CN118147274A - 一种降低dna打断形成的发夹结构数量的片段化酶反应体系和dna文库构建方法 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及DNA打断技术领域，具体公开一种降低DNA打断形成的发夹结构数量的片段化酶反应体系和DNA文库构建方法。所述片段化酶反应体系包括：组合酶和打断反应物；所述组合酶包括限制性内切酶和聚合酶类；所述打断反应物包括Mg2+和Ca2+，不含锰离子；在所述片段化酶反应体系之中，Mg2+的浓度为0.5~0.9mM，Ca2+的浓度为0.3~0.7mM。本申请通过筛选金属离子和辅助酶的种类和浓度，降低了限制性内切酶作用下的DNA回文序列暴露的频率，从而减少DNA打断过程中发夹结构的形成数量。
Description
技术领域
本申请涉及DNA打断技术领域，更具体地说，涉及一种降低DNA打断形成的发夹结构数量的片段化酶反应体系和DNA文库构建方法。
背景技术
在NGS(下一代测序技术)实验中，DNA文库构建的第一步是gDNA(基因组DNA)的片段化，将DNA随机打断成符合测序的片段大小。目前最常见的打断方式是物理打断和酶打断，二者都能高效的对DNA进行片段化，但是这两种方法在实际使用中各具优势，需要根据具体实验情况进行选择。物理打断法主要包括超声或者声波共聚焦(Covaris)，超声波产生的剪切力能够将溶液中的DNA片段进行剪切，但是这种方法需要特殊仪器，并且存在用时长，gDNA投入量大，产物回收效率低等问题。酶打断是对DNA进行随机、非特异地切割。酶打断方法操作方便，打断、末端修复和加A可以一步完成，减少实验步骤，能够显著降低实验成本。一般的酶切打断方式主要有两种：一种是由一种内切酶产生缺刻，之后用另一种内切酶把这个缺刻对面的序列切断；另一种打断方式是利用一种内切酶在DNA两个链上随机产生缺刻，再通过另一种DNA聚合酶进行链置换的方式对DNA进行片段化。
但是根据Gregory T等人的研究，在酶的作用下，DNA分子会暴露某些反向互补序列，反向互补序列的结合会导致发夹结构的形成。Chigusa S等人证实，相对于机械打断法，酶法构建的文库中的Artifact SNV/Indel(人工单核苷酸变异小片段插入删除)的数量要大得多。因此肿瘤NGS检测的高深度测序带来了大量的假阳性，给NGS结果的判读带来了一定的难度。
发明内容
鉴于目前的酶切打断DNA的过程产生较多发夹结构的问题，本申请提供一种能够降低DNA打断过程中形成发夹结构数量的片段化酶反应体系试剂和方法。
第一方面，本申请提供一种降低DNA打断形成的发夹结构数量的片段化酶反应体系，并采用如下技术方案。
一种降低DNA打断形成的发夹结构数量的片段化酶反应体系，所述片段化酶反应体系包括：组合酶和打断反应物；所述组合酶包括限制性内切酶和聚合酶类；所述打断反应物包括Mg2+和Ca2+，不含锰离子；在所述片段化酶反应体系之中，Mg2+的浓度为0.5～0.9mM，Ca2+的浓度为0.3～0.7mM。
通过采用上述技术方案，在优化片段化酶反应体系的过程中，体系中的金属离子、打断辅助酶都会影响打断过程中回文序列的暴露，其中，Mg2+和Ca2+，可以维护限制性内切酶和聚合酶类处于较高的活性，而锰离子对限制性内切酶和聚合酶类的活性有一定抑制作用。限制性内切酶在DNA两个链上随机产生缺刻，再通过聚合酶类进行链置换的方式对DNA进行片段化。通过优化方案，选择包含Mg2+的浓度为0.5～0.9mM、Ca2+的浓度为0.3～0.7mM的片段化酶反应体系，能较佳的降低DNA打断过程中形成发夹结构的数量。
作为该降低DNA打断形成的发夹结构数量的片段化酶反应体系的一种改进，所述组合酶还包括T4单链DNA结合蛋白。
通过采用上述技术方案，T4单链DNA结合蛋白简写为T4GP32，可以促进限制性内切酶对DNA的酶切消化反应，增强聚合酶类的活性，并且能降低DNA打断过程中形成发夹结构的数量。
作为该降低DNA打断形成的发夹结构数量的片段化酶反应体系的一种改进，所述T4单链DNA结合蛋白在所述片段化酶反应体系之中的浓度为0.06～0.2μg/μL。
通过采用上述技术方案，在该浓度的所述T4单链DNA结合蛋白下，所述片段化酶反应体系对DNA的打断过程形成的发夹结构数量较少。
作为该降低DNA打断形成的发夹结构数量的片段化酶反应体系的一种改进，所述打断反应物包括TrisHCl、NaCl、MgCl2、CaCl2和dNTPs；所述打断反应物的各组分在所述片段化酶反应体系之中的浓度为：TrisHCl的浓度为10～50mM，NaCl的浓度为20～60mM，MgCl2的浓度为0.5～0.9mM，CaCl2的浓度为0.3～0.7mM，dNTPs的浓度为0.03～0.07mM。
通过采用上述技术方案，以上浓度的反应体系，TrisHCl调节pH在7.5～8.5，为酶提供稳定的pH环境，NaCl提升DNA的溶解度，MgCl2和CaCl2维护限制性内切酶和聚合酶类的活性，dNTPs在聚合酶类作用下对DNA进行末端修复。
作为该降低DNA打断形成的发夹结构数量的片段化酶反应体系的一种改进，所述限制性内切酶选自DNase I和dsDNase之中的一种或两种。
通过采用上述技术方案，在适当的Mg2+和Ca2+浓度条件下，DNase I和dsDNase随机剪切双链DNA的任意位点。dsDNase能够能够裂解DNA中的磷酸二酯键，生成带有5'-磷酸和3'-羟基末端的寡核苷酸，实现对DNA的打断。
作为该降低DNA打断形成的发夹结构数量的片段化酶反应体系的一种改进，所述聚合酶类选自Klenow DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶和BST DNA聚合酶之中的一种或多种。
通过采用上述技术方案，在适当的Mg2+和Ca2+浓度条件下，以上聚合酶类均能催化DNA链置换以对DNA进行片段化，同时，Klenow DNA聚合酶具有切除DNA的5'-末端能力和5'-3'聚合酶活性，能催化DNA末端修复加A，Taq DNA聚合酶和BST DNA聚合酶均具有依赖于DNA合成作用的链置换的5’→3’核酸外切酶活性，也能催化DNA末端修复加A。
作为该降低DNA打断形成的发夹结构数量的片段化酶反应体系的一种改进，所述限制性内切酶为DNase I；所述聚合酶类为Klenow DNA聚合酶和Taq DNA聚合酶的组合；在所述片段化酶反应体系之中：DNase I的浓度为0.00005～0.0005U/μL，Klenow DNA聚合酶的浓度为0.01～0.03U/μL，Taq DNA聚合酶的浓度为0.03～0.07U/μL。
通过采用上述技术方案，该种类和浓度的限制性内切酶和聚合酶类能在Mg2+和Ca2 +的辅助作用下，在打断DNA过程较少的生成发夹结构。
第二方面，本申请提出一种DNA文库构建方法，并采用如下技术方案。
一种DNA文库构建方法，利用上述的片段化酶反应体系来构建DNA文库；所述DNA文库构建方法包括以下步骤：
S1，利用所述限制性内切酶在DNA链上产生缺刻，再通过所述聚合酶类进行链置换而使得DNA片段化，得到片段化DNA；继续通过所述聚合酶类对所述片段化DNA进行末端修复和3’端加A，得到DNA加A产物；
S2，使用连接酶将所述DNA加A产物与5’端带有突出T的接头连接在一起，得到DNA连接产物；
S3，对所述DNA连接产物进行纯化；
S4，将纯化后的所述DNA连接产物作为模板进行PCR扩增，构建得到DNA文库。
通过采用上述技术方案，构建得到发夹结构比例少的DNA文库。
作为该DNA文库构建方法的一种改进，步骤S1的反应条件为：将DNA样品和所述片段化酶反应体系混合，并在36～38℃保持5～15min，然后60～70℃保持20～40min，使得DNA连续片段化、末端修复和3’端加A，得到DNA加A产物。
通过采用上述技术方案，在上述反应条件下，在同一反应试剂中通过一步反应，DNA被连续打断、末端修复和加A，并且DNA形成的发夹结构少。
综上所述，本申请的降低DNA打断形成的发夹结构数量的片段化酶反应体系和DNA文库构建方法具有如下有益效果：选择包含Mg2+的浓度为0.5～0.9mM、Ca2+的浓度为0.3～0.7mM、限制性内切酶和聚合酶的片段化酶反应体系，能较佳的降低DNA打断过程中形成发夹结构的数量。在该片段化酶反应体系加入T4单链DNA结合蛋白，可以进一步促进限制性内切酶对DNA的酶切消化反应，增强聚合酶类的活性，并且能进一步降低DNA打断过程中形成发夹结构的数量。本申请通过筛选金属离子和辅助酶的种类和浓度，降低了限制性内切酶作用下的DNA回文序列暴露的频率，从而减少打断DNA过程中发夹结构形成的数量。
附图说明
图1为实施例1在含有钙离子、镁离子、锰离子的打断buffer作用下的文库1和文库2的2100峰图。
图2为实施例2在含有钙离子、镁离子的打断buffer作用下的文库3和文库4的2100峰图。
图3为实施例3组合酶含有不同浓度辅助蛋白T4GP32下的文库5～7的2100峰图。
具体实施方式
下面结合附图对本申请的具体实施方式做进一步说明。
实施例1：大肠杆菌基因组DNA在含有钙离子、镁离子、锰离子的打断buffer作用下的打断效果本实施例利用不同起始量的大肠杆菌基因组DNA，在含有钙离子、镁离子、锰离子的打断buffer作用下评估文库的发夹结构。
1)大肠杆菌基因组片段化，末端修复和加A。
以下文库1、文库2是同时含有钙离子、镁离子、锰离子的打断buffer构建的文库。
打断酶A(组合酶)组成：DNase I(脱氧核糖核酸酶Ⅰ，一种限制性内切酶)的用量0.001U/μL；Klenow DNA聚合酶(大肠杆菌DNA聚合酶)的用量为0.2U/μL；Taq DNA聚合酶的用量0.5U/μL。
打断bufferA(含有打断反应物)组成：300mM pH为8.5的TrisHCl，400mM NaCl、7mMMgCl2、5mM CaCl2、0.5mM MnCl2、0.5mM dNTPs(脱氧核苷酸)。
根据下表添加反应缓冲液进行大肠杆菌基因组的片段化。
表1不同大肠杆菌基因组起始量的打断
反应条件是：所有文库都是37℃保持10min，65℃保持30min，得到dA-Tailing产物，然后4℃保存。
上述表1的各文库打断反应体系的总体积为50μl，文库1～2各成分浓度为：DNaseI的浓度为0.0001U/μL，Klenow DNA聚合酶的浓度为0.02U/μL，Taq DNA聚合酶的用量0.05U/μL，30mM的TrisHCl，40mM NaCl，0.7mM MgCl2，0.5mM CaCl2，0.05mM MnCl2，0.05mMdNTPs。
2)完成打断、末端修复、加A后，可以进行接头的连接。文库1和文库2根据表2配置连接合成反应体系。
对文库进行接头连接，接头引物是天根自合成的双端Index接头(illumina平台)。表2中的组份说明如下。
dA-Tailing产物：加A后的DNA。
Adapter：接头。
5×Fast Ligation Buffer(连接反应液)组成：200mM pH为7.5的TrisHCl，20mMMgCl2，10mM ATP，10％PEG8000(v/v)。
T4 DNA Ligase(600U/μl)来自TIANSeq T4 DNA连接酶(快速)(NG201)。
按照下表2进行接头连接体系的配置。
表2连接反应体系
反应条件是：20℃保持15min，保存于4℃。
上述连接反应完成后，进行连接后文库纯化：在PCR管中加入1～2号文库，以及加入60μL天根TIANSeq DNA片段分选纯化磁珠(NG316)，混匀后，室温静置孵育5min；将PCR管置于磁力架上，待溶液澄清后，吸去上清；加入200μL新鲜配制的80％乙醇静置30s，吸去上清；加入200μL新鲜配制的80％乙醇静置30s，吸干净乙醇；室温静置3min，晾干乙醇，加入22μL无核酸酶水悬浮磁珠；室温静置5min，将PCR管置于磁力架上，待溶液澄清后，吸出上清20μL包含纯化的接头连接产物。
3)文库扩增
1～2号文库使用的文库扩增酶是天根TIANSeq NGS文库富集模块(NG304)。天根TIANSeq NGS文库富集模块(NG304)包括2×HiFi PCRMaster Mix和P5/P7 Primers Mix。文库扩增的反应体系如表3。
表3文库扩增反应体系
反应程序是：
文库1：98℃2min，12cycles(98℃20s，60℃30s，72℃30s)，72℃1min，保存于4℃。
文库2：98℃2min，6cycles(98℃20s，60℃30s，72℃30s)，72℃1min，保存于4℃。
文库1和文库2的大肠杆菌基因组DNA起始量不同，故扩增反应程序也相应调整。
上述扩增反应完成后进行文库纯化：处于不同PCR管之中的1号文库、2号文库分别加入50μL天根TIANSeq DNA片段分选纯化磁珠(NG316)，混匀后，室温静置孵育5min；将PCR管置于磁力架上，待溶液澄清后，吸去上清；加入200μL新鲜配制的80％乙醇静置30s，吸去上清；加入200μL新鲜配制的80％乙醇静置30s，吸干净乙醇。室温静置3min，晾干乙醇，加入22μL无核酸酶水悬浮磁珠。室温静置5min，将PCR管置于磁力架上，待溶液澄清后，吸出上清20μL为纯化后的文库，最后进行文库定量和质检。
文库浓度如表4所示，文库1和文库2的2100峰图见图1。图1的纵坐标为FU(荧光单位)，横坐标为s(秒，保留时间)。
表4文库得率
4)mapped reads(比对到参考基因组的碱基序列)中每M reads(每百万条碱基序列)的发夹结构数量见表5。
表5mapped reads中每M reads的发夹结构数量
mapped reads(％)：比对到参考基因组上的reads比例(包括单端比对和双端比对)。
Uniq mapped(％)：比对到参考基因组唯一位置的reads占比。
Average depth(x)：平均测序深度，比对到参考基因组的碱基总数除以基因组大小。
Genome Coverage(％)：基因组覆盖率。
Uniformity(％)：测序得到的数据在基因组或目标区域分布的均一程度。均一性越高越好，表明每一个位点都能均匀的测到基本一致的深度。
Duplication(％)：冗余率。
Chimera(％)：嵌合体百分率。
Hairpin structures/M：每百万reads之中的发夹结构数量。
结合实施例1的反应条件和表5可以看出，大肠杆菌基因组DNA在含有钙离子、镁离子、锰离子的打断buffer作用下，文库的每百万reads之中的发夹结构数量达到12～18万，发夹结构生成量大、占比过高。
实施例2：大肠杆菌基因组DNA在仅含有钙离子、镁离子的打断buffer作用下的打断效果本实施例利用不同起始量的大肠杆菌基因组DNA，在含有钙离子、镁离子的打断buffer作用下评估文库的发夹结构。实施例2和实施例1相比，取消了锰离子的使用。
1)大肠杆菌基因组片段化、末端修复和加A。
文库3、文库4是本申请的仅含有钙离子、镁离子的打断buffer构建的文库。
打断酶A(组合酶)组成：DNase I的用量0.001U/μL；Klenow DNA聚合酶的用量为0.2U/μL；Taq DNA聚合酶的用量0.5U/μL。实施例2的打断酶A组成和实施例1的打断酶A组成相同。
打断buffer B(含有打断反应物)组成：300mM pH为8.5的TrisHCl，400mM NaCl、7mM MgCl2、5mM CaCl2、0.5mM dNTPs。实施例2的打断buffer B和实施例1的打断bufferA不同，实施例2去除了MnCl2。
根据下表添加反应缓冲液进行大肠杆菌基因组DNA的片段化。
表6不同大肠杆菌基因组起始量的打断
反应条件是：所有文库都是37℃10min，65℃30min，反应后立即4℃保存，得到dA-Tailing产物。
表6的配比以及反应条件均和实施例1的表1及其反应条件基本相同，唯一区别在于，表6用打断buffer B代替表1的打断bufferA。
上述表6的各文库打断反应体系的总体积为50μl，文库3～4各成分浓度为：DNaseI的浓度为0.0001U/μL，Klenow DNA聚合酶的浓度为0.02U/μL，Taq DNA聚合酶的用量0.05U/μL，30mM的TrisHCl，40mM NaCl、0.7mM MgCl2，0.5mM CaCl2，0.05mM dNTPs。
2)完成打断、末端修复、加A后，可以进行接头的连接。3～4号文库根据表7配置连接合成反应体系。
对3～4号文库进行接头连接，接头引物是天根自合成的天根自合成的双端Index接头(illumina平台)。
5×Fast Ligation Buffer组成：200mM pH为7.5的TrisHCl，20mM MgCl2，10mMATP，10％PEG8000(v/v)。
T4 DNA Ligase(600U/μl)来自TIANSeq T4 DNA连接酶(快速)(NG201)。
