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WO2018135464A1 - 次世代シーケンサーを用いた迅速な遺伝子検査方法 - Google Patents

次世代シーケンサーを用いた迅速な遺伝子検査方法 Download PDF

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WO2018135464A1
WO2018135464A1 PCT/JP2018/000952 JP2018000952W WO2018135464A1 WO 2018135464 A1 WO2018135464 A1 WO 2018135464A1 JP 2018000952 W JP2018000952 W JP 2018000952W WO 2018135464 A1 WO2018135464 A1 WO 2018135464A1
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WO
WIPO (PCT)
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mutation
gene
mutations
brca1
genetic
Prior art date
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Ceased
Application number
PCT/JP2018/000952
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English (en)
French (fr)
Inventor
博史 中岡
逸朗 井ノ上
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Inter University Research Institute Corp Research Organization of Information and Systems
Original Assignee
Inter University Research Institute Corp Research Organization of Information and Systems
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Publication of WO2018135464A1 publication Critical patent/WO2018135464A1/ja
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Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor

Definitions

  • the present invention relates to a genetic testing technique for detecting mutations occurring in germ line cells and somatic cells.
  • Cancer develops by accumulation of somatic mutations, but, like BRCA1 and BRCA2 related to breast cancer and ovarian cancer, it carries mutations in the germ line and genetically affects breast cancer and ovarian cancer. Some have genetic factors that are likely to develop.
  • the lifetime risk of suffering from breast cancer is said to be 56-85%.
  • Breast cancer also has a bilateral breast cancer rate of 40-65%, and the lifetime risk of developing ovarian cancer is more than 50% in people with mutations in BRCA1, and more than 20% in people with mutations in BRCA2. It has been broken.
  • the rate of suffering from male breast cancer or prostate cancer increases.
  • Genetic testing has become important not only for hereditary cancers but also for cancers caused by somatic mutations. This is because it is necessary to identify a gene mutation in order to examine the effectiveness for a specific drug in advance by developing a molecular target drug. By identifying genetic mutations, it is possible not only to select the most effective medicine for the patient, but also to avoid the treatment with the risk of side effects in patients who cannot expect the therapeutic effect. it can.
  • the genetic test for detecting a specific mutation is generally performed by the Sanger sequencing method (dideoxy method).
  • the Sanger sequencing method is accurate and is the standard method for genetic testing, but requires a lot of time and effort.
  • BRCA1 and BRCA2 are large genes having lengths of 81.1 and 84.7 kb and exons of 24 and 27, respectively. Therefore, genetic testing requires a lot of time and effort.
  • the Sanger sequencing method has a problem that a large amount of sample DNA is required.
  • next generation sequencing NGS
  • NGS next generation sequencing
  • Sequence information can be obtained in a very short time and at a low cost (Non-Patent Document 6).
  • Non-Patent Document 6 a large number of clinical sample DNA sequences can be determined by exon analysis that efficiently analyzes the sequence of a specific region of the genome sequence.
  • Non-Patent Documents 7 to 14 In order to identify BRCA1 / 2 gene mutations, NGS is used in combination with a target enrichment system that selectively concentrates a specific region (Non-Patent Documents 7 to 14). According to the report of EMQN, it is reported that 19% of research institutions use NGS technology for BRCA genetic testing (Non-patent Document 5).
  • NGS has been reported to give results comparable to the conventional Sanger sequencing method.
  • an inexpensive and highly accurate technique that can be applied not only to a group suspected of having familial tumors but also to the general population has not been reported.
  • the present invention relates to the following gene mutation test method.
  • a library in which a different index sequence for each sample is added to a specimen is prepared, the prepared library is pooled, the pooled DNA sample is hybridized to a probe set, and the captured DNA library pool is PCR amplified.
  • a gene mutation test method that detects a gene mutation by performing a next-generation sequencing method.
  • the genetic test method according to (1), wherein the gene mutation to be detected is a familial tumor.
  • the genetic test method according to (2), wherein the familial tumor is hereditary breast cancer ovarian cancer syndrome or Lynch syndrome.
  • the gene testing method according to (1), wherein the mutation of the gene to be examined is a somatic mutation.
  • the method of the present invention is rapid, highly accurate, and can be performed with a low cost and a small amount of DNA sample, it can be applied not only to a population suspected of having familial tumors but also to a general population. it can. Further, in the method of the present invention, by detecting somatic mutation, a drug that can be expected to have a high effect upon treatment with a molecular target drug can be selected and provided to a patient.
  • the present invention provides a method for performing a rapid and highly accurate genetic test at a low price by performing a target sequence using a large number of clinical specimens.
