CN118773303A - 检测原发突变位点为m.14484T＞C的Leber遗传性视神经病变的组合物、试剂盒及应用 - Google Patents
检测原发突变位点为m.14484T＞C的Leber遗传性视神经病变的组合物、试剂盒及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN118773303A CN118773303A CN202410865660.XA CN202410865660A CN118773303A CN 118773303 A CN118773303 A CN 118773303A CN 202410865660 A CN202410865660 A CN 202410865660A CN 118773303 A CN118773303 A CN 118773303A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- detecting
- optic neuropathy
- hereditary optic
- crrna
- kit
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 230000035772 mutation Effects 0.000 title claims abstract description 68
- 201000000639 Leber hereditary optic neuropathy Diseases 0.000 title claims abstract description 54
- 208000032087 Hereditary Leber Optic Atrophy Diseases 0.000 title claims abstract description 52
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 20
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 71
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 26
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 7
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 7
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 claims abstract 4
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 claims abstract 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 29
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 20
- 108700004991 Cas12a Proteins 0.000 claims description 18
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 12
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 11
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 11
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 claims description 10
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 9
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 6
- 238000010791 quenching Methods 0.000 claims description 6
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 claims description 3
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 abstract description 9
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 abstract description 8
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 abstract description 6
- 238000012800 visualization Methods 0.000 abstract description 2
- 101001109052 Homo sapiens NADH-ubiquinone oxidoreductase chain 4 Proteins 0.000 abstract 3
- 102100021506 NADH-ubiquinone oxidoreductase chain 4 Human genes 0.000 abstract 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 18
- 102100035102 E3 ubiquitin-protein ligase MYCBP2 Human genes 0.000 description 13
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 12
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 11
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 8
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 8
- 238000013461 design Methods 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 101800005109 Triakontatetraneuropeptide Proteins 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 5
- NMEHNETUFHBYEG-IHKSMFQHSA-N tttn Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 NMEHNETUFHBYEG-IHKSMFQHSA-N 0.000 description 5
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 2
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 2
- 101001121408 Homo sapiens L-amino-acid oxidase Proteins 0.000 description 2
- 102100026388 L-amino-acid oxidase Human genes 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 238000009223 counseling Methods 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 230000010339 dilation Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012014 optical coherence tomography Methods 0.000 description 2
- 238000003793 prenatal diagnosis Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 2
- BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 6-carboxyfluorescein Chemical compound C12=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C2C11OC(=O)C2=CC=C(C(=O)O)C=C21 BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150111062 C gene Proteins 0.000 description 1
- 208000025721 COVID-19 Diseases 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 208000014094 Dystonic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 201000006347 Intellectual Disability Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 206010052641 Mitochondrial DNA mutation Diseases 0.000 description 1
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 description 1
- 201000010183 Papilledema Diseases 0.000 description 1
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 101150063416 add gene Proteins 0.000 description 1
- 238000007844 allele-specific PCR Methods 0.000 description 1
- 238000012197 amplification kit Methods 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 208000010118 dystonia Diseases 0.000 description 1
- 206010015037 epilepsy Diseases 0.000 description 1
- 230000000763 evoking effect Effects 0.000 description 1
- 238000013534 fluorescein angiography Methods 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 208000016354 hearing loss disease Diseases 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000002595 magnetic resonance imaging Methods 0.000 description 1
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 1
- 238000005580 one pot reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001328 optic nerve Anatomy 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了检测原发突变位点为m.14484T>C的Leber遗传性视神经病变的组合物、试剂盒及应用。基于CRISPR/Cas12的一步法检测Leber遗传性视神经病变的组合物，包含crRNA和RPA扩增引物对；所述crRNA的序列为如SEQ ID NO:10所示的序列，并且所述RPA扩增引物对为如SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28所示的序列组成的引物对；所述Leber遗传性视神经病变的原发突变位点为m.14484T>C。本发明提供的组合物和试剂盒可以对LHON基因突变进行快速诊断，一步法快速实现对LHON致病突变的快速检测，精准地检测样品的LHON致病原发突变位点m.14484T>C是否存在，具有检测快速、操作简便(一步法)、特异性、可视化，无需大型贵重仪器和昂贵试剂等特点。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别地涉及检测原发突变位点为m.14484T＞C的Leber遗传性视神经病变的组合物、试剂盒及应用。
背景技术
Leber遗传性视神经病变(Leber Hereditary Optic Neuropathy；LHON)是由线粒体DNA突变所引起的母系遗传性视神经退行性疾病。LHON临床表现为双眼先后发生的无痛性视力突然急剧下降。眼底早期表现为视盘充血水肿、视盘旁毛细血管迂曲扩张，疾病后期视盘水肿和毛细血管扩张消退，最终视盘颞侧或全部呈萎缩性改变。多数LHON病人只存在眼部表现，少数可合并全身其他系统症状如智力障碍、癫痫、听力障碍、肌张力障碍等。LHON较为罕见，在亚洲的流行率约为1.18/10000，且具有明显的男性多发倾向，通常在男性20-30岁时发病，男女患者比例大致为5:1。
LHON线粒体原发突变位点为11778G＞A、3460G＞A和14484T＞C，约90％的LHON病例由上述三个基因突变引起。其中，我国m.11778G＞A突变率约为90％。这些基因突变的携带者可能不发病，这是LHON外显不全的特点，但是这些女性的携带者可能通过遗传将突变传递给下一代，从而对后代视力造成一定的风险。因此，对LHON相关致病基因突变位点的检测以及遗传咨询和产前诊断还是非常必要的。
临床上，通过视觉诱发电位(VEP)、眼底荧光血管造影(FFA)、光学相干断层扫描(OCT)、视野(VF)、共振成像(MRI)等方式可以协助诊断LHON，但是最终仍需要通过对上述三个突变位点的检测来确诊。目前，常见的检测LHON致病突变的方法有桑格测序，二代测序，限制性片段长度多态性PCR，单链构象多态性PCR，等位基因特异性PCR，逆转录定量PCR等方法。
这些方法在一定程度上需要消耗12-24小时时间不等，并且操作比较繁琐，个别技术如桑格测序和二代测序需要大型测序仪等贵重仪器，不适合作为一种临床常备的快速检测的方法。
发明内容
有鉴于此，本发明提出检测原发突变位点为m.14484T＞C的Leber遗传性视神经病变的组合物、试剂盒及应用。一步法快速实现对LHON致病突变的快速检测，精准地检测样品的LHON致病原发突变位点m.14484T＞C是否存在，具有检测快速、操作简便(一步法)、特异性、可视化，无需大型贵重仪器和昂贵试剂等特点。本发明提供的组合物和试剂盒可以对LHON基因突变进行快速诊断，适用于在人群中大规模筛查突变携带者，为临床遗传咨询和产前诊断提供基础支持。
本发明的技术方案如下：
本发明提供了基于CRISPR/Cas12的一步法检测Leber遗传性视神经病变的组合物。
本发明所提供的基于CRISPR/Cas12的一步法检测Leber遗传性视神经病变的组合物，包含crRNA和RPA扩增引物对；所述crRNA的序列为如SEQ ID NO:10所示的序列，并且所述RPA扩增引物对为如SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28所示的序列组成的引物对；所述Leber遗传性视神经病变的原发突变位点为m.14484T＞C。
所述基于CRISPR/Cas12的一步法检测Leber遗传性视神经病变的组合物在制备检测Leber遗传性视神经病变的试剂盒中应用也属于本发明的保护范围。
本发明还提供了一种一步法检测Leber遗传性视神经病变的试剂盒。
本发明所提供的一步法检测Leber遗传性视神经病变的试剂盒，包括所述的基于CRISPR/Cas12的一步法检测Leber遗传性视神经病变的组合物。
所述试剂盒还包括独立包装的如下组分：RPA粉末、反应缓冲液、Cas12a蛋白和可被Cas12a特异性切割的荧光探针；所述可被Cas12a特异性切割的荧光探针两端分别是发光基团和猝灭基团，中间由单链DNA进行连接。
所述的一步法检测Leber遗传性视神经病变的试剂盒在制备检测临床样本的Leber遗传性视神经病变的原发突变位点的反应体系中的应用也属于本发明的保护范围；所述Leber遗传性视神经病变的原发突变位点为m.14484T＞C。
所述临床样本为临床血液样本。
本发明的crRNA选自检测m.11778G＞A的表1中的crRNA5、检测m.3460G＞A的表1中的crRNA3、以及检测m.14484T＞C的表1中的crRNA7。crRNA可以通过本领域熟知的化学方法合成或转录获得，例如：设计并合成模板序列(表2)；退火构建体外转录模板，用转录试剂盒体外转录，即可获得所述crRNA。上述Cas12a蛋白可通过商业化的公司购买，如NEB等。
为了保证检测的特异性，本发明提供的crRNA和等温快速扩增(RPA)引物经过NCBI核酸数据库检索，确定了序列的特异性，与包括人、动植物等在内的基因组其他区域无高度同源性匹配。为了提高crRNA对靶序列的特异性，所提供的crRNA上会人为引入一个错配碱基，增强crRNA对靶序列的打靶特异性。
在反应中，还包括RPA的粉末、缓冲物和特异性引物。上述RPA粉末和缓冲液购买自TwistDx公司。上述RPA引物，经过设计，从金斯瑞公司订购合成，包括引物对1扩增m.3460G＞A位点附近的片段、引物对2扩增m.11778G＞A位点附近的片段以及引物对3扩增m.14484T＞C位点附近的片段。
在具体实施方式中，所述反应还包括独立存在的可被Cas12a特异性切割的荧光探针(ssDNA-FQ)，该探针的特点是两端分别是发光基团6-FAM和猝灭基团BQH1，中间由单链DNA(ssDNA)进行连接，本发明中使用的连接序列为TTATT。正常情况下，由于猝灭基团作用，该荧光探针不激发荧光，只有当特定情况下，ssDNA断裂，释放荧光基团，则可进行荧光读数与鉴定。该荧光探针可从上海生物工程公司购买。检测结果判读既可利用酶标仪进行荧光读数，也可使用实时定量PCR仪器进行连续荧光检测。
当检测m.11778G＞A突变时，需使用表1所示的crRNA5和表3所示的PRA引物对2进行反应；当检测m.3460G＞A突变时，需使用表1所示的crRNA3和表3所示的PRA引物对1进行反应；当检测m.14484T＞C突变时，需使用表1所示的crRNA7和表3所示的PRA引物对3进行反应。每个反应需要加入荧光探针，作为指示剂，进行结果判定。
本发明的检测基本原理如下：基于CRISPR(Clustered regularly interspacedshort palindromic repeats)系统开发的核酸快速检测系统在COVID-19和zaka Virus等传染病领域的广泛使用，CRISPR/Cas12a可在crRNA引导下，对特异性靶序列进行识别，并激活核酸内切酶活性，对附近的双链DNA和单链DNA进行非特异性切割。基于此，本发明的发明人研究设计了一步法快速精准检测临床样本中m.3460G＞A、m.11778G＞A和m.14484T＞C基因突变。当CRISPR/Cas12a与crRNA复合物与靶序列进行特异性结合，即可激活Cas12a的内切酶活性，切割周边荧光探针的ssDNA，从而暴露出荧光基团，再利用酶标仪或者实时定量PCR仪即可检测到荧光并进行定量，依据荧光值可判定为阳性结果；反之，若检测样本中不存在上述突变，则基底荧光与阴性对照相差无几，即可判定为阴性。图1为本发明一步法检测LHON致病基因突变的流程图。
与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：
本发明提供的基于CRISPR/Cas12检测Leber遗传性视神经病变的组合物，能够检测LHON常见的三种原发性突变中的任一一种：m.3460G＞A或m.11778G＞A或m.14484T＞C。
在m.3460G＞A、m.11778G＞A和m.14484T＞C位点附近前后10bp之内分别寻找包含Cas12a识别序列(PAM,5’…TTTN…3’)的靶向序列，使得突变位点位于crRNAtarget区域的6bp之内，能获得最高的打靶效应。
当检测m.3460G＞A突变时，在m.3460G＞A位点附近发现合适的PAM结构。
当检测m.11778G＞A或m.14484T＞C突变时，m.11778G＞A和m.14484T＞C位点附近并不存在合适的PAM序列，因此发明人设计特定的RPA引物，直接在RPA引物上引入PAM(5’…TTTN…3’)，这样可以通过RPA引物位置的变动，使突变位点存在于crRNAtarget区域不同的位置，以筛选活性最高的crRNA。为了降低WT的背景信号，在crRNA上突变位点附近(前后6bp内)再设计引入一处错配碱基。
本发明还提供了检测Leber遗传性视神经病变的试剂盒，该试剂盒除包括上述的基于CRISPR/Cas12检测Leber遗传性视神经病变的组合物以外，还包括独立包装的如下组分：RPA粉末、反应缓冲液、Cas12a蛋白和可被Cas12a特异性切割的荧光探针，该探针的特点是两端分别是发光基团和猝灭基团，中间由单链DNA(ssDNA)进行连接，正常情况下，由于猝灭基团作用，该荧光探针不激发荧光，只有当特定情况下，ssDNA断裂，释放荧光基团，则可进行荧光读数与鉴定。利用RT-PCR仪器读取荧光值，无需利用其他大型仪器，方便快捷。
作为对照，本发明在一步法体系中，选用专利申请(CN 114774530 A)提及的crRNA转录模板(表7)和RPA引物对(表8)分别检测m.3460G＞A，m.11778G＞A和m.14484T＞C突变位点时的分辨率。与本发明进行对比发现，CN 114774530A所使用的体系在一步法检测中，并不能很好的区分突变DNA与野生型DNA，在分辨效果上与本发明提供的体系存在较大的差距。
附图说明
为了说明而非限制的目的，现在将根据本发明的优选实施例、特别是参考附图来描述本发明，其中：
图1为一步法检测LHON致病基因突变的流程图；
图2为m.11778G＞A位点crRNA筛选结果图；其中，crRNA5 vs Mut-PCR：crRNA5对突变型PCR产物的检测结果；crRNA5 vs WT-PCR：crRNA5对野生型PCR产物的检测结果；crRNA5NTC：crRNA5对不加模板对照结果。
图3为m.3460G＞A位点crRNA筛选结果图。图3中A：crRNA1对突变型PCR产物(Mut-PCR)、野生型PCR产物(WT-PCR)和不加模板对照(NTC)的检测结果；图3中B：crRNA2对突变型PCR产物(Mut-PCR)、野生型PCR产物(WT-PCR)和不加模板对照(NTC)的检测结果；图3中C:crRNA3对突变型PCR产物(Mut-PCR)、野生型PCR产物(WT-PCR)和不加模板对照(NTC)的检测结果；图3中D：crRNA4对突变型PCR产物(Mut-PCR)、野生型PCR产物(WT-PCR)和不加模板对照(NTC)的检测结果。
图4为m.14484T＞C位点crRNA筛选结果图。图4中A：crRNA6对突变型PCR产物(Mut-PCR)、野生型PCR产物(WT-PCR)和不加模板对照(NTC)的检测结果；图4中B：crRNA7对突变型PCR产物(Mut-PCR)、野生型PCR产物(WT-PCR)和不加模板对照(NTC)的检测结果；图4中C:crRNA8对突变型PCR产物(Mut-PCR)、野生型PCR产物(WT-PCR)和不加模板对照(NTC)的检测结果；图4中D：crRNA9对突变型PCR产物(Mut-PCR)、野生型PCR产物(WT-PCR)和不加模板对照(NTC)的检测结果。
图5为三条crRNA，即crRNA3、crRNA5、crRNA7在对各自临床样本的检测结果，其中，图5中A：crRNA3在临床突变样本(Mut-DNA)、野生型样本(WT-DNA)和不加模板对照(NTC)中的检测结果；图5中B:crRNA5在临床突变样本(Mut-DNA)、野生型样本(WT-DNA)和不加模板对照(NTC)中的检测结果；图5中C:crRNA7在临床突变样本(Mut-DNA)、野生型样本(WT-DNA)中和不加模板对照(NTC)中的检测结果。
图6为CN 114774530A选用的crRNA和RPA引物在一步法分别检测检测m.3460G＞A，m.11778G＞A和m.14484T＞C突变的结果。图6中A：ND1-patent-crRNA和RPA引物检测临床突变样本(Mut-DNA)、野生型样本(WT-DNA)和不加模板对照(NTC)中的检测结果；图6中B：ND4-patent-crRNA和RPA引物检测临床突变样本(Mut-DNA)、野生型样本(WT-DNA)和不加模板对照(NTC)中的检测结果；图6中C：ND6-patent-crRNA和RPA引物检测临床突变样本(Mut-DNA)、野生型样本(WT-DNA)和不加模板对照(NTC)中的检测结果。
具体实施方式
本发明中的RPA扩增试剂盒购买自TwistDx公司；检测所用crRNA模板、T7引物和RPA引物对合成由南京金斯瑞公司完成；DNA使用天根生物技术有限公司的试剂盒预先提取。本发明对LHON三个原发常见突变位点(m.3460G＞A或m.11778G＞A或m.14484T＞C)进行检测，包括以下两部分：(1)待测突变位点的RPA引物和crRNA筛选确定；(2)一步法检测临床样本基因突变的存在，如图1所示：抽取待测对象的血液1ml，进行DNA提取，然后在检测各自位点时，分别选用筛选得到的RPA引物和crRNA进行组合，配制反应体系，在实时定量PCR仪中反应20～30min，即对待测样品进行一步法检测，反应完成即可读取荧光值进行结果判定。
实施例1、筛选针对LHON三个原发常见突变位点(m.3460G＞A、m.11778G＞A和m.14484T＞C)的crRNA
1.1核酸制备
本实施例中分别携带有LHON三个原发常见突变位点(m.3460、m.11778和m.14484)野生型(WT)基因片段和突变型(MT)基因片段的质粒均由南京金斯瑞公司合成，这些基因片段合成之后被克隆进PUC57(addgene,#54338)的骨架质粒中，可在体外进行独立扩增。m.3460G＞A、m.11778G＞A和m.14484T＞C位点合成基因序列如下所述：
ND1 WT(m.3460位点以下划线加粗显示)：
ND4 WT(m.11778位点以下划线加粗显示)：
ND6 WT(m.14484位点以下划线加粗显示)：
上述均为WT的基因序列，分别合成重组形成PUC57-ND1-WT，PUC57-ND4-WT，PUC57-ND6-WT质粒。三个位点的突变序列即将ND1m.3460位点的G(上述划线加粗显示的碱基)突变为A，ND4 m.11778位点的G(上述划线加粗显示的碱基)突变为A和ND6 m.14484位点的T(上述划线加粗显示的碱基)突变为C，前后其余序列不变分别合成重组形成突变型质粒PUC57-ND1-MT，PUC57-ND4-MT，PUC57-ND6-MT。
1.2 LHON三个原发常见突变位点(m.3460G＞A、m.11778G＞A和m.14484T＞C)的crRNA的设计和制备
在m.3460G＞A、m.11778G＞A和m.14484T＞C位点附近前后10bp之内分别寻找包含Cas12a识别序列(PAM,5’…TTTN…3’)的靶向序列，使得突变位点位于crRNA target区域的6bp之内，能获得最高的打靶效应。搜寻发现，仅在m.3460G＞A位点附近发现合适的PAM结构，而m.11778G＞A和m.14484T＞C位点附近并不存在合适的PAM序列，因此需设计特定的RPA引物，直接在RPA引物上引入PAM(5’…TTTN…3’)，这样可以通过RPA引物位置的变动，使突变位点存在于crRNA target区域不同的位置，以筛选活性最高的crRNA。为了降低WT的背景信号，在crRNA上突变位点附近(前后6bp内)再设计引入一处错配碱基；完成crRNA设计后，转换形成crRNA体外转录模板，交由南京金斯瑞公司直接合成。
本发明实施方式提供了crRNA序列(表1)及其体外转录模板(表2)。当体外转录模板合成之后，将模板用ddH2O溶解成终浓度为100μm的工作液，同时溶解T7启动子模板。将分别取1μl crRNA转录模板和1μl T7启动子模板，另加入8μl ddH2O进行链退火反应(95℃开始以每分钟6℃的速率递减至20℃)，使之形成最终的体外转录模板，使用NEB公司的体外转录试剂盒与纯化试剂盒，生产并纯化crRNA，并调整终浓度至400ng/μl。
表1本发明所使用的crRNA序列
表2本发明所需的转录模板序列
1.3RPA引物设计和合成
m.3460G＞A位点附近存在的PAM结构可以直接进行利用，因此设计的RPA引物扩增的片段约为150bp，使得m.3460位点处在扩增片段的中间，RPA上下游引物分别为30个碱基长度；m.11778G＞A和m.14484T＞C位点附近由于不具有现成的PAM结构，因此在其中一段RPA引物上直接引入PAM(5’…TTTN…3’)，即可使得突变位点处在特定的位置，因此其中一条引物位置较为固定，需与crRNA相互配合；具体的RPA引物序列如表3所示，设计完成后，可交由金斯瑞公司直接合成。
表3本发明所需的RPA引物序列
1.4利用PCR产物一步法筛选crRNA
利用PCR引物表4所列引物序列，分别对合成的不同位点的野生型和突变型质粒进行扩增，产物经过天根生物有限公司的PCR产物纯化试剂盒纯化，获得DNA模板，将产物浓度稀释为10ng/μl，并取1μl作为检测样品进行一步法检测。
表4本发明所需的普通PCR引物序列及适用模板
本发明使用的一步法检测体系为50μl，具体成分设置如下表5所示。
表5一步法体系
| 组分 | 50μL |
| RPA缓冲液、粉末混合物 | 29.5μL |
| PRA-FP | 2.4μL |
| PRA-RP | 2.4μL |
| ssDNA-FQ | 4μL |
| crRNA | 1μL |
| Cas12a | 2μL |
| DNA | 1μL |
| Mg2+ | 2.5μL |
| ddH2O | 5.2μL |
上述反应于荧光PCR仪中进行，反应温度设置为42℃，反应时长30min，在反应期间每30s进行荧光定量检测。
经过检测发现：
对于m.11778G＞A的检测，crRNA5具有较高的特异性(图2)，图2为m.11778G＞A位点crRNA筛选结果图；其中，Mut-PCR：突变型PCR产物；WT-PCR野生型PCR产物；NTC：不加模板对照。由图2中可知，crRNA5能很好区分突变型(Mut)和野生型(WT)PCR产物，可用于后续临床样本的筛选检测。
对于m.3460G＞A的检测，crRNA3具有较高的特异性(图3)。图3为m.3460G＞A位点crRNA筛选结果图。图3中A：crRNA1对突变型PCR产物(Mut-PCR)、野生型PCR产物(WT-PCR)和不加模板对照(NTC)的检测结果；图3中B：crRNA2对突变型PCR产物(Mut-PCR)、野生型PCR产物(WT-PCR)和不加模板对照(NTC)的检测结果；图3中C:crRNA3对突变型PCR产物(Mut-PCR)、野生型PCR产物(WT-PCR)和不加模板对照(NTC)的检测结果；图3中D：crRNA4对突变型PCR产物(Mut-PCR)、野生型PCR产物(WT-PCR)和不加模板对照(NTC)的检测结果。由图3中可知，在m.3460G＞A位点crRNA筛选中，crRNA3能很好区分突变型(Mut)和野生型(WT)PCR产物，具有最高的灵敏度。由此可选择crRNA3用于后续临床样本的筛选检测。
对于m.14484T＞C的检测，crRNA7具有较高的特异性(图4)。图4为m.14484T＞C位点crRNA筛选结果图。图4中A：crRNA6对突变型PCR产物(Mut-PCR)、野生型PCR产物(WT-PCR)和不加模板(NTC)对照的检测结果；图4中B：crRNA7对突变型PCR产物(Mut-PCR)、野生型PCR产物(WT-PCR)和不加模板对照(NTC)的检测结果；图4中C:crRNA8对突变型PCR产物(Mut-PCR)、野生型PCR产物(WT-PCR)和不加模板对照(NTC)的检测结果；图4中D：crRNA9对突变型PCR产物(Mut-PCR)、野生型PCR产物(WT-PCR)和不加模板对照(NTC)的检测结果。由图4中可知，在m.14484T＞C位点crRNA筛选中，crRNA7能很好区分突变型(Mut)和野生型(WT)PCR产物，具有最高的灵敏度。由此可选择crRNA7用于后续临床样本的筛选检测。
后续对于临床样本的检测，分别选取crRNA3、crRNA5、crRNA7对相应的临床样本进行检测。
实施例2、利用一步法检测临床样本
临床样本：依据临床诊断记录分别取m.11778G＞A突变型、m.3460G＞A突变型、m.14484T＞C突变型病人血液各一例，以及一例正常人血液作为对照。
检测方法：利用DNA提取试剂盒(天根生物科技有限公司生产)对病人血液提取DNA，并稀释至合适浓度(10ng/μl)备用，然后利用上文及图1所示的一步法分别检测三个不同突变。当检测m.11778G＞A突变时，需使用上述表1所示的crRNA5和表3所示的PRA引物对2进行反应；当检测m.3460G＞A突变时，需使用表1所示的crRNA3和表3所示的PRA引物对1进行反应；当检测m.14484T＞C突变时，需使用表1所示的crRNA7和表3所示的PRA引物对3进行反应。反应体系以及其它所需试剂的加入量如下表6所示。
表6一步法检测临床样本的反应体系
| 组分 | 50μl |
| RPA缓冲液、粉末混合物 | 29.5μl |
| PRA-FP | 2.4μl |
| PRA-RP | 2.4μl |
| ssDNA-FQ | 4μl |
| crRNA | 1μl |
| Cas12a | 2μl |
| DNA | 1μl |
| Mg2+ | 2.5μl |
| ddH2O | 5.2μl |
如上文所述，RPA缓冲液和粉末可自TwistDx公司购买，ssDNA-FQ可自生物工程有限公司购买，Cas12a可自NEB公司购买，Mg2+则由RPA粉末和缓冲液试剂中自带。Mg2+需最后添加。当上述反应体系构建完成之后，立即震荡混匀，简短离心之后，快速置实时定量PCR仪中反应。反应设置为：42℃，30min，每30s进行荧光定量检测，反应完成即可进行结果判定。
结果如图5所示，图5为三条crRNA，即crRNA3、crRNA5、crRNA7在各自突变位点检测结果图，其中，图5中A：crRNA3在临床突变样本和野生型样本中的检测结果；图5中B:crRNA5在临床突变样本和正常样本中的检测结果，；图5中C:crRNA7在临床突变样本和正常样本中的检测结果。WT-DNA：正常人DNA样本；Mut-DNA：临床突变DNA样本；NTC：无模板对照。由图5可知本发明提供的一步法检测体系，能快速精确的检测各自临床样本中的突变。
对比例1、专利申请(CN 114774530 A)中选用的crRNA和RPA体系在一步法检测体系中对相同临床样本进行检测。
CN 114774530A中使用的检测方法为两步法检测，与本发明在步骤上具有较大的不同。本发明的一步法检测在实施步骤上更加的简便。在设计上，本发明检测m.11778G＞A和m.14484T＞C位点是，在RPA引物上引入PAM，如此可使突变位点位于距离PAM的6bp种子区域，使得该crRNA具有更高的特异性。
选取CN 114774530A中所述的检测m.3460G＞A的crRNA和RPA引物、检测m.11778G＞A的crRNA和RPA引物以及检测m.14484T＞C的crRNA和RPA引物验证其在一步法体系中的检测效果。crRNA制备步骤参考实施例1中的制备方法：在制备检测m.3460G＞A位点的crRNA时，选用表7所示的相应模板(SEQ ID NO：35)；在制备检测m.11778G＞A位点的crRNA时，选用表7所示的相应模板(SEQ ID NO：36)；在制备检测m.14484T＞C位点的crRNA时，选用表7所示的相应模板(SEQ ID NO：36)。一步法检测临床样本实施方法和步骤同上述实施例2所述，检测m.3460G＞A位点时选取的临床Mut-DNA和WT-DNA与上述实施例2中crRNA3检测的样本相同；检测m.11778G＞A位点时选取的临床Mut-DNA和WT-DNA与上述实施例2中crRNA5检测的样本相同；检测m.14484T＞C位点时选取的临床Mut-DNA和WT-DNA与上述实施例2中crRNA7检测的样本相同。检测m.3460G＞A位点时选取表8所示的RPA引物对7进行反应；检测m.11778G＞A位点时选取表8所示的RPA引物对8进行反应；检测m.14484T＞C位点时选取表8所示的RPA引物对9进行反应。
结果如图6所示，图6为CN 114774530A中选用的crRNA和RPA引物在一步法分别检测m.3460G＞A，m.11778G＞A和m.14484T＞C突变的结果。图6中A：ND1-patent-crRNA和RPA体系检测临床突变样本(Mut-DNA)、野生型样本(WT-DNA)和不加模板对照(NTC)中的检测结果；图6中B：ND4-patent-crRNA和RPA体系检测临床突变样本(Mut-DNA)、野生型样本(WT-DNA)和不加模板对照(NTC)中的检测结果；图6中C：ND6-patent-crRNA和RPA体系检测临床突变样本(Mut-DNA)、野生型样本(WT-DNA)和不加模板对照(NTC)中的检测结果。由图6中结果可知，在一步法反应体系中，CN 114774530A选用的ND1体系和ND6体系不能很好的区分Mut-DNA和WT-DNA，与本发明提供的相应体系(图5中A和C)相比，在分辨率上存在较大的差距。ND4体系虽然在反应开始时能区分Mut-DNA和WT-DNA，但随着反应的进行，WT-DNA中的荧光强度不断增强，最终达到与Mut-DNA相似的程度，在后期存在一定的干扰，与本发明提供的ND4检测体系(图5中B)在最终效果上存在较大的差距。综合上述结果，本发明提供的m.3460G＞A，m.11778G＞A和m.14484T＞C检测体系与其他专利相比，在一步法检测中具有较高的检测分辨率和效果。
表7 CN 114774530A选用的crRNA的对应转录模板
表8 CN 114774530 A选用的RPA引物
与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：
1、本发明提供了一步法检测LHON常见的三个原发性突变(m.3460G＞A或m.11778G＞A或m.14484T＞C)，在实施上具有灵敏、特异、快速的特点，将反应时间缩短至半小时。
2、本发明涉及的快速检测技术，利用RT-PCR仪器读取荧光值，无需利用其他大型仪器，方便快捷，适合于一般医院、实验室进行大规模筛查。
3、本发明涉及的试剂均已经实现商业化或由商业化公司合成，大规模筛选试剂成本降低，大大节约经济和时间成本。
上述具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限制。本领域技术人员应该明白的是，取决于设计要求和其他因素，可以发生各种各样的修改、组合、子组合和替代。任何在本发明的精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明保护范围之内。
Claims (6)
1.基于CRISPR/Cas12的一步法检测Leber遗传性视神经病变的组合物，其特征在于：所述组合物包含crRNA和RPA扩增引物对；
所述crRNA的序列为如SEQ ID NO:10所示的序列，并且所述RPA扩增引物对为如SEQ IDNO:27和SEQ ID NO:28所示的序列组成的引物对；
所述Leber遗传性视神经病变的原发突变位点为m.14484T>C。
2.权利要求1所述的基于CRISPR/Cas12的一步法检测Leber遗传性视神经病变的组合物在制备检测Leber遗传性视神经病变的试剂盒中应用。
3.一种一步法检测Leber遗传性视神经病变的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求1所述的基于CRISPR/Cas12的一步法检测Leber遗传性视神经病变的组合物。
4.根据权利要求3所述的一步法检测Leber遗传性视神经病变的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括独立包装的如下组分：RPA粉末、反应缓冲液、Cas12a蛋白和可被Cas12a特异性切割的荧光探针；所述可被Cas12a特异性切割的荧光探针两端分别是发光基团和猝灭基团，中间由单链DNA进行连接。
5.权利要求3或4中任一所述的一步法检测Leber遗传性视神经病变的试剂盒在制备检测临床样本的Leber遗传性视神经病变的原发突变位点的反应体系中的应用；所述Leber遗传性视神经病变的原发突变位点为m.14484T>C。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述临床样本为临床血液样本。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410865660.XA CN118773303A (zh) | 2024-03-08 | 2024-03-08 | 检测原发突变位点为m.14484T＞C的Leber遗传性视神经病变的组合物、试剂盒及应用 |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410268943.6A CN117887841B (zh) | 2024-03-08 | 2024-03-08 | 基于CRISPR/Cas12的一步法检测Leber遗传性视神经病变的组合物、试剂盒及应用 |
| CN202410865660.XA CN118773303A (zh) | 2024-03-08 | 2024-03-08 | 检测原发突变位点为m.14484T＞C的Leber遗传性视神经病变的组合物、试剂盒及应用 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202410268943.6A Division CN117887841B (zh) | 2024-03-08 | 2024-03-08 | 基于CRISPR/Cas12的一步法检测Leber遗传性视神经病变的组合物、试剂盒及应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN118773303A true CN118773303A (zh) | 2024-10-15 |
Family
ID=90639770
Family Applications (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202410268943.6A Active CN117887841B (zh) | 2024-03-08 | 2024-03-08 | 基于CRISPR/Cas12的一步法检测Leber遗传性视神经病变的组合物、试剂盒及应用 |
| CN202410865660.XA Pending CN118773303A (zh) | 2024-03-08 | 2024-03-08 | 检测原发突变位点为m.14484T＞C的Leber遗传性视神经病变的组合物、试剂盒及应用 |
| CN202410865671.8A Pending CN118667942A (zh) | 2024-03-08 | 2024-03-08 | 检测原发突变位点为m.3460G>A的Leber遗传性视神经病变的组合物、试剂盒及应用 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202410268943.6A Active CN117887841B (zh) | 2024-03-08 | 2024-03-08 | 基于CRISPR/Cas12的一步法检测Leber遗传性视神经病变的组合物、试剂盒及应用 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202410865671.8A Pending CN118667942A (zh) | 2024-03-08 | 2024-03-08 | 检测原发突变位点为m.3460G>A的Leber遗传性视神经病变的组合物、试剂盒及应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (3) | CN117887841B (zh) |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SG11201900049QA (en) * | 2016-07-05 | 2019-02-27 | Univ Johns Hopkins | Crispr/cas9-based compositions and methods for treating retinal degenerations |
| CN111575352A (zh) * | 2020-05-22 | 2020-08-25 | 重庆大学 | 一种基于CRISPR-Cas9点特异性切割可视化检测ssRNA或ssDNA的方法 |
| CN116490605A (zh) * | 2020-08-13 | 2023-07-25 | 萨那生物技术股份有限公司 | 以低免疫性细胞治疗敏感性患者的方法以及相关方法和组合物 |
| US20220049226A1 (en) * | 2020-08-13 | 2022-02-17 | Sana Biotechnology, Inc. | Methods of treating sensitized patients with hypoimmunogenic cells, and associated methods and compositions |
| CN112980933B (zh) * | 2020-12-30 | 2023-08-29 | 南方科技大学 | 一种基于CRISPR-Cas体系的SNP分型检测方法及其应用 |
| CN113388691B (zh) * | 2021-07-23 | 2022-08-30 | 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 | 一种基于PCR扩增和CRISPR-Cas12a的核酸检测方法及应用 |
| WO2023051734A1 (en) * | 2021-09-29 | 2023-04-06 | Huidagene Therapeutics Co., Ltd. | Engineered crispr-cas13f system and uses thereof |
| CN114774530B (zh) * | 2022-02-08 | 2023-10-20 | 上海市第一人民医院 | 检测LHON致病突变的CRISPR-Cas组合物、试剂盒和方法 |
| CN117587117A (zh) * | 2023-10-30 | 2024-02-23 | 河南兰德施坦纳基因科技有限公司 | 一种检测Leber遗传性视神经病变的引物组、试剂盒及应用 |
-
2024
- 2024-03-08 CN CN202410268943.6A patent/CN117887841B/zh active Active
- 2024-03-08 CN CN202410865660.XA patent/CN118773303A/zh active Pending
- 2024-03-08 CN CN202410865671.8A patent/CN118667942A/zh active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN117887841B (zh) | 2024-07-26 |
| CN117887841A (zh) | 2024-04-16 |
| CN118667942A (zh) | 2024-09-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Dwivedi et al. | Diseases and molecular diagnostics: a step closer to precision medicine | |
| WO2021164472A1 (zh) | 基于纳米孔测序平台的文库的构建方法、鉴定微生物的方法及应用 | |
| JP2010514427A (ja) | 母性遺伝性難聴に関連するミトコンドリア遺伝子Ｃ１４９４Ｔ突然変異を検出するためのＴａｑＭａｎＭＧＢプローブ及びその使用方法 | |
| CN103571847A (zh) | Foxc1基因突变体及其应用 | |
| CN106987642A (zh) | 检测mpl基因全外显子的试剂盒和方法 | |
| CN110551812B (zh) | 一种诊断脊髓性肌萎缩症的CRISPR-Cas系统及其应用 | |
| CN111733227B (zh) | 特发性视神经炎诊断分子标记物circRNA、试剂盒及应用 | |
| CN114774530B (zh) | 检测LHON致病突变的CRISPR-Cas组合物、试剂盒和方法 | |
| CN111575366A (zh) | 用于检测自闭症基因组拷贝数变异的引物组、探针组及试剂盒 | |
| CN110129422A (zh) | 基于长片段pcr和单分子测序解析多核苷酸重复突变疾病突变结构的方法 | |
| CN117887841B (zh) | 基于CRISPR/Cas12的一步法检测Leber遗传性视神经病变的组合物、试剂盒及应用 | |
| WO2018135464A1 (ja) | 次世代シーケンサーを用いた迅速な遺伝子検査方法 | |
| CN109457031B (zh) | BRCA2基因g.32338309A＞G突变体及其在乳腺癌辅助诊断中的应用 | |
| CN103981255B (zh) | 一种Leber遗传性视神经病变体外诊断试剂盒 | |
| CN115927356B (zh) | Slc45a2致病突变基因、致病突变体及在制备眼皮肤白化病ⅳ型诊断试剂盒中的应用 | |
| CN110172506A (zh) | 一种试剂盒及其用于定量检测Leber遗传性视神经病突变体的应用 | |
| JP2017038553A (ja) | 喘息の診断用マイクロｒｎａ | |
| CN116426630A (zh) | 导致Joubert综合征的致病基因、检测及应用 | |
| CN116606923A (zh) | 导致x连锁慢性肉芽肿病的致病基因、检测及应用 | |
| CN106834476B (zh) | 一种乳腺癌检测试剂盒 | |
| CN105624167A (zh) | 一种遗传性中心性晕轮状视网膜病变的致病突变及其检测试剂 | |
| CN116004801B (zh) | 一种导致mcph5型小头畸形的致病基因aspm复合杂合突变的应用及检测试剂和应用 | |
| CN116064768B (zh) | 视神经脊髓炎谱系疾病相关性视神经炎诊断分子标记物circRNA试剂盒及应用 | |
| CN115927354B (zh) | 一种sh3tc2基因致病突变体及其在制备腓骨肌萎缩症4c型诊断试剂盒中的应用 | |
| CN117471107B (zh) | 检测先天性无毛症的hr突变基因、蛋白、试剂、试剂盒及应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |