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CN118556079A - 抗pacap抗体的组合物和方法 - Google Patents

抗pacap抗体的组合物和方法 Download PDF

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CN118556079A
CN118556079A CN202280063638.2A CN202280063638A CN118556079A CN 118556079 A CN118556079 A CN 118556079A CN 202280063638 A CN202280063638 A CN 202280063638A CN 118556079 A CN118556079 A CN 118556079A
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pacap
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A·克拉克
D·巴特
D·莱恩
H·麦克雷
J·沃
J·罗森菲尔德
S·苏拉德
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Sefalong Co ltd
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Abstract

本公开文本总体上涉及抗PACAP抗体、包含此类抗体的药物组合物以及产生和使用此类抗体的方法。

Description

抗PACAP抗体的组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年7月29日提交的美国临时专利申请号63/226,875的优先权，将其公开内容通过引用以其整体(包括任何附图)并入本文。
序列表的并入
本申请含有序列表，将其通过引用以其整体特此并入本文。所附的名称为“035680-502001WO_SequenceListing_ST26.xml”的序列表文本文件创建于2022年7月26日，并且为69KB。
技术领域
本公开文本总体上涉及抗垂体腺苷酸环化酶激活多肽(PACAP)抗体、包含此类抗体的药物组合物以及产生和使用此类单克隆抗体的方法。
背景技术
垂体腺苷酸环化酶激活肽(PACAP)是一种与诸如伤害性感受等广泛的功能和原发性偏头痛有关的神经肽。PACAP是分泌素/血管活性肠肽(VIP)/生长激素释放激素(GHRH)家族的一员。PACAP/VIP受体PAC1、VPAC1和VPAC2存在于感觉神经元和与三叉神经血管系统相关的血管平滑肌中。PAC1受体以高亲和力结合PACAP并且对VIP具有低得多的亲和力。VPAC1和VPAC2受体同样良好地识别PACAP和VIP。
PACAP是一种多功能血管舒张肽，其以两种α酰胺化活性形式存在，一种具有38个氨基酸，并且另一种具有27个氨基酸。PACAP38是更普遍的活性形式，占哺乳动物组织中高达90％的PACAP形式。
据我们目前所知，PACAP(而不是VIP)与诸如偏头痛、丛集性头痛和创伤后应激障碍(PTSD)等病症有关。例如，根据三叉神经激活的实验模型中的发现，已经记录了急性偏头痛发作和丛集性头痛中的增加的PACAP血浆水平。这表明三叉神经系统的激活可能导致PACAP的静脉水平升高，当治疗头痛时可以减少这一变化。此外，PACAP注射在患有偏头痛或丛集性头痛的患者中诱导这些病症。另外，PACAP血清水平与女性患者的PTSD诊断和症状的严重程度有关联。
抗PACAP抗体可用于治疗多种病症，如偏头痛、丛集性头痛、焦虑和PTSD。然而，迄今为止，尚无靶向PACAP的抗体被批准用于治疗使用。因此，需要适用于在人类中治疗使用的抗PACAP抗体。
本公开文本提供了解决所述问题并且满足本领域需要的抗PACAP抗体。
发明内容
在至少一个实施方案中，本公开文本提供了一种抗垂体腺苷酸环化酶激活多肽(PACAP)抗体，其中所述抗体包含分别在SEQ ID NO:9、2和3中所示的重链可变区(VH)-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3序列；以及分别在SEQ ID NO:10、5和6中所示的轻链可变区(VL)-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3序列。
在至少一个实施方案中，本公开文本提供了一种抗PACAP抗体，其中所述抗体或其抗原结合片段包含选自以下的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3序列：a)分别地，SEQ ID NO:1、2和3；b)分别地，SEQ ID NO:7、2和3；以及c)包含1、2或3个保守氨基酸取代的a)-b)的变体；并且其中所述抗体或其抗原结合片段包含选自以下的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3序列：a)分别地，SEQ ID NO:4、5和6；b)分别地，SEQ ID NO:8、5和6；以及c)包含1、2或3个保守氨基酸取代的d)-e)的变体。
在至少一个实施方案中，本公开文本提供了一种抗PACAP抗体，其中所述抗体包含衍生自SEQ ID NO:19的VH序列，其中所述VH序列包含根据Kabat编号的在残基32处的缬氨酸(V)或亮氨酸(L)；并且其中所述抗体包含衍生自SEQ ID NO:22的VL序列，其中所述VL序列包含根据Kabat编号的在残基27E处的丙氨酸(A)、根据Kabat编号的分别在残基50和51处的色氨酸(W)和丙氨酸(A)。在至少一个实施方案中，所述抗体进一步包含根据Kabat编号的在所述VH中的残基92-94处的半胱氨酸-丙氨酸-异亮氨酸(CAI)。
在至少一个实施方案中，所述抗体包含分别衍生自人基因IGHV1-69*01和IGKV4-1*01的重链和轻链框架区(FR)序列及其功能变体。
在至少一个实施方案中，所述抗体包含分别在SEQ ID NO:29-32中所示的重链框架区(VHFR)-1、VHFR-2、VHFR-3和VHFR-4序列；以及分别在SEQ ID NO:33-36中所示的轻链框架区(VLFR)-1、VLFR-2、VLFR-3和VLFR-4序列。
在至少一个实施方案中，所述抗体包含与选自SEQ ID NO:11和12的序列约90％、约95％或约99％相同的VH序列，以及与选自SEQ ID NO:20和21的序列约90％、约95％或约99％相同的VL序列。
在至少一个实施方案中，所述抗体包含选自SEQ ID NO:11和12的VH序列以及选自SEQ ID NO:20和21的VL序列。
在至少一个实施方案中，本公开文本提供了一种抗PACAP抗体，其中所述抗体包含选自以下的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3序列以及VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3序列：a)分别地，SEQ ID NO:1、2和3以及SEQ ID NO:4、5和6；b)分别地，SEQ ID NO:7、2和3以及SEQ IDNO:8、5和6；c)分别地，SEQ ID NO:1、2和3以及SEQ ID NO:8、5和6；以及d)分别地，SEQ IDNO:7、2和3以及SEQ ID NO:4、5和6。
在至少一个实施方案中，所述抗体包含与选自以下的序列约90％、约95％或约99％相同的VH序列和VL序列：a)分别地，SEQ ID NO:11和20；b)分别地，SEQ ID NO:12和21；c)分别地，SEQ ID NO:11和21；以及d)分别地，SEQ ID NO:12和20。
在至少一个实施方案中，所述抗体包含选自以下的VH序列和VL序列：a)分别地，SEQ ID NO:11和20；b)分别地，SEQ ID NO:12和21；c)分别地，SEQ ID NO:11和21；以及d)分别地，SEQ ID NO:12和20。
在至少一个实施方案中，所述抗体包含SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的VH序列，其中所述VH序列具有在SEQ ID NO:11或12的残基1处的谷氨酰胺(Q)，而不是谷氨酸(E)。
在至少一个实施方案中，所述抗体包含选自SEQ ID NO:37-51或SEQ ID NO:76的重链恒定区序列以及选自SEQ ID NO:23和24的轻链恒定区序列。
在至少一个实施方案中，所述抗体包含SEQ ID NO:43中所示的重链恒定区序列和SEQ ID NO:23中所示的轻链恒定区序列。
在至少一个实施方案中，所述抗体包含SEQ ID NO:43中所示的重链恒定区序列和SEQ ID NO:23中所示的轻链恒定区序列。
在至少一个实施方案中，所述抗体包含SEQ ID NO:42中所示的重链恒定区序列和SEQ ID NO:23中所示的轻链恒定区序列。
在至少一个实施方案中，所述抗体包含SEQ ID NO:76中所示的重链恒定区序列和SEQ ID NO:23中所示的轻链恒定区序列。
在至少一个实施方案中，所述抗体是人的或人源化的。在至少一个实施方案中，所述抗体是人源化抗体。
在至少一个实施方案中，所述抗体具有低或没有免疫原性特征。
在至少一个实施方案中，所述抗体具有大于或等于约89％的人性得分。
在至少一个实施方案中，所述抗体具有低于或等于约5x 10-11摩尔(M)的KD，如在37℃下通过SPR测量的。
在至少一个实施方案中，所述抗体具有低于或等于约3x 10-11摩尔(M)的KD，如在37℃下通过SPR测量的。
在至少一个实施方案中，所述抗体是抗原结合片段。
在至少一个实施方案中，所述抗体包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、单链Fv或scFv、二硫键连接的Fv、V-NAR结构域、IgNar、胞内抗体、IgGACH2、微抗体、F(ab')3、四抗体(tetrabody)、三抗体(triabody)、双抗体(diabody)、单结构域抗体、DVD-Ig、Fcab、mAb2、(scFv)2或scFv-Fc。
在至少一个实施方案中，所述抗体是全长抗体。
在至少一个实施方案中，所述抗体恒定区是IgG恒定区。
在至少一个实施方案中，所述恒定区是IgG1恒定区。
在至少一个实施方案中，所述恒定区是IgG4恒定区。
在至少一个实施方案中，所述恒定区包含选自以下的序列：SEQ ID NO:37中所示的人IgG1序列、SEQ ID NO:38中所示的人IgG1FAB TAG序列、SEG ID NO:39中所示的人IgG1KiH臼(Hole)序列、SEQ ID NO:40中所示的人IgG1KiH杵(Knob)序列、SEQ ID NO:41中所示的人IgG1(L235A，G237A)序列、SEQ ID NO:42中所示的人IgG1YTE序列、SEQ ID NO:76中所示的人IgG1(L235A，G237A，YTE)序列、SEQ ID NO:43中所示的人IgG2DASS序列、SEQ IDNO:44中所示的人IgG4序列、SEQ ID NO:45中所示的人IgG4KiH臼序列、SEQ ID NO:46中所示的人IgG4KiH杵序列、SEQ ID NO:47中所示的人IgG4(L235A，G237A)序列、SEQ ID NO:48中所示的人IgG4(L235E)序列、SEQ ID NO:49中所示的人IgG4YTE序列、SEQ ID NO:50中所示的人IgG4YTE KiH臼序列和SEQ ID NO:51中所示的人IgG4YTE KiH杵序列。
在至少一个实施方案中，所述抗体重链是IgG2重链。在至少一个实施方案中，所述重链包含SEQ ID NO:43中所示的IgG2DASS序列。
在至少一个实施方案中，所述抗体轻链是人κ轻链。
在至少一个实施方案中，所述抗体轻链是人λ轻链。
在至少一个实施方案中，所述抗体包含与选自以下的序列约90％、约95％或约99％相同的全长重链序列和全长轻链序列：a)分别地，SEQ ID NO:70和71；b)分别地，SEQID No:74和71；c)分别地，SEQ ID No:75和71；d)分别地，SEQ ID NO:72和73；e)分别地，SEQID NO:70和73；以及f)分别地，SEQ ID NO:72和71。
在至少一个实施方案中，所述抗体包含选自以下的全长重链序列和全长轻链序列：a)分别地，SEQ ID NO:70和71；b)分别地，SEQ ID No:74和71；c)分别地，SEQ ID No:75和71；d)分别地，SEQ ID NO:72和73；e)分别地，SEQ ID NO:70和73；以及f)分别地，SEQ IDNO:72和71。在至少一个实施方案中，所述重链序列具有在SEQ ID NO:70、72、74和75的残基1处的谷氨酰胺(Q)，而不是谷氨酸(E)。
在至少一个实施方案中，所述抗体是PACAP的拮抗剂。
在至少一个实施方案中，所述抗体与PACAP特异性结合。
在至少一个实施方案中，本公开文本提供了一种核酸，所述核酸编码本文所述的抗体。
在至少一个实施方案中，本公开文本提供了一种载体，所述载体包含本文所述的核酸。
在至少一个实施方案中，本公开文本提供了一种工程化细胞，所述工程化细胞包含本文所述的载体。
在至少一个实施方案中，本公开文本提供了一种产生抗体的方法，所述方法包括将本公开文本的工程化细胞在足以使所述细胞产生所述抗体的条件下培养。
在至少一个实施方案中，本公开文本提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含本文所述的抗体以及药学上可接受的载剂。
在至少一个实施方案中，本公开文本提供了一种治疗或预防个体的病症的方法，所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的本公开文本的抗体或药物组合物，其中所述病症选自：头痛(例如，偏头痛、丛集性头痛、难治性偏头痛)、焦虑、抑郁、PTSD、伴有头痛(例如，偏头痛、丛集性头痛、难治性偏头痛)的共病病症(例如，焦虑/抑郁/PTSD)、伴有偏头痛的共病焦虑障碍、复杂性区域性疼痛综合征和玫瑰痤疮。在至少一个实施方案中，所述头痛选自：有先兆偏头痛、无先兆偏头痛、偏瘫性偏头痛、丛集性头痛、神经性偏头痛、慢性头痛、阵发性偏头痛、慢性偏头痛、药物过度使用性头痛和紧张性头痛。
在至少一个实施方案中，本公开文本提供了一种治疗或预防个体的偏头痛的方法，所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的本公开文本的抗体或药物组合物。
在至少一个实施方案中，本公开文本提供了一种治疗或预防个体的偏头痛的方法，所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的本公开文本的抗体或药物组合物，其中所述个体对两种至四种适用的预防性药物没有反应。在至少一个实施方案中，所述个体对两种至四种选自以下的适用的预防性药物没有反应：双丙戊酸盐、丙戊酸钠、丙戊酸盐、丙戊酸、托吡酯、加巴喷丁、普萘洛尔、噻吗洛尔、阿替洛尔、美托洛尔、纳多洛尔、比索洛尔(bisopropol)、氟桂利嗪、阿米替林、去甲替林、多塞平、氟西汀和坎地沙坦。
在至少一个实施方案中，本公开文本提供了一种治疗或预防个体的偏头痛的方法，所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的本公开文本的抗体或药物组合物，其中所述个体对两种至四种适用的预防性药物类别没有反应。在至少一个实施方案中，所述预防性药物类别选自：抗癫痫药、β阻断剂、三环抗抑郁药、钙通道阻断剂、血管紧张素II受体拮抗剂、肉毒杆菌毒素和CGRP途径单克隆抗体。在至少一个实施方案中，所述预防性药物类别选自不同的集群，其中所述集群定义如下：集群A：抗癫痫药；集群B：β阻断剂；集群C：三环抗抑郁药；集群D：钙通道阻断剂；集群E：血管紧张素II受体拮抗剂；集群F：肉毒杆菌毒素；以及集群G：降钙素基因相关肽(CGRP)途径单克隆抗体。
在至少一个实施方案中，所述个体对两种至三种、至少两种、至少三种、至少四种、多于两种或多于三种预防性药物或预防性药物类别没有反应。
在至少一个实施方案中，本公开文本提供了一种治疗或预防个体的偏头痛的方法，所述方法包括：选择对两种至四种适用的预防性药物或预防性药物类别没有反应的个体；以及向所述个体施用治疗有效量的本公开文本的抗体或药物组合物。
在至少一个实施方案中，本公开文本提供了一种治疗或预防对CGRP途径单克隆抗体没有反应的个体的偏头痛的方法，所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的本公开文本的抗体或药物组合物。在至少一个实施方案中，所述CGRP途径单克隆抗体包括抗CGRP抗体(即，抗CGRP配体抗体)、抗CGRP-R抗体(即，抗CGRP受体抗体)或二者。在至少一个实施方案中，所述抗CGRP抗体选自瑞玛奈珠单抗(fremanezumab)、伽奈珠单抗(galcanezumab)、依普奈珠单抗(eptinezumab)或其组合。在至少一个实施方案中，所述抗CGRP-R抗体是厄瑞努单抗(erenumab)。
在至少一个实施方案中，本公开文本提供了一种用于根据本公开文本使用的组合物。
除非从实施方案或方面的上下文中明确或清楚地排除，否则本文所述的每个方面和实施方案都能够一起使用。
附图说明
图1示出了人PACAP38、PACAP27和VIP多肽序列的比对。“*”-表示完全保守的残基。“.”-表示特性弱相似的残基之间的保守，“:”-表示特性强相似的残基的保守。
图2A-图2B示出了本文提供的一些示例性抗体的VL(图2A)和VH(图2B)序列比对。CDR是根据Kabat编号来定义的，除重链CDR-1(其在图2B中是由AbM定义的)之外。
图3A-图3C示出了抗PACAP抗体605C与PACAP38和PACAP27和VIP的结合亲和力的示例性结果，如在37℃下通过SPR测量的。
图4示出了关于抗PACAP抗体890C与PACAP38、PACAP27、VIP和其他胰高血糖素-分泌素家族肽结合的示例性实验SPR数据。
图5示出了在基于细胞的环AMP诱导测定中抗PACAP抗体890C对PACAP38相比于VIP的活性的选择性的示例性实验数据。
图6示出了本文提供的一些示例性抗PACAP抗体和各种同种型形式的其他抗PACAP抗体的表观分子量。
图7示出了608C、609C、627C、890C和其他抗PACAP抗体的可变区的预测的免疫原性特征的总结。
图8示出了抗PACAP抗体890C氨基酸序列。CDR加下划线(所有CDR都是根据Kabat定义来定义的，除重链CDR-1是由AbM定义的之外)。恒定区加点下划线。重链恒定区上的A330S和P331S取代(EU Fc编号)加双下划线。C末端赖氨酸的缺失(Δ447K；EU Fc编号)由星号标出。
图9示出了抗PACAP抗体608C氨基酸序列。CDR加下划线(所有CDR都是根据Kabat定义来定义的，除重链CDR-1是由AbM定义的之外)。恒定区加点下划线。重链恒定区上的A330S和P331S取代(EU Fc编号)加双下划线。C末端赖氨酸的缺失(Δ447K；EU Fc编号)由星号标出。
图10示出了抗PACAP抗体627C氨基酸序列。CDR加下划线(所有CDR都是根据Kabat定义来定义的，除重链CDR-1是由AbM定义的之外)。恒定区加点下划线。重链恒定区上的A330S和P331S取代(EU Fc编号)加双下划线。C末端赖氨酸的缺失(Δ447K；EU Fc编号)由星号标出。
图11示出了抗PACAP抗体609C氨基酸序列。CDR加下划线(所有CDR都是根据Kabat定义来定义的，除重链CDR-1是由AbM定义的之外)。恒定区加点下划线。重链恒定区上的A330S和P331S取代(EU Fc编号)加双下划线。C末端赖氨酸的缺失(Δ447K；EU Fc编号)由星号标出。
具体实施方式
本公开文本涉及抗垂体腺苷酸环化酶激活多肽(PACAP)抗体，特别是涉及对PACAP具有高亲和力并且当施用至人时具有低免疫原性的抗体。在人中，PACAP是从由ADCYAP1基因编码的176个氨基酸的前体蛋白产生的。PACAP有两种天然存在的亚型：38个氨基酸的肽(PACAP38)和27个氨基酸的肽(PACAP27)。PACAP38对应于前体蛋白的氨基酸132-169并且它的序列是HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVLGKRYKQRVKNK(SEQ ID NO:13)。PACAP27是PACAP38的氨基末端片段并且对应于前体蛋白的氨基酸132-158。PACAP27的序列是HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVL(SEQ ID NO:14)。PACAP38和PACAP27二者都显示出与血管活性肠肽(VIP)的高序列相似性，后者的序列是HSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILN(SEQ IDNO:15)。参见图1。在一些实施方案中，本文提供的抗PACAP抗体可以以高亲和力与PACAP38和PACAP27二者结合。在其他实施方案中，本文提供的抗体与VIP具有低结合或没有结合。
本公开文本还提供了可用于产生此类抗体的组合物和方法、编码所述抗体的核酸、用所述核酸遗传修饰的细胞以及用于治疗或预防多种健康病症(如偏头痛、难治性偏头痛等)的方法。
在以下具体实施方式中，参考形成其一部分的附图。在附图中，除非上下文另外规定，否则相似的符号通常标识相似的组分。在具体实施方式、附图和权利要求中描述的说明性替代方案并不意在是限制性的。在不脱离在此呈现的主题的精神或范围的情况下，可以使用其他替代方案并且可以进行其他改变。将容易理解的是，如在本文总体上描述的以及在附图中展示的方面可以以各种各样的不同配置来布置、取代、组合和设计，所有这些都被明确地考虑并构成本申请的一部分。
定义
除非另外定义，否则本文所用的所有技术术语、符号和其他科学术语或用辞都旨在具有本公开文本所属领域的技术人员通常理解的含义。在一些情况下，为了清楚和/或为了便于参考而在本文中定义具有通常理解的含义的术语，并且在本文中包含此类定义不必被解释为表示与本领域通常所理解的有实质性差异。本文描述或提及的许多技术和程序是本领域技术人员很好理解的并且通常由本领域技术人员使用常规方法加以采用。
“结合亲和力”通常是指分子(例如，抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如，抗原/靶标)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另外指示，否则如本文所用，“结合亲和力”是指固有结合亲和力，其反映结合对(例如，抗体和抗原)的成员之间的1:1相互作用。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以由解离常数(KD)表示。亲和力可以通过本领域已知的常见方法(包括本文所述的那些方法)测量。低亲和力抗体通常缓慢地结合抗原并倾向于易于解离，而高亲和力抗体通常更快地结合抗原并倾向于更长时间地保持结合。测量结合亲和力的各种方法是本领域已知的，其中的任何方法都可以用于本公开文本的目的，其例子是亲和力ELISA测定。另外，亲和力可以通过表面等离子体共振测定(SPR，例如基于的测定)确定。使用此方法，可以测量缔合速率常数(ka，以M-1s-1计)和解离速率常数(kd，以s-1计)。平衡解离常数(KD，以M计)然后可以由动力学速率常数的比率(kd/ka)计算。结合亲和力也可以通过动力学方法诸如如Rathanaswami等人AnalyticalBiochemistry,第373卷:52-60,2008中所述的动力学排除测定(KinExA)确定。使用KinExA测定，可以测量平衡解离常数(KD，以M计)和缔合速率常数(ka，以M-1s-1计)。解离速率常数(kd，以s-1计)可以由这些值计算(KD X ka)。结合亲和力也可以通过平衡/溶液方法确定。
“特异性结合”通常意指抗体经由其抗原结合结构域与表位结合，并且意指结合需要抗原结合结构域与表位之间的一些互补性。根据此定义，当抗体经由其抗原结合结构域与表位结合比其与随机不相关的表位结合更容易时，抗体被说成与该表位“特异性结合”。在本文中使用术语“特异性”来限定某一抗体与某一表位结合的相对亲和力。例如，抗体“A”可以被认为比抗体“B”对给定表位具有更高的亲和力，或者抗体“A”可以被说成以比其对相关表位“D”更高的特异性与表位“C”结合。在对本文所述的抗体的具体提及中，“特异性结合”意指抗体与PACAP27和/或PACAP38结合比其与VIP结合更容易。在一个实施方案中，抗体与人PACAP特异性结合。例如：抗体与PACAP27和PACAP38结合比其与VIP结合更容易。
“分离”的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物是呈未在自然界中发现的形式的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物。分离的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物包括已经被纯化至它们不再呈它们在自然中发现的形式的程度的那些。在一些实施方案中，分离的抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物是基本上纯的。
如本文关于蛋白质或多肽所用的术语“衍生自”是指起源或来源，并且可以包括从来源或起源蛋白质或多肽获得的、基于来源或起源蛋白质或多肽获得的天然存在的、重组的、未纯化的或纯化的多肽。因此，衍生自起源蛋白质或多肽的蛋白质或多肽可以部分或全部地包括起源蛋白质或多肽，并且可以是起源蛋白质或多肽的片段或变体。在一些情形下，衍生自来源或起源的多肽序列或结构域可以是遗传修饰的或化学修饰的。
如本文所用，术语“施用(administer)”、“施用(administration)”、“施用(administering)”等是指通过包括但不限于以下的施用途径来递送组合物或配制品或药物(例如，如本文所公开的抗PACAP抗体)：静脉内、动脉内、颅内、肌内、腹膜内、皮下、肌内或其组合。所述术语包括但不限于由医学专业人员进行的施用和自我施用。
如本文所用，“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”和“治疗(to treat)”意指至少一种或多种症状改善，即使根本不必如此。例如，这些术语是指利用用于获得有益或所需临床结果的方法，包括但不限于实现此类有益或所需临床结果的方法，其中临床结果可以包括改善、治愈、减慢、减轻病理性病症或障碍的症状和/或停止病理性病症或障碍的进展的治疗措施。需要治疗的那些可以包括已经被诊断患有或怀疑患有障碍的那些。如本文所用，并且除非另外说明，否则药剂或药物(例如，如本文所公开的抗PACAP抗体)的“治疗有效量”是足以在治疗或管理受试者的疾病或障碍方面提供治疗益处或者延迟或最小化与疾病相关的一种或多种症状的量。治疗有效量的化合物、药剂或药物意指单独或与其他治疗剂组合的在治疗或管理疾病方面提供治疗益处的量的治疗剂。术语“治疗有效量”可以涵盖改善疾病的整体疗法、减轻或避免疾病的症状或原因或者增强另一种治疗剂的治疗功效的量。“有效量”的例子是足以促成治疗、预防或减轻疾病的一种或多种症状的量，其也可以称为“治疗有效量”。包括“治疗有效量”在内的组合物的确切量将取决于治疗的目的，并且将可使用已知技术由本领域技术人员确定。
如本文所用，“受试者”或“个体”包括动物，如人(例如，人个体)和非人动物。在一些实施方案中，“受试者”或“个体”是在医生的护理下的患者。因此，受试者可以是患有、有风险患上或怀疑患有目的疾病(例如，偏头痛、难治性偏头痛等)和/或疾病的一种或多种症状的人类患者。受试者也可以是在诊断时或之后被诊断为有目的病症的风险的个体。例如，受试者可以被进一步表征为有风险患上本文所述的病症或将从PACAP活性的降低中受益的病症。
术语“细胞”、“细胞培养物”、“细胞系”不仅指代特定的主题细胞、细胞培养物或细胞系，而且指代这样的细胞、细胞培养物或细胞系的后代或潜在后代，而不考虑培养中的转移或传代次数。应当理解的是，并非所有后代都与亲代细胞完全相同。这是因为某些修饰可能由于突变(例如，故意或无意的突变)或环境影响(例如，甲基化或其他表观遗传修饰)而在后代中发生，使得后代实际上可能与亲本细胞不同，但是仍被包括在如本文所用的术语的范围内，只要后代保留与原始细胞、细胞培养物或细胞系的功能相同的功能即可。
如本文所用，术语“可操作地连接”表示两个或更多个元件(例如，多肽序列或多核苷酸序列)之间的物理或功能连接，其允许它们以它们预期的方式操作。例如，当在核酸构建体中或在工程化响应元件中的本文所述的正交DNA靶序列或启动子序列的上下文中使用时，术语“可操作地连接”意指正交DNA靶序列和启动子是框内的并且在远离编码蛋白质或RNA的目的多核苷酸的适当空间和距离内，以允许通过转录因子或RNA聚合酶的相应结合对转录施加影响。
除非上下文另外明确规定，否则单数形式“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”和“所述”包括复数指示物。例如，术语“一种细胞”包括一种或多种细胞，包括其混合物。在本文中使用“A和/或B”来包括所有以下替代形式：“A”、“B”、“A或B”以及“A和B”。
在提供值范围的情况下，应理解的是除非上下文另外明确规定，否则在该范围的上限值与下限值之间的每个中间值(至下限值的单位的十分之一)以及所陈述的范围内的任何其他所陈述的或中间值都被涵盖在本公开文本内。这些更小范围的上限值和下限值可以独立地被包括在更小范围内，并且也被涵盖在本公开文本内，服从于在所陈述的范围内任何确切排除的限值。在所陈述的范围包括一个或两个限值的情况下，排除那些被包括的限值中的任一个或两个的范围也被包括在本公开文本中。
本文公开的所有范围还都涵盖任何和所有可能的子范围及其子范围的组合。任何列出的范围都可以被认为充分描述和使得能够将相同的范围分解为至少相等的两份、三份、四份、五份、十份等。作为一个非限制性例子，本文所讨论的每个范围都可以容易地分解为下三分之一、中三分之一和上三分之一，等等。同样如本领域技术人员将理解的，诸如“高达”、“至少”、“大于”、“小于”等所有言辞都包括所列举的数字，并且涉及随后可以分解为如上文所讨论的子范围的范围。最后，如本领域技术人员将理解的，范围包括每个单独成员。因此，例如，具有1-3个物品的组是指具有1、2或3个物品的组。类似地，具有1-5个物品的组是指具有1、2、3、4或5个物品的组，等等。
应了解，为清楚起见在单独实施方案的上下文中描述的本公开文本的某些特征也可以在单个实施方案中组合提供。相反，为简洁起见在单个实施方案的上下文中描述的本公开文本的各种特征也可以分开地或以任何合适的子组合提供。属于本公开文本的实施方案的所有组合都确切地被本公开文本所涵盖并且在本文中公开，如同每一个组合都单独且明确地公开一样。另外，各种实施方案及其要素的所有子组合也确切地被本公开文本所涵盖并且在本文中公开，如同每一个这样的子组合都单独且明确地在本文中公开一样。
组合物
本公开文本尤其提供了抗垂体腺苷酸环化酶激活多肽(PACAP)抗体。本文提供的抗PACAP抗体可以阻断通过PACAP受体(即，PAC1)的PACAP信号传导以及通过VIP受体VPAC1和VPAC2的PACAP信号传导。在某些实施方案中，本文提供的抗PACAP抗体已经被工程化以经由人源化改善人序列百分比。此外，本文提供的抗PACAP抗体的CDR3序列被工程化以改善亲和力、效力或二者。在一些实施方案中，抗PACAP抗体被工程化以包括具有根据Kabat编号的在SEQ ID NO:3的残基96处的谷氨酰胺(Q)的重链可变区(VH)-CDR3。在一些实施方案中，抗PACAP抗体包括根据Kabat编号的在SEQ ID NO:6的残基93处的色氨酸(W)和残基95处的天冬氨酸(D)的轻链可变区(VL)-CDR3。在其他实施方案中，本文提供的抗PACAP抗体可以被工程化以消除免疫原性并且降低制造责任。此外，本文提供的抗PACAP抗体被工程化以实现对PACAP-38和/或PACAP-27诱导的环腺苷一磷酸(cAMP)产生的有效抑制，这描述于实施例5中并且如先前由Wang,Li等人2004所述。
如下文更详细地描述的，本文提供的抗体在施用至受试者时展现出低潜在的免疫原性风险或没有潜在的免疫原性风险。如本文所用，“低潜在的免疫原性风险或没有潜在的免疫原性风险”是指治疗性抗体当以足够量施用至受试者时无法诱导抗药物抗体(ADA)的形成。ADA是免疫系统产生的针对治疗剂的可以降低药物功效的抗体，并且更重要的是，它们还可能引起范围从注射部位的皮疹到可能是致命的全身性炎症反应的不良反应。在某些实施方案中，本文提供的抗体在施用至人时展现出低潜在的免疫原性风险或没有潜在的免疫原性风险。对于施用至人，可以例如通过工程化抗体以具有较高的人性得分以及通过经由预测性体外技术消除发现具有较高潜在的免疫原性风险的残基来提供较低潜在的免疫原性风险或没有潜在的免疫原性风险。如本文所用，“人性得分(humanness score)”是指抗体与人种系的序列同一性百分比。
本领域技术人员将容易地了解如何计算抗体与人种系之间的序列同一性。例如，抗PACAP抗体具有高人性得分，例如大于或等于约89％。另外，抗PACAP抗体对PACAP具有很强的亲和力。例如，本文提供的一些抗PACAP抗体具有低于约5x 10-11摩尔(M)的KD，如在37℃下通过SPR测量的。在一些实施方案中，本文提供的抗PACAP抗体具有低于或等于约3x10-11摩尔(M)的KD，如在37℃下通过SPR测量的。在一些实施方案中，抗PACAP抗体优先与PACAP(包括PACAP-38和PACAP-27)结合。
抗原结合分子
如本文所用的抗体具有其在本领域中常见的含义，并且是指这样的免疫球蛋白分子，其通过在免疫球蛋白分子的可变区内的至少一个抗原结合结构域识别靶标的表位并且与所述表位特异性结合。靶标可以是肽，例如PACAP肽。本公开文本的抗体涵盖全长抗体(包括全长多克隆抗体和全长单克隆抗体)、抗原结合片段(如Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段)、单链Fv(scFv)突变体、多特异性抗体(如从至少两种全长抗体产生的双特异性抗体)、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、包含抗体的抗原决定区的融合蛋白和包含抗原识别位点的任何其他经修饰的免疫球蛋白分子，只要抗体展现出所需生物学活性即可。基于它们的重链恒定结构域(分别称为α、δ、ε、γ和μ)的身份，抗体可以属于五大类免疫球蛋白(IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)或其亚类(同种型)(例如，IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2)中的任一个。在一些实施方案中，本公开文本的抗体是IgG抗体。在某些实施方案中，本公开文本的抗体是IgG2抗体。在一个更确定的实施方案中，本公开文本的抗体是包含以下突变的经修饰的IgG2：A330P331至S330S331(参考野生型IgG2序列进行氨基酸编号，Eur.J.Immunol.(1999)29:2613-2624)。不同的免疫球蛋白类别具有不同且熟知的亚基结构和三维构型。
本公开文本的抗体可以包括一个或多个可变区。抗体的可变区是指单独或组合的抗体轻链的可变区(VL)或抗体重链的可变区(VH)。重链和轻链的可变区各自由通过三个互补决定区(CDR)(也称为高变区)连接的四个框架区(FR)组成。每条链中的CDR通过FR紧密靠近地保持在一起，并且与来自另一条链的CDR一起促进形成抗体的抗原结合位点。有至少两种确定CDR的技术：(1)基于跨物种序列变异性的方法(即，Kabat等人Sequences ofProteins of Immunological Interest(第5版,1991,National Institutes of Health,马里兰州贝塞斯达))；以及(2)基于抗原-抗体复合物的晶体学研究的方法(Al-lazikani等人(1997)J.Molec.Biol.273:927-948；Chothia和Lesk,1987,J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人,1989,Nature 342:878-883；Oxford Molecular's AbM antibody modellingsoftware and North numbering convention(North等人,A New Clustering ofAntibody CDR Loop Conformations,Journal of Molecular Biology,406:228-256(2011)))。另外，这两种方法的组合有时在本领域中用于确定CDR。
在一些实施方案中，本文提供的抗PACAP抗体是全长抗体。全长抗体可以包括四个多肽的单元，其由通过二硫键保持在一起的两条相同的重链和两条相同的轻链组成，如下文更详细地描述的。与重链相比，轻链通常更短，并且分子量更低。每条多肽链都具有恒定区和可变区。可变区特异于每种具体抗体。轻链可变区被称为VL，并且轻链恒定区被称为CL。类似地，重链可变区被称为VH，并且重链恒定区被称为CH，其中CH1、CH2和CH3各自表示重链的恒定区的不同部分。在一些实施方案中，碳水化合物通常可以附接至重链的CH2结构域。此外，全长抗体还可以含有可结晶片段(Fc)区。Fc区仅含有来自重链的恒定区(CH2和CH3)。相比之下，片段抗原结合区(Fab)可以包括重链和轻链二者的恒定结构域和可变结构域二者(VH、VL、CH1和CL)。片段可变区(Fv)仅含有两个可变结构域。
如上文所述，本公开文本的抗体可以包括一个或多个恒定区。抗体的“恒定区”是本领域熟知的术语，并且是指抗体的在不同分子之间的氨基酸序列中相对恒定的部分。通常，重链恒定区由三个不同的区域(称为CH1、CH2和CH3，按从氨基末端(N末端)到羧基末端(C末端)的方向编号)构成。典型的轻链仅具有一个恒定区，称为CL。抗体的恒定区决定其特定效应子功能。本领域技术人员将容易地理解抗体的恒定区的用辞和结构特征。
此外，本公开文本的抗PACAP抗体还包括特异性结合PACAP的抗原结合片段。如本文所用的抗原结合片段是指全长抗体的一部分。例如，在一些实施方案中，如本文所用的抗体的抗原结合片段是指全长抗体的抗原决定可变区。抗原结合片段的例子包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、单链Fv或scFv、二硫键连接的Fv、V-NAR结构域、IgNar、胞内抗体、IgGACH2、微抗体、F(ab')3、四抗体、三抗体、双抗体、单结构域抗体、DVD-Ig、Fcab、mAb2、(scFv)2或scFv-Fc。
在一个实施方案中，本公开文本的抗PACAP抗体是阻断性拮抗剂抗体，其抑制或降低PACAP的生物学活性。在一些实施方案中，阻断性抗体或拮抗剂抗体基本上或完全抑制PACAP的生物学活性。PACAP的生物学活性与其天然生物学活性相比可以降低10％、20％、30％、50％、70％、80％、90％、95％或甚至100％。例如可以在监测配体诱导的环腺苷一磷酸(cAMP)产生的基于细胞的测定中测量本公开文本的抗PACAP抗体拮抗PACAP的能力。在一些实施方案中，本发明的抗PACAP抗体拮抗PACAP诱导的人PACl、VPACl和/或VPAC2受体的激活。用于评估PACl、VPACl和/或VPAC2受体的激活的各种测定是本领域已知的，并且包括测量配体诱导的钙动员和cAMP产生的基于细胞的测定。示例性的基于细胞的cAMP测定描述于实施例5中并且如先前由Wang,Li等人2004所述。
术语“表位”或“抗原决定簇”在本文中可互换地使用，并且是指抗原的能够被特定抗体识别并且特异性结合的那部分。当抗原是多肽时，表位可以由通过蛋白质的三级折叠并列的连续氨基酸和非连续氨基酸二者形成。由连续氨基酸形成的表位通常在蛋白质变性时保留，而通过三级折叠形成的表位通常在蛋白质变性时丢失。
本文提供的抗体可以是单克隆抗体。“单克隆抗体”是指参与单个抗原决定簇或表位的高度特异性识别和结合的同质抗体群体。这与通常包括针对不同抗原决定簇的不同抗体的多克隆抗体形成对比。术语“单克隆抗体”涵盖全长和全长单克隆抗体以及抗原结合片段(如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)二者、单链(scFv)突变体、包含抗体部分的融合蛋白和包含抗原识别位点的任何其他经修饰的免疫球蛋白分子。此外，“单克隆抗体”是指以许多方式(包括但不限于通过杂交瘤、噬菌体选择、重组表达和转基因动物)制备的此类抗体。
本公开文本所涵盖的抗体可以是人的、非人的、人源化的、鼠的、嵌合的或表面重修的。在一些实施方案中，本公开文本的抗体可以是人源化抗体。如本文所用，人源化抗体是指衍生自最初在非人动物(如啮齿动物或兔)中产生的单克隆抗体的抗体。此单克隆抗体中的某些氨基酸残基(通常来自抗体的非抗原识别部分)被修饰为与相应同种型的人抗体中的相应残基同源。例如，可以使用各种方法通过将啮齿动物或兔可变区的至少一部分取代为人抗体的相应区域进行人源化(参见例如，美国专利号5,585,089和美国专利号5,693,762；Jones等人,1986,Nature 321:522-525；Riechmann等人,1988,Nature 332:323-27；和Verhoeyen等人,1988,Science 239:1534-1536)。
在一个实施方案中，本公开文本的抗体被工程化以含有重链/轻链可变框架区，其分别是如下所示的人基因VH：IGHV1-69*01/VK：IGKV4-1*01的产物或由所述人基因衍生。
表1
衍生自以上人种系的变体的例子可以具有包含相对于相应非人抗体的相应重链和/或轻链可变区的至少一个氨基酸修饰的重链和/或轻链可变框架区(例如，具有根据Kabat编号的在残基92-94处的“CAI”基序的重链变体)。
举例来说，抗PACAP抗体的序列提供于下表中。在一些实施方案中，本公开文本的抗PACAP抗体包含表2中提供的VH和VL CDR序列的组合。在一些实施方案中，所有CDR都是根据Kabat编号来定义的，除VH-CDR1(其是由AbM定义的)之外。
表2：CDR序列
在一些实施方案中，Xa包括V或L；并且Xb包括A或S。
在一些实施方案中，本公开文本的抗PACAP抗体包含分别在SEQ ID NO:9、2和3中所示的重链可变区(VH)-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3序列；以及分别在SEQ ID NO:10、5和6中所示的轻链可变区(VL)-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3序列。
在一些实施方案中，本公开文本提供了抗PACAP抗体，其具有分别在SEQ ID NO:1、2和3中所示的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3序列；以及包含1、2或3个保守氨基酸取代的变体。在其他实施方案中，本公开文本提供了其抗PACAP抗体，其具有分别在SEQ ID NO:7、2和3中所示的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3序列；以及包含7、2或3个保守氨基酸取代的变体。
在一些实施方案中，本公开文本提供了抗PACAP抗体或其抗原结合片段，所述抗PACAP抗体或其抗原结合片段具有分别在SEQ ID NO:4、5和6中所示的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3序列；以及包含4、5或6个保守氨基酸取代的变体。在其他实施方案中，本公开文本提供了抗PACAP抗体，其具有分别在SEQ ID NO:8、5和6中所示的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3序列；以及包含8、5或6个保守氨基酸取代的变体。
在一些示例性实施方案中，本公开文本提供了抗PACAP抗体，其具有分别在SEQ IDNO:1、2和3以及SEQ ID NO:4、5和6中所示的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3序列以及VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3序列。
在一些实施方案中，本公开文本的抗PACAP抗体包含分别在图8的SEQ ID NO:1、2、3和SEQ ID NO:4、5、6中所示的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3序列以及VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3序列。例如，所述CDR在图8中加下划线(所有CDR都是根据Kabat定义来定义的，除重链CDR-1是由AbM定义的之外)。
在其他示例性实施方案中，本公开文本提供了抗PACAP抗体，其具有分别在SEQ IDNO:7、2和3以及SEQ ID NO:8、5和6中所示的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3序列以及VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3序列。
在一些实施方案中，本公开文本的抗PACAP抗体包含分别在图9的SEQ ID NO:7、2、3和SEQ ID NO:8、5、6中所示的(VH)-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3序列以及(VL)-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3序列。例如，所述CDR在图9中加下划线(所有CDR都是根据Kabat定义来定义的，除重链CDR-1是由AbM定义的之外)。
在一些示例性实施方案中，本公开文本提供了抗PACAP抗体，其具有分别在SEQ IDNO:1、2和3以及SEQ ID NO:8、5和6中所示的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3序列以及VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3序列。
在一些实施方案中，本公开文本的抗PACAP抗体包含分别在图10的SEQ ID NO:1、2、3和SEQ ID NO:8、5、6中所示的(VH)-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3序列以及(VL)-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3序列。例如，所述CDR在图10中加下划线(所有CDR都是根据Kabat定义来定义的，除重链CDR-1是由AbM定义的之外)。
在又其他示例性实施方案中，本公开文本提供了抗PACAP抗体，其具有分别在SEQID NO:7、2和3以及SEQ ID NO:4、5和6中所示的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3序列以及VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3序列。
在一些实施方案中，本公开文本的抗PACAP抗体包含分别在图11的SEQ ID NO:7、2、3和SEQ ID NO:4、5、6中所示的(VH)-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3序列以及(VL)-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3序列。例如，所述CDR在图11中加下划线(所有CDR都是根据Kabat定义来定义的，除重链CDR-1是由AbM定义的之外)。
在一些实施方案中，本公开文本的抗PACAP抗体包含下表3-表5中提供的VH、VL和FR序列的组合。在一些实施方案中，本公开文本的抗PACAP抗体包含表3中提供的VH序列，其中VH序列具有在SEQ ID NO:11、12、18和19的残基1处的谷氨酰胺(Q)，而不是谷氨酸(E)。
表3：可变区重链(VH)序列
表4：可变区轻链(VL)序列
表5：框架区(FR)序列
FR ID 序列 SEQ ID NO
VRFR-1 EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKAS 29
VRFR-2 WVRQAPGQGLEWMGLI 30
VRFR-3 TRYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAI 31
VRFR-4 WGQGTLVTVSS 32
VLFR-1 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLL 33
VLFR-2 TYLNWLQQKPGQPPKRLIY 34
VLFR-3 GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC 35
VLFR-4 FGGGTKVEIK 36
此外，一些示例性抗PACAP抗体的重链和轻链恒定区序列提供于下表6-表7中。本公开文本的抗PACAP抗体的重链可以包含恒定区，如表6中所述的恒定区。在一些实施方案中，对恒定区进行免疫原性惰性的修饰，例如若干个经修饰的恒定区描述于表6中。例如，经修饰的恒定区可以在本文表6中列出的残基中，使用基于IgG1序列(即，SEQ ID NO:37)的EU编号。在一些实施方案中，本公开文本的抗PACAP抗体的重链恒定区可以是具有如表6中所述的IgG1的经修饰的恒定区的人重链。例如，IgG1的经修饰的恒定区可以是以下中的任一种：人IgG1FAB TAG、人IgG1KiH臼、人IgG1KiH杵、人IgG1(L235A，G237A)、人IgG1YTE、人IgG1(L235A，G237A，YTE)及其变体。在一些实施方案中，本公开文本的抗PACAP抗体的重链恒定区可以是具有如表6中所述的IgG2的经修饰的恒定区的人重链。例如，经修饰的恒定区重链可以是包含以下突变的人重链IgG2恒定区：A330P331至S330S331(参考野生型IgG2序列进行氨基酸编号，Eur.J.Immunol.(1999)29:2613-2624)，如表6中所述，SEQ ID:人IgG2DASS；SEQ ID NO:43。在一些实施方案中，本发明的抗PACAP抗体的重链恒定区可以是具有如表6中所述的IgG4的经修饰的恒定区的人重链。例如，IgG4的经修饰的恒定区可以是以下中的任一种：人IgG4KiH臼、人IgG4KiH杵、人IgG4(L235A，G237A)、人IgG4(L235E)、人IgG4YTE、人IgG4YTE KiH臼、人IgG4YTE KiH杵及其变体。
在仍其他实施方案中，可以将恒定区针对N-连接的糖基化进行去糖基化。在一些实施方案中，可以通过使寡糖附接残基(如Asn297)突变和/或侧接作为恒定区中的N-糖基化识别序列的一部分的残基将恒定区针对N-连接的糖基化进行去糖基化。在一些实施方案中，可以将恒定区针对N-连接的糖基化进行去糖基化。可以酶促地或通过在糖基化缺陷宿主细胞中表达将恒定区针对N-连接的糖基化进行去糖基化。
在仍其他实施方案中，本公开文本的抗体包含任何以上恒定区，如表6中所述的恒定区，其中恒定区序列可以进一步包含根据EU Fc编号的在位置447处的C末端赖氨酸(K)。
表6：重链恒定区序列
表7：轻链恒定区序列
在一些实施方案中，本公开文本的抗PACAP抗体包含分别在SEQ ID NO:29-32中所示的重链框架区(VHFR)-1、VHFR-2、VHFR-3和VHFR-4序列；以及分别在SEQ ID NO:33-36中所示的轻链框架区(VLFR)-1、VLFR-2、VLFR-3和VLFR-4序列。
在一些实施方案中，本公开文本的抗PACAP抗体包含与选自SEQ ID NO:11和12的序列约80％、约85％、约90％、约95％或约99％相同的VH序列，以及与选自SEQ ID NO:20和21的序列约80％、约85％、约90％、约95％或约99％相同的VL序列。在一些实施方案中，本公开文本的抗PACAP抗体包含选自SEQ ID NO:11和12的VH序列以及选自SEQ ID NO:20和21的VL序列。
在一些实施方案中，本公开文本的抗PACAP抗体包含分别与SEQ ID NO:11和20中所示的序列约80％、约85％、约90％、约95％或约99％相同的VH序列和VL序列。在其他实施方案中，本公开文本的抗PACAP抗体包含分别与SEQ ID NO:12和21中所示的序列约80％、约85％、约90％、约95％或约99％相同的VH序列和VL序列。在一些实施方案中，本公开文本的抗PACAP抗体包含分别与SEQ ID NO:11和21中所示的序列约80％、约85％、约90％、约95％或约99％相同的VH序列和VL序列。在其他实施方案中，本公开文本的抗PACAP抗体包含分别与SEQ ID NO:12和20中所示的序列约80％、约85％、约90％、约95％或约99％相同的VH序列和VL序列。
在一些示例性实施方案中，本公开文本的抗PACAP抗体包含分别在SEQ ID NO:11和20中所示的VH序列和VL序列。在一些示例性实施方案中，本公开文本的抗PACAP抗体包含分别在SEQ ID NO:11和20中所示的VH序列和VL序列，其中VH序列具有在SEQ ID NO:11的残基1处的谷氨酰胺(Q)，而不是谷氨酸(E)。
在一些实施方案中，本公开文本的抗PACAP抗体包含分别在图8的SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:20中提供的VH和VL氨基酸序列。例如，所述VH和VL在图8中加粗。
在其他示例性实施方案中，本公开文本的抗PACAP抗体包含分别在SEQ ID NO:12和21中所示的VH序列和VL序列。在其他示例性实施方案中，本公开文本的抗PACAP抗体包含分别在SEQ ID NO:12和21中所示的VH序列和VL序列，其中VH序列具有在SEQ ID NO:12的残基1处的谷氨酰胺(Q)，而不是谷氨酸(E)。
在一些实施方案中，本公开文本的抗PACAP抗体包含分别在图9的SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:21中提供的VH和VL氨基酸序列。例如，所述VH和VL在图9中加粗。
在一些示例性实施方案中，本公开文本的抗PACAP抗体包含分别在SEQ ID NO:11和21中所示的VH序列和VL序列。在一些示例性实施方案中，本公开文本的抗PACAP抗体包含分别在SEQ ID NO:11和21中所示的VH序列和VL序列，其中VH序列具有在SEQ ID NO:11的残基1处的谷氨酰胺(Q)，而不是谷氨酸(E)。
在一些实施方案中，本公开文本的抗PACAP抗体包含分别在图10的SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:21中提供的VH和VL氨基酸序列。例如，所述VH和VL在图10中加粗。
在其他示例性实施方案中，本公开文本的抗PACAP抗体包含分别在SEQ ID NO:12和20中所示的VH序列和VL序列。在其他示例性实施方案中，本公开文本的抗PACAP抗体包含分别在SEQ ID NO:12和20中所示的VH序列和VL序列，其中VH序列具有在SEQ ID NO:12的残基1处的谷氨酰胺(Q)，而不是谷氨酸(E)。
在一些实施方案中，本公开文本的抗PACAP抗体包含分别在图11的SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:20中提供的VH和VL氨基酸序列。例如，所述VH和VL在图11中加粗。
在一些实施方案中，本公开文本的抗PACAP抗体包含选自SEQ ID NO:37-51的重链恒定区序列以及选自SEQ ID NO:23和24的轻链恒定区序列。在某些示例性实施方案中，本公开文本的抗PACAP抗体包含SEQ ID NO:43中所示的重链恒定区序列和SEQ ID NO:23中所示的轻链恒定区序列。
当提及可变区中的残基(大约是轻链的残基1-107和重链的残基1-113)时，通常使用Kabat编号系统(例如，Kabat等人,Sequences of Immunological Interest.第5版Public Health Service,National Institutes of Health,马里兰州贝塞斯达(1991))。如在Kabat中的氨基酸位置编号是指Kabat等人,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第5版Public Health Service,National Institutes ofHealth,马里兰州贝塞斯达(1991)中的用于抗体汇编的重链可变区或轻链可变区的编号系统。根据此系统，重链可变区可以包括H2的残基52后的单个氨基酸插入(例如，根据Kabat的残基52a)和重链FR残基82后插入的残基(例如，残基82a、82b和82c等)。通过在抗体序列同源性区域处与“标准”Kabat编号序列比对可以确定给定抗体的残基的Kabat编号。Chothia替代地是指结构环的位置(Chothia和Lesk J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。当使用Kabat编号规则编号时，Chothia VH-CDR1环的末端在VH的位置32与34之间变化，这取决于环的长度(这是因为Kabat编号方案在VH的位置35A和35B处放置插入；如果35A和35B都不存在，则环在32处终止；如果仅存在35A，则环在33处终止；如果35A和35B二者都存在，则环在34处终止)。AbM高变区表示Kabat CDR与Chothia结构环之间的折衷，并且由OxfordMolecular的AbM抗体建模软件使用。
在VH CDR1的位置32(Kabat编号)处的残基对于具有低预测的免疫原性特征是至关重要的。因此，在一些实施方案中，本文提供的抗体包括在VH CDR1的位置32(Kaba编号)处的缬氨酸(V)或亮氨酸(L)。在一些实施方案中，本文提供的抗体不具有在VH CDR1的位置32(Kabat编号)处的丝氨酸(S)。
此外，在一些实施方案中，本文提供的抗体具有分别在VHFR-3的位置93和94(Kabat编号)处的丙氨酸-异亮氨酸(AI)。在一些实施方案中，本文提供的抗体不具有分别在VHFR-3的位置93和94(Kabat编号)处的丙氨酸-精氨酸(AR)。
另外，VL CDR2的位置50和51(Kabat编号)对于本文提供的抗体的低免疫原性特征也是至关重要的。因此，在一些实施方案中，本文提供的抗体包括分别在VL CDR2位置50和51(Kabat编号)处的色氨酸-丙氨酸(WA)。
在一些实施方案中，本公开文本还涵盖含有衍生自SEQ ID NO:19的VH序列和衍生自SEQ ID NO:22的VL序列的抗PACAP抗体。在一些实施方案中，抗PACAP抗体包括具有根据Kabat编号的在SEQ ID NO:19的残基32处的缬氨酸(V)或亮氨酸(L)的VH序列；以及具有根据Kabat编号的在SEQ ID NO:22的残基27E处的丙氨酸(A)和根据Kabat编号的分别在SEQID NO:22的残基50和51处的色氨酸(W)和丙氨酸(A)的VL序列。在某些实施方案中，本文提供的抗PACAP抗体进一步包括根据Kabat编号的在VH中的残基92-94处的半胱氨酸-丙氨酸-异亮氨酸(CAI)基序。参见图2A-图2B。
对于本文提供的所有抗体，恒定区和/或可变区编号可以根据(the international ImMunoGeneTics informationLefranc M P等人,NucleicAcids Res,27(1):209-12(1999)；Ruiz M等人,Nucleic Acids Res,28(1):219-21(2000)；Lefranc M P,Nucleic Acids Res,29(1):207-9(2001)；Lefranc M P,Nucleic AcidsRes,31(1):307-10(2003)；Lefranc M P等人,Dev Comp Immunol,29(3):185-203(2005)；Kaas Q等人,Briefings in Functional Genomics&Proteomics,6(4):253-64(2007))。
例如，在一些实施方案中，本公开文本进一步包括包含下表8中提供的VH和VL CDR序列的组合的抗PACAP抗体。在一些实施方案中，CDR序列是基于IMGT编号的。
表8：基于IMGT定义的CDR序列
在一些实施方案中，本文提供的抗PACAP抗体包括表8中提供的VH和VL CDR序列的组合，其中每个CDR序列都可以包括1、2或3个保守氨基酸取代。
在一些实施方案中，本公开文本的抗PACAP抗体包含分别在SEQ ID NO:61、52和55中所示的重链可变区(VH)-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3序列；以及分别在SEQ ID NO:62、53和57中所示的轻链可变区(VL)-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3序列；以及包含1、2或3个保守氨基酸取代的变体。
在一些实施方案中，本公开文本的抗PACAP抗体包含分别在SEQ ID NO:28、52和55中所示的重链可变区(VH)-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3序列；以及分别在SEQ ID NO:62、53和57中所示的轻链可变区(VL)-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3序列；以及包含1、2或3个保守氨基酸取代的变体。
此外，本公开文本的抗PACAP抗体还可以包括本文表9中提供的FR序列和如下文更详细地描述的变体。
表9：基于IMGT编号的框架区序列
对于本文提供的所有抗体，恒定结构域和/或可变结构域编号也可以根据“EU编号系统”(Edelman G M等人,Proc Natl Acad Sci USA,63(1):78-85(1969))。IGHG1的人CH1、铰链、CH2和CH3恒定区的完整对应可以在数据库(the internationalImMunoGeneTics informationLefranc M P等人,Nucleic Acids Rev,27(1):209-12(1999)；Ruiz M等人,Nucleic Acids Res,28(1):219-21(2000)；Lefranc M P,Nucleic Acids Res,29(1):207-9(2001)；Lefranc M P,Nucleic Acids Res,31(1):307-10(2003)；Lefranc M P等人,Dev Comp Immunol,29(3):185-203(2005))；Kaas Q等人,Briefings in Functional Genomics&Proteomics,6(4):253-64(2007))中找到。
例如，人κ免疫球蛋白轻链恒定结构域(IGKC)编号可以根据“EU编号系统”(Edelman G M等人,Proc Natl Acad Sci USA,63(1):78-85(1969))。人CK结构域的完整对应可以在IMGT数据库(the international ImMunoGeneTics informationLefranc M P等人,Nucleic Acids Rev,27(1):209-12(1999)；Ruiz M等人,Nucleic Acids Res,28(1)；219-21(2000)；Lefranc M P,Nucleic Acids Res,29(1):207-9(2001)；Lefranc M P,Nucleic Acids Res,31(1):307-10(2003)；Lefranc M P等人,DevComp Immunol,29(3):185-203(2005))；Kaas Q等人,Briefings in FunctionalGenomics&Proteomics,6(4):253-64(2007))中找到。
在一些实施方案中，本公开文本的抗PACAP抗体包含下表10中提供的重链和轻链全长序列的组合。在一些实施方案中，本公开文本的抗PACAP抗体包含表10中提供的重链全长序列，其中重链序列具有在SEQ ID NO:70、72、74和75的残基1处的谷氨酰胺(Q)，而不是谷氨酸(E)。在仍其他实施方案中，本公开文本的抗体包含表10中提供的重链全长序列，其中恒定区序列可以进一步包含根据EU Fc编号的在位置447处的C末端赖氨酸(K)。
表10：另外的抗体的全长序列
在一些实施方案中，本公开文本的抗PACAP抗体包含与SEQ ID NO:70、和72、74和75中所示的序列至少约80％、约85％、约90％、约95％、约99％相同的全长重链序列。在一些实施方案中，本公开文本的抗PACAP抗体包含与SEQ ID NO:71和73中所示的序列至少约80％、约85％、约90％、约95％、约99％相同的全长轻链序列。
在一些实施方案中，本公开文本的抗PACAP抗体包含分别与SEQ ID NO:70和71至少约80％、约85％、约90％、约95％、约99％相同的全长重链序列和全长轻链序列。
在一些实施方案中，本公开文本的抗PACAP抗体包含分别与SEQ ID NO:74和71至少约80％、约85％、约90％、约95％、约99％相同的全长重链序列和全长轻链序列。
在一些实施方案中，本公开文本的抗PACAP抗体包含分别与SEQ ID NO:75和71至少约80％、约85％、约90％、约95％、约99％相同的全长重链序列和全长轻链序列。
在一些实施方案中，本公开文本的抗PACAP抗体包含分别与SEQ ID NO:72和73至少约80％、约85％、约90％、约95％、约99％相同的全长重链序列和全长轻链序列。
在一些实施方案中，本公开文本的抗PACAP抗体包含分别与SEQ ID NO:70和73至少约80％、约85％、约90％、约95％、约99％相同的全长重链序列和全长轻链序列。
在一些实施方案中，本公开文本的抗PACAP抗体包含分别与SEQ ID NO:72和71至少约80％、约85％、约90％、约95％、约99％相同的全长重链序列和全长轻链序列。
在一些示例性实施方案中，本公开文本的抗PACAP抗体包含分别在SEQ ID NO:70和71中所示的全长重链序列和全长轻链序列。在一些实施方案中，本公开文本的抗PACAP抗体包含分别在图8的SEQ ID NO:70和SEQ ID NO:71中提供的重链和轻链全长氨基酸序列。例如，恒定区在图8中加点下划线。
在其他示例性实施方案中，本公开文本的抗PACAP包含分别在SEQ ID NO:72和73中所示的全长重链序列和全长轻链序列。在一些实施方案中，本公开文本的抗PACAP抗体包含分别在图9的SEQ ID NO:72和SEQ ID NO:73中提供的重链和轻链全长氨基酸序列。例如，恒定区在图9中加点下划线。
在一些示例性实施方案中，本公开文本的抗PACAP抗体包含分别在SEQ ID NO:70和73中所示的全长重链序列和全长轻链序列。在一些实施方案中，本公开文本的抗PACAP抗体包含分别在图10的SEQ ID NO:70和SEQ ID NO:73中提供的重链和轻链全长氨基酸序列。例如，恒定区在图10中加点下划线。
在又其他示例性实施方案中，本公开文本的抗PACAP抗体包含分别在SEQ ID NO:72和71中所示的全长重链序列和全长轻链序列。在一些实施方案中，本公开文本的抗PACAP抗体包含分别在图11的SEQ ID NO:71和SEQ ID NO:72中提供的重链和轻链全长氨基酸序列。例如，恒定区在图11中加点下划线。
在一些实施方案中，本公开文本的抗PACAP抗体包含上文提供的重链全长序列，其中重链序列具有在SEQ ID NO:70、72、74和75的残基1处的谷氨酰胺(Q)，而不是谷氨酸(E)。
如上文所讨论的，本公开文本涵盖本文公开的任何抗体或抗原结合片段的变体。多肽(如免疫球蛋白链(例如，VH、VL、HC或LC))的“变体”是指包含与本文所示的参考氨基酸序列至少约80％-99.9％(例如，80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％)相同或相似的氨基酸序列的多肽；当通过BLAST算法进行比较时，其中选择算法的参数以得到在相应参考序列的整个长度上相应序列之间的最大匹配。
如本文在两种或更多种核酸或蛋白质的上下文中所用的术语“同一性百分比”是指两个或更多个序列或子序列相同或具有指定百分比的相同核苷酸或氨基酸(例如，当在比较窗口或指定区域上比较和比对以获得最大对应时，在指定区域上的80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％或更高同一性)，如使用采用下述默认参数的BLAST或BLAST 2.0序列比较算法或通过手动比对和视觉检查测量的。参见例如，NCBI网址ncbi.nlm.nih.gov/BLAST。然后，此类序列被说成“基本上相同”。此定义也涉及或可以应用于序列的互补体。此定义还包括具有缺失和/或添加的序列以及具有取代的那些序列。可以在氨基酸的范围上计算序列同一性。例如，可以在长度为至少约20个氨基酸或核苷酸的区域上，或在长度为10-100个氨基酸或核苷酸的区域上，或在给定序列的整个长度上计算序列同一性。可以使用已公布的技术和广泛可用的计算机程序来计算序列同一性，所述计算机程序如GCS程序包(Devereux等人,Nucleic Acids Res.12:387,1984)、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul等人,J Mol Biol 215:403,1990)。可以使用序列分析软件采用其默认参数来测量序列同一性，所述序列分析软件如University of Wisconsin Biotechnology Center(大学大道1710号，威斯康星州麦迪逊，53705)的Genetics Computer Group的序列分析软件包。
“同一性”本身具有本领域公认的含义，并且可以使用已公布的技术计算。参见例如，COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY,Lesk,A.M.编辑,Oxford University Press,纽约,(1988)；BIOCOMPUTING:INFORMATICS AND GENOME PROJECTS,Smith,D.W.编辑,Academic Press,纽约,(1993)；COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA,PART I,Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编辑,Humana Press,新泽西州,(1994)；SEQUENCE ANALYSIS INMOLECULAR BIOLOGY,von Heinje,G.,Academic Press,(1987)；和SEQUENCE ANALYSISPRIMER,Gribskov,M.和Devereux,J.编辑,M Stockton Press,纽约,(1991)。虽然存在许多方法来测量两个多核苷酸或多肽序列之间的同一性，但术语“同一性”是熟练技术人员熟知的。(Carillo,H.和Lipton,D.,SIAM J.Applied Math.48:1073(1988))。通常用于确定两个序列之间的同一性或相似性的方法包括但不限于“Guide to Huge Computers,”MartinJ.Bishop编辑,Academic Press,圣地亚哥,(1994)以及Carillo,H.和Lipton,D.,SIAMJ.Applied Math.48:1073(1988)中公开的那些方法。用于比对多核苷酸或多肽的方法被编码在计算机程序中，所述计算机程序包括GCG程序包(Devereux,J.等人,Nucleic AcidsResearch 12(1):387(1984))、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul,S.F.等人,J.Mol.Biol.215:403(1990))、Bestfit程序(用于Unix的威斯康星序列分析包第8版，Genetics Computer Group，大学科技园，科学大道575号，威斯康星州麦迪逊53711(使用Smith和Waterman,Advances in Applied Mathematics 2:482 489(1981)的局部同源性算法)。
具有与本公开文本的查询氨基酸序列至少例如95％“相同”的氨基酸序列的多肽意图是主题多肽的氨基酸序列与查询序列相同，不同之处在于主题多肽序列可以包括查询氨基酸序列的每100个氨基酸的至多五个氨基酸改变。换言之，为了获得具有与查询氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列的多肽，参考序列中至多的5％的氨基酸残基可以被插入、缺失或被另一种氨基酸取代。参考序列的这些改变可以发生在参考氨基酸序列的氨基或羧基末端位置或这些末端位置之间的任何位置，单独地散布在参考序列中的残基之间，或者散布在参考序列内的一个或多个连续组中。实际上，可以使用已知的计算机程序确定任何特定多肽是否与本公开文本的多肽序列(例如，本文提供的抗PACAP抗体)至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％相同。
实际上，可以使用已知的计算机程序常规地确定任何特定多肽是否与例如表1-表10中的任一个所示的氨基酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％相同。可以使用上文提到的FASTDB计算机程序确定用于确定查询序列(本公开文本的序列)与参考序列之间的最佳总体匹配(也称为全局序列比对)的优选方法。在序列比对中，查询序列和参考序列二者都为氨基酸序列。所述全局序列比对的结果是以同一性百分比计的。在本公开文本的一个实施方案中，在氨基酸序列的FASTDB比对中用于计算同一性百分比的参数是：矩阵＝PAM 0，k元组＝2，不匹配罚分＝1，合并罚分(Joining Penalty)＝20，随机组长度＝0，截止值得分＝1，窗口尺寸＝序列长度，空位罚分＝5，空位尺寸罚分＝0.05，窗口尺寸＝500或主题氨基酸序列的长度，以较短者为准。
如果参考序列由于N末端或C末端缺失(而不是因为内部缺失)而比查询序列短，则必须对结果进行手动修正。这是因为当计算全局同一性百分比时，FASTDB程序不考虑参考序列的N末端和C末端截短。对于在N末端和C末端截短的参考序列，相对于查询序列，通过计算作为参考序列的N末端和C末端的查询序列的残基(其与相应的主题残基不匹配/对齐)数占查询序列的总碱基的百分比来修正同一性百分比。通过FASTDB序列比对的结果确定残基是否匹配/对齐。然后，从使用指定参数通过以上FASTDB程序计算得出的同一性百分比中减去此百分比，以得到最终同一性百分比得分。此最终同一性百分比得分是用于本公开文本的目的的同一性百分比得分。出于手动调整同一性百分比得分的目的，仅考虑与查询序列不匹配/对齐的参考序列的N末端和C末端的残基。也就是说，仅查询在参考序列的最远N末端和C末端残基之外的残基位置。
例如，将90个氨基酸残基的参考序列与100个残基的查询序列进行比对，以确定同一性百分比。缺失发生在参考序列的N末端，因此，FASTDB比对不显示N末端的前10个残基的匹配/比对。10个未配对的残基占序列的10％(不匹配的N末端和C末端的残基数/查询序列中残基的总数)，因此从通过FASTDB程序计算得出的同一性百分比得分中减去10％。如果剩余的90个残基是完美匹配的，则最终同一性百分比将是90％。在另一个例子中，将90个残基的参考序列与100个残基的查询序列进行比较。这次缺失是内部缺失，因此参考序列的N末端或C末端没有与查询序列不匹配/对齐的残基。在这种情况下，不用手动修正通过FASTDB计算得出的同一性百分比。再一次，只手动修正与查询序列不匹配/对齐的如FASTDB比对中所展示的参考序列的N末端和C末端之外的残基位置。
在所公开的同一性百分比的范围内，本公开文本还涉及本公开文本的所公开的多肽的取代变体。取代变体包括去除一个或多个氨基酸残基并且用替代残基替代的那些多肽。在一个方面，虽然如上文公开的同一性百分比与所鉴定的具体序列的总体序列相关，但要保持恒定并且不经受变化的氨基酸残基将是CDR的氨基酸残基，而框架的氨基酸残基将经受变化。例如，在一个具体实施方案中，当本公开文本的抗PACAP抗体包含至少一个含有与SEQ ID NO:11的氨基酸序列至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％相同的氨基酸序列的VH时，VH的CDR区将保持恒定并且允许框架区是可变的，条件是SEQ ID NO:11的总体同一性百分比落入实施方案的范围内。在一个方面，变化是在性质上保守的取代；然而，本公开文本涵盖也不保守的取代。出于本公开文本的目的的保守取代可以如下表11-表13中所列出的定义。氨基酸可以根据物理特性以及对二级和三级蛋白质结构的贡献进行分类。保守取代在本领域中被认为是一种氨基酸被另一种具有相似特性的氨基酸取代。下文列出了示例性保守取代。
表11：保守取代
可替代地，保守氨基酸可以如Lehninger(1975)Biochemistry,第二版；WorthPublishers,第71-77页中所述的进行分组，如下文所示。
表12：保守取代
此外，下文列出了仍其他替代示例性保守取代。
表13：保守取代
核酸
在上文的讨论中，本公开文本的一个方面涉及包括编码本公开文本的抗体的核酸序列的重组核酸。在一些实施方案中，本公开文本的重组核酸可以被配置为含有与异源核酸序列可操作地连接的这些核酸分子的表达盒或载体，所述异源核酸序列例如像允许抗体在宿主细胞中的体内表达的调节序列。
本公开文本的核酸分子可以具有任何长度，包括例如在约1Kb与约50Kb之间，例如在约1.2Kb与约10Kb之间、在约2Kb与约15Kb之间、在约5Kb与约20Kb之间、在约10Kb与约20Kb之间、在约5Kb与约40Kb之间、在约5Kb与约30Kb之间、在约5Kb与约20Kb之间或在约10Kb与约50Kb之间，例如在约15Kb至30Kb之间、在约20Kb与约50Kb之间、在约20Kb与约40Kb之间、在约5Kb与约25Kb之间或在约30Kb与约50Kb之间。
因此，在一些实施方案中，本文提供了包括编码本公开文本的抗体的核苷酸序列的核酸分子。在某些实施方案中，本文提供的核酸分子包括编码本文公开的任何多肽序列(例如，表1-表10中所述的那些多肽序列)的核苷酸序列。在一些实施方案中，核苷酸序列被掺入表达盒或表达载体中。熟练技术人员将理解的是，表达盒通常包括遗传物质的构建体，其含有抗体或其抗原结合片段的编码序列和足够的调节信息以引导编码序列在体内和/或离体在受体细胞中的适当转录和/或翻译。通常，表达盒可以被插入载体中用于靶向至所需宿主细胞和/或被插入个体中。因此，在一些实施方案中，本公开文本的表达盒包括本公开文本的抗体或其抗原结合片段的编码序列，其与表达控制元件(如启动子)以及任选的影响编码序列的转录或翻译的其他核酸序列中的任一种或组合可操作地连接。
表达盒可以作为线性或环状的单链或双链的DNA或RNA多核苷酸分子被插入质粒、粘粒、病毒、自主复制多核苷酸分子、噬菌体中，衍生自任何来源，能够进行基因组整合或自主复制，包括一个或多个核酸序列已经以功能上可操作的方式连接(例如，可操作地连接)的核酸分子。
在一些实施方案中，本公开文本的核酸分子被掺入表达载体中。本领域技术人员将理解的是，术语“载体”通常是指设计用于在宿主细胞之间转移并且可以用于将异源DNA转化(例如，引入)至宿主细胞中的目的的重组多核苷酸构建体。因此，在一些实施方案中，载体可以是复制子，如质粒、噬菌体或粘粒，可以将另一个DNA区段插入其中以导致所插入区段的复制。在一些实施方案中，表达载体可以是整合载体。
在一些实施方案中，表达载体可以是病毒载体。如本领域技术人员将了解的，术语“病毒载体”广泛用于指代包括通常促进核酸分子的转移或整合至细胞的基因组中的病毒来源的核酸元件的核酸分子(例如，转移质粒)，或者指代介导核酸转移的病毒颗粒。病毒颗粒将通常包括各种病毒组分，并且有时还包括除了一种或多种核酸以外的宿主细胞组分。术语病毒载体可以指代能够将核酸转移至细胞中的病毒或病毒颗粒或者指代所转移的核酸本身。病毒载体和转移质粒含有主要衍生自病毒的结构性和/或功能性遗传元件。术语“逆转录病毒载体”是指含有主要衍生自逆转录病毒的结构性和功能性遗传元件或其部分的病毒载体或质粒。术语“慢病毒载体”是指含有主要衍生自慢病毒(其为逆转录病毒的属)的结构性和功能性遗传元件或其部分(包括LTR)的病毒载体或质粒。
编码如本文所公开的抗体和抗原结合片段的核酸序列可以被优化以用于在目的宿主细胞中表达。例如，可以将序列的G-C含量调节至给定细胞宿主的平均水平，如参考宿主细胞中表达的已知基因所计算的。密码子使用优化的方法是本领域已知的。本文公开的抗体和抗原结合片段的编码序列内的密码子使用可以被优化以增强在宿主细胞中的表达，使得编码序列内约1％、约5％、约10％、约25％、约50％、约75％或高达100％的密码子已经被优化以用于在特定宿主细胞中表达。
本文还提供了含有编码如本文所公开的任何抗体或其抗原结合片段的一种或多种核酸分子的载体、质粒或病毒。核酸分子可以包含在载体内，所述载体能够引导所述核酸分子在例如已经用载体转化/转导的细胞中表达。用于真核细胞和原核细胞的合适载体是本领域已知的，并且是可商购的或容易由熟练技术人员制备的。参见例如，Sambrook,J.和Russell,D.W.(2012).Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第4版).纽约州冷泉港:Cold Spring Harbor Laboratory以及Sambrook,J.和Russel,D.W.(2001).MolecularCloning:A Laboratory Manual(第3版).纽约州冷泉港:Cold Spring Harbor Laboratory(在本文中统称为“Sambrook”)；Ausubel,F.M.(1987).Current Protocols in MolecularBiology.纽约州纽约:Wiley(包括至2014年的增刊)；Bollag,D.M.等人(1996).ProteinMethods.纽约州纽约:Wiley-Liss；Huang,L.等人(2005).Nonviral Vectors for GeneTherapy.圣地亚哥:Academic Press；Kaplitt,M.G.等人(1995).Viral Vectors:GeneTherapy and Neuroscience Applications.加利福尼亚州圣地亚哥:Academic Press；Lefkovits,I.(1997).The Immunology Methods Manual:The Comprehensive Sourcebookof Techniques.加利福尼亚州圣地亚哥:Academic Press；Doyle,A.等人(1998).Cell andTissue Culture:Laboratory Procedures in Biotechnology.纽约州纽约:Wiley；Mullis,K.B.,Ferré,F.和Gibbs,R.(1994).PCR:The Polymerase ChainReaction.Boston:Birkhauser Publisher；Greenfield,E.A.(2014).Antibodies:ALaboratory Manual(第2版).纽约州纽约:Cold Spring Harbor Laboratory Press；Beaucage,S.L.等人(2000).Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry.纽约州纽约:Wiley(包括至2014年的增刊)；以及Makrides,S.C.(2003).Gene Transfer andExpression in Mammalian Cells.荷兰阿姆斯特丹:Elsevier Sciences B.V.，将其公开内容通过引用并入本文。
DNA载体可以经由常规转化或转染技术被引入细胞(例如，真核细胞)中。用于转化或转染宿主细胞的合适方法可以在Sambrook等人(2012,同上)和其他标准分子生物学实验室手册中找到，如磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、转染、显微注射、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、划痕负载、弹道引入、核穿孔、流体动力冲击和感染。
可以在本公开文本中使用的病毒载体包括例如逆转录病毒载体、腺病毒载体和腺相关病毒载体、慢病毒载体、疱疹病毒、猿猴病毒40(SV40)和牛乳头瘤病毒载体(参见例如，Gluzman(编辑),Eukaryotic Viral Vectors,CSH Laboratory Press,纽约州冷泉港)。
例如，如本文所公开的抗体或其抗原结合片段可以在真核宿主(如哺乳动物细胞(例如，COS细胞、NIH 3T3细胞或HeLa细胞))中产生。这些细胞可从包括美国典型培养物保藏中心(弗吉尼亚州马纳萨斯)在内的许多来源获得。在选择表达系统时，唯一重要的是组分彼此相容。技术人员或普通技术人员能够做出这样的决定。此外，如果在选择表达系统时需要指导，熟练技术人员可以查阅P.Jones,“Vectors:Cloning Applications”,JohnWiley and Sons,纽约州纽约,2009。
所提供的核酸分子可以含有天然存在的序列，或者与天然存在的那些序列不同但由于遗传密码的简并性而编码相同多肽(例如，抗体)的序列。这些核酸分子可以由RNA或DNA(例如，基因组DNA、cDNA或合成DNA(如通过基于亚磷酰胺的合成产生的DNA))或这些类型的核酸内的核苷酸的组合或修饰组成。另外，核酸分子可以是双链的或单链的(例如，有义链或反义链)。
核酸分子并不限于编码多肽(例如，抗体)的序列；也可以包括位于编码序列(例如，抗体的编码序列)上游或下游的一些或全部非编码序列。分子生物学领域的普通技术人员熟悉用于分离核酸分子的常规程序。在核酸分子是核糖核酸(RNA)的情况下，分子可以例如通过体外转录产生。
重组细胞和细胞培养物
本公开文本的核酸可以被引入宿主细胞(例如像中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)中，以产生含有核酸分子的工程化重组细胞。将本公开文本的核酸分子(例如，DNA或RNA，包括mRNA)或载体引入细胞中可以通过本领域技术人员已知的方法来实现，所述方法例如像病毒感染、转染、缀合、原生质体融合、脂转染、电穿孔、核转染、磷酸钙沉淀、聚乙烯亚胺(PEI)介导的转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质体介导的转染、粒子枪技术、磷酸钙沉淀、直接显微注射、纳米颗粒介导的核酸递送。例如，用于将异源核酸分子引入哺乳动物细胞中的方法是本领域已知的，并且包括葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、聚凝胺介导的转染、原生质体融合、电穿孔、一种或多种核酸分子在脂质体中的封装、脂质纳米颗粒技术、基因枪注射和将DNA直接显微注射至细胞核中。另外，核酸分子可以通过病毒载体(如慢病毒或腺相关病毒)被引入哺乳动物细胞中。如下文更详细地讨论的，在一些实施方案中，本公开文本的抗体或其抗原结合片段可以以核酸形式(例如，DNA或RNA，包括mRNA)被引入受试者中，使得受试者的自身细胞产生抗体。本公开文本进一步提供了对编码本文所述的抗CoV-S抗体的核苷酸序列的修饰，其导致增加的抗体表达、增加的抗体稳定性、增加的核酸(例如，mRNA)稳定性或者改进的抗体对CoV刺突蛋白的亲和力或特异性。
因此，在一些实施方案中，核酸分子可以通过本领域已知的病毒或非病毒递送媒介物来递送。例如，核酸分子可以稳定地整合在宿主基因组中，或者可以以附加体复制，或者作为微环表达载体存在于重组宿主细胞中以用于瞬时表达。因此，在一些实施方案中，核酸分子在重组宿主细胞中作为附加体单元维持和复制。在一些实施方案中，核酸分子稳定地整合到重组细胞的基因组中。稳定整合可以使用经典随机基因组重组技术或者用更精确的技术来实现，所述更精确的技术如指导RNA引导的CRISPR/Cas基因组编辑，或采用NgAgo(格氏嗜盐碱杆菌(Natronobacterium gregoryi)阿尔古蛋白(Argonaute))的DNA指导的核酸内切酶基因组编辑，或TALEN基因组编辑(转录激活因子样效应物核酸酶)。在一些实施方案中，核酸分子作为微环表达载体存在于重组宿主细胞中以用于瞬时表达。
核酸分子可以被封装在病毒衣壳或脂质纳米颗粒中，或者可以通过本领域已知的病毒或非病毒递送手段和方法(如电穿孔)来递送。例如，将核酸引入细胞中可以通过病毒转导来实现。在一个非限制性例子中，腺相关病毒(AAV)被工程化以经由病毒转导将核酸递送至靶细胞。已经描述了若干种AAV血清型，并且所有已知的血清型都可以感染来自多种不同组织类型的细胞。AAV能够在体内转导广泛的物种和组织，而没有毒性迹象，并且它产生相对温和的先天性和适应性免疫应答。
慢病毒来源的载体系统也可用于经由病毒转导进行核酸递送和基因疗法。慢病毒载体作为基因递送媒介物提供了若干种有吸引力的特性，包括：(i)通过将载体稳定整合到宿主基因组中进行持续的基因递送；(ii)能够感染分裂细胞和非分裂细胞二者；(iii)具有广泛的组织嗜性，包括重要的基因疗法靶细胞类型和细胞疗法靶细胞类型；(iv)在载体转导后不表达病毒蛋白；(v)能够递送复杂遗传元件，如多顺反子序列或含内含子的序列；(vi)具有可能更安全的整合位点特征；以及(vii)为相对容易的用于载体操纵和产生的系统。
在一些实施方案中，宿主细胞可以被例如本申请的载体构建体基因工程化(例如，转导或转化或转染)，所述载体构建体可以是例如包括与宿主细胞的基因组的一部分同源的核酸序列的病毒载体或用于同源重组的载体，或者可以是用于目的多肽的表达的表达载体。可以使用已知方法制备和纯化本发明的抗体。例如，可以使用已知方法将编码HC(例如由SEQ ID NO.70给出的氨基酸序列)和LC(例如，由SEQ ID NO.71给出的氨基酸序列)的cDNA序列克隆和工程化到表达载体中。然后可以将工程化免疫球蛋白表达载体稳定转染到工程化细胞中。
在一些实施方案中，工程化细胞是真核细胞。在一些实施方案中，工程化细胞是动物细胞。在一些实施方案中，动物细胞是脊椎动物的动物细胞或无脊椎动物的动物细胞。在一些实施方案中，动物细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，动物细胞是人细胞。在一些实施方案中，动物细胞是非人动物细胞。在一些实施方案中，工程化细胞是非人灵长类动物细胞。在一些实施方案中，工程化细胞选自幼仓鼠肾(BHK)细胞、中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)、非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)、人A549细胞、人宫颈细胞、人CHME5细胞、人PER.C6细胞、NS0鼠骨髓瘤细胞、人表皮样喉细胞、人成纤维细胞、人HEK-293细胞、人HeLa细胞、人HepG2细胞、人HUH-7细胞、人MRC-5细胞、人肌细胞、小鼠3T3细胞、小鼠结缔组织细胞、小鼠肌细胞和兔肾细胞。在一些实施方案中，工程化细胞是毕赤酵母(Pichia pastoris)细胞或酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞，二者都还适用于产生本发明所述的抗体。
在另一个方面，本文提供了包括至少一种如本文所公开的重组细胞和培养基的细胞培养物。通常，培养基可以是用于培养本文所述的细胞的任何合适的培养基。用于转化各种各样的上文提到的宿主细胞和物种的技术是本领域已知的并且描述于技术和科学文献中。因此，包括至少一种如本文所公开的重组细胞的细胞培养物也在本申请的范围内。适用于产生和维持细胞培养物的方法和系统是本领域已知的。
在一些实施方案中，本公开文本提供了用于产生如本文所述的抗体或其抗原结合片段的方法。所述方法可以包括将本文所述的工程化或重组细胞在足以使细胞产生抗体或其抗原结合片段的条件下培养。
在另一个方面，还提供了包括如本文所公开的重组核酸或载体的动物。在一些实施方案中，本公开文本提供了作为非人动物的转基因动物。在一些实施方案中，转基因动物产生如本文所公开的抗体或抗原结合片段。
使用本领域已知的用于将外源核酸引入非人动物的基因组中的标准方法来制备本公开文本的转基因非人宿主动物。在一些实施方案中，本公开文本的非人动物是小鼠。适用于本公开文本的组合物和方法的其他动物物种包括这样的动物，其(i)适用于转基因作用，并且(ii)能够将免疫球蛋白基因区段重排以产生抗体应答。此类物种的例子包括但不限于大鼠、兔、鸡、山羊、猪、绵羊和牛。用于制备转基因非人动物的方式和方法是本领域已知的。示例性方法包括原核显微注射、DNA显微注射、慢病毒载体介导的将DNA转移至早期胚胎中和精子介导的转基因作用、腺病毒介导的将DNA引入动物精子中(例如，在猪中)、逆转录病毒载体(例如，鸟类物种)、体细胞核转移(例如，在山羊中)。转基因家畜农场动物的制备的最新技术综述于Niemann,H.等人(2005)Rev.Sci.Tech.24:285-298中。
在一些实施方案中，动物是脊椎动物或无脊椎动物。在一些实施方案中，动物是哺乳动物受试者。在一些实施方案中，哺乳动物是非人动物。在一些实施方案中，本公开文本的转基因动物可以使用经典随机基因组重组技术或者用更精确的技术来制备，所述更精确的技术如指导RNA引导的CRISPR/Cas基因组编辑，或采用NgAgo(格氏嗜盐碱杆菌阿尔古蛋白)的DNA指导的核酸内切酶基因组编辑，或TALEN基因组编辑(转录激活因子样效应物核酸酶)。在一些实施方案中，本公开文本的转基因动物可以使用转基因显微注射技术来制备，并且不需要使用同源重组技术，因此被认为比使用同源重组的方法更易于制备和选择。
在另一个方面，本文提供了用于产生抗体或其抗原结合片段的方法，其中所述方法包括使(i)如本文所公开的转基因动物，或(ii)如本文所公开的重组细胞在使得产生抗体或抗原结合片段的条件下生长。
在一些实施方案中，如本文所述的用于产生抗体或其抗原结合片段的方法进一步包括从(i)转基因动物或(ii)重组细胞和/或培养重组细胞的培养基中分离所产生的抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，哺乳动物是非人灵长类动物。因此，通过本文公开的方法产生的抗体或抗原结合片段也在本公开文本的范围内。
药物组合物
本公开文本的抗PACAP抗体、核酸可以被掺入组合物(包括药物组合物)中。
在另一个方面，本公开文本的抗体、核酸可以被掺入适用于各种下游应用的组合物(例如，药物组合物)中。本公开文本的示例性组合物包括药物组合物，其通常包括抗体、核酸中的一种或多种以及药学上可接受的赋形剂(例如，载剂)。在一些实施方案中，组合物是无菌组合物。在一些实施方案中，组合物被配制为疫苗。在一些实施方案中，组合物进一步包括佐剂。
本文提供的药物组合物可以呈允许将组合物施用至个体的任何形式。在一些具体实施方案中，药物组合物适用于人类施用。本公开文本的范围包括包含抗CoV-S抗原结合多肽(例如，抗体或其抗原结合片段(例如，表1的))的烘干的(例如，冷冻干燥的)组合物，或者其包括药学上可接受的载剂但基本上不含水的药物组合物。如本文所用，术语“药学上可接受的”意指由联邦政府或州政府的管理机构批准的或者在美国药典或其他公认药典中列出用于动物、更特别是用于人的。载剂可以是与药物组合物一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。盐水溶液以及水性右旋糖和甘油溶液也可以用作液体载剂，包括可注射溶液。合适的赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化钠、脱脂乳、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。合适的药物载剂的例子由E.W.Martin描述于“Remington's Pharmaceutical Sciences”中。在一些实施方案中，药物组合物被无菌配制用于施用至个体或动物(一些非限制性例子包括人或哺乳动物)。在一些实施方案中，个体是人。
在一些实施方案中，本公开文本的药物组合物被配制成适用于施用至个体的预期途径。例如，药物组合物可以被配制成适用于肠胃外、腹膜内、结直肠、腹膜内和肿瘤内施用。在一些实施方案中，药物组合物可以被配制用于口服、直肠、经粘膜、肠、肠胃外、肌内、皮下、真皮内、髓内、鞘内、直接心室内、静脉内、腹膜内、鼻内、眼内、吸入、吹入、局部、皮肤、透皮或动脉内施用。本领域普通技术人员将了解配制品应当适于施用方式。
例如，适用于注射使用的药物组合物包括无菌水性溶液或分散体，以及用于无菌可注射溶液或分散体的临时制备的无菌粉末。对于静脉内施用，合适的载剂包括生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF，新泽西州帕西波尼)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在一些实施方案中，组合物应当是无菌的并且应当是易于注射的程度的流体。它可以在制造和储存的条件下被稳定，并且可以抵抗微生物(如细菌和真菌)的污染作用而被保存。载剂可以是溶剂或分散介质，所述溶剂或分散介质含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。例如，可以通过使用包衣(如卵磷脂)、通过在分散体的情况下维持所需的粒度以及通过使用表面活性剂(例如，十二烷基硫酸钠)来维持适当的流动性。防止微生物的作用可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等)来实现。在许多情况下，组合物中通常将包括等渗剂，例如糖、多元醇(如甘露醇、山梨醇)和/或氯化钠。通过在组合物中包括延迟吸收的药剂(例如，单硬脂酸铝和明胶)，可以实现可注射组合物的延长吸收。
无菌可注射溶液可以通过以下方式制备：将活性化合物以所需量掺入视需要具有上文所列举成分中的一种或组合的适当溶剂中，然后过滤灭菌。通常，通过将活性化合物掺入无菌媒介物中来制备分散体，所述无菌媒介物含有基础分散介质和来自上文所列举的那些成分的所需其他成分。
方法
本公开文本尤其进一步提供了治疗或预防个体的病症(如本文所述的那些病症)的方法。在一些实施方案中，本发明可以包括治疗或预防任何方面的PACAP相关病症的方法，所述PACAP相关病症如头痛、偏头痛、丛集性头痛和/或难治性偏头痛、焦虑、抑郁、PTSD、伴有头痛(例如，偏头痛、丛集性头痛、难治性偏头痛)的共病病症(例如，焦虑/抑郁/PTSD)、伴有偏头痛的共病焦虑障碍、复杂性区域性疼痛综合征和玫瑰痤疮。例如，在头痛或偏头痛治疗的上下文中，这包括减轻严重程度、缓解疼痛强度(例如，头痛，即头部疼痛)和其他相关症状、降低复发频率、提高患有头痛的这些人的生活质量以及减少治疗头痛所需的其他药物的剂量。对于偏头痛，其他相关症状包括但不限于恶心、呕吐以及对光、声音和/或运动的敏感性。对于丛集性头痛，其他相关症状包括但不限于眼下或眼周肿胀、眼泪过多、红眼、鼻漏或鼻塞以及脸部发红。
本文进一步提供的包括用于减轻个体的病症(如本文所述的那些病症)的症状的方法。症状的“减轻”意指一种或多种症状的严重程度或频率的降低或者一种或多种症状的消除。因此，如本文所用，术语“降低发生率”、“预防(prophylaxis)”或“预防(prevention)”意指降低特定疾病、病症、症状或障碍(术语疾病、病症和障碍贯穿本申请可互换地使用)的严重程度。严重程度的降低包括通过例如减少对药物或疗法的需求、量和/或暴露来减少通常用于病症的药物和/或疗法。严重程度的降低还包括降低特定病症、症状或障碍的持续时间和/或频率(包括例如延迟或增加个体到下一次阵发性发作的时间)。
此外，本公开文本提供了改善个体的病症(如本文所述的那些病症)的方法。改善病症(诸如如本文所述的头痛或偏头痛或其他PACAP相关病症的一种或多种症状)意指与不施用抗PACAP拮抗剂抗体相比，减轻或改善病症(例如，头痛或偏头痛)的一种或多种症状。改善还可以包括缩短或降低症状的持续时间。
在一些实施方案中，本公开文本进一步提供了控制个体的病症(如本文所述的那些病症)的方法。如本文所用，“控制头痛”或“控制偏头痛”或“控制”另一种PACAP相关病症是指维持或降低个体的病症(例如，头痛、偏头痛)的一种或多种症状的严重程度或持续时间、或者头痛或偏头痛的发作频率(与治疗前的水平相比)。例如，与治疗前的水平相比，个体的头部疼痛的持续时间或严重程度或发作频率被降低至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％中的任一个。头部疼痛的持续时间或严重程度或发作频率的降低可以持续任何时间长度，例如2周、4周(1个月)、8周(2个月)、12周(3个月)、4个月、5个月、6个月、9个月、12个月等。
如本文所用，“延迟”病症(例如，PACAP相关病症，如偏头痛或头痛)的发展意指推迟、阻碍、减慢、减缓、稳定和/或延迟病症或疾病的进展。此延迟可以具有不同的时间长度，这取决于病症或疾病的病史和/或所治疗的个体。正如本领域技术人员所清楚的，足够或显著的延迟实际上可以涵盖预防，因为个体不会患上头痛(例如，偏头痛)。“延迟”症状的发展的方法是当与不使用所述方法相比时，在给定时间范围内减小症状发展概率和/或在给定时间范围内降低症状程度的方法。此类比较通常是基于临床研究的，使用统计学上显著数量的受试者。
病症(例如，如本文所述的PACAP相关病症)的“发展”或“进展”意指障碍或症状或这样的障碍的副作用(如畏光或厌光)的初始表现和/或随之而来的进展。可以使用如本领域熟知的标准临床技术来检测和评估头痛或偏头痛的发展。然而，发展也指代可能无法检测到的进展。出于本公开文本的目的，发展或进展是指症状的生物学过程。“发展”包括发生、复发和发作。如本文所用，病症(如头痛或偏头痛)的“发作”或“发生”包括初始发作和/或复发。病症可以是例如原发性头痛或继发性头痛。原发性头痛包括例如有先兆偏头痛、无先兆偏头痛、偏瘫性偏头痛、阵发性偏头痛、慢性偏头痛、腹部偏头痛、丛集性头痛、紧张性头痛、正头痛、阵发性偏头痛和连续性偏头痛。继发性头痛包括例如由于稳态的失调而导致的头痛(如归因于自主神经反射异常的头痛)、伴有偏头痛的共病焦虑障碍和复杂性区域性疼痛综合征。此外，所述受试者可以患有选自以下的病症：偏头痛、头痛和疼痛相关疾病或病症(如丛集性头痛和/或难治性偏头痛)、焦虑、抑郁、PTSD、伴有头痛(例如，偏头痛、丛集性头痛、难治性偏头痛)的共病病症(例如，焦虑/抑郁/PTSD)、伴有偏头痛的共病焦虑障碍、复杂性区域性疼痛综合征和玫瑰痤疮。在一些实施方案中，头痛可以选自有先兆偏头痛、无先兆偏头痛、偏瘫性偏头痛、丛集性头痛、神经性偏头痛、慢性头痛、阵发性偏头痛、慢性偏头痛、药物过度使用性头痛和紧张性头痛。
在其他实施方案中，个体可以患有此处未列出但被认为需要通过本文所述的抗体或药物组合物治疗的病症。
偏头痛是一种慢性阵发性神经系统障碍，其特征在于中度或重度头痛以及可逆的神经系统和全身性症状的发作。与偏头痛相关的最具特征性的症状包括但不限于畏光、畏声和胃肠道症状(如恶心和呕吐)。相比之下，头痛通常是指头部任何区域的疼痛。头痛可以发生在头部的一侧或两侧，被隔离到某个位置，从一个点辐射到整个头部，或者具有虎钳样特征(vise-like quality)。头痛可以是锐痛、悸动的感觉或钝痛。头痛可以逐渐出现或突然出现，并且它们可以持续不到一小时或持续几天。
国际头痛协会(IHS)将偏头痛定义为在持续4-72小时的发作中表现出的一种复发性头痛障碍。头痛的典型特征是单侧位置、脉动特征、中度或重度强度、因常规体力活动加重以及与恶心和/或畏光和畏声相关。(Headache Classification Subcommittee of theInternational Headache Society(2018).The international classification ofheadache disorders第3版Cephalalgia 38:1-211)。根据IHS头痛分类委员会，偏头痛有两种主要类型：1)无先兆偏头痛，它是一种临床综合征，其特征在于具有具体特征和相关症状的头痛；以及2)有先兆偏头痛，其主要特征在于通常在头痛之前或有时伴随头痛的瞬时局灶性神经系统症状。
有先兆偏头痛(也称为典型偏头痛)包括诸如通常逐渐发展并且通常然后是头痛的单侧完全可逆的视觉、感觉或其他中枢神经系统症状的反复发作等症状以及相关偏头痛症状。这些发作通常持续数分钟。偏头痛可以是慢性的。此外，慢性偏头痛还可以包括偏头痛的阵发性子类型。慢性偏头痛每月发生15天或更长时间，持续超过三个月，其每月至少八天具有偏头痛头痛的特征。
另外，本文提供的方法可以用于治疗患有丛集性头痛的个体。丛集性头痛的症状包括但不限于重度严格单侧疼痛的发作，所述疼痛在眼眶、眼眶上、颞部或这些部位的任何组合中，持续15-180分钟，并且从每隔一天发生一次至一天发生八次。疼痛与同侧结膜注射、流泪、鼻塞、鼻溢、额头和面部出汗、缩瞳、上睑下垂和/或眼睑水肿相关，和/或与躁动或激越相关。
丛集性头痛可以是阵发性的或慢性的。阵发性丛集性头痛可以是在持续从七天至一年的时间段内发生的发作，由持续至少三个月的无痛期隔开。例如，阵发性丛集性头痛可以表现为在持续从七天至一年的时间段内发生的发作，由持续至少三个月的无痛期隔开。此外，根据国际头痛疾病分类第3版，阵发性丛集性头痛也可以表现为持续从七天至一年的至少两个丛集性时间段(未经治疗时)，并且由≥3个月的无痛缓解期隔开。相比之下，慢性丛集性头痛可以是持续一年或更长时间发生而无缓解或有持续不到三个月的缓解期的发作。
术语难治性偏头痛或耐药性偏头痛已经被用于描述难以治疗或对标准和/或积极治疗没有反应的持续性头痛。在一些实施方案中，如本文所用的难治性偏头痛需要两种至四种适用的预防性药物或预防性药物类别的先前治疗的失败。在某些实施方案中，如本文所用的难治性偏头痛需要两种至三种、至少两种、至少三种、至少四种、多于两种或多于三种适用的预防性药物或预防性药物类别的先前治疗的失败。
如本文所用，“没有反应”或“治疗失败”是指在标准药物治疗方案后，预防性药物或预防性药物类别缺乏降低患者的偏头痛头痛的频率、持续时间和/或严重程度的功效，或者当治疗(例如，用预防性药物或预防性药物类别)由于不良事件使患者对其不耐受而不得不被中断时，或者药物对患者而言是禁忌的或不适用于患者。
预防性药物可以被分为若干种类别。例如，这些类别包括以下集群：集群A，抗癫痫药；集群B，β阻断剂；集群C，三环抗抑郁药；集群D，钙通道阻断剂；集群E，血管紧张素II受体拮抗剂；集群F，肉毒杆菌毒素；以及集群G，降钙素基因相关肽(CGRP)途径单克隆抗体。在一些实施方案中，如本文所用的难治性偏头痛需要两种至四种的上述集群中的任一种的先前治疗的失败。在某些实施方案中，如本文所用的难治性偏头痛需要两种至三种、至少两种、至少三种、至少四种、多于两种或多于三种的上述集群中的任一种的先前治疗的失败。
示例性抗癫痫药包括双丙戊酸盐、丙戊酸钠、丙戊酸盐、丙戊酸、托吡酯和加巴喷丁。示例性β阻断剂包括普萘洛尔、噻吗洛尔、阿替洛尔、美托洛尔、纳多洛尔和比索洛尔。示例性三环抗抑郁药包括阿米替林、去甲替林、多塞平和氟西汀。示例性钙通道阻断剂包括氟桂利嗪。示例性血管紧张素II受体拮抗剂包括坎地沙坦。下文描述了抗CGRP途径单克隆抗体。例如，降钙素基因相关肽(CGRP)途径单克隆抗体可以包括抗CGRP抗体、抗CGRP受体(CGRP-R)抗体或二者。在一个示例性实施方案中，抗CGRP抗体是瑞玛奈珠单抗。在另一个实施方案中，抗CGRP抗体是伽奈珠单抗。在一个实施方案中，抗CGRP抗体是依普奈珠单抗。示例性抗CGRP-R抗体包括厄瑞努单抗。
在某些实施方案中，用于偏头痛的适用的预防性药物不包括急性治疗。在其他实施方案中，如本公开文本所涵盖的难治性偏头痛需要两种至四种、三种至四种、至少两种或至少三种预防性药物类别(如通过美国头痛协会(AHS)的难治性头痛专家小组(RefractoryHeadache Special Interest Section，RHSIS)定义的)的失败。在此定义下的一些情形下，个体需要3种预防性治疗类别的失败。
此外，药理学上顽固的头痛的定义已经由Silberstein SD等人(2010)(Definingthe pharmacologically intractable headache for clinical trials and clinicalpractice.Headache50(9):1499-1506)提出。此定义建立在AHS标准的基础上，提出了对急性和预防性治疗的顽固性的分级分类方案以及对与头痛相关的残疾的评级。具体而言，此定义提出了I类(轻度)顽固性头痛，对2种不同的非特异性急性治疗类别(例如，非甾体类抗炎药(NSAID)、组合镇痛药)没有足够的反应；II类(中度)顽固性头痛，I类加上对曲坦类或麦角衍生物(如二氢麦角胺(DHE))没有反应；以及III类(重度)顽固性头痛，I类和II类加上对以足够剂量和适当配方的口服或肠胃外阿片类或皮质类固醇或肠胃外多巴胺拮抗剂没有反应。
此外，欧洲头痛联盟(EHF)在2014年就慢性偏头痛(CM)的定义提供了共识声明。这些标准局限于CM，并且需要三种预防性治疗类别的失败。它们还需要多学科团队(如果有的话)对精神病或其他共病进行充分治疗。在一些方面，急性治疗和残疾程度不被包括在这些标准内。因此，当提及难治性或耐药性偏头痛时，本公开文本旨在包括所有以上定义。
在其他实施方案中，本公开文本进一步提供了治疗或预防个体的头痛的方法。在一些实施方案中，头痛是偏头痛。在一些实施方案中，本公开文本进一步提供了治疗或预防个体的偏头痛的方法。在一些实施方案中，本公开文本进一步提供了治疗或预防阵发性偏头痛的方法。在一些实施方案中，本公开文本进一步提供了治疗或预防慢性偏头痛的方法。在一些实施方案中，头痛是丛集性头痛。在一些实施方案中，头痛是阵发性丛集性头痛。在一些实施方案中，头痛是慢性丛集性头痛。在进一步的实施方案中，本公开文本进一步提供了治疗或预防个体的难治性或耐药性偏头痛的方法。在另外的实施方案中，本公开文本提供了治疗被诊断患有偏头痛的个体的方法，所述个体对至少两种、至少三种、两种至三种、两种至四种、多于两种、多于三种或高达四种用于偏头痛的先前预防性疗法没有反应(即，难治性偏头痛)。
在一些实施方案中，本文提供的治疗或预防方法包括向个体施用治疗有效量的本文所述的抗PACAP抗体或药物组合物。
在某些实施方案中，待治疗或预防的病症是偏头痛或难治性偏头痛。在其他实施方案中，待治疗或预防的病症是阵发性偏头痛。在其他实施方案中，待治疗或预防的病症是慢性偏头痛。在其他实施方案中，所述方法还可以包括向个体与抗PACAP抗体同时或依序施用第二药剂。第二药剂可以是例如用于偏头痛的急性治疗。在又其他实施方案中，第二药剂可以是用于偏头痛和/或难治性偏头痛的预防性治疗。
用于偏头痛的急性治疗是本领域已知的，并且包括非甾体类抗炎药(NSAID)和/或麦角生物碱和/或曲坦类和/或5羟色胺1F受体激动剂(即，地坦类)和戈潘类(gepants)(即，降钙素基因相关肽受体拮抗剂)。
可以与抗PACAP抗体组合使用的NSAID的非限制性例子包括阿司匹林、双氯芬酸、二氟尼柳(diflusinal)、依托度酸、芬布芬、非诺洛芬、氟苯柳、氟比洛芬、布洛芬、吲哚美辛、酮洛芬、酮咯酸、甲氯芬那酸、甲芬那酸、萘丁美酮、萘普生、奥沙普秦、苯基丁氮酮、吡罗昔康、舒林酸、托美丁或佐美酸、环氧合酶-2(COX-2)抑制剂、塞来昔布、罗非昔布(rofecoxcib)、美洛昔康、JTE-522、L-745、337、NS398或其药学上可接受的盐。
可以与如本文所述的抗PACAP抗体组合使用的曲坦类的非限制性例子包括舒马曲坦、佐米曲坦、那拉曲坦、利扎曲坦、依立曲坦、阿莫曲坦和呋罗曲坦。
可以与本公开文本的抗PACAP抗体组合使用的二苯甲烷类的非限制性例子包括拉司米地坦(lasmiditan)。
可以与本公开文本的抗PACAP抗体组合使用的戈潘类的非限制性例子包括乌洛戈潘(ubrogepant)、利美戈潘(rimegepant)、阿托戈潘(atogepant)和维泽戈潘(vazegepant)。
用于偏头痛和/或难治性偏头痛的预防性治疗是本领域已知的。在一个实施方案中，预防性治疗包括托吡酯。在另一个实施方案中，预防性治疗包括肉毒杆菌素(Onabotulinumtoxin)A。在一个实施方案中，预防性治疗包括降钙素基因相关肽(CGRP)途径单克隆抗体。例如，降钙素基因相关肽(CGRP)途径单克隆抗体可以包括抗CGRP抗体、抗CGRP受体(CGRP-R)抗体或二者。在一个示例性实施方案中，抗CGRP抗体是瑞玛奈珠单抗。在另一个实施方案中，抗CGRP抗体是伽奈珠单抗。在一个实施方案中，抗CGRP抗体是依普奈珠单抗。示例性抗CGRP-R抗体包括厄瑞努单抗。
在某些实施方案中，将本文所述的抗PACAP抗体与肉毒杆菌素A组合施用。
在某些实施方案中，将本文所述的抗PACAP抗体与任何上述CGRP途径单克隆抗体组合施用。在某些实施方案中，将本文所述的抗PACAP抗体与瑞玛奈珠单抗组合施用。
在某些实施方案中，将本文所述的抗PACAP抗体与伽奈珠单抗组合施用。
在某些实施方案中，将本文所述的抗PACAP抗体与依普奈珠单抗组合施用。
在某些实施方案中，将本文所述的抗PACAP抗体与厄瑞努单抗组合施用。
在一些实施方案中，本文所述的抗PACAP抗体可以与本领域已知的其他抗PACAP抗体(如WO 2017181031、WO 2017181039、WO 2017106578和WO 2019067293中所述的那些抗PACAP抗体)组合使用。
在一些实施方案中，本文所述的抗PACAP抗体可以与如WO 2019140216和WO2014144632中所述的抗PAC1抗体组合使用。
在一些实施方案中，本文所述的抗PACAP抗体可以用于通过自主功能的生理测量鉴定的亚群中的患有偏头痛的患者。例如，可以通过(i)基线发作或发作间PACAP水平、血浆、泪液、唾液或其他生物学样品；(ii)自主功能(如瞳孔对光反射和皮肤电反应)的基线生理测量值；以及(iii)对PACAP输注的基线发作或发作间自主反应来鉴定亚群。
在一些实施方案中，治疗有效量的本文所述的抗PACAP抗体或药物组合物的施用可以导致延迟本文讨论的病症的发作、降低病症的持续时间或降低病症的严重程度。
本文所述的任一种或多种组合物(例如，抗PACAP抗体)的施用都可以被掺入治疗性组合物或组合治疗方案中，用于如本文所述的治疗或预防方法。例如，抗PACAP抗体与任何上述CGRP途径单克隆抗体(例如，瑞玛奈珠单抗)的组合疗法都可以被掺入一种治疗性组合物中，或者作为两种单独的治疗性组合物，用于治疗或预防PACAP相关病症(如头痛、偏头痛或任何上述病症)的方法。本公开文本的抗PACAP抗体或药物组合物通常在溶液或悬浮液配制品中通过注射或输注来施用。在一个示例性实施方案中，抗PACAP抗体可以通过直接注射到个体中来施用。在另一个示例性实施方案中，抗PACAP抗体可以通过全身输注来施用。在基于细胞的测定中，本公开文本的一些抗PACAP抗体(例如，890C)在等于约300皮摩尔(pM)的浓度下有效。基于细胞的测定可以是监测在抗PACAP抗体的存在下环腺苷一磷酸(cAMP)产生的测定(Wang,T.等人(2004).Measurement of cAMP for G(αs)-and G(αi)Protein-Coupled Receptors(GPCRs).Assay Guidance Manual.S.Markossian,G.S.Sittampalam,A.Grossman等人贝塞斯达(马里兰州),Eli Lilly&Company and theNational Center for Advancing Translational Sciences)。cAMP是GPCR信号转导中重要的细胞内第二信使。与G(αs)蛋白偶联的GPCR的激动剂激活导致细胞内cAMP水平的产生增加，而与G(αi)蛋白偶联的GPCR的激活导致细胞内cAMP水平的产生降低。这两种细胞内cAMP变化都是通过调节腺苷酸环化酶活性来介导的。cAMP调节cAMP依赖性蛋白激酶A(PKA)的活性，后者在多种下游细胞过程中起着重要作用。许多可以用于测量细胞内cAMP水平的试剂盒在市场上有售。这些试剂盒包括来自Cisbio的HTRF cAMP试剂盒、来自PerkinElmer的LANCE cAMP试剂盒、来自DiscoverX的HitHunter cAMP试剂盒以及来自Abcam和BioVision的cAMP直接免疫测定试剂盒。这些测定都是基于抗体的使用的，所述抗体特异性识别细胞内cAMP和充当竞争物的外源标记的cAMP缀合物二者，然后通过多种检测技术(包括荧光共振能量转移(FRET)或酶促反应)检测标记的cAMP缀合物。另外，来自Promega的抗体非依赖性GloSensor cAMP测定采用半分裂的萤光素酶，其在与cAMP结合时会重新组装。本文提供的其他抗PACAP抗体可能在较高或较低的浓度下最有效，这取决于对PACAP的结合亲和力以及个体中PACAP的表达程度。在一些实施方案中，在基于细胞的测定中，本公开文本的抗体或其抗原结合片段在等于约30至约90pM的浓度下有效。在一些实施方案中，在基于细胞的测定中，本公开文本的抗体或其抗原结合片段在等于约40至约80pM的浓度下有效。在一些实施方案中，在基于细胞的测定中，本公开文本的抗体或其抗原结合片段在等于约50至约70pM的浓度下有效。在一些实施方案中，在基于细胞的测定中，本公开文本的抗体或其抗原结合片段在等于约60、65、67、69或70pM的浓度下有效。
系统和试剂盒
本文还提供了系统和试剂盒，所述系统和试剂盒包括本文提供和描述的抗PACAP抗体、重组核酸、重组细胞或药物组合物以及用于制备和使用它们的书面说明书。例如，在一些实施方案中，本文提供了包括以下中的一种或多种的系统和/或试剂盒：如本文所述的抗PACAP抗体、如本文所述的重组核酸、如本文所述的重组细胞或如本文所述的药物组合物。在一些实施方案中，本公开文本的系统和/或试剂盒进一步包括用于向个体施用所提供的抗PACAP抗体、重组核酸、重组细胞或药物组合物中的任一种的一个或多个注射器(包括预填充注射器)和/或导管。在一些实施方案中，试剂盒可以具有一种或多种另外的治疗剂，它们可以与其他试剂盒组分同时或依序施用以用于所需目的，例如用于调节细胞的活性、抑制靶癌细胞或治疗有需要的个体的疾病。
任何上述系统和试剂盒都可以进一步包括一种或多种另外的试剂，其中此类另外的试剂可以选自：稀释缓冲液、重构溶液、洗涤缓冲液、对照试剂、对照表达载体、阴性对照多肽、阳性对照多肽、用于体外产生双特异性结合剂或工程化跨膜蛋白的试剂。
在一些实施方案中，系统或试剂盒可以进一步包括用于使用试剂盒的组分来实践所述方法的说明书。用于实践所述方法的说明书通常记录在合适的记录介质上。例如，可以将说明书印刷在基材(如纸或塑料等)上。说明书可以作为包装插页存在于试剂盒中，在试剂盒或其组分的容器的标签中(即，与包装或子包装相关)等。说明书可以以存在于合适的计算机可读存储介质(例如，CD-ROM、软磁盘、闪存驱动器等)上的电子存储数据文件存在。在一些情形下，实际说明书不存在于试剂盒中，而是可以提供从远程源(例如，经由互联网)获得说明书的手段。此实施方案的例子是包括网址的试剂盒，在所述网址中可以查看说明书和/或可以从其下载说明书。与说明书一样，可以将这种用于获得说明书的手段记录在合适的基材上。
将本公开文本中提到的所有出版物和专利申请都通过引用并入本文，并入程度如同确切且单独地指示每个单独出版物或专利申请都通过引用并入一般。
不承认本文引用的任何参考文献构成现有技术。参考文献的讨论陈述其著者的主张，并且诸位发明人保留质疑所引用文件的准确性和相关性的权利。应清楚地理解的是，尽管在本文中提及许多信息源，包括科学期刊文章、专利文件和教科书；但此提及并不构成承认任何这些文件构成本领域公知常识的一部分。
本文给出的一般方法的讨论仅旨在用于说明目的。在审阅本公开文本后，其他替代方法和替代方案对于本领域技术人员而言将是清楚的，并且将被包括在本申请的精神和范围内。
实施例
除非另外指示，否则本公开文本的实践将采用本领域技术人员熟知的分子生物学、微生物学、细胞生物学、生物化学、核酸化学和免疫学的常规技术。在上文引用的文献中对此类技术进行了充分解释。在以下实施例中进一步详细公开了另外的实施方案，所述实施例仅以说明方式提供，而并非旨在以任何方式限制本公开文本或权利要求的范围。
实施例1：抗PACAP抗体的产生。
此实施例简要描述了本公开文本中提供的抗体的产生程序。
从经免疫的小鼠中分离抗PACAP单克隆抗体。基于所述单克隆抗体对PACAP的选择性，从小鼠中分离出血浆细胞。例如，通过使用文献中已知的技术，针对PACAP-38和VIP对单个B细胞进行筛选，所述技术如以下文献中所述的那些技术：Winters等人Rapid single Bcell antibody discovery using nanopens and structured light.mAbs第11卷,2019-第6期；Asensio等人Antibody repertoire analysis of mouse immunization protocolsusing microfluidics and molecular genomics.mAbs第11卷,2019-第5期；Seah等人Microfluidic single-cell technology in immunology and antibody screening.MolAspects Med.2018；59:47-61；Proserpio等人Single-cell technologies arerevolutionizing the approach to rare cells.Immunol Cell Biol.2016；94(3):225-229；El Debs等人Functional single-cell hybridoma screening using droplet-basedmicrofluidics.Proc Natl Acad Sci USA.2012；109(29):11570-11575；和Theberge等人Microdroplets in microfluidics:an evolving platform for discoveries inchemistry and biology.Angew Chem Int Ed Engl.2010；49(34):5846-5868。对多于61,000个B细胞进行筛选。分离出阳性B细胞分泌的抗原特异性抗体并且对其进行测序。
对201种编码免疫球蛋白重链和轻链的抗体进行测序和克隆。鉴定出39种具有PACAP选择性结合的抗体。选择两个克隆用于进一步优化。这些抗体展现出高PACAP结合活性和低至无VIP结合亲和力。此外，两种抗体都展现出针对PACAP的高效力和针对VIP的低至无效力。
两种抗体都显示出针对PACAP38和PACAP27的高亲和力和效力，如在37℃下通过SPR以及使用人PAC1表达细胞系测量PACAP27/PACAP38介导的cAMP积累的基于细胞的功能测定测量的。优化过程产生多于660种人源化变体，以产生候选高亲和力和高效抗体，并且同时产生具有降低的潜在免疫原性风险的抗体，如通过ProImmune(肽-MHC II类稳定性)测定和通过高人性得分测量的。
通过体外亲和力成熟进一步优化保留了效力的人源化变体，体外亲和力成熟涉及产生多于1亿(108)种变体的组合文库。对约950种其他变体进行筛选，以解决潜在的可制造性和免疫原性，同时保留效力特征。
下表14示出了针对结合亲和力、效力和预测的免疫原性进行筛选的示例性人源化变体。
表14.
四种人源化抗体(890C、608C、627C和609C)显示出高亲和力、高效力和较低的预测的免疫原性。
使用抗体可开发性标准(如实施例7中所述的标准)来鉴定具有最佳可开发性特征的变体。
如从表14可以看出，最高的结合亲和力不一定轻易地与预测的免疫原性相关。举例来说，变体524C展现出比变体890C、608C、627C和609C更高的结合亲和力，但是也展现出高预测的免疫原性特征，而890C、608C、627C和609C并没有。此外，对于PACAP的效力也不能预测免疫原性和可开发性的有利特征。举例来说，变体519C展现出比变体890C、608C、627C和609C更高的效力，但是也展现出高预测的免疫原性特征，而890C、608C、627C和609C并没有。举例来说，通过如实施例3中所述的测定测量预测的免疫原性特征。
实施例2：抗PACAP抗体的人性。
此实施例描述了本公开文本中提供的抗体的人性。
增加作为潜在治疗候选物的单克隆抗体的可变区序列的人性是最小化潜在免疫原性的重要方法。本公开文本的抗PACAP抗体被工程化以获得高人性得分，而不会损害如本文所述的高亲和力和高效力。使用包括IMGT和AbGenesis在内的各种抗体分析平台获得人性得分，即与人种系序列的相似性。用单个输入可变区抗体序列开始，鉴定出序列的最接近人种系，并且使用AbGenesis软件(版本4.1)计算可变重链和轻链的人性百分比。基于重链和轻链的平均序列同一性百分比值计算抗体的总体人性。
本公开文本的一些示例性抗PACAP抗体和一些已知的抗PACAP抗体的人性得分示于表15中。
表15：人性得分
抗体 VH％ VK％ ％人性
608C 88.2 90.7 89.5
627C 88.2 90.7 89.5
609C 88.2 89.8 89.0
604C 88.2 90.7 89.5
605C 88.2 89.8 89.0
890C 88.2 89.8 89.0
919A 88.2 85.8 87.0
917B 88.2 88.8 88.5
Ab C和D 92.3 88.7 90.5
Ab1H 86.4 87.8 87.1
Ab10.H3 77.7 85.1 81.4
如上所示，抗PACAP抗体(例如，608C、627C、609C、604C、605C和890C)都具有至少89％人性，这高于已知的WO 2017181031中所述的抗PACAP抗体Ab1h和WO2017181039中所述的抗体Ab10.H3。抗PACAP抗体Ab C和D描述于WO 2019067293中。如以下实施例所述，与种系不同的序列在进一步的免疫原性预测分析中特别令人感兴趣。
实施例3：抗PACAP抗体的预测的免疫原性。
此实施例描述了本公开文本中提供的抗体的预测的免疫原性。
在产生本文所述的抗体的过程期间，对具有预测的低免疫原性的抗体进行进一步优化，不包括具有通过肽-MHC II类稳定性分析预测的表位的那些抗体。
将覆盖所有非种系残基的来自本文提供的抗PACAP抗体(如实施例2中所述的抗体(表15))的重链和轻链可变区的合成肽与重组MHC II类蛋白一起孵育。使用ProImmune测定来评估肽与MHC II类分子结合的稳定性。例如，针对所测试的抗体评估覆盖所有非种系残基的来自重链和轻链序列的15个残基长的合成肽。
所分析的MHC II类等位基因包括在整个群体中具有至少3％的频率的所有等位基因。通过ELISA检测肽与MHC II类的结合。这些分析鉴定出低预测的免疫原性抗体(如608C、609C、627C和890C)，针对其所测试的所有肽都显示出与MHC II类蛋白没有或有低稳定性相互作用(图7)。相比之下，先前描述的抗PACAP抗体(如Ab1H、Ab10.H3、Ab B、Ab C或Ab D)的分析都显示出预测的免疫原性表位。
实施例4：抗PACAP抗体的动力学。
此实施例描述了本公开文本中提供的抗体的动力学。
简言之，通过先前所述的方法(Andreu和Gomes 2002)在Biacore S200(GEHealthcare)上确定抗体和肽相互作用。将抗人IgG Fc捕获抗体经由标准胺偶联固定在CM5生物传感器芯片上。注射抗PACAP抗体，并且将其捕获至200至400个响应单位(RU)。将PACAP38、PACAP27和VIP稀释于含有0.1％w/v BSA(Bovostar，目录号BSAS1.0)和0.15MNaCl(Sigma-Aldrich目录号S7653)的HBS-EP+缓冲液(pH 7.4)中。通过在37℃下将在运行缓冲液中两倍连续稀释的PACAP(12nm至0nM)和VIP(1200nM至0nM)以40uL/min的流速注射2min，然后解离10分钟来确定抗体的结合动力学。对于随后的循环，使用0.85％磷酸使芯片再生。采用Biacore S200评价软件(1.0版)分析数据。使用简单的一对一Langmuir结合模型确定缔合速率(ka)和解离速率(kd)常数，并且使用它们来计算平衡解离常数(KD)。
使用相同的测定形式来捕获来自上清液的抗体，并且将33.3nM PACAP的单次分析物注射用于抗体变体的解离速率排名。涉及单一浓度的PACAP38的示例性的基于Biacore的解离速率排名测定示于表16中。
表16：抗PACAP变体的结合测量
图3A、图3B、图3C示出了通过SPR得到的抗PACAP抗体605C与PACAP38和PACAP27和VIP的结合亲和力分析的例子。此外，表17显示抗PACAP抗体605C以高亲和力和选择性结合PACAP38和PACAP27。由于与VIP的缔合速率和解离速率非常快，使用稳态时的结合亲和力。
表17：605C与PACAP38和PACAP27的结合
实施例5：抗PACAP抗体的效力。
此实施例描述了本公开文本中提供的抗体的效力。
根据先前所述的方法(Wang,Li等人2004)进行基于细胞的测定以测量PACAP诱导的cAMP积累。具体而言，对PACAP38或PACAP27诱导的经由PAC1、VPAC1和VPAC2受体的信号传导的抑制利用稳定表达人PAC1、VPAC1或VPAC2受体的CHO-K1细胞系(Eurofins/DiscoverX)，并且使用Promega cAMP-GloTM确定终点。下表18总结了本文提供的一些示例性抗PACAP抗体的IC50。
表18：IC50比较
实施例6：抗PACAP抗体的选择性。
此实施例描述了本公开文本中提供的抗体的选择性。
针对分泌素胰高血糖素家族中的相关肽(表19)测试抗PACAP抗体(例如，890C)，以确定任何脱靶结合的存在和程度。胰高血糖素超家族中的九种生物活性肽是：PACAP、VIP、胰高血糖素、胰高血糖素样肽(GLP-1、GLP-2)、生长激素释放因子(GRF或GHRF)、肽组氨酸甲硫氨酸(PHM)、分泌素和肠抑胃肽(GIP)。在如实施例4中所述的捕获抗体后，通过在37℃下将在缓冲液中稀释的37.5nM的每种肽以50mL/min的流速注射2min，然后是4-5min的解离期来测量抗体和肽相互作用。通过经由以30μL/min的流速两次注射0.85％磷酸使捕获表面再生，将样品以多循环方式注射经过新鲜捕获的抗PACAP抗体。
表19：分泌素胰高血糖素家族中的肽
肽 序列
PACAP38 HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVLGKRYKQRVKNK(SEQ ID NO:13)
PACAP27 HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVL(SEQ ID NO:14)
VIP HSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILN(SEQ ID NO:15)
PHM HADGVFTSDFSKLLGQLSAKKYLESLM(SEQ ID NO:77)
分泌素 HSDGTFTSELSRLREGARLQRLLQGLV(SEQ ID NO:78)
胰高血糖素 HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT(SEQ ID NO:79)
GIP YAEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQKGKKNDWKHNITQ(SEQ ID NO:80)
GLP-1 HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR(SEQ ID NO:81)
GLP-2 HADGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITD(SEQ ID NO:82)
GRF YADAIFTNSYRKVLGQLSARKLLQDIMSRQQGESNQERGARARL(SEQ ID NO:83)
如图4所示，在通过Biacore确定的稳定性水平(15秒解离后的相对结合)下，抗体890C对PACAP具有高度选择性，而与其他胰高血糖素-分泌素家族肽的没有结合或有最小结合。通过SPR测量并且以pM计的890C与PACAP38、PACAP27和VIP的亲和力分别为54、218和390,000。通过在测量环AMP(cAMP)的基于细胞的功能测定中将对PACAP38信号传导的抑制与对VIP信号传导的抑制进行比较来评估抗体890C的选择性。如图5所示，相比于在稳定表达VPAC1受体的CHO-K1细胞中对VIP诱导的cAMP产生的抑制，抗体890C在稳定表达PAC1受体的CHO-K1细胞中抑制PACAP38诱导的cAMP产生时展示出>1000倍的选择性。
实施例7：使用HPLC-SEC分析的可开发性评估
可以使用测量抗体分子的非特异性相互作用的生物物理技术评估抗体分子的可开发性。已经表明，在使用基于二氧化硅的柱或基于葡聚糖的尺寸排阻柱的抗体的高效液相色谱(HPLC)分析中，抗体样品的保留时间与其胶体稳定性相关；其中易于沉淀或聚集的抗体在柱上保留更长时间，这可能是由于抗体与柱基质的非特异性相互作用(Kohli等人,(2015)mAbs,7:4,752-758,DOI:10.1080/19420862.2015.1048410)。可以使用分子量标准品计算抗体的表观分子量。由于与基于序列计算得出的表观分子量相比更低的表观分子量，保留时间更长。
如图6所示，具有可接受的IgG的抗体的典型分子量约为155kDa。抗体609C和890C正常洗脱，其表观分子量窗口为155kDa-165kDa，而Ab C和Ab D展示出显著增加的保留时间，其表观分子量约为95-105kDa，这取决于IgG亚型。这些数据证明，预期抗体609C和890C具有更好的可开发性，因为它们具有适当的胶体稳定性，如通过柱上的保留时间所反映的。
实施例8：抗PACAP单克隆抗体在食蟹猴中的单剂量研究。
使4只未接受过生物制剂的雄性食蟹猴经由皮下施用以10mg/kg接受单剂量的具有以下CDR的抗PACAP抗体：分别在SEQ ID NO:1、2和3以及SEQ ID NO:4、5和6中所示的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3序列以及VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3序列。进行采样用于药代动力学和药效学分析、血液学和临床化学评估。例如，通过将经注射的动物的血清样品与同一动物的给药前样品进行比较，通过离体测定进行药效学分析。未观察到可持续的抗体相关血液学、临床化学或体重变化。在食蟹猴中，抗体血清浓度时间曲线与典型的单克隆抗体曲线可比较。
虽然已经公开了本公开文本的特定替代方案，但应理解的是，各种修改和组合是可能的并且被考虑在所附权利要求的真实精神和范围内。因此，无意限制于本文呈现的确切摘要和公开文本。

Claims (56)

1.一种抗垂体腺苷酸环化酶激活多肽(PACAP)抗体，其中所述抗体包含分别在SEQ IDNO:9、2和3中所示的重链可变区(VH)-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3序列；以及分别在SEQ IDNO:10、5和6中所示的轻链可变区(VL)-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3序列。
2.一种抗PACAP抗体，其中所述抗体或其抗原结合片段包含选自以下的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3序列：
a)分别地，SEQ ID NO:1、2和3；
b)分别地，SEQ ID NO:7、2和3；以及
c)包含1、2或3个保守氨基酸取代的a)-b)的变体；并且
其中所述抗体或其抗原结合片段包含选自以下的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3序列：
d)分别地，SEQ ID NO:4、5和6；
e)分别地，SEQ ID NO:8、5和6；以及
f)包含1、2或3个保守氨基酸取代的d)-e)的变体。
3.一种抗PACAP抗体，其中所述抗体包含衍生自SEQ ID NO:19的VH序列，其中所述VH序列包含根据Kabat编号的在残基32处的缬氨酸(V)或亮氨酸(L)；并且其中所述抗体包含衍生自SEQ ID NO:22的VL序列，其中所述VL序列包含根据Kabat编号的在残基27E处的丙氨酸(A)、根据Kabat编号的分别在残基50和51处的色氨酸(W)和丙氨酸(A)。
4.根据权利要求3所述的抗体，所述抗体进一步包含根据Kabat编号的在所述VH中的残基92-94处的半胱氨酸-丙氨酸-异亮氨酸(CAI)。
5.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，所述抗体包含分别衍生自人基因IGHV1-69*01和IGKV4-1*01的重链和轻链框架区(FR)序列及其功能变体。
6.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，所述抗体包含分别在SEQ ID NO:29-32中所示的重链框架区(VHFR)-1、VHFR-2、VHFR-3和VHFR-4序列；以及分别在SEQ ID NO:33-36中所示的轻链框架区(VLFR)-1、VLFR-2、VLFR-3和VLFR-4序列。
7.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，所述抗体包含与选自SEQ ID NO:11和12的序列约90％、约95％或约99％相同的VH序列，以及与选自SEQ ID NO:20和21的序列约90％、约95％或约99％相同的VL序列。
8.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，所述抗体包含选自SEQ ID NO:11和12的VH序列以及选自SEQ ID NO:20和21的VL序列。
9.一种抗PACAP抗体，其中所述抗体包含选自以下的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3序列以及VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3序列：
a)分别地，SEQ ID NO:1、2和3以及SEQ ID NO:4、5和6；
b)分别地，SEQ ID NO:7、2和3以及SEQ ID NO:8、5和6；
c)分别地，SEQ ID NO:1、2和3以及SEQ ID NO:8、5和6；以及
d)分别地，SEQ ID NO:7、2和3以及SEQ ID NO:4、5和6。
10.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，所述抗体包含与选自以下的序列约90％、约95％或约99％相同的VH序列和VL序列：
a)分别地，SEQ ID NO:11和20；
b)分别地，SEQ ID NO:12和21；
c)分别地，SEQ ID NO:11和21；以及
d)分别地，SEQ ID NO:12和20。
11.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，所述抗体包含选自以下的VH序列和VL序列：
a)分别地，SEQ ID NO:11和20；
b)分别地，SEQ ID NO:12和21；
c)分别地，SEQ ID NO:11和21；以及
d)分别地，SEQ ID NO:12和20。
12.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，所述抗体包含SEQ ID NO:11或SEQ IDNO:12的VH序列，其中所述VH序列具有在SEQ ID NO:11或12的残基1处的谷氨酰胺(Q)，而不是谷氨酸(E)。
13.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，所述抗体包含选自SEQ ID NO:37-51或76的重链恒定区序列以及选自SEQ ID NO:23和24的轻链恒定区序列。
14.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，所述抗体包含SEQ ID NO:43中所示的重链恒定区序列和SEQ ID NO:23中所示的轻链恒定区序列。
15.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体是人的或人源化的。
16.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体是人源化抗体。
17.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体具有低或没有免疫原性特征。
18.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体具有大于或等于约89％的人性得分。
19.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体具有低于或等于约5x10-11摩尔(M)的KD，如在37℃下通过SPR测量的。
20.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体或其抗原结合片段具有低于或等于约3x 10-11摩尔(M)的KD，如在37℃下通过SPR测量的。
21.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，所述抗体是抗原结合片段。
22.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、单链Fv或scFv、二硫键连接的Fv、V-NAR结构域、IgNar、胞内抗体、IgGACH2、微抗体、F(ab')3、四抗体、三抗体、双抗体、单结构域抗体、DVD-Ig、Fcab、mAb2、(scFv)2或scFv-Fc。
23.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，所述抗体是全长抗体。
24.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述恒定区是IgG恒定区。
25.根据权利要求24所述的抗体，其中所述恒定区是IgG1恒定区。
26.根据权利要求24所述的抗体，其中所述恒定区是IgG4恒定区。
27.根据权利要求25或26所述的抗体，其中所述恒定区包含选自以下的序列：SEQ IDNO:37中所示的人IgG1序列、SEQ ID NO:38中所示的人IgG1 FAB TAG序列、SEG ID NO:39中所示的人IgG1 KiH臼序列、SEQ ID NO:40中所示的人IgG1 KiH杵序列、SEQ ID NO:41中所示的人IgG1(L235A，G237A)序列、SEQ ID NO:42中所示的人IgG1 YTE序列、SEQ ID NO:76中所示的人IgG1(L235A，G237A，YTE)序列、SEQ ID NO:43中所示的人IgG2DASS序列、SEQ IDNO:44中所示的人IgG4序列、SEQ ID NO:45中所示的人IgG4KiH臼序列、SEQ ID NO:46中所示的人IgG4 KiH杵序列、SEQ ID NO:47中所示的人IgG4(L235A，G237A)序列、SEQ ID NO:48中所示的人IgG4(L235E)序列、SEQ ID NO:49中所示的人IgG4 YTE序列、SEQ ID NO:50中所示的人IgG4 YTE KiH臼序列和SEQ ID NO:51中所示的人IgG4 YTE KiH杵序列。
28.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述重链是IgG2重链。
29.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述重链包含SEQ ID NO:43中所示的IgG2DASS序列。
30.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述轻链是人κ轻链。
31.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述轻链是人λ轻链。
32.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，所述抗体包含与选自以下的序列约90％、约95％或约99％相同的全长重链序列和全长轻链序列：
a)分别地，SEQ ID NO:70和71；
b)分别地，SEQ ID NO:74和71；
c)分别地，SEQ ID NO:75和71；
d)分别地，SEQ ID NO:72和73；
e)分别地，SEQ ID NO:70和73；以及
f)分别地，SEQ ID NO:72和71。
33.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，所述抗体包含选自以下的全长重链序列和全长轻链序列：
a)分别地，SEQ ID NO:70和71；
b)分别地，SEQ ID NO:74和71；
c)分别地，SEQ ID NO:75和71；
d)分别地，SEQ ID NO:72和73；
e)分别地，SEQ ID NO:70和73；以及
f)分别地，SEQ ID NO:72和71。
34.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述重链序列具有在SEQ ID NO:70、72、74和75的残基1处的谷氨酰胺(Q)，而不是谷氨酸(E)。
35.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体是PACAP的拮抗剂。
36.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述抗体与PACAP特异性结合。
37.一种核酸，所述核酸编码根据前述权利要求中任一项所述的抗体。
38.一种载体，所述载体包含根据权利要求37所述的核酸。
39.一种工程化细胞，所述工程化细胞包含根据权利要求38所述的载体。
40.一种产生抗体的方法，所述方法包括将根据权利要求36所述的工程化细胞在足以使所述细胞产生所述抗体的条件下培养。
41.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据前述权利要求中任一项所述的抗体以及药学上可接受的载剂。
42.一种治疗或预防个体的病症的方法，所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的根据前述权利要求中任一项所述的抗体或药物组合物，其中所述病症选自：头痛(例如，偏头痛、丛集性头痛、难治性偏头痛)、焦虑、抑郁、PTSD、伴有头痛(例如，偏头痛、丛集性头痛、难治性偏头痛)的共病病症(例如，焦虑/抑郁/PTSD)、伴有偏头痛的共病焦虑障碍、复杂性区域性疼痛综合征和玫瑰痤疮。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述头痛选自：有先兆偏头痛、无先兆偏头痛、偏瘫性偏头痛、丛集性头痛、神经性偏头痛、慢性头痛、阵发性偏头痛、慢性偏头痛、药物过度使用性头痛和紧张性头痛。
44.一种治疗或预防个体的偏头痛的方法，所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的根据前述权利要求中任一项所述的抗体或药物组合物。
45.一种治疗或预防个体的偏头痛的方法，所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的根据前述权利要求中任一项所述的抗体或药物组合物，其中所述个体对两种至四种适用的预防性药物没有反应。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述个体对两种至四种选自以下的适用的预防性药物没有反应：双丙戊酸盐、丙戊酸钠、丙戊酸盐、丙戊酸、托吡酯、加巴喷丁、普萘洛尔、噻吗洛尔、阿替洛尔、美托洛尔、纳多洛尔、比索洛尔、氟桂利嗪、阿米替林、去甲替林、多塞平、氟西汀和坎地沙坦。
47.一种治疗或预防个体的偏头痛的方法，所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的根据前述权利要求中任一项所述的抗体或药物组合物，其中所述个体对两种至四种适用的预防性药物类别没有反应。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述预防性药物类别选自：抗癫痫药、β阻断剂、三环抗抑郁药、钙通道阻断剂、血管紧张素II受体拮抗剂、肉毒杆菌毒素和CGRP途径单克隆抗体。
49.根据权利要求47所述的方法，其中所述预防性药物类别选自不同的集群，其中所述集群定义如下：
集群A：抗癫痫药
集群B：β阻断剂
集群C：三环抗抑郁药
集群D：钙通道阻断剂
集群E：血管紧张素II受体拮抗剂
集群F：肉毒杆菌毒素
以及集群G：降钙素基因相关肽(CGRP)途径单克隆抗体。
50.根据权利要求45-49所述的方法，其中所述个体对两种至三种、至少两种、至少三种、至少四种、多于两种或多于三种预防性药物或预防性药物类别没有反应。
51.一种治疗或预防个体的偏头痛的方法，所述方法包括：选择对两种至四种适用的预防性药物或预防性药物类别没有反应的个体；以及向所述个体施用治疗有效量的根据前述权利要求中任一项所述的抗体或药物组合物。
52.一种治疗或预防对CGRP途径单克隆抗体没有反应的个体的偏头痛的方法，所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的根据前述权利要求中任一项所述的抗体或药物组合物。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述CGRP途径单克隆抗体包括抗CGRP抗体、抗CGRP-R抗体或二者。
54.根据权利要求52所述的方法，其中所述抗CGRP抗体选自瑞玛奈珠单抗、伽奈珠单抗、依普奈珠单抗或其组合。
55.根据权利要求52所述的方法，其中所述抗CGRP-R抗体是厄瑞努单抗。
56.一种用于根据前述权利要求中任一项使用的组合物。
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