按照下表7进行接头连接体系的配置。
表7连接反应体系
反应条件是：20℃15min，保存于4℃。
上述连接反应完成后，进行连接后文库纯化：分别在两组PCR管之中的3～4号文库加入60μL天根TIANSeq DNA片段分选纯化磁珠(NG316)，混匀后，室温静置孵育5min；将PCR管置于磁力架上，待溶液澄清后，吸去上清；加入200μL新鲜配制的80％乙醇静置30s，吸去上清；加入200μL新鲜配制的80％乙醇静置30s，吸干净乙醇；室温静置3min，晾干乙醇，加入22μL无核酸酶水悬浮磁珠；室温静置5min，将PCR管置于磁力架上，待溶液澄清后，吸出上清20μL为纯化的接头连接产物，待进行文库扩增。
3)文库扩增
3～4号文库使用的文库扩增酶是天根TIANSeq NGS文库富集模块(NG304)，天根TIANSeq NGS文库富集模块(NG304)包括2×HiFi PCRMaster Mix和P5/P7 Primers Mix。文库扩增的反应体系如表8。
表8文库扩增反应体系
反应程序是：
文库3：98℃2min，12cycles(98℃20s，60℃30s，72℃30s)，72℃1min，保存于4℃。
文库4：98℃2min，6cycles(98℃20s，60℃30s，72℃30s)，72℃1min，保存于4℃。
由于文库3和文库4的大肠杆菌基因组DNA起始量不同，故以上扩增反应程序也相应调整。
上述PCR完成后进行文库纯化：对置于两组PCR管的3～4号文库分别加入50μL天根TIANSeq DNA片段分选纯化磁珠(NG316)，混匀后，室温静置孵育5min；将PCR管置于磁力架上，待溶液澄清后，吸去上清；分别加入200μL新鲜配制的80％乙醇静置30s，吸去上清；分别加入200μL新鲜配制的80％乙醇静置30s，吸干净乙醇；室温静置3min，晾干乙醇，分别加入22μL无核酸酶水悬浮磁珠，室温静置5min，将PCR管置于磁力架上，待溶液澄清后，吸出上清20μL为纯化后的文库3和文库4，进行如下文库定量和质检。
文库3和4的浓度如表9所示，文库3和文库4的2100峰图见图2。图2的纵坐标为FU(荧光单位)，横坐标为s(秒，保留时间)。
表9文库得率
4)mapped reads中每M reads的发夹结构数量见表10。
表10mapped reads中每M reads的发夹结构数量
结合实施例2的反应条件和表10可以看出，大肠杆菌基因组DNA在含有钙离子、镁离子的打断buffer作用下，文库的每百万reads之中的发夹结构数量为689～2058。相比于实施例1，本实施例2的发夹结构占比较低。
实施例3：大肠杆菌基因组DNA在含有不同浓度的T4GP32(T4单链DNA结合蛋白)作用下的打断效果
本实施例利用相同起始量的大肠杆菌基因组DNA，在含有不同浓度的T4GP32的打断酶作用下评估文库的发夹结构产生量。
1)大肠杆菌基因组片段化、末端修复并加A。
文库5、文库6、文库7是本申请在含有不同浓度的T4GP32的打断酶作用下的文库构建。
打断酶A(组合酶)组成：DNase I的用量0.001U/μL；Klenow DNA聚合酶的用量为0.2U/μL；Taq DNA聚合酶的用量0.5U/μL。该打断酶A组成和实施例1、实施例2的打断酶A组成均相同。
打断酶A1(组合酶)组成：DNase I的用量0.001U/μL；Klenow DNA聚合酶的用量为0.2U/μL；Taq DNA聚合酶的用量0.5U/μL；T4GP32的用量是0.6μg/μL。
打断酶A2(组合酶)组成：DNase I的用量0.001U/μL；Klenow DNA聚合酶的用量为0.2U/μL；Taq DNA聚合酶的用量0.5U/μL；T4GP32的用量是2μg/μL。
打断bufferB(含有打断反应物)组成：300mM pH为8.5的TrisHCl，400mM NaCl、7mMMgCl2、5mM CaCl2、0.5mM dNTPs。本实施例3的打断bufferB和实施例2的打断bufferB相同。
根据下表添加反应缓冲液进行大肠杆菌基因组DNA的片段化。
表11不同打断酶对20ng大肠杆菌基因组的打断
文库5～7反应条件均是：37℃10min，65℃30min，反应后得到dA-Tailing产物，4℃保存。反应条件和实施例1和实施例2均相同，但大肠杆菌基因组DNA的用量不同。
上述表11的各文库打断反应体系中，总体积为50μl。文库5～7相同部分的成分浓度为：DNase I的浓度为0.0001U/μL，Klenow DNA聚合酶的浓度为0.02U/μL，Taq DNA聚合酶的用量0.05U/μL，30mM的TrisHCl，40mM NaCl，0.7mM MgCl2，0.5mM CaCl2，0.05mM dNTPs。文库5～7不同部分的成分浓度为：文库5不含T4GP32，文库6的T4GP32浓度为0.06μg/μL，文库7的T4GP32浓度为0.2μg/μL。
以下连接和扩增的反应条件和实施例1和实施例2均相同。
2)完成打断、末端修复、加A后，可以进行接头的连接。5～7号文库根据表12配置连接合成反应体系。
对5～7号文库进行接头连接，接头引物是天根自合成的天根自合成的双端Index接头(illumina平台)。
5×Fast Ligation Buffer组成：200mM pH为7.5的TrisHCl，20mM MgCl2，10mMATP，10％PEG8000(v/v)。
T4 DNA Ligase(600U/μl)来自TIANSeq T4 DNA连接酶(快速)(NG201)。
按照下表12进行接头连接体系的配置。
表12连接反应体系
三个文库的反应条件均是：20℃保持15min，反应后保存于4℃。
上述连接反应完成后，进行连接后文库的纯化。三组PCR管中的5～7号文库分别加入60μL天根TIANSeq DNA片段分选纯化磁珠(NG316)，混匀后，室温静置孵育5min；将PCR管置于磁力架上，待溶液澄清后，吸去上清；加入200μL新鲜配制的80％乙醇静置30s，吸去上清；加入200μL新鲜配制的80％乙醇静置30s，吸干净乙醇；室温静置3min，晾干乙醇，加入22μL无核酸酶水悬浮磁珠，室温静置5min；将PCR管置于磁力架上，待溶液澄清后，吸出上清20μL含纯化的接头连接产物，进行以下的文库扩增。
3)文库扩增
5～7号文库使用的文库扩增酶是天根TIANSeq NGS文库富集模块(NG304)。天根TIANSeq NGS文库富集模块(NG304)包括2×HiFi PCRMaster Mix和P5/P7 Primers Mix。文库扩增的反应体系如表13。
表13文库扩增反应体系
反应程序是：98℃2min，12cycles(98℃20s，60℃30s，72℃30s)，72℃1min，保存于4℃。
上述PCR完成后进行文库纯化。三组PCR管中的5～7号文库分别加入50μL天根TIANSeq DNA片段分选纯化磁珠(NG316)，混匀后，室温静置孵育5min；将PCR管置于磁力架上，待溶液澄清后，吸去上清；加入200μL新鲜配制的80％乙醇静置30s，吸去上清；加入200μL新鲜配制的80％乙醇静置30s，吸干净乙醇；室温静置3min，晾干乙醇，加入22μL无核酸酶水悬浮磁珠，室温静置5min，将PCR管置于磁力架上，待溶液澄清后，吸出上清20μL进行文库定量和质检。
文库5～7的浓度如表14所示，文库5～7的2100峰图见图3。图3的纵坐标为FU(荧光单位)，横坐标为s(秒，保留时间)。
表14文库得率
4)mapped reads中每M reads的发夹结构数量见表15。
表15mapped reads中每M reads的发夹结构数量
结合实施例3的反应条件和表15可以看出，相同起始量的大肠杆菌基因组DNA，在含有相同浓度的钙离子、镁离子的打断buffer作用下，以及在含有不同浓度的T4GP32的打断酶作用下，文库的每百万reads之中的发夹结构数量为278～872，在T4GP32的用量是0～2μg/μL区间，打断酶之中的T4GP32用量越大，文库的发夹结构数量越少，如文库7。
因此，本申请的片段化酶反应体系之中的各组分及其浓度选定为：DNase I的浓度为0.00005～0.0005U/μL，Klenow DNA聚合酶的浓度为0.01～0.03U/μL，Taq DNA聚合酶的浓度为0.03～0.07U/μL，TrisHCl的浓度为10～50mM，NaCl的浓度为20～60mM，MgCl2的浓度为0.5～0.9mM，CaCl2的浓度为0.3～0.7mM，dNTPs的浓度为0.03～0.07mM，不含Mn离子。
进一步优选为DNase I的浓度为0.0001U/μL，Klenow DNA聚合酶的浓度为0.02U/μL，Taq DNA聚合酶的用量0.05U/μL，还可以包含T4GP32浓度为0.06～0.2μg/μL，30mM的TrisHCl，40mM NaCl，0.7mM MgCl2，0.5mM CaCl2，0.05mM dNTPs。
以上仅是本申请的一些实施例，本申请的保护范围并不局限于上述实施例，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请创意设计前提下的若干改进和润饰，也应落入本申请的保护范围。
Claims (9)
1.一种降低DNA打断形成的发夹结构数量的片段化酶反应体系，其特征在于，所述片段化酶反应体系包括：组合酶和打断反应物；所述组合酶包括限制性内切酶和聚合酶类；所述打断反应物包括Mg2+和Ca2+，不含锰离子；在所述片段化酶反应体系之中，Mg2+的浓度为0.5~0.9mM，Ca2+的浓度为0.3~0.7mM。
2.根据权利要求1所述的降低DNA打断形成的发夹结构数量的片段化酶反应体系，其特征在于，所述组合酶还包括T4单链DNA结合蛋白。
3.根据权利要求2所述的降低DNA打断形成的发夹结构数量的片段化酶反应体系，其特征在于，所述T4单链DNA结合蛋白在所述片段化酶反应体系之中的浓度为0.06~0.2μg/μL。
4.根据权利要求1~3任一项所述的降低DNA打断形成的发夹结构数量的片段化酶反应体系，其特征在于，所述打断反应物包括TrisHCl、NaCl、MgCl2、CaCl2和dNTPs；所述打断反应物的各组分在所述片段化酶反应体系之中的浓度为：TrisHCl的浓度为10~50mM，NaCl的浓度为20~60mM，MgCl2的浓度为0.5~0.9mM，CaCl2的浓度为0.3~0.7mM，dNTPs的浓度为0.03~0.07mM。
5.根据权利要求1所述的降低DNA打断形成的发夹结构数量的片段化酶反应体系，其特征在于，所述限制性内切酶选自DNase I和dsDNase之中的一种或两种。
6.根据权利要求5所述的降低DNA打断形成的发夹结构数量的片段化酶反应体系，其特征在于，所述聚合酶类选自Klenow DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶和BST DNA聚合酶之中的一种或多种。
7.根据权利要求6所述的降低DNA打断形成的发夹结构数量的片段化酶反应体系，其特征在于，所述限制性内切酶为DNase I；所述聚合酶类为Klenow DNA聚合酶和Taq DNA聚合酶的组合；在所述片段化酶反应体系之中：DNase I的浓度为0.00005~0.0005U/μL，KlenowDNA聚合酶的浓度为0.01~0.03U/μL，Taq DNA聚合酶的浓度为0.03~0.07U/μL。
8.一种DNA文库构建方法，其特征在于，利用权利要求1~7任一项所述的片段化酶反应体系来构建DNA文库；所述DNA文库构建方法包括以下步骤：
S1，利用所述限制性内切酶在DNA链上产生缺刻，再通过所述聚合酶类进行链置换而使得DNA片段化，得到片段化DNA；继续通过所述聚合酶类对所述片段化DNA进行末端修复和3’端加A，得到DNA加A产物；
S2，使用连接酶将所述DNA加A产物与5’端带有突出T的接头连接在一起，得到DNA连接产物；
S3，对所述DNA连接产物进行纯化；
S4，将纯化后的所述DNA连接产物作为模板进行PCR扩增，构建得到DNA文库。
9.根据权利要求8所述的DNA文库构建方法，其特征在于，步骤S1的反应条件为：将DNA样品和所述片段化酶反应体系混合，并在36~38℃保持5~15min，然后60~70℃保持20~40min，使得DNA连续片段化、末端修复和3’端加A，得到DNA加A产物。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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