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CN119015203A - 一种具有抗氧化、抗衰老和抗肿瘤活性的发酵粘液乳杆菌菌株a21038及其应用 - Google Patents

一种具有抗氧化、抗衰老和抗肿瘤活性的发酵粘液乳杆菌菌株a21038及其应用 Download PDF

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CN119015203A CN202411147058.9A CN202411147058A CN119015203A CN 119015203 A CN119015203 A CN 119015203A CN 202411147058 A CN202411147058 A CN 202411147058A CN 119015203 A CN119015203 A CN 119015203A
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Abstract

本发明提供了一种具有抗氧化、抗衰老和抗肿瘤活性的发酵粘液乳杆菌(Limosilactobacillusfermentum)菌株A21038及其应用，属于功能微生物技术领域。所述菌株A21038是从百岁健康老人肠道粪便中分离筛选获得，经过形态鉴定和分子鉴定，属于发酵粘液乳杆菌。所述菌株A21038具有良好的耐胃肠液和牛胆碱能力。本发明提供的发酵粘液乳杆菌菌株A21038兼具抑菌、抗炎症、抗氧化和抗肿瘤活性，为临床相关疾病的治疗和药物开发以及体外制剂或日用品的制备提供了新途径。

Description

一种具有抗氧化、抗衰老和抗肿瘤活性的发酵粘液乳杆菌菌 株A21038及其应用
技术领域
本发明属于功能微生物技术领域，具体涉及一种具有抗氧化、抗衰老和抗肿瘤活性的发酵粘液乳杆菌(Limosilactobacillusfermentum)菌株A21038及其应用。
背景技术
肠道微生物已在人们生活中发挥着不可忽视的作用，它既可以维持肠道健康，又可以通过代谢物调控各类信号通路，与各种疾病的发生和治疗息息相关。比如，与人体肠道共生的乳杆菌，是一种有益菌，在抑制病原菌入侵、缓解肠道炎症、损伤，延缓衰老，甚至是在抵抗肿瘤发生发展的过程中都发挥着重要的作用。发酵粘液乳杆菌是一类由卫生部经过批准的可用于食品的益生菌，其可以定殖在人体肠道中，通过改变宿主菌群组成并对宿主产生有益作用。在膳食中及时添加一些活性益生菌，对表现出相关症状或疾病的人来说异常重要。例如公开号CN113234612A公开了一种对结肠炎具有预防效果的发酵乳杆菌ZS40，该菌株可通过抑制NF-κB和MAPK信号通路的激活从而更好地缓解炎症发生。
人体内无时无刻不在发生着氧化还原反应，皮肤是人体的第一道屏障，老化受损是在所难免的。公开号为CN117363524A的专利公开了一株格氏乳杆菌MY4及其在制备助睡眠和美白食品药品中的应用，该菌株具有抗氧化、美白、延缓衰老的功效。此外，Luo等人的研究报道了一株罗伊氏粘液乳杆菌FLRE5K1菌株，实验结果显示其能显著减少小鼠体内黑色素瘤细胞数量，并且对非癌组织无毒副作用，具有抗黑色素瘤活性。可见，乳杆菌作为益生菌在抗氧化、抗肿瘤方面具有广泛应用。然而目前还未有关于兼具抗氧化、抗衰老和抗肿瘤活性的乳杆菌的报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种发酵粘液乳杆菌在制备抗氧化、抗衰老和抗肿瘤的产品中的应用。
本发明的目的还在于提供一种新型的发酵粘液乳杆菌(Limosilactobacillusfermentum)菌株A21038，同时具有抗氧化、抗衰老和抗肿瘤活性。
本发明提供了发酵粘液乳杆菌(Limosilactobacillusfermentum)在制备以下至少两种功能的产品中的应用：抗氧化、抗衰老、抑菌性和抗肿瘤。
优选的，所述抗氧化表现在对以下至少一种清除能力：DPPH自由基、羟自由基、超氧阴离子和H2O2。
优选的，所述抗衰老表现在具有超氧化物歧化酶活性和/或谷胱甘肽过氧化酶活性。
优选的，当制备抗氧化和/或抗衰老的产品时，所述产品包括以下至少一种：药品、保健品、化妆品和食品。
优选的，所述抑菌性中的菌包括大肠杆菌。
优选的，所述抗肿瘤中肿瘤或癌症包括结肠癌和/或黑色素瘤。
优选的，所述制备抑菌性和/或抗肿瘤的产品时，所述产品包括药品。
本发明提供了一种发酵粘液乳杆菌菌株A21038，保藏编号为GDMCC No：64675。
本发明提供了一种益生菌剂，活性成分包括所述发酵粘液乳杆菌菌株A21038。
本发明提供了所述发酵粘液乳杆菌菌株A21038或所述益生菌剂在制备抗氧化、抗衰老、抑菌性和抗肿瘤中至少一种的产品中的应用。
本发明提供了发酵粘液乳杆菌(Limosilactobacillusfermentum)在制备以下至少两种功能的产品中的应用：抗氧化、抗衰老、抑菌性和抗肿瘤。本发明以发酵粘液乳杆菌菌种在体外条件下分别开展了抗氧化、抗衰老、抑菌性和抗肿瘤的实验。其中所述发酵粘液乳杆菌菌种对致病菌大肠杆菌和/或大肠埃希氏菌具有良好的抑制能力，说明所述发酵粘液乳杆菌菌种具有良好的抑菌性。本发明分别以DPPH自由基、羟自由基(OH-)和超氧阴离子以及过氧化氢(H2O2)为指标说明抗氧化性能，结果表明所述发酵粘液乳杆菌对DPPH自由基具有98％以上的清除率，且在0.5mM高浓度的H2O2中培养12h依然可以生长，说明对H2O2中具有良好的耐受性，可以发挥抗氧化作用。在抗衰老方面检测，结果表面所述发酵粘液乳杆菌具有超氧化物歧化酶(SOD)活力和谷胱甘肽过氧化酶(GSH-Px)活力，延缓皮肤衰老方面效果与商品菌株鼠李糖乳杆菌LGG相当。同时分别以人结肠癌细胞HCT116和小鼠结肠癌细胞MC38为实验对象，验证了所述发酵粘液乳杆菌的抗肿瘤作用，结果表明，无论是活菌还是灭活菌均具有抑制结肠癌细胞增殖的性能，且抑制效果与时间呈相关性。同时以小鼠黑色素瘤细胞B16为实验对象，验证了所述发酵粘液乳杆菌的抗肿瘤作用，结果与结肠癌抑制结果相同，也具有抑制黑色素瘤生长的作用。因此本发明首次证明发酵粘液乳杆菌同时具备抗氧化、抗衰老、抑菌性和抗肿瘤的活性，为制备抗肿瘤药物、抑菌药物以及抗衰老和/或抗氧化的药品、保健品以及化妆品方面具有极高的应用价值。
本发明还提供了一种发酵粘液乳杆菌菌株A21038，保藏编号为GDMCCNo：64675。所述菌株A21038分离自百岁健康老人肠道粪便样本中，经形态和分子鉴定属于发酵粘液乳杆菌。所述菌株A21038生长速度快，具有耐胃肠液和耐牛胆盐的能力，能够通过胃肠道定殖于肠道发挥作用。所述菌株A21038对大肠杆菌致病菌具有良好的抑制作用，同时对自由基具有清除能力对高浓度过氧化氢具有耐受性，具有良好的抗氧化能力。另外，所述菌株A21038具有超氧化物歧化酶(SOD)活力和谷胱甘肽过氧化酶(GSH-Px)活力，具有延缓衰老的能力。此外，所述菌株A21038的活菌或灭活菌均对结肠癌和黑色素瘤的细胞增殖具有抑制作用。可见，所述菌株A21038同时具备抗氧化、抗衰老、抑菌性和抗肿瘤的特性，在工业生产中具有极高的应用价值。
附图说明
图1为发酵粘液乳杆菌菌株A21038菌株形态图；
图2为发酵粘液乳杆菌菌株A21038生长曲线图；
图3为发酵粘液乳杆菌菌株A21038对人工胃肠液耐受性检测结果图；
图4为发酵粘液乳杆菌菌株A21038对牛胆盐耐受性检测结果图；
图5为发酵粘液乳杆菌菌株A21038对H2O2耐受能力检测结果图；
图6为发酵粘液乳杆菌菌株A21038抑制人结肠癌细胞HCT116生长检测结果图；
图7为发酵粘液乳杆菌菌株A21038抑制小鼠结肠癌细胞MC38生长检测结果图；
图8为发酵粘液乳杆菌菌株A21038抑制小鼠黑色素瘤细胞B16生长检测结果图。
生物材料保藏信息
发酵粘液乳杆菌(Limosilactobacillusfermentum)菌株A21038，于2024年05月23日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，单位简称GDMCC，地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC No：64675。
具体实施方式
本发明提供了发酵粘液乳杆菌在制备以下至少两种功能的产品中的应用：抗氧化、抗衰老、抑菌性和抗肿瘤。
在本发明中，所述发酵粘液乳杆菌优选包括菌体和/或芽孢。发酵粘液乳杆菌菌体指将活化的发酵粘液乳杆菌经过扩大培养，固液分离，收集的固相菌体。所述植物乳植杆菌芽孢是指发酵粘液乳杆菌生长发育到一定阶段后，在细胞内形成一个圆形的或椭圆形的抗逆性休眠体。
在本发明中，所述发酵粘液乳杆菌的存在形态优选包括以下至少一种：发酵粘液乳杆菌的培养液、发酵粘液乳杆菌的培养上清液和发酵粘液乳杆菌的菌悬液。所述发酵粘液乳杆菌的培养液的制备方法优选将活化的发酵粘液乳杆菌接种于MRS液体培养基中培养，得到培养液。所述培养的温度优选为36～38℃，更优选为37℃。所述培养的时间为12～16h，更优选为14h。所述发酵粘液乳杆菌的接种量优选为5％～10％，更优选为8％。所述发酵粘液乳杆菌的培养上清液和发酵粘液乳杆菌的菌悬液的制备方法，优选将上述制备得到的培养液经过固液分离，液相为培养上清液，收集固相重悬，得到菌悬液。
在本发明中，所述发酵粘液乳杆菌的菌株优选包括发酵粘液乳杆菌菌株A21038。所述发酵粘液乳杆菌菌株A21038，保藏编号为GDMCC No：64675。
在本发明中，所述应用当制备包含两种功能的产品时，优选包括制备抗氧化和抗衰老的产品中的应用和/或制备抑菌性和抗肿瘤的产品中的应用；或者制备抗氧化和抗肿瘤的产品中的应用和/或制备抑菌性和抗衰老的产品中的应用；或者制备抗衰老和抗肿瘤的产品中的应用和/或制备抗氧化和抑菌性的产品中的应用。
在本发明中，所述应用当制备包含三种功能的产品时，优选包括制备抗氧化、抗衰老和抑菌性的产品中的应用；或制备抗氧化、抑菌性和抗肿瘤的产品中的应用；或制备抗衰老、抑菌性和抗肿瘤的产品中的应用；或制备抗氧化、抗衰老和抗肿瘤的产品中的应用。所述应用当制备包含四种功能的产品时，优选包括制备抗氧化、抗衰老、抑菌性和抗肿瘤的产品中的应用。
在本发明中，所述抗氧化优选表现在对以下至少一种清除能力：DPPH自由基、羟自由基、超氧阴离子和H2O2，更优选为DPPH自由基和H2O2。所述抗衰老优选表现在具有超氧化物歧化酶活性和/或谷胱甘肽过氧化酶活性。当制备抗氧化和/或抗衰老的产品时，所述产品优选包括以下至少一种：药品、保健品、化妆品和食品。所述抑菌性中的菌优选包括大肠杆菌。所述抗肿瘤中肿瘤或癌症优选包括结肠癌和/或黑色素瘤。所述制备抑菌性和/或抗肿瘤的产品时，所述产品优选包括药品。所述制备抑菌性的产品时，所述产品还可以制备体外条件下使用的抑菌剂。本发明对所述制备上述功能的产品的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的方法制备产品即可，例如采用发酵粘液乳杆菌的培养液、上清液或发酵液作为活性成分与辅料混合，制备各种形式的产品。
本发明提供了一种发酵粘液乳杆菌菌株A21038，保藏编号为GDMCC No：64675。
在本发明中，所述菌株A21038分离自百岁健康老人肠道粪便样本中。所述菌株A21038在MRS平板上的菌落呈圆形，边缘整齐，不透明，中间凸起，表面光滑，浅黄色，属于革兰氏阳性菌。所述菌株A21038的16S rDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。经形态鉴定和分子鉴定，所述菌株A21038属于发酵粘液乳杆菌。通过所述菌株A21038的生长曲线发现所述菌株A21038具有生长速度快的特点，2h进入对数期，6～24h为稳定期，24h内未出现衰亡期。
在本发明中，所述菌株A21038在人工胃液中处理3h，存活率为100％。在人工肠液中处理7h，保持70％以上的存活率，效果优于同批筛选的对照菌株A20014。所述菌株A21038在浓度0.5g/L的牛胆盐中24h时存活率为100％。上述结果说明所述菌株A21038具有耐胃肠液和耐牛胆盐的能力，能够通过胃肠道定殖于肠道发挥作用。
在本发明中，所述菌株A21038对大肠杆菌致病菌具有良好的抑制作用。所述大肠杆菌致病菌优选包括大肠杆菌和/或大肠埃希氏菌。在本发明实施例中，以大肠杆菌菌株O157:H7(ATCC 35150)和大肠埃希氏菌(ATCC 25922)为致病菌代表，说明所述菌株A21038的抑菌特性，结果表明，所述菌株A21038对大肠杆菌菌株O157:H7的抑菌圈为21.33mm，抑菌效果优于同批筛选的对照菌株A20014；所述菌株A21038对大肠埃希氏菌菌株的抑菌圈为25.00mm，抑菌效果与同批筛选的对照菌株A20014效果相当。
在本发明中，所述菌株A21038对自由基具有良好清除能力，同时对高浓度过氧化氢具有耐受性，具有良好的抗氧化能力。所述自由基优选包括DPPH自由基、羟自由基(OH-)和超氧阴离子(O2 -)。所述DPPH自由基是一种很稳定的氮中心的自由基，是样本抗氧化能力的重要指标之一，广泛应用于抗氧化类食品、保健品及药品的研究中。羟自由基(OH-)是活性氧的一种，羟自由基能杀死红细胞，降解DNA、细胞膜和多糖化合物，继而又发现许多由它所致有害效应当加入羟自由基的清除剂后会明显降低。超氧阴离子也是抗氧化性的检测指标，当生物体遭受外界胁迫时，生物体内超氧阴离子等活性氧大量产生和积累，可作为生物体氧化胁迫的信号。因此在逆境条件下生物体内超氧阴离子自由基的产生，可间接反映组织细胞受损状况和抗性强弱。过氧化氢(H2O2)是生物体内最常见的活性氧分子，是一种活性氧代谢的副产物，主要由超氧化物歧化酶(SOD)和黄嘌呤氧化酶(XOD)等催化产生，由过氧化氢酶(CAT)和活性酶(POD)等催化降解。正常人体内H2O2浓度处于较低水平，一般为10～100μM。高浓度的H2O2会诱导体内氧化应激反应的增加，直接或间接地氧化细胞内核酸，蛋白质等生物大分子，并使细胞膜遭受损害，从而加速细胞的衰老和解体，对人体细胞产生毒性作用，甚至会引起细胞功能异常和器官损伤，导致相关疾病的发生。
在本发明一个实施例中，所述菌株A21038对DPPH清除率为98％以上，效果明显优于对照菌株A20014(15％)。所述菌株A21038对羟自由基清除率为20％，效果明显优于对照菌株A20014(10％)。所述菌株A21038对超氧阴离子清除率为33％，效果明显优于对照菌株A20014(24％)。在本发明另一个实施例了，测定所述菌株A21038对高浓度过氧化氢的耐受性，所述菌株A21038在0.5mM的H2O2中处理12h依然可以生长，对H2O2具有很好的耐受作用，而对照菌株A20014在相同条件下无法繁殖，对H2O2不具有耐受性。
在本发明中，所述菌株A21038具有超氧化物歧化酶活力和谷胱甘肽过氧化酶(GSH-Px)活力，具有延缓衰老的能力。超氧化物歧化酶能催化超氧化物阴离子发生歧化作用，生成过氧化氢(H2O2)和氧气(O2)，是生物体内一种重要的抗氧化酶，在防止皮肤老化、损伤中发挥作用。谷胱甘肽过氧化物酶专一使用谷胱甘肽(GSH)还原过氧化物，尤其是过氧化氢。所述谷胱甘肽是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成，具有抗氧化作用和整合解毒作用。谷胱甘肽不仅仅可用于医疗药物，它还兼具减少黑色素生长的美白功效，延缓衰老。在本发明一个实施例中，证明所述菌株A21038具有分泌超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化酶的能力，经测定超氧化物歧化酶的活力为0.27U/104CFU，谷胱甘肽过氧化酶的活力为0.77nmol/min/mL。
在本发明中，所述菌株A21038的活菌或灭活菌均对结肠癌和黑色素瘤的细胞增殖具有抑制作用。所述菌株A21038的灭活菌的制备方法优选为将菌体在70℃下处理30min。在本发明一个实施例中，所述菌株A21038的活菌在抑制肿瘤细胞生长方面优于灭活菌，在商业菌株LGG中存在相同的结果。
本发明提供了一种益生菌剂，活性成分包括所述发酵粘液乳杆菌菌株A21038。
在本发明中，所述益生菌剂是指补充肠道内的有益菌，使有益菌有足够的数量，发挥独特的生物学功效，从而实现保健或疾病预防和治疗的目的。所述发酵粘液乳杆菌菌株A21038的活菌浓度优选为1×109CFU/mg～1×1011CFU/mg或1×109CFU/mL～1×1011CFU/mL，进一步优选为5×109CFU/mg～5×1010CFU/mg或5×109CFU/mL～5×1010CFU/mL，更优选为8×109CFU/mg～2×1011CFU/mg或8×109CFU/mL～2×1011CFU/mL，最优选为1×1010CFU/mg或1×1010CFU/mL。所述益生菌剂的剂型优选为以下至少一种：片剂、滴剂、胶囊和粉剂。所述粉剂是低温冷冻干燥技术加工得到，保障了益生菌的活性。所述粉剂的辅料优选包括冷冻干燥剂，例如脱脂奶粉等。所述粉剂适合温水冲服，适合婴儿。所述片剂是将发酵粘液乳杆菌菌株A21038和辅料混合压片制备得到，适合咀嚼服用。所述辅料优选包括甜味剂或可可粉等。所述胶囊优选为将发酵粘液乳杆菌菌株A21038单独或与辅料混合作为囊芯分装在胶囊壳内。所述滴剂是将发酵粘液乳杆菌菌株A21038与食用油混合制成隔绝空气、水分的滴剂，服用时打开滴剂口将封装的油状物挤入口中。
鉴于所述发酵粘液乳杆菌菌株A21038的多重功能，本发明提供了所述发酵粘液乳杆菌菌株A21038或所述益生菌剂在制备抗氧化、抗衰老、抑菌性和抗肿瘤中至少一种的产品中的应用。
本发明对所述产品的具体种类不做特殊限制，采用本领域所熟知具体功效的产品类型即可。
下面结合实施例对本发明提供的一种具有抗氧化、抗衰老和抗肿瘤活性的发酵粘液乳杆菌菌株A21038及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
发酵粘液乳杆菌菌株A21038的分离和鉴定
将百岁健康老人肠道粪便样本经过倍比稀释，涂布在MRS平皿，在生化培养箱37℃培养48h，获得单菌落。挑取单菌落，接种于MRS液体培养基，放在37℃摇床培养12～16h。取菌液在MRS平皿上划线，继续培养出单菌落。培养24h后再挑取单菌落重新划线，继续培养出单菌落，即为所得到纯分离的乳杆菌。挑取纯分离的乳杆菌单菌落，进行革兰氏染色、16SrDNA PCR扩增以及16SrDNA测序，经过NCBI数据库比对结果。
所述菌株A21038在MRS平板中生长状态如图1所示，菌落呈圆形，边缘整齐，不透明，中间凸起，表面光滑，浅黄色，属于革兰氏阳性菌。
所述菌株A21038的16SrDNA序列为GGCCTAATACATGCAGTCGAACGC GTTGGCCCAATTGATTGATGGTGCTTGCACCTGATTGATTTTGGTCGCCAACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTAGGTAACCTGCCCAGAAGCGGGGGACAACATTTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAGCGTTGTTCGCATGAACAACGCTTAAAAGATGGCTTCTCGCTATCACTTCTGGATGGACCTGCGGTGCATTAGCTTGTTGGTGGGGTAACGGCCTACCAAGGCGATGATGCATAGCCGAGTTGAGAGACTGATCGGCCACAATGGGACTGAGACACGGCCCATACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGGCGCAAGCCTGATGGAGCAACACCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAGCTCTGTTGTTAAAGAAGAACACGTATGAGAGTAACTGTTCATACGTTGACGGTATTTAACCAGAAAGTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGAGAGTGCAGGCGGTTTTCTAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTTAACCGGAGAAGTGCATCGGAAACTGGATAACTTGAGTGCAGAAGAGGGTAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGGAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTACCTGGTCTGCAACTGACGCTGAGACTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAGTGCTAGGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCCGGAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTTGCGCCAACCCTAGAGATAGGGCGTTTCCTTCGGGAACGCAATGACAGGTGGTGCATGGTCGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTTACTAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTAGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAGATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGGTACAACGAGTCGCGAACTCGCGAGGGCAAGCAAATCTCTTAAAACCGTTCTCAGTTCGGACTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCACGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCAAAGTCGGTGGGGTAACCTTTTAGGAGCCAGCCGCGTAAGGGGACAGA(SEQ ID NO:1)。所述菌株A21038与Lactobacillusfermentum strain 562516S序列相似度为99.93％，为发酵粘液乳杆菌。将所述菌株A21038保藏至广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNo64675。
实施例2
发酵粘液乳杆菌菌株A21038生长曲线
将菌株从甘油保藏管中取出，在MRS固体平板中划线，置于37℃培养箱培养，24h后挑取单克隆至2ml MRS液体培养基培养12～16h，重复该步骤1次，使菌株充分活化，然后吸取0.2mL菌悬液至96孔板中，做3个重复孔，并使用酶标仪检测其24h内生长情况，检测波长为600nm，测定结束后进行统计并作图。
图2显示了发酵粘液乳杆菌A21038的生长曲线。菌株A21038生长速度较快，2h后进入对数生长期，6-24h为稳定期，该菌生长稳定，在24h内未出现衰亡期。
实施例3
发酵粘液乳杆菌菌株A21038耐人工胃肠液功能
分别将所述菌株A21038、从百岁老人粪便中分离出的其他株发酵粘液乳杆菌A20014(作为对照菌株)的甘油保藏管解冻后，用MRS固体培养基进行平板划线，置于37℃培养箱进行过夜培养，24h后分别挑取单克隆菌落接种于MRS液体培养基，于37℃摇床培养12～16h。重复该步骤1次，使菌株充分活化，得到菌液。按10％的接种量，将菌液接种于pH 2.5的人工胃液(配方为胃蛋白酶10g，盐酸16.4ml，蒸馏水定容至100ml)，设置3个时间点(0h、1h、3h)，各取100μl涂布于MRS平皿，在生化培养箱37℃培养48h后，计数单菌落数量；将在人工胃液处理3h后的菌液，按10％的接种量接种于pH 6.8的人工肠液(配方为胰酶10g，磷酸二氢钾6.8g，蒸馏水定容至1000ml，使用NaOH调节pH值)，设置4个时间点(0h、2h、4h、8h)，各取100μl涂布于MRS平皿，在生化培养箱37℃培养48h后，计数单菌落数量，按照公式I计算存活率。
存活率(％)＝(不同时间点的单菌落数量/0h时单菌落数量)×100％公式I
结果如图3显示，对照菌株A20014在pH2.5人工胃液中存活率达100％，而其在肠液中存活率随着时间的延长而降低，在肠液7h时存活率低于20％。与对照菌株A20014相比，所述菌株A21038在人工胃液3h时存活率达100％，在肠液7h后仍然保持70％以上的存活率，显著优于对照菌株A20014。说明菌株A21038具有极好的胃肠道耐受的能力，可以顺利通过胃肠液刺激而到达肠道发挥作用。
实施例4
发酵粘液乳杆菌A21038耐牛胆盐能力测定
分别将所述菌株A21038、从百岁老人粪便中分离出的其他株发酵粘液乳杆菌A20014(作为对照菌株)的甘油保藏管解冻后，用MRS固体培养基进行平板划线，置于37℃培养箱进行过夜培养，24h后分别挑取单克隆菌落接种于MRS液体培养基，于37℃摇床培养12～16h。重复该步骤1次，使菌株充分活化，得到菌液。分别取1mL加入至分别含有0.3g/L或0.5g/L牛胆盐的MRS培养基中，37℃厌氧培养18h，分别取加入后0h、2h、24h培养液100uL进行梯度稀释涂布，置于37℃厌氧条件下培养1-2天，统计活菌数。根据公式II计算菌株耐胆盐存活率：
耐胆盐存活率＝(N h活菌数/0h活菌数)×100％公式II
其中，N表示2h或24h。
结果如图4所示，与对照菌株A20014相比，所述菌株A21038在浓度为0.5g/L的牛胆盐中24h时存活率仍然超过100％，说明菌株A21038具有极好的胆盐耐受的能力。
实施例5
发酵粘液乳杆菌菌株A21038抑制病原菌功能
将处于对数生长期(浓度为1×109CFU/mL)的致病菌大肠杆菌O157:H7(ATCC35150)、大肠埃希氏菌(ATCC 25922)吸取0.1mL涂布于LB平板中，放置牛津杯。
根据实施例2活化菌株的方法，获得活化后的菌悬液，将OD600调整至0.5(浓度为1×106CFU/mL)，取200μl菌悬液接种至牛津杯中，做3个重复，过夜，观察其对致病菌的作用。抑菌圈大小统计方式为，用直尺测量抑菌圈的大小，取3次重复的平均值。结果如下表1所示。
表1菌株抑制病原菌检测结果
结果表明，所述发酵粘液乳杆菌菌株A21038具有显著抑制致病菌生长的能力，且优于对照菌株A20014。
实施例6
发酵粘液乳杆菌菌株A21038抗氧化功能
根据实施例2活化菌株A21038的方法，获得活化后的菌悬液以及对照菌株A20014菌悬液，菌悬液调整OD600至0.5(浓度为1×106CFU/mL)，备用。
当有抗氧化剂存在时，DPPH自由基被清除，其溶液颜色变浅，515nm的吸光度下降，在一定范围内其吸光度的变化与自由基被清除的程度成正比。通过吸光度下降的程度来反映样本清除DPPH自由基的能力。按照DPPH自由基清除能力试剂盒说明书(江莱生物)对两株菌株进行检测。
2-脱氧核糖在羟自由基(OH-)存在下被氧化成丙二醛类似物，接着与硫代巴比妥酸(TBA)缩合生成有色产物，通过测定该有色产物在532nm的最大吸收峰，进而计算出羟自由基(OH-)含量。按照羟自由基(OH-)含量测定试剂盒(江莱生物)说明书对两株菌株进行检测。
超氧阴离子(O2 -)与羟胺反应产生NO2 －，NO2 －在对氨基苯磺酸和α-萘胺作用下，生成粉红色的偶氮染料，该染料在540nm处有最大光吸收，根据A540值可计算出样品中的O2 -的含量。按照超氧阴离子(O2 -)试剂盒(格瑞思生物)说明书对两株菌株进行检测。
检测结果如表2所示。
表2两株菌株的抗氧化性检测结果
结果表明，所述发酵粘液乳杆菌菌株A21038具有良好的抗氧化能力，并显著优于对照菌株A20014。
实施例7
发酵粘液乳杆菌菌株A21038对H2O2耐受能力测定
过氧化氢(H2O2)是生物体内最常见的活性氧分子，是一种活性氧代谢的副产物，主要由SOD和XOD等催化产生，由CAT和POD等催化降解。正常人体内H2O2浓度处于较低水平，一般为10～100μM。高浓度的H2O2会诱导体内氧化应激反应的增加，直接或间接地氧化细胞内核酸，蛋白质等生物大分子，并使细胞膜遭受损害，从而加速细胞的衰老和解体，对人体细胞产生毒性作用，甚至会引起细胞功能异常和器官损伤，导致相关疾病的发生。
将所述菌株A21038，对照菌株A20014从甘油保藏管中取出划线活化3次，挑取单克隆至MRS液体培养基培养，加入0.5mM、1.0mM、2.0mM不同浓度的H2O2并使用酶标仪检测其生长情况，测定结束后进行绘图。
结果如图5所示，发酵粘液乳杆菌A21038(图5中A)在0.5mM高浓度的H2O2中12h依然可以生长，对H2O2具有很好的耐受作用，而对照菌株A20014在相同条件下无法繁殖(图5中B)，对H2O2不具有耐受性。说明所述菌株A21038在体内高度氧化应激环境下依然可以稳定生长，发挥抗氧化作用。
实施例8
发酵粘液乳杆菌菌株A21038延缓衰老功能
超氧化物歧化酶(SOD)能催化超氧化物阴离子发生歧化作用，生成过氧化氢(H2O2)和氧气(O2)，是生物体内一种重要的抗氧化酶，在防止皮肤老化、损伤中发挥作用。谷胱甘肽(GSH)是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成，具有抗氧化作用和整合解毒作用。谷胱甘肽不仅仅可用于医疗药物，它还兼具减少黑色素生长的美白功效，延缓衰老。
商业菌株鼠李糖乳杆菌(Lacticaseibacillus rhamnosus)菌株LGG作为人体肠道中的有益菌，能够增强机体免疫，改善胃肠道功能以及延缓机体衰老的过程。根据上述实施例研究结果显示，本发明所述菌株A21038的各项性能均显著优于同一种属的对照菌株A20014，因此，以下实施例中则选取LGG作为对照菌株，研究本发明所述菌株A21038的抗衰老功能。
(1)菌株A21038具有超氧化物歧化酶(SOD)活力检测
将所述菌株A21038和商业菌株鼠李糖乳杆菌LGG菌液浓度分别调至浓度5×106CFU/mL，离心弃上清，按照SOD活性检测试剂盒(江莱生物)操作流程，测定菌株含SOD活力。结果定义为每104CFU单菌落在反应体系中SOD抑制率达50％时，所对应的SOD量为一个SOD活力单位。
(2)菌株A21038具有谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力检测
将所述菌株A21038和对照菌株LGG的菌液浓度调分别至5×106CFU/mL，离心弃上清，按照GSH-Px检测试剂盒(格锐思生物提供)操作流程，测定菌株中GSH-Px含量。结果定义为在25℃反应条件下，每104个细胞每分钟氧化1nmol GSH为1个酶活单位。
所述发酵粘液乳杆菌A21038所含酶活力如下表3所示。
表3酶活力检测结果
菌株 SOD活力(U/104CFU) GSH-Px酶活(nmol/min/mL)
A21038 0.27 0.77
LGG 0.51 0.77
结果表明，发酵粘液乳杆菌菌株A21038具有良好的谷胱甘肽过氧化酶活性，可以在延缓皮肤衰老方面发挥作用，其效果与对照菌株LGG相当。
实施例9
发酵粘液乳杆菌菌株A21038对人结肠癌细胞HCT116的抑制作用
HCT116细胞株接种在含有10％胎牛血清的RPMI1640培养基(TransGen)中培养，待细胞生长至对数期时，用胰酶消化后通过血球计数板进行细胞计数，将细胞按照每孔5000个细胞均匀接种于96孔板中，置于37℃三气培养箱中培养过夜。
有现有技术报道商业菌株鼠李糖乳杆菌LGG具有抗肿瘤的作用，因此选择LGG菌株作为本实施例的阳性对照。将所述菌株A21038以及对照菌株LGG从甘油保藏管中取出，在MRS固体平板中划线，置于37℃培养箱培养，24h后挑取单克隆至2ml MRS液体培养基培养12～16h，重复该步骤1次，使菌株充分活化，获得菌悬液，调整菌悬液OD600＝0.5，浓度为1×106CFU/mL，用PBS清洗3次之后，分为活菌与灭活菌(70℃30min)，按照每孔0.2mL菌悬液依次加入96孔板中，活菌与细胞共孵育2h，灭活菌灭活后与细胞共孵育至72h。利用CCK-8试剂(索莱宝)检测HCT116细胞增殖情况。
结果如图6所示。所述菌株A21038活菌可以显著抑制HCT116细胞增殖(P<0.0001)，其效果与对照菌株LGG相当。所述菌株A21038在灭活后48h内表现出显著的抑制效果(P<0.001)，且优于对照菌株LGG。菌株灭活后效果显著弱于活菌效果，菌株灭活之后之所以能发挥潜在的抗肿瘤细胞生长作用，有可能是因为灭活后的菌体蛋白发挥作用，这有待进一步研究。
实施例10
发酵粘液乳杆菌菌株A21038对小鼠结肠癌细胞MC38的抑制作用
MC38细胞株接种在含有10％胎牛血清的DMEM培养基(TransGen)中培养，待细胞生长至对数期时，用胰酶消化后通过血球计数板进行细胞计数，将细胞按照每孔5000个细胞均匀接种于96孔板中，置于37℃三气培养箱中培养过夜。
将所述菌株A21038以及对照菌株LGG分别从甘油保藏管中取出，在MRS固体平板中划线，置于37℃培养箱培养，24h后挑取单克隆至2ml MRS液体培养基培养12-16h，重复该步骤1次，使菌株充分活化，获得菌悬液，调整菌悬液OD600＝0.5，浓度为1×106CFU/mL，用PBS清洗3次之后，分为活菌与灭活菌(70℃30min)，按照每孔0.2mL菌悬液依次加入96孔板中，分别与细胞共孵育24h、48h、72h。利用CCK-8试剂(索莱宝)检测MC38细胞增殖情况。
结果如图7所示，所述菌株A21038与商业菌株LGG，均可以显著抑制结肠癌细胞增殖，且随着时间增加，活菌抑制效果越显著(P<0.0001)，所述菌株A21038灭活后在72h到达半抑制效果，显著弱于活菌效果。因此，推测所述菌株A21038具有潜在的抗结肠癌细胞生长能力可能主要是依赖于活菌本身或其所产生的代谢物，灭活后细菌菌体发挥的作用较弱。
实施例11
发酵粘液乳杆菌菌株A21038对小鼠黑色素瘤细胞B16的抑制作用
B16细胞株接种在含有10％胎牛血清的DMEM培养基(TransGen)中培养，待细胞生长至对数期时，用胰酶消化后通过血球计数板进行细胞计数，将细胞按照每孔5000个细胞均匀接种于96孔板中，置于37℃三气培养箱中培养过夜。
将所述菌株A21038以及对照菌株LGG从甘油保藏管中取出，在MRS固体平板中划线，置于37℃培养箱培养，24h后挑取单克隆至2ml MRS液体培养基培养12～16h，重复该步骤1次，使菌株充分活化，获得菌悬液，调整菌悬液OD600至0.5(浓度为1×106CFU/mL)，用PBS清洗3次之后，分为活菌与灭活菌(70℃30min)，按照每孔0.2mL菌悬液依次加入96孔板中，分别与细胞共孵育24h。利用CCK-8试剂(索莱宝)检测细胞增殖情况。
结果如图8所示，所述菌株A21038可以显著抑制黑色素瘤细胞增殖(P<0.0001)，其效果与对照菌株LGG相当。不管是A21038还是商业菌株LGG，其灭活后的效果均弱于活菌效果。因此，推测所述菌株A21038具有潜在的抗黑色素瘤细胞生长能力可能是依赖于活菌本身或其所产生的代谢物，灭活后细菌菌体发挥的作用较弱。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.发酵粘液乳杆菌(Limosilactobacillusfermentum)在制备以下至少两种功能的产品中的应用：抗氧化、抗衰老、抑菌性和抗肿瘤。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述抗氧化表现在对以下至少一种清除能力：DPPH自由基、羟自由基、超氧阴离子和H2O2。
3.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述抗衰老表现在具有超氧化物歧化酶活性和/或谷胱甘肽过氧化酶活性。
4.根据权利要求1～3中任意一项所述应用，其特征在于，当制备抗氧化和/或抗衰老的产品时，所述产品包括以下至少一种：药品、保健品、化妆品和食品。
5.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述抑菌性中的菌包括大肠杆菌。
6.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述抗肿瘤中肿瘤或癌症包括结肠癌和/或黑色素瘤。
7.根据权利要求1、5和6中任意一项所述应用，其特征在于，所述制备抑菌性和/或抗肿瘤的产品时，所述产品包括药品。
8.一种发酵粘液乳杆菌菌株A21038，其特征在于，保藏编号为GDMCC No：64675。
9.一种益生菌剂，其特征在于，活性成分包括权利要求8所述发酵粘液乳杆菌菌株A21038。
10.权利要求8所述发酵粘液乳杆菌菌株A21038或权利要求9所述益生菌剂在制备抗氧化、抗衰老、抑菌性和抗肿瘤中至少一种的产品中的应用。
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CN120272367A (zh) * 2025-04-10 2025-07-08 渤海大学 一种发酵粘液乳杆菌bl-swn1及其应用

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