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CN118979036B - 抑制APP基因表达的siRNA及其缀合物和应用 - Google Patents

抑制APP基因表达的siRNA及其缀合物和应用

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CN118979036B
CN118979036B CN202411052122.5A CN202411052122A CN118979036B CN 118979036 B CN118979036 B CN 118979036B CN 202411052122 A CN202411052122 A CN 202411052122A CN 118979036 B CN118979036 B CN 118979036B
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Abstract

本发明属于生物医药领域，涉及一种抑制APP基因表达的siRNA和缀合物，所述siRNA包含正义链和反义链，所述正义链包含核苷酸序列I，所述反义链包含核苷酸序列II；所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II中的每一个核苷酸均为修饰或未修饰的核苷酸；所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II至少部分地反向互补形成双链区；所述核苷酸序列I与第一段核苷酸序列基本一致，所述第一段核苷酸序列为APP基因表达的mRNA中的一段长度为至少19个核苷酸的核苷酸序列。本发明的siRNA可特异性诱导APP mRNA降解，从而抑制肝脏中APP的合成，诱导APP蛋白持久减少，减少Aβ等相关毒性蛋白病理性沉积，有良好的成药前景。

Description

抑制APP基因表达的siRNA及其缀合物和应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种抑制APP基因表达的siRNA和缀合物。
背景技术
阿尔茨海默(Alzheimer Disease，AD)是痴呆的主要原因，定义是淀粉样蛋白β斑块和神经原纤维缠结，表现为遗忘，或视觉、语言、执行、行为或运动功能障碍。
脑淀粉样血管病(Cerebral amyloid angiopathy,CAA)在老年人的大脑中是一种常见的以β淀粉样蛋白(Amyloidβ，Aβ)沉积于颅内微血管(软脑膜动脉、皮质小动脉、毛细血管)为特点的神经系统变性疾病。临床可以表现为脑叶出血、认知功能障碍、快速进展性痴呆、脑淀粉样发作等不同亚型；中老年以痴呆、精神症状、反复或多发性脑叶出血起病者要考虑，目前尚无特异性治疗。
人源APP(Amyloid Precursor Protein)基因，定位于染色体21q21.3，含有20个外显子,编码淀粉样前体蛋白，APP膜蛋白。研究证实，APP蛋白分解产生的β-淀粉样蛋白(amyloidβ-protein，Aβ)是导致AD和CAA两种疾病重要病理原因。APP和Aβ都与AD有关，Aβ的毒性取决于APP的表达，APP的作用超出了产生毒性片段的范围。衰老通过诱导APP进程，使得β分泌酶上调而加速Aβ的积累。过度表达APP的转基因小鼠也发生血管活性信号的显著改变，导致神经血管功能障碍。而APP的减少将导致Aβ以及所有其他有毒APP代谢物同时减少，这将减轻与AD相关的毒性环境并减缓疾病进展。因此，靶向APP减少Aβ的形成是药物开发的重点。
目前靶向APP的疗法有免疫疗法或APP分泌酶抑制剂等，但免疫疗法中将药物有效递送到大脑是关键性问题，其他或因毒性或副作用而被临床试验终止。而靶向Aβ蛋白抗体药的临床证据均集中在早期AD患者，因此中、晚期患者并不符合用药适应症，并且有脑水肿等毒副作用。其它针对AD的特异性药物，如乙酰胆碱抑制剂，只能对轻度至中度的AD症状有所缓解，并没有显著治疗作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够抑制APP基因表达的siRNA分子，以期对阿尔茨海默和脑淀粉样血管病提供新的治疗方式。
在一方面，本发明提供一种siRNA，所述siRNA包含正义链和反义链，所述正义链包含核苷酸序列I，所述反义链包含核苷酸序列II；所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II中的每一个核苷酸均为修饰或未修饰的核苷酸；所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II至少部分地反向互补形成双链区；所述核苷酸序列I与第一段核苷酸序列基本一致，所述第一段核苷酸序列为APP基因表达的mRNA中的一段长度为至少19个核苷酸的核苷酸序列。
在优选实施方式中，所述第一段核苷酸序列为APP基因表达的mRNA中的一段长度为19～25个核苷酸的核苷酸序列，例如，19、20、21、22、23、24或25个核苷酸。
在优选实施方式中，所述第一段核苷酸序列为APP基因表达的mRNA的高活性区间中的一段长度为至少19个核苷酸的核苷酸序列，如19～25个核苷酸的核苷酸序列。所述高活性区间为APP基因表达的mRNA的第334-804位、2305-2327位和2813-2835位，优选为第334-356位、第490-512位、第503-525位、第635-656位、第641-662位、第782-804位、2305-2327位和2813-2835位；所述APP基因表达的mRNA如NCBI refseq ID NM_000484.4所示；具体地，所述APP基因表达的mRNA的序列如SEQ ID NO:1所示。
所述高活性区间是指在该段区间内设计的siRNA和siRNA缀合物都能有效降低APPmRNA水平，在图1中根据观察到的siRNA和siRNA缀合物对APP mRNA的最大抑制率是否落入40-60％、60％-80％或大于80％进行了区间划分。
在优选实施方式中，所述核苷酸序列I与第一段核苷酸有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％的序列一致性。
在一些实施方案中，上述siRNA中，所述核苷酸序列II与所述第一段核苷酸序列基本上反向互补、实质上反向互补或完全反向互补。
所述正义链和反义链长度相同或不同，所述正义链的长度为16-23个核苷酸，反义链的长度为19-26个核苷酸。在一些实施方案中，所述siRNA正义链和反义链的长度比为16/21、19/21、21/23、19/24。
在具体实施方式中，所述序列I包含SEQ ID NO:2-111中任一序列所示的至少15个连续核苷酸，如至少15、16、17、18、19、20或21个核苷酸。优选地，所述序列I如SEQ ID NO:2-111任一序列所示。
在具体实施方式中，所述序列II包含SEQ ID NO:112-221中任一序列所示的至少15个连续核苷酸，如至少15、16、17、18、19、20、21、22或23个核苷酸。优选地，所述序列II如SEQ ID NO:112-221任一序列所示。
在具体实施方式中，所述siRNA包括正义链和反义链，为：
1)所述正义链的序列如SEQ ID NO:2所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:112所示；
2)所述正义链的序列如SEQ ID NO:3所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:113所示；
3)所述正义链的序列如SEQ ID NO:4所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:114所示；
4)所述正义链的序列如SEQ ID NO:5所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:115所示；
5)所述正义链的序列如SEQ ID NO:6所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:116所示；
6)所述正义链的序列如SEQ ID NO:7所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:117所示；
7)所述正义链的序列如SEQ ID NO:8所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:118所示；
8)所述正义链的序列如SEQ ID NO:9所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:119所示；
9)所述正义链的序列如SEQ ID NO:10所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:120所示；
10)所述正义链的序列如SEQ ID NO:11所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:121所示；
11)所述正义链的序列如SEQ ID NO:12所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:122所示；
12)所述正义链的序列如SEQ ID NO:13所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:123所示；
13)所述正义链的序列如SEQ ID NO:14所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:124所示；
14)所述正义链的序列如SEQ ID NO:15所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:125所示；
15)所述正义链的序列如SEQ ID NO:16所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:126所示；
16)所述正义链的序列如SEQ ID NO:17所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:127所示；
17)所述正义链的序列如SEQ ID NO:18所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:128所示；
18)所述正义链的序列如SEQ ID NO:19所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:129所示；
19)所述正义链的序列如SEQ ID NO:20所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:130所示；
20)所述正义链的序列如SEQ ID NO:21所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:131所示；
21)所述正义链的序列如SEQ ID NO:22所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:132所示；
22)所述正义链的序列如SEQ ID NO:23所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:133所示；
23)所述正义链的序列如SEQ ID NO:24所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:134所示；
24)所述正义链的序列如SEQ ID NO:25所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:135所示；
25)所述正义链的序列如SEQ ID NO:26所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:136所示；
26)所述正义链的序列如SEQ ID NO:27所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:137所示；
27)所述正义链的序列如SEQ ID NO:28所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:138所示；
28)所述正义链的序列如SEQ ID NO:29所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:139所示；
29)所述正义链的序列如SEQ ID NO:30所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:140所示；
30)所述正义链的序列如SEQ ID NO:31所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:141所示；
31)所述正义链的序列如SEQ ID NO:32所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:142所示；
32)所述正义链的序列如SEQ ID NO:33所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:143所示；
33)所述正义链的序列如SEQ ID NO:34所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:144所示；
34)所述正义链的序列如SEQ ID NO:35所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:145所示；
35)所述正义链的序列如SEQ ID NO:36所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:146所示；
36)所述正义链的序列如SEQ ID NO:37所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:147所示；
37)所述正义链的序列如SEQ ID NO:38所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:148所示；
38)所述正义链的序列如SEQ ID NO:39所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:149所示；
39)所述正义链的序列如SEQ ID NO:40所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:150所示；
40)所述正义链的序列如SEQ ID NO:41所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:151所示；
41)所述正义链的序列如SEQ ID NO:42所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:152所示；
42)所述正义链的序列如SEQ ID NO:43所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:153所示；
43)所述正义链的序列如SEQ ID NO:44所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:154所示；
44)所述正义链的序列如SEQ ID NO:45所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:155所示；
45)所述正义链的序列如SEQ ID NO:46所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:156所示；
46)所述正义链的序列如SEQ ID NO:47所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:157所示；
47)所述正义链的序列如SEQ ID NO:48所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:158所示；
48)所述正义链的序列如SEQ ID NO:49所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:159所示；
49)所述正义链的序列如SEQ ID NO:50所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:160所示；
50)所述正义链的序列如SEQ ID NO:51所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:161所示；
51)所述正义链的序列如SEQ ID NO:52所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:162所示；
52)所述正义链的序列如SEQ ID NO:53所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:163所示；
53)所述正义链的序列如SEQ ID NO:54所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:164所示；
54)所述正义链的序列如SEQ ID NO:55所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:165所示；
55)所述正义链的序列如SEQ ID NO:56所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:166所示；
56)所述正义链的序列如SEQ ID NO:57所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:167所示；
57)所述正义链的序列如SEQ ID NO:58所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:168所示；
58)所述正义链的序列如SEQ ID NO:59所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:169所示；
59)所述正义链的序列如SEQ ID NO:60所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:170所示；
60)所述正义链的序列如SEQ ID NO:61所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:171所示；
61)所述正义链的序列如SEQ ID NO:62所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:172所示；
62)所述正义链的序列如SEQ ID NO:63所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:173所示；
63)所述正义链的序列如SEQ ID NO:64所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:174所示；
64)所述正义链的序列如SEQ ID NO:65所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:175所示；
65)所述正义链的序列如SEQ ID NO:66所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:176所示；
66)所述正义链的序列如SEQ ID NO:67所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:177所示；
67)所述正义链的序列如SEQ ID NO:68所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:178所示；
68)所述正义链的序列如SEQ ID NO:69所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:179所示；
69)所述正义链的序列如SEQ ID NO:70所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:180所示；
70)所述正义链的序列如SEQ ID NO:71所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:181所示；
71)所述正义链的序列如SEQ ID NO:72所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:182所示；
72)所述正义链的序列如SEQ ID NO:73所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:183所示；
73)所述正义链的序列如SEQ ID NO:74所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:184所示；
74)所述正义链的序列如SEQ ID NO:75所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:185所示；
75)所述正义链的序列如SEQ ID NO:76所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:186所示；
76)所述正义链的序列如SEQ ID NO:77所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:187所示；
77)所述正义链的序列如SEQ ID NO:78所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:188所示；
78)所述正义链的序列如SEQ ID NO:79所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:189所示；
79)所述正义链的序列如SEQ ID NO:80所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:190所示；
80)所述正义链的序列如SEQ ID NO:81所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:191所示；
81)所述正义链的序列如SEQ ID NO:82所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:192所示；
82)所述正义链的序列如SEQ ID NO:83所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:193所示；
83)所述正义链的序列如SEQ ID NO:84所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:194所示；
84)所述正义链的序列如SEQ ID NO:85所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:195所示；
85)所述正义链的序列如SEQ ID NO:86所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:196所示；
86)所述正义链的序列如SEQ ID NO:87所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:197所示；
87)所述正义链的序列如SEQ ID NO:88所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:198所示；
88)所述正义链的序列如SEQ ID NO:89所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:199所示；
89)所述正义链的序列如SEQ ID NO:90所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:200所示；
90)所述正义链的序列如SEQ ID NO:91所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:201所示；
91)所述正义链的序列如SEQ ID NO:92所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:202所示；
92)所述正义链的序列如SEQ ID NO:93所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:203所示；
93)所述正义链的序列如SEQ ID NO:94所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:204所示；
94)所述正义链的序列如SEQ ID NO:95所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:205所示；
95)所述正义链的序列如SEQ ID NO:96所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:206所示；
96)所述正义链的序列如SEQ ID NO:97所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:207所示；
97)所述正义链的序列如SEQ ID NO:98所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:208所示；
98)所述正义链的序列如SEQ ID NO:99所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:209所示；
99)所述正义链的序列如SEQ ID NO:100所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:210所示；
100)所述正义链的序列如SEQ ID NO:101所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:211所示；
101)所述正义链的序列如SEQ ID NO:102所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:212所示；
102)所述正义链的序列如SEQ ID NO:103所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:213所示；
103)所述正义链的序列如SEQ ID NO:104所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:214所示；
104)所述正义链的序列如SEQ ID NO:105所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:215所示；
105)所述正义链的序列如SEQ ID NO:106所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:216所示；
106)所述正义链的序列如SEQ ID NO:107所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:217所示；
107)所述正义链的序列如SEQ ID NO:108所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:218所示；
108)所述正义链的序列如SEQ ID NO:109所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:219所示；
109)所述正义链的序列如SEQ ID NO:110所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:220所示；或者
110)所述正义链的序列如SEQ ID NO:111所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:221所示。
在一方面，本发明提供的siRNA中，所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II中的每一个核苷酸均为修饰的核苷酸。
在具体实施方式中，所述修饰的核苷酸为氟代修饰的核苷酸或者非氟代修饰的核苷酸。
在具体实施方式中，所述氟代修饰的核苷酸指核苷酸的核糖基2'-位的羟基被氟取代形成的核苷酸，其具有以下式(1)所示的结构。所述非氟代修饰的核苷酸指核苷酸的核糖基2'-位的羟基被非氟基团取代形成的核苷酸或核苷酸类似物。在一些实施方案中，每一个非氟代修饰的核苷酸独立地选自核苷酸的核糖基2'-位的羟基被非氟基团取代形成的核苷酸或核苷酸类似物中的一种。这些核糖基2'-位的羟基被非氟基团取代形成的核苷酸是本领域技术人员所公知的，这些核苷酸可以选自2'-烷氧基修饰的核苷酸、2'-经取代的烷氧基修饰的核苷酸、2'-烷基修饰的核苷酸、2'-经取代的烷基修饰的核苷酸、2'-氨基修饰的核苷酸、2'-经取代的氨基修饰的核苷酸、2'-脱氧核苷酸中的一种。在一些实施方案中，2'-烷氧基修饰的核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸(2'-OMe)，如式(2)所示。在一些实施方案中，2'-经取代的烷氧基修饰的核苷酸，例如可以是2'-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸(2'-MOE)，如式(3)所示。在一些实施方案中，2'-氨基修饰的核苷酸(2'-NH2)如式(4)所示。在一些实施方案中，2'-脱氧核苷酸(DNA)如式(5)所示。
核苷酸类似物指能够在核酸中代替核苷酸，但结构不同于腺嘌呤核糖核苷、鸟嘌呤核糖核苷酸、胞嘧啶核糖核苷酸、尿嘧啶核糖核苷酸或胸腺嘧啶核糖核苷酸的基团。在一些实施方案中，核苷酸类似物可以是异核苷酸、桥连核苷酸或无环核苷酸。
桥连核苷酸是指受约束的或不能接近的核苷酸。桥连核苷酸可以含有五元环、六元环或七元环的具有固定C3-内切糖缩拢的桥连结构。在一些实施方案中，桥连核苷酸可以是LNA、ENA、cET BNA等；其中LNA如式(6)所示，ENA如式(7)所示，cET BNA如式(8)所示。
无环核苷酸是核苷酸的糖环被打开形成的一类核苷酸。在一些实施方案中，无环核苷酸可以是解锁核酸(UNA)或甘油核酸(GNA)，其中，UNA如式(9)所示，GNA如式(10)所示。
上述式(9)和式(10)中，R选自H、OH、或烷氧基(O-烷基)。
异核苷酸是指核苷酸中碱基在核糖环上的位置发生改变而形成的化合物。在一些实施方案中，异核苷酸可以是碱基从核糖环的1’-位移动至2'位或3'位而形成的化合物。如式(11)或式(12)所示。
上述式(11)、式(12)化合物中，R选自H、OH、F或者如上述的非氟基团；
上述式(1)～式(12)化合物中，Base表示碱基，例如A、U、G、C或T。
在具体实施方式中，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列Ⅰ的7、9、10、11位中的一个或多个核苷酸为氟代修饰的核苷酸；并且，按照5'末端到3'末端的方向，所述核苷酸序列Ⅱ的第2、6、8、9、13、14、15、16位中的一个或多个核苷酸为氟代修饰核苷酸。
在具体实施方案中，本发明提供的siRNA的正义链和反义链中至少一条单链的磷酸-糖骨架中的磷酸酯基中的至少一部分为具有修饰基团的磷酸酯基。在一些实施方法中，具有修饰基团的磷酸酯基为磷酸酯基中的磷酸二酯键中的至少一个氧原子被硫原子取代而形成的硫代磷酸酯基；在一些实施方案中，所述具有修饰基团的磷酸酯基为具有如式(13)所示结构的硫代磷酸酯基：
在一些实施方案中，本发明提供的siRNA中，优选地，所述硫代磷酸酯基连接存在于以下位置组成的组中的至少1处：正义链和/或反义链的第1个和第2个核苷酸之间；正义链和/或反义链的第2个和第3个核苷酸之间；反义链的第19个和第20个核苷酸之间；反义链的第20个和第21个核苷酸之间；反义链的第21个和第22个核苷酸之间；反义链的第22个和第23个核苷酸之间；或上述的任意组合。
在一些实施方案中，所述siRNA反义链的5'末端核苷酸为5'-磷酸核苷酸或5'-磷酸类似物修饰的核苷酸，如式(14)、式(15)和式(16)所示：
在一方面，本发明提供了一种siRNA缀合物，所述siRNA缀合物含有上述siRNA以及缀合连接至该siRNA的缀合基团。在一些实施方案中，所述的siRNA缀合物中药学上可接受的缀合集团可以是半乳糖或N-乙酰半乳糖胺，其中，半乳糖或N-乙酰半乳糖胺分子可以是一价、二价、三价、四价。在一些实施方案中，siRNA与缀合物基团的缀合位点可以在siRNA正义链的3'端或5'端，也可以在反义链的3'端，还可以在siRNA的内部序列中。
在一些具体实施方式中，本发明所涉及的siRNA缀合物，所述缀合基团是L96，结构如下所示：
在具体实施方式中，所述siRNA缀合物包括正义链和反义链，为：
1)所述正义链的序列如SEQ ID NO:222所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:332所示；
2)所述正义链的序列如SEQ ID NO:223所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:333所示；
3)所述正义链的序列如SEQ ID NO:224所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:334所示；
4)所述正义链的序列如SEQ ID NO:225所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:335所示；
5)所述正义链的序列如SEQ ID NO:226所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:336所示；
6)所述正义链的序列如SEQ ID NO:227所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:337所示；
7)所述正义链的序列如SEQ ID NO:228所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:338所示；
8)所述正义链的序列如SEQ ID NO:229所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:339所示；
9)所述正义链的序列如SEQ ID NO:230所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:340所示；
10)所述正义链的序列如SEQ ID NO:231所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:341所示；
11)所述正义链的序列如SEQ ID NO:232所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:342所示；
12)所述正义链的序列如SEQ ID NO:233所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:343所示；
13)所述正义链的序列如SEQ ID NO:234所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:344所示；
14)所述正义链的序列如SEQ ID NO:235所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:345所示；
15)所述正义链的序列如SEQ ID NO:236所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:346所示；
16)所述正义链的序列如SEQ ID NO:237所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:347所示；
17)所述正义链的序列如SEQ ID NO:238所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:348所示；
18)所述正义链的序列如SEQ ID NO:239所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:349所示；
19)所述正义链的序列如SEQ ID NO:240所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:350所示；
20)所述正义链的序列如SEQ ID NO:241所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:351所示；
21)所述正义链的序列如SEQ ID NO:242所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:352所示；
22)所述正义链的序列如SEQ ID NO:243所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:353所示；
23)所述正义链的序列如SEQ ID NO:244所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:354所示；
24)所述正义链的序列如SEQ ID NO:245所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:355所示；
25)所述正义链的序列如SEQ ID NO:246所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:356所示；
26)所述正义链的序列如SEQ ID NO:247所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:357所示；
27)所述正义链的序列如SEQ ID NO:248所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:358所示；
28)所述正义链的序列如SEQ ID NO:249所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:359所示；
29)所述正义链的序列如SEQ ID NO:250所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:360所示；
30)所述正义链的序列如SEQ ID NO:251所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:361所示；
31)所述正义链的序列如SEQ ID NO:252所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:362所示；
32)所述正义链的序列如SEQ ID NO:253所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:363所示；
33)所述正义链的序列如SEQ ID NO:254所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:364所示；
34)所述正义链的序列如SEQ ID NO:255所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:365所示；
35)所述正义链的序列如SEQ ID NO:256所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:366所示；
36)所述正义链的序列如SEQ ID NO:257所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:367所示；
37)所述正义链的序列如SEQ ID NO:258所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:368所示；
38)所述正义链的序列如SEQ ID NO:259所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:369所示；
39)所述正义链的序列如SEQ ID NO:260所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:370所示；
40)所述正义链的序列如SEQ ID NO:261所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:371所示；
41)所述正义链的序列如SEQ ID NO:262所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:372所示；
42)所述正义链的序列如SEQ ID NO:263所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:373所示；
43)所述正义链的序列如SEQ ID NO:264所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:374所示；
44)所述正义链的序列如SEQ ID NO:265所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:375所示；
45)所述正义链的序列如SEQ ID NO:266所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:376所示；
46)所述正义链的序列如SEQ ID NO:267所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:377所示；
47)所述正义链的序列如SEQ ID NO:268所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:378所示；
48)所述正义链的序列如SEQ ID NO:269所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:379所示；
49)所述正义链的序列如SEQ ID NO:270所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:380所示；
50)所述正义链的序列如SEQ ID NO:271所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:381所示；
51)所述正义链的序列如SEQ ID NO:272所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:382所示；
52)所述正义链的序列如SEQ ID NO:273所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:383所示；
53)所述正义链的序列如SEQ ID NO:274所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:384所示；
54)所述正义链的序列如SEQ ID NO:275所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:385所示；
55)所述正义链的序列如SEQ ID NO:276所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:386所示；
56)所述正义链的序列如SEQ ID NO:277所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:387所示；
57)所述正义链的序列如SEQ ID NO:278所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:388所示；
58)所述正义链的序列如SEQ ID NO:279所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:389所示；
59)所述正义链的序列如SEQ ID NO:280所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:390所示；
60)所述正义链的序列如SEQ ID NO:281所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:391所示；
61)所述正义链的序列如SEQ ID NO:282所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:392所示；
62)所述正义链的序列如SEQ ID NO:283所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:393所示；
63)所述正义链的序列如SEQ ID NO:284所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:394所示；
64)所述正义链的序列如SEQ ID NO:285所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:395所示；
65)所述正义链的序列如SEQ ID NO:286所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:396所示；
66)所述正义链的序列如SEQ ID NO:287所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:397所示；
67)所述正义链的序列如SEQ ID NO:288所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:398所示；
68)所述正义链的序列如SEQ ID NO:289所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:399所示；
69)所述正义链的序列如SEQ ID NO:290所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:400所示；
70)所述正义链的序列如SEQ ID NO:291所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:401所示；
71)所述正义链的序列如SEQ ID NO:292所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:402所示；
72)所述正义链的序列如SEQ ID NO:293所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:403所示；
73)所述正义链的序列如SEQ ID NO:294所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:404所示；
74)所述正义链的序列如SEQ ID NO:295所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:405所示；
75)所述正义链的序列如SEQ ID NO:296所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:406所示；
76)所述正义链的序列如SEQ ID NO:297所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:407所示；
77)所述正义链的序列如SEQ ID NO:298所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:408所示；
78)所述正义链的序列如SEQ ID NO:299所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:409所示；
79)所述正义链的序列如SEQ ID NO:300所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:410所示；
80)所述正义链的序列如SEQ ID NO:301所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:411所示；
81)所述正义链的序列如SEQ ID NO:302所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:412所示；
82)所述正义链的序列如SEQ ID NO:303所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:413所示；
83)所述正义链的序列如SEQ ID NO:304所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:414所示；
84)所述正义链的序列如SEQ ID NO:305所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:415所示；
85)所述正义链的序列如SEQ ID NO:306所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:416所示；
86)所述正义链的序列如SEQ ID NO:307所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:417所示；
87)所述正义链的序列如SEQ ID NO:308所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:418所示；
88)所述正义链的序列如SEQ ID NO:309所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:419所示；
89)所述正义链的序列如SEQ ID NO:310所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:420所示；
90)所述正义链的序列如SEQ ID NO:311所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:421所示；
91)所述正义链的序列如SEQ ID NO:312所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:422所示；
92)所述正义链的序列如SEQ ID NO:313所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:423所示；
93)所述正义链的序列如SEQ ID NO:314所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:424所示；
94)所述正义链的序列如SEQ ID NO:315所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:425所示；
95)所述正义链的序列如SEQ ID NO:316所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:426所示；
96)所述正义链的序列如SEQ ID NO:317所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:427所示；
97)所述正义链的序列如SEQ ID NO:318所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:428所示；
98)所述正义链的序列如SEQ ID NO:319所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:429所示；
99)所述正义链的序列如SEQ ID NO:320所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:430所示；
100)所述正义链的序列如SEQ ID NO:321所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:431所示；
101)所述正义链的序列如SEQ ID NO:322所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:432所示；
102)所述正义链的序列如SEQ ID NO:323所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:433所示；
103)所述正义链的序列如SEQ ID NO:324所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:434所示；
104)所述正义链的序列如SEQ ID NO:325所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:435所示；
105)所述正义链的序列如SEQ ID NO:326所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:436所示；
106)所述正义链的序列如SEQ ID NO:327所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:437所示；
107)所述正义链的序列如SEQ ID NO:328所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:438所示；
108)所述正义链的序列如SEQ ID NO:329所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:439所示；
109)所述正义链的序列如SEQ ID NO:330所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:440所示；或者
110)所述正义链的序列如SEQ ID NO:331所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:441所示。
在一方面，本发明提供一种组合物，包括前述siRNA或siRNA缀合物。在优选实施方式中，所述组合物为药物组合物，还包括药学上可接受的载体或辅料。本发明涉及的药学上可接受的载体或辅料包括但不限于注射用水、氢氧化钠、磷酸二氢钠一水合物、磷酸二氢钠二水合物、磷酸、氯化钠、氯化钾、盐酸、无水磷酸二氢钾、无水磷酸氢二钠、PEG2000、PEG6000、胆固醇、二硬脂酰磷脂酰胆碱、1,2-二肉豆蔻酸甘油酯、己二酸二甲酯。
在一方面，本发明提供前述的siRNA、siRNA缀合物或药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗APP过多引起的相关疾病。
在一方面，本发明提供一种预防或治疗APP过多引起的相关疾病的方法，所述方法包括给受试者给药本发明的siRNA、siRNA缀合物或药物组合物。
在具体实施方式中，所述APP过多引起的相关疾病选自脑淀粉样血管病(CAA)和阿兹海默症(AD)。
本发明所涉及的药物组合物可单独应用于脑淀粉样血管病(CAA)和阿兹海默症(AD)治疗，也可与标准口服药物联合应用，为上述疾病临床患者实现多样化的治疗方案提供了试验支持。
本发明涉及的抑制APP基因表达siRNA通常合适剂量范围将在约0.1mg/kg至约10.0mg/kg，优选约0.3mg/kg至约3.0mg/kg的范围内。
本发明的涉及的给药途径包括静脉给药、皮下给药、鞘内注射、肌肉内给药、皮下给药、经皮给药、气道给药(气雾剂)、眼部给药、鼻部给药、直肠给药、肺部给药和局部给药(包括口腔含化给药和舌下给药)等给药方式。
本发明的siRNA可特异性诱导APP mRNA降解，从而抑制肝脏中APP的合成，诱导APP蛋白持久减少，减少Aβ等相关毒性蛋白病理性沉积，有良好的成药前景。与传统的小分子药和抗体药相比，小核酸药物能够直接调节上游基因表达，相对不易产生耐药性；而且小核酸药物在体内的半衰期长，因此给药频次低(可半年给一次药)，患者依从性好。因此本发明能够有效预防或治疗APP蛋白分解产生Aβ等有毒性蛋白病理性沉积所导致的AD和CAA两种疾病，为上述患者提供更有效、安全和便捷的治疗药物。
附图说明
图1为本发明siRNA与人APP基因结合的位点示意图；
图2为本发明siRNA缀合物在体内抑制APP表达的结果。
具体实施方式
定义
在上文及下文中，如无特别说明，大写字母C、G、U、A表示胞嘧啶、鸟嘌呤、尿嘧啶、腺嘌呤核苷酸；小写字母m表示该字母m左侧相邻的一个核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸；小写字母f表示该字母f左侧相邻的一个核苷酸为氟代修饰的核苷酸；小写字母s表示与该字母s左右相邻的两个核苷酸之间为硫代磷酸酯亚基连接；字母组合VP表示该字母组合VP右侧相邻的一个核苷酸为乙烯基磷酸酯(5'-(E)-vinylphosphonate,E-VP)修饰的核苷酸；L96具有式(I)的结构，通过磷酸酯键连接到正义链的3'末端。
在上文及下文中，所述“氟代修饰的核苷酸”指核苷酸的核糖基2'位的羟基被氟取代形成的核苷酸，“非氟代修饰的核苷酸”指核苷酸的核糖基2'位的羟基被非氟基团取代形成的核苷酸或核苷酸类似物。“核苷酸类似物”指能够在核酸中代替核苷酸，但结构不同于腺嘌呤核糖核苷酸、鸟嘌呤核糖核苷酸、胞嘧啶核糖核苷酸、尿嘧啶核糖核苷酸或胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸的基团。如异核苷酸、桥连的核苷酸(bridged nucleic acid，简称BNA)或无环核苷酸。所述“甲氧基修饰的核苷酸”指核糖基的2'-羟基被甲氧基取代而形成的核苷酸。在本文的上下文中，表述“互补”或“反向互补”可互相替代使用，并具有本领域技术人员周知的含义，即，在双链核酸分子中，一条链的碱基各自与另一条链上的碱基以互补的方式相配对。在DNA中，嘌呤碱基腺嘌呤(A)始终与嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)(或者在RNA中为尿嘧啶(U))相配对；嘌呤碱基鸟嘌呤(C)始终与嘧啶碱基胞嘧啶(G)相配对。每个碱基对都包括一个嘌呤和一个嘧啶。当一条链上的腺嘌呤始终与另一条链上的胸腺嘧啶(或尿嘧啶)配对，以及鸟嘌呤始终与胞嘧啶配对时，两条链被认为是彼此相互补的，以及从其互补链的序列中可以推断出该链的序列。与此相应地，“错配”在本领域中意指在双链核酸中，对应位置上的碱基并未以互补的形式配对存在。在上文及下文中，如无特别说明，“基本上反向互补”是指所涉及的两段核苷酸序列之间存在不多于3个的碱基错配；“实质上反向互补”是指两段核苷酸序列之间存在不多于1个的碱基错配；“完全反向互补”是指两段核苷酸序列之间不存在碱基错配。在上文及下文中，特别是在描述本公开的siRNA、药物组合物或siRNA缀合物的制备方法时，除非特别说明，所述核苷单体(nucleoside monomer)是指，根据欲制备的siRNA或siRNA缀合物中核苷酸的种类和顺序，亚磷酰胺固相合成中使用的修饰或未修饰的核苷亚磷酰胺单体(unmodified or modified RNAphosphoramidites，有时RNAphosphoramidites也称为Nucleoside phosphora-midites)。亚磷酰胺固相合成为本领域技术人员所公知的siRNA 合成中所用的方法。本发明所用的核苷单体均可商购得到。
表1和表2中，正义链或连接缀合基团的修饰的正义链的5'末端核苷酸左侧如果没有标有VP，则代表该5'末端核苷酸没有连接5'磷酸基团或5'磷酸衍生基团，其结构如式(II)所示：
其中，Base表示碱基，例如A、U、G、C或T；R为羟基或被本领域技术人员所知晓的各类基团所取代，例如，R可以为2'-氟代(2'-F)、2'-烷氧基、2'-取代的烷氧基、2'-烷基、2'-取代的烷基、2'-氨基、2'-取代的氨基、2'-脱氧核苷酸。
表1和表2中，反义链或修饰的反义链的5'末端核苷酸左侧如果没有标有VP，则代表该5'末端核苷酸没有连接5'磷酸基团或5'磷酸衍生基团，其结构也如式(II)所示。
表1和表2中，正义链的3'末端核苷酸、反义链和修饰的反义链的3'末端核苷酸的3'位置为羟基。
实施例1.siRNA设计与合成
1.1siRNA设计
采用oligowalk在线设计一组靶向人类APP基因的siRNA(人类APP基因：NCBIrefseqID NM_000484.4；NCBI Gene ID:351)。人类NM_000484.4REF SEQ mRNA，具有3583个碱基长度。同时，为了避免任何序列产生的毒性，还需排除与人源基因相似的序列。人类NM_000484.4REFSEQ mRNA(NCBI refseqID NM_000484.4)：GTCAGTTTCCTCGGCAGCGGTAGGCGAGAGCACGCGGAGGAGCGTGCGCGGGGGCCCCGGGAGACGGCGGCGGTGGCGGCGCGGGCAGAGCAAGGACGCGGCGGATCCCACTCGCACAGCAGCGCACTCGGTGCCCCGCGCAGGGTCGCGATGCTGCCCGGTTTGGCACTGCTCCTGCTGGCCGCCTGGACGGCTCGGGCGCTGGAGGTACCCACTGATGGTAATGCTGGCCTGCTGGCTGAACCCCAGATTGCCATGTTCTGTGGCAGACTGAACATGCACATGAATGTCCAGAATGGGAAGTGGGATTCAGATCCATCAGGGACCAAAACCTGCATTGATACCAAGGAAGGCATCCTGCAGTATTGCCAAGAAGTCTACCCTGAACTGCAGATCACCAATGTGGTAGAAGCCAACCAACCAGTGACCATCCAGAACTGGTGCAAGCGGGGCCGCAAGCAGTGCAAGACCCATCCCCACTTTGTGATTCCCTACCGCTGCTTAGTTGGTGAGTTTGTAAGTGATGCCCTTCTCGTTCCTGACAAGTGCAAATTCTTACACCAGGAGAGGATGGATGTTTGCGAAACTCATCTTCACTGGCACACCGTCGCCAAAGAGACATGCAGTGAGAAGAGTACCAACTTGCATGACTACGGCATGTTGCTGCCCTGCGGAATTGACAAGTTCCGAGGGGTAGAGTTTGTGTGTTGCCCACTGGCTGAAGAAAGTGACAATGTGGATTCTGCTGATGCGGAGGAGGATGACTCGGATGTCTGGTGGGGCGGAGCAGACACAGACTATGCAGATGGGAGTGAAGACAAAGTAGTAGAAGTAGCAGAGGAGGAAGAAGTGGCTGAGGTGGAAGAAGAAGAAGCCGATGATGACGAGGACGATGAGGATGGTGATGAGGTAGAGGAAGAGGCTGAGGAACCCTACGAAGAAGCCACAGAGAGAACCACCAGCATTGCCACCACCACCACCACCACCACAGAGTCTGTGGAAGAGGTGGTTCGAGAGGTGTGCTCTGAACAAGCCGAGACGGGGCCGTGCCGAGCAATGATCTCCCGCTGGTACTTTGATGTGACTGAAGGGAAGTGTGCCCCATTCTTTTACGGCGGATGTGGCGGCAACCGGAACAACTTTGACACAGAAGAGTACTGCATGGCCGTGTGTGGCAGCGCCATGTCCCAAAGTTTACTCAAGACTACCCAGGAACCTCTTGCCCGAGATCCTGTTAAACTTCCTACAACAGCAGCCAGTACCCCTGATGCCGTTGACAAGTATCTCGAGACACCTGGGGATGAGAATGAACATGCCCATTTCCAGAAAGCCAAAGAGAGGCTTGAGGCCAAGCACCGAGAGAGAATGTCCCAGGTCATGAGAGAATGGGAAGAGGCAGAACGTCAAGCAAAGAACTTGCCTAAAGCTGATAAGAAGGCAGTTATCCAGCATTTCCAGGAGAAAGTGGAATCTTTGGAACAGGAAGCAGCCAACGAGAGACAGCAGCTGGTGGAGACACACATGGCCAGAGTGGAAGCCATGCTCAATGACCGCCGCCGCCTGGCCCTGGAGAACTACATCACCGCTCTGCAGGCTGTTCCTCCTCGGCCTCGTCACGTGTTCAATATGCTAAAGAAGTATGTCCGCGCAGAACAGAAGGACAGACAGCACACCCTAAAGCATTTCGAGCATGTGCGCATGGTGGATCCCAAGAAAGCCGCTCAGATCCGGTCCCAGGTTATGACACACCTCCGTGTGATTTATGAGCGCATGAATCAGTCTCTCTCCCTGCTCTACAACGTGCCTGCAGTGGCCGAGGAGATTCAGGATGAAGTTGATGAGCTGCTTCAGAAAGAGCAAAACTATTCAGATGACGTCTTGGCCAACATGATTAGTGAACCAAGGATCAGTTACGGAAACGATGCTCTCATGCCATCTTTGACCGAAACGAAAACCACCGTGGAGCTCCTTCCCGTGAATGGAGAGTTCAGCCTGGACGATCTCCAGCCGTGGCATTCTTTTGGGGCTGACTCTGTGCCAGCCAACACAGAAAACGAAGTTGAGCCTGTTGATGCCCGCCCTGCTGCCGACCGAGGACTGACCACTCGACCAGGTTCTGGGTTGACAAATATCAAGACGGAGGAGATCTCTGAAGTGAAGATGGATGCAGAATTCCGACATGACTCAGGATATGAAGTTCATCATCAAAAATTGGTGTTCTTTGCAGAAGATGTGGGTTCAAACAAAGGTGCAATCATTGGACTCATGGTGGGCGGTGTTGTCATAGCGACAGTGATCGTCATCACCTTGGTGATGCTGAAGAAGAAACAGTACACATCCATTCATCATGGTGTGGTGGAGGTTGACGCCGCTGTCACCCCAGAGGAGCGCCACCTGTCCAAGATGCAGCAGAACGGCTACGAAAATCCAACCTACAAGTTCTTTGAGCAGATGCAGAACTAGACCCCCGCCACAGCAGCCTCTGAAGTTGGACAGCAAAACCATTGCTTCACTACCCATCGGTGTCCATTTATAGAATAATGTGGGAAGAAACAAACCCGTTTTATGATTTACTCATTATCGCCTTTTGACAGCTGTGCTGTAACACAAGTAGATGCCTGAACTTGAATTAATCCACACATCAGTAATGTATTCTATCTCTCTTTACATTTTGGTCTCTATACTACATTATTAATGGGTTTTGTGTACTGTAAAGAATTTAGCTGTATCAAACTAGTGCATGAATAGATTCTCTCCTGATTATTTATCACATAGCCCCTTAGCCAGTTGTATATTATTCTTGTGGTTTGTGACCCAATTAAGTCCTACTTTACATATGCTTTAAGAATCGATGGGGGATGCTTCATGTGAACGTGGGAGTTCAGCTGCTTCTCTTGCCTAAGTATTCCTTTCCTGATCACTATGCATTTTAAAGTTAAACATTTTTAAGTATTTCAGATGCTTTAGAGAGATTTTTTTTCCATGACTGCATTTTACTGTACAGATTGCTGCTTCTGCTATATTTGTGATATAGGAATTAAGAGGATACACACGTTTGTTTCTTCGTGCCTGTTTTATGTGCACACATTAGGCATTGAGACTTCAAGCTTTTCTTTTTTTGTCCACGTATCTTTGGGTCTTTGATAAAGAAAAGAATCCCTGTTCATTGTAAGCACTTTTACGGGGCGGGTGGGGAGGGGTGCTCTGCTGGTCTTCAATTACCAAGAATTCTCCAAAACAATTTTCTGCAGGATGATTGTACAGAATCATTGCTTATGACATGATCGCTTTCTACACTGTATTACATAAATAAATTAAATAAAATAACCCCGGGCAAGACTTTTCTTTGAAGGATGACTACAGACATTAAATAATCGAAGTAATTTTGGGTGGGGAGAAGAGGCAGATTCAATTTTCTTTAACCAGTCTGAAGTTTCATTTATGATACAAAAGAAGATGAAAATGGAAGTGGCAATATAAGGGGATGAGGAAGGCATGCCTGGACAAACCCTTCTTTTAAGATGTGTCTTCAATTTGTATAAAATGGTGTTTTCATGTAAATAAATACATTCTTGGAGGAGCA(SEQ ID NO:1)
1.2siRNA序列合成
根据标准的寡核苷酸固相合成方案合成siRNA，包括阴性对照siRNA(siCtrl)。
寡核苷酸固相合成方案：使用商购的5'-DMT-2'-TBDMS-rU亚磷酰胺单体，5'-DMT-2'-TBDMS-rA(Bz)亚磷酰胺单体，5'-DMT-2'-TBDMS-rC(Ac)亚磷酰胺单体，5'-DMT-2'-TBDMS-rG(iBu)亚磷酰胺单体。在合成500nmol的规模下合成RNA。在50mM的浓度下制备亚磷酰胺溶液，并且0.3M苄硫基四氮唑(BTT)乙腈溶液作为活化剂。在合成过程中，使用0.1M氧化试剂(吡啶：THF：水＝20:78:2)将三价磷转变为五价磷稳定磷酸骨架。在合成完成后，将序列从固相载体上氨解，沉降。用三乙胺三氢氟酸除去2'的2'O-叔丁基二甲基甲硅烷基保护基。
对于合成结束的RNA序列，在55℃的条件下，用氨水：甲胺＝1:1的氨解液氨解40分钟，氨解结束后，除去固相载体CPG粉末，取上清液抽干。加入保护基脱除剂，在60℃条件下反应2小时，按照1：5比例加入正丁醇，-20℃条件下静置30分钟，离心取沉淀。加入无RNase水溶解，用反相色谱(0.1M三乙胺乙酸(TEAA)以及乙腈)进行纯化。纯化后的样品用PBS进行超滤脱盐。并进行退火，得到siRNA，对得到的siRNA进行验证，结果发现目标siRNA制备成功。
1.3siRNA序列修饰及缀合物合成
根据寡核苷酸固相合成方案合成修饰的siRNA，可以通过使用具有相应修饰的核苷单体将修饰的核苷酸基团引入本公开的siRNA中，制备具有相应修饰的核苷单体的方法也是本领域技术人员所熟知的。参考WO2014025805A1或WO2017015109A1公开的合成方法将L96缀合至siRNA合成siRNA缀合物。
缀合基团L96的结构如下所示：
寡核糖核苷酸的退火产生siRNA缀合物：把待退火的RNA寡聚体用无菌RNaseFreeH2O(无RNA水解酶)配制成200μΜ的溶液。如下设置退火反应体系，将总体积为100μL的上述溶液(双链体浓度为10nmol)放置95℃水浴锅10分钟(≥100nmol需求量需要高温20分钟)→迅速放入60℃水浴自然降温→退火完成后的溶液在4℃保存。通过合并等摩尔的RNA溶液混合互补链。经鉴定，siRNA分子构建正确。将siRNA溶液制备成干粉备用。
合成的siRNA分子序列如下表1所示，与人APP基因结合的位点如图1所示：
表1.靶向APP的siRNA序列表
其中，A、U、G、C代表腺嘌呤、尿嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶核苷酸。合成的siRNA缀合物序列如下表2所示：
表2.靶向APP的siRNA缀合物序列表
其中，小写字母m表示该字母m左侧相邻的一个核苷酸为甲氧基修饰的核苷酸；小写字母f表示该字母f左侧相邻的一个核苷酸为氟代修饰的核苷酸；小写字母s表示与该字母s左右相邻的两个核苷酸之间为硫代磷酸酯亚基连接；VP表示该字母组合VP右侧相邻的一个核苷酸为乙烯基磷酸酯(5'-(E)-vinylphosphonate，E-VP)修饰的核苷酸；L96表示与siRNA连接的L96缀合基团。
实施例2.siRNA HCT116细胞系体外活性筛选
2.1实验步骤
2.1.1细胞培养
将HCT116细胞(BNCC，BNCC287750)在37℃，5％CO2的环境中使用DMEM完全培养基(Eallbio，添加10％FBS)培养，当融合率达到80％-90％时，使用胰酶消化细胞，计数并进行转染。
2.1.2siRNA稀释液配制
(1)将待测siRNA的干粉以低温高速离心，然后用超纯蒸馏水溶解，配制成100μM的siRNA母液。
(2)配制200nM的siRNA稀释液Y。
a)取上述步骤(1)中制得的100μM siRNA母液50μl，加入50μl超纯蒸馏水，得到终浓度为50μM的siRNA稀释液；
b)取步骤a)中制得的50μM的siRNA稀释液2μl，加入18μl超纯蒸馏水，得到终浓度为5μM的siRNA贮备液X；
c)取上述配制好的siRNA贮备液X 2μl，加入48μl Opti-medium(Gibco，31985070)，得到200nM的siRNA稀释液Y。
2.1.3HCT116细胞转染
取RNAiMAX转染试剂0.6μl，加入10μl Opti-medium，得到RNAiMAX转染试剂稀释液；将RNAiMAX转染试剂稀释液与步骤2.1.2中制得的200nM siRNA稀释液Y以1:1体积比混合制备成转染混合物，静置5分钟，取10μl转染混合物加入到96孔板中，并加入步骤2.1.1中培养的HCT116细胞90μl(终体积100μl/孔，细胞数量为20000个/孔，以siRNA稀释液Y为200nM为例，该体系中siRNA的浓度为10nM)；上述转染后培养24小时。
2.1.4RNA提取
根据FlysisAmp Cells-to-CT 1-Step SYBR Green Kit试剂盒产品说明书，提取步骤2.1.3中获得的HCT116细胞的总RNA。
2.1.5荧光定量PCR
对提取的总RNA使用FlysisAmp Cells-to-CT 1-Step SYBR Green Kit试剂盒进行逆转录及实时PCR分析。
2.1.6结果分析
(1)使用7500实时荧光定量PCR仪(Thermo Fisher)的软件，自动计算Ct值；
(2)使用以下公式计算基因的相对表达量：
ΔCt1＝Ct(APP组)–Ct(APP组的ACTIN)
ΔCt2＝Ct(siCtrl组)–Ct(siCtrl组的ACTIN)
ΔΔCt＝ΔCt1(APP组)-ΔCt2(siCtrl组)，其中siCtrl组表示非特异性siRNA序列，为阴性对照组；
相对于siCtrl组的mRNA表达＝2-ΔΔCt
抑制率(％)＝(1-相对于siCtrl组的mRNA表达)×100％。
2.2实验结果
本发明siRNA的抑制效果见下表3所示：
表3.siRNA HCT116细胞系体外筛选结果
从表3可以看出，本发明的部分siRNA在10nM下可显著抑制HCT116细胞APP基因的表达。
实施例3.siRNABE(2)-C细胞系体外活性筛选
3.1实验步骤
3.1.1细胞培养
将BE(2)-C细胞(BNCC，BNCC247047)在37℃，5％CO2的环境中使用DMEM完全培养基(Eallbio，添加10％FBS)培养，当融合率达到80％-90％时，使用胰酶消化细胞，计数并进行转染。
3.1.2siRNA稀释液配制
(1)将待测siRNA的干粉以低温高速离心，然后用超纯蒸馏水溶解，配制成100μM的siRNA母液。
(2)配制200nM的siRNA稀释液Y。
a)取上述步骤(1)中制得的100μM siRNA母液50μl，加入50μl超纯蒸馏水，得到终浓度为50μM的siRNA稀释液；
b)取步骤a)中制得的50μM的siRNA稀释液2μl，加入18μl超纯蒸馏水，得到终浓度为5μM的siRNA贮备液X；
c)取上述配制好的siRNA贮备液X 2μl，加入48μl Opti-medium，得到200nM的siRNA稀释液Y。
3.1.3BE(2)-C细胞转染
取RNAiMAX转染试剂0.6μl，加入10μl Opti-medium，得到RNAiMAX转染试剂稀释液；将RNAiMAX转染试剂稀释液与步骤3.1.2中制得的200nM siRNA稀释液Y以1:1体积比混合制备成转染混合物，静置5分钟，取10μl转染混合物加入到96孔板中，并加入步骤3.1.1中培养的BE(2)-C细胞90μl(终体积100μl/孔，细胞数量为20000个/孔，该体系中siRNA的浓度为10nM)；上述转染后培养24小时。
3.1.4RNA提取
根据FlysisAmp Cells-to-CT 1-Step SYBR Green Kit试剂盒产品说明书，提取步骤3.1.3中获得的BE(2)-C细胞的总RNA。
3.1.5荧光定量PCR
对提取的总RNA使用FlysisAmp Cells-to-CT 1-Step SYBR Green Kit试剂盒进行逆转录及实时PCR分析。
3.1.6结果分析
(1)使用7500实时荧光定量PCR仪(ThermoFisher)的软件，自动计算Ct值；
(2)使用以下公式计算基因的相对表达量：
ΔCt1＝Ct(APP组)–Ct(APP组的ACTIN)
ΔCt2＝Ct(siCtrl组)–Ct(siCtrl组的ACTIN)
ΔΔCt＝ΔCt1(APP组)-ΔCt2(siCtrl组)，其中siCtrl组表示非特异性siRNA序列，为阴性对照组；
相对于siCtrl组的mRNA表达＝2-ΔΔCt
抑制率(％)＝(1-相对于siCtrl组的mRNA表达)×100％。
3.2实验结果
本发明的siRNA的抑制效果见下表4所示：
表4.siRNABE(2)-C细胞系体外筛选结果
从表4可以看出，本发明的部分siRNA在10nM下可显著抑制BE(2)-C细胞APP基因的表达。基于实施例2和实施例3的体外筛选结果，从而确定了抑制APP mRNA的高效活性区间，为依照NCBI refseqID NM_000484.4计算的第334-804位、2305-2327位和2813-2835位。
实施例4.siRNA IC50测定
本实施例通过计算每种siRNA的半数抑制浓度(IC50)，来考察药物剂量与生物效应的量效关系，从而定量地反映药物引起该指标变化的能力。
4.1按照与实施例2相似的方法，进行siRNA抑制APP基因表达的IC50测定，其中转染的siRNA的浓度分别为25nM、5nM、1nM、0.2nM、0.04nM、0.008nM、0.0016nM。
4.2结果分析
(1)使用7500实时荧光定量PCR仪(Thermo Fisher)的软件，自动计算Ct值；
(2)使用以下公式计算基因的相对表达量：
ΔCt1＝Ct(APP组)–Ct(APP组的ACTIN)
ΔCt2＝Ct(siCtrl组)–Ct(siCtrl组的ACTIN)
ΔΔCt＝ΔCt1(APP组)-ΔCt2(siCtrl组)，其中siCtrl组表示非特异性siRNA序列，为阴性对照组；
相对于siCtrl组的mRNA表达＝2-ΔΔCt
抑制率(％)＝(1-相对于siCtrl组的mRNA表达)×100％。
以siRNA浓度的log值作为X轴，百分比抑制率为Y轴，采用分析软件GraphPad
Prism 8的“log(inhibitor)vs.normalized response--Variable slope”功能模块，来拟合量效曲线，从而得出各个siRNA的IC50值。
拟合公式为：Y＝100/(1+10^((LogIC50-X)×HillSlope))
其中：HillSlope表示百分比抑制率曲线的斜率。
4.3实验结果
本发明的siRNA的IC50测定结果见下表5所示：
表5.siRNA HCT116细胞系IC50测定结果
从表5中可以看出，本发明的部分siRNA可显著抑制APP基因表达。
实施例5.siRNA缀合物体内活性筛选
根据上述实施例2、3、4体外实验筛选结果，挑选部分体外活性较好的siRNA序列，将其缀合物进行体内活性验证。
5.1实验步骤
6-8周龄雄性小鼠(C57BL/6)，购自斯贝福(北京)生物技术有限公司，体重20g左右，每只小鼠静脉注射1×1011个基因组拷贝的重组腺相关病毒8(AAV8)载体。重组AAV8载体由AAV8衣壳蛋白表达质粒与携带AAV8-hAPP的转移质粒进行包装，其中转移质粒上携带人APP序列(NM_000484.4)的151-3583位，由TBG启动子控制。注射14天后完成AAV8-hAPP转基因小鼠模型构建。然后按照每只小鼠给予3mg/kg缀合物的剂量皮下给药。在给药后第7天(D7)、第14天(D14)分别处死小鼠，各组小鼠6只，取肝脏组织进行mRNA表达检测。Trizol法提取总RNA，mRNA逆转录使用HiScript III RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)试剂盒(货号：R323-01,Vazyme)，实时荧光定量PCR使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix试剂盒(货号：Q711-03，Vazyme)。不同siRNA缀合物体内活性筛选结果如表6和图2所示。
表6.siRNA缀合物体内筛选结果
5.2实验结果说明
经过化学修饰的siRNA序列在小鼠体内活性较好，YGND22-9M、YGND22-16M、YGND22-17M、YGND22-23M、YGND22-24M、YGND22-28M、YGND22-71M和YGND22-92M均可显著降低小鼠体内APP表达水平。其中第14天时，YGND22-28M抑制效率高达81.17％，YGND22-16M抑制效率达71.21％。

Claims (4)

1.一种抑制APP基因表达的siRNA，所述siRNA包含正义链和反义链，所述正义链包含核苷酸序列I，所述反义链包含核苷酸序列II；所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II中的每一个核苷酸均为修饰或未修饰的核苷酸；所述核苷酸序列I和所述核苷酸序列II至少部分地反向互补形成双链区；所述核苷酸序列I与第一段核苷酸序列基本一致，所述第一段核苷酸序列为APP基因表达的mRNA中的一段长度为至少19个核苷酸的核苷酸序列，其中，所述正义链的序列如SEQ ID NO:29所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:139所示。
2.一种siRNA缀合物，所述正义链的序列如SEQ ID NO:249所示，所述反义链的序列如SEQ ID NO:359所示。
3.一种组合物，包括权利要求1所述的siRNA或权利要求2所述的siRNA缀合物。
4.根据权利要求3所述的组合物，其中，所述组合物为药物组合物，还包括药学上可接受的载体或辅料，所述载体或辅料包括但不限于注射用水、氢氧化钠、磷酸二氢钠一水合物、磷酸二氢钠二水合物、磷酸、氯化钠、氯化钾、盐酸、无水磷酸二氢钾、无水磷酸氢二钠、PEG2000、PEG6000、胆固醇、二硬脂酰磷脂酰胆碱、1,2-二肉豆蔻酸甘油酯、己二酸二甲酯。
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