CN118743712A - 一种刺梨多糖在制备抗肾纤维化的药物中的应用 - Google Patents
一种刺梨多糖在制备抗肾纤维化的药物中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN118743712A CN118743712A CN202410864518.3A CN202410864518A CN118743712A CN 118743712 A CN118743712 A CN 118743712A CN 202410864518 A CN202410864518 A CN 202410864518A CN 118743712 A CN118743712 A CN 118743712A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- polysaccharide
- roxburghii
- appropriate amount
- clp2
- use according
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 title claims abstract description 57
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 title claims abstract description 57
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 title claims abstract description 57
- 201000002793 renal fibrosis Diseases 0.000 title claims abstract description 23
- 239000003814 drug Substances 0.000 title claims abstract description 18
- 208000020832 chronic kidney disease Diseases 0.000 claims abstract description 16
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims abstract description 13
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 21
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 12
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 11
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 10
- 240000002547 Rosa roxburghii Species 0.000 claims description 9
- 235000000640 Rosa roxburghii Nutrition 0.000 claims description 9
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 9
- -1 DEAE cellulose anion Chemical class 0.000 claims description 7
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 claims description 7
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 7
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 6
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 6
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims description 6
- OQUKIQWCVTZJAF-UHFFFAOYSA-N phenol;sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O.OC1=CC=CC=C1 OQUKIQWCVTZJAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 6
- 101001089083 Daboia russelii C-type lectin domain-containing protein 2 Proteins 0.000 claims description 5
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 claims description 5
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 claims description 5
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims description 5
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 4
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 claims description 4
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 4
- 208000017169 kidney disease Diseases 0.000 claims description 4
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 4
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 claims description 3
- 239000002775 capsule Substances 0.000 claims description 3
- 238000010612 desalination reaction Methods 0.000 claims description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 3
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 claims description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 3
- 229940055729 papain Drugs 0.000 claims description 3
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 2
- 238000011033 desalting Methods 0.000 claims description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 2
- 239000003826 tablet Substances 0.000 claims description 2
- 230000003907 kidney function Effects 0.000 abstract description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 230000006378 damage Effects 0.000 abstract description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 20
- DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N creatinine Chemical compound CN1CC(=O)NC1=N DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 17
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 13
- PNNCWTXUWKENPE-UHFFFAOYSA-N [N].NC(N)=O Chemical compound [N].NC(N)=O PNNCWTXUWKENPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 229940109239 creatinine Drugs 0.000 description 9
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 9
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 8
- 102000000905 Cadherin Human genes 0.000 description 7
- 108050007957 Cadherin Proteins 0.000 description 7
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 6
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 6
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 6
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- AEMOLEFTQBMNLQ-YMDCURPLSA-N D-galactopyranuronic acid Chemical compound OC1O[C@H](C(O)=O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-YMDCURPLSA-N 0.000 description 4
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 4
- IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N Galacturonsaeure Natural products O=CC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010061481 Renal injury Diseases 0.000 description 4
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 4
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 4
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 description 4
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 210000005084 renal tissue Anatomy 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 3
- 102100034459 Hepatitis A virus cellular receptor 1 Human genes 0.000 description 3
- 101001068136 Homo sapiens Hepatitis A virus cellular receptor 1 Proteins 0.000 description 3
- 101000702691 Homo sapiens Zinc finger protein SNAI1 Proteins 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 102100030917 Zinc finger protein SNAI1 Human genes 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 3
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 3
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010011985 Decubitus ulcer Diseases 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000294611 Punica granatum Species 0.000 description 2
- 235000014360 Punica granatum Nutrition 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 2
- 230000007705 epithelial mesenchymal transition Effects 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- 108020004463 18S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical group [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 1
- 101710088172 HTH-type transcriptional regulator RipA Proteins 0.000 description 1
- 101001121408 Homo sapiens L-amino-acid oxidase Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 102100026388 L-amino-acid oxidase Human genes 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 235000004789 Rosa xanthina Nutrition 0.000 description 1
- 241000220222 Rosaceae Species 0.000 description 1
- CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N SYBR Green I Chemical compound CN(C)CCCN(CCC)C1=CC(C=C2N(C3=CC=CC=C3S2)C)=C2C=CC=CC2=[N+]1C1=CC=CC=C1 CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100012902 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) FIG2 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000019197 Superoxide Dismutase Human genes 0.000 description 1
- 108010012715 Superoxide dismutase Proteins 0.000 description 1
- 239000006180 TBST buffer Substances 0.000 description 1
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001460 carbon-13 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 208000028208 end stage renal disease Diseases 0.000 description 1
- 201000000523 end stage renal failure Diseases 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 238000005570 heteronuclear single quantum coherence Methods 0.000 description 1
- 238000000990 heteronuclear single quantum coherence spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000004192 high performance gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 1
- 238000002329 infrared spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002398 materia medica Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 238000001543 one-way ANOVA Methods 0.000 description 1
- 210000004279 orbit Anatomy 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 206010033675 panniculitis Diseases 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 150000002989 phenols Chemical class 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 230000002980 postoperative effect Effects 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- 238000003762 quantitative reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 1
- 210000002254 renal artery Anatomy 0.000 description 1
- 230000008458 response to injury Effects 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 235000019614 sour taste Nutrition 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 1
- 210000004304 subcutaneous tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 210000004926 tubular epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
- A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
- A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
- A61K36/73—Rosaceae (Rose family), e.g. strawberry, chokeberry, blackberry, pear or firethorn
- A61K36/738—Rosa (rose)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/0006—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid
- C08B37/0045—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid alpha-D-Galacturonans, e.g. methyl ester of (alpha-1,4)-linked D-galacturonic acid units, i.e. pectin, or hydrolysis product of methyl ester of alpha-1,4-linked D-galacturonic acid units, i.e. pectinic acid; Derivatives thereof
- C08B37/0048—Processes of extraction from organic materials
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Alternative & Traditional Medicine (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Botany (AREA)
- Medical Informatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
Abstract
本发明公开了一种刺梨多糖在制备抗肾纤维化的药物中的应用。实验结果表明，本发明中的刺梨多糖具有抗肾纤维化、改善肾损伤的作用，可以有效改善慢性肾脏病的肾脏功能。因此，本发明中的刺梨多糖具有制备成抗肾纤维化、治疗慢性肾脏病的药物的前景。
Description
技术领域
本发明属于医药领域，具体涉及一种刺梨多糖在制备抗肾纤维化的药物中的应用。
背景技术
肾纤维化是所有进展期慢性肾脏病(chronic kidney disease，CKD)的共有病理特征，以细胞外基质过度沉积导致的肾组织结构改建及肾功能丧失为主要表现，预示肾损伤反应进入了以组织结构重塑和器官功能丧失为标志的共同终末通路。目前，临床上尚缺乏针对肾纤维化有效的治疗药物，导致大量肾纤维化患者不可避免地发展为终末期肾病。
刺梨是是蔷薇科植物，是一种广泛分布于中国西南和中南部山区的珍贵植物，其果实被称为刺梨。早在1640年明朝田文撰写的《贵州志》中就有记载刺梨，其果实类似石榴，但是要比石榴小。《本草纲目补编》中描述它为一种可食用的野果，味道略微酸涩，可以帮助消化。不仅如此，刺梨的其他部位，例如花、叶、根、籽均可入药以治疗多种疾病。刺梨果实富含多种营养成分，包括多糖、抗坏血酸、酚类和超氧化物歧化酶。
多糖是由糖苷键结合的糖链，超过10个单糖组成的聚合糖髙分子碳水化合物，结构复杂，种类繁多。目前已发现的活性多糖有几百种，按其来源不同，可分为植物多糖、真菌多糖、藻类多糖、动物多糖和细菌多糖五大类。
发明人从刺梨中分离得到一种多糖(专利申请号：202410729810.4)，代号为CLP2-2，经鉴定其为一种均聚半乳糖醛酸，结构式为[→4)α-GalAp-(1→]n，相对分子质量为78.6kDa。
发明人发现刺梨多糖CLP2-2具有多种生物活性，特提出本发明创造。
发明内容
本发明的目的在于提供一种刺梨多糖在制备抗肾纤维化的药物中的应用。
本发明上述目的通过如下技术方案实现：
一种刺梨多糖在制备治疗伴随肾纤维化的肾脏疾病的药物中的应用，所述刺梨多糖的制备方法包括以下步骤：
步骤S1，多糖提取：将新鲜成熟的刺梨果实去籽冲洗干净，粉碎风干，有机溶剂脱脂，得到脱脂粉末；取脱脂粉末，加入适量水，调节溶液pH至弱酸性，加入适量木瓜蛋白酶，在50～70℃条件下搅拌提取适当时间，灭酶；冷却后再调节溶液pH至弱碱性，加入适量胰蛋白酶，在30～45℃条件下搅拌提取适当时间，灭酶；冷却后离心取上清，透析脱盐，冷冻干燥，得酶提刺梨粗多糖；
步骤S2，多糖纯化：取适量酶提刺梨粗多糖，加适量水溶解，离心除去不溶物，上清液通过DEAE纤维素阴离子柱分离，依次以水、0.1M NaCl溶液和0.2M NaCl溶液洗脱，硫酸-苯酚检测，收取合并0.2M NaCl洗脱液，透析脱盐，冷冻干燥，得刺梨多糖CLP2；取适量刺梨多糖CLP2加入适量水溶解，通过Bio-Gel P-6Gel凝胶色谱柱纯化，以水进行洗脱，硫酸-苯酚法绘制洗脱曲线，将洗脱曲线主峰对应的洗脱液合并，冷冻干燥，即得。
进一步地，所述伴随肾纤维化的肾脏疾病为慢性肾脏病。
进一步地，步骤S1中所述有机溶剂为无水乙醇。
进一步地，步骤S2中所述DEAE纤维素阴离子柱为Cl-型DEAE纤维素阴离子柱。
进一步地，所述药物以所述刺梨多糖为活性成分，用药学上可以接受的载体或辅料，制成药学上可以接受的剂型。
更进一步地，所述载体或辅料为固体、液体或半固体。
更进一步地，所述剂型包括片剂、胶囊和注射剂。
有益效果：
实验结果表明，本发明中的刺梨多糖具有抗肾纤维化、改善肾损伤的作用，可以有效改善慢性肾脏病的肾脏功能。因此，本发明中的刺梨多糖具有制备成抗肾纤维化、治疗慢性肾脏病的药物的前景。
附图说明
图1为刺梨多糖CLP2-2的IR图；
图2为刺梨多糖CLP2-2的13C NMR图(A)和HSQC图(B)；
图3为各组HK-2细胞中标志基因表达水平；
图4为各组HK-2细胞中E-cadherin蛋白表达水平；
图5为各组小鼠血清中尿素氮和肌酐水平测定结果。
具体实施方式
下面结合实施例具体介绍本发明实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。
实施例1：刺梨多糖CLP2-2的制备
步骤S1，多糖提取：将新鲜成熟的刺梨果实去籽冲洗干净，粉碎风干，过100目筛后加入10倍体积(1g:10mL)无水乙醇，70℃水浴条件下热回流脱脂3h，弃去溶剂，粉末重复脱脂一次；将脱脂后的粉末干燥，得到脱脂粉末。取25g脱脂粉末加入30倍体积(1g:30mL)的去离子水，搅拌，用盐酸溶液调节溶液pH＝6，然后加入脱脂粉末质量2.5％的木瓜蛋白酶(10U/mg)，在60℃的条件下搅拌提取12h后，将溶液在100℃的条件下灭酶15min。冷却后再用氢氧化钠溶液调节pH＝8，加入脱脂粉末质量为2.5％的胰蛋白酶(≥250N.F.U/g)，在37℃的条件下搅拌提取12h后，将溶液在100℃的条件下灭酶15min，冷却，离心取上清，浓缩，透析脱盐，再浓缩，浓缩液冷冻干燥，得酶提刺梨粗多糖3.31g。
步骤S2，多糖纯化：取制备的酶提刺梨粗多糖1g，加30mL去离子水溶解，离心除去不溶物，上清液通过DEAE纤维素阴离子柱(Cl-型)进行初步分离，依次以蒸馏水、0.1MNaCl溶液和0.2MNaCl溶液洗脱，硫酸-苯酚检测，收取合并0.2MNaCl洗脱液，浓缩，透析脱盐，冷冻干燥，得刺梨多糖CLP2125mg。取100mg刺梨多糖CLP2加入2mL去离子水溶解并离心，上清液过混合纤维素膜后，通过Bio-GelP-6Gel凝胶色谱柱进行纯化，以去离子水进行洗脱，流速为0.3mL/min，硫酸-苯酚法绘制洗脱曲线，将洗脱曲线主峰对应的洗脱液合并(洗脱曲线只有一个主峰)，浓缩，重复纯化两次，浓缩干燥，得到多糖组分CLP2-2。
多糖CLP2-2的结构解析：经HPGPC分析表明，CLP2-2的分子量为78.6kDa。单糖组成分析表明，CLP2-2主要含半乳糖醛酸(83.5％)。红外图谱显示，3279cm-1为O-H伸缩振动吸收峰，1000-1400cm-1附近为C-O和糖环振动信号，1597cm-1处有明显吸收峰，表明该刺梨多糖含有糖醛酸(图1)。
13CNMR谱和HSQC谱显示，δ98.95端基碳信号为半乳糖醛酸C1信号且表明为α构型，而δ77.86表明半乳糖醛酸的C4位发生取代，δ175.29是C6位的糖醛酸取代的信号(图2)，并且对CLP2-2的C/H氢信号进行归属，结果如表1所示：
表1CLP2-2核磁信号归属
综合单糖组成、红外及核磁数据表明该刺梨多糖CLP2-2为均聚半乳糖醛酸，结构为：[→4)α-GalAp-(1→]n。
实施例2：刺梨多糖CLP2-2的抗肾纤维化活性
一、试验材料
1、仪器和试剂
仪器：超净台、离心机(Thermo)、细胞孵育箱、电泳槽(Biotek)、Nano-100微量分光光度计、梯度PCR仪、全自动荧光定量PCR仪等。
试剂：DMEM/F12培养基(南京凯基生物有限公司)、巴西胎牛血清、胰酶消化液(Gibco)、CLP2-2按实施例1方法制备(纯度>98％)、引物合成购自生工生物工程有限公司、血清尿素氮生化试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)、血清肌酐生化试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司)。
2、细胞和动物
人肾近曲小管上皮细胞(HK-2)来源于中国科学院细胞库。
C57雄性小鼠购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司。
二、试验方法
1、细胞培养、分组、造模和给药
将HK-2细胞培养于含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基中，每2天换液一次，细胞长满后用胰酶消化传代。将传代的细胞按1×105/孔接种到6孔板中，分为对照组(Ctrl)、模型组(TGFβ)和给药组(CLP2-2)。待细胞生长融合至约70％，模型组(TGFβ)更换为含有10ng/mlTGFβ的培养基，给药组(CLP2-2)更换为含有10ng/ml TGFβ和25μg/ml或100μg/ml多糖CLP2-2的培养基，对照组(Ctrl)更换为新鲜的不添加TGFβ也不添加多糖CLP2-2的培养基，继续培养24h。
2、PCR检测细胞中标志基因变化
PCR实验检测HK-2细胞纤维化表型变化，纤维化代表性变化是上皮间充质转化相关基因改变。将各组细胞弃去培养基，PBS洗2遍，每孔加入1ml Trizol，多次吹打细胞使其完全脱落。加入200μl氯仿，上下颠倒30秒，室温静置5分钟，12000rpm，离心15分钟，取500μl上层溶液，置于新Ep管中，并加入等体积的异丙醇，上下颠倒混匀，4℃静置2-3小时。4℃，12000rpm，离心10分钟，小心吸取上清，注意不可碰及底物RNA沉淀，加入1ml预冷的75％乙醇，轻轻弹起底物RNA沉淀，洗涤RNA。4℃，12000rpm，离心10分钟，再次弃去上清，室温倒扣Ep管，自然风干5分钟，加入适量DEPC水，溶解RNA。吸取1μl溶解的RNA，使用Nano-100微量分光光度计测量RNA的浓度和纯度。按照逆转录试剂盒要求设置逆转录程序，配置逆转录体系，合成cDNA。合成的cDNA放-20℃保存。
利用NCBI网站的Gene栏目设计引物，引物序列如下：
按照试剂说明书中推荐的反应比例，配置反应体系：每孔SYBR Green I Master 5μl，Primer1μl，cDNA 1μl，DEPC水1μl。配置完成后将该体系加入PCR板中，进行RT-qPCR反应，数据采用Threshold cycle(Ct)法进行定量，其中以18s为内参，目的基因的表达量依据公式2-[(Ct of gene)-(Ct of 18S rRNA)]来计算。
3、Westernblot观察细胞中蛋白水平变化
Western blotting实验检测E-cadherin蛋白表达水平的变化。将各组细胞弃去培养基，用PBS清洗细胞2次，用上样缓冲液或含有蛋白酶磷酸酶抑制剂的RIPA蛋白裂解液提取总蛋白，总蛋白用BCA法定量后，取煮沸后冷却的等量蛋白样品加样于聚丙烯酰胺凝胶孔中，在电泳缓冲液中80V电压电泳30分钟后转为120V电压电泳1小时，然后在湿转液里以350mA电流转膜70分钟。转膜完成后，用含5％脱脂奶粉的封闭液室温封闭2h。封闭结束后，按照抗体说明书配制一抗(E-cadherin:Proteintech-60335-1-Ig)，在4℃孵育过夜。次日用洗膜液TBST室温洗涤三次，每次10min。加入用封闭液稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育2小时。洗膜液室温洗涤四次，每次15min。最后用显影液孵育后显影。
4、动物分组、慢性肾脏病(CKD)模型造模和给药
选取6-8周龄SPF级C57BL/7雄性小鼠，随机分成假手术对照组(Sham)、模型组(5/6Nx)、CLP2-2给药组(5/6Nx+CLP2-2，4mg/kg/d i.g.)，每组6只。5/6Nx组和CLP2-2给药组：C57BL/7小鼠麻醉，左侧卧位固定小鼠，碘伏消毒左侧肾脏部分皮肤，于左侧肾脏部位做一长为1cm左右的切口，钝性分离皮下组织，暴露左侧肾脏，撕去肾脏包膜，用4-0丝线结扎肾上下各1/3，等待5分钟后，用无菌剪刀，减去肾脏上下两极，回纳肾组织，逐层缝合肌肉及皮肤组织。一周后，麻醉小鼠，右侧卧位固定小鼠，碘伏消毒右侧肾脏部分皮肤，暴露肾组织，用4-0丝线结扎肾动脉，等待5分钟后，剪去右全肾，逐层缝合肌肉及皮肤组织。Sham组小鼠：C57BL/7小鼠同条件麻醉后，两侧肾脏部位分别做一长为1cm左右的切口，不结扎肾组织，逐层缝合肌肉及皮肤组织。术后所有小鼠以标准饲料喂养8周，自由饮水。饲养温度维持在(22±2℃)、湿度70％、12h光照/12h黑暗循环。给药：术后恢复两周后开始给药，CLP2-2组给药小鼠：每日按小鼠体重灌胃口服CLP2-2药液，保持给药量为4mg/kg/d；同时，Sham组和5/6Nx组小鼠：每日灌胃口服与CLP2-2组小鼠同样体积的无菌水，给药时间共计6周。
5、小鼠血清中尿素氮和肌酐水平测定
将各组小鼠麻醉后眼眶取血，取血量约200-300μl，室温静置1-2小时，3500rpm离心15分钟，收集上清。按尿素氮和肌酐生化试剂盒说明书要求测定血清中尿素氮和肌酐水平。
6、统计学分析
数据采用GraphPad Prism统计作图软件进行分析处理，统计采用One-wayanalysis of variance(ANOVA)方法，p<0.05认为具有统计学上的显著性差异。
三、实验结果
各组HK-2细胞中标志基因表达水平如图3所示。纤维化代表性变化是上皮间充质转化相关基因表达上调，如VIM、SNAI1。从图3中A、B可以看出，与对照组相比，模型组VIM、SNAI1表达水平均显著上调，说明TGFβ诱导的肾纤维化模型造模成功。与模型组相比，给药组VIM、SNAI1表达水平均显著下调，说明刺梨多糖CLP2-2显著改善了肾纤维化。
KIM1是肾损伤标志基因。从图3中C可以看出，与对照组相比，模型组KIM1表达水平显著上调，说明TGFβ诱导的肾纤维化模型造模成功，出现明显肾损伤。与模型组相比，给药组KIM1表达水平显著下调，说明刺梨多糖CLP2-2显著改善了肾损伤。
各组HK-2细胞中E-cadherin蛋白表达水平如图4所示。正常HK-2细胞强烈表达上皮标志性蛋白E-cadherin。从图4可以看出，与对照组相比，模型组E-cadherin蛋白表达水平显著下调，表明HK-2细胞出现表型转化，诱导纤维化形成，TGFβ诱导的肾纤维化模型造模成功。与模型组相比，给药组E-cadherin蛋白表达水平显著上调，说明刺梨多糖CLP2-2显著改善了肾纤维化。
在CKD模型中，肾脏功能明显降低，导致肌酐和尿素氮水平上升。各组小鼠血清中尿素氮和肌酐水平测定结果如图5所示。从图5中A、B可以看出，与假手术对照组相比，模型组小鼠血清中尿素氮和肌酐水平均显著上调，说明CKD模型造模成功。与模型组相比，CLP2-2给药组小鼠血清中尿素氮和肌酐水平均显著下调，说明刺梨多糖CLP2-2显著改善了CKD模型小鼠的肾脏功能。
上述实验结果表明，实施例1提供的刺梨多糖具有抗肾纤维化、改善肾损伤的作用，可以有效改善慢性肾脏病的肾脏功能。因此，本发明中的刺梨多糖具有制备成抗肾纤维化、治疗慢性肾脏病的药物的前景。
上述实施例的作用在于具体介绍本发明的实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于该具体实施例。
Claims (7)
1.一种刺梨多糖在制备治疗伴随肾纤维化的肾脏疾病的药物中的应用，所述刺梨多糖的制备方法包括以下步骤：
步骤S1，多糖提取：将新鲜成熟的刺梨果实去籽冲洗干净，粉碎风干，有机溶剂脱脂，得到脱脂粉末；取脱脂粉末，加入适量水，调节溶液pH至弱酸性，加入适量木瓜蛋白酶，在50～70℃条件下搅拌提取适当时间，灭酶；冷却后再调节溶液pH至弱碱性，加入适量胰蛋白酶，在30～45℃条件下搅拌提取适当时间，灭酶；冷却后离心取上清，透析脱盐，冷冻干燥，得酶提刺梨粗多糖；
步骤S2，多糖纯化：取适量酶提刺梨粗多糖，加适量水溶解，离心除去不溶物，上清液通过DEAE纤维素阴离子柱分离，依次以水、0.1M NaCl溶液和0.2M NaCl溶液洗脱，硫酸-苯酚检测，收取合并0.2M NaCl洗脱液，透析脱盐，冷冻干燥，得刺梨多糖CLP2；取适量刺梨多糖CLP2加入适量水溶解，通过Bio-Gel P-6Gel凝胶色谱柱纯化，以水进行洗脱，硫酸-苯酚法绘制洗脱曲线，将洗脱曲线主峰对应的洗脱液合并，冷冻干燥，即得。
2.根据权利要求1所述的应用，所述伴随肾纤维化的肾脏疾病为慢性肾脏病。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：步骤S1中所述有机溶剂为无水乙醇。
4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：步骤S2中所述DEAE纤维素阴离子柱为Cl-型DEAE纤维素阴离子柱。
5.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述药物以所述刺梨多糖为活性成分，用药学上可以接受的载体或辅料，制成药学上可以接受的剂型。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述载体或辅料为固体、液体或半固体。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述剂型包括片剂、胶囊和注射剂。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410864518.3A CN118743712A (zh) | 2024-07-01 | 2024-07-01 | 一种刺梨多糖在制备抗肾纤维化的药物中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410864518.3A CN118743712A (zh) | 2024-07-01 | 2024-07-01 | 一种刺梨多糖在制备抗肾纤维化的药物中的应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN118743712A true CN118743712A (zh) | 2024-10-08 |
Family
ID=92922829
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202410864518.3A Pending CN118743712A (zh) | 2024-07-01 | 2024-07-01 | 一种刺梨多糖在制备抗肾纤维化的药物中的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN118743712A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN120771174A (zh) * | 2025-09-10 | 2025-10-14 | 上海海洋大学 | 一种刺梨多糖在制备抗肝纤维化的药物或功能性食品中的应用 |
-
2024
- 2024-07-01 CN CN202410864518.3A patent/CN118743712A/zh active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN120771174A (zh) * | 2025-09-10 | 2025-10-14 | 上海海洋大学 | 一种刺梨多糖在制备抗肝纤维化的药物或功能性食品中的应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20210346281A1 (en) | Multi-component injection | |
| Wang et al. | Effects of three Huanglian-derived polysaccharides on the gut microbiome and fecal metabolome of high-fat diet/streptozocin-induced type 2 diabetes mice | |
| CN101560268A (zh) | 一种Cs-4发酵菌丝体多糖及其制备方法与用途 | |
| CN107375308B (zh) | 毛蕊花糖苷在制备预防或治疗肾小球足细胞损伤型肾脏疾病的药物中的用途 | |
| US9303006B2 (en) | Line leaf inula flower lactone A and methods for preparing and using the same for treating myocarditis | |
| CN118546271A (zh) | 一种刺梨多糖clp2-2及其制备方法和用途 | |
| CN118743712A (zh) | 一种刺梨多糖在制备抗肾纤维化的药物中的应用 | |
| CN113773409B (zh) | 倒心盾翅藤多糖及其用途 | |
| CN102309542A (zh) | 用于慢性肾炎的肾茶正丁醇部位药及其制备方法 | |
| CN106177187B (zh) | 具有增效减毒抗肝癌作用的茶多酚茶多糖组合物 | |
| CN103724318B (zh) | 九香虫酰胺a及其组合物和其在制药和食品中的应用 | |
| CN113384618B (zh) | 一种无花果乳浆提取物作为制备治疗血管内皮细胞损伤药物的应用 | |
| CN113413402B (zh) | 梅花草提取物在制备治疗幽门螺杆菌感染疾病药物中的应用 | |
| CN118620098A (zh) | 一种刺梨多糖用于制备抗血管钙化的药物的用途 | |
| CN116270705A (zh) | 一种苣荬菜多糖类提取物在防治溃疡性结肠炎中的应用 | |
| CN104814954B (zh) | 一种药物制剂及在制备治疗心肌缺血与胃炎药物中的应用 | |
| CN105560302B (zh) | 老鹳草水提物在制备抗血管生成类药物中的应用 | |
| CN115607606B (zh) | 辣椒来源纳米囊泡在制备防治动脉粥样硬化疾病药物中的应用 | |
| CN120837554B (zh) | 一种治疗慢性肾脏病的组合物及其制备方法和应用 | |
| CN117815261B (zh) | 一种锯叶棕果实提取物及其软胶囊的医药新用途 | |
| CN119504599B (zh) | 一种用于治疗肾脏纤维化的吡唑类化合物及其应用 | |
| CN103288889A (zh) | 蒽醌衍生物及其药物组合物与其在制药中的应用 | |
| CN117085006B (zh) | 丹酚酸y制备治疗荨麻疹药物中的应用 | |
| CN111297849B (zh) | 用于治疗喉癌的药物组合物、其制备方法及其应用 | |
| CN114656575B (zh) | 一种合欢花非均一多糖，其制备方法及用途 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |