CN110384820A - 一种冻干脱细胞肌腱线及其构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物纤维材料领域，具体是一种冻干脱细胞肌腱线及其构建方法。本发明制备的组织冻干肌腱纤维束线为一种新型的天然生物材料，主要成分为Ⅰ型胶原蛋白，保留有肌腱胶原纤维固有的力学结构单位和细胞附着结构，具有良好的力学性能和生物相容性。肌腱胶原纤维或纤维束材料来源广泛，量大且廉价，猪、牛等哺乳动物的肌腱均可作为材料来源。冻干脱细胞肌腱纤维线因其具有纤维材料的特性，可以广泛应用于其他生物医学领域，社会需求量大。
Description
技术领域
本发明涉及生物纤维材料领域，是一种新的天然生物材料，具体地说，是一种冻干脱细胞肌腱线(胶原纤维材料)及其构建方法。
背景技术
医用生物高分子纤维材料是目前应用最为广泛的医用生物材料，它可以来源于天然物质，也可以人工合成。这种材料除应满足一般的物理、化学性能要求外，还必须有足够好的生物相容性。它有可降解与不可降解型两种类型。不可降解型必须要在生物环境中长期保持稳定，不降解，不交联，不发生物理磨损和物理性能的显著变化，可用的高分子材料有聚乙烯、聚丙烯、聚丙烯酸酯、芳香聚酯等；可降解型则有胶原蛋白、线性脂肪族聚酯、甲壳素、纤维素、氨基酸、聚乳酸等。医用生物高分子纤维材料主要用作心血管系统、软组织和赢组织的修复材料。
医用再生生物纤维材料是指经过特殊处理的取天然生物组织形式的医用生物材料，故也称为再生生物材料，它主要用于人工心脏瓣膜、血管修复体、皮肤敷膜、纤维蛋白制品、骨修复体、软膜修复体、鼻软骨种植体、血液透析膜等。生物相容性，它是影响生物材料成败的重要因素。生物相容性是指材料被其他周围组织和整个人体系统接受与容纳，至少它不能引起周围组织的兴奋，激起感染与过敏，并不导致细胞组织发生癌症。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的天然生物材料，具体是一种冻干脱细胞肌腱线(胶原纤维材料)及其构建方法。
为了实现上述目的，本发明采用以下方法：
本发明的冻干脱细胞肌腱线为一种新型的生物材料，保留有肌腱细胞外基质固有的力学结构单位和细胞附着结构，去除了细胞成分，具有良好的力学性能和生物相容性。冻干脱细胞肌腱线有别于常规胶原纤维缝合线如羊肠线。虽然都取材于动物(如来源于羊小肠粘膜下层、牛跟腱组织)，但常规胶原纤维缝合线是将动物胶原溶解提纯的胶原分子，在体外聚合成原纤维，其提纯胶原分子的过程完全破坏了其细胞外基质的空间结构和成分，生物力学方面受到破坏。冻干脱细胞肌腱线通过动物肌腱分离成肌腱纤维束后加捻成线，再进行脱细胞后获得，其保留有肌腱细胞外基质固有的力学结构单位和细胞附着结构。因其具有纤维材料的特性，可以广泛应用于生物医学领域，社会需求量大。
冻干肌腱线的编织实质上是将冻干肌腱纤维由杂乱无章的状态变为按定向有序排列的加工过程，前期分离的纤维是分散的，每根纤维没有一定方向，且纤维束间的抱合力差，常用的成纱纺织工艺难以使纤维束成线。但是冻干的肌腱纤维湿化后，纤维间的抱合力显著增加，在湿化条件下加捻、脱细胞等更容易呈长线状纤维材料，线状肌腱纤维无完整的纤维束膜包绕，其内部的细胞成分可通过胰蛋白酶、超声震荡等方法脱除，并保留肌腱纤维束的胶原纤维结构。成线的脱细胞肌腱纤维束便于肌腱、韧带、筋膜及其他多种组织工程支架的编织，用途广泛。
本发明的第一方面，提供一种冻干脱细胞肌腱线的构建方法，包括以下步骤：
a)清除新鲜动物肌腱表面的外膜和滑膜组织；
b)将肌腱置于-56℃真空冻干24h；
c)通过物理开松、梳理等方法获得冻干肌腱纤维束；
d)冻干肌腱纤维束通过梳理成条；
e)成条的肌腱纤维束用双蒸水湿化，增强纤维束间的抱合力；
f)通过加捻，将已湿化的成条的肌腱纤维束制备成长线，保存于双蒸水中；
g)湿化的肌腱纤维线进行脱细胞处理：通过胰蛋白酶、超声震荡等方法脱除肌腱纤维线表面和内部的细胞成分；
h)将脱细胞的肌腱纤维线置于-56℃真空冻干3h，备生物材料的编织用。
进一步的，步骤a所述的动物为猪、牛等哺乳动物。
进一步的，步骤c所述的物理开松方法是指挤压、锤击、真空反爆气流冲击等方法。
进一步的，所述的步骤d是将1000mg/米、500mg/米和250mg/米冻干肌腱纤维束成条。
进一步的，步骤g所述的脱细胞处理方法为：将步骤f得到的肌腱纤维线放入Tris溶液，加入质量浓度0.05％丝氨酸蛋白酶抑制剂，常温下摇床震荡12h；倒掉溶液，PBS溶液冲洗3遍，加入质量浓度0.05％胰蛋白酶，37℃摇床震荡2h；倒掉溶液，PBS冲洗3遍后，加入90U/mL核酸酶，37℃摇床震荡2h；倒掉溶液，PBS冲洗3遍后，使用超声波破碎仪，超声探头悬浮在样品上方0.5cm处，超声振幅240μm，频率20赫兹，接受5分钟的超声波处理(美国Qsonica Q700超声波破碎仪)。
进一步的，步骤g所有步骤均在摇床(150RPM)进行，均加5ml/L青霉素/链霉素溶液(10000U/ml/10000mg/ml)预防污染，完成每一步骤均使用PBS冲洗3遍。
本发明的第二方面，提供一种冻干脱细胞肌腱线，其采用如上所述的构建方法制备得到。
本发明的第三方面，提供一种如上所述的冻干脱细胞肌腱线在制备医用再生生物纤维材料中的应用。
本发明优点在于：
1、本发明的冻干脱细胞肌腱纤维线，来源于动物的肌腱的胶原纤维，取材丰富，廉价，不含细胞成分，具备良好的生物力学特性、生物相容性和实用性。
2、低温干燥对肌腱细胞外结构影响小，可以减小其抗原性，并且便于物理开松、梳理的方法分离胶原纤维。实验证实，无腱膜包绕的胶原纤维或纤维束，通过低浓度胰蛋白酶及超声震荡可以脱除粘附于胶原纤维表面的细胞成分，并对其生物力学和组织相容性无明显影响，其编织而成的冻干脱细胞肌腱线较传统羊肠线等胶原线具有更好的组织相容性和仿生结构。
3、理想的生物编织材料应该具备良好的生物力学特性、生物相容性。本发明的组织冻干肌腱纤维束线为一种新型的天然生物材料，主要成分为Ⅰ型胶原蛋白，保留有肌腱胶原纤维固有的力学结构单位和细胞附着结构，具有良好的力学性能和生物相容性。肌腱胶原纤维或纤维束材料来源广泛，量大且廉价，猪、牛等哺乳动物的肌腱均可作为材料来源。冻干脱细胞肌腱纤维线因其具有纤维材料的特性，可以广泛应用于其他生物医学领域，社会需求量大。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1：冻干脱细胞肌腱线的制备
1)取新鲜牛肌腱，清除肌腱表面的外膜和滑膜组织。
2)将肌腱置于-56℃真空冻干仪，24h。
3)通过物理开松、梳理等方法分离获得冻干肌腱胶原纤维束。
4)将1000mg/米、500mg/米和250mg/米冻干肌腱纤维束成条。
5)成条的肌腱纤维束用双蒸水湿化、加捻成线，保留于双蒸水中
6)湿化的肌腱纤维线脱细胞：10mM的低渗tris缓冲液+丝氨酸蛋白酶抑制剂(0.05％苯甲基磺酰氟化物乙醇溶剂，35ml/L 50ml乙醇+25mgPMSF)，常温下摇床震荡12h。倒掉溶液，PBS溶液冲洗3遍，加入0.05％胰蛋白酶，37℃摇床震荡2h。倒掉溶液，PBS溶液冲洗3遍，加入90U/mL核酸酶(type II牛)，37℃摇床震荡2h。倒掉溶液，PBS冲洗3遍后，使用超声波破碎仪，超声探头悬浮在样品上方0.5cm处，超声振幅240μm，频率20赫兹，接受5分钟的超声波处理(美国Qsonica Q700超声波破碎仪)。所有步骤均在摇床(150RPM)进行，均加5ml/L青霉素/链霉素溶液(10000U/ml 10000mg/ml)溶液预防污染，完成每一步骤均使用PBS冲洗3遍。
7)将脱细胞肌腱纤维线置于-56℃真空冻干仪，3h后干燥保存待用。
实施例2：冻干脱细胞肌腱线直径测量
不同mg/m成条的冻干肌腱纤维束制备的冻干脱细胞肌腱纤维线的直径。如下表1。
表1不同mg/m成条的冻干肌腱纤维束制备的冻干脱细胞肌腱纤维线的直径
实施例3：冻干脱细胞肌腱线的生物力学测试
不同mg/m成条的冻干肌腱纤维束制备的冻干脱细胞肌腱纤维线的生物力学测试。如下表2：
表2不同mg/m成条的冻干肌腱纤维束制备的冻干脱细胞肌腱纤维线的生物力学测试
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
Claims (7)
1.一种冻干脱细胞肌腱线的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
a)清除新鲜动物肌腱表面的外膜和滑膜组织；
b)将肌腱置于-56℃真空冻干24h；
c)通过物理开松、梳理的方法获得冻干肌腱纤维束；
d)冻干肌腱纤维束通过梳理成条；
e)成条的肌腱纤维束用双蒸水湿化；
f)通过加捻，将已湿化的成条的肌腱纤维束制备成长线，保存于双蒸水中；
g)湿化的肌腱纤维线进行脱细胞处理：将步骤f得到的肌腱纤维线放入Tris溶液，加入质量浓度0.05％丝氨酸蛋白酶抑制剂，常温下摇床震荡12h；倒掉溶液，PBS溶液冲洗3遍，加入质量浓度0.05％胰蛋白酶，37℃摇床震荡2h；倒掉溶液，PBS冲洗3遍后，加入90U/mL核酸酶，37℃摇床震荡2h；倒掉溶液，PBS冲洗3遍后，使用超声波破碎仪，超声探头悬浮在样品上方0.5cm处，超声振幅240μm，频率20赫兹，接受5分钟的超声波处理；
h)将脱细胞的肌腱纤维线置于-56℃真空冻干3h。
2.根据权利要求1所述的冻干脱细胞肌腱线的构建方法，其特征在于，步骤a所述的动物为猪、牛。
3.根据权利要求1所述的冻干脱细胞肌腱线的构建方法，其特征在于，步骤c所述的物理开松方法是指挤压、锤击、或真空反爆气流冲击。
4.根据权利要求1所述的冻干脱细胞肌腱线的构建方法，其特征在于，所述的步骤d是将1000mg/米、500mg/米和250mg/米冻干肌腱纤维束成条。
5.根据权利要求1所述的冻干脱细胞肌腱线的构建方法，其特征在于，步骤g所有步骤均在摇床进行，均加5ml/L青霉素/链霉素溶液预防污染，完成每一步骤均使用PBS冲洗3遍。
6.一种冻干脱细胞肌腱线，其采用如权利要求1-5任一所述的构建方法制备得到。
7.一种如权利要求6所述的冻干脱细胞肌腱线在制备医用再生生物纤维材料中的应用。
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