  • Table 1 shows a list of familial tumors and their causative genes. Examining patients with possible hereditary diseases to determine the causative gene. In addition, by examining a gene of a family who has developed a hereditary disease, it is possible to detect a person who may have the disease at an early stage. Furthermore, if it is possible to examine the general population as well as those who have a family member who has developed a genetic disease, it is very beneficial because it leads to early detection. In particular, BRCA1 and BRCA2 having a high mutation prevalence can detect a person who may develop a tumor in the future and perform preventive intervention if genetic testing can be performed on the general population. . For example, if it is found that there is a high possibility of suffering from breast cancer or ovarian cancer in the future, measures such as increasing the frequency of screening can be taken in order to detect cancer early.
  • Example 1 Outline of genetic testing method This testing method is roughly divided into three steps: a DNA library preparation step, a hybridization step, and a sequencing step (FIG. 1).
  • a DNA library preparation step a DNA library preparation step
  • a hybridization step a hybridization step
  • a sequencing step a sequencing step
  • each process is implemented using various kits, you may implement using the method and kit which can perform the same reaction.
  • Each kit uses a modified protocol attached to the kit so as to meet the purpose of genetic testing, and does not use the method of the kit as it is.
  • DNA samples are prepared from blood samples.
  • DNA was extracted from blood using MagNA Pure Compact (manufactured by Roche) and used.
  • MagNA Pure Compact manufactured by Roche
  • a DNA sample may be prepared from a diseased site such as a tumor tissue.
  • DNA library preparation step (1) First, the extracted DNA is quantified. The DNA concentration was measured with a FilterMax F5 multimode plate reader (manufactured by Molecular Devices) using a Qubit dsDNA BR Assay Kit (manufactured by Thermo Fisher). The DNA sample is diluted with nuclease-free water to a final concentration of 20 ng / ⁇ l. (2) On the PCR plate, 20 ng DNA is fragmented by transposase using SureSelectQXT Library Prep Kit (manufactured by Agilent Technologies), and then an adapter is added. (3) The adapter-added DNA is purified using AMPure XP beads (manufactured by Beckman Coulter).
  • Step 1 68 ° C for 2 minutes
  • Step 2 98 ° C for 2 minutes
  • Step 3 98 ° C for 30 seconds
  • Step 4 57 ° C for 30 seconds
  • Step 5 72 ° C for 1 minute
  • Step 6 72 ° C for 5 minutes
  • Step 7 Maintained at 4 ° C. Repeat steps 3-5 7 times.
  • (5) Purify DNA in the same manner as in step (3).
  • (6) The DNA concentration is measured using Qubit dsDNA BR Assay Kit in the same manner as in (1) above, and an equal amount of each DNA sample is pooled in a new tube so that the final amount is 1 ⁇ g.
  • library adjustment is performed at once for up to 96 different objects, samples are pooled, and the following steps are performed.
  • the number of samples to be pooled does not need to be limited to 96, and the number of samples convenient for performing the reaction, such as 384 samples, can be used.
  • the DNA library preparation step shown in this example is devised so that the index tag addition step for personal identification can be performed simultaneously with the DNA library amplification step by PCR. As a result, a large number of samples can be simultaneously performed in the following hybridization step.
  • the DNA library preparation step takes 1 hour each for steps (1), (2), and (6), and 1.5 hours each for steps (3) to (5).
  • the DNA obtained by the post capture pool method is purified using Dynabeads M-270 Streptavidin (manufactured by Thermo Fisher Scientific).
  • the purified DNA was amplified by PCR using TS-PCR oligos 1 and 2 by KAPA HiFi HotStart Ready Mix (manufactured by Kapa Biosystems). The sequence of the oligo DNA and the PCR cycle are as follows.
  • Oligo 1 AATGATACCGGCGACCACCGAGA (SEQ ID NO: 1)
  • Oligo 2 CAAGCAGAAGACGGCATACGAG (SEQ ID NO: 2)
  • Step 1 98 ° C for 30 seconds
  • Step 2 98 ° C for 10 seconds
  • Step 3 60 ° C for 30 seconds
  • Step 4 72 ° C for 30 seconds
  • Step 5 72 ° C for 5 minutes
  • Step 6 Maintain at 4 ° C. Repeat steps 2-4 12-12 times.
  • PCR amplified DNA is purified by AMPure XP beads.
  • the hybridization step takes 21 hours for the step (1), 3 hours for the step (2), and 1.5 hours for the step (3).
  • the steps from the DNA library preparation step to the hybridization with the probe in the hybridization step (1) may be performed on the first day, and the hybridization steps (2) and (3) may be performed on the second day.
  • (III) Sequencing step (1) The DNA library amplified by PCR is diluted and made single-stranded with alkali. (2) Sequencing is performed using MiSeq Reagent Kit v3 (manufactured by Illumina). Step (1) takes 0.5 hour and step (2) takes 55 hours. Therefore, all the processes are completed in about 5 days.
  • this genetic testing method is performed by using a small amount of DNA of 20 ng by combining a library preparation method that can be performed with SureSelectQXT Library Kit and a target enrichment system by hybridization that can be performed with SeqCap EZ Choice System. By pooling a large number of samples called samples and performing hybridization, genetic testing can be performed without cost and labor.
  • Example 2 Results of using a sample obtained from a breast cancer patient A blood sample was obtained from 11 patients whose diagnosis was confirmed pathologically at Chiba University and informed consent was obtained. Used for inspection.
  • Example 3 BRCA1 / BRCA2 gene test in a general population BRCA1 / 2 gene test was performed in the same manner as in Example 2 on a general population of 373 Japanese patients who received medical examinations.
  • a genetic test can be performed for screening a general population by the method of the present invention, a person having a gene mutation can be detected from a population with no family history.
  • VUS it is currently determined as VUS, and it is possible to evaluate by continually monitoring and accumulating information on unknown mutations that are meaningful or unknown, and accumulating important genetic information. Will be able to.
  • Example 4 Application to breast cancer patients Next, in order to verify the usefulness of this method, the results of analyzing samples of 288 breast cancer patients are shown. Familial tumors that can be considered as the risk of developing breast cancer as shown in Table 1 by extracting DNA from the cancer tissue of a breast cancer patient whose pathological diagnosis has been confirmed and informed consent has been obtained at the first clinic attached to Chongqing Medical University in China A multi-gene panel test for the causative gene was performed. Probes were designed to hybridize and capture the protein coding region of 54 genes shown in Table 1 and exon junction 50 bp. The mutations detected in breast cancer patients are classified, and single nucleotide substitutions determined to be causative are shown in Table 4, and insertion / deletion mutations are shown in Table 5.
  • Multi-gene panel testing which tests for a large number of genes, not only accumulates information such as the discovery of new mutations, but also treats with molecular targeted drugs when there is a mutation in the gene where the molecular targeted drug exists Expected to be applied in actual clinical practice. Proper treatment for patients who are expected to have an effect is considered to become more and more important from the viewpoint of medical economy, but the method shown in this example is a high-accuracy and rapid examination method. Further, since the inspection can be performed at a low cost, it is a very useful inspection method.

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Abstract

作製したライブラリーをプールし、ハイブリダイゼーションによるターゲットエンリッチメントシステムを組み合わせ、さらに次世代シーケンシングにより遺伝子検査を行うことにより、迅速、高精度、かつ低価格の遺伝子検査方法を提供することができる。

Description

次世代シーケンサーを用いた迅速な遺伝子検査方法
　本発明は、生殖系列細胞、体細胞に生じた変異を検出する遺伝子検査技術に関する。
　遺伝子の変異が原因となって生じる疾患には種々のものが知られている。中でも、がんは特定の遺伝子の変異が発がんに関与することが知られている。がんは体細胞の変異が集積して発症するが、乳がん及び卵巣がんに関連するＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２のように、生殖系列に変異を保因しており、遺伝的に乳がん、卵巣がんを発症しやすい遺伝要因を有している者がいる。
　ＢＲＣＡ１あるいはＢＲＣＡ２遺伝子変異を生まれつき持つ遺伝性乳がん卵巣がん症候群（Ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ　ｂｒｅａｓｔ　ａｎｄ　ｏｖａｒｉａｎ　ｃａｎｃｅｒ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ）では、乳がんに罹患する生涯リスクは５６～８５％と言われている。乳がんも両側性乳がんの割合が４０～６５％、さらに、卵巣がんに罹患する生涯リスクは、ＢＲＣＡ１に変異を有する者では５０％以上、ＢＲＣＡ２に変異を有する者では２０％以上であると言われている。また、男性の場合も、ＢＲＣＡ１あるいはＢＲＣＡ２に変異を有すると男性乳がんや前立腺がんに罹患する割合が高くなることが知られている。
　ＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２に対する遺伝子検査によって、病因となりうる生殖系列変異保因者を早期に発見することは、予防的介入を可能にし、がんの発症率、死亡率を顕著に減少させることができる（非特許文献１～４）。また、ＢＲＣＡ１／２の変異に関する情報は、同じ変異を有している可能性のある他の家族にとっても重要な情報となる。そのため、ＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２に対する遺伝子検査は、乳がん、あるいは卵巣がんを罹患した女性、また、乳がん・卵巣がんの家族歴のある女性において、標準的な検査となってきている。さらに、最近では一般集団に対するＢＲＣＡ１／２変異の遺伝子検査も提唱されている。生殖系列変異保因者を早期発見することは、予防的介入を可能にすることから潜在的利益につながると考えられている。
　従来から、ＢＲＣＡ１／２遺伝子の変異を検出する遺伝子検査方法が開示されており、これらの方法により検査を行うことが可能である（特許文献１、２）。しかしながら、現在提供されている遺伝子検査は、非常に高額であることから、一般集団に遺伝子検査が普及するには至っていない。
　また、遺伝子検査は遺伝性のがんだけではなく、体細胞突然変異により発症したがんにおいても重要となってきている。分子標的薬の開発により、特定の医薬品に対する有効性を予め検討するためには、遺伝子変異を同定する必要があるからである。遺伝子変異を同定することにより、患者にとって最も有効な医薬を選択することができるだけではなく、治療効果を期待することができない患者に対して、副作用の危険性のある治療を行うことを避けることができる。
　特定の変異を検出する遺伝子検査は、一般的にサンガーシーケンス法（ジデオキシ法）によって行われている。例えば、Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｑｕａｌｉｔｙ　Ｎｅｔｗｏｒｋ（ＥＭＱＮ）の報告によれば、ＢＲＣＡ１／２の遺伝子検査の場合には、７５％がサンガーシーケンス法で行っている（非特許文献５）。サンガーシーケンス法は正確であり、遺伝子検査の標準的な方法であるものの、多くの時間と労力が必要とされる。特にＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２は、それぞれ長さが８１．１、８４．７ｋｂにわたり、２４、２７のエクソンが存在する大きな遺伝子である。そのため、遺伝子検査には、多くの時間と労力を必要とする。さらに、サンガーシーケンス法は、多量の試料ＤＮＡを必要とするという問題もある。
　次世代シーケンス法（ｎｅｘｔ　ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、ＮＧＳ、以下、次世代シーケンス法をＮＧＳと略記することがある。）と呼ばれる高速高精度のシーケンサーの開発により、従来のサンガーシーケンス法に比べて、膨大な塩基配列情報を非常に短時間、かつ低コストで得ることができるようになった（非特許文献６）。さらに、ゲノム配列のうちの特定の領域のシーケンスを効率的に解析するエクソン解析により、多数の臨床サンプルＤＮＡ配列を決定することができるようになった。
　ＢＲＣＡ１／２の遺伝子変異の同定にも、特定の領域を選択的に濃縮するターゲットエンリッチメントシステムとＮＧＳを組み合わせて検査が行われるようになってきた（非特許文献７～１４）。ＥＭＱＮの報告によれば、１９％の研究機関でＢＲＣＡの遺伝子検査にＮＧＳの技術を用いていることが報告されている（非特許文献５）。
特表２００２－５０２２２７号公報 特表平１０－５０５７４２号公報
Hartmann, L.C. et al., 1999, N. Engl. J. Med., Vol.340, pp.77-84. Meijers-Heijboer, H. et al., 2001, N. Engl. J. Med., Vol.345,pp.159-164. Rebbeck, T.R. et al., 2004, J. Clin. Oncol., Vol.22, pp.1055-1062. Domcheck, S.M. et al., 2010, JAMA., Vol.304, pp.967-975. Wallace, A.J., 2016, Eur. J. Hum. Genet. Suppl 1, S10-8. Goodwin, S. et al., 2016, Nat. Rev. Genet., Vol.17. pp.333-351. Walsh, T. et al., 2010, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., Vol.107,pp.12629-12633. Bosdet, I.E. et al., 2013, J. Mol. Diagn., Vol.15, pp.769-809. Chong, H.K. et al., 2014, PLoS One, Vol.9, e97408. Castera, L. et al., 2014, Eur. J. Hum. Genet., Vol.22, pp.1305-1313. Judkins, T. et al., 2015, BMC Cancer, Vol.15, 215., doi:10.1186/s12885-015-1224-y Strom, C.M. et al., 2015, PLoS One, Vol.10, e0136419. Lincoln, S.E. et al., 2015, J. Mol. Diagn., Vol.17, pp.533-544. Kang, H. et al., 2016, PeerJ., Vol.4, e2162. Smith, T.M. et al., 1996, Genome Res., Vol.6, pp.1029-1049.
　ＮＧＳは、従来のサンガーシーケンス法と遜色ない結果が得られることが報告されている。しかしながら、家族性腫瘍が疑われる集団だけではなく一般集団にも適用できるような安価で高精度な技術は報告されていない。
　本発明は、ターゲットエンリッチメントシステムとＮＧＳを組み合わせ、ＢＲＣＡ１やＢＲＣＡ２をはじめとする家族性腫瘍の原因遺伝子の変異や、体細胞遺伝子変異の検出を行うための新しい検査方法を提供することを課題とする。
　本発明は、以下の遺伝子変異検査方法に関する。
（１）試料ごとに異なるインデックス配列を検体に付加したライブラリーを作製し、作製したライブラリーをプールし、プールしたＤＮＡ試料をプローブセットにハイブリダイゼーションさせ、キャプチャーしたＤＮＡライブラリープールをＰＣＲ増幅し、次世代シーケンス法を行うことにより遺伝子変異を検出する遺伝子変異検査方法。
（２）検出する遺伝子の変異が家族性腫瘍であることを特徴とする（１）記載の遺伝子検査方法。
（３）前記家族性腫瘍が、遺伝性乳がん卵巣がん症候群、又はリンチ症候群であることを特徴とする（２）記載の遺伝子検査方法。
（４）検査する遺伝子の変異が体細胞変異であることを特徴とする（１）記載の遺伝子検査方法。
　本発明の方法は、迅速であり、高精度であるとともに、低価格かつ少量のＤＮＡ試料で実施することができることから、家族性腫瘍が疑われる集団だけではなく、一般集団にも適用することができる。また、本発明の方法において、体細胞変異を検出することにより、分子標的薬による治療に際して高い効果が期待できる医薬を選択して患者に提供することができる。
遺伝子検査の工程を示す図。 ＢＲＣＡ１／２のプローブの位置を示す図。
　本発明は多数臨床検体を用いてターゲットシーケンスを行うことにより、低価格でありながら、迅速、高精度の遺伝子検査を行う方法を提供する。
　表１に家族性腫瘍とその原因遺伝子のリストを示す。遺伝性疾患の可能性のある患者の検査を行い、原因遺伝子を調べることができる。また、遺伝性疾患を発症した家族の遺伝子を検査することにより、早期に疾患に罹患する可能性のある者を検出することができる。さらに、遺伝性疾患を発症した家族がいる者だけではなく、一般集団を検査することができれば、早期発見につながることから非常に有益である。特に、変異の保有率の高いＢＲＣＡ１やＢＲＣＡ２は、一般集団を対象として遺伝子検査を行うことができれば、将来腫瘍を発症する可能性のある人を早期に検出し、予防的介入を行うことができる。例えば、乳がん、卵巣がんに将来罹患する可能性が高いことが分かった場合には、早期にがんを発見するために、検診の頻度を高くするなどの対策を立てることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　検査の対象となる表１に示す家族性疾患と遺伝子は今後研究により増加する可能性がある。また、体細胞遺伝子変異は、分子標的薬の増加とともに、治療に先立って遺伝子変異の検査を行う必要性が高まることから適用範囲が広がるものと考えられる。
　以下、母集団における遺伝子変異の頻度の高いＢＲＣＡ１／２の変異の検出を例に詳細に説明するが、これに限らずあらゆる遺伝子変異の検出に用いることができる。
　［実施例１］遺伝子検査方法の概要
　本検査方法は大きく分けてＤＮＡライブラリー調整工程、ハイブリダイゼーション工程、シーケンス工程の３工程からなっている（図１）。以下、種々のキットを利用して各工程を実施しているが、同様の反応を行うことのできる方法やキットを用いて実施してもよい。各キットは、遺伝子検査の目的に合うように、キットに添付されているプロトコルを修正して用いており、キットの方法をそのまま用いているわけではない。
　ＢＲＣＡ１／２などの生殖系列の変異を検出する場合には、血液サンプルからＤＮＡサンプル調整する。ここでは、ＭａｇＮＡ　Ｐｕｒｅ　Ｃｏｍｐａｃｔ（ロシュ社製）を用いて血液からＤＮＡを抽出して用いた。なお、体細胞変異を検出する場合には腫瘍組織などの疾患部位からＤＮＡサンプル調整すればよい。
（Ｉ）ＤＮＡライブラリー調整工程
（１）まず、抽出したＤＮＡを定量する。ＤＮＡ濃度は、Ｑｕｂｉｔ　ｄｓＤＮＡ　ＢＲ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ（サーモフィッシャー社製）を用い、ＦｉｌｔｅｒＭａｘ　Ｆ５マルチモードプレートリーダー（モレキュラーデバイス社製）によって測定した。ＤＮＡサンプルは終濃度が２０ｎｇ／μｌになるようにヌクレアーゼフリー水で希釈する。
（２）ＰＣＲプレート上で、２０ｎｇＤＮＡに、ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔＱＸＴ　Ｌｉｂｒａｒｙ　Ｐｒｅｐ　Ｋｉｔ（アジレント・テクノロジー社製）を用いてトランスポゼースによりＤＮＡを断片化した後、アダプターを付加する。
（３）アダプターが付加されたＤＮＡをＡＭＰｕｒｅ　ＸＰ　ビーズ（ベックマン　コールター社製）を用いて精製する。
（４）Ｐ７、Ｐ５　ｄｕａｌ　ｉｎｄｅｘ　ｐｒｉｍｅｒを用いて、以下のＰＣＲ反応により、インデックスタグを付加する。ステップ１：６８℃２分、ステップ２：９８℃２分、ステップ３：９８℃３０秒、ステップ４：５７℃３０秒、ステップ５：７２℃１分、ステップ６：７２℃５分、ステップ７：４℃で維持。ステップ３～５を７回繰り返す。
（５）工程（３）と同様にしてＤＮＡを精製する。
（６）ＤＮＡ濃度を上記（１）と同様に、Ｑｕｂｉｔ　ｄｓＤＮＡ　ＢＲ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔを用いて測定し、それぞれ等量のＤＮＡサンプルを最終的に１μｇになるように新しいチューブにプールする。ここでは、９６検体までの異なる対象について１度にライブラリー調整を行い、試料をプールして以下の工程を行っている。プールする試料は９６検体までである必要はなく、３８４検体等、反応を行うのに都合のよい検体数とすることができる。
　本実施例で示すＤＮＡライブラリー調整工程は、個人識別のためのインデックスタグ付加の工程をＰＣＲによるＤＮＡライブラリー増幅工程と同時に行えるように工夫している。その結果、以下のハイブリダイゼーション工程において、多数サンプルを同時に行うことができる。ＤＮＡライブラリー調整工程は、工程（１）、（２）、（６）が各１時間、工程（３）～（５）が各１．５時間を要する。
（ＩＩ）ハイブリダイゼーション工程
（１）ＳｅｑＣａｐ　ＥＺ　ｃｈｏｉｃｅ　ｓｙｓｔｅｍ（ロシュ　ダイアグノスティクス社製）を用いて、上記ＤＮＡライブラリー調整工程においてプールされたＤＮＡサンプルとプローブをハイブリダイズする。
　このとき、プールされたＤＮＡライブラリーには、インデックス、及びアダプターが付加されている。そのため、インデックス付加アダプター配列同士が反応してしまい、非特異的なキャプチャーにより、標的領域の抽出効率が低下する可能性がある。そこで、ヒトゲノム中に存在する反復配列に起因する非特異的なハイブリダイゼーションを抑制するためのＣＯＴヒトＤＮＡに加え、インデックス付加アダプター配列の反応を抑制するために、インデックス配列に対応したブロックオリゴを合成し過剰量添加している。
（２）ポストキャプチャー・プール法により得られたＤＮＡをＤｙｎａｂｅａｄｓ　Ｍ－２７０　ストレプトアビジン（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用いて精製する。
（３）精製後のＤＮＡをＴＳ-ＰＣＲ　オリゴ１、２を用い、ＫＡＰＡ　ＨｉＦｉ　ＨｏｔＳｔａｒｔ　Ｒｅａｄｙ　Ｍｉｘ（カパ　バイオシステムズ社製）によってＰＣＲ増幅した。オリゴＤＮＡの配列、ＰＣＲサイクルは以下のとおりである。
オリゴ１：ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡ（配列番号１）
オリゴ２：ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧ（配列番号２）
　ステップ１：９８℃３０秒、ステップ２：９８℃１０秒、ステップ３：６０℃３０秒、ステップ４：７２℃３０秒、ステップ５：７２℃５分、ステップ６：４℃で維持。ステップ２～４を１２～１８回繰り返す。
　ＰＣＲ増幅したＤＮＡは、ＡＭＰｕｒｅ　ＸＰ　ビーズにより精製する。
　ハイブリダイゼーション工程は、工程（１）に２１時間、工程（２）に３時間、工程（３）に１．５時間を要する。ＤＮＡライブラリー調整工程からハイブリダイゼーション工程（１）のプローブとのハイブリダイゼーションまでを１日目に行えばよく、ハイブリダイゼーション工程（２）、（３）は２日目に行えばよい。
（ＩＩＩ）シーケンス工程
（１）ＰＣＲ増幅したＤＮＡライブラリーを希釈し、アルカリにより一本鎖にする。
（２）ＭｉＳｅｑ　Ｒｅａｇｅｎｔ　Ｋｉｔ　ｖ３（イルミナ社製）によってシーケンシングを行う。
　工程（１）は０．５時間、工程（２）は５５時間を要する。したがって、すべての工程は５日程度で終了する。
　この遺伝子検査方法は、例えば、ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔＱＸＴ　Ｌｉｂｒａｒｙ　Ｋｉｔで行うことができるライブラリー作製方法とＳｅｑＣａｐ　ＥＺ　Ｃｈｏｉｃｅ　Ｓｙｓｔｅｍで行うことができるハイブリダイゼーションによるターゲットエンリッチメントシステムを組み合わせることによって２０ｎｇという少量のＤＮＡを用いて９６サンプルという多数の試料をプールしてハイブリダイゼーションを行うことにより、費用と労力をかけずに遺伝子検査を行うことができる。
　［実施例２］乳がん患者から得られた試料を用いた結果
　千葉大学において病理学的に診断が確定し、インフォームドコンセントが得られた患者１１名から、血液試料を得てＢＲＣＡ１／２遺伝子の検査に用いた。
　プローブとしては、ＵＣＳＣ　Ｇｅｎｅｓ　Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎに基づいて、ＢＲＣＡ１／２の転写産物を包含する合計２３０ｋｂの領域とこれら遺伝子に隣接する５ｋｂの領域を選択した。また、ＢＲＣＡ１のイントロン領域の約４１．５％はＡｌｕ配列からなることが報告されていることから（非特許文献１５）、意味のない変異の検出を避けるために、これらの反復配列の領域を除いてプローブデザインを行った（図２）。
　実施例１に記載の方法で、乳がん患者１１名から得た試料を用いて遺伝子解析を行い、標準的な臨床検査（サンガーシーケンス法）によってすでに得られている遺伝子変異との比較を行った。
　すでに得られていた検査結果によれば、１１名の患者のうち８名で、９つの明らかな遺伝子変異が認められていた。ＢＲＣＡ１における２つのナンセンス変異（ｃ．Ｔ１８８Ａ［ｐ．Ｌ６３Ｘ］、ｃ．Ｃ３６０７Ｔ［ｐ．Ｒ１２０３Ｘ］）、ＢＲＣＡ１におけるフレームシフト（ｃ．６６ｄｕｐＡ［ｐ．Ｅ２３ｆｓ］）、ＢＲＣＡ２におけるフレームシフト（ｃ．６５９７＿６５９８ｄｅｌ［ｐ．Ｔ２１９９ｆｓ］）は病因として報告されていた。また、ＢＲＣＡ１のスプライス部位の変異（ｃ．４４８５－２Ａ＞Ｇ）が、病因の可能性があると報告されていた。さらに、ＢＲＣＡ１に２つ（ｃ．Ｃ６２６Ｔ［ｐ．Ｐ２０９Ｌ］、ｃ．Ａ２７２６Ｔ［ｐ．Ｎ９０９Ｉ］）、ＢＲＣＡ２に２つ（ｃ．Ａ３３９５Ｇ［ｐ．Ｋ１１３２Ｒ］、ｃ．Ｔ３４２０Ａ［ｐ．Ｓ１１４０Ｒ］）の合計４つのミスセンス変異体が重要性不明の変異体（ｖａｒｉａｎｔｓ　ｕｎｃｅｒｔａｉｎ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ、ＶＵＳ）として報告されていた（表２）。実施例１に記載の方法を用いて得られた結果は、完全に標準的な遺伝子検査方法により得られた結果と一致していた。この結果は、本発明の検査方法が正確な検査を行うことができることを裏付ける結果である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
［実施例３］一般集団でのＢＲＣＡ１／ＢＲＣＡ２遺伝子検査
　健康診断のために受診した３７３名の日本人の一般集団について、実施例２と同様の方法によりＢＲＣＡ１／２の遺伝子検査を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　３７３名から得られたＢＲＣＡ１、及びＢＲＣＡ２の遺伝子配列において、７６の変異がエクソン中に検出された。２７の変異は同義置換であり、１６の変異は、機能的な重要性及び東アジア集団で１％以上の変異が認められていることから無害な変異であると考えられる。
　病因となり得る変異として、ＢＲＣＡ２にナンセンス変異（ｃ．Ａ６９２２Ｔ［ｐ．Ｋ２０３８Ｘ］）、及びフレームシフトによる欠失変異（ｃ．３５７１ｄｅｌＡ［ｐ．Ｋ１１９１ｆｓ］）を検出した（表３）。これらの病因となり得る変異ついてはサンガーシーケンス法によっても確認を行った結果、本発明の方法と同一の結果が得られた。
　さらに、重要性が不明の変異体としてフレームシフトを伴わない欠失変異をＢＲＣＡ２で検出した（ｃ．９１０６＿９１０８ｄｅｌ［ｐ．３０３６＿３０３６ｄｅｌ］）。
　以上の結果から、ＢＲＣＡ１、あるいはＢＲＣＡ２の生殖系列に有害な遺伝子変異を有する割合は０．５４％と推定された（９５％信頼区間は０．０６５～１．９％）。有害な遺伝子変異が一般集団にも検出されたことは、ＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２の遺伝子変異のスクリーニング検査を行うことの重要性を示している。ＢＲＣＡ１、あるいはＢＲＣＡ２の変異を検出することにより、乳がん、卵巣がんの早期発見、予防につなげることができる。
　上記実施例２及び３の結果は、ハイブリダイゼーションをベースとしている本発明の方法が、サンガーシーケンス法と並ぶ高い精度を備えていることを示している。ＰＣＲをベースとしている遺伝子検査方法では、父方、母方から由来するアリールを同等に増幅できない場合もあるため、精度が低くなる傾向がある。しかし、本発明のようにハイブリダイゼーションをベースとする方法では、そのような心配をする必要がない。
　本発明の方法により、一般集団のスクリーニングにも遺伝子検査を行うことができるようになれば、家族歴のない集団から遺伝子変異を有する者を検出できる。さらに、現在のところＶＵＳとして判定され、意味のある変異かどうか不明の変異についても継続的にモニタリングを行い、情報を蓄積することによって評価することが可能となり、重要な遺伝子情報の蓄積を行うことができるようになる。
　［実施例４］乳がん患者への適用
　次に、本法の有用性を検証するために、乳がん患者２８８名の試料を解析した結果を示す。中国の重慶医科大学付属第一医院において病理学的に診断が確定し、インフォームドコンセントが得られた乳がん患者のがん組織からＤＮＡを抽出し、表１に示す乳がん発症リスクとなりうる家族性腫瘍原因遺伝子を対象とした多遺伝子パネル検査を実施した。表１に示す５４遺伝子のタンパク質コーディング領域およびエクソン・ジャンクション５０ｂｐをハイブリダイゼーション・キャプチャするためのプローブを設計した。乳がん患者において検出された変異を分類し、病因になりうると判断された一塩基置換を表４に、挿入・欠失変異を表５に示す。２８８例中、４２例（１４．６％）の乳癌患者において病因となる変異を同定することができた。ＢＲＣＡ１／２変異を有する患者が最も多いものの、２３例（８．０％）を説明するに過ぎず、多遺伝子パネル検査でより多くの遺伝子を同時解析する有用性が分かる。表４、及び表５において、Ｅｘｏｍｅ　Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ　Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ（ＥｘＡＣ）が解析を行った東アジア人における遺伝子変異の頻度情報を併せて示しているが、これらの変異は病因変異であることから一般的な東アジア人ではほとんど保有していない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　多数の遺伝子について検査を行う多遺伝子パネル検査は、新たな変異の発見といった情報の蓄積だけではなく、分子標的薬が存在する遺伝子に変異が生じている場合には分子標的薬で治療を行うなど、実臨床での応用が期待される。効果が期待できる患者に適切な治療を行うことは、医療経済の観点からも今後益々重要になると考えられるが、本実施例で示した方法であれば、高精度、迅速な検査方法であり、かつ安価に検査を行うことができることから、非常に有用な検査方法となる。

Claims (4)

  1. 　試料ごとに異なるインデックス配列を検体に付加したライブラリーを作製し、
    　作製したライブラリーをプールし、
    　プールしたＤＮＡ試料をプローブセットにハイブリダイゼーションさせ、
    　キャプチャーしたＤＮＡライブラリープールをＰＣＲ増幅し、
    　次世代シーケンス法を行うことにより遺伝子変異を検出する遺伝子変異検査方法。
  2. 　検出する遺伝子の変異が
    　家族性腫瘍であることを特徴とする請求項１記載の遺伝子検査方法。
  3. 　前記家族性腫瘍が、遺伝性乳がん卵巣がん症候群、又はリンチ症候群であることを特徴とする請求項２記載の遺伝子検査方法。
  4. 　検査する遺伝子の変異が
    　体細胞変異であることを特徴とする請求項１記載の遺伝子検査方法。
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