和多功能性。

该治疗性寡核苷酸可以在被调配成用于鞘内注射的溶液或载体中提供，优选地每年约3至4次。该寡核苷酸可以具有任何合适的长度，例如至少约13个碱基，优选地介于约15个与25个碱基之间。该寡核苷酸的主链中可以具有硫代磷酸酯键。在优选的实施例中，该寡核苷酸具有已经过筛选并且确定不满足人的任何长的非编码RNA或其它脱靶序列或转录物的阈值匹配的碱基序列。该寡核苷酸可以具有与非人灵长类动物基因组中的同源片段具有0个错配并且与啮齿动物基因组中的同源片段具有不超过约5个错配的碱基序列。

当该组合物体外递送至背根神经节(DRG)神经元时，这些DRG神经元表现出NaV1.7、NaV1.8或NaV1.9的剂量依赖性敲低。该寡核苷酸可以是具有与SEQ ID NO:1-141之一至少90％匹配的碱基序列的间隙体，其中碱基通过硫代磷酸酯连接进行连接。这些连接可以是所有硫代磷酸酯或硫代磷酸酯和磷酸二酯键的混合物。该寡核苷酸可以进一步具有侧接有5'翼和3'翼的中心10个DNA碱基，该5'翼和该3'翼各自包括五个连续的2'修饰的RNA碱基。优选地，该寡核苷酸具有与SEQ ID NO:1-141之一相匹配的碱基序列，该碱基序列具有通过硫代磷酸酯连接进行连接的碱基，和具有5'翼和3'翼的中心DNA碱基的结构。翼中的RNA碱基和中心片段中的DNA碱基的数量可以是5-10-5或4-12-4，或类似的合适模式。5'翼和3'翼可以各自包含若干2'-MOE RNA碱基。例如，寡核苷酸在具有10个DNA碱基的每个翼中可以具有5个连续的2'-MOE RNA碱基(“5-10-5”结构)，在整个中心DNA片段中具有硫代磷酸酯连接，并且在翼中具有硫代磷酸酯和磷酸二酯键的混合物。

在组合实施例中，本发明提供了组合物，这些组合物在合适的调配物或载体中包含多个不同的治疗性间隙体的多个拷贝的，该多个治疗性间隙体各自根据上文的描述。

优选地，相比对照间隙体，本公开的寡核苷酸表现出优至少25％的NaV敲低(例如，在体外使用DRG神经元的测定中，其中该对照间隙体由仅通过硫代磷酸酯连接进行连接并且进一步包括侧接有五个连续2'-MOE RNA碱基的5'翼和五个连续2'-MOE RNA碱基的3'翼的中心10个DNA碱基的GCCAUAATCCGGGTTUCUGC(SEQ ID NO:165)组成)。

本公开的各方面提供了一种反义寡核苷酸(ASO)用于制造用于治疗患者的疼痛的药物的用途。在该用途中，ASO与SEQ ID NO:1-141之一具有至少约75％同一性，并且更优选地至少90％同一性，例如95％或100％同一性。优选的实施例使用长度介于约15个与25个碱基之间，优选地介于约18个与22个之间，或介于约19个与21个之间(包含端值)的ASO。通常，提到“ASO”时，包含大量基本上相同分子的拷贝。因此，“ASO”可以是所指示的ASO的任何数量的，例如，几十万或几百万个拷贝。在优选的实施例中，ASO长度为20个碱基，并且具有SEQID NO:1-141之一的序列，并且用于制备用于治疗疼痛的药物。ASO可以以任何合适的格式提供，如例如在管中冻干或在管如微量离心管或试管中的溶液中。使用靶标NaV1.7和/或NaV1.8的优选实施例。一个或多个(例如，两个、三个、四个或五个或更多个)ASO可以用于制造药物。该一个或多个ASO可以与NaV1.7前体mRNA或mRNA、或NaV1.8前体mRNA或mRNA中的靶标杂交。在该用途的某些实施例中，ASO中的碱基序列与SEQ ID NO:1-101之一至少90％相同。在实施例中，ASO可以具有间隙体结构，该间隙体结构的中心DNA片段侧接有RNA翼，例如，具有10个DNA碱基的中心区，在中心区的两侧上具有5个经修饰的RNA碱基。每个经修饰的RNA碱基可以是2'-MOE。优选地，ASO的主链具有多个硫代磷酸酯键，例如，在用途实施例中，大多数或所有的糖连接可以是硫代磷酸酯。对应药物可以被调配成用于鞘内递送。因此，ASO最初可以呈适于混合到适于通过注射或泵引入的调配物中的形式。例如，ASO(一个ASO的数千或数百万或更多拷贝)可以在管中或在已知质量摩尔浓度或浓度的溶液中冻干。可以将ASO溶解或稀释到药学上可接受的组合物中，在该组合物中，载体如溶剂和/或赋形剂包含ASO，并且可以将其装载在IV袋、注射器或泵中。可以使用超过一个ASO，例如2个、3个、4个或5个或更多个的任何组合来制备药物。为了增加本发明的组合物的广度和有效性，可以对本发明的组合物中的碱基进行修饰或使用摆动碱基。在一个实例中，用于本发明的ASO可以含有经甲基化的碱基(例如，5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿嘧啶(胸腺嘧啶)等)。

本发明的组合物可以被调配成适应连续给药。例如，调配物可以提供要在两个或更多个不同时间施用的剂量，并且任选地，具有两个或更多个不同的ASO，以便利用最佳治疗窗并避免ASO之间的潜在竞争。另外，本发明的组合物，无论是否连续施用，都可以与超过一个靶标相互作用，这取决于所涉及的ASO的组成。例如，ASO可以包括允许与多个靶标相互作用的靶向错配(在mRNA和前体mRNA种类内和之间)，从而允许相关的治疗影响超过一个通道。

附图说明

图1示出了用于治疗疼痛的组合物。

图2示出了具有间隙体结构的寡核苷酸。

图3示出了2'-O-甲氧基乙基(MOE)修饰的核糖糖。

图4示出了DNA片段中的硫代磷酸酯键。

图5给出了通过17个不同ASO敲低NaV1.7的qPCR测定的结果。

图6示出了与对照相比，靶向NaV1.7的ASO的效果。

图7示出了本公开的ASO的靶标选择性。

图8比较了核糖糖修饰对ASO的作用。

图9示出了抗NaV1.7 ASO的作用。

图10示出了抗NaV1.8 ASO的作用。

图11示出了用组合组合物治疗时的神经活性水平。

具体实施方式

图1示出了用于治疗疼痛的组合物101。组合物101包含与mRNA 117或前体mRNA中的靶片段115杂交的寡核苷酸107。mRNA 117编码钠通道蛋白。包含靶标的mRNA 117的片段115与SEQ ID NO:1-141之一至少约75％互补。寡核苷酸107与mRNA 117的片段115的杂交防止了mRNA翻译成钠通道蛋白。寡核苷酸107可以与以下中的一者或多者杂交并且敲低以下中的一者或多者的表达：NaV1.7前体mRNA或mRNA；NaV1.8前体mRNA或mRNA；和NaV1.9前体mRNA或mRNA。优选地，该寡核苷酸中的碱基序列与SEQ ID NO:1-141之一具有至少80％同一性，并且更优选地至少90％同一性。

在某些实施例中，该寡核苷酸中的碱基序列与SEQ ID NO:1-101之一至少90％相同，其中该寡核苷酸可以与以下杂交并且诱导以下的RNA酶H切割：NaV1.7 mRNA或NaV1.8mRNA。

寡核苷酸107与mRNA 117中的片段115杂交，因为寡核苷酸107基本上或完全与mRNA 117的靶片段115反义。在这个意义上，该组合物包含反义寡核苷酸(ASO)。基于ASO化学结构和设计，组合物101包含通过碱基对互补性与靶RNA结合并发挥各种作用的ASO。可以使用通常在神经疾病的临床前模型和人类临床试验开发中采用的各种机制。这些机制包含：通过RNA酶H酶的募集进行RNA靶标降解；用于包含或排除外显子的替代性剪接修饰，以及用于抑制miRNA与其靶标结合的miRNA抑制。

本公开的优选实施例包含与电压门控钠通道(NaV通道)前体mRNA或mRNA杂交并募集RNA酶H酶的ASO。RNA酶H酶切割下调NaV通道蛋白的表达的NaV通道RNA。因此，本公开的寡核苷酸107将NaV通道作为用于疼痛疗法的靶标。本公开建立在临床和临床前数据支持使用小分子NaV阻断剂进行疼痛疗法的认识基础上。例如，IV利多卡因(lidocaine)和利多卡因贴剂已经表现出缓解疼痛的作用，这表明阻断利多卡因的靶标的合成可以提供类似的作用。事实上，许多用于神经性疼痛的药剂，如三环类药物和选择性血清素再摄取抑制剂，具有多种作用机制，但都具有阻断NaV通道的能力。钠通道NaV1.7、NaV1.8和NaV1.9与疼痛有关。这些蛋白质提供了疼痛表型的遗传联系。例如，NaV1.7功能丧失与先天性疼痛不敏感有关(在小鼠模型中复制)。另外地，NaV1.7和NaV1.8功能获得性均与过度疼痛障碍有关。此外，NaV1.9功能获得性与对疼痛不敏感的神经病有关。遗传见解为选择性地靶向NaV1.7和NaV1.8以及

NaV1.9提供了理论依据。包含抗NaV ASO的组合物可以施用于受试者以治疗或减轻疼痛。可以发现，抗NaV ASO提供了优于其它方法如利多卡因的益处，因为抗NaV ASO可以是状态非依赖性的和亚型选择性的。

因此，本公开提供了一种反义寡核苷酸(ASO)用于制造用于治疗患者的疼痛的药物的用途。在该用途中，ASO与SEQ ID NO:1-141之一具有至少约75％同一性，并且更优选地至少90％同一性，例如95％或更大同一性。优选的实施例使用长度介于约15个与25个碱基之间，优选地介于约18个与22个之间(包含端值)的ASO。通常，提到“ASO”时，包含大量基本上相同分子的拷贝。“ASO”可以是所定义的ASO的超过几十万或几百万个拷贝。在优选的实施例中，ASO长度为20个碱基，并且具有SEQ ID NO:1-141之一的序列，并且用于制备用于治疗疼痛的药物。ASO可以以任何合适的格式提供，如例如在管中冻干或在管如微量离心管或试管中的溶液中。使用靶标NaV1.7和/或NaV1.8的优选实施例。一个或多个(例如，两个、三个、四个或五个或更多个)ASO可以用于制造药物。该一个或多个ASO可以与NaV1.7 mRNA或NaV1.8 mRNA中的靶标杂交。在该用途的某些实施例中，ASO中的碱基序列与SEQ ID NO:1-101之一至少90％相同。在该用途的实施例中，ASO可以具有间隙体结构，该间隙体结构的中心DNA片段侧接有RNA翼，例如，具有10个DNA碱基的中心区，在中心区的两侧上具有5个经修饰的RNA碱基。每个经修饰的RNA碱基可以是2'-MOE RNA、2'-O-Me RNA或其它合适的糖。优选地，ASO的主链具有多个硫代磷酸酯键，仅包含或者也包含磷酸二酯键，例如，在用途实施例中，大多数或所有的糖连接可以是硫代磷酸酯。药物可以被调配成用于鞘内(IT)递送。因此，ASO最初可以呈适于混合到适于引入到鞘内泵中的调配物中的形式。例如，ASO(一个ASO的数千或数百万或更多拷贝)可以在管中或在已知质量摩尔浓度的溶液中冻干。可以将ASO溶解或稀释到药学上可接受的组合物中，在该组合物中，载体如溶剂或赋形剂包含ASO，并且可以将其装载在IV袋、注射器或鞘内泵中。可以使用超过一个ASO，例如2个、3个、4个或5个或更多个的任何组合来制备药物。

在用途实施例中描述的任何ASO可以包含在本公开的组合物中。本公开的组合物的优选实施例包含多个治疗性寡核苷酸，该多个治疗性寡核苷酸各自具有与SEQ ID NO:1-141之一至少80％相同的碱基序列，其中该治疗性寡核苷酸中的每个治疗性寡核苷酸都具有间隙体结构(gapmer structure)，该间隙体结构包括侧接有经修饰的RNA翼的中心DNA片段，其中该多个治疗性寡核苷酸在被调配成用于鞘内注射的溶液或载体中提供。

图2示出了具有间隙体结构的寡核苷酸207。寡核苷酸207包含两个翼(第一翼215和第二翼216)，这两个翼侧接具有约10个DNA碱基的中心区221。在优选实施例中，翼215、216全部或主要是RNA碱基，而中心区221全部或主要是DNA碱基。优选地，翼都是RNA碱基(经修饰的或未经修饰的)，并且中心区都是DNA碱基。在一些实施例中，每个翼由5个RNA碱基组成，所有或大部分碱基是经修饰的RNA碱基，例如，其中每个经修饰的RNA碱基选自由2'-O-甲氧基乙基RNA和2'-O-甲基RNA组成的组。经修饰的RNA碱基可以包含在核糖糖的2'羟基上的取代。

图3示出了可以包含在RNA碱基中的2'-O-甲氧基乙基(“2'-MOE”)修饰的糖。

寡核苷酸207优选地包含至少约15个碱基，并且可以包含约15个约25个碱基。在一些实施例中，寡核苷酸207具有包括多个硫代磷酸酯键的主链。

图4示出了DNA的片段的主链如寡核苷酸207的中心区221内的硫代磷酸酯键505。寡核苷酸207可以包含一个或任何数量的硫代磷酸酯键505。例如，寡核苷酸207内的每个主链连接可以是硫代磷酸酯，或者大部分或大约一半可以是硫代磷酸酯。

组合物101可以被调配成用于递送。因此，寡核苷酸107最初可以呈适于混合到适于引入到注射器、袋或注射泵中的调配物中的形式。例如，寡核苷酸107(一个寡核苷酸107的数千或数百万或更多拷贝)可以在管中或在已知质量摩尔浓度的溶液中冻干。可以将寡核苷酸107溶解或稀释到药学上可接受的组合物中，在该组合物中，载体如溶剂或赋形剂包含寡核苷酸107，并且可以将其装载在IV袋、注射器或鞘内泵中。如所描述的，组合物101包含至少一个寡核苷酸107，该至少一个寡核苷酸的序列通过与SEQ ID NO:1-141之一进行比较来定义。因此，本公开的组合物由所识别靶标来定义和说明。

