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CN111278859A - 包含酶替代疗法酶的融合蛋白 - Google Patents

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CN111278859A
CN111278859A CN201880068837.6A CN201880068837A CN111278859A CN 111278859 A CN111278859 A CN 111278859A CN 201880068837 A CN201880068837 A CN 201880068837A CN 111278859 A CN111278859 A CN 111278859A
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M·S·丹尼斯
J·A·盖茨
A·亨利
M·科里奥利
C·马霍
A·P·西尔弗曼
A·斯里瓦斯塔瓦
J·厄尔曼
J·王
J·Y·扎克海洛
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Denali Therapeutics Inc
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Denali Therapeutics Inc
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Abstract

本文提供了包含酶替代疗法酶和Fc区的融合蛋白，以及使用此类蛋白质来治疗溶酶体贮积症的方法。本文还提供了将剂运送穿过血脑屏障的方法。

Description

包含酶替代疗法酶的融合蛋白
相关申请的交叉引用
本申请要求于2017年10月2日提交的美国临时专利申请62/566,898、于2017年11月8日提交的美国临时专利申请62/583,276、于2018年2月5日提交的美国临时专利申请62/626,365、于2018年5月30日提交的美国临时专利申请62/678,183以及于2018年8月22日提交的美国临时专利申请62/721,396的优先权，所述临时专利申请的公开内容出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。
序列表
本申请含有序列表，所述序列表已以ASCII格式以电子方式提交并且以全文引用的方式并入本文中。所述ASCII副本创建于2018年9月28日，名称为102342-000350PC-1103949_SL.txt并且大小为580,464字节。
背景技术
溶酶体贮积症(LSD)为相对罕见的由溶酶体功能缺陷引起的遗传性代谢疾病。LSD典型地由缺乏参与溶酶体中的代谢产物分解的单一酶引起。由缺乏酶活性引起的产物积累影响各种器官系统并且会导致严重症状和早亡。大部分LSD还具有在进行性神经变性和严重认知损伤至癫痫、行为以及精神病症范围内的显著神经组分。可使用LSD中缺乏的酶的重组形式来治疗所述所述病症，但此类疗法对脑部可能几乎没有作用，这是由于难以将重组酶递送穿过血脑屏障(BBB)。
发明内容
本文提供了包含酶替代疗法(ERT)酶的融合蛋白以及使用所述融合蛋白来治疗溶酶体贮积症(LSD)的方法。
在一些方面中，本文提供了一种蛋白质，所述蛋白质包含：
(a)第一Fc多肽，所述第一Fc多肽键联至ERT酶、ERT酶变体或其催化活性片段；以及
(b)第二Fc多肽，所述第二Fc多肽与第一Fc多肽形成Fc二聚体。
在一些实施方案中，第一Fc多肽和/或第二Fc多肽不包括免疫球蛋白重链和/或轻链可变区序列或其抗原结合部分。
在一些实施方案中，ERT酶为艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶(IDS)、IDS变体或其催化活性片段。在一些实施方案中，ERT酶包含与SEQ ID NO:91、92、114、230以及234中的任一者的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，ERT酶包含SEQ ID NO:91、92、114、230以及234中的任一者的氨基酸序列。
在一些实施方案中，ERT酶为N-磺基葡糖胺磺基水解酶(SGSH)、SGSH变体或其催化活性片段。在一些实施方案中，ERT酶包含与SEQ ID NO:119和120中的任一者的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，ERT酶包含SEQID NO:119和120中的任一者的氨基酸序列。
在一些实施方案中，ERT酶为酸性神经鞘磷脂酶(ASM)、ASM变体或其催化活性片段。在一些实施方案中，ERT酶包含与SEQ ID NO:121、122以及123中的任一者的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，ERT酶包含SEQID NO:121、122以及123中的任一者的氨基酸序列。
在一些实施方案中，ERT酶为β-葡糖脑苷脂酶(GBA)、GBA变体或其催化活性片段。在一些实施方案中，ERT酶包含与SEQ ID NO:93和94中的任一者的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，ERT酶包含SEQ ID NO:93和94中的任一者的氨基酸序列。
在一些实施方案中，第一Fc多肽为融合多肽，所述融合多肽通过肽键或通过多肽接头键联至ERT酶、ERT酶变体或其催化活性片段。在一些实施方案中，多肽接头为柔性多肽接头。在一些实施方案中，柔性多肽接头为富含甘氨酸的接头。在一些实施方案中，富含甘氨酸的接头为G4S(SEQ ID NO:239)或(G4S)2(SEQ ID NO:240)。在一些实施方案中，第一Fc多肽不通过化学交联剂键联至ERT酶、ERT酶变体或其催化活性片段，例如融合多肽不包括非肽键或非多肽接头。
在某些实施方案中，融合多肽从N端到C端包含：ERT酶、ERT酶变体或其催化活性片段；多肽接头；以及第一Fc多肽。
在一些实施方案中，第二Fc多肽键联至ERT酶、ERT酶变体或其催化活性片段。在一些实施方案中，第二Fc多肽为融合多肽，所述融合多肽通过肽键或通过多肽接头键联至ERT酶、ERT酶变体或其催化活性片段。在一些实施方案中，多肽接头为柔性多肽接头。在一些实施方案中，柔性多肽接头为富含甘氨酸的接头。在一些实施方案中，富含甘氨酸的接头为G4S(SEQ ID NO:239)或(G4S)2(SEQ ID NO:240)。在一些实施方案中，第二Fc多肽不通过化学交联剂键联至ERT酶、ERT酶变体或其催化活性片段，例如融合多肽不包括非肽键或非多肽接头。
在一些实施方案中，第一Fc多肽的N端和/或第二Fc多肽的N端键联至ERT酶。在一些实施方案中，第一Fc多肽的N端键联至一个ERT酶并且第二Fc多肽的N端键联至另一ERT酶。
在一些实施方案中，第一Fc多肽的C端和/或第二Fc多肽的C端键联至ERT酶。在一些实施方案中，第一Fc多肽的C端键联至一个ERT酶并且第二Fc多肽的C端键联至另一ERT酶。
在一些实施方案中，第一Fc多肽的N端键联至一个ERT酶并且第二Fc多肽的C端键联至另一ERT酶。在一些实施方案中，第一Fc多肽的C端键联至一个ERT酶并且第二Fc多肽的N端键联至另一ERT酶。
在一些实施方案中，蛋白质包含单个ERT酶，并且第一Fc多肽的N端或C端键联至ERT酶。在一些实施方案中，蛋白质包含两个ERT酶(例如刚好两个ERT酶)。在一些实施方案中，蛋白质包含刚好一个或刚好两个ERT酶、酶变体或其催化活性片段。
在一些实施方案中，第一Fc多肽为被修饰的Fc多肽和/或第二Fc多肽为被修饰的Fc多肽。
在一些实施方案中，第一Fc多肽和第二Fc多肽各自含有促进异二聚化的修饰。在一些实施方案中，Fc二聚体为Fc异二聚体。在一些实施方案中，根据EU编号，Fc多肽中的一者具有T366W取代并且另一Fc多肽具有T366S、L368A以及Y407V取代。在一些实施方案中，第一Fc多肽含有T366S、L368A以及Y407V取代并且第二Fc多肽含有T366W取代。在一些实施方案中，第一Fc多肽键联至ERT酶IDS并且包含SEQ ID NO:117、232以及236中的任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一Fc多肽含有T366W取代并且第二Fc多肽含有T366S、L368A以及Y407V取代。在一些实施方案中，第一Fc多肽键联至ERT酶IDS并且包含SEQ ID NO:118、233以及237中的任一者的氨基酸序列。
在一些实施方案中，第一Fc多肽和/或第二Fc多肽包含天然FcRn结合位点。在一些实施方案中，第一Fc多肽和第二Fc多肽不具有效应功能。在一些实施方案中，第一Fc多肽和/或第二Fc多肽包括降低效应功能的修饰。在一些实施方案中，降低效应功能的修饰为根据EU编号在位置234的Ala和在位置235的Ala的取代。在一些实施方案中，降低效应功能的修饰还包含根据EU编号在位置329的Gly的取代。在一些实施方案中，第一Fc多肽键联至ERT酶IDS并且包含SEQ ID NO:115、231以及235中的任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一Fc多肽键联至ERT酶SGSH并且包含SEQ ID NO:149、150、152以及153中的任一者的氨基酸序列。
在一些实施方案中，第一Fc多肽和/或第二Fc多肽相对于天然Fc序列包含延长血清半衰期的氨基酸变化。在一些实施方案中，氨基酸变化包含根据EU编号在位置252的Tyr、在位置254的Thr和在位置256的Glu的取代。或者，在其他实施方案中，氨基酸变化包含根据EU编号在位置428的Leu和在位置434的Ser的取代。或者，在其他实施方案中，氨基酸变化包含根据EU编号在位置434的Ser或Ala的取代。
在一些实施方案中，第一Fc多肽和/或第二Fc多肽特异性结合于转铁蛋白受体(TfR)。
在一些实施方案中，第一Fc多肽和/或第二Fc多肽包含根据EU编号在选自由以下组成的组的位置的至少两个取代：384、386、387、388、389、390、413、416以及421。在一些实施方案中，第一Fc多肽和/或第二Fc多肽包含在所述位置的至少三个、四个、五个、六个、七个、八个或九个取代。
在一些实施方案中，第一Fc多肽和/或第二Fc多肽还包含根据EU编号在包含380、391、392以及415的位置的一个、两个、三个或四个取代。在一些实施方案中，第一Fc多肽和/或第二Fc多肽还包含根据EU编号在包含414、424以及426的位置的一个、两个或三个取代。
在一些实施方案中，第一Fc多肽和/或第二Fc多肽包含在位置388的Trp。在一些实施方案中，第一Fc多肽和/或第二Fc多肽包含在位置421的芳族氨基酸。在一些实施方案中，在位置421的芳族氨基酸为Trp或Phe。
在一些实施方案中，第一Fc多肽和/或第二Fc多肽包含至少一个选自以下的位置：位置380为Trp、Leu或Glu；位置384为Tyr或Phe；位置386为Thr；位置387为Glu；位置388为Trp；位置389为Ser、Ala、Val或Asn；位置390为Ser或Asn；位置413为Thr或Ser；位置415为Glu或Ser；位置416为Glu；以及位置421为Phe。
在一些实施方案中，第一Fc多肽和/或第二Fc多肽包含2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个选自以下的位置：位置380为Trp、Leu或Glu；位置384为Tyr或Phe；位置386为Thr；位置387为Glu；位置388为Trp；位置389为Ser、Ala、Val或Asn；位置390为Ser或Asn；位置413为Thr或Ser；位置415为Glu或Ser；位置416为Glu；以及位置421为Phe。
在一些实施方案中，第一Fc多肽和/或第二Fc多肽包含如下11个位置：位置380为Trp、Leu或Glu；位置384为Tyr或Phe；位置386为Thr；位置387为Glu；位置388为Trp；位置389为Ser，Ala、Val或Asn；位置390为Ser或Asn；位置413为Thr或Ser；位置415为Glu或Ser；位置416为Glu；以及位置421为Phe。
在一些实施方案中，第一Fc多肽和/或第二Fc多肽具有与SEQ ID NO:34-38、58以及60-90、151以及156-229中的任一者的氨基酸111-217具有至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性的CH3结构域。在一些实施方案中，第一Fc多肽和/或第二Fc多肽包含SEQ ID NO:156-229中的任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，在对应于SEQ ID NO:34-38、58以及60-90、151以及156-229中的任一者的EU索引位置380、384、386、387、388、389、390、391、392、413、414、415、416、421、424以及426的位置中的至少5者、6者、7者、8者、9者、10者、11者、12者、13者、14者、15者或16者处的残基未缺失或取代。
在一些实施方案中，第一Fc多肽和/或第二Fc多肽包含SEQ ID NO:157的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一Fc多肽和/或第二Fc多肽包含SEQ ID NO:169的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一Fc多肽和/或第二Fc多肽包含SEQ ID NO:181的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一Fc多肽和/或第二Fc多肽包含SEQ ID NO:193的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一Fc多肽和/或第二Fc多肽包含SEQ ID NO:205的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一Fc多肽和/或第二Fc多肽包含SEQ ID NO:217的氨基酸序列。
在一些实施方案中，第一Fc多肽包含SEQ ID NO:115的氨基酸序列，并且第二Fc多肽包含SEQ ID NO:205和228中的任一者(例如SEQ ID NO:228)的氨基酸序列。在其他实施方案中，第一Fc多肽包含SEQ ID NO:115的氨基酸序列，并且第二Fc多肽包含SEQ ID NO:169和229中的任一者(例如SEQ ID NO:229)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，第一Fc多肽包含SEQ ID NO:231的氨基酸序列，并且第二Fc多肽包含SEQ ID NO:205和228中的任一者(例如SEQ ID NO:228)的氨基酸序列。在其他实施方案中，第一Fc多肽包含SEQ ID NO:231的氨基酸序列，并且第二Fc多肽包含SEQ ID NO:169和229中的任一者(例如SEQ ID NO:229)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，第一Fc多肽包含SEQ ID NO:235的氨基酸序列，并且第二Fc多肽包含SEQ ID NO:205和228中的任一者(例如SEQ ID NO:228)的氨基酸序列。在其他实施方案中，第一Fc多肽包含SEQ ID NO:235的氨基酸序列，并且第二Fc多肽包含SEQ ID NO:169和229中的任一者(例如SEQ ID NO:229)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，第一Fc多肽和/或第二Fc多肽结合于TfR的顶端结构域。在一些实施方案中，蛋白质结合于TfR不大体上抑制转铁蛋白结合于TfR。
在一些实施方案中，第一Fc多肽和/或第二Fc多肽与对应野生型Fc多肽相比具有至少75％或至少80％、85％、90％、92％或95％的氨基酸序列同一性。在一些实施方案中，对应野生型Fc多肽为人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc多肽。
在一些实施方案中，ERT酶在脑中的摄入(例如使用适当动物模型，诸如本文所描述的那些动物模型)比在不存在第一Fc多肽和/或第二Fc多肽的情况下的ERT酶摄入或在不存在对第一Fc多肽和/或第二Fc多肽的引起TfR结合的修饰的情况下的ERT酶摄入大。在一些实施方案中，与在不存在第一Fc多肽和/或第二Fc多肽的情况下的ERT酶摄入相比或与在不存在对第一Fc多肽和/或第二Fc多肽的引起TfR结合的修饰的情况下的ERT酶摄入相比，ERT酶在脑中的摄入为至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100倍。
在一些实施方案中，第一Fc多肽未被修饰以结合于血脑屏障(BBB)受体并且第二Fc多肽被修饰以特异性结合于TfR。在一些实施方案中，第一Fc多肽被修饰以特异性结合于TfR并且第二Fc多肽未被修饰以结合于BBB受体。
在一些实施方案中，蛋白质不包括免疫球蛋白重链和/或轻链可变区序列或其抗原结合部分。
在一些方面中，本文提供了一种包含键联至ERT酶、ERT酶变体或其催化活性片段的Fc多肽的多肽，其中Fc多肽含有促进它与另一Fc多肽异二聚化的一个或多个修饰。
在一些实施方案中，ERT酶为IDS、IDS变体或其催化活性片段。在一些实施方案中，ERT酶包含与SEQ ID NO:91、92、114、230以及234中的任一者的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，ERT酶包含SEQ ID NO:91、92、114、230以及234中的任一者的氨基酸序列。
在一些实施方案中，ERT酶为SGSH、SGSH变体或其催化活性片段。在一些实施方案中，ERT酶包含与SEQ ID NO:119和120中的任一者的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，ERT酶包含SEQ ID NO:119和120中的任一者的氨基酸序列。
在一些实施方案中，ERT酶为ASM、ASM变体或其催化活性片段。在一些实施方案中，ERT酶包含与SEQ ID NO:121、122以及123中的任一者的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，ERT酶包含SEQ ID NO:121、122以及123中的任一者的氨基酸序列。
在一些实施方案中，ERT酶为GBA、GBA变体或其催化活性片段。在一些实施方案中，ERT酶包含与SEQ ID NO:93和94中的任一者的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，ERT酶包含SEQ ID NO:93和94中的任一者的氨基酸序列。
在一些实施方案中，Fc多肽为融合多肽，所述融合多肽通过肽键或通过多肽接头键联至ERT酶、ERT酶变体或其催化活性片段。在一些实施方案中，多肽接头为柔性多肽接头。在一些实施方案中，柔性多肽接头为富含甘氨酸的接头。在一些实施方案中，富含甘氨酸的接头为G4S(SEQ ID NO:239)或(G4S)2(SEQ ID NO:240)。在一些实施方案中，Fc多肽不通过化学交联剂键联至ERT酶、ERT酶变体或其催化活性片段，例如融合多肽不包括非肽键或非多肽接头。
在某些实施方案中，融合多肽从N端到C端包含：ERT酶、ERT酶变体或其催化活性片段；多肽接头；以及第一Fc多肽。
在一些实施方案中，根据EU编号，Fc多肽含有T366S、L368A以及Y407V取代。在一些实施方案中，多肽包含SEQ ID NO:115、117、231、232、235以及236中的任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，多肽包含SEQ ID NO:149和150中的任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，Fc多肽含有T366W取代。在一些实施方案中，多肽包含SEQ ID NO:118、233以及237中的任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，多肽包含SEQ ID NO:152-155中的任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，多肽还包含另一Fc多肽。在一些实施方案中，另一Fc多肽含有T366W取代或含有T366S、L368A以及Y407V取代并且与ERT酶-Fc融合多肽形成Fc二聚体。
在一些实施方案中，Fc多肽包含天然FcRn结合位点。在一些实施方案中，Fc多肽不具有效应功能。在一些实施方案中，Fc多肽包括降低效应功能的修饰。在一些实施方案中，降低效应功能的修饰为根据EU编号在位置234的Ala和在位置235的Ala的取代。在一些实施方案中，降低效应功能的修饰还包含根据EU编号在位置329的Gly的取代。
在一些实施方案中，Fc多肽相对于天然Fc序列包含延长血清半衰期的氨基酸变化。在一些实施方案中，氨基酸变化包含根据EU编号在位置252的Tyr、在位置254的Thr以及在位置256的Glu的取代。
在一些实施方案中，Fc多肽特异性结合于TfR。
在一些实施方案中，Fc多肽包含根据EU编号在选自由以下组成的组的位置的至少两个取代：384、386、387、388、389、390、413、416以及421。在一些实施方案中，Fc多肽包含在所述位置的至少三个、四个、五个、六个、七个、八个或九个取代。
在一些实施方案中，Fc多肽还包含根据EU编号在包含380、391、392以及415的位置的一个、两个、三个或四个取代。在一些实施方案中，Fc多肽还包含根据EU编号在包含414、424以及426的位置的一个、两个或三个取代。
在一些实施方案中，Fc多肽包含在位置388的Trp。在一些实施方案中，Fc多肽包含在位置421的芳族氨基酸。在一些实施方案中，在位置421的芳族氨基酸为Trp或Phe。
在一些实施方案中，Fc多肽包含至少一个选自以下的位置：位置380为Trp、Leu或Glu；位置384为Tyr或Phe；位置386为Thr；位置387为Glu；位置388为Trp；位置389为Ser、Ala、Val或Asn；位置390为Ser或Asn；位置413为Thr或Ser；位置415为Glu或Ser；位置416为Glu；以及位置421为Phe。
在一些实施方案中，Fc多肽包含2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个选自以下的位置：位置380为Trp、Leu或Glu；位置384为Tyr或Phe；位置386为Thr；位置387为Glu；位置388为Trp；位置389为Ser、Ala、Val或Asn；位置390为Ser或Asn；位置413为Thr或Ser；位置415为Glu或Ser；位置416为Glu；以及位置421为Phe。
在一些实施方案中，Fc多肽包含如下11个位置：位置380为Trp、Leu或Glu；位置384为Tyr或Phe；位置386为Thr；位置387为Glu；位置388为Trp；位置389为Ser、Ala、Val或Asn；位置390为Ser或Asn；位置413为Thr或Ser；位置415为Glu或Ser；位置416为Glu；以及位置421为Phe。
在一些实施方案中，Fc多肽具有与SEQ ID NO:34-38、58以及60-90中的任一者的氨基酸111-217具有至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性的CH3结构域。在一些实施方案中，在对应于SEQ ID NO:34-38、58以及60-90中的任一者的EU索引位置380、384、386、387、388、389、390、391、392、413、414、415、416、421、424以及426的位置中的至少5者、6者、7者、8者、9者、10者、11者、12者、13者、14者、15者或16者处的残基未缺失或取代。
在一些实施方案中，Fc多肽结合于TfR的顶端结构域。在一些实施方案中，蛋白质结合于TfR不大体上抑制转铁蛋白结合于TfR。
在一些实施方案中，Fc多肽与对应野生型Fc多肽相比具有至少75％或至少80％、85％、90％、92％或95％的氨基酸序列同一性。在一些实施方案中，对应野生型Fc多肽为人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc多肽。
在一些实施方案中，Fc多肽不包括免疫球蛋白重链和/或轻链可变区序列或其抗原结合部分。
在一些实施方案中，本文提供了一种包含编码多肽的核酸序列的多核苷酸，所述多肽包含键联至ERT酶、ERT酶变体或其催化活性片段的Fc多肽，其中Fc多肽含有促进它与另一Fc多肽异二聚化的一个或多个修饰。在一些实施方案中，本文提供了一种包含所述多核苷酸的载体。在一些实施方案中，本文提供了一种包含所述多核苷酸或所述载体的宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞还包含含有编码另一Fc多肽的核酸序列的多核苷酸。在一些实施方案中，本文提供了一种制备本文所描述的多肽的方法，所述方法包括在使得由多核苷酸编码的多肽表达的条件下培养宿主细胞。
在一些方面中，本文提供了一种蛋白质，所述蛋白质包含：
(a)第一多肽链，所述第一多肽链包含特异性结合于TfR的被修饰的Fc多肽；
(b)第二多肽链，所述第一多肽链包含Fc多肽，其中第一和第二多肽链形成Fc二聚体；以及
(c)ERT酶、ERT酶变体或其催化活性片段，所述ERT酶、ERT酶变体或其催化活性片段键联至(a)的被修饰的Fc多肽或(b)的Fc多肽。
在一些实施方案中，ERT酶为IDS、IDS变体或其催化活性片段。在一些实施方案中，ERT酶包含与SEQ ID NO:91、92、114、230以及234中的任一者的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，ERT酶包含SEQ ID NO:91、92、114、230以及234中的任一者的氨基酸序列。
在一些实施方案中，ERT酶为SGSH、SGSH变体或其催化活性片段。在一些实施方案中，ERT酶包含与SEQ ID NO:119和120中的任一者的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，ERT酶包含SEQ ID NO:119和120中的任一者的氨基酸序列。
在一些实施方案中，ERT酶为ASM、ASM变体或其催化活性片段。在一些实施方案中，ERT酶包含与SEQ ID NO:121、122以及123中的任一者的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，ERT酶包含SEQ ID NO:121、122以及123中的任一者的氨基酸序列。
在一些实施方案中，ERT酶为GBA、GBA变体或其催化活性片段。在一些实施方案中，ERT酶包含与SEQ ID NO:93和94中的任一者的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，ERT酶包含SEQ ID NO:93和94中的任一者的氨基酸序列。
在一些实施方案中，ERT酶键联至(a)的被修饰的Fc多肽。在一些实施方案中，ERT酶键联至(b)的Fc多肽。在一些实施方案中，(b)的Fc多肽未被修饰以结合于BBB受体。在一些实施方案中，(b)的Fc多肽为特异性结合于TfR的被修饰的Fc多肽。
在一些实施方案中，ERT酶通过肽键或通过多肽接头键联(例如融合)至(a)的被修饰的Fc多肽或(b)的Fc多肽以形成融合多肽。在一些实施方案中，多肽接头为柔性多肽接头。在一些实施方案中，柔性多肽接头为富含甘氨酸的接头。在一些实施方案中，富含甘氨酸的接头为G4S(SEQ ID NO:239)或(G4S)2(SEQ ID NO:240)。在一些实施方案中，ERT酶不通过化学交联剂键联至(a)的被修饰的Fc多肽或(b)的Fc多肽，例如融合多肽不包括非肽键或非多肽接头。
在一些实施方案中，ERT酶键联至(a)的被修饰的Fc多肽的N端或(b)的Fc多肽的N端。在一些实施方案中，ERT酶键联至(a)的被修饰的Fc多肽的C端或(b)的Fc多肽的C端。
在一些实施方案中，蛋白质包含两个ERT酶。在一些实施方案中，一个ERT酶键联至(a)的被修饰的Fc多肽并且另一ERT酶键联至(b)的Fc多肽。在一些实施方案中，ERT酶均键联至相应Fc多肽的N端或均键联至C端。在一些实施方案中，一个ERT酶键联至(a)的被修饰的Fc多肽的N端并且另一ERT酶键联至(b)的Fc多肽的C端。在一些实施方案中，一个ERT酶键联至(a)的被修饰的Fc多肽的C端并且另一ERT酶键联至(b)的Fc多肽的N端。
在一些实施方案中，(a)和(b)的Fc多肽各自含有促进异二聚化的修饰。在一些实施方案中，根据EU编号，Fc多肽中的一者具有T366W取代并且另一Fc多肽具有T366S、L368A以及Y407V取代。在一些实施方案中，(a)的被修饰的Fc多肽含有T366W取代并且(b)的Fc多肽含有T366S、L368A以及Y407V取代。在一些实施方案中，(b)的Fc多肽键联至ERT酶IDS并且包含SEQ ID NO:117、232以及236中的任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，(a)的被修饰的Fc多肽含有T366S、L368A以及Y407V取代并且(b)的Fc多肽含有T366W取代。在一些实施方案中，(b)的Fc多肽键联至ERT酶IDS并且包含SEQ ID NO:118、233以及237中的任一者的氨基酸序列。
在一些实施方案中，(a)的被修饰的Fc多肽和/或(b)的Fc多肽包含天然FcRn结合位点。在一些实施方案中，(a)的被修饰的Fc多肽和(b)的Fc多肽不具有效应功能。在一些实施方案中，(a)的被修饰的Fc多肽和/或(b)的Fc多肽包括降低效应功能的修饰。在一些实施方案中，降低效应功能的修饰为根据EU编号在位置234的Ala和在位置235的Ala的取代。在一些实施方案中，降低效应功能的修饰还包含根据EU编号在位置329的Gly的取代。在一些实施方案中，(b)的Fc多肽键联至ERT酶IDS并且包含SEQ ID NO:115、231以及235中的任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，(b)的Fc多肽键联至ERT酶SGSH并且包含SEQ ID NO:149、150、152以及153中的任一者的氨基酸序列。
在一些实施方案中，(a)的被修饰的Fc多肽和/或(b)的Fc多肽相对于天然Fc序列包含延长血清半衰期的氨基酸变化。在一些实施方案中，氨基酸变化包含根据EU编号在位置252的Tyr、在位置254的Thr以及在位置256的Glu的取代。
在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽包含根据EU编号在选自由以下组成的组的位置的至少两个取代：384、386、387、388、389、390、413、416以及421。在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽包含在所述位置的至少三个、四个、五个、六个、七个、八个或九个取代。
在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽还包含根据EU编号在包含380、391、392以及415的位置的一个、两个、三个或四个取代。在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽还包含根据EU编号在包含414、424以及426的位置的一个、两个或三个取代。
在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽包含在位置388的Trp。在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽包含在位置421的芳族氨基酸。在一些实施方案中，在位置421的芳族氨基酸为Trp或Phe。
在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽包含至少一个选自以下的位置：位置380为Trp、Leu或Glu；位置384为Tyr或Phe；位置386为Thr；位置387为Glu；位置388为Trp；位置389为Ser、Ala、Val或Asn；位置390为Ser或Asn；位置413为Thr或Ser；位置415为Glu或Ser；位置416为Glu；以及位置421为Phe。
在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽包含2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个选自以下的位置：位置380为Trp、Leu或Glu；位置384为Tyr或Phe；位置386为Thr；位置387为Glu；位置388为Trp；位置389为Ser、Ala、Val或Asn；位置390为Ser或Asn；位置413为Thr或Ser；位置415为Glu或Ser；位置416为Glu；以及位置421为Phe。
在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽包含如下11个位置：位置380为Trp、Leu或Glu；位置384为Tyr或Phe；位置386为Thr；位置387为Glu；位置388为Trp；位置389为Ser、Ala、Val或Asn；位置390为Ser或Asn；位置413为Thr或Ser；位置415为Glu或Ser；位置416为Glu；以及位置421为Phe。
在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽具有与SEQ ID NO:34-38、58以及60-90、151以及156-229中的任一者的氨基酸111-217具有至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性的CH3结构域。在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽包含SEQ ID NO:156-229中的任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，在对应于SEQ ID NO:34-38、58以及60-90、151以及156-229中的任一者的EU索引位置380、384、386、387、388、389、390、391、392、413、414、415、416、421、424以及426的位置中的至少5者、6者、7者、8者、9者、10者、11者、12者、13者、14者、15者或16者处的残基未缺失或取代。
在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽包含SEQ ID NO:157的氨基酸序列。在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽包含SEQ ID NO:169的氨基酸序列。在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽包含SEQ ID NO:181的氨基酸序列。在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽包含SEQID NO:193的氨基酸序列。在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽包含SEQ ID NO:205的氨基酸序列。在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽包含SEQ ID NO:217的氨基酸序列。
在一些实施方案中，第一多肽链包含SEQ ID NO:205和228中的任一者(例如SEQID NO:228)的氨基酸序列并且第二多肽链包含SEQ ID NO:115的氨基酸序列。在其他实施方案中，第一多肽链包含SEQ ID NO:169和229中的任一者(例如SEQ ID NO:229)的氨基酸序列并且第二多肽链包含SEQ ID NO:115的氨基酸序列。
在一些实施方案中，第一多肽链包含SEQ ID NO:205和228中的任一者(例如SEQID NO:228)的氨基酸序列并且第二多肽链包含SEQ ID NO:231的氨基酸序列。在其他实施方案中，第一多肽链包含SEQ ID NO:169和229中的任一者(例如SEQ ID NO:229)的氨基酸序列并且第二多肽链包含SEQ ID NO:231的氨基酸序列。
在一些实施方案中，第一多肽链包含SEQ ID NO:205和228中的任一者(例如SEQID NO:228)的氨基酸序列并且第二多肽链包含SEQ ID NO:235的氨基酸序列。在其他实施方案中，第一多肽链包含SEQ ID NO:169和229中的任一者(例如SEQ ID NO:229)的氨基酸序列并且第二多肽链包含SEQ ID NO:235的氨基酸序列。
在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽结合于TfR的顶端结构域。在一些实施方案中，蛋白质结合于TfR不大体上抑制转铁蛋白结合于TfR。
在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽与对应野生型Fc多肽相比具有至少75％或至少80％、85％、90％、92％或95％的氨基酸序列同一性。在一些实施方案中，对应野生型Fc多肽为人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc多肽。
在一些实施方案中，ERT酶在脑中的摄入(例如使用适当动物模型，诸如本文所描述的那些动物模型)比在不存在Fc多肽的情况下的ERT酶摄入或在不存在对Fc多肽的引起TfR结合的修饰的情况下的ERT酶摄入大。在一些实施方案中，与在不存在Fc多肽的情况下的ERT酶摄入相比或与在不存在对Fc多肽的引起TfR结合的修饰的情况下的ERT酶摄入相比，ERT酶在脑中的摄入大至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50，55、60、65、70、75、80、85、90、95或100倍。
在一些方面中，本文提供了一种治疗LSD的方法，所述方法包括向有需要的患者施用如上文所描述的蛋白质或多肽。在一些实施方案中，所述方法使患者中的毒性代谢产物累积减少，例如使患者脑和/或脑脊髓液(CSF)中的毒性代谢产物减少。
在相关方面中，本文提供了一种使患有LSD的患者中的毒性代谢产物累积减少的方法，所述方法包括向患者施用如上文所描述的蛋白质或多肽。在一些实施方案中，所述方法使患者脑和/或CSF中的毒性代谢产物累积减少。
在一些实施方案中，LSD为亨特综合征(Hunter syndrome)，并且ERT酶为IDS。在一些实施方案中，毒性代谢产物包含硫酸乙酰肝素衍生的二糖和/或硫酸皮肤素衍生的二糖。
在一些实施方案中，LSD为圣菲利柏综合征A(Sanfilippo syndrome A)，并且ERT酶为SGSH。在一些实施方案中，毒性代谢产物包含硫酸乙酰肝素衍生的寡糖(例如六糖)。
在一些实施方案中，LSD为尼曼-皮克病(Niemann-Pick disease)，并且ERT酶为ASM。在一些实施方案中，毒性代谢产物包含神经鞘磷脂。
在一些实施方案中，LSD为高歇氏病(Gaucher's disease)或帕金森氏病(Parkinson's disease)，并且ERT酶为GBA。在一些实施方案中，毒性代谢产物包含葡糖基神经酰胺。
在一些实施方案中，毒性代谢产物的总量与在不存在所述蛋白质或多肽的情况下的毒性代谢产物总量相比降低了至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。本文描述了用于测量ERT酶活性和底物累积的说明性分析。
在一些方面中，本文提供了一种包含如上文所描述的蛋白质或多肽及药学上可接受的载体的药物组合物。
在一些方面中，本文提供了一种监测底物累积以评估IDS活性的方法，所述方法包括：
(a)将来自施用如上文所描述的蛋白质或多肽的受试者的细胞或组织样品中的细胞或流体样品中的微泡破碎以使微泡裂开从而获得所要分析的糖胺聚糖(GAG)溶液；
(b)使用至少一种肝素酶(例如肝素酶I、肝素酶II以及肝素酶III)和软骨素酶B消化GAG溶液以获得GAG衍生的二糖；
(c)通过质谱法(例如LC-MS/MS)分析GAG衍生的二糖；以及
(d)测定硫酸乙酰肝素衍生的二糖和/或硫酸皮肤素衍生的二糖的水平，其中与缺乏IDS活性的对照相比硫酸乙酰肝素衍生的二糖和/或硫酸皮肤素衍生的二糖的水平降低指示与对照相比样品中的IDS活性增加。
在一些实施方案中，将细胞或微泡破碎的步骤包括至少一个冷冻-解冻循环和/或至少一个超声处理步骤。在一些实施方案中，细胞来自组织样品并且所述方法包括至少三个、四个或五个冷冻-解冻循环。在一些实施方案中，受试者为缺乏IDS活性的小鼠。在一些实施方案中，受试者为非人灵长类动物。在一些实施方案中，受试者为患有亨特综合征的人患者。
在一些实施方案中，硫酸乙酰肝素衍生的二糖和/或硫酸皮肤素衍生的二糖的水平与缺乏IDS活性的对照中的硫酸乙酰肝素衍生的二糖和/或硫酸皮肤素衍生的二糖的水平相比降低了至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。在一些实施方案中，对照为在施用蛋白质或多肽之前从受试者获得的相同组织类型细胞的细胞或组织样品。在一些实施方案中，对照为已知缺乏IDS活性的相同组织类型细胞的细胞或组织样品。在一些实施方案中，蛋白质或多肽使样品中的IDS活性与对照中的IDS活性相比增加了至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100倍。
在其他方面中，本文提供了一种监测底物累积以评估SGSH活性的方法，所述方法包括：
(a)将来自施用如上文所描述的蛋白质或多肽的受试者的细胞或组织样品中的细胞或流体样品中的微泡破碎以使微泡裂开从而获得所要分析的糖胺聚糖(GAG)溶液；
(b)用至少一种肝素酶消化GAG溶液以获得GAG衍生的二糖；
(c)通过质谱法(例如LC-MS/MS)分析GAG衍生的二糖；以及
(d)测定硫酸乙酰肝素衍生的二糖的水平，其中与缺乏SGSH活性的对照相比硫酸乙酰肝素衍生的二糖的水平降低指示与对照相比样品中的SGSH活性增加。
在一些实施方案中，将细胞或微泡破碎的步骤包括至少一个冷冻-解冻循环和/或至少一个超声处理步骤。在一些实施方案中，细胞来自组织样品并且所述方法包括至少三个、四个或五个冷冻-解冻循环。在一些实施方案中，受试者为缺乏SGSH活性的小鼠。在一些实施方案中，受试者为非人灵长类动物。在一些实施方案中，受试者为患有圣菲利柏综合征A的人患者。
在一些实施方案中，硫酸乙酰肝素衍生的二糖的水平与缺乏SGSH活性的对照中的硫酸乙酰肝素衍生的二糖的水平相比降低了至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。在一些实施方案中，对照为在施用蛋白质或多肽之前从受试者获得的相同组织类型细胞的细胞或组织样品。在一些实施方案中，对照为已知缺乏SGSH活性的相同组织类型细胞的细胞或组织样品。在一些实施方案中，蛋白质或多肽使样品中的SGSH活性与对照中的SGSH活性相比增加至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100倍。
在其他方面中，本文提供了一种将剂运送穿过哺乳动物的BBB的方法，所述方法包括使BBB暴露于以约50nM至约250nM的亲和力结合于TfR的蛋白质，其中蛋白质键联至所述剂并且将键联的剂运送穿过BBB。在一些实施方案中，哺乳动物脑中的所述剂的最大浓度(C最大)有所提高。在一些实施方案中，所述剂可用于治疗LSD。
在其他方面中，本文提供了一种治疗LSD的方法，所述方法包括向哺乳动物施用以约50nM至约250nM的亲和力结合于TfR的蛋白质，其中蛋白质键联至用于治疗LSD的剂，由此使哺乳动物的脑暴露于所述剂。在一些实施方案中，与键联至以较弱亲和力结合于TfR的参考蛋白质的所述剂相比所述蛋白质使脑中的所述剂的C最大有所提高。在一些实施方案中，参考蛋白质以约600nM或更弱的亲和力结合于TfR。
在一些实施方案中，TfR为灵长类动物TfR。在一些实施方案中，灵长类动物TfR为人TfR。在一些实施方案中，蛋白质结合于TfR顶端结构域。
在一些实施方案中，蛋白质以约100nM至约200nM的亲和力结合于TfR。在一些实施方案中，蛋白质以约110nM至约150nM的亲和力结合于TfR。
在一些实施方案中，所述剂的治疗有效浓度为可治疗哺乳动物的LSD的一种或多种症状的浓度。在一些实施方案中，所述剂为蛋白质替代治疗剂。在一些实施方案中，所述剂或蛋白质替代治疗剂为酶。
在一些实施方案中，与酶键联至参考蛋白质时相比，当酶键联至所述蛋白质时在更大程度上使患有LSD的哺乳动物脑中的毒性代谢产物累积减少。在一些实施方案中，酶为IDS并且LSD为亨特综合征。在一些实施方案中，毒性代谢产物包含硫酸肝素衍生的二糖和/或硫酸皮肤素衍生的二糖。在一些实施方案中，酶为SGSH并且LSD为圣菲利柏综合征A。在一些实施方案中，酶为ASM并且LSD为尼曼-皮克病。在一些实施方案中，酶为GBA并且LSD为高歇氏病。
在一些实施方案中，所述剂包含抗体可变区。在一些实施方案中，所述剂包含抗体片段。在一些实施方案中，所述剂包含Fab或scFv。
在一些实施方案中，蛋白质为含有能够结合TfR的非天然结合位点的被修饰的Fc多肽。在一些实施方案中，蛋白质包含特异性结合TfR的抗体可变区。在一些实施方案中，蛋白质包含抗体片段。在一些实施方案中，蛋白质包含Fab或scFv。
在一些实施方案中，键联至所述剂的蛋白质作为药学上可接受的载体的一部分而施用。
附图说明
图1示出了包含键联至艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(IDS)的Fc多肽以及结合于转铁蛋白受体(TfR)的被修饰的Fc多肽的IDS-Fc融合蛋白的纯化和分析。
图2示出了对图1中分析的IDS-Fc融合蛋白的结合亲和力分析的结果，证实融合蛋白结合于TfR。
图3提供展示图1中分析的IDS-Fc融合蛋白的体外IDS活性的数据。
图4提供证实缺乏IDS的敲出细胞的硫酸乙酰肝素衍生的二糖的水平如使用LC-MS/MS分析所评估有所增加，并且IDS在IDS敲出(KO)细胞中的表达挽救敲出表型的数据。
图5A表明包含相同TfR结合性Fc多肽(即，CH3C.35.21.17)的作为N端单酶或C端单酶的IDS-Fc融合蛋白使IDS KO细胞中的硫酸乙酰肝素和硫酸皮肤素累积逆转。图5B表明N端单酶(“ETV:IDS 35.21.17”)具有与IDS类似的细胞功效。图5C示出了在用IDS-Fc融合蛋白(“ETV:IDS”)或IDS处理的MPS II患者纤维母细胞中累积的S35-硫酸盐标记的蛋白质的剂量依赖性减少；n＝8。图5D示出了在存在或不存在5mM M6P的情况下用增加剂量的IDS-Fc融合蛋白(“ETV:IDS”)或IDS处理的MPS II患者纤维母细胞中S35标记的蛋白质的M6PR依赖性清除的评估；n＝3。图5C至图5D：“ETV:IDS”＝ETV:IDS 35.23.2；图式展示实验重复的平均值±SEM。
图6提供说明在小鼠中在来自给予媒介物的野生型(WT)小鼠或给予IDS或IDS-Fc融合蛋白(“ETV:IDS”)的IDS KO小鼠的血清中硫酸乙酰肝素和硫酸皮肤素随时间推移的水平的数据。“ETV:IDS”＝ETV:IDS 35.21。
图7提供说明以下情况下的数据：在施以40mg/kg IDS-Fc融合蛋白(“ETV:IDS”)或5.3mg/kg IDS的单次静脉内注射后七天时评估在来自IDS KO小鼠的外周组织中二糖D0SO、DOA0以及D0a4的总体水平(称为“总sGAG水平”)并且与媒介物处理的IDS KO和野生型小鼠相比较；IDS KO组n＝8并且野生型组n＝3。数据以平均值±SEM的形式显示，p值：单因素ANOVA加上杜纳多次比较检验(Dunnett multiple comparison test)；**p<0.01并且****p<0.0001。“ETV:IDS”＝ETV:IDS 35.21。
图8提供说明在外周施用IDS-Fc融合蛋白ETV:IDS 35.21或缺乏赋予TfR结合的突变的对照IDS-Fc融合蛋白(“IDS:Fc”)之后人TfR敲入(TfRms/hu KI)小鼠脑中的IDS-Fc融合蛋白浓度的数据。
图9A提供说明在外周施用IDS-Fc融合蛋白ETV:IDS 35.21.17.2或ETV:IDS35.23.2或缺乏赋予TfR结合的突变的对照IDS-Fc融合蛋白(“IDS:Fc”)之后TfRms/hu KI小鼠脑中的IDS-Fc融合蛋白浓度的数据。图9B提供说明在单次静脉内注射50mg/kg剂量之后TfRms/hu KI小鼠中的IDS-Fc融合蛋白ETV:IDS 35.21或IDS:Fc的肝脏浓度的数据；n＝4-5。图式展示平均值±SEM。
图10A至图10C表明ETV:IDS使IDS KO x TfRms/hu KI小鼠的脑和外周组织中的GAG减少。如实施例2中所描述为IDS KO x TfRms/huKI小鼠施用40mg/kg ETV:IDS或14.2mg/kgIDS的单次静脉内注射或四个周剂量。在单个剂量之后测量在IDS KO x TfRms/hu KI小鼠中在血清(图10A)和组织(图10B)中的IDS浓度。示出在给药后2h时时的组织PK；n＝4。图式展示平均值±SEM并且p值：非配对t检验分析。图10C示出了在单个剂量或多个剂量的ETV:IDS或IDS之后测量IDS KO x TfRms/hu KI小鼠的脑、CSF以及外周组织中的二糖D0SO、DOA0以及D0a4的水平(“总sGAG水平”)并且与媒介物处理的小鼠和野生型小鼠相比较；每个IDS KO xTfRms/hu KI组n＝8并且野生型组n＝5。图式展示平均值±SEM并且p值：单因素ANOVA加上杜纳多次比较检验；**p<0.01，***p≤0.001，并且****p≤0.0001。
图11示出了包含键联至两个酸性神经鞘磷脂酶(ASM)酶的Fc区的ASM-Fc融合蛋白的纯化和分析。
图12提供展示图11中分析的ASM-Fc融合蛋白的体外ASM活性的数据。
图13提供使用基于成像的分析表明如图11中所分析的ASM-Fc融合蛋白使ASM KO细胞中的神经鞘磷脂累积减少的数据。
图14提供使用基于LC-MS/MS的分析表明如图11中所分析的ASM-Fc融合蛋白使ASMKO细胞中的神经鞘磷脂累积减少的数据。
图15提供展示实施例6中所描述的SGSH-Fc融合蛋白的体外N-磺基葡糖胺磺基水解酶(SGSH)活性的数据。
图16提供证实缺乏SGSH的敲出(KO)细胞的硫酸乙酰肝素衍生的二糖的水平如使用LC-MS/MS分析所评估有所增加的数据。n＝3-4个独立细胞系；数据以平均值±s.e.m的形式显示。
图17提供说明图15中分析的SGSH-Fc融合蛋白使SGSH KO细胞中的硫酸乙酰肝素累积逆转的数据。
图18示出了工程化的TfR结合性多肽的hTfR亲和力与在TfRms/hu KI小鼠中随时间推移的脑暴露之间的关系。点表示在TfRms/huKI小鼠中在单个50mg/kg剂量之后不同的工程化的TfR结合性多肽亲和力变体的随时间推移的累积脑暴露(AUC)。在给药后的不同天数(介于1-10天范围内)时计算多肽的脑浓度(如通过huIgG1所测量)。数据表示三个独立研究的汇总，n＝每个研究每组4-5个小鼠。
图19示出了工程化的TfR结合性多肽的hTfR亲和力与在TfRms/hu KI小鼠中的最大脑浓度之间的关系。点表示在单个50mg/kg剂量之后在给药后第1天测量的不同多肽亲和力变体的最大脑浓度。数据表示三个独立研究的汇总，n＝每个研究每组4-5个小鼠。
图20示出了工程化的TfR结合性多肽的hTfR亲和力与在TfRms/hu KI小鼠中多肽脑浓度与血浆浓度的比率之间的关系。点表示在单个50mg/kg剂量之后在给药后第1天测量的不同多肽亲和力变体的最大脑浓度与血浆浓度的比率。数据表示三个独立研究的汇总，n＝每个研究每组4-5个小鼠。
图21A和图21B展示在单次50mg/kg全身性注射抗BACE1_A b153、CH3C35.21:Ab153、CH3C35.20:Ab153或CH3C35:Ab153多肽融合物之后，TfRms/hu敲入(KI)小鼠的血浆(图21A)和脑溶解产物(图21B)中的huIgG1浓度(平均值±SEM，n＝每组5个)。
图21C展示在单次50mg/kg全身性注射抗BACE1_Ab153、CH3C35.21:Ab153、CH3C35.20:Ab153或CH3C35:Ab153多肽融合物之后TfRms/hu KI小鼠的脑溶解产物中的内源性小鼠Aβ浓度(平均值±SEM，n＝每组5个)。
图21D展示在单次50mg/kg全身性注射抗BACE1_Ab153、CH3C35.21:Ab153、CH3C35.20:Ab153或CH3C35:Ab153多肽融合物之后对在TfRms/hu KI小鼠的脑溶解产物中针对肌动蛋白归一化的脑TfR蛋白质的西方墨点法(Western blot)定量(平均值±SEM，n＝每组5个)。
具体实施方式
I.引言
我们已研发包括键联至Fc多肽的酶替代疗法(ERT)酶的融合蛋白。可使用这些蛋白质来治疗溶酶体贮积症(LSD)。在一些情况下，蛋白质包括二聚Fc多肽，其中Fc多肽单体中的一者键联至ERT酶。Fc多肽可增加酶半衰期并且在一些情况下，可被修饰以赋予蛋白质额外的功能特性。本文还描述了促进ERT酶递送穿过血脑屏障(BBB)的融合蛋白。这些蛋白质包含Fc多肽和被修饰的Fc多肽，所述Fc多肽和被修饰的Fc多肽形成二聚体；以及键联至Fc区和/或被修饰的Fc区的ERT酶。被修饰的Fc区可特异性结合于BBB受体，诸如转铁蛋白受体(TfR)。在一些实施方案中，ERT酶为艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶(IDS)或野生型IDS(例如野生型人IDS)的催化活性变体或片段。在其他实施方案中，ERT酶为N-磺基葡糖胺磺基水解酶(SGSH)、酸性神经鞘磷脂酶(ASM)、β-葡糖脑苷脂酶(GBA)，或野生型SGSH、ASM或GBA(例如野生型人SGSH、ASM或GBA)的催化活性变体或片段。
我们还研发了将键联至TfR结合性多肽和蛋白质的治疗剂运送穿过BBB以治疗疾病的方法。我们发现，将治疗剂运送穿过BBB所需的TfR结合亲和力取决于治疗剂的靶标，以及驱动在治疗疾病中的功效的作用机制。特别地，我们发现，使用具有较强TfR亲和力的多肽和蛋白质可产生较大的C最大，但清除较快。
对于一些疗法，诸如可用于治疗例如LSD的包括使用诸如IDS等ERT酶(例如用于治疗亨特综合征)的蛋白质替代疗法，以及其他疗法，需要在给药窗内实现治疗剂的高脑C最大，因为较高的细胞外浓度又将促成增加的细胞内蛋白质浓度。在递送至细胞中后，所递送的蛋白质的细胞内半衰期持续与血浆滞留时间相比更长的时间。此外，具有高C最大可有益于酶替代，因为高酶浓度可促成增加的由酶引起的底物周转速率。为提高脑C最大，使用具有50-250nM的TfR亲和力范围的多肽和蛋白质为特别适用的。
II.定义
如本文所用，除非内容另有清楚指示，否则单数形式“一个(种)(a/an)”和“所述”包括复数指示物。因此，举例来说，提到“一种多肽”可包括两种或更多种此类分子等。
如本文所用，术语“约”和“大约”，当用于修饰数值或范围中指定的量时，表明所述数值以及本领域技术人员已知的与所述值的合理偏差(例如±20％、±10％或±5％)在所叙述的值的预期含义内。
“酶替代疗法酶”或“ERT酶”是指溶酶体贮积症中缺乏的酶。“ERT酶变体”是指野生型ERT酶或其片段的功能变体，包括等位基因变体和剪接变体，其中例如当在相同条件下分析时，ERT酶变体具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的对应野生型ERT酶或其片段的活性。ERT酶的“催化活性片段”是指全长ERT酶或其变体的一部分，其中例如当在相同条件下分析时，催化活性片段具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的对应全长ERT酶或其变体的活性。
如本文所用的“艾杜糖醛酸硫酸酯酶”、“艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶”或“IDS”是指艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶(EC 3.1.6.13)，这是一种参与糖胺聚糖硫酸乙酰肝素和硫酸皮肤素的溶酶体降解的酶。IDS的缺乏与粘多糖贮积病II(也称为亨特综合征)相关。如本文中用作包含Fc多肽的蛋白质的组分的术语“IDS”为催化活性的并且涵盖野生型IDS或其片段的功能变体，包括等位基因变体和剪接变体。人IDS同种型I的序列为指定为规范序列的人序列，在UniProt条目P22304下可获得并且由Xq28处的人IDS基因编码。以SEQ ID NO:91形式提供全长序列。如本文所用的“成熟”IDS序列是指缺乏天然存在的全长多肽链的信号和前肽序列的多肽链形式。以SEQ ID NO:92形式提供成熟人IDS多肽的氨基酸序列，这对应于全长人序列的氨基酸34-550。如本文所用的“截短”IDS序列是指天然存在的全长多肽链的催化活性片段。以SEQ ID NO:114形式提供示例性截短人IDS多肽的氨基酸序列，这对应于全长人序列的氨基酸26-550。已对人IDS的结构进行了充分表征。可在PDB登录代码5FQL下获得说明性结构。Nat.Comm.8:15786doi:10.1038/ncomms15786,2017中也描述了所述结构。还已描述了非人灵长类动物IDS序列，包括黑猩猩(UniProt条目K7BKV4)和恒河猴(UniProt条目H9FTX2)。小鼠IDS序列在UniProt条目Q08890下可获得。IDS变体例如当在相同条件下分析时具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的对应野生型IDS或其片段的活性。催化活性IDS片段例如当在相同条件下分析时具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的对应全长IDS或其变体的活性。
如本文所用的“磺基葡糖胺磺基水解酶”、“N-磺基葡糖胺磺基水解酶”或“SGSH”是指N-磺基葡糖胺磺基水解酶(EC 3.10.1.1)，这是一种参与硫酸乙酰肝素的溶酶体降解的酶。此基因中的突变与圣菲利柏综合征A相关，这是一种类型的溶酶体贮积症粘多糖贮积症III，粘多糖贮积症III由硫酸乙酰肝素的降解受损引起。如本文用作包含Fc多肽的蛋白质的组分的术语“SGSH”为催化活性的并且涵盖野生型SGSH或其片段的功能变体，包括等位基因变体和剪接变体。人SGSH的序列在UniProt条目P51688下可获得并且由17q25.3处的人SGSH基因编码。以SEQ ID NO:119形式提供全长序列。如本文所用的“成熟”SGSH序列是指缺乏天然存在的全长多肽链之信号序列的多肽链形式。以SEQ ID NO:120形式提供成熟人SGSH多肽的氨基酸序列，这对应于全长人序列的氨基酸21-502。如本文所用的“截短”SGSH序列是指天然存在的全长多肽链的催化活性片段。已对人SGSH的结构进行了充分表征。说明性结构在PDB登录代码4MHX下可获得。还已描述了非人灵长类动物SGSH序列，包括黑猩猩(UniProt条目K7C218)。小鼠SGSH序列在UniProt条目Q9EQ08下可获得。SGSH变体例如当在相同条件下分析时具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的对应野生型SGSH或其片段的活性。催化活性SGSH片段例如当在相同条件下分析时具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的对应全长SGSH或其变体的活性。
如本文所用的“酸性神经鞘磷脂酶”、“神经鞘磷脂磷酸二酯酶”或“ASM”是指神经鞘磷脂磷酸二酯酶1(EC 3.1.4.12)，这是一种将神经鞘磷脂转化为神经酰胺的溶酶体酶。与ASM缺乏相关的疾病包括尼曼-皮克病(例如A型或B型)。如本文中用作包含Fc多肽的蛋白质的组分的术语“ASM”为催化活性的并且涵盖野生型ASM或其片段的功能变体，包括等位基因变体和剪接变体。人ASM同种型1的序列为指定为规范序列的人序列，在UniProt条目P17405下可获得并且由11p15.4处的人SMPD1基因编码。以SEQ ID NO:121形式提供全长序列。如本文所用的“成熟”ASM序列是指缺乏天然存在的全长多肽链之信号序列的多肽链形式。以SEQ ID NO:122形式提供成熟人ASM多肽的氨基酸序列，这对应于全长人序列的氨基酸47-629。如本文所用的“截短”ASM序列是指天然存在的全长多肽链的催化活性片段。以SEQ ID NO:123形式提供示例性截短人ASM多肽的氨基酸序列，这对应于全长人序列的氨基酸47-620。已对人ASM的结构进行了充分表征。说明性结构在PDB登录代码5I81下可获得。还已描述了非人灵长类动物ASM序列，包括黑猩猩(UniProt条目H2Q319)。小鼠ASM序列在UniProt条目Q04519下可获得。ASM变体例如当在相同条件下分析时具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的对应野生型ASM或其片段的活性。催化活性ASM片段例如当在相同条件下分析时具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的对应全长ASM或其变体的活性。
“β-葡糖脑苷脂酶”或“GBA”也称为葡糖基神经酰胺酶(EC 3.2.1.45)。如本文所用的所述术语是指具有葡糖基神经酰胺酶活性并且催化葡糖基神经酰胺分解为神经酰胺和葡萄糖的溶酶体酶。GBA的缺乏与高歇氏病和帕金森氏病相关。如本文中用作包含Fc多肽的蛋白质的组分的术语“GBA”为催化活性的并且涵盖野生型GBA或其片段的功能变体，包括等位基因变体和剪接变体。人GBA长同种型的序列被指定为规范序列，在UniProt条目P04062-1下可获得并且由1q22处的人GBA基因编码。以SEQ ID NO:93形式提供全长序列。如本文所用的“成熟”GBA序列是指缺乏天然存在的全长多肽链的信号和前肽序列的多肽链形式。成熟人GBA多肽的氨基酸序列以SEQ ID NO:94形式提供，这对应于全长人序列的氨基酸40-536。如本文所用的“截短”GBA序列是指天然存在的全长多肽链的催化活性片段。已对人GBA的结构进行了充分表征。可获得GBA的近20种晶体结构。还已描述了非人灵长类动物GBA序列，包括黑猩猩(UniProt条目Q9BDT0)和红毛猩猩(UniProt条目Q5R8E3)。小鼠GBA序列可在UniProt条目P17439下获得。GBA变体例如当在相同条件下分析时具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的对应野生型GBA或其片段的活性。催化活性GBA片段例如当在相同条件下分析时具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的对应全长GBA或其变体的活性。
如本文所用的“转铁蛋白受体”或“TfR”是指转铁蛋白受体蛋白1。SEQ ID NO:96中阐述了人转铁蛋白受体1多肽序列。其他物种的转铁蛋白受体蛋白1序列也是已知的(例如黑猩猩，登录号XP_003310238.1；恒河猴，NP_001244232.1；狗，NP_001003111.1；牛，NP_001193506.1；小鼠，NP_035768.1；大鼠，NP_073203.1；以及鸡，NP_990587.1)。术语“转铁蛋白受体”还涵盖由在转铁蛋白受体蛋白1染色体位点处的基因编码的示例性参考序列(例如人序列)的等位基因变体。全长转铁蛋白受体蛋白包括短N端细胞内区、跨膜区以及大细胞外结构域。细胞外结构域的特征为三个结构域：蛋白酶样结构域、螺旋状结构域以及顶端结构域。SEQ ID NO:238中阐述了人转铁蛋白受体1的顶端结构域序列。
如本文所用的“融合蛋白”或“[ERT酶]-Fc融合蛋白”是指二聚蛋白质，所述二聚蛋白质包含键联(例如融合)至ERT酶、ERT酶变体或其催化活性片段的第一Fc多肽(即，“[ERT]-Fc融合多肽”)；以及与第一Fc多肽形成Fc二聚体的第二Fc多肽。第二Fc多肽也可键联(例如融合)至ERT酶、ERT酶变体或其催化活性片段。第一Fc多肽和/或第二Fc多肽可通过肽键或通过多肽接头键联至ERT酶、ERT酶变体或其催化活性片段。第一Fc多肽和/或第二Fc多肽可为被修饰的Fc多肽，所述被修饰的Fc多肽含有促进它与另一Fc多肽异二聚化的一个或多个修饰。第一Fc多肽和/或第二Fc多肽可为被修饰的Fc多肽，所述被修饰的Fc多肽含有使其结合于转铁蛋白受体的一个或多个修饰。第一Fc多肽和/或第二Fc多肽可为被修饰的Fc多肽，所述被修饰的Fc多肽含有降低效应功能的一个或多个修饰。第一Fc多肽和/或第二Fc多肽可为被修饰的Fc多肽，所述被修饰的Fc多肽含有延长血清半衰期的一个或多个修饰。
如本文所用的“融合多肽”或“[ERT酶]-Fc融合多肽”是指键联(例如融合)至ERT酶、ERT酶变体或其催化活性片段的Fc多肽。Fc多肽可通过肽键或通过多肽接头键联至ERT酶、ERT酶变体或其催化活性片段。Fc多肽可为被修饰的Fc多肽，所述被修饰的Fc多肽含有促进它与另一Fc多肽异二聚化的一个或多个修饰。Fc多肽可为被修饰的Fc多肽，所述被修饰的Fc多肽含有使其结合于转铁蛋白受体的一个或多个修饰。Fc多肽可为被修饰的Fc多肽，所述被修饰的Fc多肽含有降低效应功能的一个或多个修饰。Fc多肽可为被修饰的Fc多肽，所述被修饰的Fc多肽含有延长血清半衰期的一个或多个修饰。
如本文所用，术语“Fc多肽”是指天然存在的以作为结构域的Ig折叠为特征的免疫球蛋白重链多肽的C端区。Fc多肽含有至少包括CH2结构域和/或CH3结构域的恒定区序列并且可含有至少部分的铰链区。一般来说，Fc多肽不含可变区。
“被修饰的Fc多肽”是指与野生型免疫球蛋白重链Fc多肽序列相比具有至少一个突变，例如取代、缺失或插入，但保留天然Fc多肽的总体Ig折叠或结构的Fc多肽。
术语“FcRn”是指新生儿Fc受体。Fc多肽结合于FcRn使Fc多肽的清除率降低并且使血清半衰期增加。人FcRn蛋白为由尺寸为约50kDa并且类似于主要组织相容性(MHC)I类蛋白的蛋白质以及尺寸为约15kDa的β2-微球蛋白组成的异二聚体。
如本文所用，“FcRn结合位点”是指Fc多肽中结合于FcRn的区域。在人IgG中，如使用EU索引编号，FcRn结合位点包括T250、L251、M252、I253、S254、R255、T256、T307、E380、M428、H433、N434、H435以及Y436。这些位置对应于SEQ ID NO:1的位置20至26、77、150、198以及203至206。
如本文所用，“天然FcRn结合位点”是指Fc多肽中结合于FcRn并且具有与天然存在的Fc多肽中结合于FcRn的区域相同的氨基酸序列的区域。
如本文所用的术语“CH3结构域”和“CH2结构域”是指免疫球蛋白恒定区结构域多肽。出于本申请的目的，CH3结构域多肽是指如根据EU编号从约位置341到约位置447的氨基酸区段，并且CH2结构域多肽是指如根据EU编号流程从约位置231到约位置340的氨基酸区段并且不包括铰链区序列。还可根据IMGT(ImMunoGeneTics)编号方案对CH2和CH3结构域多肽进行编号，其中根据IMGT科学图表编号(IMGT网站)，CH2结构域编号为1-110并且CH3结构域编号为1-107。CH2和CH3结构域为免疫球蛋白Fc区的一部分。Fc区是指如根据EU编号流程编号从约位置231到约位置447的氨基酸区段，但如本文所用，可包括抗体铰链区的至少一部分。说明性铰链区序列为人IgG1铰链序列EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO:95)。
关于CH3或CH2结构域的术语“野生型”、“天然”以及“天然存在”在本文中用于指结构域具有存在于自然界中的序列。
如本文所用，关于突变体多肽或突变体多核苷酸的术语“突变体”可与“变体”互换使用。关于给定野生型CH3或CH2结构域参考序列的变体可包括天然存在的等位基因变体。“非天然”存在的CH3或CH2结构域是指天然CH3结构域或CH2结构域多核苷酸或多肽的在自然界中不存在于细胞中并且通过例如使用基因工程化技术或诱变技术进行基因修饰所产生的变体或突变体结构域。“变体”包括相对于野生型包含至少一个氨基酸突变的任何结构域。突变可包括取代、插入以及缺失。
术语“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。
天然存在的氨基酸为那些由遗传密码编码的氨基酸，以及随后被修饰的那些氨基酸，例如羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸盐以及O-磷酸丝氨酸。“氨基酸类似物”是指具有与天然存在的氨基酸相同的基础化学结构(即结合于氢、羧基、氨基以及R基团的α碳)的化合物，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。此类类似物具有被修饰的R基团(例如正亮氨酸)或被修饰的肽主链，但保留与天然存在的氨基酸相同的基础化学结构。“氨基酸模拟物”是指结构不同于氨基酸的一般化学结构，但以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的化合物。
天然存在的α-氨基酸包括但不限于丙氨酸(Ala)、半胱氨酸(Cys)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、苯丙氨酸(Phe)、甘氨酸(Gly)、组氨酸(His)、异亮氨酸(Ile)、精氨酸(Arg)、赖氨酸(Lys)、亮氨酸(Leu)、甲硫氨酸(Met)、天冬酰胺(Asn)、脯氨酸(Pro)、谷酰胺(Gln)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、缬氨酸(Val)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)以及它们的组合。天然存在的α-氨基酸的立体异构体包括但不限于D-丙氨酸(D-Ala)、D-半胱氨酸(D-Cys)、D-天冬氨酸(D-Asp)、D-谷氨酸(D-Glu)、D-苯丙氨酸(D-Phe)、D-组氨酸(D-His)、D-异亮氨酸(D-Ile)、D-精氨酸(D-Arg)、D-赖氨酸(D-Lys)、D-亮氨酸(D-Leu)、D-甲硫氨酸(D-Met)、D-天冬酰胺(D-Asn)、D-脯氨酸(D-Pro)、D-谷酰胺(D-Gln)、D-丝氨酸(D-Ser)、D-苏氨酸(D-Thr)、D-缬氨酸(D-Val)、D-色氨酸(D-Trp)、D-酪氨酸(D-Tyr)以及它们的组合。
在本文中可通过通常已知的三字母符号或通过IUPAC-IUB生物化学命名委员会所建议的一字母符号提到氨基酸。
术语“多肽”和“肽”在本文中可互换地用于指单个链中的氨基酸残基的聚合物。所述术语适用于一个或多个氨基酸残基为对应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。氨基酸聚合物可包含完全L-氨基酸、完全D-氨基酸或L氨基酸和D氨基酸的混合物。
如本文所用的术语“蛋白质”是指多肽或单链多肽的二聚体(即，两者)或多聚体(即，三者或更多者)。可通过共价键(例如二硫键)或非共价相互作用连接蛋白质的单链多肽。
术语“保守取代”、“保守突变”或“保守修饰的变体”是指使得氨基酸用可归类为具有类似特征的另一氨基酸取代的改变。以此方式定义的保守氨基酸组类别的实例可包括：“带电荷/极性组”，包括Glu(谷氨酸或E)、Asp(天冬氨酸或D)、Asn(天冬酰胺或N)、Gln(谷酰胺或Q)、Lys(赖氨酸或K)、Arg(精氨酸或R)以及His(组氨酸或H)；“芳族组”，包括Phe(苯丙氨酸或F)、Tyr(酪氨酸或Y)、Trp(色氨酸或W)以及(组氨酸或H)；以及“脂族组”，包括Gly(甘氨酸或G)、Ala(丙氨酸或A)、Val(缬氨酸或V)、Leu(亮氨酸或L)、Ile(异亮氨酸或I)、Met(甲硫氨酸或M)、Ser(丝氨酸或S)、Thr(苏氨酸或T)以及Cys(半胱氨酸或C)。在每个组内，还可鉴定出亚组。举例来说，可将带电荷或极性氨基酸组再划分成包括以下的亚组：“带正电荷的亚组”，包含Lys、Arg以及His；“带负电荷的亚组”，包含Glu和Asp；以及“极性亚组”，包含Asn和Gln。在另一实例中，可将芳族或环状组再划分成包括以下的亚组：“氮环亚组”，包含Pro、His以及Trp；以及“苯基亚组”，包含Phe和Tyr。在另一实例中，可将脂族组再划分成例如以下的亚组：“脂族非极性亚组”，包含Val、Leu、Gly以及Ala；以及“脂族略带极性的亚组”，包含Met、Ser、Thr以及Cys。保守突变类别的实例包括以上亚组内氨基酸的氨基酸取代，诸如但不限于：Lys取代Arg或反之亦然，使得可维持正电荷；Glu取代Asp或反之亦然，使得可维持负电荷；Ser取代Thr或反之亦然，使得可维持游离-OH；以及Gln取代Asn或反之亦然，使得可维持游离-NH2。在一些实施方案中，疏水性氨基酸取代例如活性位点中的天然存在的疏水性氨基酸以保留疏水性。
在两个或更多个多肽序列的背景下，术语“同一”或“同一性”百分比是指如使用序列比较算法或通过手动比对和视觉检查所测量，当在比较窗或指定区域上比较和比对以获得最大对应性时，两个或更多个序列或子序列在指定区域上相同或具有指定百分比的相同氨基酸残基，例如至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％或更大的同一性。
对于多肽的序列比较，典型地一个氨基酸序列充当与候选序列相比较的参考序列。可使用本领域技术人员可获得的各种方法(例如视觉比对)或使用公共可获得的软件使用已知算法以实现最佳比对来进行比对。此类程序包括BLAST程序、ALIGN、ALIGN-2(Genentech,South San Francisco,Calif.)或Megalign(DNASTAR)。用于比对以实现最佳比对的参数可由本领域技术人员确定。对于用于本申请的目的的多肽序列的序列比较，使用用于比对两个蛋白质序列的BLASTP算法标准蛋白质BLAST，并且使用默认参数。
当在鉴定多肽序列中的给定氨基酸残基的背景中使用术语“对应于”、“参考……确定”或“参考……编号”时，是指当将给定氨基酸序列与参考序列最佳比对和比较时指定参考序列的残基位置。因此，举例来说，当将被修饰的Fc多肽中的氨基酸残基在与SEQ IDNO:1最佳比对时与SEQ ID NO:1中的氨基酸对齐时，所述残基“对应于”SEQ ID NO:1中的氨基酸。与参考序列比对的多肽不需要与参考序列长度相同。
如本文所用的“结合亲和力”是指两个分子(例如多肽上的单个结合位点和与它结合的靶标，例如转铁蛋白受体)之间的非共价相互作用的强度。因此，举例来说，除非另外指出或由上下文来看为清楚的，否则所述术语可指多肽与它的靶标之间的1:1相互作用。可通过测量平衡解离常数(KD)来定量结合亲和力，平衡解离常数是指解离速率常数(kd，时间-1)除以缔合速率常数(ka，时间-1M-1)。可通过测量复合物形成和解离的动力学来确定KD，例如使用表面等离子体共振(SPR)法，例如BiacoreTM系统；动力学排除分析，诸如
Figure BDA0002461603810000371
以及BioLayer干涉术(例如使用
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平台)。如本文所用，“结合亲和力”不仅包括形式结合亲和力，诸如反映多肽与它的靶标之间的1:1相互作用的那些形式结合亲和力，而且包括可反映亲合结合的计算KD'要获得的表观亲和力。
如本文所用，当提到如本文所描述的工程化的TfR结合性多肽、TfR结合性肽或TfR结合性抗体时，术语“特异性结合”或“选择性结合”于靶标，例如TfR，是指一种结合反应，通过此结合反应工程化的TfR结合性多肽、TfR结合性肽或TfR结合性抗体与结合于结构不同的靶标相比以更大亲和力、更大亲合力(avidity)和/或更大持久性结合于靶标。在典型实施方案中，当在相同亲和力分析条件下分析时，工程化的TfR结合性多肽、TfR结合性肽或TfR结合性抗体对特定靶标(例如TfR)具有与不相关靶标相比至少5倍、10倍、50倍、100倍、1,000倍、10,000倍或更大的亲和力。如本文所用，术语“特异性结合特定靶标(例如TfR)”、“特异性结合于特定靶标(例如TfR)”或“对特定靶标(例如TfR)具特异性”可例如由如下分子展现，所述分子对与它结合的靶标具有例如10-4M或更小(例如10-5M、10-6M、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M或10-12M)的平衡解离常数KD。在一些实施方案中，工程化的TfR结合性多肽、TfR结合性肽或TfR结合性抗体特异性结合于TfR上的表位，所述表位在物种间为保守的(例如在物种间在结构上保守)，例如在非人灵长类动物与人物种之间为保守的(例如在非人灵长类动物与人物种之间在结构上保守)。在一些实施方案中，工程化的TfR结合性多肽、TfR结合性肽或TfR结合性抗体可排他地结合于人TfR。
术语“可变区”或“可变域”是指抗体重链或轻链中的结构域，所述结构域衍生自生殖系可变(V)基因、多样性(D)基因或连接(J)基因(并且不衍生自恒定(Cμ和Cδ)基因区段)，并且给予抗体结合于抗原的特异性。典型地，抗体可变区包含穿插有三个高变“互补决定区”的四个保守“构架”区。
术语“抗原结合部分”和“抗原结合片段”在本文中可互换使用并且指抗体中保留经由可变区特异性结合于抗原的能力的一个或多个片段。抗原结合片段的实例包括但不限于Fab片段(由VL、VH、CL以及CH1结构域组成的单价片段)、F(ab')2片段(包含通过位于铰链区的二硫键键联的两个Fab片段的二价片段)、单链Fv(scFv)、二硫键联的Fv(dsFv)、互补决定区(CDR)、VL(轻链可变区)以及VH(重链可变区)。
术语“治疗(treatment/treating)”等在本文中通常用于意指获得所需药理学和/或生理作用。“治疗(treating/treatment)”可指成功治疗或改善溶酶体贮积症(例如亨特综合征、圣菲利柏综合征A、尼曼-皮克病、高歇氏病或帕金森氏病)的任何标志，包括任何客观或主观参数，诸如消除、缓解、患者存活率提高、存活时间或存活率增加、症状减少或使病症对患者而言更可忍受、变性或衰退速率减慢或改善患者的身体或精神健康。症状的治疗或改善可以是基于客观或主观参数的。可将治疗的效果与未接受治疗的个体或个体集合或与同一患者在治疗之前或在治疗期间的不同时间相比较。
如本文中可互换使用的术语“受试者(subject/individual)”和“患者”是指哺乳动物，包括但不限于人、非人灵长类动物、啮齿动物(例如大鼠、小鼠以及豚鼠)、兔、牛、猪、马以及其他哺乳动物物种。在一个实施方案中，患者为人。
术语“药学上可接受的赋形剂”是指对在人或动物中使用而言在生物学或药理学上相容的非活性药物成分，诸如但不限于缓冲剂、载体或防腐剂。
如本文所用，剂的“治疗量”、“治疗有效量”或“治疗有效浓度”为剂可治疗受试者(例如哺乳动物)中的疾病(例如LSD)迹象或症状的量或浓度。
术语“施用”是指将剂、化合物或组合物递送至所需生物作用位点的方法。这些方法包括但不限于表面递送、肠胃外递送、静脉内递送、真皮内递送、肌肉内递送、鞘内递送、经结肠递送、经直肠递送或腹膜内递送。在一个实施方案中，静脉内施用本文所描述的多肽。
III.酶替代疗法(ERT)酶
溶酶体贮积症(LSD)为以未消化或部分消化的大分子的累积为特征的遗传性代谢疾病，所述遗传性代谢疾病最终产生细胞功能障碍和临床异常。传统地，已将LSD定义为溶酶体功能缺乏，通常根据累积的底物来归类并且包括鞘脂贮积病(sphingolipidose)、寡糖贮积病(oligosaccharidose)、粘脂贮积病(mucolipidose)、粘多糖贮积病、脂蛋白贮积症、神经元蜡样脂褐质贮积病(neuronal ceroid lipofuscinose)以及其他溶酶体贮积病。最近已将这些病症的类别扩大为包括引起大分子(诸如溶酶体酶的正常翻译后修饰所必需的蛋白质或对于适当溶酶体运输来说重要的蛋白质)累积的其他蛋白质的缺乏或缺陷。
在一些方面中，本文所描述的融合蛋白包含：(i)Fc多肽，所述Fc多肽可含有修饰(例如促进异二聚化的一个或多个修饰)或可为野生型Fc多肽；以及ERT酶；以及(ii)Fc多肽，所述Fc多肽可含有修饰(例如促进异二聚化的一个或多个修饰)或可为野生型Fc多肽；以及任选的ERT酶。在一些实施方案中，一个或两个Fc多肽可含有引起结合于血脑屏障(BBB)受体，例如转铁蛋白受体(TfR)的修饰。ERT酶可为LSD中缺乏的任何酶。合并至融合蛋白中的ERT酶为催化活性的，即，它保留LSD中缺乏的酶活性。在一些实施方案中，ERT酶为艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶(IDS)，艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶在亨特综合征中为缺乏的。在一些实施方案中，ERT酶为N-磺基葡糖胺磺基水解酶(SGSH)，N-磺基葡糖胺磺基水解酶在圣菲利柏综合征中为缺乏的。在一些实施方案中，ERT酶为酸性神经鞘磷脂酶(ASM)，酸性神经鞘磷脂酶在尼曼-皮克病中为缺乏的。在一些实施方案中，ERT酶为β-葡糖脑苷脂酶(GBA)，β-葡糖脑苷脂酶在高歇氏病和帕金森氏病中为缺乏的。
在一些实施方案中，包含ERT酶和任选的结合于BBB受体的被修饰的Fc多肽(例如TfR结合性Fc多肽)的融合蛋白包含野生型IDS的催化活性片段或变体。在一些实施方案中，IDS酶为IDS蛋白质的变体或催化活性片段，所述IDS蛋白质的变体或催化活性片段包含SEQID NO:91、92、114、230以及234中的任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，IDS酶的催化活性变体或片段具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更大的野生型IDS酶活性。
在一些实施方案中，包含ERT酶和任选的结合于BBB受体的被修饰的Fc多肽(例如TfR结合性Fc多肽)的融合蛋白包含野生型SGSH的催化活性片段或变体。在一些实施方案中，SGSH酶为SGSH蛋白质的变体或催化活性片段，所述SGSH蛋白质的变体或催化活性片段包含SEQ ID NO:119和120中的任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，SGSH酶的催化活性变体或片段具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更大的野生型SGSH酶活性。
在一些实施方案中，包含ERT酶和任选的结合于BBB受体的被修饰的Fc多肽(例如TfR结合性Fc多肽)的融合蛋白包含野生型ASM的催化活性片段或变体。在一些实施方案中，ASM酶为ASM蛋白质的变体或催化活性片段，所述ASM蛋白质的变体或催化活性片段包含SEQID NO:121、122以及123中的任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，ASM酶的催化活性变体或片段具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更大的野生型ASM酶活性。
在一些实施方案中，包含ERT酶和任选的结合于BBB受体的被修饰的Fc多肽(例如TfR结合性Fc多肽)的融合蛋白包含野生型GBA的催化活性片段或变体。在一些实施方案中，GBA酶为GBA蛋白质的变体或催化活性片段，所述GBA蛋白质的变体或催化活性片段包含SEQID NO:93和94中的任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，GBA酶的催化活性变体或片段具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更大的野生型GBA酶活性。
在一些实施方案中，存在于本文所描述的融合蛋白中的ERT酶(例如IDS、SGSH、ASM或GBA)或其催化活性变体或片段与它不连接至Fc多肽或TfR结合性Fc多肽时的活性相比保留它的活性的至少25％。在一些实施方案中，ERT酶或其催化活性变体或片段与它不连接至Fc多肽或TfR结合性Fc多肽时的活性相比保留它的活性的至少10％或至少15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。在一些实施方案中，ERT酶或其催化活性变体或片段与它不连接至Fc多肽或TfR结合性Fc多肽时的活性相比保留它的活性的至少80％、85％、90％或95％。在一些实施方案中，融合至Fc多肽不降低ERT酶(例如IDS、SGSH、ASM或GBA)或其催化活性变体或片段的活性。在一些实施方案中，融合至TfR结合性Fc多肽不降低ERT酶的活性。
IV.用于血脑屏障(BBB)受体结合的Fc多肽修饰
在一些方面中，本文提供了能够运送穿过血脑屏障(BBB)的融合蛋白。此类蛋白质包含结合于BBB受体的被修饰的Fc多肽。BBB受体在BBB内皮以及其他细胞和组织类型上表达。在一些实施方案中，BBB受体为转铁蛋白受体(TfR)。
在本文中使用EU索引编号对在各种Fc修饰(包括引入结合于BBB受体(例如TfR)的被修饰的Fc多肽的那些Fc修饰)中指定的氨基酸残基进行编号。任何Fc多肽(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc多肽)均可如本文所描述在一个或多个位置具有修饰，例如氨基酸取代。
存在于本文所描述的融合蛋白中的被修饰(例如增强异二聚化和/或BBB受体结合)的Fc多肽可与天然Fc区序列或其片段(例如长度为至少50个氨基酸或至少100个氨基酸或更长的片段)具有至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，天然Fc氨基酸序列为SEQ ID NO:1的Fc区序列。在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽与SEQ ID NO:1的氨基酸1-110或与SEQID NO:1的氨基酸111-217或其片段(例如长度为至少50个氨基酸或至少100个氨基酸或更长的片段)具有至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。
在一些实施方案中，被修饰(例如增强异二聚化和/或BBB受体结合)的Fc多肽包含对应于天然Fc区氨基酸序列的至少50个氨基酸或至少60、65、70、75、80、85、90或95或更多个或至少100个或更多个氨基酸。在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽包含对应于天然Fc区氨基酸序列(诸如SEQ ID NO:1)的至少25个连续氨基酸或至少30、35、40或45个连续氨基酸或50个连续氨基酸或至少60、65、70、75、80 85、90或95或更多个连续氨基酸或100或更多个连续氨基酸。
在一些实施方案中，被修饰以获得BBB受体结合活性的结构域为人Ig CH3结构域，诸如IgG1 CH3结构域。CH3结构域可属于任何IgG亚型，即来自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在IgG1抗体的背景下，CH3结构域是指如根据EU编号流程编号从约位置341到约位置447的氨基酸区段。
在一些实施方案中，被修饰以获得BBB受体结合活性的结构域为人Ig CH2结构域，诸如IgG CH2结构域。CH2结构域可属于任何IgG亚型，即来自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在IgG1抗体的背景下，CH2结构域是指如根据EU编号流程编号从约位置231到约位置340的氨基酸区段。
在一些实施方案中，存在于本文所描述的融合蛋白中的被修饰(例如BBB受体结合)的Fc多肽包含根据EU编号流程在包含266、267、268、269、270、271、295、297、298以及299的氨基酸位置的至少一个、两个或三个取代；并且在一些实施方案中，为至少四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个取代。
在一些实施方案中，存在于本文所描述的融合蛋白中的被修饰(例如BBB受体结合)的Fc多肽包含根据EU编号流程在包含274、276、283、285、286、287、288、289以及290的氨基酸位置的至少一个、两个或三个取代；并且在一些实施方案中，为至少四个、五个、六个、七个、八个或九个取代。
在一些实施方案中，存在于本文所描述的融合蛋白中的被修饰(例如BBB受体结合)的Fc多肽包含根据EU编号流程在包含268、269、270、271、272、292、293、294、296以及300的氨基酸位置的至少一个、两个或三个取代；并且在一些实施方案中，为至少四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个取代。
在一些实施方案中，存在于本文所描述的融合蛋白中的被修饰(例如BBB受体结合)的Fc多肽包含根据EU编号流程在包含272、274、276、322、324、326、329、330以及331的氨基酸位置的至少一个、两个或三个取代；并且在一些实施方案中，为至少四个、五个、六个、七个、八个或九个取代。
在一些实施方案中，存在于本文所描述的融合蛋白中的被修饰(例如BBB受体结合)的Fc多肽包含根据EU编号流程在包含345、346、347、349、437、438、439以及440的氨基酸位置的至少一个、两个或三个取代；并且在一些实施方案中，为至少四个、五个、六个或七个取代。
在一些实施方案中，存在于本文所描述的融合蛋白中的被修饰(例如BBB受体结合)的Fc多肽包含根据EU编号流程在氨基酸位置384、386、387、388、389、390、413、416以及421的至少一个、两个或三个取代；并且在一些实施方案中，为至少四个、五个、六个、七个、八个或九个取代。
FcRn结合位点
在某些方面中，被修饰(例如BBB受体结合)的Fc多肽或存在于本文所描述的融合蛋白中并且不特异性结合于BBB受体的Fc多肽还可包含FcRn结合位点。在一些实施方案中，FcRn结合位点在Fc多肽或其片段内。
在一些实施方案中，FcRn结合位点包含天然FcRn结合位点。在一些实施方案中，FcRn结合位点相对于天然FcRn结合位点的氨基酸序列不包含氨基酸变化。在一些实施方案中，天然FcRn结合位点为IgG结合位点，例如人IgG结合位点。在一些实施方案中，FcRn结合位点包含改变FcRn结合的修饰。
在一些实施方案中，FcRn结合位点具有突变(例如被取代)的一个或多个氨基酸残基，其中所述一个或多个突变增加血清半衰期或不大体上减少血清半衰期(即，当在相同条件下分析时与在突变位置具有野生型残基的对应被修饰的Fc多肽相比使血清半衰期减少不超过25％)。在一些实施方案中，FcRn结合位点具有根据EU编号流程在位置250-256、307、380、428以及433-436被取代的一个或多个氨基酸残基。
在一些实施方案中，使位于FcRn结合位点处或其附近的一个或多个残基相对于天然人IgG序列发生突变，以延长被修饰的多肽的血清半衰期。在一些实施方案中，将突变引入位置252、254以及256中的一者、两者或三者。在一些实施方案中，突变为M252Y、S254T以及T256E。在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽还包含突变M252Y、S254T以及T256E。在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽包含根据EU编号流程在位置T307、E380以及N434中的一者、两者或全部三者处的取代。在一些实施方案中，突变为T307Q和N434A。在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽包含突变T307A、E380A以及N434A。在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽包含根据EU编号流程在位置T250和M428的取代。在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽包含突变T250Q和/或M428L。在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽包含根据EU编号流程在位置M428和N434的取代。在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽包含突变M428L和N434S。在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽包含N434S或N434A突变。
V.转铁蛋白受体结合性Fc多肽
本部分描述了本文所描述的结合于转铁蛋白受体(TfR)并且能够运送穿过血脑屏障(BBB)的被修饰的Fc多肽的产生。
在CH3结构域中包含突变的TfR结合性Fc多肽
在一些实施方案中，特异性结合于TfR的被修饰的Fc多肽在CH3结构域中包含取代。在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽包含人Ig CH3结构域，诸如IgG CH3结构域，所述人Ig CH3结构域被修饰以获得TfR结合活性。CH3结构域可属于任何IgG亚型，即来自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在IgG抗体的背景下，CH3结构域是指如根据EU编号流程编号从约位置341到约位置447的氨基酸区段。
在一些实施方案中，特异性结合于TfR的被修饰的Fc多肽结合于TfR的顶端结构域并且可在不阻断或以其他方式抑制转铁蛋白结合于TfR的情况下结合于TfR。在一些实施方案中，转铁蛋白结合于TfR未大体上受到抑制。在一些实施方案中，转铁蛋白结合于TfR被抑制不到约50％(例如不到约45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％或5％)。在一些实施方案中，转铁蛋白结合于TfR被抑制不到约20％(例如不到约19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％)。
在一些实施方案中，特异性结合于TfR的被修饰的Fc多肽包含根据EU编号流程在位置384、386、387、388、389、390、413、416以及421的至少两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个或九个取代。表4和表5中示出了可在这些位置引入的说明性取代。在一些实施方案中，在位置388和/或421的氨基酸为芳族氨基酸，例如Trp、Phe或Tyr。在一些实施方案中，在位置388的氨基酸为Trp。在一些实施方案中，在位置421的芳族氨基酸为Trp或Phe。
在一些实施方案中，至少一个如下位置被取代：在位置384的Leu、Tyr、Met或Val；在位置386的Leu、Thr、His或Pro；在位置387的Val、Pro或酸性氨基酸；在位置388的芳族氨基酸，例如Trp；在位置389的Val、Ser或Ala；在位置413的酸性氨基酸、Ala、Ser、Leu、Thr或Pro；在位置416的Thr或酸性氨基酸；或在位置421的Trp、Tyr、His或Phe。在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽可包含保守取代，例如集合中的一个或多个位置的指定氨基酸的相同电荷分组、疏水性分组、侧链环结构分组(例如芳族氨基酸)或尺寸分组和/或极性或非极性分组中的氨基酸。因此，举例来说，Ile可存在于位置384、386和/或位置413处。在一些实施方案中，在位置387、413以及416中的一者、两者或每一者的位置处的酸性氨基酸为Glu。在其他实施方案中，在位置387、413以及416中的一者、两者或每一者处的酸性氨基酸为Asp。在一些实施方案中，位置384、386、387、388、389、413、416以及421中的两者、三者、四者、五者、六者、七者或全部八者处具有如此段落中指定的氨基酸取代。
在一些实施方案中，如前两个段落中所描述被修饰的Fc多肽包含在位置390的天然Asn。在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽包含在位置390的Gly、His、Gln、Leu、Lys、Val、Phe、Ser、Ala或Asp。在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽还包含根据EU编号流程在包含380、391、392以及415的位置的一个、两个、三个或四个取代。在一些实施方案中，Trp、Tyr、Leu或Gln可存在于位置380处。在一些实施方案中，Ser、Thr、Gln或Phe可存在于位置391处。在一些实施方案中，Gln、Phe或His可存在于位置392处。在一些实施方案中，Glu可存在于位置415处。
在某些实施方案中，被修饰的Fc多肽包含两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或十一个选自以下的位置：在位置380的Trp、Leu或Glu；在位置384的Tyr或Phe；在位置386的Thr；在位置387的Glu；在位置388的Trp；在位置389的Ser、Ala、Val或Asn；在位置390的Ser或Asn；在位置413的Thr或Ser；在位置415的Glu或Ser；在位置416的Glu；和/或在位置421的Phe。在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽包含如下全部十一个位置：在位置380的Trp、Leu或Glu；在位置384的Tyr或Phe；在位置386的Thr；在位置387的Glu；在位置388的Trp；在位置389的Ser、Ala、Val或Asn；在位置390的Ser或Asn；在位置413的Thr或Ser；在位置415的Glu或Ser；在位置416的Glu；和/或在位置421的Phe。
在某些实施方案中，被修饰的Fc多肽包含在位置384的Leu或Met；在位置386的Leu、His或Pro；在位置387的Val；在位置388的Trp；在位置389的Val或Ala；在位置413的Pro；在位置416的Thr；和/或在位置421的Trp。在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽还包含在位置391的Ser、Thr、Gln或Phe。在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽还包含在位置380的Trp、Tyr、Leu或Gln和/或在位置392的Gln、Phe或His。在一些实施方案中，Trp存在于位置380处和/或Gln存在于位置392处。在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽不具有在位置380的Trp。
在其他实施方案中，被修饰的Fc多肽包含在位置384的Tyr；在位置386的Thr；在位置387的Glu或Val；在位置388的Trp；在位置389的Ser；在位置413的Ser或Thr；在位置416的Glu；和/或在位置421的Phe。在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽包含在位置390的天然Asn。在某些实施方案中，被修饰的Fc多肽还包含在位置380的Trp、Tyr、Leu或Gln；和/或在位置415的Glu。在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽还包含在位置380的Trp和/或在位置415的Glu。
在额外的实施方案中，被修饰的Fc多肽还包含根据EU编号流程在包含414、424以及426的位置的一个、两个或三个取代。在一些实施方案中，位置414为Lys、Arg、Gly或Pro；位置424为Ser、Thr、Glu或Lys；和/或位置426为Ser、Trp或Gly。
在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽包含以下取代中的一者或多者：根据EU编号流程在位置380的Trp；在位置386的Thr；在位置388的Trp；在位置389的Val；在位置413的Thr或Ser；在位置415的Glu；和/或在位置421的Phe。
在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽与SEQ ID NO:4-90、97-100以及105-108中的任一者(例如SEQ ID NO:34-38、58以及60-90)的氨基酸111-217具有至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽与SEQ ID NO:4-90、97-100以及105-108中的任一者(例如SEQ ID NO:34-38、58以及60-90)具有至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽包含在SEQ ID NO:4-90、97-100以及105-108中的任一者(例如SEQ ID NO:34-38、58以及60-90)的EU索引位置384-390和/或413-421的氨基酸。在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽包含在4-90、97-100以及105-108中的任一者(例如SEQ ID NO:34-38、58以及60-90)的EU索引位置380-390和/或413-421的氨基酸。在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽包含在SEQ IDNO:4-90、97-100以及105-108中的任一者(例如SEQ ID NO:34-38、58以及60-90)的EU索引位置380-392和/或413-426的氨基酸。
在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽与SEQ ID NO:4-90、97-100以及105-108中的任一者(例如SEQ ID NO:34-38、58以及60-90)具有至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性，并且还包含根据EU索引编号的如下位置中的至少五者、六者、七者、八者、九者、十者、十一者、十二者、十三者、十四者、十五者或十六者：在位置380的Trp、Tyr、Leu、Gln或Glu；在位置384的Leu、Tyr、Met或Val；在位置386的Leu、Thr、His或Pro；在位置387的Val、Pro或酸性氨基酸；在位置388的芳族氨基酸，例如Trp；在位置389的Val、Ser或Ala；在位置390的Ser或Asn；在位置391的Ser、Thr、Gln或Phe；在位置392的Gln、Phe或His；在位置413的酸性氨基酸、Ala、Ser、Leu、Thr或Pro；在位置414的Lys、Arg、Gly或Pro；在位置415的Glu或Ser；在位置416的Thr或酸性氨基酸；在位置421的Trp、Tyr、His或Phe；在位置424的Ser、Thr、Glu或Lys；以及在位置426的Ser、Trp或Gly。
在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽包含SEQ ID NO:34-38、58以及60-90中的任一者的氨基酸序列。在其他实施方案中，被修饰的Fc多肽包含SEQ ID NO:34-38、58以及60-90中的任一者的氨基酸序列，但其中一个、两个或三个氨基酸被取代。
在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽包含额外的突变，诸如以下第VI部分中所描述的突变，包括但不限于杵突变(例如如参考EU编号进行编号的T366W)、臼突变(例如如参考EU编号进行编号的T366S、L368A以及Y407V)、调节效应功能的突变(例如如参考EU编号进行编号的L234A、L235A和/或P329G(例如L234A和L235A))和/或增加血清稳定性或血清半衰期的突变(例如(i)如参考EU编号进行编号的M252Y、S254T以及T256E，或(ii)如根据EU编号流程编号的N434S加上或不加上M428L)。作为例证，SEQ ID NO:156-229提供在CH3结构域中具有包含这些额外突变中的一者或多者的突变的被修饰的Fc多肽的非限制性实例(例如克隆CH3C.35.20.1、CH3C.35.23.2、CH3C.35.23.3、CH3C.35.23.4、CH3C.35.21.17.2以及CH3C.35.23)。
在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽包含杵突变(例如如参考EU编号进行编号的T366W)并且与SEQ ID NO:156、168、180、192、204以及216中的任一者的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽包含SEQID NO:156、168、180、192、204以及216中的任一者的序列。
在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽包含杵突变(例如如参考EU编号进行编号的T366W)以及调节效应功能之突变(例如如参考EU编号进行编号的L234A、L235A和/或P329G(例如L234A和L235A))，并且与SEQ ID NO:157、158、169、170、181、182、193、194、205、206、217、218、228以及229中的任一者的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽包含SEQ ID NO:157、158、169、170、181、182、193、194、205、206、217以及218中的任一者的序列。
在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽包含杵突变(例如如参考EU编号进行编号的T366W)以及增加血清稳定性或血清半衰期的突变(例如(i)如参考EU编号进行编号的M252Y、S254T以及T256E，或(ii)如根据EU编号流程编号的N434S加上或不加上M428L)，并且与SEQ ID NO:159、171、183、195、207以及219中的任一者的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽包含SEQ ID NO:159、171、183、195、207以及219中的任一者的序列。
在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽包含杵突变(例如如参考EU编号进行编号的T366W)、调节效应功能的突变(例如如参考EU编号进行编号的L234A、L235A和/或P329G(例如L234A和L235A))以及增加血清稳定性或血清半衰期的突变(例如(i)如参考EU编号进行编号的M252Y、S254T以及T256E，或(ii)如根据EU编号流程编号的N434S加上或不加上M428L)，并且与SEQ ID NO:160、161、172、173、184、185、196、197、208、209、220以及221中的任一者的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽包含SEQ ID NO:160、161、172、173、184、185、196、197、208、209、220以及221中的任一者的序列。
在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽包含臼突变(例如如参考EU编号进行编号的T366S、L368A以及Y407V)并且与SEQ ID NO:162、174、186、198、210以及222中的任一者的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽包含SEQ ID NO:162、174、186、198、210以及222中的任一者的序列。
在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽包含臼突变(例如如参考EU编号进行编号的T366S、L368A以及Y407V)以及调节效应功能的突变(例如如参考EU编号进行编号的L234A、L235A和/或P329G(例如L234A以及L235A))，并且与SEQ ID NO:163、164、175、176、187、188、199、200、211、212、223以及224中的任一者的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽包含SEQ ID NO:163、164、175、176、187、188、199、200、211、212、223以及224中的任一者的序列。
在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽包含臼突变(例如如参考EU编号进行编号的T366S、L368A以及Y407V)以及增加血清稳定性或血清半衰期的突变(例如(i)如参考EU编号进行编号的M252Y、S254T以及T256E，或(ii)如根据EU编号流程编号的N434S加上或不加上M428L)，并且与SEQ ID NO:165、177、189、201、213以及225中的任一者的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽包含SEQID NO:165、177、189、201、213以及225中的任一者的序列。
在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽包含臼突变(例如如参考EU编号进行编号的T366S、L368A以及Y407V)、调节效应功能的突变(例如如参考EU编号进行编号的L234A、L235A和/或P329G(例如L234A以及L235A))以及增加血清稳定性或血清半衰期的突变(例如(i)如参考EU编号进行编号的M252Y、S254T以及T256E，或(ii)如根据EU编号流程编号的N434S加上或不加上M428L)，并且与SEQ ID NO:166、167、178、179、190、191、202、203、214、215、226以及227中的任一者的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽包含SEQ ID NO:166、167、178、179、190、191、202、203、214、215、226以及227中的任一者的序列。
在一些实施方案中，特异性结合于TfR的被修饰的Fc多肽包含根据EU编号流程在位置345、346、347、349、437、438、439以及440的至少两个、三个、四个、五个、六个、七个或八个取代。SEQ ID NO:124-128中提供了说明性被修饰的Fc多肽。在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽包含在位置437的Gly；在位置438的Phe；和/或在位置440的Asp。在一些实施方案中，Glu存在于位置440处。在某些实施方案中，被修饰的Fc多肽包含在如下位置的至少一个取代：在位置345的Phe或Ile；在位置346的Asp、Glu、Gly、Ala或Lys；在位置347的Tyr、Met、Leu、Ile或Asp；在位置349的Thr或Ala；在位置437的Gly；在位置438的Phe；在位置439的His、Tyr、Ser或Phe；或在位置440的Asp。在一些实施方案中，位置345、346、347、349、437、438、439以及440中的两者、三者、四者、五者、六者、七者或全部八者处具有如此段落中所指定的取代。在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽可包含保守取代，例如集合中的一个或多个位置的指定氨基酸的相同电荷分组、疏水性分组、侧链环结构分组(例如芳族氨基酸)或尺寸分组和/或极性或非极性分组中的氨基酸。
在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽与SEQ ID NO:124-128中的任一者的氨基酸111-217具有至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽与SEQ ID NO:124-128具有至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽包含SEQ ID NO:124-128中的任一者的氨基酸序列。在其他实施方案中，被修饰的Fc多肽包含SEQ ID NO:124-128中的任一者的氨基酸序列，但其中一个、两个或三个氨基酸被取代。
在CH2结构域中包含突变的TfR结合性Fc多肽
在一些实施方案中，特异性结合于TfR的被修饰的Fc多肽在CH2结构域中包含取代。在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽包含人IgCH2结构域，诸如IgG CH2结构域，所述人Ig CH2结构域被修饰以获得TfR结合活性。CH2结构域可属于任何IgG亚型，即，来自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在IgG抗体的背景下，CH2结构域是指如根据EU编号流程编号从约位置231到约位置340的氨基酸区段。
在一些实施方案中，特异性结合于TfR的被修饰的Fc多肽结合于TfR的顶端结构域并且可在不阻断或以其他方式抑制转铁蛋白结合于TfR的情况下结合于TfR。在一些实施方案中，转铁蛋白结合于TfR未大体上受到抑制。在一些实施方案中，转铁蛋白结合于TfR被抑制不到约50％(例如不到约45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％或5％)。在一些实施方案中，转铁蛋白结合于TfR被抑制不到约20％(例如不到约19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％)。
在一些实施方案中，特异性结合于TfR的被修饰的Fc多肽包含根据EU编号流程在位置274、276、283、285、286、287、288以及290的至少两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个或九个取代。SEQ ID NO:129-133中提供了说明性被修饰的Fc多肽。在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽包含在位置287的Glu和/或在位置288的Trp。在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽包含在如下位置的至少一个取代：在位置274的Glu、Gly、Gln、Ser、Ala、Asn、Tyr或Trp；在位置276的Ile、Val、Asp、Glu、Thr、Ala或Tyr；在位置283的Asp、Pro、Met、Leu、Ala、Asn或Phe；在位置285的Arg、Ser、Ala或Gly；在位置286的Tyr、Trp、Arg或Val；在位置287的Glu；在位置288的Trp或Tyr；在位置289的Gln、Tyr、His、Ile、Phe、Val或Asp；或在位置290的Leu、Trp、Arg、Asn、Tyr或Val。在一些实施方案中，位置274、276、283、285、286、287、288以及290中的两者、三者、四者、五者、六者、七者、八者或全部九者具有如此段落中所指定的取代。在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽可包含保守取代，例如集合中的一个或多个位置的指定氨基酸的相同电荷分组、疏水性分组、侧链环结构分组(例如芳族氨基酸)或尺寸分组和/或极性或非极性分组中的氨基酸。
在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽包含在位置274的Glu、Gly、Gln、Ser、Ala、Asn或Tyr；在位置276的Ile、Val、Asp、Glu、Thr、Ala或Tyr；在位置283的Asp、Pro、Met、Leu、Ala或Asn；在位置285的Arg、Ser或Ala；在位置286的Tyr、Trp、Arg或Val；在位置287的Glu；在位置288的Trp；在位置289的Gln、Tyr、His、Ile、Phe或Val；和/或在位置290的Leu、Trp、Arg、Asn或Tyr。在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽包含在位置285的Arg；在位置286的Tyr或Trp；在位置287的Glu；在位置288的Trp；和/或在位置290的Arg或Trp。
在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽与SEQ ID NO:129-133中的任一者的氨基酸1-110具有至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽与SEQ ID NO:129-133具有至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽包含SEQ ID NO:129-133中的任一者的氨基酸序列。在其他实施方案中，被修饰的Fc多肽包含SEQ ID NO:129-133中的任一者的氨基酸序列，但其中一个、两个或三个氨基酸被取代。
在一些实施方案中，特异性结合于TfR的被修饰的Fc多肽包含根据EU编号流程在位置266、267、268、269、270、271、295、297、298以及299的至少两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个取代。SEQ ID NO:134-138中提供了说明性被修饰的Fc多肽。在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽包含在位置270的Pro、在位置295的Glu和/或在位置297的Tyr。在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽包含在如下位置的至少一个取代：在位置266的Pro、Phe、Ala、Met或Asp；在位置267的Gln、Pro、Arg、Lys、Ala、Ile、Leu、Glu、Asp或Tyr；在位置268的Thr、Ser、Gly、Met、Val、Phe、Trp或Leu；在位置269的Pro、Val、Ala、Thr或Asp；在位置270的Pro、Val或Phe；在位置271的Trp、Gln、Thr或Glu；在位置295的Glu、Val、Thr、Leu或Trp；在位置297的Tyr、His、Val或Asp；在位置298的Thr、His、Gln、Arg、Asn或Val；或在位置299的Tyr、Asn、Asp、Ser或Pro。在一些实施方案中，位置266、267、268、269、270、271、295、297、298以及299中的两者、三者、四者、五者、六者、七者、八者、九者或全部十者具有如此段落中所指定的取代。在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽可包含保守取代，例如集合中的一个或多个位置的指定氨基酸的相同电荷分组、疏水性分组、侧链环结构分组(例如芳族氨基酸)或尺寸分组和/或极性或非极性分组中的氨基酸。
在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽包含在位置266的Pro、Phe或Ala；在位置267的Gln、Pro、Arg、Lys、Ala或Ile；在位置268的Thr、Ser、Gly、Met、Val、Phe或Trp；在位置269的Pro、Val或Ala；在位置270的Pro；在位置271的Trp或Gln；在位置295的Glu；在位置297的Tyr；在位置298的Thr、His或Gln；和/或在位置299的Tyr、Asn、Asp或Ser。
在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽包含在位置266的Met；在位置267的Leu或Glu；在位置268的Trp；在位置269的Pro；在位置270的Val；在位置271的Thr；在位置295的Val或Thr；在位置197的His；在位置198的His、Arg或Asn；和/或在位置299的Pro。
在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽包含在位置266的Asp；在位置267的Asp；在位置268的Leu；在位置269的Thr；在位置270的Phe；在位置271的Gln；在位置295的Val或Leu；在位置297的Val；在位置298的Thr；和/或在位置299的Pro。
在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽与SEQ ID NO:134-138中的任一者的氨基酸1-110具有至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽与SEQ ID NO:134-138具有至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽包含SEQ ID NO:134-138中的任一者的氨基酸序列。在其他实施方案中，被修饰的Fc多肽包含SEQ ID NO:134-138中的任一者的氨基酸序列，但其中一个、两个或三个氨基酸被取代。
在一些实施方案中，特异性结合于TfR的被修饰的Fc多肽包含根据EU编号流程在位置268、269、270、271、272、292、293、294以及300的至少两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个取代。SEQ ID NO:139-143中提供了说明性被修饰的Fc多肽。在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽包含在如下位置的至少一个取代：在位置268的Val或Asp；在位置269的Pro、Met或Asp；在位置270的Pro或Trp；在位置271的Arg、Trp、Glu或Thr；在位置272的Met、Tyr或Trp；在位置292的Leu或Trp；在位置293的Thr、Val、Ile或Lys；在位置294的Ser、Lys、Ala或Leu；在位置296的His、Leu或Pro；或在位置300的Val或Trp。在一些实施方案中，位置268、269、270、271、272、292、293、294以及300中的两者、三者、四者、五者、六者、七者、八者、九者或全部十者具有如此段落中所指定的取代。在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽可包含保守取代，例如集合中的一个或多个位置的指定氨基酸的相同电荷分组、疏水性分组、侧链环结构分组(例如芳族氨基酸)或尺寸分组和/或极性或非极性分组中的氨基酸。
在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽包含在位置268的Val；在位置269的Pro；在位置270的Pro；在位置271的Arg或Trp；在位置272的Met；在位置292的Leu；在位置293的Thr；在位置294的Ser；在位置296的His；和/或在位置300的Val。
在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽包含在位置268的Asp；在位置269的Met或Asp；在位置270的Trp；在位置271的Glu或Thr；在位置272的Tyr或Trp；在位置292的Trp；在位置293的Val、Ile或Lys；在位置294的Lys、Ala或Leu；在位置296的Leu或Pro；和/或在位置300的Trp。
在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽与SEQ ID NO:139-143中的任一者的氨基酸1-110具有至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽与SEQ ID NO:139-143具有至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽包含SEQ ID NO:139-143中的任一者的氨基酸序列。在其他实施方案中，被修饰的Fc多肽包含SEQ ID NO:139-143中的任一者的氨基酸序列，但其中一个、两个或三个氨基酸被取代。
在一些实施方案中，特异性结合于TfR的被修饰的Fc多肽具有根据EU编号流程在位置272、274、276、322、324、326、329、330以及331的至少两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个取代。SEQ ID NO:144-148中提供了说明性被修饰的Fc多肽。在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽包含在位置330的Trp。在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽包含在如下位置的至少一个取代：在位置272的Trp、Val、Ile或Ala；在位置274的Trp或Gly；在位置276的Tyr、Arg或Glu；在位置322的Ser、Arg或Gln；在位置324的Val、Ser或Phe；在位置326的Ile、Ser或Trp；在位置329的Trp、Thr、Ser、Arg或Asp；在位置330的Trp；或在位置331的Ser、Lys、Arg或Val。在一些实施方案中，位置272、274、276、322、324、326、329、330以及331中的两者、三者、四者、五者、六者、七者、八者或全部九者具有如此段落中所指定的取代。在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽可包含保守取代，例如集合中的一个或多个位置的指定氨基酸的相同电荷分组、疏水性分组、侧链环结构分组(例如芳族氨基酸)或尺寸分组和/或极性或非极性分组中的氨基酸。
在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽包含两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个或九个选自以下的位置：位置272为Trp、Val、Ile或Ala；位置274为Trp或Gly；位置276为Tyr、Arg或Glu；位置322为Ser、Arg或Gln；位置324为Val、Ser或Phe；位置326为Ile、Ser或Trp；位置329为Trp、Thr、Ser、Arg或Asp；位置330为Trp；以及位置331为Ser、Lys、Arg或Val。在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽包含在位置272的Val或Ile；在位置274的Gly；在位置276的Arg；在位置322的Arg；在位置324的Ser；在位置326的Ser；在位置329的Thr、Ser或Arg；在位置330的Trp；和/或在位置331的Lys或Arg。
在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽与SEQ ID NO:144-148中的任一者的氨基酸1-110具有至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽与SEQ ID NO:144-148具有至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽包含SEQ ID NO:144-148中的任一者的氨基酸序列。在其他实施方案中，被修饰的Fc多肽包含SEQ ID NO:144-148中的任一者的氨基酸序列，但其中一个、两个或三个氨基酸被取代。
VI.额外的Fc多肽突变
在一些方面中，本文所描述的融合蛋白包含两个Fc多肽，所述两个Fc多肽可各自包含独立选择的修饰或可为野生型Fc多肽，例如人IgG1Fc多肽。在一些实施方案中，一个或两个Fc多肽含有一个或多个修饰，所述一个或多个修饰使其结合于血脑屏障(BBB)受体，例如转铁蛋白受体(TfR)。可引入一个或两个Fc多肽中的其他突变的非限制性实例包括例如用于以下目的的突变：增加血清稳定性或血清半衰期、调节效应功能、影响糖基化、降低人的免疫原性和/或提供Fc多肽的杵和臼异二聚化。
在一些实施方案中，存在于融合蛋白中的Fc多肽独立地与对应野生型Fc多肽(例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc多肽)具有至少约75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性。
在一些实施方案中，存在于融合蛋白中的Fc多肽包括杵和臼突变以促进异二聚体形成并且阻止均二聚体形成。通常，修饰在第一多肽的界面处引入突起(“杵”)并且在第二多肽的界面中引入对应空腔(“臼”)，使得突起可安置于空腔中以便促进异二聚体形成并且因此阻止均二聚体形成。通过将第一多肽界面的小氨基酸侧链用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)置换来构建突起。通过将大氨基酸侧链用较小氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)置换在第二多肽的界面中形成尺寸与突起一致或类似的补偿性空腔。在一些实施方案中，此类额外突变位于Fc多肽中不对多肽结合于BBB受体(例如TfR)有负面影响的位置。
在杵和臼二聚化方法的一个说明性实施方案中，存在于融合蛋白中的Fc多肽中的一者的位置366(根据EU编号流程编号)包含替代天然苏氨酸的色氨酸。二聚体中的另一Fc多肽具有在位置407(根据EU编号流程编号)的替代天然酪氨酸的缬氨酸。另一Fc多肽可还包含如下取代，其中在位置366(根据EU编号流程编号)的天然苏氨酸被丝氨酸取代并且在位置368(根据EU编号流程编号)的天然亮氨酸被丙氨酸取代。因此，本文所描述的融合蛋白的Fc多肽中的一者具有T366W杵突变并且另一Fc多肽具有Y407V突变，典型地伴随T366S和L368A臼突变。
在一些实施方案中，可引入用于增强血清半衰期的修饰。举例来说，在一些实施方案中，存在于本文所描述的融合蛋白中的一个或两个Fc多肽可包含如根据EU编号流程编号在位置252的酪氨酸、在位置254的苏氨酸以及在位置256的谷氨酸。因此，一个或两个Fc多肽可具有M252Y、S254T以及T256E取代。或者，一个或两个Fc多肽可具有如根据EU编号流程编号的M428L和N434S取代。或者，一个或两个Fc多肽可具有N434S或N434A取代。
在一些实施方案中，存在于本文所描述的融合蛋白中的一个或两个Fc多肽可包含降低效应功能的修饰，即，具有降低的在结合于在介导效应功能的效应细胞上表达的Fc受体后诱导某些生物功能的能力。抗体效应功能的实例包括但不限于C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)、Fc受体结合、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞介导的噬菌作用(ADCP)、细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调以及B细胞活化。效应功能可随抗体类别而变化。举例来说，天然人IgG1和IgG3抗体可在结合于免疫系统细胞上存在的适当Fc受体后引发ADCC和CDC活性；并且天然人IgG1、IgG2、IgG3以及IgG4可在结合于免疫细胞上存在的适当Fc受体后引发ADCP功能。
在一些实施方案中，存在于本文所描述的融合蛋白中的一个或两个Fc多肽还可被工程化以含有用于异二聚化之其他修饰，例如对CH3-CH3界面内天然带电荷的接触残基的静电工程化或疏水补丁修饰(hydrophobic patch modification)。
在一些实施方案中，存在于本文所描述的融合蛋白中的一个或两个Fc多肽可包括调节效应功能的额外修饰。
在一些实施方案中，存在于本文所描述的融合蛋白中的一个或两个Fc多肽可包含降低或消除效应功能的修饰。说明性降低效应功能的Fc多肽突变包括但不限于在CH2结构域中例如根据EU编号流程在位置234和235的取代。举例来说，在一些实施方案中，一个或两个Fc多肽可包含在位置234和235的丙氨酸残基。因此，一个或两个Fc多肽可具有L234A和L235A(LALA)取代。
调节效应功能的额外的Fc多肽突变包括但不限于以下情况：位置329可具有突变，其中脯氨酸用甘氨酸或精氨酸或足够大以破坏在Fc的脯氨酸329与FcγRIII的色氨酸残基Trp 87与Trp 110之间形成的Fc/Fcγ受体界面的氨基酸残基取代。额外的说明性取代包括根据EU编号流程的S228P、E233P、L235E、N297A、N297D以及P331S。还可存在多重取代，例如根据EU编号流程，人IgG1Fc区的L234A和L235A；人IgG1 Fc区的L234A、L235A以及P329G；人IgG4 Fc区的S228P和L235E；人IgG1 Fc区的L234A和G237A；人IgG1 Fc区的L234A、L235A以及G237A；人IgG2 Fc区的V234A和G237A；人IgG4Fc区的L235A、G237A以及E318A；以及人IgG4Fc区的S228P和L236E。在一些实施方案中，一个或两个Fc多肽可具有调节ADCC的一个或多个氨基酸取代，例如根据EU编号流程在位置298、333和/或334的取代。
包含额外突变的说明性Fc多肽
作为非限制性实例，存在于本文所描述的融合蛋白中的一个或两个Fc多肽可包含额外突变，包括杵突变(例如如根据EU编号流程编号的T366W)、臼突变(例如如根据EU编号流程编号的T366S、L368A以及Y407V)、调节效应功能的突变(例如如根据EU编号流程编号的L234A、L235A和/或P329G(例如L234A和L235A))和/或增加血清稳定性或血清半衰期的突变(例如(i)如参考EU编号进行编号的M252Y、S254T以及T256E，或(ii)如根据EU编号流程编号的N434S加上或不加上M428L)。
在一些实施方案中，Fc多肽可具有杵突变(例如如根据EU编号流程编号的T366W)并且与SEQ ID NO:1、4-90以及124-148中的任一者的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，具有SEQ ID NO:1、4-90以及124-148中的任一者的序列的Fc多肽可被修饰以具有杵突变。
在一些实施方案中，Fc多肽可具有杵突变(例如如根据EU编号流程编号的T366W)、调节效应功能的突变(例如如根据EU编号流程编号的L234A、L235A和/或P329G(例如L234A和L235A))，并且与SEQ ID NO:1、4-90以及124-148中的任一者的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，具有SEQ ID NO:1、4-90以及124-148中的任一者的序列的Fc多肽可被修饰以具有杵突变以及调节效应功能的突变。
在一些实施方案中，Fc多肽可具有杵突变(例如如根据EU编号流程编号的T366W)、增加血清稳定性或血清半衰期的突变(例如(i)如参考EU编号进行编号的M252Y、S254T以及T256E，或(ii)如根据EU编号流程编号的N434S加上或不加上M428L)，并且与SEQ ID NO:1、4-90以及124-148中的任一者的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，具有SEQ ID NO:1、4-90以及124-148中的任一者的序列的Fc多肽可被修饰以具有杵突变以及增加血清稳定性或血清半衰期的突变。
在一些实施方案中，Fc多肽可具有杵突变(例如如根据EU编号流程编号的T366W)、调节效应功能的突变(例如如根据EU编号流程编号的L234A、L235A和/或P329G(例如L234A和L235A))、增加血清稳定性或血清半衰期的突变(例如(i)如参考EU编号进行编号的M252Y、S254T以及T256E，或(ii)如根据EU编号流程编号的N434S加上或不加上M428L)，并且与SEQ ID NO:1、4-90以及124-148中的任一者的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，具有SEQ ID NO:1、4-90以及124-148中的任一者的序列的Fc多肽可被修饰以具有杵突变、调节效应功能的突变以及增加血清稳定性或血清半衰期的突变。
在一些实施方案中，Fc多肽可具有臼突变(例如如根据EU编号流程编号的T366S、L368A以及Y407V)并且与SEQ ID NO:1、4-90以及124-148中的任一者的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，具有SEQ ID NO:1、4-90以及124-148中的任一者的序列的Fc多肽可被修饰以具有臼突变。
在一些实施方案中，Fc多肽可具有臼突变(例如如根据EU编号流程编号的T366S、L368A以及Y407V)、调节效应功能的突变(例如如根据EU编号流程编号的L234A、L235A和/或P329G(例如L234A和L235A))，并且与SEQ ID NO:1、4-90以及124-148中的任一者的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，具有SEQ IDNO:1、4-90以及124-148中的任一者的序列的Fc多肽可被修饰以具有臼突变以及调节效应功能的突变。
在一些实施方案中，Fc多肽可具有臼突变(例如如根据EU编号流程编号的T366S、L368A以及Y407V)、增加血清或血清半衰期的突变(例如(i)如参考EU编号进行编号的M252Y、S254T以及T256E，或(ii)如根据EU编号流程编号的N434S加上或不加上M428L)，并且与SEQ ID NO:1、4-90以及124-148中的任一者的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，具有SEQ ID NO:1、4-90以及124-148中的任一者的序列的Fc多肽可被修饰以具有臼突变以及增加血清稳定性或血清半衰期的突变。
在一些实施方案中，Fc多肽可具有臼突变(例如如根据EU编号流程编号的T366S、L368A以及Y407V)、调节效应功能的突变(例如如根据EU编号流程编号的L234A、L235A和/或P329G(例如L234A和L235A))、增加血清稳定性或血清半衰期的突变(例如(i)如参考EU编号进行编号的M252Y、S254T以及T256E，或(ii)如根据EU编号流程编号的N434S加上或不加上M428L)，并且与SEQ ID NO:1、4-90以及124-148中的任一者的序列具有至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性。在一些实施方案中，具有SEQ ID NO:1、4-90以及124-148中的任一者的序列的Fc多肽可被修饰以具有臼突变、调节效应功能的突变以及增加血清稳定性或血清半衰期的突变。
VII.包含ERT酶的说明性融合蛋白
在一些方面中，本文所描述的融合蛋白包含第一Fc多肽，所述第一Fc多肽键联至酶替代疗法(ERT)酶、ERT酶变体或其催化活性片段；以及第二Fc多肽，所述第二Fc多肽与第一Fc多肽形成Fc二聚体。在一些实施方案中，第一Fc多肽和/或第二Fc多肽不包括免疫球蛋白重链和/或轻链可变区序列或其抗原结合部分。在一些实施方案中，ERT酶为IDS、SGSH、ASM或GBA。在一些实施方案中，第一Fc多肽为被修饰的Fc多肽和/或第二Fc多肽为被修饰的Fc多肽。在一些实施方案中，第二Fc多肽为被修饰的Fc多肽。在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽含有促进它与另一Fc多肽的异二聚化的一个或多个修饰。在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽含有降低效应功能的一个或多个修饰。在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽含有延长血清半衰期的一个或多个修饰。在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽含有使它结合于血脑屏障(BBB)受体(例如转铁蛋白受体(TfR))的一个或多个修饰。
在其他方面中，本文所描述的融合蛋白包含第一多肽链，所述第一多肽链包含特异性结合于BBB受体(例如TfR)的被修饰的Fc多肽；以及第二多肽链，所述第二多肽链包含与被修饰的Fc多肽二聚化以形成Fc二聚体的Fc多肽。ERT酶可键联至第一或第二多肽链。在一些实施方案中，ERT酶为IDS、SGSH、ASM或GBA。在一些实施方案中，ERT酶键联至第二多肽链。在一些实施方案中，蛋白质包含两个ERT酶，这两个ERT酶各自键联至多肽链中的一者。在一些实施方案中，Fc多肽可为BBB受体结合性多肽，所述BBB受体结合性多肽特异性结合于与第一多肽链中的被修饰的Fc多肽相同的BBB受体。在一些实施方案中，Fc多肽不特异性结合于BBB受体。
在一些实施方案中，本文所描述的融合蛋白包含第一多肽链，所述第一多肽链包含特异性结合于TfR的被修饰的Fc多肽；以及第二多肽链，所述第二多肽链包含Fc多肽，其中所述被修饰的Fc多肽与所述Fc多肽二聚化以形成Fc二聚体。在一些实施方案中，ERT酶为IDS、SGSH、ASM或GBA。在一些实施方案中，ERT酶键联至第一多肽链。在一些实施方案中，ERT酶键联至第二多肽链。在一些实施方案中，Fc多肽不特异性结合于BBB受体，例如TfR。
在一些实施方案中，本文所描述的融合蛋白包含第一多肽链，所述第一多肽链包含结合于TfR并且包含T366W(杵)取代的被修饰的Fc多肽；以及第二多肽链，所述第二多肽链包含含有T366S、L368A以及Y407V(臼)取代的Fc多肽。在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽和/或Fc多肽还包含L234A和L235A(LALA)取代。在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽和/或Fc多肽还包含M252Y、S254T以及T256E(YTE)取代。在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽和/或Fc多肽还包含L234A和L235A(LALA)取代以及M252Y、S254T以及T256E(YTE)取代。在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽和/或Fc多肽包含在位置234、235、252、254、256以及366的人IgG1野生型残基。
在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽包含如关于SEQ ID NO:97-100、151、156-161、168-173、180-185、192-197、204-209以及216-221中的任一者所指定的杵、LALA以及YTE突变，并且与相应序列具有至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性；或包含SEQ ID NO:97-100、151、156-161、168-173、180-185、192-197、204-209以及216-221中的任一者的序列。在一些实施方案中，Fc多肽包含如关于SEQ ID NO:101-104中的任一者所指定的臼、LALA以及YTE突变并且与相应序列具有至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性；或包含SEQ ID NO:101-104中的任一者的序列。在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽包含SEQ ID NO:97-100、151、156-161、168-173、180-185、192-197、204-209以及216-221中的任一者，并且Fc多肽包含SEQ ID NO:101-104中的任一者。在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽和/或Fc多肽的N端包括IgG1铰链区的一部分(例如DKTHTCPPCP；SEQ IDNO:113)。在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽与SEQ ID NO:116、228以及229中的任一者具有至少85％、至少90％或至少95％同一性，或包含SEQ ID NO:116、228以及229中的任一者的序列。
在一些实施方案中，本文所描述的融合蛋白包含第一多肽链，所述第一多肽链包含结合于TfR并且包含T366S、L368A以及Y407V(臼)取代的被修饰的Fc多肽；以及第二多肽链，所述第二多肽链包含含有T366W(杵)取代的Fc多肽。在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽和/或Fc多肽还包含L234A和L235A(LALA)取代。在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽和/或Fc多肽还包含M252Y、S254T以及T256E(YTE)取代。在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽和/或Fc多肽还包含L234A和L235A(LALA)取代以及M252Y、S254T以及T256E(YTE)取代。在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽和/或Fc多肽包含在位置234、235、252、254、256以及366的人IgG1野生型残基。
在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽包含如关于SEQ ID NO:105-108、162-167、174-179、186-191、198-203、210-215以及222-227中的任一者所指定的臼、LALA以及YTE突变，并且与相应序列具有至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性；或包含SEQID NO:105-108、162-167、174-179、186-191、198-203、210-215以及222-227中的任一者的序列。在一些实施方案中，Fc多肽包含如关于SEQ ID NO:109-112中的任一者所指定的杵、LALA以及YTE突变并且与相应序列具有至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性；或包含SEQ ID NO:109-112中的任一者的序列。在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽包含SEQ ID NO:105-108、162-167、174-179、186-191、198-203、210-215以及222-227中的任一者，并且Fc多肽包含SEQ ID NO:109-112中的任一者。在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽和/或Fc多肽的N端包括IgG1铰链区的一部分(例如DKTHTCPPCP；SEQ ID NO:113)。
在一些实施方案中，存在于本文所描述的融合蛋白中的ERT酶(例如IDS、SGSH、ASM或GBA)键联至多肽链，所述多肽链包含与SEQ ID NO:101-104中的任一者具有至少85％、至少90％或至少95％同一性的Fc多肽，或包含SEQ ID NO:101-104中的任一者的序列(例如呈融合多肽的形式)。在一些实施方案中，ERT酶(例如IDS、SGSH、ASM或GBA)通过诸如柔性接头的接头键联至Fc多肽和/或铰链区或其部分(例如DKTHTCPPCP；SEQ ID NO:113)。在一些实施方案中，ERT酶包含与SEQ ID NO:114、230以及234中的任一者具有至少85％、至少90％或至少95％同一性的IDS序列，或包含SEQ ID NO:114、230以及234中的任一者的序列。在一些实施方案中，键联至Fc多肽的IDS序列与SEQ ID NO:115、117、231、232、235以及236中的任一者具有至少85％、至少90％或至少95％同一性，或包含SEQ ID NO:115、117、231、232、235以及236中的任一者的序列。在一些实施方案中，ERT酶包含与SEQ ID NO:120具有至少85％、至少90％或至少95％同一性的SGSH序列，或包含SEQ ID NO:120的序列。在一些实施方案中，键联至Fc多肽的SGSH序列与SEQ ID NO:149和150中的任一者具有至少85％、至少90％或至少95％同一性，或包含SEQ ID NO:149和150中的任一者的序列。在一些实施方案中，融合蛋白包含与SEQ ID NO:97-100、151、156-161、168-173、180-185、192-197、204-209以及216-221中的任一者具有至少85％、至少90％或至少95％同一性的被修饰的Fc多肽，或包含SEQ ID NO:97-100、151、156-161、168-173、180-185、192-197、204-209以及216-221中的任一者的序列。在一些实施方案中，Fc多肽和/或被修饰的Fc多肽的N端包括IgG1铰链区的一部分(例如DKTHTCPPCP；SEQ ID NO:113)。在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽与SEQID NO:116、228以及229中的任一者具有至少85％、至少90％或至少95％同一性，或包含SEQID NO:116、228以及229中的任一者的序列。
在一些实施方案中，融合蛋白包含IDS-Fc融合多肽，所述IDS-Fc融合多肽包含SEQID NO:115的序列；以及被修饰的Fc多肽，所述被修饰的Fc多肽包含SEQ ID NO:205和228中的任一者的序列。在其他实施方案中，融合蛋白包含IDS-Fc融合多肽，所述IDS-Fc融合多肽包含SEQ ID NO:115的序列；以及被修饰的Fc多肽，所述被修饰的Fc多肽包含SEQ ID NO:169和229中的任一者的序列。
在一些实施方案中，融合蛋白包含IDS-Fc融合多肽，所述IDS-Fc融合多肽包含SEQID NO:231的序列；以及被修饰的Fc多肽，所述被修饰的Fc多肽包含SEQ ID NO:205和228中的任一者的序列。在其他实施方案中，融合蛋白包含IDS-Fc融合多肽，所述IDS-Fc融合多肽包含SEQ ID NO:231的序列；以及被修饰的Fc多肽，所述被修饰的Fc多肽包含SEQ ID NO:169和229中的任一者的序列。
在一些实施方案中，融合蛋白包含IDS-Fc融合多肽，所述IDS-Fc融合多肽包含SEQID NO:235的序列；以及被修饰的Fc多肽，所述被修饰的Fc多肽包含SEQ ID NO:205和228中的任一者的序列。在其他实施方案中，融合蛋白包含IDS-Fc融合多肽，所述IDS-Fc融合多肽包含SEQ ID NO:235的序列；以及被修饰的Fc多肽，所述被修饰的Fc多肽包含SEQ ID NO:169和229中的任一者的序列。
在一些实施方案中，存在于本文所描述的融合蛋白中的ERT酶(例如IDS、SGSH、ASM或GBA)键联至多肽链，所述多肽链包含与SEQ ID NO:109-112中的任一者具有至少85％、至少90％或至少95％同一性的Fc多肽，或包含SEQ ID NO:109-112中的任一者的序列(例如呈融合多肽的形式)。在一些实施方案中，ERT酶(例如IDS、SGSH、ASM或GBA)通过诸如柔性接头的接头键联至Fc多肽，和/或铰链区或其部分(例如DKTHTCPPCP；SEQ ID NO:113)。在一些实施方案中，ERT酶包含与SEQ ID NO:114、230以及234中的任一者具有至少85％、至少90％或至少95％同一性的IDS序列，或包含SEQ ID NO:114、230以及234中的任一者的序列。在一些实施方案中，键联至Fc多肽的IDS序列与SEQ ID NO:118、233以及237中的任一者具有至少85％、至少90％或至少95％同一性，或包含SEQ ID NO:118、233以及237中的任一者的序列。在一些实施方案中，ERT酶包含与SEQ ID NO:120具有至少85％、至少90％或至少95％同一性的SGSH序列，或包含SEQ ID NO:120的序列。在一些实施方案中，键联至Fc多肽的SGSH序列与SEQ ID NO:152和153中的任一者具有至少85％、至少90％或至少95％同一性，或包含SEQ ID NO:152和153中的任一者的序列。在一些实施方案中，融合蛋白包含与SEQ ID NO:105-108、162-167、174-179、186-191、198-203、210-215以及222-227中的任一者具有至少85％、至少90％或至少95％同一性的被修饰的Fc多肽，或包含SEQ ID NO:105-108、162-167、174-179、186-191、198-203、210-215以及222-227中的任一者的序列。在一些实施方案中，Fc多肽和/或被修饰的Fc多肽的N端包括IgG1铰链区的一部分(例如DKTHTCPPCP；SEQ IDNO:113)。
在一些实施方案中，存在于本文所描述的融合蛋白中的ERT酶(例如IDS、SGSH、ASM或GBA)键联至多肽链，所述多肽链包含与SEQ ID NO:97-100、151、156-161、168-173、180-185、192-197、204-209以及216-221中的任一者具有至少85％、至少90％或至少95％同一性的被修饰的Fc多肽，或包含SEQ ID NO:97-100、151、156-161、168-173、180-185、192-197、204-209以及216-221中的任一者的序列(例如呈融合多肽的形式)。在一些实施方案中，ERT酶(例如IDS、SGSH、ASM或GBA)通过诸如柔性接头的接头键联至被修饰的Fc多肽，和/或铰链区或其部分(例如DKTHTCPPCP；SEQ ID NO:113)。在一些实施方案中，ERT酶包含与SEQ IDNO:114、230以及234中的任一者具有至少85％、至少90％或至少95％同一性的IDS序列，或包含SEQ ID NO:114、230以及234中的任一者的序列。在一些实施方案中，ERT酶包含与SEQID NO:120具有至少85％、至少90％或至少95％同一性的SGSH序列，或包含SEQ ID NO:120的序列。在一些实施方案中，键联至被修饰的Fc多肽的SGSH序列与SEQ ID NO:154和155中的任一者具有至少85％、至少90％或至少95％同一性，或包含SEQ ID NO:154和155中的任一者的序列。在一些实施方案中，融合蛋白包含与SEQ ID NO:101-104、149以及150中的任一者具有至少85％、至少90％或至少95％同一性的Fc多肽，或包含SEQ ID NO:101-104、149以及150中的任一者的序列。在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽和/或Fc多肽的N端包括IgG1铰链区的一部分(例如DKTHTCPPCP；SEQ ID NO:113)。
在一些实施方案中，存在于本文所描述的融合蛋白中的ERT酶(例如IDS、SGSH、ASM或GBA)键联至多肽链，所述多肽链包含与SEQ ID NO:105-108、162-167、174-179、186-191、198-203、210-215以及222-227中的任一者具有至少85％、至少90％或至少95％同一性的被修饰的Fc多肽，或包含SEQ ID NO:105-108、162-167、174-179、186-191、198-203、210-215以及222-227中的任一者的序列(例如呈融合多肽的形式)。在一些实施方案中，ERT酶(例如IDS、SGSH、ASM或GBA)通过诸如柔性接头的接头键联至被修饰的Fc多肽，和/或铰链区或其部分(例如DKTHTCPPCP；SEQ ID NO:113)。在一些实施方案中，ERT酶包含与SEQ ID NO:114、230以及234中的任一者具有至少85％、至少90％或至少95％同一性的IDS序列，或包含SEQID NO:114、230以及234中的任一者的序列。在一些实施方案中，ERT酶包含与SEQ ID NO:120具有至少85％、至少90％或至少95％同一性的SGSH序列，或包含SEQ ID NO:120的序列。在一些实施方案中，融合蛋白包含与SEQ ID NO:109-112中的任一者具有至少85％、至少90％或至少95％同一性的Fc多肽，或包含SEQ ID NO:109-112中的任一者的序列。在一些实施方案中，融合蛋白包含键联至Fc多肽的SGSH序列，所述SGSH序列与SEQ ID NO:152和153中的任一者具有至少85％、至少90％或至少95％同一性，或包含SEQ ID NO:152和153中的任一者的序列。在一些实施方案中，被修饰的Fc多肽和/或Fc多肽的N端包括IgG1铰链区的一部分(例如DKTHTCPPCP；SEQ ID NO:113)。
VIII.测量结合动力学、亲和力、脑浓度以及脑暴露
本文所描述的融合蛋白和其他组合物可具有广泛范围的结合亲和力。举例来说，在一些实施方案中，蛋白质对血脑屏障(BBB)受体(例如转铁蛋白受体(TfR))具有介于1pM至10μM的范围内的亲和力。在一些实施方案中，对TfR的亲和力介于1nM至5μM或10nM至1μM范围内。在一些实施方案中，对TfR的亲和力介于约50nM至约250nM范围内。
在一些实施方案中，可以单价形式对TfR结合性多肽的亲和力进行测量。在其他实施方案中，可以二价形式加对亲和力进行测量，例如作为包含多肽-Fab融合蛋白的二聚体。
用于分析结合亲和力、结合动力学以及交叉反应性以分析与BBB受体(例如TfR)的结合的方法为本领域中已知的。这些方法包括但不限于固相结合分析(例如ELISA分析)、免疫沉淀、表面等离子体共振(例如BiacoreTM(GE Healthcare,Piscataway,NJ))、动力学排除分析(例如
Figure BDA0002461603810000721
)、流式细胞术、荧光激活细胞分选(FACS)、BioLayer干涉术(例如
Figure BDA0002461603810000722
(FortéBio,Inc.,Menlo Park,CA))以及西方墨点分析。在一些实施方案中，使用ELISA来测定结合亲和力和/或交叉反应性。进行ELISA分析的方法为本领域中已知的并且还描述于以下实施例部分中。在一些实施方案中，使用表面等离子体共振(SPR)来测定结合亲和力、结合动力学和/或交叉反应性。在一些实施方案中，使用动力学排除分析来测定结合亲和力、结合动力学和/或交叉反应性。在一些实施方案中，使用BioLayer干涉术分析来测定结合亲和力、结合动力学和/或交叉反应性。
以下实施例13中描述了测定结合亲和力(例如对TfR)的方法的非限制性实例，其中使用BiacoreTM仪器通过表面等离子体共振(SPR)来测定亲和力。在此方法中，将所关注的工程化TfR结合性多肽、TfR结合性肽或TfR结合性抗体捕获于传感器芯片上并且在指定流速(例如30μL/min)和温度(例如室温)下将TfR的连续稀释液注射至传感器芯片上。使用指定缔合和解离时间(例如分别45和180秒)分析样品，随后进行传感器芯片再生。通过将测量到的反应从对照(例如使用类似密度的不相关IgG)中扣除来校正结合反应，然后可通过使用软件拟合针对浓度的平衡反应来确定稳态亲和力。
可例如使用人转铁蛋白受体(hTfR)敲入小鼠模型来测量脑和/或血浆中的工程化的TfR结合性多肽、TfR结合性肽、TfR结合性抗体或剂(例如键联至工程化的TfR结合性多肽、TfR结合性肽或TfR结合性抗体)的浓度。可使用此类模型来例如测量和/或比较最大脑浓度(C最大)和/或脑暴露，例如以确定C最大是否增加和/或脑暴露是否延长。下文在实施例12中描述了人顶端TfR(TfRms/hu)小鼠敲入模型的创建。为创建适合的模型，可使用CRISPR/Cas9系统来产生表达鼠Tfrc基因内的人Tfrc顶端结构域的小鼠(例如其中体内表达受内源性启动子控制)。特别地，可将Cas9、单一导向RNA以及供体DNA(例如已关于在小鼠中的表达密码子优化的人顶端结构域编码序列)引入小鼠胚胎中(例如通过原核注射)。然后可将胚胎转移至假妊娠雌性。可使来自接受胚胎的雌性的子代的首建雄性(founder male)与野生型雌性繁殖以产生F1杂合子小鼠。然后可随后由培育F1代杂合子小鼠产生纯合子小鼠。
对于工程化的TfR结合性多肽、TfR结合性肽、TfR结合性抗体或剂(例如键联至工程化的TfR结合性多肽、TfR结合性肽或TfR结合性抗体)的脑和/或血浆浓度或暴露的评估，可向小鼠模型(例如TfRms/hu)施用工程化的TfR结合性多肽、TfR结合性肽、TfR结合性抗体(例如键联至所述剂)。可在适合的时间段之后从小鼠获得血浆样品，随后用适合的溶液灌注血管系统。在灌注之后，可提取脑部(或其部分)并且均质化和溶解。然后可使用一般本领域技术人员将已知的标准方法测定血浆和/或脑溶解产物中所述剂的浓度。作为非限制性实例，可使用基于ELISA的分析，诸如以下实施例3中所描述的基于ELISA的分析来测量浓度。简单来说，可使用夹心ELISA来定量剂、工程化的TfR结合性多肽、TfR结合性肽或TfR结合性抗体(例如在血浆或溶解产物中)的浓度。可以所需浓度(例如约3μg/mL)将捕获抗体(例如抗Fc捕获抗体)包被至板(例如384孔MaxiSorpTM板)上。将板封闭(例如用5％BSA)，然后与已稀释(例如1:1,000或1:10,000)的血浆一起孵育。接着，以所需浓度(例如约0.5μg/mL)添加检测抗体，随后添加第二抗体，诸如抗山羊-HRP抗体。然后使板显色(例如使用TMB底物)、停止反应(例如用硫酸)并且在读板仪(例如BioTek读板仪)上测量在适当波长(例如450nm)下的吸光度。可使用适当的(例如4倍)稀释系列产生标准曲线并且使用诸如四参数罗吉斯回归(four-parameter logistic regression)的算法进行拟合。
通过向敲入小鼠模型施用一系列剂量，可产生标准曲线。通过向敲入小鼠模型施用键联至不同的工程化的TfR结合性多肽、TfR结合性肽或TfR结合性抗体(例如具有不同TfR亲和力)的剂或键联至参考多肽或蛋白质(例如与所关注的多肽或蛋白质相比对TfR具有较弱的亲和力)的剂，可关于工程化的TfR结合性多肽、TfR结合性肽或TfR结合性抗体对脑暴露于所述剂和/或所述剂在脑中的C最大值的影响进行比较。
IX.键联至Fc多肽的ERT酶
在一些实施方案中，本文所描述的融合蛋白包含如本文所描述的两个Fc多肽并且Fc多肽中的一者或两者可还包含部分或全部铰链区。铰链区可来自任何免疫球蛋白亚类或同型。说明性免疫球蛋白铰链为IgG铰链区，诸如IgG1铰链区，例如人IgG1铰链氨基酸序列EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO:95)或其一部分(例如DKTHTCPP CP；SEQ ID NO:113)。在一些实施方案中，铰链区位于Fc多肽的N端区域。
在一些实施方案中，Fc多肽通过接头(例如肽接头)连接至ERT酶。在一些实施方案中，Fc多肽通过肽键或通过肽接头连接至ERT酶，例如为融合多肽。肽接头可被配置成使得它允许ERT酶相对于与它所连接的Fc多肽发生转动；和/或对由蛋白酶消化具抗性。肽接头可含有天然氨基酸、非天然氨基酸或它们的组合。在一些实施方案中，肽接头可为柔性接头，例如含有诸如以下的氨基酸：Gly、Asn、Ser、Thr、Ala等。此类接头使用已知参数进行设计并且可具有任何长度并且含有任何数目的任何长度的重复单元(例如Gly和Ser残基的重复单元)。举例来说，接头可具有重复，诸如两个、三个、四个、五个或更多个Gly4-Ser(SEQID NO:239)重复或单个Gly4-Ser(SEQ ID NO:239)。在一些实施方案中，肽接头可包括蛋白酶裂解位点，例如它可由存在于中枢神经系统中的酶裂解。
在一些实施方案中，ERT酶例如通过Gly4-Ser接头(SEQ ID NO:239)或(Gly4-Ser)2接头(SEQ ID NO:240)连接至Fc多肽的N端。在一些实施方案中，Fc多肽可包含在N端的铰链序列或部分铰链序列，所述N端连接至接头或直接连接至ERT酶。
在一些实施方案中，ERT酶例如通过Gly4-Ser接头(SEQ ID NO:239)或(Gly4-Ser)2接头(SEQ ID NO:240)连接至Fc多肽的C端。在一些实施方案中，Fc多肽的C端直接连接至ERT酶。
在一些实施方案中，ERT酶通过化学交联剂连接至Fc多肽。可使用熟知化学交联试剂和方案来产生此类缀合物。举例来说，存在大量本领域技术人员已知并且可用于交联多肽与所关注的剂的化学交联剂。举例来说，交联剂为异双功能交联剂，所述异双功能交联剂可用于逐步键联分子。异双功能交联剂提供设计用于缀合蛋白质的更具特异性的偶联方法的能力，由此减少不想要的副反应(诸如同源蛋白质聚合物)的出现。多种异双功能交联剂为本领域中已知的，包括N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)或它的水溶性类似物N-羟基磺基琥珀酰亚胺(磺基-NHS)、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)、间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)；氨基苯甲酸N-琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)酯(SIAB)、4-(对马来酰亚胺基苯基)丁酸琥珀酰亚胺酯(SMPB)、1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二酰亚胺盐酸盐(EDC)；4-琥珀酰亚胺基氧基羰基-a-甲基-a-(2-吡啶基二硫代)-甲苯(SMPT)、3-(2-吡啶基二硫代)丙酸N-琥珀酰亚胺酯(SPDP)以及6-[3-(2-吡啶基二硫代)丙酸]己酸琥珀酰亚胺酯(LC-SPDP)。具有N-羟基琥珀酰亚胺部分的那些交联剂可以N-羟基磺基琥珀酰亚胺类似物的形式获得，N-羟基磺基琥珀酰亚胺类似物通常具有更大的水溶性。此外，那些在连接链内具有二硫键的交联剂可替代地以烷基衍生物的形式合成，以便使体内接头裂解的量减少。除异双功能交联剂之外，还存在许多其他交联剂，包括同双功能和光反应性交联剂。辛二酸二琥珀酰亚胺酯(DSS)、双马来酰亚胺基己烷(BMH)以及庚二酰亚胺酸二甲酯(dimethylpimelimidate)。2HCl(DMP)为可用的同双功能交联剂的实例，并且双-[B-(4-叠氮基水杨基酰氨基)乙基]二硫化物(BASED)以及N-琥珀酰亚胺基-6(4'-叠氮基-2'-硝基苯基氨基)己酸酯(SANPAH)为可用的光反应性交联剂的实例。
X.蛋白质活性的评估
可使用各种分析来评估本文所描述的包含诸如IDS、SGSH、ASM或GBA的ERT酶的融合蛋白的活性，包括使用人工底物测量体外活性的分析，诸如实施例部分中所描述的那些分析。实施例2中提供了用于测量体外IDS活性的说明性方案。实施例5中提供了用于测量体外ASM活性的说明性方案。实施例7和8中提供了用于测量体外SGSH活性的说明性方案。
在一些方面中，通过分析诸如细胞样品、组织样品或流体样品(例如CSF或尿液)的样品中因IDS缺乏而累积的糖胺聚糖(GAG)硫酸乙酰肝素和硫酸皮肤素的量来评估IDS活性。通过用肝素酶和软骨素酶消化存在于样品中的GAG来测定硫酸乙酰肝素和硫酸皮肤素的量。然后可通过质谱法(例如LC-MS/MS)分析所得二糖。含有高水平的硫酸乙酰肝素和硫酸皮肤素累积的样品中硫酸乙酰肝素和硫酸皮肤素衍生的二糖的量将增加。因此，二糖的水平与IDS酶活性成反比。
可对GAG累积的任何样品，包括细胞样品、组织样品以及流体样品进行质谱法(例如LC-MS/MS)分析。可对此类样品进行评估以监测例如在体外向细胞施用或在一些实施方案中在体内向受试者施用的本文所描述的含有IDS的蛋白质的活性。受试者可为动物，诸如啮齿动物，例如小鼠，或非人灵长类动物。在一些实施方案中，受试者为人患者，诸如患有亨特综合征并且正经历用IDS疗法治疗的患者，其中所述分析用于监测患者中的IDS活性。在一些实施方案中，人患者正经历用本文所描述的融合蛋白治疗。
对于细胞样品，诸如细胞或组织样品，所述分析包括将细胞破碎并且使微泡裂开。将细胞破碎或使微泡裂开可通过使用冷冻-解冻和/或超声处理来实现以获得包含GAG的提取物(例如细胞提取物)。然后用肝素酶(例如本文所描述的任何肝素酶)和软骨素酶对GAG进行处理，所述酶分解硫酸乙酰肝素和硫酸皮肤素GAG。在消化之后，获得含有GAG二糖的上清液并且通过质谱法(例如LC-MS/MS)分析二糖产物。实施例2中提供了说明性方案。
在一些实施方案中，将要分析IDS活性的细胞样品洗涤并且冷冻。将细胞球粒在二糖消化缓冲液中超声处理。然后将来自超声处理的样品的所需量的总蛋白添加至包含肝素酶I、肝素酶II、肝素酶III以及软骨素酶B的消化缓冲液中，其中后者对硫酸皮肤素具特异性。在例如在30℃下消化约3小时之后，用EDTA和煮沸将酶去活化。然后例如在16,000x G下将样品离心，并且将上清液转移至离心过滤器中并且在约14,000x G下离心。然后将二糖再悬浮于1:1v/v比率的分析缓冲液:乙腈混合物中并且例如如实施例2中所描述通过与电喷雾质谱法联用的液相色谱进一步分析。可基于与可商购获得的参考标准物相比的滞留时间来鉴定GAG衍生的二糖产物。说明性硫酸乙酰肝素衍生的二糖包括D0S0和D2S0(根据Lawrence等,Nat.Methods,5:291-292(2008)的命名法)。
在其他方面中，通过分析诸如细胞样品或组织样品等样品中因SGSH缺乏而累积的硫酸乙酰肝素糖胺聚糖(GAG)的量来评估SGSH活性。通过用肝素酶(例如本文所描述的任何肝素酶)消化存在于样品中的GAG来测定硫酸乙酰肝素的量。然后可通过质谱法(例如LC-MS/MS)对所得二糖进行分析。含有高水平的硫酸乙酰肝素累积的样品中的硫酸乙酰肝素衍生的二糖的量将增加。因此，二糖的水平与SGSH酶活性成反比。
可对GAG累积的任何样品，包括细胞样品、组织样品以及流体样品进行质谱法(例如LC-MS/MS)分析。可对此类样品进行评估以监测例如在体外向细胞施用或在一些实施方案中在体内向受试者施用的本文所描述的含有SGSH的蛋白质的活性。受试者可为动物，诸如啮齿动物，例如小鼠，或非人灵长类动物。在一些实施方案中，受试者为人患者，诸如患有圣菲利柏综合征A并且正经历用SGSH疗法治疗的患者，其中所述分析用于监测患者中的SGSH活性。在一些实施方案中，人患者正经历用本文所描述的融合蛋白治疗。
对于细胞样品，诸如细胞或组织样品，所述分析包括将细胞破碎和/或使微泡裂开。将细胞破碎或使微泡裂开可通过使用冷冻-解冻和/或超声处理来实现以获得包含GAG的提取物(例如细胞提取物)。然后用肝素酶(例如本文所描述的任何肝素酶)对GAG进行处理，肝素酶分解硫酸乙酰肝素GAG。在消化之后，获得含有GAG二糖的上清液并且通过质谱法(例如LC-MS/MS)对二糖产物进行分析。实施例7中提供了说明性方案。
在一些实施方案中，将要分析SGSH活性的细胞样品洗涤并且冷冻。将细胞球粒在二糖消化缓冲液中超声处理。然后将来自超声处理的样品的所需量的总蛋白添加至包含肝素酶I、肝素酶II和/或肝素酶III的消化缓冲液中。在例如在30℃下消化约3小时之后，用EDTA和煮沸将酶去活化。然后例如在16,000x G下将样品离心，并且将上清液转移至离心过滤器中并且在约14,000x G下离心。然后将二糖再悬浮于1:1v/v比率的分析缓冲液:乙腈混合物中并且例如如实施例7中所描述通过与电喷雾质谱法联用的液相色谱进一步分析。可基于与可商购获得的参考标准物相比的滞留时间来鉴定GAG衍生的二糖产物。说明性硫酸乙酰肝素衍生的二糖包括D0S0和D2S0(根据Lawrence等,Nat.Methods,5:291-292(2008)的命名法)。
在一些实施方案中，对组织样品进行评估。可使用如上文所描述的分析对组织样品进行分析，除了典型地在超声处理步骤之前包括多个冷冻-解冻周期(例如2、3、4、5或更多个)以确保微泡裂开。
可通过本文所描述的对所评估的样品，包括脑、肝脏、肾脏、肺脏、脾脏、血浆、血清、脑脊髓液(CSF)以及尿液进行分析。在一些实施方案中，可对来自接受本文所描述的酶-Fc融合蛋白(例如IDS-Fc或SGSH-Fc融合蛋白)的患者的CSF样品进行评估。
XI.核酸、载体以及宿主细胞
典型地使用重组方法制备如本文所描述的融合蛋白中所含的多肽链。因此，在一些方面中，本公开提供了分离的核酸，所述分离的核酸所包含的核酸序列编码包含如本文所描述的Fc多肽的多肽链中的任一者；以及引入了所述核酸的宿主细胞，所述宿主细胞用于复制编码多肽的核酸和/或表达多肽。在一些实施方案中，宿主细胞为真核细胞，例如人细胞。
在另一方面中，提供了包含编码本文所描述的多肽链的核苷酸序列的多核苷酸。多核苷酸可为单链或双链的。在一些实施方案中，多核苷酸为DNA。在特定实施方案中，多核苷酸为cDNA。在一些实施方案中，多核苷酸为RNA。
在一些实施方案中，多核苷酸包括于核酸构建体内。在一些实施方案中，构建体为可复制载体。在一些实施方案中，载体选自质粒、病毒载体、噬菌粒、酵母染色体载体以及非附加型哺乳动物载体。
在一些实施方案中，多核苷酸可操作地连接至表达构建体中的一个或多个调控核苷酸序列。在一系列实施方案中，核酸表达构建体适合于用作表面表达文库。在一些实施方案中，所述文库适合于在酵母中的表面表达。在一些实施方案中，所述文库适合于在噬菌体中的表面表达。在另一系列实施方案中，核酸表达构建体适合于使多肽在容许以毫克或克量分离多肽的系统中表达。在一些实施方案中，系统为哺乳动物细胞表达系统。在一些实施方案中，系统为酵母细胞表达系统。
用于制备重组多肽的表达媒介物包括质粒和其他载体。举例来说，适合的载体包括以下类型的质粒：pBR322衍生的质粒、pEMBL衍生的质粒、pEX衍生的质粒、pBTac衍生的质粒以及pUC衍生的质粒(用于在诸如大肠杆菌(E.coli)的原核细胞中表达)。pcDNAI/amp、pcDNAI/neo、pRc/CMV、pSV2gpt、pSV2neo、pSV2-dhfr、pTk2、pRSVneo、pMSG、pSVT7、pko-neo以及pHyg衍生的载体为适合于转染真核细胞的哺乳动物表达载体的实例。或者，可将诸如牛乳头瘤病毒(BPV-1)或爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr virus)(pHEBo、pREP衍生型以及p205)等病毒衍生物用于多肽在真核细胞中的瞬时表达。在一些实施方案中，可能需要通过使用杆状病毒表达系统来表达重组多肽。此类杆状病毒表达系统的实例包括pVL衍生的载体(诸如pVL1392、pVL1393以及pVL941)、pAcUW衍生的载体(诸如pAcUW1)以及pBlueBac衍生的载体。额外的表达系统包括腺病毒、腺相关病毒以及其他病毒表达系统。
可将载体转化至任何适合的宿主细胞中。在一些实施方案中，宿主细胞(例如细菌或酵母细胞)可适合于用作表面表达文库。在一些细胞中，使载体在宿主细胞中表达以表达相对大量的多肽。此类宿主细胞包括哺乳动物细胞、酵母细胞、昆虫细胞以及原核细胞。在一些实施方案中，细胞为哺乳动物细胞，诸如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、幼仓鼠肾脏(BHK)细胞、NS0细胞、Y0细胞、HEK293细胞、COS细胞、Vero细胞或HeLa细胞。
可将用编码如本文所描述的一个或多个Fc多肽链的表达载体转染的宿主细胞在适当条件下培养以允许发生一种或多种多肽的表达。多肽可为分泌的以及从细胞混合物和含有多肽的培养基分离的。或者，多肽可保留在细胞质中或膜级分中并且收获细胞，溶解，并且使用所需方法分离多肽。
XII.治疗方法
可将本文所描述的键联至工程化的TfR结合性多肽、TfR结合性肽或TfR结合性抗体的融合蛋白或剂(例如治疗剂)治疗性地用于治疗LSD。在一些实施方案中，使用包含IDS的键联至工程化的TfR结合性多肽、TfR结合性肽或TfR结合性抗体的融合蛋白或剂来治疗患有亨特综合征的患者。在一些实施方案中，使用包含SGSH的键联至工程化的TfR结合性多肽、TfR结合性肽或TfR结合性抗体的融合蛋白或剂来治疗患有圣菲利柏综合征A的患者。在一些实施方案中，使用包含ASM的键联至工程化的TfR结合性多肽、TfR结合性肽或TfR结合性抗体的融合蛋白或剂来治疗患有尼曼-皮克病的患者。在一些实施方案中，使用包含GBA的键联至工程化的TfR结合性多肽、TfR结合性肽或TfR结合性抗体的融合蛋白或剂来治疗患有高歇氏疾病或帕金森氏病的患者。
以治疗有效量或剂量向受试者施用本文所描述的包含ERT酶(例如IDS、SGSH、ASM或GBA)的融合蛋白。说明性剂量包括约0.01mg/kg至约500mg/kg或约0.1mg/kg至约200mg/kg或约1mg/kg至约100mg/kg的日剂量范围，或可使用约10mg/kg至约50mg/kg。在一些实施方案中，蛋白质的酶活性为至少约500单位(U)/mg，约1,000U/mg，或至少约1,500、2,000、2,500、3,000、3,500、4,000、4,500、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000或10,000U/mg。在一些实施方案中，酶活性为至少约11,000U/mg，或至少约12,000、13,000、14,000、15,000、16,000、17,000、18,000、19,000、20,000、25,000、30,000、35,000、40,000、45000或50,000U/mg；或约500U/mg至约50,000U/mg范围内任何值。然而，可根据若干因素改变剂量，所述若干因素包括所选施用途径、组合物的配制、患者反应、病状的严重程度、受试者的重量以及处方医师的判断。可根据个别患者的需要随时间推移增加或减小剂量。在一些实施方案中，最初给予患者低剂量，然后使剂量增加至患者可忍受的有效剂量。有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内。
在各个实施方案中，肠胃外施用本文所描述的融合蛋白。在一些实施方案中，静脉内施用所述蛋白质。可通过输注例如历经约10至约30分钟的时间或历经至少1小时、2小时或3小时的时间进行静脉内施用。在一些实施方案中，以静脉内速注的形式施用所述蛋白质。还可使用输注与速注施用的组合。
在一些肠胃外实施方案中，腹膜内、皮下、皮内或肌肉内施用键联至工程化的TfR结合性多肽、TfR结合性肽或TfR结合性抗体的融合蛋白或剂(例如治疗剂)。在一些实施方案中，皮内或肌肉内施用键联至工程化的TfR结合性多肽、TfR结合性肽或TfR结合性抗体的蛋白质或剂。在一些实施方案中，鞘内施用，诸如通过硬膜外施用或脑室内施用键联至工程化的TfR结合性多肽、TfR结合性肽或TfR结合性抗体的蛋白质或剂。
在其他实施方案中，可经口、通过经肺施用、鼻内施用、眼内施用或通过表面施用来施用键联至工程化的TfR结合性多肽、TfR结合性肽或TfR结合性抗体的融合蛋白或剂(例如治疗剂)。还可采用经肺施用，例如通过使用吸入器或喷雾器以及与粉雾剂一起配制。
XIII.蛋白质替代的方法
在其他方面中，本文提供了一种将剂(例如可用于治疗溶酶体贮积症(LSD)的剂)运送穿过哺乳动物的血脑屏障(BBB)的方法。在一些实施方案中，所述方法包括使BBB暴露于以约50nM至约250nM的亲和力结合(例如特异性结合)于转铁蛋白受体(TfR)的多肽或蛋白质。在一些实施方案中，多肽或蛋白质键联至所述剂并且将键联的剂运送穿过BBB。在一些实施方案中，所述剂在哺乳动物脑中的最大浓度(C最大)有所提高(例如增加)。
在其他方面中，本文提供了一种治疗LSD的方法。在一些实施方案中，所述方法包括向哺乳动物施用以约50nM至约250nM的亲和力结合(例如特异性结合)于TfR的多肽或蛋白质。在一些实施方案中，多肽或蛋白质键联至用于治疗LSD的剂，由此使哺乳动物的脑部暴露于所述剂。
在一些实施方案中，多肽或蛋白质以约50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240或250nM的亲和力结合(例如特异性结合)于TfR。在一些实施方案中，多肽或蛋白质以约100nM至约200nM或约110nM至约150nM的亲和力结合于TfR。
在一些实施方案中，多肽或蛋白质(例如键联至所述剂)与键联至以较弱的亲和力结合(例如特异性结合)于TfR的参考多肽或蛋白质的剂相比使所述剂在脑中的C最大提高(例如增加)。
在一些实施方案中，所述剂在脑中的C最大与键联至参考多肽或蛋白质(例如其以较弱亲和力结合于TfR)的剂相比提高(例如增加)了至少约1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、2.2倍、2.4倍、2.6倍、2.8倍、3倍、4倍、5倍或更多倍。
在一些实施方案中，哺乳动物的脑部暴露于治疗有效浓度(例如足以治疗LSD的一种或多种迹象或症状的浓度)的剂持续与键联至参考多肽或蛋白质的剂相比较短的持续时间。在一些实施方案中，脑暴露持续时间缩短了至少约5％、10％、25％、40％、50％、60％、75％、85％、90％、95％或98％。
在一些实施方案中，通过绘制脑暴露(例如脑中的剂的浓度)随时间变化的曲线并且计算曲线下面积(AUC)来定量脑暴露。AUC降低可表示脑暴露减少或缩短。在一些实施方案中，脑暴露于剂(例如在治疗有效浓度下)的持续时间缩短。
在一些实施方案中，参考多肽或蛋白质以等于或弱于约250nM、300nM、350nM、400nM、450nM、500nM、550nM或600nM的亲和力结合(例如特异性结合)于TfR。在一些实施方案中，参考多肽或蛋白质以等于或弱于约600nM的亲和力结合于TfR。
在一些实施方案中，哺乳动物为灵长类动物(例如人)。在一些实施方案中，人为需要治疗LSD的患者。在一些实施方案中，患者具有LSD的一种或多种迹象或症状。
在一些实施方案中，多肽或蛋白质结合(例如特异性结合)于灵长类动物TfR。在一些实施方案中，灵长类动物TfR为人TfR。在一些实施方案中，多肽或蛋白质结合于TfR顶端结构域。
在一些实施方案中，所述剂(例如治疗剂)键联至工程化的TfR结合性多肽。在一些实施方案中，工程化的TfR结合性多肽包含CH3或CH2结构域，所述CH3或CH2结构域具有允许多肽特异性结合于TfR的修饰。本文中描述了适合的工程化的TfR结合性多肽的非限制性实例。在一些实施方案中，所述剂键联至表4或表5中所描述的工程化的TfR结合性多肽。在一些实施方案中，所述剂键联至选自由以下组成的组的工程化的TfR结合性多肽：CH3C.35.20.2、CH3C.35.23.2、CH3C.35.23.5、CH3C.35.21.17以及CH3C.35.21.17.2。
在一些实施方案中，所述剂(例如治疗剂)键联至TfR结合性肽。在一些实施方案中，TfR结合性肽为短肽，长度为约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。产生、筛选以及鉴定适合的肽(即，以在所需范围内的亲和力结合于TfR的肽)的方法为本领域中已知的。举例来说，可使用交替使用多轮负选择和正选择的噬菌体展示策略来鉴定适合的肽。例如Lee等,Eur.J.Biochem.,268:2004-2012(2001)中描述了此策略，所述文献出于所有目的全文并入本文中。
在一些实施方案中，所述剂(例如治疗剂)键联至TfR结合性抗体。适合的TfR结合性抗体的非限制性实例包括Thom等,Mol.Pharm.,15(4):1420-1431(2018)中所公开的OX26抗TfR抗体(即，具有约76nM、108nM以及174nM的亲和力)。在一些实施方案中，所述剂键联至包含特异性结合于TfR的抗体可变区的蛋白质。在一些情况下，蛋白质包含Fab或scFv。
在一些实施方案中，所述剂(例如治疗剂)为蛋白质(例如酶)。在一些实施方案中，所述剂为蛋白质替代治疗剂。在一些实施方案中，所述剂为在哺乳动物中的细胞或组织(例如神经细胞或组织)中缺乏(例如低表达或不存在)的蛋白质或酶。在一些实施方案中，所述剂为对哺乳动物中的正常健康细胞或组织(例如神经细胞或组织)来说为内源性的或在其中表达，但在针对LSD进行治疗的哺乳动物中缺乏(例如在对应细胞或组织中)的蛋白质或酶。
在一些实施方案中，蛋白质替代治疗剂为酶。可使任何数目的剂(例如蛋白质替代治疗剂，诸如酶)键联至多肽或蛋白质(例如结合于TfR的多肽或蛋白质)以治疗各种LSD。在一些实施方案中，所述剂为酶，所述酶在键联至所述多肽或蛋白质时与所述酶键联至参考多肽或蛋白质时相比在更大程度上减少毒性代谢产物在患有LSD的哺乳动物脑中的累积。在一些实施方案中，酶为艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶(IDS)并且LSD为亨特综合征。在一些情况下，毒性代谢产物包含硫酸肝素衍生的二糖和/或硫酸皮肤素衍生的二糖。在一些实施方案中，酶为N-磺基葡糖胺磺基水解酶(SGSH)并且LSD为圣菲利柏综合征。在一些实施方案中，酶为酸性神经鞘磷脂酶(ASM)并且LSD为尼曼-皮克病。在一些实施方案中，酶为β-葡糖脑苷脂酶(GBA)并且LSd为高歇氏病。
在一些实施方案中，所述剂(例如治疗剂)包含抗体可变区。在一些实施方案中，所述剂包含抗体片段。在一些实施方案中，所述剂包含Fab或scFv。在一些实施方案中，所述剂不包含抗体可变区。在一些情况下，所述剂不包含抗β分泌酶1(BACE1)Fab。
额外的实施方案和接头
多肽(例如如本文进一步描述的被修饰的CH3或CH2结构域多肽)可连接至Fc区的另一结构域。在一些实施方案中，被修饰的CH3结构域多肽典型地在CH2结构域的C末端连接至CH2结构域，所述CH2结构域可为天然存在的CH2结构域或变体CH2结构域。在一些实施方案中，被修饰的CH2结构域多肽典型地在CH3结构域的N端连接至CH3结构域，所述CH3结构域可为天然存在的CH3结构域或CH3变体结构域。在一些实施方案中，包含连接至CH3结构域的被修饰的CH2结构域的多肽或包含连接至CH2结构域的被修饰的CH3结构域的多肽还包含抗体的部分或全部铰链区，由此产生一种形式，在所述形式中被修饰的CH3结构域多肽或被修饰的CH2结构域多肽为具有部分或全部铰链区的Fc区的一部分。铰链区可来自任何免疫球蛋白亚类或同型。说明性免疫球蛋白铰链为IgG铰链区，诸如IgG1铰链区，例如人IgG1铰链氨基酸序列EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO:95)。
在一些实施方案中，工程化的TfR结合性多肽、TfR结合性肽或TfR结合性抗体融合至可用于蛋白质纯化的肽或蛋白质，例如聚组氨酸、表位标签(例如FLAG、c-Myc、血球凝集素标签等、谷胱甘肽S转移酶(GST)、硫氧还蛋白、蛋白质A、蛋白质G或麦芽糖结合蛋白(MBP)。在一些情况下，与工程化的TfR结合性多肽、TfR结合性肽或TfR结合性抗体融合的肽或蛋白质可包含蛋白酶裂解位点，诸如因子Xa或凝血酶的裂解位点。
在本公开的方法中，剂(例如治疗剂)键联至多肽或蛋白质(例如工程化的TfR结合性多肽、TfR结合性肽或TfR结合性抗体)。接头可为适合于将剂连接至多肽或蛋白质的任何接头。在一些实施方案中，键联为酶可裂解的。在某些实施方案中，键联可由存在于中枢神经系统中的酶裂解。
在一些实施方案中，接头为肽接头。肽接头可被配置成使得它允许所述剂(例如治疗剂)和多肽或蛋白质相对于彼此转动；和/或对由蛋白酶消化具抗性。在一些实施方案中，接头可为柔性接头，所述柔性接头例如含有诸如以下的氨基酸：Gly、Asn、Ser、Thr、Ala等。此类接头使用已知参数进行设计。举例来说，接头可具有重复，诸如Gly-Ser重复。
在各个实施方案中，所述剂(例如治疗剂)键联至多肽或蛋白质(例如工程化的TfR结合性多肽、TfR结合性肽或TfR结合性抗体)可使用熟知化学交联试剂和方案来实现。举例来说，存在大量本领域技术人员已知并且可用于交联多肽或蛋白质与所关注的剂的化学交联剂。举例来说，交联剂为异双功能交联剂，所述异双功能交联剂可用于逐步键联分子。异双功能交联剂提供设计用于缀合蛋白质的更具特异性的偶联方法的能力，由此减少不想要的副反应(诸如同源蛋白质聚合物)的出现。
所述剂(例如治疗剂)可键联至多肽或蛋白质(例如工程化的TfR结合性多肽、TfR结合性肽或TfR结合性抗体)的N端或C端区域，或附接至多肽或蛋白质的任何区域，只要所述剂不妨碍多肽或蛋白质结合于转铁蛋白受体即可。
XIV.药物组合物和药盒
在其他方面中，提供了包含本文所描述的融合蛋白的药物组合物和药盒。
药物组合物
可在本领域技术人员已知的大量药物制备和配制手册中找到关于制备供在本公开中使用的制剂的指导。
在一些实施方案中，药物组合物包含如本文所描述的融合蛋白并且还包含一种或多种药学上可接受的载体和/或赋形剂。药学上可接受的载体包括任何溶剂、分散介质或包衣剂，所述物质为生理学上相容的并且不妨碍或以其他方式抑制活性剂的活性。
在一些实施方案中，载体适合用于静脉内、鞘内、经眼、脑室内、肌肉内、经口、腹膜内、经皮肤、表面或皮下施用。药学上可接受的载体可含有一种或多种生理学上可接受的化合物，所述一种或多种生理学上可接受的化合物起到例如稳定组合物或增加或减少多肽吸收的作用。生理学上可接受的化合物可包括例如碳水化合物，诸如葡萄糖、蔗糖或右旋糖酐；抗氧化剂，诸如抗坏血酸或谷胱甘肽；螯合剂、低分子量蛋白质、减少活性剂的清除或水解的组合物或赋形剂或其他稳定剂和/或缓冲剂。其他药学上可接受的载体和它们的制剂也是本领域中可获得的。
可例如借助于常规混合、溶解、造粒、糖衣丸制备、乳化、封装、包埋或冻干过程来制造本文所描述的药物组合物。以下方法和赋形剂为示例性的。
对于经口施用，可通过将本文所描述的融合蛋白与本领域中熟知的药学上可接受的载体组合来配制如本文所描述的融合蛋白。此类载体使融合蛋白能够配制成片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、乳液、亲脂性和亲水性悬浮液、液体、凝胶、糖浆、浆液、悬浮液等供由所要治疗的患者经口摄取。可如下获得用于经口使用的药物制剂：将融合蛋白与固体赋形剂混合，任选研磨所得混合物，并且在添加适合的助剂(若需要)之后对颗粒混合物进行加工以获得片剂或糖衣丸核心。适合的赋形剂包括例如填料，诸如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇；纤维素制剂，诸如玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基-纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮。如果需要，那么可添加崩解剂，诸如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或海藻酸或它们的盐，诸如海藻酸钠。
如上文所公开，如本文所描述的融合蛋白可被配制成用于通过注射(例如通过快速注射或连续输注)进行肠胃外施用。为进行注射，可如下将融合蛋白配制成制剂，将它们在水性或非水溶剂(诸如植物油或其他类似油、合成脂肪族酸甘油酯、高碳脂肪酸的酯或丙二醇)中溶解、悬浮或乳化；并且如果需要，那么使用常规添加剂，诸如增溶剂、等张剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂以及防腐剂。在一些实施方案中，可将融合蛋白在水溶液中加以配制，所述水溶液为诸如生理学相容缓冲液，所述生理学相容缓冲液的非限制性实例包括汉克斯氏溶液(Hanks's solution)、林格氏溶液(Ringer's solution)以及生理盐水缓冲液。用于注射的制剂可以单位剂型形式与所添加的防腐剂一起存在于例如安瓿或多剂量容器中。组合物可呈诸如于油性或水性媒介物中的悬浮液、溶液或乳液的形式，并且可含有配制剂，诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。
在一些实施方案中，将如本文所描述的融合蛋白例如在含有活性剂的固体疏水性聚合物的半渗透基质中制备成用于以持续释放、控制释放、延长释放、限时释放或延迟释放制剂形式进行递送。各种类型的持续释放材料已被确定并且为本领域技术人员所熟知。延长释放制剂包括薄膜包衣片剂、多颗粒或球粒系统、使用亲水性或亲脂性材料的基质技术以及使用成孔赋形剂的蜡基片剂。通常，持续释放制剂可使用天然存在或合成的聚合物来制备，例如聚合乙烯基吡咯烷酮，诸如聚乙烯吡咯烷酮；羧基乙烯基亲水聚合物；疏水性和/或亲水性水状胶体，诸如甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基纤维素以及羟丙基甲基纤维素；以及羧基聚亚甲基(carboxypolymethylene)。
典型地，用于体内施用的药物组合物为无菌的。可根据本领域中已知的方法来实现灭菌，例如热灭菌、蒸气灭菌、无菌过滤或辐射。
本文所描述的药物组合物的剂量和所需药物浓度可根据所设想的特定用途而变化。以上第XII部分中还描述了适合的剂量。
药盒
在一些实施方案中，提供了一种用于治疗LSD(例如亨特综合征、圣菲利柏综合征A、尼曼-皮克病、高歇氏病或帕金森氏病)的药盒，所述药盒包含如本文所描述的融合蛋白。
在一些实施方案中，药盒还包含一种或多种额外治疗剂。举例来说，在一些实施方案中，药盒包含如本文所描述的融合蛋白并且还包含用于治疗LSD的神经症状的一种或多种额外治疗剂。在一些实施方案中，药盒还包含说明材料，所述说明材料含有关于实践本文所描述的方法的指导(即，方案)(例如关于使用药盒穿过血脑屏障施用包含ERT酶的融合蛋白的说明书)。虽然说明材料典型地包含书面或印刷材料，但它们不限于书面或印刷材料。本公开涵盖能够储存此类说明书并且使它们与最终用户通信的任何介质。此类介质包括但不限于，电子存储介质(例如磁盘、磁带、盒式磁带、芯片)、光学介质(例如CD-ROM)等。此类介质可包括提供此类说明材料的网络站点网址。
XV.实施例
将通过特定实施例更详细地描述本公开。以下实施例仅出于说明目的而提供，并且不旨在以任何方式限制本公开。本领域技术人员将容易识别多个非关键参数，所述多个非关键参数可被改变或修改以得到基本上相同的结果。已努力确保关于所用数字(例如量、温度等)的准确性，但可能存在一些实验误差和偏差。除非另外指出，否则本公开的实践将在本领域的技术范围内采用蛋白质化学、生物化学、重组DNA技术以及药理学的常规方法。文献中充分解释了此类技术。另外，对本领域技术人员来说将显而易见的是，如可用于某些文库的用于工程化的方法也可适用于本文所描述的其他文库。
实施例1.包含艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶(IDS)的融合蛋白的构建.
设计和克隆
将IDS-Fc融合蛋白设计成含有(i)融合多肽，其中成熟人IDS酶融合至包括Fc区的人IgG1片段(“IDS-Fc融合多肽”)，以及(ii)被修饰的人IgG1片段，所述被修饰的人IgG1片段在Fc区中含有赋予转铁蛋白受体(TfR)结合的突变(“被修饰的Fc多肽”)。特别地，形成IDS-Fc融合多肽，其中IDS片段融合至人IgG1Fc区的N端或C端。在一些情况下，将接头放置于IDS与IgG1片段之间以缓解两个片段之间的任何空间位阻。在所有构建体中，将来自κ链V-III的信号肽，氨基酸1-20(UniProtKB ID-P01661)插入融合物的上游以促进分泌，并且将IDS截短至由氨基酸S26-P550(UniProtKB ID-P22304)组成。所用人IgG1Fc区的片段对应于UniProtKB ID P01857中的序列的氨基酸D104-K330(位置221-447，EU编号，其包括铰链的10个氨基酸(位置221-230))。在一些实施方案中，将衍生自人IgG1残基D104-K330但缺乏IDS融合的第二Fc多肽用IDS-Fc融合多肽共转染以产生含有一个IDS酶的异二聚融合蛋白(“单酶”)。在一些构建体中，IgG1片段含有额外的突变以促进两个Fc区的异二聚化。类似地设计和构建缺乏赋予TfR结合的突变的对照IDS-Fc融合蛋白，差异在于这些蛋白质缺乏赋予TfR结合的突变。作为另一对照，我们生成了含有C端六组氨酸标签(SEQ ID NO:241)以促进检测和纯化的IDS(氨基酸S26-P550)。
实施例中所用的TfR结合IDS-Fc融合蛋白为由IDS-Fc融合多肽以及结合于TfR的被修饰的Fc多肽形成的二聚体。对于IDS酶键联至Fc区N端的二聚体，IDS-Fc融合多肽可具有SEQ ID NO:115、231以及235中的任一者的序列。在这些序列中，IDS序列加下划线并且在位置59(加双下划线)所含的半胱氨酸被修饰为甲酰甘氨酸。IDS通过GGGGS接头(SEQ IDNO:239)连接至Fc多肽。在Fc多肽的N端包括IgG1铰链区的一部分(DKTHTCPPCP；SEQ ID NO:113)。CH2结构域序列从SEQ ID NO:115、231以及235的位置541开始。
实施例中所用的IDS-Fc融合蛋白ETV:IDS 35.21为由具有SEQ ID NO:115、231以及235中的任一者的序列的IDS-Fc融合多肽以及结合于TfR并且具有SEQ ID NO:116的序列的被修饰的Fc多肽形成的二聚体。头10个氨基酸为IgG1铰链区的一部分。CH2结构域序列从SEQ ID NO:116的位置11开始。
实施例中所用的IDS-Fc融合蛋白ETV:IDS 35.21.17.2为由具有SEQ ID NO:115、231以及235中的任一者的序列的IDS-Fc融合多肽以及结合于TfR并且具有SEQ ID NO:228的序列的被修饰的Fc多肽形成的二聚体。头10个氨基酸为IgG1铰链区的一部分。CH2结构域序列从SEQ ID NO:228的位置11开始。
实施例中所用的IDS-Fc融合蛋白ETV:IDS 35.23.2为由具有SEQ ID NO:115、231以及235中的任一者的序列的IDS-Fc融合多肽以及结合于TfR并且具有SEQ ID NO:229的序列的被修饰的Fc多肽形成的二聚体。头10个氨基酸为IgG1铰链区的一部分。CH2结构域序列从SEQ ID NO:229的位置11开始。
实施例中所用的IDS-Fc融合蛋白ETV:IDS 35.21.17为由具有SEQ ID NO:115、231以及235中的任一者的序列的IDS-Fc融合多肽以及结合于TfR并且具有SEQ ID NO:151的序列的被修饰的Fc多肽形成的二聚体。被修饰的Fc多肽的N端可包括IgG1铰链区的一部分(例如SEQ ID NO:113)。
重组蛋白表达和纯化
为表达融合至Fc区的重组IDS酶，使用ExpifectamineTMCHO转染药盒根据制造商的说明书(Thermo Fisher Scientific)用相关DNA构建体对ExpiCHO细胞(Thermo FisherScientific)进行转染。使细胞在回转式振荡器(Infors HT Multitron)中在37℃，6％CO2和120rpm下在ExpiCHOTM表达培养基中生长。简单地说，在每毫升6x106个细胞的密度下用每毫升培养体积0.8μg的DNA质粒对对数生长的ExpiCHOTM细胞进行转染。在转染之后，使细胞回到37℃并且在转染后18-22小时时为转染的培养物补充如所指示的馈料。在转染后120小时时通过在3,500rpm下离心20min收获转染的细胞培养物上清液。将澄清上清液过滤(0.22μM膜)并且储存在4℃下。在进行微小修改的情况下如上文所描述进行表位标记的IDS酶(用作对照)的表达。简单地说，使具有C端六组氨酸标签(SEQ ID NO:241)的IDS酶在ExpiCHO细胞中表达。
使用蛋白质A亲和色谱从细胞培养物上清液纯化具有(或不具有)赋予TfR结合的工程化的Fc区的IDS-Fc融合蛋白。将上清液加载至HiTrap MabSelect SuRe蛋白质A亲和柱(GE Healthcare Life Sciences，使用Akta Pure系统)上。然后将所述柱用>20柱体积(CV)的PBS洗涤。使用含有150mM NaCl的100mM柠檬酸盐/NaOH缓冲液pH 3.0将结合的蛋白质洗脱。在洗脱之后，立即使用1M精氨酸-670mM琥珀酸盐缓冲液pH 5.0(1:5稀释)将级分中和。通过还原和非还原性SDS-PAGE对洗脱的级分中IDS-Fc融合蛋白的均质性进行评估。
为纯化六组氨酸标记(SEQ ID NO:241)的IDS酶，将转染的上清液用含有100mMNaCl的15L 20mM HEPES pH 7.4充分渗析过夜。使渗析的上清液结合于HisTrap柱(GEHealthcare Life Sciences，使用Akta Pure系统)。在结合之后，将所述柱用20CV的PBS洗涤。使用含有500mM咪唑的PBS将结合的蛋白质洗脱。通过还原和非还原性SDS-PAGE对洗脱级分中IDS酶的均质性进行评估。将含有IDS酶的汇集级分在50mM Tris pH 7.5中1:10稀释并且使用高性能Q琼脂糖凝胶(GE Healthcare)进一步纯化。在结合之后，将所述柱用10CV的50mM Tris pH 7.5洗涤。使用达到50mM Tris pH 7.5和0.5M NaCl的线性梯度将结合的蛋白质洗脱并且收集于1CV级分中。通过非还原性SDS-PAGE对级分纯度进行评估。如图1中所示，纯化产生均质IDS-Fc融合蛋白和六组氨酸标记(SEQ ID NO:241)的IDS酶。
实施例2.IDS融合蛋白的表征.
具有工程化的TfR结合位点的IDS-Fc融合蛋白结合于人TfR
为确定具有工程化的TfR结合的IDS-Fc融合蛋白是否影响被修饰的Fc结构域与人TfR相互作用的能力，使用BiacoreTM表面等离子体共振分析评估此蛋白质对人TfR的亲和力。将BiacoreTM系列S CM5传感器芯片用抗人Fab(来自GE Healthcare的人Fab捕获试剂盒)固定。将5μg/mL的IDS-Fc融合蛋白捕获于每个液体池(flow cell)上持续1分钟并且以30μL/min的流速注射人顶端结构域TfR的连续3倍稀释液。在3分钟缔合和3分钟解离的情况下对每个样品进行分析。在每次注射之后，使用10mM甘氨酸-HCl(pH 2.1)使芯片再生。通过从在类似密度下捕获不相关IgG的液体池扣除RU来校正结合反应。使用BiacoreTMT200评估软件v3.1通过针对浓度对平衡状态下的反应进行拟合来获得稳态亲和力。如图2中所示，BiacoreTM分析证实具有工程化至Fc区的TfR结合位点的IDS-Fc融合蛋白结合于人TfR。BiacoreTM分析还证实IDS-Fc融合蛋白ETV:IDS 35.21以约200nM的亲和力结合于人TfR。
具有工程化的TfR结合位点的IDS-Fc融合蛋白在体外、细胞中以及体内具活性
对工程化的TfR结合性IDS-Fc融合蛋白的体外和细胞活性进行评估以证实IDS在融合至人IgG片段时维持它的酶活性。使用人工底物使用两步荧光酶分析测量体外活性。具体地说，将20μL的1mM 4-甲基伞形酮基a-L-吡喃艾杜糖醛酸2-硫酸二钠盐底物(Carbosynth Limited，#EM03201)在分析缓冲液(100mM乙酸钠，10mM乙酸铅，0.05％TritonX-100，pH 5.0)中稀释并且与10μL的0.2nM IDS混合。将第一反应物在37℃下孵育4小时并且使用60μL的0.2M磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液，pH 5.0终止反应。然后在存在来自用人α-艾杜糖醛酸酶(IDUA)瞬时转染的HEK 293T细胞的15μg细胞溶解产物的情况下进行第二反应，在37℃下孵育16小时，并且以添加100μL的0.5M碳酸钠缓冲液，pH 10.5来停止反应。然后测量反应溶液的荧光(在365nm下激发并且在450nm下发射)。通过线性回归对4-甲基伞形酮标准曲线进行拟合以计算产物的量并且经验证为不到10％的总底物裂解。通过用产物的量除以反应时间和IDS的摩尔量来计算特定活性(每纳摩尔IDS每分钟的产物纳摩尔数)。
体外酶活性分析证实IDS-Fc融合蛋白为活性的并且表明Fc区融合至IDS不妨碍酶活性(图3)。
使用CRISPR/CAS9产生IDS敲出(KO)细胞以提供用于测试工程化的IDS-Fc融合蛋白的细胞活性的细胞系统。将HEK 293T细胞(ATCC)用含有靶向人IDS中的外显子1的后半部分的向导序列的CRISPR/CAS9pCas-Guide-EF1a-GFP载体(Origene)转染。在根据制造商说明书使用Guide-it突变检测试剂盒(Clontech)之后针对IDS的基因组序列内插入缺失的存在对单个细胞克隆进行分析。为鉴定IDS KO细胞，使用上文所描述的体外IDS酶分析对插入缺失阳性克隆细胞溶解产物进行分析。简单来说，使用12.5、25、50以及100μg细胞溶解产物如先前所描述在乙酸铅分析缓冲液pH 5.0(100mM乙酸钠，10mM乙酸铅，0.02％叠氮化钠)中进行体外活性分析(Vozyni等,J.Inherit.Metab.Dis.,24:675-80(2001))。通过将10μL归一化的细胞溶解产物(于水中)与1mM底物在20μL乙酸铅缓冲液中组合来起始反应。将第一反应物在37℃下孵育4小时并且使用60μL的0.2M磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液，pH 5.0终止反应。然后以添加来自用人α-艾杜糖醛酸酶(IDUA)瞬时转染的HEK 293T细胞的10μg/10μL细胞溶解产物进行第二反应并且使其在37℃下进行24小时，并且以添加100μL的0.5M碳酸钠缓冲液，pH 10.3来停止反应。然后测量反应溶液的荧光(在365nm下激发并且在450nm下发射)。将在HEK 293T CRISPR克隆中的IDS活性与用作分析标准物的重组IDS、HEK野生型(WT)溶解产物以及过表达IDS的HEK细胞溶解产物相比较。在mini-Topo(ThermoFisher)克隆之后对酶活性水平类似于背景信号的克隆进行序列验证并且确认为KO克隆。后续细胞分析使用三个独特的并且经验证的IDS KO克隆以及三个独立批次的WT HEK 293T细胞。
为测试裸IDS酶或IDS-Fc融合蛋白的细胞活性，开展基于LC-MS/MS的糖体学分析，从而允许监测底物累积(硫酸乙酰肝素和硫酸皮肤素)的量作为IDS活性的指示。在将IDS或IDS-Fc融合蛋白添加至细胞培养基之前和之后测量IDS KO细胞中的底物累积。简单来说，将细胞用PBS洗涤三次，使其集结成粒并且冷冻。将细胞球粒在二糖消化缓冲液(111mMNH4OAc，11mM CaOAc，pH 7.0)中超声处理。使用BCA分析(Pierce)测量蛋白质浓度。将总蛋白(100μg)与2mM DTT、1.25mIU肝素酶I(Galen)、1.25mIU肝素酶II(G alen)、1.25mIU肝素酶III(Galen)以及6.25mIU软骨素酶B(Galen)一起添加至100μL消化缓冲液中。在30℃下三小时之后硫酸乙酰肝素和硫酸皮肤素消化完成，此后将20ng的内部标准物(4UA-2S-GlcNCOEt-6S HD009[Galen])添加至每个样品中。通过添加6μL的250mM EDTA将酶去活化并且将样品在95℃下煮沸10分钟。然后将样品在室温下在16,000x G下离心5分钟。将上清液转移至Amicon Ultra 30KD离心过滤器(Millipore)中并且在14,000x G下离心15分钟。将二糖浓缩在流出物(flow through)中并且再悬浮于[1:1，v/v]分析缓冲液:乙腈的混合物中，然后将其转移至质谱分析小瓶用于进一步分析。
通过与电喷雾质谱法(Sciex 6500+QTRAP,Sciex,Framingham,MA,USA)联用的液相色谱(Shimadzu Nexera X2系统，Shimadzu Scientific Instrument,Columbia,MD,USA)对由硫酸乙酰肝素和硫酸皮肤素的酶消化所产生的二糖进行分析。对于每个分析，使用0.4mL/min的流速和50℃的柱温，将10μL的样品注射在ACQUITY UPLC BEH酰胺1.7μm，2.1×150mm柱(Waters Corporation,Milford,Massachusetts,USA)上。流动相A由水加上10mM甲酸铵和0.1％甲酸组成。流动相B由乙腈加上0.1％甲酸组成。如下对梯度进行程序化：0.0-1.0min为85％B，1.0-5.0min从85％B到50％B，5.0-6.0min 50％B至85％B，在85％B下保持6-8.0min。应用以下设定以阴离子模式进行电喷雾电离：气帘气体(curtain gas)，30；碰撞气体设定为中等；离子喷雾电压，-4500；温度，450；离子源气体1，50；离子源气体2，60。使用Analyst 1.6.3(Sciex)以多反应监测模式(MRM)进行数据采集，停留时间为25(毫秒)。碰撞能量，-30；去簇电位，-80；入口电位，-10；碰撞室出口电位，-10。使用以下MRM瞬态(transition)以[M--H]-的形式检测GAG：m/z 378.1的D0A0>87.0；m/z 378.1的D0a0>175.0；m/z 416.1的D0S0>138.0；m/z 458.1的D0a4>300.0；m/z 458.1的D0A6、D2A0、D0a6、D2a0>97.0；m/z 496.0的D0S6、D2S0>416.1；m/z 538.0的D2a4、D2a6、D0a10、D2A6>458.0；m/z 575.95的D0S6>97.0；m/z 472.0(碎片离子)的4UA-2S-GlcNCOEt-6S>97.0用作内部标准物(I.S.)。基于滞留时间以及与可商购获得的参考标准物(Iduron Ltd,Manchester,UK)匹配的MRM瞬态来鉴定GAG。使用MultiQuant 3.0.2(Sciex)通过与I.S.的面积比进行定量。针对总蛋白量对GAG进行归一化。使用BCA分析(Pierce)测量蛋白质浓度。
与对照细胞系相比，在IDS KO细胞中观察到如由在硫酸乙酰肝素和硫酸皮肤素消化之后所观测到的二糖量反映的显著底物累积，此影响可以向细胞中添加重组IDS来挽救(图4)。这证实可使用基于LC-MS/MS的分析来评估IDS和IDS-Fc融合蛋白的细胞活性。
使用此分析，证实了将细胞用包含相同TfR结合性Fc多肽(即，CH3C.35.21.17)的呈N端单酶(即，ETV:IDS 35.21.17)或C端单酶形式的IDS-Fc融合蛋白进行处理使硫酸乙酰肝素和硫酸皮肤素衍生的二糖的水平降回到在野生型细胞中观察到的水平(图5A)。此外，N端单酶的活性类似于IDS(图5B)。总之，这些数据证实IDS-Fc融合蛋白维持酶活性并且可使IDS KO细胞中的底物累积减少。
还如先前所描述使用35S脉冲追踪分析在来自MPS II患者和健康对照的纤维母细胞中检验IDS-Fc融合蛋白的细胞活性，其中35S整合至新合成的GAG中(Lu等,BioconjugateChemistry,21:151-156(2010))。MPS II患者纤维母细胞缺乏可检测的IDS活性，从而产生约10倍的底物累积和2.5倍的35S信号累积(图5C)。类似于IDS KO细胞，诸如ETV:IDS35.23.2的IDS-Fc融合蛋白在MPS II患者衍生的细胞中高度有效，关于减少S35标记的蛋白质的累积展示低皮摩尔细胞EC50(图5C)。此外，证实诸如ETV:IDS 35.23.2的IDS-Fc融合蛋白的细胞活性为M6PR依赖性的，因为过量的M6P抑制所处理的MPS II患者纤维母细胞中35S标记的蛋白质的清除(图5D)。总起来说，这些数据证实在IDS-Fc融合蛋白模式中IDS的M6PR依赖性运输和细胞活性可得以维持。
为测量体内硫酸乙酰肝素和硫酸皮肤素衍生的二糖，将基于LC-MS/MS的糖体学分析加以调适用于组织和流体的分析。简单来说，收集所有组织和流体，然后立即冷冻并且储存在-80℃下。对样品进行5个冷冻-解冻循环并且如上文所描述进行加工用于细胞分析。与雄性野生型同窝对照相比，在所分析的来自雄性IDS KO小鼠的所有组织和流体中观察到硫酸乙酰肝素和硫酸皮肤素衍生的二糖的显著累积(表1)。使用此分析来进行体内融合蛋白的功效研究。IDS KO小鼠获自Jackson Laboratories(JAX品系024744)。
表1.来自IDS KO小鼠的组织和流体的糖体学分析.
Figure BDA0002461603810000981
使用此方法，评估来自给予媒介物的野生型(WT)小鼠和给予IDS或IDS-Fc融合蛋白(即，ETV:IDS 35.21)的IDS KO小鼠的血清中的硫酸乙酰肝素和硫酸皮肤素衍生的二糖的水平。给药之前的基线测量展现与WT小鼠相比在来自IDS KO小鼠的血清中硫酸乙酰肝素和硫酸皮肤素衍生的二糖的显著累积。在给予IDS-Fc融合蛋白之后，在IDS KO血清中硫酸乙酰肝素和硫酸皮肤素衍生的二糖的水平显著降低，显示与在来自给予IDS的IDS KO小鼠的血清中所观察类似的降低(图6)。这些数据证实IDS-Fc融合蛋白在体内为活性的并且可使IDS KO小鼠中的底物累积减少。基于这些数据，在单个剂量的IDS-Fc融合蛋白之后七天时评估在IDS KO小鼠的组织中的分布和药效动力学(PD)反应。为IDS KO小鼠静脉内施用40mg/kg的IDS-Fc融合蛋白或5.3mg/kg的IDS(25％摩尔当量剂量)作为阳性对照，并且评估GAG水平。在给药后两小时时确认两种分子在外周组织中的分布。在给予IDS-Fc融合蛋白之后七天时在IDS KO小鼠的肝脏、脾脏以及肺脏中观测到显著底物减少(图7)。
为确定TfR结合性IDS-Fc融合蛋白是否与对照IDS-Fc融合蛋白相比显示改善的脑递送，给予人TfR敲入(TfRms/hu KI)小鼠50mg/kg的TfR结合性IDS-Fc融合蛋白ETV:IDS35.21或缺乏赋予TfR结合的突变的对照IDS-Fc融合蛋白(“IDS:Fc”)，并且在给药后4小时时使用以下实施例3中所描述的基于夹心ELISA的分析测量脑中的IDS-Fc融合蛋白浓度。如国际专利公布号WO 2018/152285中所描述使用CRISPR/Cas9技术表达鼠Tfrc基因内的人Tfrc顶端结构域来产生TfRms/hu KI小鼠；所得嵌合TfR在内源性启动子的控制下在体内表达。与对照IDS-Fc融合蛋白相比，在脑中检测到显著更高水平的IDS-Fc融合蛋白ETV:IDS35.21，ETV:IDS 35.21的平均脑浓度为23.7nM(图8)。使用TfRms/hu KI小鼠评估两种额外的TfR结合性IDS-Fc融合蛋白ETV:IDS 35.21.17.2和ETV:IDS 35.23.2的脑摄入。给予TfRms/huKI小鼠50mg/kg的ETV:IDS 35.21.17.2、ETV:IDS 35.23.2或对照IDS-Fc融合蛋白(“IDS:Fc”)，并且在给药后2小时和8小时时使用基于夹心ELISA的分析测量脑中的IDS-Fc融合蛋白浓度。在给药后2小时时，相对于对照IDS-Fc融合蛋白，施用TfR结合性IDS-Fc融合蛋白使得脑摄入增加5倍，并且在8小时时，使得脑浓度增加10-20倍(图9A)。ETV:IDS 35.21与IDS:Fc两者的血清PK和完整融合蛋白在肝脏中的累积为等效的(图9B)，表明IDS部分主要决定血浆清除的分布期。TfR结合性IDS-Fc融合蛋白的脑水平保持升高持续八小时，随外周清除而稍微降低。总之，这些数据证实TfR结合性IDS-Fc融合蛋白与TfR的相互作用总体上维持外周分布，同时显著改善脑暴露。
ETV:IDS的静脉内施用使脑中的GAG减少
为检验在上文所描述并且根据实施例1制备的TfR结合性IDS-Fc融合蛋白(在本文中称为ETV:IDS)的情况下所观测到改善的脑暴露是否产生对应的脑中所累积底物的减少，产生了具有敲入鼠TfR的人TfR顶端结构域的IDS缺陷型小鼠模型(在本文中称为IDS KO xTfRms/hu KI小鼠)。简单来说，使TfRms/hu KI雄性小鼠与雌性IDS杂合子小鼠繁殖以在TfRms/huKI纯合子背景中产生IDS KO小鼠。此研究中所用的所有小鼠均为雄性并且收容在12小时明-暗周期下，随意获取食物(LabDiet JL照射6F)和水。
为IDS KO x TfRms/hu KI小鼠静脉内施用单个或四个周活性等效剂量的ETV:IDS或IDS(747μmol产物/min/kg或分别40mg/kg和14.2mg/kg)，并且评估药代动力学和药效动力学反应。具体地说，使用一次(n＝8)或每周一次持续4周(n＝8)静脉内注射(i.v.)盐水、IDS(每千克体重14.2mg)或ETV:IDS(每千克体重40mg)的2月龄IDS KO x TfRms/hu KI小鼠测定外周施用ETV:IDS对IDS KO x TfRms/hu KI小鼠中的脑和组织GAG的影响。将一次(n＝5)或每周一次持续4周(n＝5)静脉内注射盐水的2月龄同窝TfRms/hu KI小鼠用作对照。对于给予IDS或ETV:IDS的动物，在各个时间点通过下颌下放血收集寿命内血清样品。在单个剂量后7天时或最后的4周剂量之后7天时将所有动物处死。对尿液、血清、CSF、肝脏、肾脏、脾脏、肺脏、心脏以及右半脑进行解剖并且在干冰上快速冷冻。
在单个剂量之后，如使用以下实施例3中所描述的用于检测IDS浓度的基于ELISA的分析所评估，ETV:IDS展现与IDS类似的血清清除型态，从而提供对酶主要影响外周清除的额外支持(图10A)。在给药后两小时时与IDS相比ETV:IDS的脑水平显著增加，平均浓度分别为8.4和1.6nM，并且与IDS相比ETV:IDS的肝脏和脾脏水平显著升高(图10B)。
为确定ETV:IDS是否降低脑中的底物水平，如实施例2中所描述评估在单个剂量或四个周剂量的酶之后在IDS KO x TfRms/hu KI小鼠中的GAG水平。在早期时间点IDS轻微地使脑GAG水平降低，但在处理四周之后对于显著降低GAG为无效的(图10C)。然而，ETV:IDS在单个剂量之后使脑GAG水平降低约58％并且在处理四周之后降低71％(图10C)。这使得在单个剂量之后CSF GAG伴随地减少约75％，这在给药四周之后得以维持(图10C)。两种分子在一周之后均有效地使肝脏和脾脏中的GAG水平降低，并且在重复给药的情况下反应得以维持(图10C)，证实TfR结合不负面地影响这些组织中的药效动力学反应。总之，这些数据证实ETV:IDS显著增加酶的脑暴露并且使外周与CNS中的底物累积大大减少。
实施例3.IDS融合蛋白的药代动力学表征.
此实施例描述小鼠血浆中工程化的IDS-Fc融合蛋白的药代动力学(PK)表征。
为测定TfR结合性IDS-Fc融合蛋白的血浆半衰期和清除率，经由尾部静脉注射给予7-8周龄雄性C57BL/6小鼠10mg/kg的两种IDS-Fc融合蛋白分子(N端单酶和C端单酶)。使用基于ELISA的分析测量历经24小时的时间保留在血浆中的IDS-Fc融合蛋白的浓度。简单来说，使用夹心ELISA定量小鼠血浆中的IDS-Fc融合蛋白浓度。将抗Fc捕获抗体(Abcam#ab124055)以3μg/mL包被至384孔MaxiSorpTM板(Thermo Scientific#464718)上。将板用5％BSA封闭，然后与1:1,000或1:10,000稀释的血浆一起孵育。接着，以0.5μg/mL添加多克隆抗IDS检测抗体(R&D Systems#AF2449)，随后添加抗山羊HRP抗体。使用TMB底物使板显色，用硫酸停止反应，并且在BioTek读板仪上测量在450nm下的吸光度。标准曲线为4倍稀释系列中的200-0.1ng/mL的个别构建体并且使用四参数罗吉斯回归进行拟合。
使用此分析，证实IDS-Fc融合蛋白的终末血浆半衰期为7.7-10小时(表2)。在体内在IDS-Fc融合蛋白情况下未观察到未预期的PK倾向。
表2.IDS-Fc融合蛋白在小鼠中经历24小时的药代动力学.
Figure BDA0002461603810001021
实施例4.包含酸性神经鞘磷脂酶(ASM)的融合蛋白的构建.
设计和克隆
将ASM-Fc融合蛋白设计成成熟人ASM酶融合至包括Fc区的人IgG1片段的融合多肽(“ASM-Fc融合多肽”)的二聚体。在一些实施方案中，ASM-Fc融合多肽包含含有赋予转铁蛋白受体(TfR)结合的突变的被修饰的Fc区。特别地，形成ASM片段融合至人IgG1Fc区N端的ASM-Fc融合多肽。在一些情况下，将接头放置于ASM与IgG1片段之间以缓解两个片段之间的任何空间位阻。在所有构建体中，天然ASM信号序列氨基酸1-46(UniProtKB ID-P17405)被移除并且用来自κ链V-III的分泌信号氨基酸1-20(UniProtKB ID-P01661)置换，以改善ASM的分泌。另外，在融合蛋白中，将ASM在它的C端截短，于氨基酸Q620处结束，以防止ASM与人IgG1Fc区域之间任何不想要的裂解。然后将人IgG1Fc区的片段(UniProtKB ID-P01857)与ASM的C端从氨基酸E99开始放置于框内，在位置103的半胱氨酸突变为丝氨酸。在一些实施方案中，IgG1片段含有用于促进两个Fc区异二聚化的额外突变。另外，产生含有一个或两个ASM分子的ASM-Fc融合蛋白。作为对照，将ASM-六组氨酸(SEQ ID NO:241)融合蛋白设计成由被截短以移除C端半胱氨酸并且促进酶活化的ASM氨基酸1-628以及C端融合的六组氨酸标签(SEQ ID NO:241)组成。
重组蛋白表达和纯化
为表达融合至Fc区的重组ASM酶，将ExpiCHO-S细胞(Thermo Fisher)在每毫升6x106个细胞密度下用Expifectamine CHO/质粒DNA复合物根据制造商的说明书(ThermoFisher Scientific)进行转染。在转染之后，将细胞在回转式振荡器(Infors HTMultitron)中在32℃加上6-8％CO2的湿润气氛下孵育。在转染后第一天，将Expifectamine增强子和Expifectamine馈料添加至培养物中。在48-72小时表达时间之后通过离心收获培养基上清液。为澄清的上清液补充不含EDTA的蛋白酶抑制剂(Roche)并且储存在-80℃下。
对于ASM-Fc融合蛋白纯化，为澄清的培养基上清液补充200μM乙酸锌(SigmaAldrich)。将上清液加载于HiTrap MabSelect SuRe蛋白质A亲和柱(GE Healthcare LifeSciences)上并且用200mM精氨酸和137mM琥珀酸盐缓冲液pH 5.0(精氨酸-琥珀酸盐缓冲液)洗涤。将融合蛋白在补充有200μM乙酸锌的100mM QB柠檬酸盐缓冲液pH 3.0中洗脱。在洗脱之后，立即添加精氨酸-琥珀酸盐缓冲液以调节pH值。通过在Superdex 200increase10/300GL柱(GE Healthcare Life Sciences)上的尺寸排阻色谱(SEC)将蛋白质聚集物与ASM-Fc融合蛋白分离。使SEC流动相保持在补充有200μM乙酸锌的精氨酸-琥珀酸盐pH 5.0缓冲液中。使用Akta Pure系统或Akta Avant系统(GE Healthcare Life Sciences)进行所有色谱步骤。通过非还原性SDS-PAGE对级分纯度进行评估。如图11中所示，纯化产生均质ASM-Fc融合蛋白。
实施例5.ASM融合蛋白的表征.
ASM-Fc融合蛋白在体外和细胞中为活性的
为证实ASM在融合至人IgG重链时维持它的酶活性，对ASM-Fc融合蛋白的体外和细胞活性进行评估。使用神经鞘磷脂的合成生色类似物测量重组ASM酶或重组ASM-Fc融合蛋白的体外活性。特别地，将2.5mM 2-(N-十六酰基氨基)-4-硝基苯基磷酸胆碱(EMDMillipore)与0.75nM ASM在100mM乙酸钠缓冲液(pH 5.3；在100μL反应体积中的最终浓度)中混合。将反应物在37℃下孵育16小时并且以添加相等体积的0.2M NaOH来停止反应。然后在410nm下测量反应溶液的吸光度。通过线性回归对对硝基酚标准曲线进行拟合以计算产物的量并且经验证为不到10％的总底物裂解。通过用产物的量除以反应时间和ASM的摩尔量来计算特定活性(每纳摩尔ASM每分钟的产物纳摩尔数)。体外酶活性分析证实ASM-Fc融合蛋白为活性的并且表明Fc区融合至ASM不妨碍它的酶活性(图12)。
使用CRISPR/CAS9产生ASM KO细胞以提供用于测试ASM-Fc融合蛋白的细胞活性的细胞系统。将HEK 293T细胞(ATCC)用含有靶向人SMPD1中的外显子2的后半部分的向导序列的CRISPR/CAS9pCas-Guide-EF1a-GFP载体(Origene)转染。在根据制造商的说明书使用Guide-it突变检测试剂盒(Clontech)之后针对ASM的基因组序列内插入缺失的存在对单个细胞克隆进行分析。使用ASM生色底物2-N-十六酰基氨基-4-硝基苯基磷酸胆碱(EMDMillipore)对插入缺失阳性克隆细胞溶解产物进行体外ASM酶分析。简单来说，使用12.5、25、50以及100μg细胞溶解产物在100mM乙酸钠缓冲液(pH 5.3)中进行体外活性分析。通过添加2.5mM底物来起始反应并且在20小时之后以添加0.2M NaOH来停止反应。将在HEK293TCRISPR克隆中的ASM活性与用作分析标准物的重组ASM、HEK野生型(WT)溶解产物以及过表达ASM的HEK细胞溶解产物相比较。在mini-Topo(Thermo Fisher Scientific)克隆之后对酶活性水平类似于背景信号的克隆进行序列验证并且确认为KO克隆。后续细胞分析使用三个独特的并且经验证的ASM KO克隆以及三个独立批次的WT HEK293T细胞。
为测试裸ASM酶或ASM-Fc融合蛋白的细胞活性，使两种细胞分析物显色，从而允许监测在ASM KO细胞中的在基线处和在用ASM或ASM-Fc融合物处理之后的底物累积(神经鞘磷脂)量。首先，开展基于成像的分析以监测ASM KO细胞中BODIPY缀合的C5-神经鞘磷脂累积的量。简单来说，将HEK293T WT和ASM KO细胞在补充有10％FBS的DMEM(Gibco)中以低密度涂铺至PDL包被的96孔板(Perkin Elmer)上。在涂铺后四小时时，将重组ASM酶、ASM-Fc融合蛋白或对照缓冲液添加至每个孔中并且在37℃下孵育48小时。移除培养基，替换为含有1μM BODIPY-C5-神经鞘磷脂(Thermo Fisher Scientific)的新鲜培养基，并且在37℃下孵育16小时。然后将细胞用PBS洗涤，用4％多聚甲醛固定，并且用核(DAPI,Thermo Fisher)和胞质(远红外cell mask，Thermo Fisher Scientific)染色进行染色。在使用63X物镜的Opera Phenix共焦显微镜(Perkin Elmer)上获得图像，每个孔多个视野并且每种条件三个重复的孔。使用Harmony软件(Perkin Elmer)进行图像分析，所述软件检测并且分析每个细胞的BODIPY-C5-神经鞘磷脂的平均总强度、斑点数目以及斑点强度。然后将这些每个细胞的值平均为每个孔的值，将所述每个孔的值用于分析基因型和/或处理对BODIPY-C5-神经鞘磷脂的累积的影响。与对照细胞系相比在ASM KO细胞中观察到显著BODIPY-C5-神经鞘磷脂累积，此影响可以添加重组ASM酶和ASM-Fc融合蛋白来挽救(图13)。
为进一步证实ASM-Fc融合蛋白在细胞中维持它们的活性，开展基于LC-MS/MS的分析以监测ASM KO细胞中的内源性神经鞘磷脂累积。培养HEK293T WT和ASM KO细胞并且用如上文所描述的酶处理。在涂铺后68小时时，在存在或不存在ASM或ASM-Fc融合蛋白处理的情况下，将细胞用PBS充分洗涤，并且用掺加有适当内部标准物的水:甲醇[1:1，v/v]混合物提取脂质。使用甲基-叔丁基醚(MTBE)提取脂质，涡旋，并且在10,000×g和4℃下离心10min。然后将含有脂质的上部MTBE级分在柔和的氮气流下蒸发至干燥。将脂质再悬浮于异丙醇:乙腈:水[2:1:1，v/v/v]的混合物中，然后转移至质谱分析小瓶中用于进一步分析。
通过与电喷雾质谱法(Sciex 6500+QTRAP,Sciex,Framingham,MA,USA)联用的液相色谱(Shimadzu Nexera X2系统，Shimadzu Scientific Instrument,Columbia,MD,USA)进行脂质分析。对于每个分析，在55℃下使用0.25mL/min的流速将5μL的样品注射于BEHC181.7μm，2.1×100mm柱(Waters Corporation,Milford,Massachusetts,USA)上。流动相A由60:40乙腈/水(v/v)加上10mM甲酸铵+0.1％甲酸组成。流动相B由90:10异丙醇/乙腈(v/v)加上10mM甲酸铵+0.1％甲酸组成。如下对梯度进行程序化：0.0-8.0min从45％B到99％B，8.0-10.0min为99％B，10.0-10.1min达到45％B，并且10.1-12.0min为45％B。应用以下设定以阳离子模式进行电喷雾电离：气帘气体，20；碰撞气体设定为中等；离子喷雾电压，5200；温度，250；离子源气体1，50；离子源气体2，60。使用Analyst 1.6(Sciex)以多反应监测模式(MRM)进行数据采集。碰撞能量，40；去簇电位，80；入口电位，10；碰撞室出口电位，12.5。使用以下MRM瞬态以[M-H2O+H]+的形式检测神经酰胺(Cer)：m/z 538.5的Cer d18:1/16:0>264.3；m/z 566.6的Cer d18:1/18:0>264.3；m/z 594.6的Cer d18:1/20:0>264.3；m/z622.6的Cer d18:1/22:0>264.3；m/z 650.6的Cer d18:1/24:0>264.3；m/z 648.6的Cerd18:1/24:1>264.3；m/z 552.4的Cer d18:1/17:0>264.3用作内部标准物。使用以下MRM瞬态以[M+H]+的形式检测神经鞘磷脂(SM)：m/z 703.7的SM d18:1/16:0>184.1；m/z 731.7的SM d18:1/18:0>184.1；m/z 759.7的SM d18:1/20:0>184.1；m/z 787.7的SM d18:1/22:0>184.1；m/z 815.7的SM d18:1/24:0>184.1；m/z 813.7的SM d18:1/24:1>184.1；m/z 738.7的SM d18:1/18:1(d9)>184.1用作内部标准物。基于滞留时间和可商购获得的参考标准物(Avanti Polar Lipids,Birmingham,AL,USA)的MRM特性来鉴定脂质。使用MultiQuant3.02(Sciex)进行定量。针对总蛋白量对脂质进行归一化。使用BCA分析(Pierce)测量蛋白质浓度。LC-MS/MS分析证实ASM-Fc融合蛋白可使ASM KO细胞中的内源性神经鞘磷脂的水平降回到在野生型细胞中所观察到的水平(图14)。另外，在两个分析中在减少神经鞘磷脂方面ASM-Fc融合蛋白与裸ASM酶一样有效(表3)。
表3.在细胞分析中ASM-Fc融合蛋白对ASM显示类似效能.
Figure BDA0002461603810001061
Figure BDA0002461603810001071
总之，这些数据证实ASM-Fc融合蛋白保留它们的活性并且可挽救ASM缺陷型细胞中的底物累积。
实施例6.包含N-磺基葡糖胺磺基水解酶(SGSH)的融合蛋白的构建.
设计和克隆
将SGSH-Fc融合蛋白设计成含有(i)融合多肽，其中成熟人SGSH酶融合至包括Fc区的人IgG1片段(“SGSH-Fc融合多肽”)，以及(ii)被修饰的人IgG1片段，所述被修饰的人IgG1片段在Fc区中含有赋予转铁蛋白受体(TfR)结合的突变(“被修饰的Fc多肽”)。具体地说，形成SGSH-Fc融合多肽，其中SGSH片段融合至人IgG1Fc区的N端或C端。在一些情况下，将接头放置于SGSH与IgG1片段之间以缓解两个片段之间的任何空间位阻。在所有构建体中，将来自κ链V-III的信号肽，氨基酸1-20(UniProtKB ID-P01661)插入融合物的上游以促进分泌，并且将SGSH截短至由氨基酸R21-L502(UniProtKB ID-P51688)组成。所用人IgG1Fc区的片段对应于UniProtKB ID P01857中的序列的氨基酸D104-K330(位置221-447，EU编号，包括铰链的10个氨基酸(位置221-230))。在一些实施方案中，将衍生自人IgG1残基D104-K330并且在Fc区中含有赋予TfR结合的突变但缺乏SGSH融合的第二Fc多肽与SGSH-Fc融合多肽共转染，以产生具有一个SGSH酶的异二聚融合蛋白(“单酶”)。在其他实施方案中，将衍生自人IgG1残基D104-K330并且在Fc区中含有赋予TfR结合的突变并且融合至SGSH的第二Fc多肽与SGSH-Fc融合多肽共转染，以产生具有两个SGSH酶的异二聚融合蛋白(“双酶”)。在一些构建体中，IgG1片段含有额外的突变以促进两个Fc区的异二聚化。类似地设计和构建缺乏赋予TfR结合的突变的对照SGSH-Fc融合蛋白。作为另一对照，产生具有C端六组氨酸标签(SEQID NO:241)以促进检测和纯化的SGSH(氨基酸R21-L502)。
实施例中所用的包含TfR结合的SGSH-Fc融合蛋白为由SGSH-Fc融合多肽和结合于TfR的被修饰的Fc多肽形成的二聚体，其中被修饰的Fc多肽缺乏SGSH融合(“单酶”)或融合至第二SGSH分子(“双酶”)。
包含融合至具有臼和LALA突变的IgG1Fc多肽序列N端的成熟人SGSH序列的SGSH-Fc融合多肽具有SEQ ID NO:149的序列。SGSH酶通过GGGGS接头(SEQ ID NO:239)连接至Fc多肽并且Fc多肽的N端包括IgG1铰链区的一部分(DKTHTCPPCP；SEQ ID NO:113)。
包含融合至具有臼和LALA突变的IgG1Fc多肽序列C端的成熟人SGSH序列的SGSH-Fc融合多肽具有SEQ ID NO:150的序列。SGSH酶通过GGGGS接头(SEQ ID NO:239)连接至Fc多肽并且Fc多肽的N端可包括IgG1铰链区的一部分(例如SEQ ID NO:113)。
包含具有杵和LALA突变的克隆CH3C.35.21.17(SEQ ID NO:58)的序列的结合于TfR的被修饰的Fc多肽具有SEQ ID NO:151的序列。被修饰的Fc多肽的N端可包括IgG1铰链区的一部分(例如SEQ ID NO:113)。
在SEQ ID NO:149与151之间形成在Fc多肽的N端含有单个SGSH分子的“N端单酶”。在SEQ ID NO:150与151之间形成在Fc多肽的C端含有单个SGSH分子的“C端单酶”。
包含融合至具有杵和LALA突变的克隆CH3C.35.21.17(SEQ ID NO:58)的序列N端的成熟人SGSH序列的结合于TfR的被修饰的Fc多肽具有SEQ ID NO:154的序列。SGSH酶通过GGGGS接头(SEQ ID NO:239)连接至被修饰的Fc多肽并且被修饰的Fc多肽的N端可包括IgG1铰链区的一部分(例如SEQ ID NO:113)。
在SEQ ID NO:149与154之间形成含有在Fc多肽N端的第一SGSH分子以及在被修饰的Fc多肽N端的第二SGSH分子的“N端双酶”。
重组蛋白表达和纯化
为表达融合至Fc区的重组SGSH酶，使用ExpifectamineTMCHO转染试剂盒根据制造商的说明书(Thermo Fisher Scientific)用相关DNA构建体对ExpiCHO细胞(ThermoFisher Scientific)进行转染。使细胞在回转式振荡器(Infors HT Multitron)中在37℃，6％CO2和120rpm下在ExpiCHOTM表达培养基中生长。简单地说，用每毫升培养体积0.8μg的DNA质粒在每毫升6x106个细胞的密度下对对数生长的ExpiCHOTM细胞进行转染。在转染之后，使细胞回到37℃并且在转染后18-22小时时为转染的培养物补充如所指示的馈料。在转染后120小时时通过在3,500rpm下离心20min收获转染的细胞培养物上清液。将澄清上清液过滤(0.22μM膜)并且储存在4℃下。在进行微小修改的情况下如上文所描述进行表位标记的SGSH酶(用作对照)的表达。简单地说，使具有C端六组氨酸标签(SEQ ID NO:241)的SGSH酶在ExpiCHO细胞中表达。
A亲和色谱将具有(或不具有)赋予TfR结合的工程化的Fc区的SGSH-Fc融合蛋白从细胞培养物上清液纯化。将上清液加载至HiTrap MabSelect SuRe蛋白质A亲和柱(GEHealthcare Life Sciences，使用Akta Pure系统)上。然后将柱用>20柱体积(CV)的PBS洗涤。使用含有150mM NaCl的100mM柠檬酸盐/NaOH缓冲液pH 3.0将结合的蛋白质洗脱。在洗脱之后，立即使用1M精氨酸-670mM琥珀酸盐缓冲液pH 5.0(1:5稀释)将级分中和。通过还原和非还原性SDS-PAGE对洗脱级分中SGSH-Fc融合蛋白的均质性进行评估。
为纯化六组氨酸标记(SEQ ID NO:241)的SGSH，将转染的上清液用含有100mMNaCl的15L 20mM HEPES pH 7.4充分渗析过夜，并且在纯化之前将20mM咪唑添加至渗析的上清液中。使渗析的上清液结合于HisTrap柱(GE Healthcare Life Sciences，使用AktaPure系统)。在结合之后，将柱用20CV的PBS洗涤。将结合的蛋白质使用含有500mM咪唑的PBS洗脱。通过还原和非还原性SDS-PAGE对洗脱级分中SGSH酶的均质性进行评估。可将含有SGSH的汇集级分于50mM Tris pH 7.5中1:10稀释并且使用高性能Q琼脂糖凝胶(GEHealthcare)进一步纯化。在结合之后，将柱用10CV的50mM Tris pH 7.5洗涤。使用达到50mM Tris pH 7.5和0.5M NaCl的线性梯度将结合的蛋白质洗脱并且收集于1CV级分中。通过非还原性SDS-PAGE对级分纯度进行评估。纯化产生均质SGSH-Fc融合蛋白和六组氨酸标记(SEQ ID NO:241)的SGSH。
实施例7.SGSH融合蛋白的表征.
具有工程化的TfR结合位点的SGSH-Fc融合蛋白结合于人TfR
为确定具有工程化的TfR结合的SGSH-Fc融合蛋白是否影响被修饰的Fc结构域与人TfR相互作用的能力，可使用BiacoreTM表面等离子体共振分析对此蛋白质对人TfR的亲和力进行评估。将BiacoreTM系列S CM5传感器芯片用抗人Fab(来自GE Healthcare的人Fab捕获试剂盒)固定。将5μg/mL的IDS-Fc融合蛋白捕获于每个液体池上持续1分钟并且以30μL/min的流速注射人顶端结构域TfR的连续3倍稀释液。在3分钟缔合和3分钟解离的情况下对每个样品进行分析。在每次注射之后，使用10mM甘氨酸-HCl(pH 2.1)使芯片再生。通过从捕获类似密度的不相关IgG的液体池扣除RU来校正结合反应。通过使用BiacoreTMT200评估软件v3.1针对浓度对平衡状态下的反应进行拟合来获得稳态亲和力。BiacoreTM分析证实具有工程化至Fc区中的TfR结合位点的SGSH-Fc融合蛋白结合于人TfR。
具有工程化的TfR结合位点的SGSH-Fc融合蛋白在体外和细胞中为活性的
对工程化的TfR结合性SGSH-Fc融合蛋白的体外和细胞活性进行评估以证实SGSH在融合至人IgG片段时维持它的酶活性。使用人工底物使用两步荧光酶分析来测量重组SGSH的体外活性。具体地说，将于分析缓冲液(0.03M乙酸钠，0.12M NaCl，pH 6.5)中稀释的20μL 1mM 4-甲基伞形酮基2-脱氧-2-磺氨基-a-D-吡喃葡糖苷钠盐底物(CarbosynthLimited，#EM06602)与10μL的40nM SGSH混合。将第一反应物在37℃下孵育17小时，然后用10μL的0.2M磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液，pH 6.7终止反应。接着，通过添加10μL(0.5U)的酵母α-葡糖苷酶(Sigma，#G0660-750UN)起始第二反应，在37℃下孵育24小时，并且以添加100μL的0.5M碳酸钠缓冲液，pH 10.3停止反应。然后测量反应溶液的荧光(在365nm下激发并且在450nm下发射)。通过线性回归对4-甲基伞形酮标准曲线进行拟合以计算产物的量并且经验证为不到10％的总底物裂解。通过用产物的量除以反应时间和SGSH摩尔量来计算特定活性(每皮摩尔SGSH每分钟的产物法摩尔数)。
体外酶活性分析证实SGSH-Fc融合蛋白为活性的并且表明Fc区融合至SGSH不妨碍酶活性(图15)。
使用CRISPR/CAS9产生SGSH敲出(KO)细胞以提供用于测试工程化的SGSH-Fc多肽的细胞活性的细胞系统。用含有靶向人SGSH中产生甲酰甘氨酸的反应性半胱氨酸位点上游的外显子2的向导序列的CRISPR/CAS9pCas-Guide-EF1a-GFP载体(Origene)转染HEK 293T细胞(ATCC)。为鉴定SGSH KO细胞，使单个细胞克隆生长并且对细胞溶解产物进行上文所描述的体外SGSH酶分析。简单来说，使用12.5、25、50以及100μg细胞溶解产物在乙酸铅分析缓冲液pH 5.0(100mM乙酸钠，10mM乙酸铅)中进行体外活性分析。通过将20μL归一化的细胞溶解产物(于水中)与1mM底物在10μL乙酸铅缓冲液(3X)中组合来起始反应并且在37℃下孵育十七小时。通过添加70μL 4x柠檬酸盐磷酸盐缓冲液pH 6.7加上0.5U NAGLU(Sigma)来停止此第一反应。反应在37℃下进行24小时并且然后通过添加100μL 0.5M碳酸钠pH 10.3来停止反应。将HEK293T CRISPR克隆中的SGSH活性与用作分析标准物的重组SGSH(R&D)、HEK野生型(WT)溶解产物以及过表达SGSH的HEK细胞溶解产物相比较。在mini-Topo(ThermoFisher)克隆之后对酶活性水平类似于背景信号的克隆进行序列验证并且确认为KO克隆。后续细胞分析使用三个独特的并且经验证的SGSH KO克隆以及三个独立批次的WTHEK293T细胞。
为测试裸SGSH酶或SGSH-Fc融合蛋白的细胞活性，开展基于LC-MS/MS的糖体学分析，从而允许监测底物累积(硫酸乙酰肝素)的量作为SGSH活性的指示。测量SGSH KO细胞和WT HEK293T细胞中的底物累积。将SGSH KO细胞和WT HEK293T细胞培养24小时，并且将细胞用PBS洗涤三次，使其集结成粒并且冷冻。将细胞球粒在二糖消化缓冲液(111mM NH4OAc，11mM CaOAc，pH 7.0)中超声处理。使用BCA分析(Pierce)测量蛋白质浓度。将总蛋白(100μg)与2mM DTT、1.25mIU肝素酶I(Galen)、1.25mIU肝素酶II(Galen)以及1.25mIU肝素酶III(Galen)一起添加至100μL消化缓冲液中。在30℃下三小时之后硫酸乙酰肝素消化完成，此后将20ng的内部标准物(4UA-2S-GlcNCOEt-6S HD009[Galen])添加至每个样品中。通过添加6μL的250mM EDTA将酶去活化并且将样品在95℃下煮沸10分钟。然后将样品在室温下在16,000x G下离心5分钟。将上清液转移至Amicon Ultra 30KD离心过滤器(Millipore)中并且在14,000x G下离心15分钟。将二糖浓缩在流出物中并且再悬浮于[1:1，v/v]分析缓冲液:乙腈的混合物中，然后将其转移至质谱分析小瓶用于进一步分析。
通过与电喷雾质谱法(Sciex 6500+QTRAP,Sciex,Framingham,MA,USA)联用的液相色谱(Shimadzu Nexera X2系统，Shimadzu Scientific Instrument,Columbia,MD,USA)进行GAG分析。对于每个分析，使用0.4mL/min的流速和50℃的柱温度，将10μL的样品注射在ACQUITY UPLC BEH酰胺1.7μm，2.1×150mm柱(Waters Corporation,Milford,Massachusetts,USA)上。流动相A由水加上10mM甲酸铵和0.1％甲酸组成。流动相B由乙腈加上0.1％甲酸组成。如下对梯度进行程序化：0.0-1.0min为85％B，1.0-5.0min从85％B到50％B，5.0-6.0min 50％B至85％B，在85％B下保持6-8.0min。应用以下设定以阴离子模式进行电喷雾电离：气帘气体，30；碰撞气体设定为中等；离子喷雾电压，-4500；温度，450；离子源气体1，50；离子源气体2，60。使用Analyst 1.6.3(Sciex)以多反应监测模式(MRM)进行数据采集，停留时间为25(毫秒)。碰撞能量，-30；去簇电位，-80；入口电位，-10；碰撞室出口电位，-10。使用以下MRM瞬态以[M--H]-的形式检测GAG：m/z 378.1的D0A0>87.0；m/z 378.1的D0a0>175.0；m/z 416.1的D0S0>138.0；m/z 458.1的D0a4>300.0；m/z 458.1的D0A6、D2A0、D0a6、D2a0>97.0；m/z 496.0的D0S6、D2S0>416.1；m/z 538.0的D2a4、D2a6、D0a10、D2A6>458.0；m/z 575.95的D0S6>97.0；m/z 472.0(碎片离子)的4UA-2S-GlcNCOEt-6S>97.0用作内部标准物(I.S.)。基于滞留时间和与可商购获得的参考标准物(Iduron Ltd,Manchester,UK)匹配的MRM瞬态来鉴定GAG。使用MultiQuant 3.0.2(Sciex)通过与I.S.的面积比进行定量。针对总蛋白量对GAG进行归一化。使用BCA分析(Pierce)测量蛋白质浓度。
与对照细胞系相比，在SGSH KO细胞中观察到如由在硫酸乙酰肝素消化之后所观测到的二糖量反映的显著底物累积(图16)。使用基于LC-MS/MS的糖体学分析，证实用TfR结合性SGSH-Fc融合蛋白处理细胞使硫酸乙酰肝素衍生的二糖的水平降回到在野生型细胞中所观察到的水平(图17)。总之，这些数据证实SGSH-Fc融合蛋白维持酶活性并且可使SGSHKO细胞中的底物累积减少。
实施例8.SGSH活性的体外分析.
此实施例提供SGSH-Fc融合蛋白的替代体外活性分析。所述分析由Karpova等,J.Inherit.Metab.Dis.,19:278-285(1996)改编而来。
标准反应混合物由含10-15μg蛋白质和20μL MU-α-GlcNS(分别5或10mmol/L)的米氏巴比妥钠乙酸盐缓冲液(Michaelis'barbital sodium acetate buffer)，pH 6.5(29mmol/L巴比妥钠，29mmol/L乙酸钠，0.68％(w/v)NaCl，0.02％(w/v)叠氮化钠；用HCl调节至pH 6.5)组成并且将反应混合物在37℃下孵育17h。MU-α-GlcNS可购自MoscerdamSubstrates。在第一次孵育之后，添加含有0.02％叠氮化钠的6μl两次浓缩的麦基而文氏磷酸盐/柠檬酸盐缓冲液(McIlvain's phosphate/citrate buffer)，pH 6.7以及含10μl(0.1U)酵母a-葡糖苷酶(Sigma)的水并且在37℃下进行24h的第二次孵育。在用宽胶带气密密封从而将蒸发限制为<15％的96孔板中在37℃下进行长时间孵育(17-24h)。接着，添加200μL 0.5mol/L Na2CO3/NaHCO3，pH 10.7，并且在Fluoroskan(Titertek)荧光计上测量所释放的4-甲基伞形酮(MU)的荧光。如先前所描述测定蛋白质(van Diggelen等,Clin.Chim.Acta.,187:131-139(1990))。
实施例9.结合于TfR的被修饰的Fc多肽.
此实施例描述为赋予转铁蛋白受体(TfR)结合并且运送穿过血脑屏障(BBB)而对Fc多肽的修饰。
除非另外指出，否则本部分中基于对人IgG1野生型Fc区的EU索引编号对氨基酸残基的位置进行编号。
在位置384、386、387、388、389、390、413、416以及421包含修饰的Fc多肽(CH3C克 隆)的产生和表征
如下文所描述产生含有Fc区的酵母文库，所述Fc区具有引入包括氨基酸位置384、386、387、388、389、390、413、416以及421的位置中的修饰。表4和表5中示出了结合于TfR的说明性克隆。
在再两轮分选之后，对单个克隆进行测序并且鉴定出四个独特序列。这些序列具有在位置388的保守Trp，并且全部具有在位置421的芳族残基(即，Trp、Tyr或His)。在其他位置存在极大的多样性。
使选自所述文库的四个克隆在CHO或293细胞中表达为与Fab片段的Fc融合物，并且通过蛋白质A和尺寸排阻色谱纯化，然后在存在或不存在holo-Tf的情况下通过ELISA针对与人TfR结合进行筛检。所述克隆全部结合于人TfR并且所述结合不因添加过量(5μM)holo-Tf而受影响。还针对与内源性表达人TfR的293F细胞的结合对克隆进行测试。克隆结合于293F细胞，不过总体结合大体上弱于高亲和力阳性对照。
接着，使用克隆CH3C.3作为测试克隆来测试克隆是否可内化于表达TfR的细胞中。使附着的HEK 293细胞在96孔板中生长至约80％汇合，移除培养基，并且以1μM的浓度添加样品：克隆CH3C.3、抗TfR基准阳性对照抗体(Ab204)、抗BACE1基准阴性对照抗体(Ab107)以及人IgG同型对照(获自Jackson Immunoresearch)。将细胞在37℃和8％CO2浓度下孵育30分钟，然后洗涤，用0.1％TritonTMX-100透性化，并且用抗人-IgG-Alexa
Figure BDA0002461603810001151
488第二抗体染色。在再洗涤之后，使细胞在高通量荧光显微镜(即，Opera PhenixTM系统)下成像，并且定量每一细胞的斑点数目。在1μM下，克隆CH3C.3显示与阳性抗TfR对照类似的内化倾向，而阴性对照未显示内化。
克隆的进一步工程化
使用软随机化法(soft randomization approach)产生额外的文库以改善初始命中物(hit)对人TfR的亲和力，其中基于原始四个命中物中的每一者产生DNA寡核苷酸以引入软诱变(soft mutagenesis)。鉴定结合TfR的额外的克隆并且加以选择。所选克隆属于两个一般序列组。组1克隆(即，克隆CH3C.18、CH3C.21、CH3C.25以及CH3C.34)具有在位置384的半保守Leu、在位置386的Leu或His、分别在位置387和389的保守和半保守Val以及分别在位置413、416以及421的半保守P-T-W基序。组2克隆具有在位置384的保守Tyr、在位置386-390的基序TXWSX以及分别在位置413、416以及421的保守基序S/T-E-F。将克隆CH3C.18和CH3C.35用于额外的研究作为各个序列组的代表性成员。
表位定位
为确定工程化的Fc区是否结合于TfR的顶端结构域，使TfR顶端结构域在噬菌体的表面表达。为适当折叠并且展示顶端结构域，必须将环中的一者截短并且需要将序列环形排列。将克隆CH3C.18和CH3C.35包被于ELISA板上并且进行噬菌体ELISA方案。简单来说，在洗涤并且用1％PBSA封闭之后，添加噬菌体展示物的稀释液并且在室温下孵育1小时。随后将板洗涤并且添加抗M13-HRP，并且在再洗涤之后用TMB底物使板显色并且用2N H2SO4中止反应。在此分析中克隆CH3C.18与CH3C.35两者均结合于顶端结构域。
互补位定位
为理解Fc结构域中哪些残基对TfR结合来说最重要，形成一系列突变体克隆CH3C.18和克隆CH3C.35Fc区，其中每个突变体在TfR结合登记者中有单个位置突变回野生型。使所得变体重组表达为Fc-Fab融合物并且针对与人或犬TfR结合进行测试。对于克隆CH3C.35，位置388和421对结合来说为重要的；这些位置中的任一者恢复为野生型均完全消除与人TfR的结合。
成熟克隆的结合表征
如上文所描述，在存在包被于板上的人或犬TfR的情况下用纯化的Fc-Fab融合变体进行结合ELISA。来自克隆CH3C.18成熟文库的变体克隆CH3C.3.2-1、克隆CH3C.3.2-5以及克隆CH3C.3.2-19以大致相等的EC50值结合人和犬TfR，而亲本克隆CH3C.18和CH3C.35相较于犬TfR与人TfR具有大于10倍的更佳结合。
接着，测试被修饰的Fc多肽是否内化于人和猴细胞中。使用上文所描述的方案，测试在人HEK 293细胞和恒河猴LLC-MK2细胞中的内化。与克隆CH3C.35相比，类似地结合人和犬TfR的变体克隆CH3C.3.2-5和CH3C.3.2-19在LLC-MK2细胞中具有显著改善的内化。
克隆的额外工程化
对其他亲和力成熟克隆CH3C.18和CH3C.35的额外工程化涉及向通过直接相互作用、第二壳相互作用(second-shell interaction)或结构稳定化增强结合的位置添加额外的突变。这是经由产生“NNK行走(NNK walk)”或“NNK补丁(NNK patch)”文库和由其选择来实现。NNK行走文库涉及形成靠近互补位之残基的逐个NNK突变。通过查看Fc结合于FcγRI的结构(PDB ID：4W4O)，将靠近原始修饰位置的44个残基鉴定为询问候选残基。特别地，靶向以下残基进行NNK诱变：K248、R255、Q342、R344、E345、Q347、T359、K360、N361、Q362、S364、K370、E380、E382、S383、G385、Y391、K392、T393、D399、S400、D401、S403、K409、L410、T411、V412、K414、S415、Q418、Q419、G420、V422、F423、S424、S426、Q438、S440、S442、L443、S444、P4458、G446以及K447。使用孔克尔诱变(Kunkel mutagenesis)产生44单点NNK文库，并且将产物汇集并且如上文关于其他酵母文库所描述经由电穿孔引入酵母。
这些迷你文库(其中的每一者具有一个突变位置，从而产生20个变体)的组合产生小文库，针对引起较高亲和力结合的任何位置使用酵母表面展示对所述小文库加以选择。使用TfR顶端结构域蛋白质如上文所描述进行选择。在三轮分选之后，对来自富集酵母文库的克隆进行测序，并且鉴定出若干“热点”位置，在所述位置中某些点突变显著改善与顶端结构域蛋白质的结合。对于克隆CH3C.35，这些突变包括E380(突变为Trp、Tyr、Leu或Gln)和S415(突变为Glu)。SEQ ID NO:27-38中阐述了克隆CH3C.35单一和组合突变体的序列。对于克隆CH3C.18，这些突变包括E380(突变为Trp、Tyr或Leu)和K392(突变为Gln、Phe或His)。SEQ ID NO:21-26中阐述了克隆CH3C.18单一突变体的序列。
用于改善克隆CH3C.35亲和力的额外的成熟文库
如关于先前的酵母文库所描述产生用于鉴定来自NNK行走文库的突变组合同时添加在这些位置周边的若干额外位置的另一文库。在此文库中，YxTEWSS(SEQ ID NO:242)和TxxExxxxF基序保持恒定，并且六个位置为完全随机化的：E380、K392、K414、S415、S424以及S426。包括位置E380和S415，因为它们是NNK行走文库中的“热点”。包括位置K392、S424以及S426，因为它们构成可定位结合区的核心的一部分，同时选择K414，这是由于它邻近位置415。
仅使用犬TfR顶端结构域如先前所描述对此文库进行分选。在五轮之后对富集汇集物进行测序，并且SEQ ID NO:42-59中阐述了所鉴定的独特克隆的被修饰区域的序列。
设计接下来的文库以进一步探索在主要结合互补位中可接受的多样性。用NNK密码子将原始位置(384、386、387、388、389、390、413、416以及421)中的每一者加上两个热点(380和415)个别地随机化以产生一系列基于酵母的单位置饱和诱变文库。此外，将每个位置个别地恢复为野生型残基，并且使这些个别克隆展示于酵母上。应注意，位置380、389、390以及415为在恢复为野生型残基后保留与TfR的实质性结合的仅有位置(对于413恢复为野生型观测到一定程度残留但极大程度减弱的结合)。
将单位置NNK文库针对人TfR顶端结构域分选三轮以收集最先前的约5％的结合者，然后由每个文库对至少16个克隆进行测序。结果指示在克隆CH3C.35的背景下，在每个位置在不显著降低与人TfR的结合的情况下可忍受什么氨基酸。汇总如下：
位置380：Trp、Leu或Glu；
位置384：Tyr或Phe；
位置386：仅Thr；
位置387：仅Glu；
位置388：仅Trp；
位置389：Ser、Ala或Val(虽然野生型Asn残基似乎保留一些结合，但它在文库分选之后不出现)；
位置390：Ser或Asn；
位置413：Thr或Ser；
位置415：Glu或Ser；
位置416：仅Glu；以及
位置421：仅Phe。
以上残基当作为单一变化或以组合形式取代至克隆CH3C.35中时呈现保留与TfR顶端结构域结合的互补位多样性。在这些位置具有突变的克隆包括表5中所示的那些克隆，并且SEQ ID NO:34-38、58以及60-90中阐述了这些克隆的CH3结构域的序列。
实施例10.可被修饰以赋予TfR结合的额外的Fc位置.
产生在Fc区中在替代位点，例如在以下位置具有修饰的结合于转铁蛋白受体(TfR)的额外的被修饰的Fc多肽：
位置274、276、283、285、286、287、288以及290(CH2A2克隆)；
位置266、267、268、269、270、271、295、297、298以及299(CH2C克隆)；
位置268、269、270、271、272、292、293、294以及300(CH2D克隆)；
位置272、274、276、322、324、326、329、330以及331(CH2E3克隆)；或
位置345、346、347、349、437、438、439以及440(CH3B克隆)。
SEQ ID NO:124-128中阐述了结合于TfR的说明性CH3B克隆。SEQ ID NO:129-133中阐述了结合于TfR的说明性CH2A2克隆。SEQ ID NO:134-138中阐述了结合于TfR的说明性CH2C克隆。SEQ ID NO:139-143中阐述了结合于TfR的说明性CH2D克隆。SEQ ID NO:144-148中阐述了结合于TfR的说明性CH2E3克隆。
实施例11.方法.
噬菌体展示文库的产生
合成编码野生型人Fc序列的DNA模板并且合并至噬菌粒载体中。噬菌粒载体含有ompA或pelB前导序列、融合至c-Myc和6xHis(SEQ ID NO:241)表位标签的Fc插入物以及在M13外壳蛋白pIII之后的琥珀(amber)终止密码子。
产生在用于修饰的所需位置含有“NNK”三密码子的引物，其中N为任何DNA碱基(即，A、C、G或T)并且K为G或T。或者，使用用于“软”随机化的引物，其中每个随机化位置使用对应于70％野生型碱基和10％其他三种碱基中的每一者的碱基混合物。通过进行对应于随机化区域的Fc区片段的PCR扩增来产生文库，然后使用含有SfiI限制位点的末端引物进行组装，然后用SfiI消化并且连结至噬菌粒载体中。或者，使用引物来进行孔克尔诱变。将连结产物或孔克尔产物转化至菌株TG1(获自
Figure BDA0002461603810001201
)的电转感受态大肠杆菌细胞中。在回收和生长过夜之后使大肠杆菌细胞感染M13K07辅助噬菌体，此后将文库噬菌体用5％PEG/NaCl沉淀，再悬浮于含15％甘油的PBS中，并且冷冻直至使用。典型文库尺寸介于约109至约1011个转化体范围内。经由pIII融合的Fc与不附着于pIII的可溶性Fc(后者因pIII前的琥珀终止密码子而产生)之间的配对使Fc-二聚体展示于噬菌体上。
酵母展示文库的产生
合成编码野生型人Fc序列的DNA模板并且合并至酵母展示载体中。对于CH2和CH3文库，使Fc多肽展示于Aga2p细胞壁蛋白质上。两种载体均含有具有Kex2裂解序列的前原前导肽(prepro leader peptide)以及融合至Fc末端的c-Myc表位标签。
使用类似于关于噬菌体文库所描述的那些方法的方法来组装酵母展示文库，除了使用含有对载体同源的末端的引物来进行片段扩增。用线性化的载体和组装的文库插入物对新制备的电转感受态酵母(即，菌株EBY100)进行电穿孔。电穿孔方法将为本领域技术人员已知的。在选择性SD-CAA培养基中回收之后，使酵母生长至汇合并且分裂两次，然后通过转移至SG-CAA培养基诱导蛋白质表达。典型文库尺寸介于约107至约109个转化体范围内。通过邻近展示的Fc单体的配对形成Fc-二聚体。
噬菌体选择的一般方法
噬菌体方法是由Phage Display:A Laboratory Manual(Barbas,2001)改编而来。从此参考文献可获得额外的方案细节。
板分选法
在4℃下将抗原包被于
Figure BDA0002461603810001211
微量滴定板上(典型地1-10μg/mL)过夜。将噬菌体文库添加至每个孔中并且孵育过夜以便结合。将微量滴定孔用含有0.05％
Figure BDA0002461603810001212
20(PBST)的PBS充分洗涤并且通过将孔在酸(典型地为50mM HCl加上500mM KCl，或100mM甘氨酸，pH 2.7)存在下孵育30分钟将结合的噬菌体洗脱。将洗脱的噬菌体用1M Tris(pH 8)中和并且使用TG1细胞和M13/KO7辅助噬菌体扩增，并且在37℃下在含有50μg/mL羧苄西林(carbenacillin)和50ug/mL卡那霉素(Kanamycin)的2YT培养基中生长过夜。将从含有靶标的孔洗脱的噬菌体的效价与从不含靶标的孔中回收的噬菌体的效价相比较以评估富集。通过随后减少结合期间的孵育时间以及增加洗涤时间以及洗涤次数来增加选择严格性。
珠粒分选法
NHS-PEG4-生物素(获自PierceTM)通过游离胺将抗原生物素化。对于生物素化反应，在PBS中使用3倍至5倍摩尔过量的生物素试剂。用Tris中止反应，随后在PBS中充分渗析。将生物素化的抗原固定于链霉亲和素包被的磁性珠粒(即，获自Thermo Fisher的M280-链霉亲和素珠粒)上。将噬菌体展示文库与抗原包被的珠粒在室温下一起孵育1小时。然后移除未结合的噬菌体并且用PBST洗涤珠粒。通过在存在含有500mM KCl的50mM HCl(或0.1M甘氨酸，pH 2.7)的情况下孵育30分钟将结合的噬菌体洗脱，然后如上文关于板分选所描述进行中和和增殖。
在三至五轮淘选之后，通过使Fc在噬菌体上表达或在大肠杆菌周质中可溶性表达来筛选单个克隆。此类表达方法将为本领域技术人员已知的。使个别噬菌体上清液或周质提取物暴露于包被有抗原或阴性对照的封闭的ELISA板，并且随后对于周质提取物使用HRP缀合的山羊抗Fc(获自Jackson Immunoresearch)或对于噬菌体使用抗M13(GEHealthcare)进行检测，然后用TMB试剂(获自Thermo Fisher)显色。将OD450值大于约5倍于背景的孔视为阳性克隆并且测序，此后使一些克隆作为可溶性Fc片段或以融合至Fab片段的形式表达。
酵母选择的一般方法
珠粒分选(磁性辅助细胞分选(MACS))法
类似于Ackerman等,Biotechnol.Prog.,25(3):774(2009)中所描述进行MACS和FACS选择。将链霉亲和素磁性珠粒(例如来自ThermoFisher的M-280链霉亲和素珠粒)用生物素化的抗原标记并且与酵母一起孵育(典型地5-10x文库多样性)。移除未结合的酵母，洗涤珠粒，并且使结合的酵母在选择性培养基中生长并且诱导后续各轮选择。
荧光激活细胞分选(FACS)法
将酵母用抗c-Myc抗体标记以监测表达和经物素化的抗原(浓度根据各轮分选而变化)。在一些实验中，将抗原与链霉亲和素-Alexa
Figure BDA0002461603810001231
647预混合以增强相互作用的亲合力。在其他实验中，在结合并且用链霉亲和素-Alexa
Figure BDA0002461603810001232
647洗涤之后检测到生物素化的抗原。使用FACS Aria III细胞分选器对结合情况下的单线态酵母进行分选。使分选的酵母在选择性培养基中生长，然后诱导后续各轮选择。
在实现富集酵母群体之后，将酵母涂铺于SD-CAA琼脂板上并且使单个菌落生长并且诱导表达，然后如上文所描述进行标记以测定它们结合于靶标的倾向。随后针对结合抗原对阳性单个克隆进行测序，此后一些克隆作为可溶性Fc片段或以融合至Fab片段的形式表达。
筛选的一般方法
通过ELISA筛选
从淘选输出端选择克隆并且使其在96孔深孔板的个别孔中生长。使用自动诱导培养基(获自EMD Millipore)诱导克隆的周质表达或使其感染辅助噬菌体以使个别Fc变体于噬菌体上发生噬菌体展示。典型地以0.5mg/mL用抗原包被ELISA板过夜，然后用1％BSA封闭，然后添加噬菌体或周质提取物。在1小时孵育并且洗去未结合的蛋白质之后，添加HRP缀合的第二抗体(即，对于可溶性Fc或噬菌体展示的Fc分别为抗Fc或抗M13)并且孵育30分钟。再次将板洗涤，然后用TMB试剂显色并且用2N硫酸中止反应。使用读板仪
Figure BDA0002461603810001233
定量在450nm下的吸光度并且在适当时使用Prism软件绘制结合曲线。在一些分析中，在结合步骤期间典型地以显著摩尔过量添加可溶性转铁蛋白或其他竞争物。
通过流式细胞术筛选
将Fc变体多肽(表达于噬菌体上、周质提取物中或作为与Fab片段的融合物可溶性表达)添加至96孔V形底板中的孔中(在PBS+1％BSA(PBSA)中每孔约100,000个细胞)，并且在4℃下孵育1小时。随后将板离心并且移除培养基，然后将细胞用PBSA洗涤一次。将细胞再悬浮于含有第二抗体(典型地为山羊抗人-IgG-Alexa
Figure BDA0002461603810001241
647(获自Thermo Fisher))的PBSA中。在30分钟之后，将板离心并且移除培养基，将细胞用PBSA洗涤1-2次，然后将板在流式细胞仪(即，FACSCantoTMII流式细胞仪)上读取。使用FlowJo软件计算每种条件下的中值荧光值并且用Prism软件绘制结合曲线。
实施例12.TfR结合性多肽亲和力的选择.
此实施例描述TfR结合性多肽对转铁蛋白受体(TfR)的亲和力与所得的脑对键联至TfR结合性多肽的治疗剂的暴露之间的关系。
图18表明当治疗剂键联至对TfR具有相对更强的亲和力的多肽时，脑对治疗剂的暴露(如通过测定脑浓度相较于时间的曲线下面积(AUC)所评估)缩短。特别地，当治疗剂键联至对TfR具有比约250nM更强的亲和力的多肽时，脑暴露大体上缩短。
如图19中所示，当治疗剂键联至对TfR具有相对更强的亲和力的多肽时，在脑中观测到更高的最大浓度(C最大)。特别地，当TfR结合性多肽具有比约250nM更强的亲和力时，脑C最大值显著更高。
图20示出了当键联至对TfR具有一系列亲和力的多肽时脑C最大与治疗剂的血浆浓度的比率。
方法
TfRms/hu KI的产生
产生敲入/敲出小鼠的方法已公布于文献中并且为本领域技术人员熟知的。概括地说，使用CRISPR/Cas9技术产生TfRms/hu KI小鼠以表达鼠Tfrc基因内的人Tfrc顶端结构域；使所得嵌合TfR在内源性启动子的控制下在体内表达。如以全文引用的方式并入本文中的国际专利公布号WO 2018/152285中所描述，使用C57Bl6小鼠经由原核微量注射至单细胞胚胎中，随后胚胎移植至假妊娠雌性中来产生人顶端TfR小鼠品系的敲入。特别地，将Cas9、单一向导RNA和供体DNA引入胚胎中。供体DNA包含人顶端结构域编码序列，所述人顶端结构域编码序列已针对在小鼠中表达而密码子优化。顶端结构域编码序列侧接左侧和右侧同源臂。将供体序列设计成使得顶端结构域插入第四小鼠外显子之后，并且在3’端紧密侧接第九小鼠外显子。可使来自接受胚胎的雌性的子代的首建雄性(founder male)与野生型雌性繁殖以产生F1杂合子小鼠。然后由培育F1代杂合子小鼠产生纯合子小鼠。
小鼠PK/PD
对于PK/PD评估，经由尾部静脉注射以50mg/kg为TfRms/hu KI小鼠一次性全身给药。在灌注之前，经由心脏穿刺将血液收集于EDTA血浆管中并且在14,000rpm下离心5分钟。然后分离血浆用于后续PK/PD分析。在灌注之后提取脑并且分离半脑用于在10倍组织重量的含1％NP-40的PBS(对于PK)或5M GuHCl(对于PD)中均质化。
使用通用人IgG分析(MSD人IgG试剂盒#K150JLD)遵循制造商的说明书对小鼠血浆和脑溶解产物中的工程化的TfR结合性多肽的浓度进行定量。简单来说，将预包被的板用MSD封闭剂A封闭30分钟。使用Hamilton Nimbus液体处理器将血浆样品1:10,000稀释并且一式两份添加至封闭的板。将脑样品在1％NP-40溶解缓冲液中均质化并且将溶解产物1:10稀释用于PK分析。还在相同板上对给药溶液进行分析以确认恰当剂量。使用四参数罗吉斯回归拟合标准曲线(0.78-200ng/mL IgG)。
实施例13.使用BiacoreTM对CH3C变体的结合表征.
使用BiacoreTMT200仪器通过表面等离子体共振来测定克隆变体对重组TfR顶端结构域的亲和力。将BiacoreTM系列S CM5传感器芯片用抗人Fab(来自GE Healthcare的人Fab捕获药盒)固定。将5μg/mL的IDS-Fc融合蛋白捕获于每个液体池上持续1分钟并且以30μL/min的流速注射人或犬顶端结构域的连续3倍稀释液。在45秒缔合和3分钟解离的情况下对每个样品进行分析。在每次注射之后，使用10mM甘氨酸-HCl(pH 2.1)使芯片再生。通过从捕获类似密度的不相关IgG的液体池扣除RU来校正结合反应。使用BiacoreTMT200评估软件v3.1通过针对浓度对平衡状态下的反应进行拟合来获得稳态亲和力。
为测定克隆变体对重组TfR胞外域(ECD)的亲和力，将BiacoreTM系列S CM5传感器芯片用链霉亲和素固定。将生物素化的人或犬TfR ECD捕获于每个液体池上持续1分钟并且在室温下以30μL/min的流速注射克隆变体的连续3倍稀释液。在45秒缔合和3分钟解离的情况下对每个样品进行分析。通过从不含类似密度的TfR ECD的液体池扣除RU来校正结合反应。使用BiacoreTMT200评估软件v3.1通过针对浓度对平衡状态下的反应进行拟合来获得稳态亲和力。
表6中概括了结合亲和力。通过稳态拟合获得亲和力。
表6.示例性CH3C变体的结合亲和力.
Figure BDA0002461603810001261
Figure BDA0002461603810001271
实施例14.在TfRms/hu小鼠中多肽-Fab融合物的脑和血浆PKPD：CH3C.35.21、CH3C.35.20、CH3C.35、CH3C.35.23、CH3C.35.23.3。
为评估TfR结合亲和力对PK和脑摄入的影响，产生抗BACE1 Ab153和TfR结合性多肽融合物(CH3C.35.21:Ab153、CH3C.35.20:Ab153、CH3C.35:Ab153融合物)，所述融合物如通过BiacoreTM所测量对顶端人TfR的结合亲和力不同。CH3C.35.21:Ab153、CH3C.35.20:Ab153、CH3C.35:Ab153融合物对人TfR的结合亲和力分别为100nM、170nM以及620nM。以50mg/kg为TfRms/hu敲入小鼠全身性施用Ab153或多肽-Fab融合物，并且在给药后1、3以及7天时评估血浆PK和脑PKPD。如上文所描述进行脑和血浆PKPD分析。归因于TfR在外周组织上的表达，与单独Ab153相比，CH3C.35.21:Ab153、CH3C.35.20:Ab153以及CH3C.35:Ab153融合物在血浆中展现更快的清除，这与靶标介导的清除一致并且指示体内TfR结合(图21A)。令人深刻印象的是，与Ab153相比，CH3C.35.21:Ab153、CH3C.35.20:Ab153以及CH3C.35:Ab153融合物的脑浓度显著增加，在给药后1天时与在此相同时间点Ab153的仅约3nM相比，实现超过30nM的最大脑浓度(图21B)。CH3C.35.21:Ab153、CH3C.35.20:Ab153以及CH3C.35:Ab153融合物的脑暴露增加在小鼠脑中产生与给予Ab153的小鼠中的Aβ水平相比低约55-60％的内源性小鼠Aβ水平(图21C)。在脑中保持较低的脑Aβ水平同时剩余的CH3C.35.21:Ab153、CH3C.35.20:Ab153以及CH3C.35:Ab153融合物的浓度升高，并且当到第7天减少暴露时回到类似于Ab153处理的小鼠的水平。脑暴露随时间推移减少与CH3C.35.21:Ab153、CH3C.35.20:Ab153以及CH3C.35:Ab153融合物的外周暴露减少相关联，从而提供清楚的体内PK/PD关系(比较图21A与图21C)。另外，在此单个高剂量后Ab153处理和多肽-Fab融合物处理的小鼠的总脑TfR水平类似，指示多肽-Fab融合物的脑暴露增加对脑中的TfR表达无显著影响(图21D)。
在有差异的情况下，表格(例如表5)中描述的每个克隆的氨基酸取代指示所述克隆在登记位置对存在于序列表中所阐述的序列中的氨基酸的氨基酸取代。
应了解，本文所描述的实施例和实施方案仅用于说明性目的，并且将向本领域技术人员建议根据它进行的各种修改或变化，并且所述修改或变化应包括在本申请的精神和权限以及随附权利要求的范围内。本文引用的序列登录号的序列以引用的方式并入本文中。
表4.CH3结构域修饰.
Figure BDA0002461603810001281
Figure BDA0002461603810001291
表5.额外的CH3结构域修饰.
Figure BDA0002461603810001292
Figure BDA0002461603810001301
Figure BDA0002461603810001311
非正式序列表
Figure BDA0002461603810001312
Figure BDA0002461603810001321
Figure BDA0002461603810001331
Figure BDA0002461603810001341
Figure BDA0002461603810001351
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Figure BDA0002461603810001401
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Figure BDA0002461603810001451
Figure BDA0002461603810001461
Figure BDA0002461603810001471
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Figure BDA0002461603810001701
Figure BDA0002461603810001711
Figure BDA0002461603810001721
序列表
<110> 戴纳立制药股份有限公司(DENALI THERAPEUTICS INC.)
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<221> 来源
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<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
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<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
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<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
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<221> 来源
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<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
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<220>
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<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
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<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
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<220>
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<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
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<220>
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340 345 350
Val Ala Thr His Val Pro Leu Ile Phe Tyr Val Pro Gly Arg Thr Ala
355 360 365
Ser Leu Pro Glu Ala Gly Glu Lys Leu Phe Pro Tyr Leu Asp Pro Phe
370 375 380
Asp Ser Ala Ser Gln Leu Met Glu Pro Gly Arg Gln Ser Met Asp Leu
385 390 395 400
Val Glu Leu Val Ser Leu Phe Pro Thr Leu Ala Gly Leu Ala Gly Leu
405 410 415
Gln Val Pro Pro Arg Cys Pro Val Pro Ser Phe His Val Glu Leu Cys
420 425 430
Arg Glu Gly Lys Asn Leu Leu Lys His Phe Arg Phe Arg Asp Leu Glu
435 440 445
Glu Asp Pro Tyr Leu Pro Gly Asn Pro Arg Glu Leu Ile Ala Tyr Ser
450 455 460
Gln Tyr Pro Arg Pro Ser Asp Ile Pro Gln Trp Asn Ser Asp Lys Pro
465 470 475 480
Ser Leu Lys Asp Ile Lys Ile Met Gly Tyr Ser Ile Arg Thr Ile Asp
485 490 495
Tyr Arg Tyr Thr Val Trp Val Gly Phe Asn Pro Asp Glu Phe Leu Ala
500 505 510
Asn Phe Ser Asp Ile His Ala Gly Glu Leu Tyr Phe Val Asp Ser Asp
515 520 525
Pro Leu Gln Asp His Asn Met Tyr Asn Asp Ser Gln Gly Gly Asp Leu
530 535 540
Phe Gln Leu Leu Met Pro
545 550
<210> 92
<211> 517
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 92
Thr Asp Ala Leu Asn Val Leu Leu Ile Ile Val Asp Asp Leu Arg Pro
1 5 10 15
Ser Leu Gly Cys Tyr Gly Asp Lys Leu Val Arg Ser Pro Asn Ile Asp
20 25 30
Gln Leu Ala Ser His Ser Leu Leu Phe Gln Asn Ala Phe Ala Gln Gln
35 40 45
Ala Val Cys Ala Pro Ser Arg Val Ser Phe Leu Thr Gly Arg Arg Pro
50 55 60
Asp Thr Thr Arg Leu Tyr Asp Phe Asn Ser Tyr Trp Arg Val His Ala
65 70 75 80
Gly Asn Phe Ser Thr Ile Pro Gln Tyr Phe Lys Glu Asn Gly Tyr Val
85 90 95
Thr Met Ser Val Gly Lys Val Phe His Pro Gly Ile Ser Ser Asn His
100 105 110
Thr Asp Asp Ser Pro Tyr Ser Trp Ser Phe Pro Pro Tyr His Pro Ser
115 120 125
Ser Glu Lys Tyr Glu Asn Thr Lys Thr Cys Arg Gly Pro Asp Gly Glu
130 135 140
Leu His Ala Asn Leu Leu Cys Pro Val Asp Val Leu Asp Val Pro Glu
145 150 155 160
Gly Thr Leu Pro Asp Lys Gln Ser Thr Glu Gln Ala Ile Gln Leu Leu
165 170 175
Glu Lys Met Lys Thr Ser Ala Ser Pro Phe Phe Leu Ala Val Gly Tyr
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His Lys Pro His Ile Pro Phe Arg Tyr Pro Lys Glu Phe Gln Lys Leu
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210 215 220
Gly Leu Pro Pro Val Ala Tyr Asn Pro Trp Met Asp Ile Arg Gln Arg
225 230 235 240
Glu Asp Val Gln Ala Leu Asn Ile Ser Val Pro Tyr Gly Pro Ile Pro
245 250 255
Val Asp Phe Gln Arg Lys Ile Arg Gln Ser Tyr Phe Ala Ser Val Ser
260 265 270
Tyr Leu Asp Thr Gln Val Gly Arg Leu Leu Ser Ala Leu Asp Asp Leu
275 280 285
Gln Leu Ala Asn Ser Thr Ile Ile Ala Phe Thr Ser Asp His Gly Trp
290 295 300
Ala Leu Gly Glu His Gly Glu Trp Ala Lys Tyr Ser Asn Phe Asp Val
305 310 315 320
Ala Thr His Val Pro Leu Ile Phe Tyr Val Pro Gly Arg Thr Ala Ser
325 330 335
Leu Pro Glu Ala Gly Glu Lys Leu Phe Pro Tyr Leu Asp Pro Phe Asp
340 345 350
Ser Ala Ser Gln Leu Met Glu Pro Gly Arg Gln Ser Met Asp Leu Val
355 360 365
Glu Leu Val Ser Leu Phe Pro Thr Leu Ala Gly Leu Ala Gly Leu Gln
370 375 380
Val Pro Pro Arg Cys Pro Val Pro Ser Phe His Val Glu Leu Cys Arg
385 390 395 400
Glu Gly Lys Asn Leu Leu Lys His Phe Arg Phe Arg Asp Leu Glu Glu
405 410 415
Asp Pro Tyr Leu Pro Gly Asn Pro Arg Glu Leu Ile Ala Tyr Ser Gln
420 425 430
Tyr Pro Arg Pro Ser Asp Ile Pro Gln Trp Asn Ser Asp Lys Pro Ser
435 440 445
Leu Lys Asp Ile Lys Ile Met Gly Tyr Ser Ile Arg Thr Ile Asp Tyr
450 455 460
Arg Tyr Thr Val Trp Val Gly Phe Asn Pro Asp Glu Phe Leu Ala Asn
465 470 475 480
Phe Ser Asp Ile His Ala Gly Glu Leu Tyr Phe Val Asp Ser Asp Pro
485 490 495
Leu Gln Asp His Asn Met Tyr Asn Asp Ser Gln Gly Gly Asp Leu Phe
500 505 510
Gln Leu Leu Met Pro
515
<210> 93
<211> 536
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 93
Met Glu Phe Ser Ser Pro Ser Arg Glu Glu Cys Pro Lys Pro Leu Ser
1 5 10 15
Arg Val Ser Ile Met Ala Gly Ser Leu Thr Gly Leu Leu Leu Leu Gln
20 25 30
Ala Val Ser Trp Ala Ser Gly Ala Arg Pro Cys Ile Pro Lys Ser Phe
35 40 45
Gly Tyr Ser Ser Val Val Cys Val Cys Asn Ala Thr Tyr Cys Asp Ser
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Ser Thr Arg Ser Gly Arg Arg Met Glu Leu Ser Met Gly Pro Ile Gln
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Lys Phe Gln Lys Val Lys Gly Phe Gly Gly Ala Met Thr Asp Ala Ala
115 120 125
Ala Leu Asn Ile Leu Ala Leu Ser Pro Pro Ala Gln Asn Leu Leu Leu
130 135 140
Lys Ser Tyr Phe Ser Glu Glu Gly Ile Gly Tyr Asn Ile Ile Arg Val
145 150 155 160
Pro Met Ala Ser Cys Asp Phe Ser Ile Arg Thr Tyr Thr Tyr Ala Asp
165 170 175
Thr Pro Asp Asp Phe Gln Leu His Asn Phe Ser Leu Pro Glu Glu Asp
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Thr Lys Leu Lys Ile Pro Leu Ile His Arg Ala Leu Gln Leu Ala Gln
195 200 205
Arg Pro Val Ser Leu Leu Ala Ser Pro Trp Thr Ser Pro Thr Trp Leu
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225 230 235 240
Gly Asp Ile Tyr His Gln Thr Trp Ala Arg Tyr Phe Val Lys Phe Leu
245 250 255
Asp Ala Tyr Ala Glu His Lys Leu Gln Phe Trp Ala Val Thr Ala Glu
260 265 270
Asn Glu Pro Ser Ala Gly Leu Leu Ser Gly Tyr Pro Phe Gln Cys Leu
275 280 285
Gly Phe Thr Pro Glu His Gln Arg Asp Phe Ile Ala Arg Asp Leu Gly
290 295 300
Pro Thr Leu Ala Asn Ser Thr His His Asn Val Arg Leu Leu Met Leu
305 310 315 320
Asp Asp Gln Arg Leu Leu Leu Pro His Trp Ala Lys Val Val Leu Thr
325 330 335
Asp Pro Glu Ala Ala Lys Tyr Val His Gly Ile Ala Val His Trp Tyr
340 345 350
Leu Asp Phe Leu Ala Pro Ala Lys Ala Thr Leu Gly Glu Thr His Arg
355 360 365
Leu Phe Pro Asn Thr Met Leu Phe Ala Ser Glu Ala Cys Val Gly Ser
370 375 380
Lys Phe Trp Glu Gln Ser Val Arg Leu Gly Ser Trp Asp Arg Gly Met
385 390 395 400
Gln Tyr Ser His Ser Ile Ile Thr Asn Leu Leu Tyr His Val Val Gly
405 410 415
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420 425 430
Val Arg Asn Phe Val Asp Ser Pro Ile Ile Val Asp Ile Thr Lys Asp
435 440 445
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450 455 460
Phe Ile Pro Glu Gly Ser Gln Arg Val Gly Leu Val Ala Ser Gln Lys
465 470 475 480
Asn Asp Leu Asp Ala Val Ala Leu Met His Pro Asp Gly Ser Ala Val
485 490 495
Val Val Val Leu Asn Arg Ser Ser Lys Asp Val Pro Leu Thr Ile Lys
500 505 510
Asp Pro Ala Val Gly Phe Leu Glu Thr Ile Ser Pro Gly Tyr Ser Ile
515 520 525
His Thr Tyr Leu Trp Arg Arg Gln
530 535
<210> 94
<211> 497
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 94
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Val Cys Asn Ala Thr Tyr Cys Asp Ser Phe Asp Pro Pro Thr Phe Pro
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50 55 60
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Phe Gly Gly Ala Met Thr Asp Ala Ala Ala Leu Asn Ile Leu Ala Leu
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100 105 110
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Ser Ile Arg Thr Tyr Thr Tyr Ala Asp Thr Pro Asp Asp Phe Gln Leu
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His Asn Phe Ser Leu Pro Glu Glu Asp Thr Lys Leu Lys Ile Pro Leu
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Ile His Arg Ala Leu Gln Leu Ala Gln Arg Pro Val Ser Leu Leu Ala
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Gly Lys Gly Ser Leu Lys Gly Gln Pro Gly Asp Ile Tyr His Gln Thr
195 200 205
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210 215 220
Leu Gln Phe Trp Ala Val Thr Ala Glu Asn Glu Pro Ser Ala Gly Leu
225 230 235 240
Leu Ser Gly Tyr Pro Phe Gln Cys Leu Gly Phe Thr Pro Glu His Gln
245 250 255
Arg Asp Phe Ile Ala Arg Asp Leu Gly Pro Thr Leu Ala Asn Ser Thr
260 265 270
His His Asn Val Arg Leu Leu Met Leu Asp Asp Gln Arg Leu Leu Leu
275 280 285
Pro His Trp Ala Lys Val Val Leu Thr Asp Pro Glu Ala Ala Lys Tyr
290 295 300
Val His Gly Ile Ala Val His Trp Tyr Leu Asp Phe Leu Ala Pro Ala
305 310 315 320
Lys Ala Thr Leu Gly Glu Thr His Arg Leu Phe Pro Asn Thr Met Leu
325 330 335
Phe Ala Ser Glu Ala Cys Val Gly Ser Lys Phe Trp Glu Gln Ser Val
340 345 350
Arg Leu Gly Ser Trp Asp Arg Gly Met Gln Tyr Ser His Ser Ile Ile
355 360 365
Thr Asn Leu Leu Tyr His Val Val Gly Trp Thr Asp Trp Asn Leu Ala
370 375 380
Leu Asn Pro Glu Gly Gly Pro Asn Trp Val Arg Asn Phe Val Asp Ser
385 390 395 400
Pro Ile Ile Val Asp Ile Thr Lys Asp Thr Phe Tyr Lys Gln Pro Met
405 410 415
Phe Tyr His Leu Gly His Phe Ser Lys Phe Ile Pro Glu Gly Ser Gln
420 425 430
Arg Val Gly Leu Val Ala Ser Gln Lys Asn Asp Leu Asp Ala Val Ala
435 440 445
Leu Met His Pro Asp Gly Ser Ala Val Val Val Val Leu Asn Arg Ser
450 455 460
Ser Lys Asp Val Pro Leu Thr Ile Lys Asp Pro Ala Val Gly Phe Leu
465 470 475 480
Glu Thr Ile Ser Pro Gly Tyr Ser Ile His Thr Tyr Leu Trp Arg Arg
485 490 495
Gln
<210> 95
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 95
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10 15
<210> 96
<211> 760
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 96
Met Met Asp Gln Ala Arg Ser Ala Phe Ser Asn Leu Phe Gly Gly Glu
1 5 10 15
Pro Leu Ser Tyr Thr Arg Phe Ser Leu Ala Arg Gln Val Asp Gly Asp
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Asn Ser His Val Glu Met Lys Leu Ala Val Asp Glu Glu Glu Asn Ala
35 40 45
Asp Asn Asn Thr Lys Ala Asn Val Thr Lys Pro Lys Arg Cys Ser Gly
50 55 60
Ser Ile Cys Tyr Gly Thr Ile Ala Val Ile Val Phe Phe Leu Ile Gly
65 70 75 80
Phe Met Ile Gly Tyr Leu Gly Tyr Cys Lys Gly Val Glu Pro Lys Thr
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Gly Glu Asp Phe Pro Ala Ala Arg Arg Leu Tyr Trp Asp Asp Leu Lys
115 120 125
Arg Lys Leu Ser Glu Lys Leu Asp Ser Thr Asp Phe Thr Gly Thr Ile
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Lys Leu Leu Asn Glu Asn Ser Tyr Val Pro Arg Glu Ala Gly Ser Gln
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Lys Asp Glu Asn Leu Ala Leu Tyr Val Glu Asn Gln Phe Arg Glu Phe
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Lys Leu Ser Lys Val Trp Arg Asp Gln His Phe Val Lys Ile Gln Val
180 185 190
Lys Asp Ser Ala Gln Asn Ser Val Ile Ile Val Asp Lys Asn Gly Arg
195 200 205
Leu Val Tyr Leu Val Glu Asn Pro Gly Gly Tyr Val Ala Tyr Ser Lys
210 215 220
Ala Ala Thr Val Thr Gly Lys Leu Val His Ala Asn Phe Gly Thr Lys
225 230 235 240
Lys Asp Phe Glu Asp Leu Tyr Thr Pro Val Asn Gly Ser Ile Val Ile
245 250 255
Val Arg Ala Gly Lys Ile Thr Phe Ala Glu Lys Val Ala Asn Ala Glu
260 265 270
Ser Leu Asn Ala Ile Gly Val Leu Ile Tyr Met Asp Gln Thr Lys Phe
275 280 285
Pro Ile Val Asn Ala Glu Leu Ser Phe Phe Gly His Ala His Leu Gly
290 295 300
Thr Gly Asp Pro Tyr Thr Pro Gly Phe Pro Ser Phe Asn His Thr Gln
305 310 315 320
Phe Pro Pro Ser Arg Ser Ser Gly Leu Pro Asn Ile Pro Val Gln Thr
325 330 335
Ile Ser Arg Ala Ala Ala Glu Lys Leu Phe Gly Asn Met Glu Gly Asp
340 345 350
Cys Pro Ser Asp Trp Lys Thr Asp Ser Thr Cys Arg Met Val Thr Ser
355 360 365
Glu Ser Lys Asn Val Lys Leu Thr Val Ser Asn Val Leu Lys Glu Ile
370 375 380
Lys Ile Leu Asn Ile Phe Gly Val Ile Lys Gly Phe Val Glu Pro Asp
385 390 395 400
His Tyr Val Val Val Gly Ala Gln Arg Asp Ala Trp Gly Pro Gly Ala
405 410 415
Ala Lys Ser Gly Val Gly Thr Ala Leu Leu Leu Lys Leu Ala Gln Met
420 425 430
Phe Ser Asp Met Val Leu Lys Asp Gly Phe Gln Pro Ser Arg Ser Ile
435 440 445
Ile Phe Ala Ser Trp Ser Ala Gly Asp Phe Gly Ser Val Gly Ala Thr
450 455 460
Glu Trp Leu Glu Gly Tyr Leu Ser Ser Leu His Leu Lys Ala Phe Thr
465 470 475 480
Tyr Ile Asn Leu Asp Lys Ala Val Leu Gly Thr Ser Asn Phe Lys Val
485 490 495
Ser Ala Ser Pro Leu Leu Tyr Thr Leu Ile Glu Lys Thr Met Gln Asn
500 505 510
Val Lys His Pro Val Thr Gly Gln Phe Leu Tyr Gln Asp Ser Asn Trp
515 520 525
Ala Ser Lys Val Glu Lys Leu Thr Leu Asp Asn Ala Ala Phe Pro Phe
530 535 540
Leu Ala Tyr Ser Gly Ile Pro Ala Val Ser Phe Cys Phe Cys Glu Asp
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Thr Asp Tyr Pro Tyr Leu Gly Thr Thr Met Asp Thr Tyr Lys Glu Leu
565 570 575
Ile Glu Arg Ile Pro Glu Leu Asn Lys Val Ala Arg Ala Ala Ala Glu
580 585 590
Val Ala Gly Gln Phe Val Ile Lys Leu Thr His Asp Val Glu Leu Asn
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Leu Asp Tyr Glu Arg Tyr Asn Ser Gln Leu Leu Ser Phe Val Arg Asp
610 615 620
Leu Asn Gln Tyr Arg Ala Asp Ile Lys Glu Met Gly Leu Ser Leu Gln
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Trp Leu Tyr Ser Ala Arg Gly Asp Phe Phe Arg Ala Thr Ser Arg Leu
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Thr Thr Asp Phe Gly Asn Ala Glu Lys Thr Asp Arg Phe Val Met Lys
660 665 670
Lys Leu Asn Asp Arg Val Met Arg Val Glu Tyr His Phe Leu Ser Pro
675 680 685
Tyr Val Ser Pro Lys Glu Ser Pro Phe Arg His Val Phe Trp Gly Ser
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Gly Ser His Thr Leu Pro Ala Leu Leu Glu Asn Leu Lys Leu Arg Lys
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Gln Asn Asn Gly Ala Phe Asn Glu Thr Leu Phe Arg Asn Gln Leu Ala
725 730 735
Leu Ala Thr Trp Thr Ile Gln Gly Ala Ala Asn Ala Leu Ser Gly Asp
740 745 750
Val Trp Asp Ile Asp Asn Glu Phe
755 760
<210> 97
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 97
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
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Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
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Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Trp Trp Glu Ser Tyr Gly Thr Glu Trp Ser Ser
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Thr Lys Glu Glu Trp Gln Gln Gly Phe Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215
<210> 98
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 98
Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
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Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
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Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
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Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
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Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
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Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
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Tyr Ser Lys Leu Thr Val Thr Lys Glu Glu Trp Gln Gln Gly Phe Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
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Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215
<210> 99
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 99
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
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Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val
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Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
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Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
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Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
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Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
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Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
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Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
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Tyr Ser Lys Leu Thr Val Thr Lys Glu Glu Trp Gln Gln Gly Phe Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215
<210> 100
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 100
Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val
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Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
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Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
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Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215
<210> 101
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 101
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
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Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
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Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
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65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
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Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
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130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
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Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
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Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215
<210> 102
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 102
Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
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Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
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Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
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Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215
<210> 103
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 103
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215
<210> 104
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 104
Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215
<210> 105
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 105
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Trp Trp Glu Ser Tyr Gly Thr Glu Trp Ser Ser
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Val Ser Lys Leu Thr Val Thr Lys Glu Glu Trp Gln Gln Gly Phe Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215
<210> 106
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 106
Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Trp Trp Glu Ser Tyr Gly Thr Glu Trp Ser Ser
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Val Ser Lys Leu Thr Val Thr Lys Glu Glu Trp Gln Gln Gly Phe Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215
<210> 107
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 107
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Trp Trp Glu Ser Tyr Gly Thr Glu Trp Ser Ser
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Val Ser Lys Leu Thr Val Thr Lys Glu Glu Trp Gln Gln Gly Phe Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215
<210> 108
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 108
Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Trp Trp Glu Ser Tyr Gly Thr Glu Trp Ser Ser
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Val Ser Lys Leu Thr Val Thr Lys Glu Glu Trp Gln Gln Gly Phe Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215
<210> 109
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 109
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215
<210> 110
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 110
Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215
<210> 111
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 111
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215
<210> 112
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 112
Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215
<210> 113
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 113
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 114
<211> 525
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<221> 变体
<222> (59)..(59)
<223> /替换=“甲酰甘氨酸”
<220>
<221> 位点
<222> (1)..(525)
<223> /注释=
<400> 114
Ser Glu Thr Gln Ala Asn Ser Thr Thr Asp Ala Leu Asn Val Leu Leu
1 5 10 15
Ile Ile Val Asp Asp Leu Arg Pro Ser Leu Gly Cys Tyr Gly Asp Lys
20 25 30
Leu Val Arg Ser Pro Asn Ile Asp Gln Leu Ala Ser His Ser Leu Leu
35 40 45
Phe Gln Asn Ala Phe Ala Gln Gln Ala Val Cys Ala Pro Ser Arg Val
50 55 60
Ser Phe Leu Thr Gly Arg Arg Pro Asp Thr Thr Arg Leu Tyr Asp Phe
65 70 75 80
Asn Ser Tyr Trp Arg Val His Ala Gly Asn Phe Ser Thr Ile Pro Gln
85 90 95
Tyr Phe Lys Glu Asn Gly Tyr Val Thr Met Ser Val Gly Lys Val Phe
100 105 110
His Pro Gly Ile Ser Ser Asn His Thr Asp Asp Ser Pro Tyr Ser Trp
115 120 125
Ser Phe Pro Pro Tyr His Pro Ser Ser Glu Lys Tyr Glu Asn Thr Lys
130 135 140
Thr Cys Arg Gly Pro Asp Gly Glu Leu His Ala Asn Leu Leu Cys Pro
145 150 155 160
Val Asp Val Leu Asp Val Pro Glu Gly Thr Leu Pro Asp Lys Gln Ser
165 170 175
Thr Glu Gln Ala Ile Gln Leu Leu Glu Lys Met Lys Thr Ser Ala Ser
180 185 190
Pro Phe Phe Leu Ala Val Gly Tyr His Lys Pro His Ile Pro Phe Arg
195 200 205
Tyr Pro Lys Glu Phe Gln Lys Leu Tyr Pro Leu Glu Asn Ile Thr Leu
210 215 220
Ala Pro Asp Pro Glu Val Pro Asp Gly Leu Pro Pro Val Ala Tyr Asn
225 230 235 240
Pro Trp Met Asp Ile Arg Gln Arg Glu Asp Val Gln Ala Leu Asn Ile
245 250 255
Ser Val Pro Tyr Gly Pro Ile Pro Val Asp Phe Gln Arg Lys Ile Arg
260 265 270
Gln Ser Tyr Phe Ala Ser Val Ser Tyr Leu Asp Thr Gln Val Gly Arg
275 280 285
Leu Leu Ser Ala Leu Asp Asp Leu Gln Leu Ala Asn Ser Thr Ile Ile
290 295 300
Ala Phe Thr Ser Asp His Gly Trp Ala Leu Gly Glu His Gly Glu Trp
305 310 315 320
Ala Lys Tyr Ser Asn Phe Asp Val Ala Thr His Val Pro Leu Ile Phe
325 330 335
Tyr Val Pro Gly Arg Thr Ala Ser Leu Pro Glu Ala Gly Glu Lys Leu
340 345 350
Phe Pro Tyr Leu Asp Pro Phe Asp Ser Ala Ser Gln Leu Met Glu Pro
355 360 365
Gly Arg Gln Ser Met Asp Leu Val Glu Leu Val Ser Leu Phe Pro Thr
370 375 380
Leu Ala Gly Leu Ala Gly Leu Gln Val Pro Pro Arg Cys Pro Val Pro
385 390 395 400
Ser Phe His Val Glu Leu Cys Arg Glu Gly Lys Asn Leu Leu Lys His
405 410 415
Phe Arg Phe Arg Asp Leu Glu Glu Asp Pro Tyr Leu Pro Gly Asn Pro
420 425 430
Arg Glu Leu Ile Ala Tyr Ser Gln Tyr Pro Arg Pro Ser Asp Ile Pro
435 440 445
Gln Trp Asn Ser Asp Lys Pro Ser Leu Lys Asp Ile Lys Ile Met Gly
450 455 460
Tyr Ser Ile Arg Thr Ile Asp Tyr Arg Tyr Thr Val Trp Val Gly Phe
465 470 475 480
Asn Pro Asp Glu Phe Leu Ala Asn Phe Ser Asp Ile His Ala Gly Glu
485 490 495
Leu Tyr Phe Val Asp Ser Asp Pro Leu Gln Asp His Asn Met Tyr Asn
500 505 510
Asp Ser Gln Gly Gly Asp Leu Phe Gln Leu Leu Met Pro
515 520 525
<210> 115
<211> 757
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<220>
<221> 变体
<222> (59)..(59)
<223> /替换=“甲酰甘氨酸”
<220>
<221> 位点
<222> (1)..(757)
<223> /注释=“序列中给出的变体残基相对于针对变体位置的注释中的那些残基没有优先性”
<400> 115
Ser Glu Thr Gln Ala Asn Ser Thr Thr Asp Ala Leu Asn Val Leu Leu
1 5 10 15
Ile Ile Val Asp Asp Leu Arg Pro Ser Leu Gly Cys Tyr Gly Asp Lys
20 25 30
Leu Val Arg Ser Pro Asn Ile Asp Gln Leu Ala Ser His Ser Leu Leu
35 40 45
Phe Gln Asn Ala Phe Ala Gln Gln Ala Val Cys Ala Pro Ser Arg Val
50 55 60
Ser Phe Leu Thr Gly Arg Arg Pro Asp Thr Thr Arg Leu Tyr Asp Phe
65 70 75 80
Asn Ser Tyr Trp Arg Val His Ala Gly Asn Phe Ser Thr Ile Pro Gln
85 90 95
Tyr Phe Lys Glu Asn Gly Tyr Val Thr Met Ser Val Gly Lys Val Phe
100 105 110
His Pro Gly Ile Ser Ser Asn His Thr Asp Asp Ser Pro Tyr Ser Trp
115 120 125
Ser Phe Pro Pro Tyr His Pro Ser Ser Glu Lys Tyr Glu Asn Thr Lys
130 135 140
Thr Cys Arg Gly Pro Asp Gly Glu Leu His Ala Asn Leu Leu Cys Pro
145 150 155 160
Val Asp Val Leu Asp Val Pro Glu Gly Thr Leu Pro Asp Lys Gln Ser
165 170 175
Thr Glu Gln Ala Ile Gln Leu Leu Glu Lys Met Lys Thr Ser Ala Ser
180 185 190
Pro Phe Phe Leu Ala Val Gly Tyr His Lys Pro His Ile Pro Phe Arg
195 200 205
Tyr Pro Lys Glu Phe Gln Lys Leu Tyr Pro Leu Glu Asn Ile Thr Leu
210 215 220
Ala Pro Asp Pro Glu Val Pro Asp Gly Leu Pro Pro Val Ala Tyr Asn
225 230 235 240
Pro Trp Met Asp Ile Arg Gln Arg Glu Asp Val Gln Ala Leu Asn Ile
245 250 255
Ser Val Pro Tyr Gly Pro Ile Pro Val Asp Phe Gln Arg Lys Ile Arg
260 265 270
Gln Ser Tyr Phe Ala Ser Val Ser Tyr Leu Asp Thr Gln Val Gly Arg
275 280 285
Leu Leu Ser Ala Leu Asp Asp Leu Gln Leu Ala Asn Ser Thr Ile Ile
290 295 300
Ala Phe Thr Ser Asp His Gly Trp Ala Leu Gly Glu His Gly Glu Trp
305 310 315 320
Ala Lys Tyr Ser Asn Phe Asp Val Ala Thr His Val Pro Leu Ile Phe
325 330 335
Tyr Val Pro Gly Arg Thr Ala Ser Leu Pro Glu Ala Gly Glu Lys Leu
340 345 350
Phe Pro Tyr Leu Asp Pro Phe Asp Ser Ala Ser Gln Leu Met Glu Pro
355 360 365
Gly Arg Gln Ser Met Asp Leu Val Glu Leu Val Ser Leu Phe Pro Thr
370 375 380
Leu Ala Gly Leu Ala Gly Leu Gln Val Pro Pro Arg Cys Pro Val Pro
385 390 395 400
Ser Phe His Val Glu Leu Cys Arg Glu Gly Lys Asn Leu Leu Lys His
405 410 415
Phe Arg Phe Arg Asp Leu Glu Glu Asp Pro Tyr Leu Pro Gly Asn Pro
420 425 430
Arg Glu Leu Ile Ala Tyr Ser Gln Tyr Pro Arg Pro Ser Asp Ile Pro
435 440 445
Gln Trp Asn Ser Asp Lys Pro Ser Leu Lys Asp Ile Lys Ile Met Gly
450 455 460
Tyr Ser Ile Arg Thr Ile Asp Tyr Arg Tyr Thr Val Trp Val Gly Phe
465 470 475 480
Asn Pro Asp Glu Phe Leu Ala Asn Phe Ser Asp Ile His Ala Gly Glu
485 490 495
Leu Tyr Phe Val Asp Ser Asp Pro Leu Gln Asp His Asn Met Tyr Asn
500 505 510
Asp Ser Gln Gly Gly Asp Leu Phe Gln Leu Leu Met Pro Gly Gly Gly
515 520 525
Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala
530 535 540
Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
545 550 555 560
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
565 570 575
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
580 585 590
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
595 600 605
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
610 615 620
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
625 630 635 640
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
645 650 655
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
660 665 670
Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
675 680 685
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
690 695 700
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu
705 710 715 720
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
725 730 735
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
740 745 750
Leu Ser Pro Gly Lys
755
<210> 116
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 116
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
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Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
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130 135 140
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Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Thr Lys Glu Glu Trp Gln Gln Gly Phe Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 117
<211> 757
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<220>
<221> 变体
<222> (59)..(59)
<223> /替换=“甲酰甘氨酸”
<220>
<221> 位点
<222> (1)..(757)
<223> /注释=“序列中给出的变体残基相对于针对变体位置的注释中的那些残基没有优先性”
<400> 117
Ser Glu Thr Gln Ala Asn Ser Thr Thr Asp Ala Leu Asn Val Leu Leu
1 5 10 15
Ile Ile Val Asp Asp Leu Arg Pro Ser Leu Gly Cys Tyr Gly Asp Lys
20 25 30
Leu Val Arg Ser Pro Asn Ile Asp Gln Leu Ala Ser His Ser Leu Leu
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Asn Ser Tyr Trp Arg Val His Ala Gly Asn Phe Ser Thr Ile Pro Gln
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
Pro Trp Met Asp Ile Arg Gln Arg Glu Asp Val Gln Ala Leu Asn Ile
245 250 255
Ser Val Pro Tyr Gly Pro Ile Pro Val Asp Phe Gln Arg Lys Ile Arg
260 265 270
Gln Ser Tyr Phe Ala Ser Val Ser Tyr Leu Asp Thr Gln Val Gly Arg
275 280 285
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Leu Ser Pro Gly Lys
755
<210> 118
<211> 757
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<220>
<221> 变体
<222> (59)..(59)
<223> /替换=“甲酰甘氨酸”
<220>
<221> 位点
<222> (1)..(757)
<223> /注释=“序列中给出的变体残基相对于针对变体位置的注释中的那些残基没有优先性”
<400> 118
Ser Glu Thr Gln Ala Asn Ser Thr Thr Asp Ala Leu Asn Val Leu Leu
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Ile Ile Val Asp Asp Leu Arg Pro Ser Leu Gly Cys Tyr Gly Asp Lys
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Leu Val Arg Ser Pro Asn Ile Asp Gln Leu Ala Ser His Ser Leu Leu
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660 665 670
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690 695 700
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755
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 119
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 121
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35 40 45
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Pro Pro Ala Pro Gly Ala Pro Val Ser Arg Ile Leu Phe Leu Thr Asp
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Leu His Trp Asp His Asp Tyr Leu Glu Gly Thr Asp Pro Asp Cys Ala
165 170 175
Asp Pro Leu Cys Cys Arg Arg Gly Ser Gly Leu Pro Pro Ala Ser Arg
180 185 190
Pro Gly Ala Gly Tyr Trp Gly Glu Tyr Ser Lys Cys Asp Leu Pro Leu
195 200 205
Arg Thr Leu Glu Ser Leu Leu Ser Gly Leu Gly Pro Ala Gly Pro Phe
210 215 220
Asp Met Val Tyr Trp Thr Gly Asp Ile Pro Ala His Asp Val Trp His
225 230 235 240
Gln Thr Arg Gln Asp Gln Leu Arg Ala Leu Thr Thr Val Thr Ala Leu
245 250 255
Val Arg Lys Phe Leu Gly Pro Val Pro Val Tyr Pro Ala Val Gly Asn
260 265 270
His Glu Ser Thr Pro Val Asn Ser Phe Pro Pro Pro Phe Ile Glu Gly
275 280 285
Asn His Ser Ser Arg Trp Leu Tyr Glu Ala Met Ala Lys Ala Trp Glu
290 295 300
Pro Trp Leu Pro Ala Glu Ala Leu Arg Thr Leu Arg Ile Gly Gly Phe
305 310 315 320
Tyr Ala Leu Ser Pro Tyr Pro Gly Leu Arg Leu Ile Ser Leu Asn Met
325 330 335
Asn Phe Cys Ser Arg Glu Asn Phe Trp Leu Leu Ile Asn Ser Thr Asp
340 345 350
Pro Ala Gly Gln Leu Gln Trp Leu Val Gly Glu Leu Gln Ala Ala Glu
355 360 365
Asp Arg Gly Asp Lys Val His Ile Ile Gly His Ile Pro Pro Gly His
370 375 380
Cys Leu Lys Ser Trp Ser Trp Asn Tyr Tyr Arg Ile Val Ala Arg Tyr
385 390 395 400
Glu Asn Thr Leu Ala Ala Gln Phe Phe Gly His Thr His Val Asp Glu
405 410 415
Phe Glu Val Phe Tyr Asp Glu Glu Thr Leu Ser Arg Pro Leu Ala Val
420 425 430
Ala Phe Leu Ala Pro Ser Ala Thr Thr Tyr Ile Gly Leu Asn Pro Gly
435 440 445
Tyr Arg Val Tyr Gln Ile Asp Gly Asn Tyr Ser Gly Ser Ser His Val
450 455 460
Val Leu Asp His Glu Thr Tyr Ile Leu Asn Leu Thr Gln Ala Asn Ile
465 470 475 480
Pro Gly Ala Ile Pro His Trp Gln Leu Leu Tyr Arg Ala Arg Glu Thr
485 490 495
Tyr Gly Leu Pro Asn Thr Leu Pro Thr Ala Trp His Asn Leu Val Tyr
500 505 510
Arg Met Arg Gly Asp Met Gln Leu Phe Gln Thr Phe Trp Phe Leu Tyr
515 520 525
His Lys Gly His Pro Pro Ser Glu Pro Cys Gly Thr Pro Cys Arg Leu
530 535 540
Ala Thr Leu Cys Ala Gln Leu Ser Ala Arg Ala Asp Ser Pro Ala Leu
545 550 555 560
Cys Arg His Leu Met Pro Asp Gly Ser Leu Pro Glu Ala Gln Ser Leu
565 570 575
Trp Pro Arg Pro Leu Phe Cys
580
<210> 123
<211> 574
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 123
Leu Ser Asp Ser Arg Val Leu Trp Ala Pro Ala Glu Ala His Pro Leu
1 5 10 15
Ser Pro Gln Gly His Pro Ala Arg Leu His Arg Ile Val Pro Arg Leu
20 25 30
Arg Asp Val Phe Gly Trp Gly Asn Leu Thr Cys Pro Ile Cys Lys Gly
35 40 45
Leu Phe Thr Ala Ile Asn Leu Gly Leu Lys Lys Glu Pro Asn Val Ala
50 55 60
Arg Val Gly Ser Val Ala Ile Lys Leu Cys Asn Leu Leu Lys Ile Ala
65 70 75 80
Pro Pro Ala Val Cys Gln Ser Ile Val His Leu Phe Glu Asp Asp Met
85 90 95
Val Glu Val Trp Arg Arg Ser Val Leu Ser Pro Ser Glu Ala Cys Gly
100 105 110
Leu Leu Leu Gly Ser Thr Cys Gly His Trp Asp Ile Phe Ser Ser Trp
115 120 125
Asn Ile Ser Leu Pro Thr Val Pro Lys Pro Pro Pro Lys Pro Pro Ser
130 135 140
Pro Pro Ala Pro Gly Ala Pro Val Ser Arg Ile Leu Phe Leu Thr Asp
145 150 155 160
Leu His Trp Asp His Asp Tyr Leu Glu Gly Thr Asp Pro Asp Cys Ala
165 170 175
Asp Pro Leu Cys Cys Arg Arg Gly Ser Gly Leu Pro Pro Ala Ser Arg
180 185 190
Pro Gly Ala Gly Tyr Trp Gly Glu Tyr Ser Lys Cys Asp Leu Pro Leu
195 200 205
Arg Thr Leu Glu Ser Leu Leu Ser Gly Leu Gly Pro Ala Gly Pro Phe
210 215 220
Asp Met Val Tyr Trp Thr Gly Asp Ile Pro Ala His Asp Val Trp His
225 230 235 240
Gln Thr Arg Gln Asp Gln Leu Arg Ala Leu Thr Thr Val Thr Ala Leu
245 250 255
Val Arg Lys Phe Leu Gly Pro Val Pro Val Tyr Pro Ala Val Gly Asn
260 265 270
His Glu Ser Thr Pro Val Asn Ser Phe Pro Pro Pro Phe Ile Glu Gly
275 280 285
Asn His Ser Ser Arg Trp Leu Tyr Glu Ala Met Ala Lys Ala Trp Glu
290 295 300
Pro Trp Leu Pro Ala Glu Ala Leu Arg Thr Leu Arg Ile Gly Gly Phe
305 310 315 320
Tyr Ala Leu Ser Pro Tyr Pro Gly Leu Arg Leu Ile Ser Leu Asn Met
325 330 335
Asn Phe Cys Ser Arg Glu Asn Phe Trp Leu Leu Ile Asn Ser Thr Asp
340 345 350
Pro Ala Gly Gln Leu Gln Trp Leu Val Gly Glu Leu Gln Ala Ala Glu
355 360 365
Asp Arg Gly Asp Lys Val His Ile Ile Gly His Ile Pro Pro Gly His
370 375 380
Cys Leu Lys Ser Trp Ser Trp Asn Tyr Tyr Arg Ile Val Ala Arg Tyr
385 390 395 400
Glu Asn Thr Leu Ala Ala Gln Phe Phe Gly His Thr His Val Asp Glu
405 410 415
Phe Glu Val Phe Tyr Asp Glu Glu Thr Leu Ser Arg Pro Leu Ala Val
420 425 430
Ala Phe Leu Ala Pro Ser Ala Thr Thr Tyr Ile Gly Leu Asn Pro Gly
435 440 445
Tyr Arg Val Tyr Gln Ile Asp Gly Asn Tyr Ser Gly Ser Ser His Val
450 455 460
Val Leu Asp His Glu Thr Tyr Ile Leu Asn Leu Thr Gln Ala Asn Ile
465 470 475 480
Pro Gly Ala Ile Pro His Trp Gln Leu Leu Tyr Arg Ala Arg Glu Thr
485 490 495
Tyr Gly Leu Pro Asn Thr Leu Pro Thr Ala Trp His Asn Leu Val Tyr
500 505 510
Arg Met Arg Gly Asp Met Gln Leu Phe Gln Thr Phe Trp Phe Leu Tyr
515 520 525
His Lys Gly His Pro Pro Ser Glu Pro Cys Gly Thr Pro Cys Arg Leu
530 535 540
Ala Thr Leu Cys Ala Gln Leu Ser Ala Arg Ala Asp Ser Pro Ala Leu
545 550 555 560
Cys Arg His Leu Met Pro Asp Gly Ser Leu Pro Glu Ala Gln
565 570
<210> 124
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 124
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
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115 120 125
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130 135 140
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Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Gly Phe
195 200 205
His Asp Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215
<210> 125
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 125
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
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65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Phe Asp Met Val Thr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Gly Phe
195 200 205
His Asp Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215
<210> 126
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 126
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Phe Glu Tyr Val Thr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Gly Phe
195 200 205
His Asp Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215
<210> 127
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 127
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Phe Glu Met Val Thr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Gly Phe
195 200 205
His Asp Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215
<210> 128
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 128
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Phe Glu Leu Val Thr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Gly Phe
195 200 205
His Asp Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215
<210> 129
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 129
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Glu Phe Ile Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Asp Val Arg Tyr Glu Trp Gln Leu Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
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Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215
<210> 130
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 130
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gly Phe Val Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Pro Val Ser Trp Glu Trp Tyr Trp Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
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Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
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Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
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Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
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Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215
<210> 131
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 131
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
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Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asp Trp Tyr
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Val Asp Gly Val Met Val Arg Arg Glu Trp His Arg Pro Arg Glu Glu
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Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
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Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
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Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
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Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
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Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215
<210> 132
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 132
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
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Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
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Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Ser Phe Glu Trp Tyr
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Val Asp Gly Val Pro Val Arg Trp Glu Trp Gln Trp Pro Arg Glu Glu
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Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215
<210> 133
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 133
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
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Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
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Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Ala Phe Thr Trp Tyr
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Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
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Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
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Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215
<210> 134
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 134
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
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Val Val Asp Pro Gln Thr Pro Pro Trp Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
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Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
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65 70 75 80
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85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
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115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
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165 170 175
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215
<210> 135
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 135
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
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Val Val Asp Pro Pro Ser Pro Pro Trp Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
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Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Glu Tyr Tyr Ser Asn Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
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<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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<220>
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<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
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<220>
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<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 150
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<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
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<210> 203
<211> 217
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 203
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<220>
<221> 来源
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<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
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<220>
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<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
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<220>
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<220>
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<220>
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Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Thr Lys Glu Glu Trp Gln Gln Gly Phe Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215
<210> 219
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 219
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Tyr Gly Thr Glu Trp Ser Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Thr Lys Glu Glu Trp Gln Gln Gly Phe Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215
<210> 220
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 220
Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Tyr Gly Thr Glu Trp Ser Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Thr Lys Glu Glu Trp Gln Gln Gly Phe Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215
<210> 221
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 221
Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Tyr Gly Thr Glu Trp Ser Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Thr Lys Glu Glu Trp Gln Gln Gly Phe Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215
<210> 222
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 222
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Tyr Gly Thr Glu Trp Ser Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Val Ser Lys Leu Thr Val Thr Lys Glu Glu Trp Gln Gln Gly Phe Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215
<210> 223
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 223
Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Tyr Gly Thr Glu Trp Ser Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Val Ser Lys Leu Thr Val Thr Lys Glu Glu Trp Gln Gln Gly Phe Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215
<210> 224
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 224
Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Tyr Gly Thr Glu Trp Ser Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Val Ser Lys Leu Thr Val Thr Lys Glu Glu Trp Gln Gln Gly Phe Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215
<210> 225
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 225
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Tyr Gly Thr Glu Trp Ser Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Val Ser Lys Leu Thr Val Thr Lys Glu Glu Trp Gln Gln Gly Phe Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215
<210> 226
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 226
Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Tyr Gly Thr Glu Trp Ser Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Val Ser Lys Leu Thr Val Thr Lys Glu Glu Trp Gln Gln Gly Phe Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215
<210> 227
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 227
Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Tyr Gly Thr Glu Trp Ser Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Val Ser Lys Leu Thr Val Thr Lys Glu Glu Trp Gln Gln Gly Phe Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215
<210> 228
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 228
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Leu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Tyr Gly Thr Glu Trp Ala Ser Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Thr Lys Glu Glu Trp Gln Gln Gly Phe Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 229
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 229
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Tyr Gly Thr Glu Trp Ala Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Thr Lys Glu Glu Trp Gln Gln Gly Phe Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 230
<211> 525
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 230
Ser Glu Thr Gln Ala Asn Ser Thr Thr Asp Ala Leu Asn Val Leu Leu
1 5 10 15
Ile Ile Val Asp Asp Leu Arg Pro Ser Leu Gly Cys Tyr Gly Asp Lys
20 25 30
Leu Val Arg Ser Pro Asn Ile Asp Gln Leu Ala Ser His Ser Leu Leu
35 40 45
Phe Gln Asn Ala Phe Ala Gln Gln Ala Val Cys Ala Pro Ser Arg Val
50 55 60
Ser Phe Leu Thr Gly Arg Arg Pro Asp Thr Thr Arg Leu Tyr Asp Phe
65 70 75 80
Asn Ser Tyr Trp Arg Val His Ala Gly Asn Phe Ser Thr Ile Pro Gln
85 90 95
Tyr Phe Lys Glu Asn Gly Tyr Val Thr Met Ser Val Gly Lys Val Phe
100 105 110
His Pro Gly Ile Ser Ser Asn His Thr Asp Asp Ser Pro Tyr Ser Trp
115 120 125
Ser Phe Pro Pro Tyr His Pro Ser Ser Glu Lys Tyr Glu Asn Thr Lys
130 135 140
Thr Cys Arg Gly Pro Asp Gly Glu Leu His Ala Asn Leu Leu Cys Pro
145 150 155 160
Val Asp Val Leu Asp Val Pro Glu Gly Thr Leu Pro Asp Lys Gln Ser
165 170 175
Thr Glu Gln Ala Ile Gln Leu Leu Glu Lys Met Lys Thr Ser Ala Ser
180 185 190
Pro Phe Phe Leu Ala Val Gly Tyr His Lys Pro His Ile Pro Phe Arg
195 200 205
Tyr Pro Lys Glu Phe Gln Lys Leu Tyr Pro Leu Glu Asn Ile Thr Leu
210 215 220
Ala Pro Asp Pro Glu Val Pro Asp Gly Leu Pro Pro Val Ala Tyr Asn
225 230 235 240
Pro Trp Met Asp Ile Arg Gln Arg Glu Asp Val Gln Ala Leu Asn Ile
245 250 255
Ser Val Pro Tyr Gly Pro Ile Pro Val Asp Phe Gln Arg Lys Ile Arg
260 265 270
Gln Ser Tyr Phe Ala Ser Val Ser Tyr Leu Asp Thr Gln Val Gly Arg
275 280 285
Leu Leu Ser Ala Leu Asp Asp Leu Gln Leu Ala Asn Ser Thr Ile Ile
290 295 300
Ala Phe Thr Ser Asp His Gly Trp Ala Leu Gly Glu His Gly Glu Trp
305 310 315 320
Ala Lys Tyr Ser Asn Phe Asp Val Ala Thr His Val Pro Leu Ile Phe
325 330 335
Tyr Val Pro Gly Arg Thr Ala Ser Leu Pro Glu Ala Gly Glu Lys Leu
340 345 350
Phe Pro Tyr Leu Asp Pro Phe Asp Ser Ala Ser Gln Leu Met Glu Pro
355 360 365
Gly Arg Gln Ser Met Asp Leu Val Glu Leu Val Ser Leu Phe Pro Thr
370 375 380
Leu Ala Gly Leu Ala Gly Leu Gln Val Pro Pro Arg Cys Pro Val Pro
385 390 395 400
Ser Phe His Val Glu Leu Cys Arg Glu Gly Lys Asn Leu Leu Lys His
405 410 415
Phe Arg Phe Arg Asp Leu Glu Glu Asp Pro Tyr Leu Pro Gly Asn Pro
420 425 430
Arg Glu Leu Ile Ala Tyr Ser Gln Tyr Pro Arg Pro Ser Asp Ile Pro
435 440 445
Gln Trp Asn Ser Asp Lys Pro Ser Leu Lys Asp Ile Lys Ile Met Gly
450 455 460
Tyr Ser Ile Arg Thr Ile Asp Tyr Arg Tyr Thr Val Trp Val Gly Phe
465 470 475 480
Asn Pro Asp Glu Phe Leu Ala Asn Phe Ser Asp Ile His Ala Gly Glu
485 490 495
Leu Tyr Phe Val Asp Ser Asp Pro Leu Gln Asp His Asn Met Tyr Asn
500 505 510
Asp Ser Gln Gly Gly Asp Leu Phe Gln Leu Leu Met Pro
515 520 525
<210> 231
<211> 757
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 231
Ser Glu Thr Gln Ala Asn Ser Thr Thr Asp Ala Leu Asn Val Leu Leu
1 5 10 15
Ile Ile Val Asp Asp Leu Arg Pro Ser Leu Gly Cys Tyr Gly Asp Lys
20 25 30
Leu Val Arg Ser Pro Asn Ile Asp Gln Leu Ala Ser His Ser Leu Leu
35 40 45
Phe Gln Asn Ala Phe Ala Gln Gln Ala Val Cys Ala Pro Ser Arg Val
50 55 60
Ser Phe Leu Thr Gly Arg Arg Pro Asp Thr Thr Arg Leu Tyr Asp Phe
65 70 75 80
Asn Ser Tyr Trp Arg Val His Ala Gly Asn Phe Ser Thr Ile Pro Gln
85 90 95
Tyr Phe Lys Glu Asn Gly Tyr Val Thr Met Ser Val Gly Lys Val Phe
100 105 110
His Pro Gly Ile Ser Ser Asn His Thr Asp Asp Ser Pro Tyr Ser Trp
115 120 125
Ser Phe Pro Pro Tyr His Pro Ser Ser Glu Lys Tyr Glu Asn Thr Lys
130 135 140
Thr Cys Arg Gly Pro Asp Gly Glu Leu His Ala Asn Leu Leu Cys Pro
145 150 155 160
Val Asp Val Leu Asp Val Pro Glu Gly Thr Leu Pro Asp Lys Gln Ser
165 170 175
Thr Glu Gln Ala Ile Gln Leu Leu Glu Lys Met Lys Thr Ser Ala Ser
180 185 190
Pro Phe Phe Leu Ala Val Gly Tyr His Lys Pro His Ile Pro Phe Arg
195 200 205
Tyr Pro Lys Glu Phe Gln Lys Leu Tyr Pro Leu Glu Asn Ile Thr Leu
210 215 220
Ala Pro Asp Pro Glu Val Pro Asp Gly Leu Pro Pro Val Ala Tyr Asn
225 230 235 240
Pro Trp Met Asp Ile Arg Gln Arg Glu Asp Val Gln Ala Leu Asn Ile
245 250 255
Ser Val Pro Tyr Gly Pro Ile Pro Val Asp Phe Gln Arg Lys Ile Arg
260 265 270
Gln Ser Tyr Phe Ala Ser Val Ser Tyr Leu Asp Thr Gln Val Gly Arg
275 280 285
Leu Leu Ser Ala Leu Asp Asp Leu Gln Leu Ala Asn Ser Thr Ile Ile
290 295 300
Ala Phe Thr Ser Asp His Gly Trp Ala Leu Gly Glu His Gly Glu Trp
305 310 315 320
Ala Lys Tyr Ser Asn Phe Asp Val Ala Thr His Val Pro Leu Ile Phe
325 330 335
Tyr Val Pro Gly Arg Thr Ala Ser Leu Pro Glu Ala Gly Glu Lys Leu
340 345 350
Phe Pro Tyr Leu Asp Pro Phe Asp Ser Ala Ser Gln Leu Met Glu Pro
355 360 365
Gly Arg Gln Ser Met Asp Leu Val Glu Leu Val Ser Leu Phe Pro Thr
370 375 380
Leu Ala Gly Leu Ala Gly Leu Gln Val Pro Pro Arg Cys Pro Val Pro
385 390 395 400
Ser Phe His Val Glu Leu Cys Arg Glu Gly Lys Asn Leu Leu Lys His
405 410 415
Phe Arg Phe Arg Asp Leu Glu Glu Asp Pro Tyr Leu Pro Gly Asn Pro
420 425 430
Arg Glu Leu Ile Ala Tyr Ser Gln Tyr Pro Arg Pro Ser Asp Ile Pro
435 440 445
Gln Trp Asn Ser Asp Lys Pro Ser Leu Lys Asp Ile Lys Ile Met Gly
450 455 460
Tyr Ser Ile Arg Thr Ile Asp Tyr Arg Tyr Thr Val Trp Val Gly Phe
465 470 475 480
Asn Pro Asp Glu Phe Leu Ala Asn Phe Ser Asp Ile His Ala Gly Glu
485 490 495
Leu Tyr Phe Val Asp Ser Asp Pro Leu Gln Asp His Asn Met Tyr Asn
500 505 510
Asp Ser Gln Gly Gly Asp Leu Phe Gln Leu Leu Met Pro Gly Gly Gly
515 520 525
Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala
530 535 540
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Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
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Leu Ser Pro Gly Lys
755
<210> 232
<211> 757
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 232
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210 215 220
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755
<210> 233
<211> 757
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<400> 233
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<220>
<221> MOD_RES
<222> (59)..(59)
<223> 甲酰甘氨酸
<400> 235
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755
<210> 236
<211> 757
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<220>
<221> MOD_RES
<222> (59)..(59)
<223> 甲酰甘氨酸
<400> 236
Ser Glu Thr Gln Ala Asn Ser Thr Thr Asp Ala Leu Asn Val Leu Leu
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Ile Ile Val Asp Asp Leu Arg Pro Ser Leu Gly Cys Tyr Gly Asp Lys
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Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
725 730 735
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
740 745 750
Leu Ser Pro Gly Lys
755
<210> 237
<211> 757
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成多肽”
<220>
<221> MOD_RES
<222> (59)..(59)
<223> 甲酰甘氨酸
<400> 237
Ser Glu Thr Gln Ala Asn Ser Thr Thr Asp Ala Leu Asn Val Leu Leu
1 5 10 15
Ile Ile Val Asp Asp Leu Arg Pro Ser Leu Gly Cys Tyr Gly Asp Lys
20 25 30
Leu Val Arg Ser Pro Asn Ile Asp Gln Leu Ala Ser His Ser Leu Leu
35 40 45
Phe Gln Asn Ala Phe Ala Gln Gln Ala Val Xaa Ala Pro Ser Arg Val
50 55 60
Ser Phe Leu Thr Gly Arg Arg Pro Asp Thr Thr Arg Leu Tyr Asp Phe
65 70 75 80
Asn Ser Tyr Trp Arg Val His Ala Gly Asn Phe Ser Thr Ile Pro Gln
85 90 95
Tyr Phe Lys Glu Asn Gly Tyr Val Thr Met Ser Val Gly Lys Val Phe
100 105 110
His Pro Gly Ile Ser Ser Asn His Thr Asp Asp Ser Pro Tyr Ser Trp
115 120 125
Ser Phe Pro Pro Tyr His Pro Ser Ser Glu Lys Tyr Glu Asn Thr Lys
130 135 140
Thr Cys Arg Gly Pro Asp Gly Glu Leu His Ala Asn Leu Leu Cys Pro
145 150 155 160
Val Asp Val Leu Asp Val Pro Glu Gly Thr Leu Pro Asp Lys Gln Ser
165 170 175
Thr Glu Gln Ala Ile Gln Leu Leu Glu Lys Met Lys Thr Ser Ala Ser
180 185 190
Pro Phe Phe Leu Ala Val Gly Tyr His Lys Pro His Ile Pro Phe Arg
195 200 205
Tyr Pro Lys Glu Phe Gln Lys Leu Tyr Pro Leu Glu Asn Ile Thr Leu
210 215 220
Ala Pro Asp Pro Glu Val Pro Asp Gly Leu Pro Pro Val Ala Tyr Asn
225 230 235 240
Pro Trp Met Asp Ile Arg Gln Arg Glu Asp Val Gln Ala Leu Asn Ile
245 250 255
Ser Val Pro Tyr Gly Pro Ile Pro Val Asp Phe Gln Arg Lys Ile Arg
260 265 270
Gln Ser Tyr Phe Ala Ser Val Ser Tyr Leu Asp Thr Gln Val Gly Arg
275 280 285
Leu Leu Ser Ala Leu Asp Asp Leu Gln Leu Ala Asn Ser Thr Ile Ile
290 295 300
Ala Phe Thr Ser Asp His Gly Trp Ala Leu Gly Glu His Gly Glu Trp
305 310 315 320
Ala Lys Tyr Ser Asn Phe Asp Val Ala Thr His Val Pro Leu Ile Phe
325 330 335
Tyr Val Pro Gly Arg Thr Ala Ser Leu Pro Glu Ala Gly Glu Lys Leu
340 345 350
Phe Pro Tyr Leu Asp Pro Phe Asp Ser Ala Ser Gln Leu Met Glu Pro
355 360 365
Gly Arg Gln Ser Met Asp Leu Val Glu Leu Val Ser Leu Phe Pro Thr
370 375 380
Leu Ala Gly Leu Ala Gly Leu Gln Val Pro Pro Arg Cys Pro Val Pro
385 390 395 400
Ser Phe His Val Glu Leu Cys Arg Glu Gly Lys Asn Leu Leu Lys His
405 410 415
Phe Arg Phe Arg Asp Leu Glu Glu Asp Pro Tyr Leu Pro Gly Asn Pro
420 425 430
Arg Glu Leu Ile Ala Tyr Ser Gln Tyr Pro Arg Pro Ser Asp Ile Pro
435 440 445
Gln Trp Asn Ser Asp Lys Pro Ser Leu Lys Asp Ile Lys Ile Met Gly
450 455 460
Tyr Ser Ile Arg Thr Ile Asp Tyr Arg Tyr Thr Val Trp Val Gly Phe
465 470 475 480
Asn Pro Asp Glu Phe Leu Ala Asn Phe Ser Asp Ile His Ala Gly Glu
485 490 495
Leu Tyr Phe Val Asp Ser Asp Pro Leu Gln Asp His Asn Met Tyr Asn
500 505 510
Asp Ser Gln Gly Gly Asp Leu Phe Gln Leu Leu Met Pro Gly Gly Gly
515 520 525
Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
530 535 540
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
545 550 555 560
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
565 570 575
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
580 585 590
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
595 600 605
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
610 615 620
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
625 630 635 640
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
645 650 655
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
660 665 670
Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
675 680 685
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
690 695 700
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
705 710 715 720
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
725 730 735
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
740 745 750
Leu Ser Pro Gly Lys
755
<210> 238
<211> 181
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 238
Asn Ser Val Ile Ile Val Asp Lys Asn Gly Arg Leu Val Tyr Leu Val
1 5 10 15
Glu Asn Pro Gly Gly Tyr Val Ala Tyr Ser Lys Ala Ala Thr Val Thr
20 25 30
Gly Lys Leu Val His Ala Asn Phe Gly Thr Lys Lys Asp Phe Glu Asp
35 40 45
Leu Tyr Thr Pro Val Asn Gly Ser Ile Val Ile Val Arg Ala Gly Lys
50 55 60
Ile Thr Phe Ala Glu Lys Val Ala Asn Ala Glu Ser Leu Asn Ala Ile
65 70 75 80
Gly Val Leu Ile Tyr Met Asp Gln Thr Lys Phe Pro Ile Val Asn Ala
85 90 95
Glu Leu Ser Phe Phe Gly His Ala His Leu Gly Thr Gly Asp Pro Tyr
100 105 110
Thr Pro Gly Phe Pro Ser Phe Asn His Thr Gln Phe Pro Pro Ser Arg
115 120 125
Ser Ser Gly Leu Pro Asn Ile Pro Val Gln Thr Ile Ser Arg Ala Ala
130 135 140
Ala Glu Lys Leu Phe Gly Asn Met Glu Gly Asp Cys Pro Ser Asp Trp
145 150 155 160
Lys Thr Asp Ser Thr Cys Arg Met Val Thr Ser Glu Ser Lys Asn Val
165 170 175
Lys Leu Thr Val Ser
180
<210> 239
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 239
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 240
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成肽”
<400> 240
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 241
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“人工序列的描述：合成6xHis标签”
<400> 241
His His His His His His
1 5
<210> 242
<211> 7
<212> PRT
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源
<223> /注释=“未知序列的描述：基序序列”
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> 任何氨基酸
<400> 242
Tyr Xaa Thr Glu Trp Ser Ser
1 5

Claims (142)

1.一种蛋白质，所述蛋白质包含：
(a)第一Fc多肽，所述第一Fc多肽键联至酶替代疗法(ERT)酶、ERT酶变体或其催化活性片段；以及
(b)第二Fc多肽，所述第一Fc多肽与所述第一Fc多肽形成Fc二聚体，
其中，所述第一Fc多肽和/或所述第二Fc多肽不包括免疫球蛋白重链和/或轻链可变区序列或其抗原结合部分。
2.如权利要求1所述的蛋白质，其中所述ERT酶为艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶(IDS)、IDS变体或其催化活性片段。
3.如权利要求2所述的蛋白质，其中所述ERT酶包含与SEQ ID NO:91、92、114、230以及234中的任一者的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列。
4.如权利要求3所述的蛋白质，其中所述ERT酶包含SEQ ID NO:91、92、114、230以及234中的任一者的氨基酸序列。
5.如权利要求1所述的蛋白质，其中所述ERT酶为N-磺基葡糖胺磺基水解酶(SGSH)、SGSH变体或其催化活性片段。
6.如权利要求5所述的蛋白质，其中所述ERT酶包含与SEQ ID NO:119和120中的任一者的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列。
7.如权利要求6所述的蛋白质，其中所述ERT酶包含SEQ ID NO:119和120中的任一者的氨基酸序列。
8.如权利要求1所述的蛋白质，其中所述ERT酶为酸性神经鞘磷脂酶(ASM)、ASM变体或其催化活性片段。
9.如权利要求8所述的蛋白质，其中所述ERT酶包含与SEQ ID NO:121、122以及123中的任一者的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列。
10.如权利要求9所述的蛋白质，其中所述ERT酶包含SEQ ID NO:121、122以及123中的任一者的氨基酸序列。
11.如权利要求1所述的蛋白质，其中所述ERT酶为β-葡糖脑苷脂酶(GBA)、GBA变体或其催化活性片段。
12.如权利要求11所述的蛋白质，其中所述ERT酶包含与SEQ ID NO:93和94中的任一者的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或95％同一性的氨基酸序列。
13.如权利要求12所述的蛋白质，其中所述ERT酶包含SEQ ID NO:93和94中的任一者的氨基酸序列。
14.如权利要求1至13中任一项所述的蛋白质，其中所述第一Fc多肽为融合多肽，所述融合多肽通过肽键或通过多肽接头键联至所述ERT酶、所述ERT酶变体或其所述催化活性片段。
15.如权利要求14所述的蛋白质，其中所述多肽接头为柔性多肽接头。
16.如权利要求15所述的蛋白质，其中所述柔性多肽接头为富含甘氨酸的接头。
17.如权利要求16所述的蛋白质，其中所述富含甘氨酸的接头为G4S(SEQ ID NO:239)或(G4S)2(SEQ ID NO:240)。
18.如权利要求1至17中任一项所述的蛋白质，其中所述第二Fc多肽键联至ERT酶、ERT酶变体或其催化活性片段。
19.如权利要求18所述的蛋白质，其中所述第二Fc多肽为融合多肽，所述融合多肽通过肽键或通过多肽接头键联至所述ERT酶、所述ERT酶变体或其所述催化活性片段。
20.如权利要求18或19所述的蛋白质，其中所述第一Fc多肽的N端和/或所述第二Fc多肽的N端键联至所述ERT酶。
21.如权利要求20所述的蛋白质，其中所述第一Fc多肽的N端键联至一个ERT酶并且所述第二Fc多肽的N端键联至另一ERT酶。
22.如权利要求18或19所述的蛋白质，其中所述第一Fc多肽的C端和/或所述第二Fc多肽的C端键联至所述ERT酶。
23.如权利要求22所述的蛋白质，其中所述第一Fc多肽的C端键联至一个ERT酶并且所述第二Fc多肽的C端键联至另一ERT酶。
24.如权利要求18或19所述的蛋白质，其中所述第一Fc多肽的N端键联至一个ERT酶并且所述第二Fc多肽的C端键联至另一ERT酶。
25.如权利要求18或19所述的蛋白质，其中所述第一Fc多肽的C端键联至一个ERT酶并且所述第二Fc多肽的N端键联至另一ERT酶。
26.如权利要求1至17中任一项所述的蛋白质，其中所述蛋白质包含单个ERT酶，并且其中所述第一Fc多肽的N端或C端键联至所述ERT酶。
27.如权利要求18至25中任一项所述的蛋白质，其中所述蛋白质包含两个ERT酶。
28.如权利要求14至17中任一项所述的蛋白质，其中所述融合多肽从N端到C端包含：所述ERT酶、所述ERT酶变体或其所述催化活性片段；所述多肽接头；以及所述第一Fc多肽。
29.如权利要求1至28中任一项所述的蛋白质，其中所述第一Fc多肽为被修饰的Fc多肽和/或所述第二Fc多肽为被修饰的Fc多肽。
30.如权利要求29所述的蛋白质，其中所述第一Fc多肽和所述第二Fc多肽各自含有促进异二聚化的修饰。
31.如权利要求30所述的蛋白质，其中所述Fc二聚体为Fc异二聚体。
32.如权利要求30或31所述的蛋白质，其中根据EU编号，所述Fc多肽中的一者具有T366W取代并且另一Fc多肽具有T366S、L368A以及Y407V取代。
33.如权利要求32所述的蛋白质，其中所述第一Fc多肽含有T366S、L368A以及Y407V取代并且所述第二Fc多肽含有T366W取代。
34.如权利要求33所述的蛋白质，其中所述第一Fc多肽键联至所述ERT酶并且包含SEQID NO:117、232以及236中的任一者的氨基酸序列。
35.如权利要求32所述的蛋白质，其中所述第一Fc多肽含有T366W取代并且所述第二Fc多肽含有T366S、L368A以及Y407V取代。
36.如权利要求35所述的蛋白质，其中所述第一Fc多肽键联至所述ERT酶并且包含SEQID NO:118、233以及237中的任一者的氨基酸序列。
37.如权利要求29至36中任一项所述的蛋白质，其中所述第一Fc多肽和/或所述第二Fc多肽包含天然FcRn结合位点。
38.如权利要求29至37中任一项所述的蛋白质，其中所述第一Fc多肽和所述第二Fc多肽不具有效应功能。
39.如权利要求29至37中任一项所述的蛋白质，其中所述第一Fc多肽和/或所述第二Fc多肽包括降低效应功能的修饰。
40.如权利要求39所述的蛋白质，其中所述降低效应功能的修饰为根据EU编号在位置234的Ala和在位置235的Ala的取代。
41.如权利要求40所述的蛋白质，其中所述第一Fc多肽键联至所述ERT酶并且包含SEQID NO:115、231以及235中的任一者的氨基酸序列。
42.如权利要求40所述的蛋白质，其中所述第一Fc多肽键联至所述ERT酶并且包含SEQID NO:149、150、152以及153中的任一者的氨基酸序列。
43.如权利要求29至42中任一项所述的蛋白质，其中所述第一Fc多肽和/或所述第二Fc多肽相对于天然Fc序列包含延长血清半衰期的氨基酸变化。
44.如权利要求43所述的蛋白质，其中所述氨基酸变化包含根据EU编号在位置252的Tyr、在位置254的Thr以及在位置256的Glu的取代。
45.如权利要求43所述的蛋白质，其中所述氨基酸变化包含根据EU编号在位置428的Leu和在位置434的Ser的取代。
46.如权利要求43所述的蛋白质，其中所述氨基酸变化包含根据EU编号在位置434的Ser或Ala的取代。
47.如权利要求29至46中任一项所述的蛋白质，其中所述第一Fc多肽和/或所述第二Fc多肽特异性结合于转铁蛋白受体(TfR)。
48.如权利要求47所述的蛋白质，其中所述第一Fc多肽和/或所述第二Fc多肽包含根据EU编号在选自由以下组成的组的位置的至少两个取代：384、386、387、388、389、390、413、416以及421。
49.如权利要求48所述的蛋白质，其中所述第一Fc多肽和/或所述第二Fc多肽包含在所述位置的至少三个、四个、五个、六个、七个、八个或九个取代。
50.如权利要求48或49所述的蛋白质，其中所述第一Fc多肽和/或所述第二Fc多肽还包含根据EU编号在包含380、391、392以及415的位置的一个、两个、三个或四个取代。
51.如权利要求48至50中任一项所述的蛋白质，其中所述第一Fc多肽和/或所述第二Fc多肽还包含根据EU编号在包含414、424以及426的位置的一个、两个或三个取代。
52.如权利要求48至51中任一项所述的蛋白质，其中所述第一Fc多肽和/或所述第二Fc多肽包含在位置388的Trp。
53.如权利要求48至52中任一项所述的蛋白质，其中所述第一Fc多肽和/或所述第二Fc多肽包含在位置421的芳族氨基酸。
54.如权利要求53所述的蛋白质，其中在位置421的所述芳族氨基酸为Trp或Phe。
55.如权利要求48至54中任一项所述的蛋白质，其中所述第一Fc多肽和/或所述第二Fc多肽包含至少一个选自以下的位置：位置380为Trp、Leu或Glu；位置384为Tyr或Phe；位置386为Thr；位置387为Glu；位置388为Trp；位置389为Ser、Ala、Val或Asn；位置390为Ser或Asn；位置413为Thr或Ser；位置415为Glu或Ser；位置416为Glu；以及位置421为Phe。
56.如权利要求55所述的蛋白质，其中所述第一Fc多肽和/或所述第二Fc多肽包含2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个选自以下的位置：位置380为Trp、Leu或Glu；位置384为Tyr或Phe；位置386为Thr；位置387为Glu；位置388为Trp；位置389为Ser、Ala、Val或Asn；位置390为Ser或Asn；位置413为Thr或Ser；位置415为Glu或Ser；位置416为Glu；以及位置421为Phe。
57.如权利要求56所述的蛋白质，其中所述第一Fc多肽和/或所述第二Fc多肽包含如下11个位置：位置380为Trp、Leu或Glu；位置384为Tyr或Phe；位置386为Thr；位置387为Glu；位置388为Trp；位置389为Ser、Ala、Val或Asn；位置390为Ser或Asn；位置413为Thr或Ser；位置415为Glu或Ser；位置416为Glu；以及位置421为Phe。
58.如权利要求56或57所述的蛋白质，其中所述第一Fc多肽和/或所述第二Fc多肽具有与SEQ ID NO:34-38、58、60-90、151以及156-229中的任一者的氨基酸111-217具有至少85％同一性、至少90％同一性或至少95％同一性的CH3结构域。
59.如权利要求58所述的蛋白质，其中在对应于SEQ ID NO:34-38、58、60-90、151以及156-229中的任一者的EU索引位置380、384、386、387、388、389、390、391、392、413、414、415、416、421、424以及426的位置中的至少5者、6者、7者、8者、9者、10者、11者、12者、13者、14者、15者或16者处的残基未缺失或取代。
60.如权利要求58或59所述的蛋白质，其中所述第一Fc多肽和/或所述第二Fc多肽包含SEQ ID NO:156-229中的任一者的氨基酸序列。
61.如权利要求60所述的蛋白质，其中所述第一Fc多肽和/或所述第二Fc多肽包含SEQID NO:157、169、181、193、205以及217中的任一者的氨基酸序列。
62.如权利要求60所述的蛋白质，其中所述第一Fc多肽包含SEQ ID NO:115、231以及235中的任一者的氨基酸序列，并且所述第二Fc多肽包含SEQ ID NO:205和228中的任一者的氨基酸序列。
63.如权利要求60所述的蛋白质，其中所述第一Fc多肽包含SEQ ID NO:115、231以及235中的任一者的氨基酸序列，并且所述第二Fc多肽包含SEQ ID NO:169和229中的任一者的氨基酸序列。
64.如权利要求47至63中任一项所述的蛋白质，其中所述第一Fc多肽和/或所述第二Fc多肽结合于所述TfR的顶端结构域。
65.如权利要求47至64中任一项所述的蛋白质，其中所述蛋白质与所述TfR的所述结合不大体上抑制转铁蛋白结合于所述TfR。
66.如权利要求47至65中任一项所述的蛋白质，其中所述第一Fc多肽和/或所述第二Fc多肽与对应野生型Fc多肽相比具有至少75％或至少80％、85％、90％、92％或95％的氨基酸序列同一性。
67.如权利要求66所述的蛋白质，其中所述对应野生型Fc多肽为人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc多肽。
68.如权利要求47至67中任一项所述的蛋白质，其中与在不存在所述第一Fc多肽和/或所述第二Fc多肽的情况下所述ERT酶的摄入相比或与在不存在对所述第一Fc多肽和/或所述第二Fc多肽的引起TfR结合的修饰的情况下所述ERT酶的摄入相比，所述ERT酶在脑中的摄入为至少十倍。
69.如权利要求1至68中任一项所述的蛋白质，其中所述第一Fc多肽未被修饰以结合于血脑屏障(BBB)受体并且所述第二Fc多肽被修饰以特异性结合于TfR。
70.如权利要求1至68中任一项所述的蛋白质，其中所述第一Fc多肽被修饰以特异性结合于TfR并且所述第二Fc多肽未被修饰以结合于BBB受体。
71.如权利要求1至70中任一项所述的蛋白质，其中所述蛋白质不包括免疫球蛋白重链和/或轻链可变区序列或其抗原结合部分。
72.一种包含键联至ERT酶、ERT酶变体或其催化活性片段的Fc多肽的多肽，其中所述Fc多肽含有促进它与另一Fc多肽异二聚化的一个或多个修饰。
73.如权利要求72所述的多肽，其中所述ERT酶为艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶(IDS)、IDS变体或其催化活性片段。
74.如权利要求72所述的多肽，其中所述ERT酶为N-磺基葡糖胺磺基水解酶(SGSH)、SGSH变体或其催化活性片段。
75.如权利要求72所述的多肽，其中所述ERT酶为酸性神经鞘磷脂酶(ASM)、ASM变体或其催化活性片段。
76.如权利要求72所述的多肽，其中所述ERT酶为β-葡糖脑苷脂酶(GBA)、GBA变体或其催化活性片段。
77.如权利要求72至76中任一项所述的多肽，其中所述Fc多肽为融合多肽，所述融合多肽通过肽键或通过多肽接头键联至所述ERT酶、所述ERT酶变体或其所述催化活性片段。
78.如权利要求77所述的多肽，其中所述融合多肽从N端到C端包含：所述ERT酶、所述ERT酶变体或其所述催化活性片段；所述多肽接头；以及所述第一Fc多肽。
79.如权利要求72至78中任一项所述的多肽，其中根据EU编号，所述Fc多肽含有T366S、L368A以及Y407V取代。
80.如权利要求79所述的多肽，其中所述多肽包含SEQ ID NO:115、117、231、232、235以及236中的任一者的氨基酸序列。
81.如权利要求79所述的多肽，其中所述多肽包含SEQ ID NO:149和150中的任一者的氨基酸序列。
82.如权利要求72至78中任一项所述的多肽，其中所述Fc多肽含有T366W取代。
83.如权利要求82所述的多肽，其中所述多肽包含SEQ ID NO:118、233以及237中的任一者的氨基酸序列。
84.如权利要求82所述的多肽，其中所述多肽包含SEQ ID NO:152-155中的任一者的氨基酸序列。
85.如权利要求72至84中任一项所述的多肽，其中所述多肽还包含另一Fc多肽。
86.一种多核苷酸，所述多核苷酸包含编码如权利要求72至84中任一项所述的多肽的核酸序列。
87.一种载体，所述载体包含如权利要求86所述的多核苷酸。
88.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含如权利要求86所述的多核苷酸或如权利要求87所述的载体。
89.如权利要求88所述的宿主细胞，其还包含含有编码所述另一Fc多肽的核酸序列的多核苷酸。
90.一种制备包含Fc多肽的多肽的方法，所述Fc多肽键联至ERT酶、ERT酶变体或其催化活性片段，所述方法包括在使由如权利要求86所述的多核苷酸编码的多肽表达的条件下培养宿主细胞。
91.一种治疗溶酶体贮积症(LSD)的方法，所述方法包括向有需要的患者施用如权利要求1至71中任一项所述的蛋白质或如权利要求72至85中任一项所述的多肽。
92.一种使患有LSD的患者中毒性代谢产物的累积减少的方法，所述方法包括向所述患者施用如权利要求1至71中任一项所述的蛋白质或如权利要求72至85中任一项所述的多肽。
93.如权利要求91或92所述的方法，其中所述LSD为亨特综合征，并且所述ERT酶为IDS。
94.如权利要求93所述的方法，其中所述毒性代谢产物包含硫酸肝素衍生的二糖和/或硫酸皮肤素衍生的二糖。
95.如权利要求91或92所述的方法，其中所述LSD为圣菲利柏综合征A，并且所述ERT酶为SGSH。
96.如权利要求95所述的方法，其中所述毒性代谢产物包含硫酸乙酰肝素衍生的寡糖。
97.如权利要求91或92所述的方法，其中所述LSD为尼曼-皮克病，并且所述ERT酶为ASM。
98.如权利要求97所述的方法，其中所述毒性代谢产物包含神经鞘磷脂。
99.如权利要求91或92所述的方法，其中所述LSD为高歇氏病或帕金森氏病，并且所述ERT酶为GBA。
100.如权利要求99所述的方法，其中所述毒性代谢产物包含葡糖基神经酰胺。
101.一种药物组合物，所述药物组合物包含如权利要求1至71中任一项所述的蛋白质或如权利要求72至85中任一项所述的多肽以及药学上可接受的载体。
102.一种监测底物累积以评估IDS活性的方法，所述方法包括：
(a)将来自施用如权利要求2至4、14至41以及43至71中任一项所述的蛋白质或如权利要求72至73、77至80、82至83以及85中任一项所述的多肽的受试者的细胞或组织样品中的细胞破碎以使微泡裂开从而获得所要分析的糖胺聚糖(GAG)溶液；
(b)用至少一种肝素酶和软骨素酶B消化所述GAG溶液以获得GAG衍生的二糖；
(c)通过质谱法分析所述GAG衍生的二糖；以及
(d)测定硫酸乙酰肝素衍生的二糖和/或硫酸皮肤素衍生的二糖的水平，其中与缺乏IDS活性的对照相比硫酸乙酰肝素衍生的二糖和/或硫酸皮肤素衍生的二糖的水平降低指示与所述对照相比所述样品中的IDS活性增加。
103.如权利要求102所述的方法，其中所述破碎细胞的步骤包括至少一个冷冻-解冻循环和至少一个超声处理步骤。
104.如权利要求103所述的方法，其中所述细胞来自组织样品并且所述方法包括至少三个、四个或五个冷冻-解冻循环。
105.如权利要求102至104中任一项所述的方法，其中所述受试者为缺乏IDS活性的小鼠。
106.如权利要求102至104中任一项所述的方法，其中所述受试者为非人灵长类动物。
107.如权利要求102至104中任一项所述的方法，其中所述受试者为患有亨特综合征的人患者。
108.一种监测底物累积以评估SGSH活性的方法，所述方法包括：
(a)将来自施用如权利要求5至7、14至33、35、37至40以及42至71中任一项所述的蛋白质或如权利要求72、74、77至79、81至82以及84至85中任一项所述的多肽的受试者的细胞或组织样品中的细胞破碎以使微泡裂开从而获得所要分析的糖胺聚糖(GAG)溶液；
(b)用至少一种肝素酶消化所述GAG溶液以获得GAG衍生的二糖；
(c)通过质谱法分析所述GAG衍生的二糖；以及
(d)测定硫酸乙酰肝素衍生的二糖的水平，其中与缺乏SGSH活性的对照相比硫酸乙酰肝素衍生的二糖的水平降低指示与所述对照相比所述样品中的SGSH活性增加。
109.如权利要求108所述的方法，其中所述破碎细胞的步骤包括至少一个冷冻-解冻循环和至少一个超声处理步骤。
110.如权利要求109所述的方法，其中所述细胞来自组织样品并且所述方法包括至少三个、四个或五个冷冻-解冻循环。
111.如权利要求108至110中任一项所述的方法，其中所述受试者为缺乏SGSH活性的小鼠。
112.如权利要求108至110中任一项所述的方法，其中所述受试者为非人灵长类动物。
113.如权利要求108至110中任一项所述的方法，其中所述受试者为患有圣菲利柏综合征A的人患者。
114.一种将剂运送穿过哺乳动物的BBB的方法，所述方法包括使所述BBB暴露于以约50nM至约250nM的亲和力结合于TfR的蛋白质，其中所述蛋白质键联至所述剂并且将所键联的所述剂运送穿过所述BBB。
115.如权利要求114所述的方法，其中所述哺乳动物脑中所述剂的最大浓度(C最大)有所提高。
116.如权利要求114或115所述的方法，其中所述剂可用于治疗LSD。
117.一种治疗LSD的方法，所述方法包括向哺乳动物施用以约50nM至约250nM的亲和力结合于TfR的蛋白质，其中所述蛋白质键联至用于治疗所述LSD的剂，由此使所述哺乳动物的脑暴露于所述剂。
118.如权利要求114至117中任一项所述的方法，其中所述蛋白质使所述剂在所述脑中的C最大与键联至以较弱亲和力结合于所述TfR的参考蛋白质的所述剂相比有所提高。
119.如权利要求114至118中任一项所述的方法，其中所述蛋白质使在治疗有效浓度下所述剂在所述哺乳动物中的C最大与键联至以较弱亲和力结合于所述TfR的参考蛋白质的所述剂相比有所提高。
120.如权利要求118至119中任一项所述的方法，其中所述参考蛋白质以约600nM或更弱的亲和力结合于所述TfR。
121.如权利要求114至120中任一项所述的方法，其中所述TfR为灵长类动物TfR。
122.如权利要求121所述的方法，其中所述灵长类动物TfR为人TfR。
123.如权利要求114至122中任一项所述的方法，其中所述蛋白质结合于所述TfR顶端结构域。
124.如权利要求114至123中任一项所述的方法，其中所述蛋白质以约100nM至约200nM的亲和力结合于所述TfR。
125.如权利要求114至124中任一项所述的方法，其中所述蛋白质以约110nM至约150nM的亲和力结合于所述TfR。
126.如权利要求119至125中任一项所述的方法，其中所述剂的所述治疗有效浓度为治疗所述哺乳动物中的LSD的一种或多种症状的浓度。
127.如权利要求114至126中任一项所述的方法，其中所述剂为蛋白质替代治疗剂。
128.如权利要求114至127中任一项所述的方法，其中所述剂或蛋白质替代治疗剂为酶。
129.如权利要求128所述的方法，其中当所述酶键联至所述蛋白质时与所述酶键联至所述参考蛋白质时相比在更大程度上使患有所述LSD的所述哺乳动物脑中毒性代谢产物的累积减少。
130.如权利要求128或129所述的方法，其中所述酶为IDS并且所述LSD为亨特综合征。
131.如权利要求130所述的方法，其中所述毒性代谢产物包含硫酸肝素衍生的二糖和/或硫酸皮肤素衍生的二糖。
132.如权利要求128或129所述的方法，其中所述酶为SGSH并且所述LSD为圣菲利柏综合征A。
133.如权利要求128或129所述的方法，其中所述酶为ASM并且所述LSD为尼曼-皮克病。
134.如权利要求128或129所述的方法，其中所述酶为GBA并且所述LSD为高歇氏病。
135.如权利要求114至126中任一项所述的方法，其中所述剂包含抗体可变区。
136.如权利要求135所述的方法，其中所述剂包含抗体片段。
137.如权利要求136所述的方法，其中所述剂包含Fab或scFv。
138.如权利要求114至137中任一项所述的方法，其中所述蛋白质为被修饰的Fc多肽，所述被修饰的Fc多肽含有能够结合TfR的非天然结合位点。
139.如权利要求114至137中任一项所述的方法，其中所述蛋白质包含特异性结合TfR的抗体可变区。
140.如权利要求139所述的方法，其中所述蛋白质包含抗体片段。
141.如权利要求140所述的方法，其中所述蛋白质包含Fab或scFv。
142.如权利要求114至141中任一项所述的方法，其中键联至所述剂的所述蛋白质是作为药学上可接受的载体的一部分而施用。
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