具体地，寡核苷酸107沿着编码钠通道蛋白的mRNA的与SEQ ID NO:1-141之一至少约75％互补的片段与该mRNA杂交，以便由此防止mRNA翻译成该钠通道蛋白。这是在寡核苷酸与SEQ ID No:1-141之一具有至少约75％同一性，优选地至少约90％或95％同一性的情况下实现的。在某些实施例中，寡核苷酸具有SEQ ID No:1-141之一的序列，尽管本领域技术人员将理解与互补靶标具有90％或优选地95％同一性的寡核苷酸仍倾向于以序列特异性方式与靶标杂交。通过沃森-克里克碱基配对(Watson-Crick base pairing)和碱基堆积形成双链结构在能量上是足够有利的，以至于双链结构可以每十个左右容忍大约1个错配的碱基对。因此，在DRG神经元中适度严格的生理条件下，95％同一性应当是有效的，特别是在寡核苷酸具有带有至少几个经修饰的RNA碱基或硫代磷酸酯主链连接的间隙体结构以保护寡核苷酸免于酶降解的情况下。

事实上，本公开的组合物的特征和益处是靶(SEQ ID No:1-141)已经被筛选以排除补体存在于除钠通道转录物之外的分子中的序列。例如，针对RNA转录物数据库筛选序列，包含长的非编码RNA(IncRNA)，并且与非靶序列相匹配的初始序列被排除。因此，当施用于患者时，具有SEQ ID No:1-141的序列的ASO与非靶序列杂交的机会应当最小。因此，在优选的实施例中，寡核苷酸107具有已经过筛选并且确定不满足人的任何脱靶编码或长的非编码RNA的阈值匹配的碱基序列。满足上述标准的组合物或用途不应当在体内与脱靶物质如lncRNA结合，因为所包含的序列已经针对lncRNA的数据库进行了筛选。已经筛选了本公开的序列的靶标特异性。优选地，寡核苷酸107具有与人类或非人灵长类动物基因组中的同源片段具有0个错配并且与啮齿动物基因组中的同源片段具有不超过约5个错配的碱基序列。

当该组合物体外递送至背根神经节(DRG)神经元时，该DRG表现出NaV1.7、NaV1.8或NaV1.9的剂量依赖性敲低。

图5给出了通过根据本公开的实施例设计的17个不同ASO(各自3种浓度)在大鼠中敲低NaV1.7的qPCR测定的结果(20个碱基，10个碱基的DNA中心区，该中心区侧接有具有2'-O修饰的RNA和通过ASO的硫代磷酸酯连接的RNA翼)。沿着图的底部，给出了“起始定位”，即在大鼠SCN9A mRNA内的位置。最右边的3个柱示出了仅施用对照时的表达水平。相对于对照，至少在最高浓度下，所有17个ASO都降低了NaV1.7表达。对起始于位置1294的20个碱基靶标具有特异性的ASO表现出最强的敲低。该图给出了3个浓度，在DIV8施加，使用裸生物递送的17个ASO的结果，同时表达水平相对于GAPDH归一化。该图示出了，本公开的组合物101表现出NaV1.7的剂量依赖性敲低。

因为核酸杂交对错配具有一定的耐受性，根据图中所示的模式，可以发现寡核苷酸107表现出剂量依赖性敲低，该寡核苷酸具有与SEQ ID NO:1-141之一具有至少90％匹配的碱基序列，其中碱基仅通过硫代磷酸酯连接进行连接，并且其中寡核苷酸107具有侧接有5'翼和3'翼的DNA碱基的中心片段(例如，5-10-5结构，其中5'翼和3'翼各自包括侧接10个DNA碱基的五个连续的2'修饰的RNA碱基；或4-12-4结构；或类似结构)。在一些实施例中，寡核苷酸107特异性地具有与SEQ ID NO:1-141之一(更优选地SEQ ID NO:1-101之一)相匹配的碱基序列，其中碱基通过硫代磷酸酯连接进行连接(任选地在翼中具有一些磷酸二酯键)，其中寡核苷酸107具有侧接5'翼和3'翼的中心10个DNA碱基，并且其中5'翼和3'翼各自包含五个连续的2'MOE RNA碱基。

图6示出了与对照相比，靶向NaV1.7的ASO对大鼠DRG神经元中的DIV14处mRNA表达的作用。应注意，本公开的组合物101可以包含被调配成用于鞘内施用的载体中的前述权利要求中一项的多个不同的治疗性间隙体的多个拷贝。优选地，在体外使用DRG的测定中，相比对照间隙体，寡核苷酸107中的任何一个或多个寡核苷酸表现出优至少25％的NaV敲低，其中候选寡核苷酸和对照主要或仅通过硫代磷酸酯连接进行连接，并且包含具有侧接2'-MOE RNA碱基的5'翼和2'-MOE RNA碱基的3'翼的DNA碱基的中心片段。

因为这些组合物在敲低钠通道的表达方面是有效的，所以本公开的组合物可以用于治疗经历严重顽固性疼痛的患者群体。本公开的方法包含向有需要的患者施用本公开的任何组合物，以由此治疗或缓解癌症疼痛(例如，来自转移性骨癌)或神经性疼痛(例如，与功能获得性NaV突变相关的小纤维神经病)或其它群体。本公开的方法可以用于将任何NaV通道作为初级靶标，并且可以另外包含用于次级靶标的寡核苷酸。例如，初级靶标可以是NaV1.7(其中寡核苷酸与SEQ ID No:1-53之一或多个具有显著同一性)，次级靶标可以是NaV1.8和/或NaV1.9(其中寡核苷酸分别与SEQ ID No:54-101和/或SEQ ID No:102-141之一或多个具有显著同一性)。

图7示出了在大鼠DRG中通过qPCR测试的大鼠NaV靶向的ASO的选择性。上图示出了递送对NaV1.7具有特异性的ASO对mRNA水平的作用。中图示出了递送对NaV1.8具有特异性的ASO的作用；下图是针对NaV1.9。在所有图中，第四个三联体柱给出了递送450nM混合ASO(150nM NaV1.7 ASO+150nM NaV1.8 ASO+150nM NaV1.9 ASO)的结果。在每个图中，非靶NaV通道没有被ASO敲低(Nav1.7 ASO没有敲低NaV1.8或NaV 1.9等的表达，示出了靶标选择性)。3个寡核苷酸107的混合物显示出敲低所有三个靶标。

图8比较了本公开的寡核苷酸107内的核糖糖修饰的作用。以具有2'-O-甲基(OMe)核糖糖修饰的形式和具有2'-O-甲氧基乙基(MOE)核糖糖修饰的形式测试了具有与人SCN9A基因(SEQ ID NO:6)的位置1294开始的20个碱基相匹配的20个碱基序列的寡核苷酸107。针对对照寡核苷酸SEQ ID NO:165进行了类似的测试。发现本公开的寡核苷酸优于对照，并且如所示出的，MOE修饰优于OMe修饰(显示出对靶标相对表达的更大抑制)。因此，对于本公开的寡核苷酸来说，在RNA核糖糖上包含一个或多个2'-O-甲氧基乙基(MOE)修饰可能是优选的。例如，ASO可以具有各自约五个RNA碱基的5'翼和3'翼，并且在这些翼中，大多数或所有的核糖糖可以是2'MOE。

在体外大鼠DRG神经元中测试了Nav1.7和Nav1.8 ASO的组合作用。体外神经元包含在光刺激下提供神经激活的光遗传构建体(例如，使神经元响应于光而触发的经修饰的藻类光敏感通道蛋白)和神经活性的光学报告子(与神经元膜电压成比例发光并产生神经元活性信号的经修饰的古紫质(archaerhodopsin))。体外神经元在荧光显微镜仪器中测定，并且用疼痛介体组合物(例如，模拟的“癌症疼痛汤(cancer pain soup)”)处理，该疼痛介体组合物作为刺激物引起DRG神经元以类似于体内疼痛经历的方式触发。可以使用任何合适的光遗传构建体、光遗传显微镜或疼痛介体组合物。例如，合适的光遗传构建体包含美国专利9,594,075中描述的那些，该专利通过引用并入。合适的光遗传显微镜包含美国专利10,288,863中描述的那些，该专利通过引用并入。合适的疼痛介体组合物包含WO 2018/165577中描述的那些，该文献通过引用并入。

体外DRG测定包含在不断增加的光学刺激下，单独测量来自光遗传神经样品的光。这给出了神经兴奋性的基线读数。然后，用刺激物刺激神经样品，此处刺激物为包括以下的混合物的疼痛介体组合物：细胞因子、蛋白酶、pH、坏死因子或可以在疼痛肿瘤部位的体内发现的其它因子。测量用该刺激物处理的神经样品的光。最后，用本公开的组合物处理神经样品。假设在刺激物使测得的兴奋性远离测得的基线的情况下，寡核苷酸107将倾向于使测得的兴奋性恢复到基线。进一步预期NaV1.7和NaV1.8在不同(尽管重叠)的神经活性条件下表现出其作用。结果显示，相对于单独的NaV1.7或NaV1.8 ASO，抗NaV1.7和抗NaV1.8 ASO的组合在更大的输入刺激水平范围内更大量地减轻了对疼痛刺激物的神经应答。

图9示出了在基线、用刺激物处理和用刺激物和抗NaV1.7 ASO处理下，响应蓝光刺激的增加斜坡的神经活性的测得水平。正如预期的那样，NaV1.7 ASO降低了响应于刺激物表现出的神经兴奋性。

图10示出了在基线、用刺激物处理和用刺激物和抗NaV1.8 ASO处理下，响应蓝光刺激的增加斜坡的神经活性的测得水平。正如预期的那样，NaV1.8 ASO降低了响应于刺激物表现出的神经兴奋性，尽管是在输入刺激功率的不同区域。

图11示出了在基线和用刺激物和包括抗NaV1.7 ASO和抗NaV1.8 ASO的组合物处理下，响应蓝光刺激的增加斜坡的神经活性的测得水平。寡核苷酸组合的净疼痛减轻效果优于单独的寡核苷酸。在输入刺激的整个范围内，DRG神经元的活性水平显著较低。可以发现，通过施用包括靶向不同NaV通道的不同寡核苷酸的组合物，经历各种疼痛状况的活体受试者将受益于更大范围和效力的止痛效果。

本公开的方法和组合物可以有益地用于将本文所描述的治疗性寡核苷酸107递送至遭受疼痛的患者体内的背根神经节(DRG)神经元。可以使用任何合适的递送途径，包含例如全身性递送(例如，通过注射)或局部递送(例如，通过皮下注射或植入缓慢释放装置)。在一些实施例中，通过鞘内注射递送本公开的组合物101。本公开的方法可以包含约每隔几个月，例如每年约3或4次，通过鞘内注射递送本公开的组合物。

鞘内注射是指通过注射到椎管或蛛网膜下腔中使药物到达脑脊液(CSF)的使用途径，并且可用于脊髓麻醉、化学疗法或疼痛管理应用。鞘内递送避免了组合物被血脑屏障阻止。优选地，组合物101被调配成这种调配物，以便不含任何防腐剂或其它可能有害的非活性成分，这些成分有时在标准的可注射药物制剂中发现。组合物101可以在鞘内泵中提供，或者可以在适于在临床中重构的调配物中提供，用于通过鞘内泵递送。例如，组合物101可以在所定义浓度的溶液中(例如，在盐水中)。技术人员可以在诊所将该浓度与合适的稀释剂混合用于递送。在其它实施例中，ASO被冻干或以其它方式以干燥固体形式保存，以在临床中重新悬浮和适当稀释。鞘内递送减少了对PK、代谢、外周中靶/脱靶效应的担忧。鞘内施用方法已经与其它药物如齐考诺肽(Ziconotide)和ASO如诺西那生(nusinersen)一起进行了临床应用验证。这种方法可以用于将本公开的组合物101直接递送至神经系统。

本公开的寡核苷酸，如组合物101中的间隙体、ASO或治疗性寡核苷酸107，可以具有参考表1中所示的序列之一定义的序列。例如，本公开的寡核苷酸可以具有与表1中所示的SEQ ID NO:1-141之一至少约75％、80％、90％、95％或完全相同的序列。针对SCN9A的最优选实施例包含表1中标记如下的那些："4/6"(SEQ ID NO:6)；"4/10"(SEQ ID NO:10)；和"4/11"(SEQ ID NO:11)。这三个候选物以剂量依赖性方式显示出NaV 1.7的稳健且显著的敲低活性(>75％)。针对SCN10A的最优选实施例包含表1中标记如下的那些："5/8"(SEQ IDNO:61)；"5/18"(SEQ ID NO:71)；"5/20"(SEQ ID NO:73)。这三个候选物以剂量依赖性方式显示出NaV 1.8的稳健且显著的敲低活性(>65％)。针对SCN11A的最优选实施例包含表1中标记如下的那些："6/1"(SEQ ID NO:102)；"6/3"(SEQ ID NO:104)；和"6/6"(SEQ ID NO:107)。这三个候选物以剂量依赖性方式显示出NaV 1.9的稳健且显著的敲低活性(>70％)。

如上文所讨论，在基线时、用刺激物处理时和用刺激物和包括抗NaV1.7 ASO和抗NaV1.8 ASO的组合物处理时，测得的神经活性水平显示出寡核苷酸的组合比单独的5个寡核苷酸表现更好。如本文所公开的，针对SCN9A(又名NaV1.7)的最优选实施例包含具有SEQID NO:6；SEQ ID NO:10；或SEQ ID NO:11之一的那些实施例。针对SCN10A(又名NaV1.9)的最优选实施例包含具有SEQ ID NO:61；SEQ ID NO:71；或SEQ ID NO:73之一的那些实施例。因此，本公开的最优选的组合实施例包含用于治疗疼痛的组合物。组合物10包含：第一寡核苷酸，该第一寡核苷酸沿着编码钠通道蛋白的mRNA的与SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10和SEQID NO:11之一至少约90％互补的片段与该mRNA杂交；以及第二寡核苷酸，该第二寡核苷酸沿着编码钠通道蛋白的mRNA的与SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:71和SEQ ID NO:73之一至少约90％互补的片段与该mRNA杂交。在优选的组合实施例中，这些治疗性寡核苷酸中的每个治疗性寡核苷酸可以具有包含侧接有经修饰的RNA翼的中心DNA片段的间隙体结构。

一个或两个翼可以包含经修饰的RNA碱基，例如，两个翼可以包含5个连续的具有2'-O-甲氧基乙基核糖糖修饰的RNA碱基。每个寡核苷酸的整体可以通过磷酸二酯或硫代磷酸酯连接或对技术人员显而易见的其它连接进行连接。优选地，该多个治疗性寡核苷酸以冻干或溶液形式提供，用于在临床中稀释或重构以进行鞘内注射。也就是说，冻干或以溶液形式包装在一个或多个管中的是第一寡核苷酸的至少数千至数百万个拷贝和第二寡核苷酸的至少数千至数百万个拷贝。表现出如图11所展示的效果，该组合物的优选组合实施例可以证明作为用于治疗疼痛的非阿片类治疗剂具有意想不到的益处。

其它特征和实施例在本公开的范围内。本公开的实施例包含寡核苷酸，包含靶向SCN9A或SCN10A的能够抑制表达NaV1.7和/或NaV1.8的细胞中的NaV1.7或NaV 1.8的表达的锁定核酸(LNA)反义寡核苷酸。本发明的寡核苷酸可以用于预防或治疗疼痛。本发明进一步提供了人NaV1.7前体mRNA上的有利靶位点序列，其可以被人NaV1.7的寡核苷酸抑制剂如反义寡核苷酸或RNAi药剂如siRNA或shRNA靶向。

本发明提供了长度为10个至30个核苷酸的寡核苷酸，该寡核苷酸包括长度为10个至30个核苷酸的连续核苷酸序列，该连续核苷酸序列与人NaV1.7靶核酸和人NaV1.8靶核酸具有至少90％的互补性，如100％的互补性，并且该寡核苷酸能够抑制细胞中的NaV1.7或NaV1.8两者的表达。寡核苷酸107可以与SEQ ID NO:1-141之一100％相同，或者至少90％相同。

实施例包含根据本发明的反义寡核苷酸或根据本发明的缀合物的药学上可接受的盐。

本发明提供了一种药物组合物，其包括本发明的反义寡核苷酸或本发明的缀合物以及药学上可接受的稀释剂、溶剂、载体、盐和/或佐剂。

本发明提供了用于药物的本发明的反义寡核苷酸或本发明的缀合物或本发明的药学上的盐或组合物。

本发明提供了用于治疗或预防或减轻疼痛的本发明的反义寡核苷酸或本发明的缀合物或本发明的药学上的盐或组合物。本发明提供了本发明的反义寡核苷酸或本发明的缀合物或本发明的药学上的盐或组合物用于制备用于治疗、预防或减轻疼痛的药物的用途。

在一些实施例中，该疼痛是慢性疼痛、神经性疼痛、炎性疼痛、自发性疼痛或伤害性疼痛。

寡核苷酸通常在实验室中通过固相化学合成随后纯化并分离的方式制备分离。提及寡核苷酸的序列时，是指共价连接核苷酸或核苷的核碱基部分或其修饰的序列或顺序。本发明的寡核苷酸可以是人造的，即化学合成的，并且通常经过纯化或分离。本发明的寡核苷酸可以包括一个或多个经修饰的核苷或核苷酸，如2'糖修饰的核苷。

经修饰的核苷酸可以独立地选自由以下组成的组：脱氧核苷酸、3'末端脱氧胸腺嘧啶(dT)核苷酸、2'-O-甲基修饰的核苷酸、2'-氟修饰的核苷酸、2'-脱氧修饰的核苷酸、锁定核苷酸、解锁核苷酸、构象限制性核苷酸、约束乙基核苷酸、非碱性核苷酸、2'-氨基修饰的核苷酸、2'-O-烯丙基修饰的核苷酸、2'-C-烷基修饰的核苷酸、2'-羟基修饰的核苷酸、2'-甲氧基乙基修饰的核苷酸、2'-O-烷基修饰的核苷酸、吗啉代核苷酸、氨基磷酸酯、包括核苷酸的非天然碱基、1,5-失水己糖醇修饰的核苷酸、环己烯基修饰的核苷酸、包括硫代磷酸酯基团的核苷酸、包括甲基膦酸酯基团的核苷酸、包括5'-磷酸酯的核苷酸、包括5'-磷酸酯模拟物的核苷酸、二醇修饰的核苷酸和2'-0-(N-甲基乙酰胺)修饰的核苷酸以及其组合。

ASO的含氮碱基可以是天然存在的核碱基，如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸苷、尿嘧啶、黄嘌呤和次黄嘌呤，以及非天然存在的变体，如经取代的嘌呤或经取代的嘧啶，如选自异胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-噻唑并-胞嘧啶、5-丙炔基-胞嘧啶、5-丙炔基-脲嘧啶、5-溴脲嘧啶、5-噻唑并-脲嘧啶、2-硫脲嘧啶、2'硫胸腺嘧啶、肌苷、二氨基嘌呤、6-氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤及2-氯-6-氨基嘌呤的核碱基。

核碱基部分可以用每一对应核碱基的字母代码表示，例如A、T、G、C或U，其中各字母可任选地包含对等功能的经修饰的核碱基。例如，在示例性寡核苷酸中，核碱基部分选自A、T、G、C和5-甲基胞嘧啶。任选地，对于LNA间隙体，可以使用5-甲基胞嘧啶LNA核苷。

本公开的寡核苷酸107能够下调(抑制)钠通道(NaV1.7、1.8或1.9)的表达。在一些实施例中，本发明的反义寡核苷酸能够通过抑制或下调靶标的表达来调节该靶标的表达。优选地，与靶标的正常表达水平相比，这种调节产生至少20％的表达抑制，更优选地，与靶标的正常表达水平相比，产生至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的抑制。

本公开的反义寡核苷酸(ASO)可以降低靶核酸的水平(例如通过RNA酶H切割)，或者可以降低靶核酸的功能性(或改变功能性)，例如通过调节前体mRNA的剪接。

本公开的寡核苷酸107可以包括一个或多个具有经修饰的糖部分的核苷，即与DNA及RNA中发现的核糖糖部分相较时对糖部分的修饰。目前已制成了众多具有对核糖糖部分的修饰的核苷，主要目的为改善寡核苷酸的特定特性，如亲和力和/或核酸酶抗性。这种修饰包含对核糖环结构的修饰，例如替代为己糖环(HNA)，或通常在核糖环上的C2与C4碳原子之间具有桥的双环(LNA)，或通常在C2与C3碳原子之间无键的未连接的核糖环(例如，UNA)。经修饰的核苷也包含将糖部分替代为非糖部分的核苷，例如肽核酸(PNA)或吗啉基核酸的情况。

糖修饰也包含经由将核糖环上的取代基团改变为除在DNA及RNA核苷中自然存有的氢或2'-OH基团以外的基团来进行的修饰。取代基可例如在2'、3'、4'或5'位置引入。

寡核苷酸可以包含一个或多个锁定核酸(LNA)碱基。LNA可以包含2'-修饰的核苷，其包括连接所述核苷的核糖环的C2'和C4'的双基(也称为“2'-4'桥”)，其限制或锁定核糖环的构象。这些核苷于文献中也称为桥接的核酸或双环核酸(BNA)。核糖的构象的锁定与在将LNA并入寡核苷酸中时对于互补RNA或DNA分子杂交的亲和力增强(双链体稳定化)相关。通过测量寡核苷酸/互补双链体的解链温度，可对此进行常规的确定。非限制性的示例性LNA核苷公开于WO 99/014226、WO 00/66604、WO 98/039352、WO 2004/046160、WO 00/047599、WO 2007/134181、WO 2010/077578、WO 2010/036698、WO 2007/090071、WO 2009/006478、WO 2011/156202、WO 2008/154401、WO 2009/067647和WO 2008/150729中，全部通过引用并入。

本公开的寡核苷酸的药学上可接受的盐包含保留游离碱或游离酸的生物有效性和性质的那些盐，其在生物学上或其它方面都不是非所需的。这些盐是用无机酸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸，具体地盐酸，以及有机酸如乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、马来酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、磺酸或水杨酸形成的。另外，这些盐可以通过向游离酸中添加无机碱或有机碱来制备。衍生自无机碱的盐包含但不限于钠盐、钾盐、锂盐、铵盐、钙盐、镁盐。衍生自有机碱的盐包含但不限于伯胺、仲胺和叔胺的盐，取代胺包含天然存在的取代胺、环胺和碱性离子交换树脂，如异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、赖氨酸、精氨酸、N-乙基哌啶、哌啶、聚胺树脂。

寡核苷酸107可以介导或促进核酸酶介导的钠通道前体mRNA或mRNA转录物的降解。核酸酶介导的降解是指当与互补核苷酸序列形成双链体时，能够介导这种序列的降解的寡核苷酸。在一些实施例中，寡核苷酸可以通过核酸酶介导的靶核酸降解起作用，其中本发明的寡核苷酸能够募集核酸酶，特别是核酸内切酶，优选地核糖核酸内切酶(RNA酶)，如RNA酶H。通过核酸酶介导的机制起作用的寡核苷酸设计的实例是这样的寡核苷酸，其通常包括具有至少5个或6个连续DNA核苷的区域，并且在一侧或两侧侧接有亲和力增强的核苷，例如间隙体。反义寡核苷酸107的RNA酶H活性是指其在与互补RNA分子形成双链体时募集RNA酶H的能力。

本发明的反义寡核苷酸107，或其连续核苷酸序列，可以是间隙体，也被称为间隙体寡核苷酸或间隙体设计。反义间隙体通常用于通过RNA酶H介导的降解来抑制靶核酸。间隙体寡核苷酸包括至少三个不同的结构区域：5'-侧翼、间隙和3'-侧翼、'5->3'朝向的F-G-F'。“间隙”区(G)包括一段连续的DNA核苷酸，这些核苷酸使寡核苷酸能够募集RNA酶H。间隙区侧接有包括一个或多个糖修饰的核苷，有利地高亲和力的糖修饰的核苷的5'侧接区(F)，以及包括一个或多个糖修饰的核苷，有利地高亲和力的糖修饰的核苷的3'侧接区(F')。区域F和F'中的一个或多个糖修饰的核苷增强了寡核苷酸对靶核酸的亲和力(即，亲和力增强的糖修饰的核苷)。在一些实施例中，区域F和F'中的一个或多个糖修饰的核苷是2'糖修饰的核苷，如高亲和力2'糖修饰，如独立地选自LNA和2'-MOE。

混合的翼间隙体是LNA间隙体，其中区域F和F'中的一个或两个包括2'取代的核苷，如独立地选自由以下组成的组的2'取代的核苷：2'-O-烷基-RNA单元、2'-O-甲基-RNA单元、2'-氨基-DNA单元、2'-氟-DNA单元、2'-烷氧基-RNA单元、MOE单元、阿拉伯核酸(ANA)单元、2'-氟-ANA单元或其组合。在其中区域F和F'中的至少一个或区域F和F'两者包括至少一个LNA核苷的一些实施例中，区域F和F'的剩余核苷独立地选自由2'-MOE和LNA组成的组。在其中区域F和F'中的至少一个或区域F和F'两者包括至少两个LNA核苷的一些实施例中，区域F和F'的剩余核苷独立地选自由2'-MOE和LNA组成的组。在一些混合翼实施例中，区域F和F'中的一个或两个可以进一步包括一个或多个DNA核苷。在WO 2008/049085和WO 2012/109395中讨论了间隙体的设计，这两个文献通过引用并入本文。

寡核苷酸107对一个或多个非核苷酸部分的缀合可以例如通过影响寡核苷酸的活性、细胞分布、细胞摄入或稳定性，来改善寡核苷酸的药理学。在一些实施例中，缀合物部分可以通过改善寡核苷酸的细胞分布、生物利用度、代谢、排泄、通透性和/或细胞摄取来调节或增强寡核苷酸的药代动力学特性。具体地，缀合物可以使寡核苷酸靶向特定的器官、组织或细胞类型，并且由此增强寡核苷酸在这种器官、组织或细胞类型中的有效性。缀合物还可以用于降低寡核苷酸在非靶细胞类型、组织或器官中的活性，例如脱靶活性或在非靶细胞类型、组织或器官中的活性。

在一个实施例中，非核苷酸部分(缀合物部分)选自由以下组成的组：糖、细胞表面受体配体、药物、激素、亲脂物质、聚合物、蛋白质、肽、毒素(例如，细菌毒素)、维生素、病毒蛋白(例如，衣壳)或其组合。

本公开的寡核苷酸107可以在药物组合物中提供，这些药物组合物包含任何前述寡核苷酸和/或寡核苷酸缀合物或其盐，以及药学上可接受的稀释剂、载体、盐和/或佐剂。药学上可接受的稀释剂包含ACSF人工脑脊液，并且药学上可接受的盐包含但不限于钠盐和钾盐。在一些实施例中，药学上可接受的稀释剂是无菌磷酸盐缓冲盐水或无菌碳酸钠缓冲液。在一些优选的实施例中，用于临床应用的稀释剂包含艾略特氏B溶液(Elliott'sBsolution)和/或ACSF人工脑脊液。

在一些实施例中，本发明的寡核苷酸呈在药学上可接受的稀释剂中的溶液的形式，例如溶解在PBS或碳酸钠缓冲液中。寡核苷酸可以预先调配在溶液中，或者在一些实施例中可以呈干燥粉末(例如，冻干粉末)的形式，该干燥粉末可以在施用前溶解在药学上可接受的稀释剂中。合适地，例如寡核苷酸可以以0.1-100mg/mL如1-10mg/mL的浓度溶解。

本公开的组合物可以施用于患者用于预防或治疗疼痛，如慢性疼痛、神经性疼痛、炎性疼痛、自发性疼痛或伤害性疼痛。本发明的寡核苷酸或本发明的缀合物、盐或药物组合物可以用作局部镇痛剂。

可以由本发明的寡核苷酸或本发明的缀合物、盐或药物组合物治疗的疼痛可以是其中疼痛信号位于外周神经系统中的疼痛。与具有显著外周组成部分的疼痛相关的适应症包含例如糖尿病性神经病、癌症、颅神经痛、带状疱疹后神经痛和手术后神经痛。

使用本发明的寡核苷酸、缀合物、组合物或盐可以预防、治疗或改善的疼痛可以例如选自由以下组成的组：与遗传性红斑性肢痛症(IEM)相关的疼痛、阵发性极度疼痛障碍(PEPD)、三叉神经痛、神经性疼痛、慢性疼痛，以及伤害性疼痛(例如，神经压迫)、神经性疼痛(例如，糖尿病性神经病)、内脏疼痛、癌症疼痛或混合疼痛的一般治疗。本发明提供了用于预防或治疗疼痛，如慢性疼痛、神经性疼痛、炎性疼痛、自发性疼痛、癌症疼痛或伤害性疼痛的本发明的寡核苷酸、缀合物、组合物或盐。

本公开提供了用于治疗或预防患有或可能患有疼痛的受试者如人的疼痛的方法，该方法包括将治疗或预防有效量的本发明的寡核苷酸、寡核苷酸缀合物或药物组合物施用于患有或易患疼痛如癌症疼痛、骨关节炎疼痛、慢性疼痛、神经性疼痛、炎性疼痛、自发性疼痛或伤害性疼痛的受试者，其中该寡核苷酸靶向与SEQ ID NO:1-141之一互补的序列。

双重敲低实施例

本公开的实施例涉及通过多个靶标治疗疼痛的治疗组合物。这些组合物包含寡核苷酸，该寡核苷酸沿着来自钠通道蛋白(例如，人NaV1.7/NaV1.8)的超过一个基因的RNA的与SEQ ID NO:142-164之一至少约75％互补的片段与该RNA杂交，以便由此防止该RNA翻译成该钠通道蛋白。注意：SCN9A是NaV1.7；SCN10A是NaV1.8；并且SCN11A是NaV1.9。

该寡核苷酸可以具有与SEQ ID NO:142-164之一至少80％相似的序列(尽管是“间隙体”结构，具有DNA核和RNA翼)。寡核苷酸的外翼可以包含经修饰的RNA化学，如例如，大部分或全部由2-甲氧基乙基(2'-MOE)RNA碱基构成。优选的实施例在翼内包含几个(例如，二个至四个)磷酸二酯键，同时所有其它碱基间的连接是硫代磷酸酯。例如，第二个、第三个、第四个、第十五个和第十七个连接(按照序列中书写的方向)可以是磷酸二酯，同时所有其它连接是硫代磷酸酯。值得注意的是，在这种实施例中，最外连接和涉及DNA碱基的所有连接优选地是硫代磷酸酯，剩余三个RNA间连接包含两个或三个磷酸二酯连接(其余是硫代磷酸酯)。在优选的实施例中，组合物包含一个或多个寡核苷酸的拷贝，该一个或多个寡核苷酸各自具有由SEQ ID NO:142-164之一给出的序列，具有5-9-5(RNA-DNA-RNA)间隙体设计，其中最外碱基间连接和涉及DNA碱基的所有连接是硫代磷酸酯，并且其中每个翼的另外三个RNA间连接包括两个或三个磷酸二酯连接(其余是硫代磷酸酯)。

由SEQ ID NO:142-164例示的人NaV1.7/NaV1.8双重敲低序列各自优选地以19聚体ASO间隙体设计提供，遵循5×9×5构型，具有9碱基的DNA核和5'RNA样翼和3'RNA样翼。优选地，5'翼和3'翼至少基本上遵循2-甲氧基乙基(2'-MOE)化学，并且主链连接包含硫代磷酸酯(PS)和磷酸二酯(PO)的混合物(例如，最外碱基间连接和涉及DNA碱基的所有连接都是PS，并且在该主链中，每个翼的其它三个RNA间连接包括两个或三个PS连接，其余为PO)。在某些实施例中，人NaV1.7/NaV1.8双重敲低包括具有由SEQ ID NO:142-164之一给出的序列的寡核苷酸以及如刚描述的间隙体组合物。

在双重敲低序列中，第一优选的实施例，被称为第1组，由SEQ ID No:142-152说明，也被描述为参考号(靶标代码/编号)4/61-4/71。

所有第1组双重敲低ASO与人SCN9A转录物具有100％匹配，并且与人SCN10A仅具有1个核苷酸错配。所指示的第1组的双敲低ASO寡核苷酸具有5-9-5间隙体设计，具有9个碱基的DNA核以及5'RNA样翼和3'RNA样翼。5'翼和3'翼包含2-甲氧基乙基(2'-MOE)化学。主链包含硫代磷酸酯(PS)和磷酸二酯(PO)的混合物，例如，其中第二个、第三个、第四个、第十五个和第十七个连接(按照序列中书写的方向)可以是PO，同时所有其它连接是PS。优选地，SEQID No:142-152中的任一个均具有主链化学。此第1组中的每个序列与人SCN9A前RNA或mRNA中的靶序列具有零个错配，并且与人SCN10A前RNA或mRNA中的靶序列具有1个错配。

在双重敲低序列中，第二优选的实施例被称为第2组，由SEQ ID NO:153-164说明，也被描述为参考号(靶标代码/编号)5/49-5/60。所有第2组双重敲低ASO与人SCN10A转录物具有100％匹配，并且与人SCN9A仅具有1个核苷酸错配。所指示的第2组的双敲低ASO寡核苷酸具有5-9-5间隙体设计，具有9个碱基的DNA核以及5'RNA样翼和3'RNA样翼。5'翼和3'翼包含2-甲氧基乙基(2'-MOE)化学。主链包含硫代磷酸酯(PS)和磷酸二酯(PO)的混合物，例如，其中第二个、第三个、第四个、第十五个和第十七个连接(按照序列中书写的方向)可以是PO，同时所有其它连接是PS。优选地，SEQ ID NO:153-164中的任一个均具有主链化学。此第2组中的每个序列与人SCN9A前RNA或mRNA中的靶序列具有1个错配，并且与人SCN10A前RNA或mRNA中的靶序列具有零个错配。

在某些双重敲低实施例中，本发明提供了长度为10个至30个核苷酸的寡核苷酸，该寡核苷酸包括长度为10个至30个核苷酸的连续核苷酸序列，该连续核苷酸序列与人NaV1.7靶核酸和人NaV1.8靶核酸具有至少90％的互补性，如100％的互补性，并且该寡核苷酸能够抑制细胞中的NaV1.7或NaV1.8两者的表达。

图12示出了本公开的ASO提供了对多个Nav靶标的有效和选择性敲低。在该图中，上图示出了当用2种浓度的四个不同的ASO(标记为ASO1、ASO2、ASO3和ASO4)处理时，除NaV1.5和NaV1.2之外的NaV1.7的比较表达水平。下图示出了当用2种浓度的这同样四个不同的ASO(同样为ASO1、ASO2、ASO3和ASO4)处理时，除NaV1.5和NaV1.2之外的NaV1.8的比较表达水平。

上图中的第一组六个柱显示出，在5nM或15nM浓度的ASO1下，与NaV1.5和NaV1.2的表达相比，NaV1.7的表达显著敲低。出乎意料的是，下图中的第一组六个柱显示出，在5nM或15nM浓度的ASO1下，与NaV1.5和NaV1.2的表达相比，NaV1.8的表达显著敲低。即，上图和下图上的最左边组的六个柱显示出，与NaV1.5和NaV1.2相比，ASO1特异性敲低NaV1.7和NaV1.8的表达。一起看上图和下图，第二组的部分显示出ASO2的相同情况；第三组的柱显示出ASO3的相同结果；并且第四组六个柱显示出ASO4的相同结果。这些数据有力地表明，本公开的ASO能够抑制NaV1.7或NaV1.8两者的表达。

不同的Nav通道具有不同的生物物理性质和兴奋性作用。

图13示出了哪些Nav通道基本上或主要涉及神经活性的阈值、阈值下和阈值以上的兴奋性。这些数据是通过使用蓝光和光贴片构建体(Optopatch construct)刺激神经元和测量钠(Na)电导率获得的。蓝光刺激方案被用来表征每个Nav在伤害感受器触发中的作用。数据表明，NaV1.7和NaV1.8是阈值处和阈值以上活性的主要驱动因子，并且因此这些靶标代表用于治疗疼痛的治疗组合物的有价值的靶标。此处，本公开提供了针对经验证的靶Nav1.7和Nav1.8的基于反义寡核苷酸的治疗剂。

Claims (36)

1.一种用于治疗疼痛的组合物，所述组合物包括：

寡核苷酸，所述寡核苷酸沿着编码钠通道蛋白的RNA的与SEQ ID NO:1-164之一至少约75％互补的片段与所述RNA杂交，以便由此防止所述RNA翻译成所述钠通道蛋白。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述寡核苷酸与以下中的一者或多者杂交并且敲低以下中的一者或多者的表达：NaV1.7前体mRNA或mRNA；NaV1.8前体mRNA或mRNA；和NaV1.9前体mRNA或mRNA。

3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述寡核苷酸中的碱基序列与SEQ ID NO:1-164之一具有至少80％同一性。

4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述寡核苷酸中的碱基序列与SEQ ID NO:1-101之一至少90％相同，其中所述寡核苷酸能够与以下杂交并且诱导以下的RNA酶切割：NaV1.7前体mRNA或mRNA；或NaV1.8前体mRNA或mRNA。

5.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物包括多个治疗性寡核苷酸，所述多个治疗性寡核苷酸各自具有与SEQ ID NO:1-164之一至少80％相同的碱基序列，其中所述治疗性寡核苷酸中的每个治疗性寡核苷酸都具有间隙体结构(gapmer structure)，所述间隙体结构包括侧接有经修饰的RNA翼的中心DNA片段，其中所述多个治疗性寡核苷酸在被调配成用于鞘内注射的溶液或载体中提供。

6.根据权利要求1所述的组合物，其中所述寡核苷酸包括侧接具有至少10个DNA碱基的中心区的两个翼。

7.根据权利要求1所述的组合物，其中所述寡核苷酸的至少一个端部包括经修饰的RNA碱基。

8.根据权利要求7所述的组合物，其中每个经修饰的RNA碱基选自由2'-O-甲氧基乙基RNA和2'-O-甲基RNA组成的组。

9.根据权利要求1所述的组合物，其中所述寡核苷酸包括至少约15个碱基。

10.根据权利要求1所述的组合物，其中所述寡核苷酸包括约15个约25个之间的碱基。

11.根据权利要求1所述的组合物，其中所述寡核苷酸具有包括多个硫代磷酸酯键的主链。

12.根据权利要求1所述的组合物，其中所述寡核苷酸具有已经过筛选并且确定不满足人的任何非靶标转录物的阈值匹配的碱基序列。

13.根据权利要求1所述的组合物，其中所述寡核苷酸具有与非人灵长类动物基因组中的同源片段具有0个错配并且与啮齿动物基因组中的同源片段具有不超过约5个错配的碱基序列。

14.根据权利要求1所述的组合物，其中当所述组合物体外递送至背根神经节(DRG)神经元时，所述DRG神经元表现出NaV1.7、NaV1.8或NaV1.9的剂量依赖性敲低。

15.根据权利要求1所述的组合物，其中所述寡核苷酸具有与SEQ ID NO:1-141之一具有至少90％匹配的碱基序列，其中碱基仅通过硫代磷酸酯连接进行连接，所述寡核苷酸进一步包括侧接有5'翼和3'翼的中心10个DNA碱基，所述5'翼和所述3'翼各自包括五个连续的2'修饰的RNA碱基。

16.根据权利要求1所述的组合物，其中所述寡核苷酸具有与SEQ ID NO:1-141之一相匹配的碱基序列，其中大部分碱基间连接包括硫代磷酸酯连接，所述寡核苷酸进一步包括侧接有5'翼和3'翼的中心10个DNA碱基，所述5'翼和所述3'翼各自包括五个连续的2'MOERNA碱基。

17.一种组合物，其包括被调配成用于鞘内施用的载体中的多个不同的前述权利要求中一项的治疗性间隙体的多个拷贝。

18.根据权利要求1所述的组合物，其中在体外使用DRG神经元的测定中，相比对照间隙体，所述寡核苷酸表现出优至少25％的Nav敲低。

19.根据权利要求1所述的组合物，其中所述RNA中的一个或多个碱基是经甲基化的。

20.根据权利要求19所述的组合物，其中所述经甲基化的碱基选自5-甲基胞嘧啶和5-甲基尿嘧啶(胸腺嘧啶)。

21.一种用于治疗疼痛的组合物，所述组合物包括：

寡核苷酸，所述寡核苷酸沿着编码两个不同钠通道蛋白的两个RNA中的每个RNA的与SEQ ID NO:142-164之一至少约75％互补的片段与所述两个RNA上的位置杂交，以便由此防止所述RNA其相应钠通道蛋白的翻译。

22.根据权利要求21所述的组合物，其中所述寡核苷酸与以下杂交并且敲低以下的表达：NaV1.7前体mRNA或mRNA；和NaV1.8前体mRNA或mRNA。

23.根据权利要求21所述的组合物，其中所述寡核苷酸中的碱基序列与SEQ ID NO:142-164之一具有至少89％同一性。

24.根据权利要求21所述的组合物，其中所述寡核苷酸中的碱基序列与SEQ ID NO:142-164之一至少94％相同，其中所述寡核苷酸能够与以下杂交并且诱导以下的RNA酶切割：NaV1.7前体mRNA或mRNA；和NaV1.8前体mRNA或mRNA。

25.根据权利要求21所述的组合物，其中所述组合物包括多个治疗性寡核苷酸，所述多个治疗性寡核苷酸各自具有与SEQ ID NO:140-164之一至少94％相同的碱基序列，其中所述治疗性寡核苷酸中的每个治疗性寡核苷酸都具有间隙体结构，所述间隙体结构包括侧接有经修饰的RNA翼的中心DNA片段。

26.根据权利要求21所述的组合物，其中所述寡核苷酸包括侧接具有至少9个DNA碱基的中心区的两个翼。

27.根据权利要求21所述的组合物，其中所述寡核苷酸的至少一个端部包括经修饰的RNA碱基。

28.根据权利要求27所述的组合物，其中每个经修饰的RNA碱基是2'-O-甲氧基乙基RNA。

29.根据权利要求21所述的组合物，其中所述寡核苷酸包括约19个碱基。

30.根据权利要求21所述的组合物，其中所述寡核苷酸具有包括多个硫代磷酸酯键的主链。

31.根据权利要求21所述的组合物，其中所述寡核苷酸具有包括硫代磷酸酯(PS)和磷酸二酯(PO)的混合物的主链，在所述主链中，最外碱基间连接和涉及DNA碱基的所有连接都是PS，并且在所述主链中，每个翼的其它三个RNA间连接包括两个或三个PS连接，其余为PO。

32.根据权利要求21所述的组合物，其中所述寡核苷酸具有已经过筛选并且确定不满足人的任何非靶标转录物的阈值匹配的碱基序列。

33.根据权利要求21所述的组合物，其中所述寡核苷酸具有SEQ ID NO:142-152或153-164之一的碱基序列。

34.根据权利要求21所述的组合物，其中当所述组合物体外递送至背根神经节(DRG)神经元时，所述DRG神经元表现出NaV1.7和NaV1.8的剂量依赖性敲低。

35.根据权利要求21所述的组合物，其中所述寡核苷酸具有与SEQ ID NO:142-164之一具有至少94％匹配的碱基序列，在所述碱基序列中，至少最外碱基间连接和涉及DNA碱基的所有连接是硫代磷酸酯，并且其中所述寡核苷酸进一步包括侧接有5'RNA翼和3'RNA翼的中心9个DNA碱基，所述5'翼和所述3'翼各自包括五个连续的2'修饰的RNA碱基。

36.根据权利要求35所述的组合物，其中所述寡核苷酸具有SEQ ID NO:142-164之一的序列，并且其中两个RNA翼均由5个2-甲氧基乙基修饰的RNA碱基组成。