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CN116286726A - 一种低偏好性dna片段化的酶组合物及其反应液 - Google Patents

一种低偏好性dna片段化的酶组合物及其反应液 Download PDF

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CN116286726A
CN116286726A CN202310263158.7A CN202310263158A CN116286726A CN 116286726 A CN116286726 A CN 116286726A CN 202310263158 A CN202310263158 A CN 202310263158A CN 116286726 A CN116286726 A CN 116286726A
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CN
China
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reaction solution
enzyme composition
dna polymerase
content
endonuclease
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Application number
CN202310263158.7A
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曹振
曲文茹
秦雪梅
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Yisheng Biotechnology Shanghai Co ltd
Original Assignee
Yisheng Biotechnology Shanghai Co ltd
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Publication date
Application filed by Yisheng Biotechnology Shanghai Co ltd filed Critical Yisheng Biotechnology Shanghai Co ltd
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Abstract

本发明公开了一种低偏好性DNA片段化的酶组合物及其反应液。所述酶组合物包括核酸内切酶、核苷酸激酶和DNA聚合酶，所述核酸内切酶包括DNaseⅠ、热不稳定性耐高盐核酸内切酶HL‑SAN或核酸内切酶Ⅳ中的任意一种或至少两种的组合，所述核苷酸激酶包括T4多聚核苷酸激酶，所述DNA聚合酶包括TaqDNA聚合酶、DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段或T4DNA聚合酶中的任意一种或至少两种的组合。本发明开发了适用于一管法基因组片段化、末端修复和加A尾模块，包括酶组合物及其反应液，针对目前酶法建库存在的问题和不足，通过对各组分进行优化探究，搭配合适的连接模块，最终获得的产品具有低偏好性，产出均一性更高的文库，在二代测序中具有广阔的应用前景。

Description

一种低偏好性DNA片段化的酶组合物及其反应液
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种低偏好性DNA片段化的酶组合物及其反应液。
背景技术
近几十年间，DNA测序技术被应用于分子生物学相关研究当中，极大的推进了该领域的快速发展。虽然一代DNA测序技术高达1000bp的读长和99.99％的准确性帮助研究者完成了大量的测序工作，但一代测序速度慢、成本高和通量低等方面的不足难以支撑测序需求的增长。第二代测序(Next-generation sequencing，NGS)又称为高通量测序(High-throughput sequencing，HTS)，因其具有低成本、高通量等优点，被逐渐广泛应用于科学研究和临床实践等领域。
第二代测序的主要流程分为三部分，包括文库构建、基因测序和生信分析。其中，文库构建作为NGS测序的初始步骤，产出的文库对于最终的测序结果有着重要的影响，因此，做好文库构建提高文库质量显得尤为重要。基于二代测序的短读长特性，DNA文库构建的第一步需要将宏基因组片段化，目前有机械法和片段化酶法可以完成基因组DNA的打断。相较于传统机械法打断对于设备的过高要求和较长的操作时间，片段化酶法打断以其操作简便、时间短成本低等优点得到越来越广泛的应用。
但与传统机械打断法的无偏好性随机切割相比，片段化酶打断法会有偏好性的选择DNA双链上的酶切位点进行切割，这就导致了文库中随机片段的丰度和多样性降低，产出的文库均一性较差，会使基因上的不同区域测序深度产生较大偏差，从而在测序时部分丰度较低的基因位点比较难检出，可能会出现漏检的情况。使用加大测序深度的方式可以减少漏检位点，但又会造成大量的数据浪费。
综上所述，目前片段化酶打断法存在文库中随机片段的丰度和多样性低，产出的文库均一性较差，基因上的不同区域测序深度存在较大偏差，在测序时部分丰度较低的基因位点难以检出，存在漏检等问题。提供一种用于DNA片段化的酶组合物及其反应液，适用于一管法基因组片段化、末端修复和加A尾模块，获得具有低偏好性，产出均一性更高的文库，已成为目前生物技术领域亟待解决的问题之一。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种低偏好性DNA片段化的酶组合物及其反应液，解决了目前片段化酶打断法存在的文库中随机片段的丰度和多样性低，产出的文库均一性较差，基因上的不同区域测序深度存在较大偏差，在测序时部分丰度较低的基因位点难以检出，存在漏检等问题。本发明提供的酶组合物及其反应液通用性好，适用于各种的类型的二代测序反应。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种低偏好性DNA片段化的酶组合物，所述酶组合物包括核酸内切酶、核苷酸激酶和DNA聚合酶，所述核酸内切酶包括DNaseⅠ、热不稳定性耐高盐核酸内切酶HL-SAN或核酸内切酶Ⅳ中的任意一种或至少两种的组合，所述核苷酸激酶包括T4多聚核苷酸激酶，所述DNA聚合酶包括Taq DNA聚合酶、DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段或T4 DNA聚合酶中的任意一种或至少两种的组合。
本发明开发了适用于一管法基因组片段化、末端修复、5’磷酸化和3’加A尾模块，包括酶组合物及其反应液，能够降低DNA片段化的偏好性，针对目前酶法建库存在的问题和不足，通过对各组分进行优化探究，搭配合适的连接模块，最终获得的产品具有低偏好性，产出均一性更高的文库，在二代测序中具有广阔的应用前景。
优选的，所述酶组合物包括以下组合物中的任意一种：
(1)DNaseⅠ、Taq DNA聚合酶、DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段和T4多聚核苷酸激酶的组合物；
(2)热不稳定性耐高盐核酸内切酶HL-SAN、Taq DNA聚合酶、DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段和T4多聚核苷酸激酶的组合物；
(3)DNaseⅠ、核酸内切酶Ⅳ、Taq DNA聚合酶、DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段、T4 DNA聚合酶和T4多聚核苷酸激酶的组合物。
优选的，所述酶组合物中DNaseⅠ的浓度为0.1-3U/μL。
上述0.1-3中的具体点值可以选择0.1、0.5、1、1.5、2、2.5、3等。
优选的，所述酶组合物中热不稳定性耐高盐核酸内切酶HL-SAN的浓度为0.01-3U/μL。
上述0.01-3中的具体点值可以选择0.01、0.05、0.08、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、1.9、2、2.2、2.5、2.7、2.8、3等。
优选的，所述酶组合物中核酸内切酶Ⅳ的浓度0.005-2U/μL。
上述0.005-2中的具体点值可以选择0.005、0.008、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.2、1.5、1.7、1.8、2等。
优选的，所述酶组合物中Taq DNA聚合酶的浓度2-35U/μL。
上述2-35中的具体点值可以选择2、6、9、12、20、25、29、30、31、32、33、34、35等。
优选的，所述酶组合物中DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段的浓度为0.01-7.8U/μL。
上述0.01-7.8中的具体点值可以选择0.01、0.05、0.08、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、1.7、2.8、3.9、4、5、6、7、7.8等。
优选的，所述酶组合物中T4 DNA聚合酶的浓度0.3-40U/μL。
上述0.3-40中的具体点值可以选择0.3、0.5、1、2、3、8、10、20、30、32、33、34、36、38、39、40等。
优选的，所述酶组合物中T4多聚核苷酸激酶的浓度为0.1-3U/μL。
上述0.1-3中的具体点值可以选择0.2、0.5、1、1.5、2.5等。
第二方面，本发明提供了一种酶组合物的反应液，所述反应液包括：二糖和/或二糖衍生物。
本发明反应液中二糖或二糖衍生物能够维持蛋白的结构稳定性，增强酶的蛋白功能结构域非特异性识别切割DNA双链上的位点的能力，能够促进酶组合物之间的协同作用，进一步降低产生文库的偏好性。
优选地，所述二糖包括蔗糖。
优选地，所述二糖衍生物包括水苏糖。
优选的，所述反应液中蔗糖的浓度为50-120mM。
上述50-120中的具体点值可以选择50、60、70、80、90、100、110、120等。
优选地，所述反应液中水苏糖的浓度为30-80mM。
上述30-80中的具体点值可以选择30、40、50、60、70、80等。
优选地，所述反应液还包括缓冲液、金属盐离子、去垢剂、ATP、dATP和dNTP。
优选地，所述缓冲液包括三羟甲基氨基甲烷醋酸盐、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐或4-羟乙基哌嗪乙磺酸中的任意一种或至少两种的组合。
优选的，所述反应液中三羟甲基氨基甲烷醋酸盐的含量为50-200mM，pH为7-8.5。
上述50-200中的具体点值可以选择50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、190、200等。
优选的，所述反应液中三羟甲基氨基甲烷盐酸盐的含量为100-150mM，pH为7-9。
上述7-9中的具体点值可以选择7、8、9等。
上述100-150中的具体点值可以选择100、110、120、130、140、150等。
优选的，优选地，所述反应液中4-羟乙基哌嗪乙磺酸的含量为100-180mM，pH为7-9。
上述7-9中的具体点值可以选择7、8、9等。
上述100-180中的具体点值可以选择100、110、120、130、140、150、160、180等。
优选的，所述金属盐离子包括CaCl2、MgCl2、ZnCl2、NaCl或KCl中的任意一种或至少两种的组合。
优选的，所述反应液中CaCl2的含量为15-50mM。
上述20-50中的具体点值可以选择15、30、40、50等。
优选的，所述反应液中MgCl2的含量为35-200mM。
上述50-200中的具体点值可以选择35、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、190、200等。
优选的，所述反应液中ZnCl2的含量为20-80mM。
上述20-80中的具体点值可以选择20、30、40、50、60、70、80等。
优选的，所述反应液中NaCl的含量为20-200mM。
上述20-200中的具体点值可以选择20、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、190、200等。
优选的，所述反应液中KCl的含量为30-80mM。
上述30-80中的具体点值可以选择30、40、50、60、70、80等。
优选的，所述去垢剂包括DTT、TritonⅩ-100、Tween-20或NP-40中的任意一种或至少两种的组合。
优选的，所述反应液中DTT的含量为10-50mM。
上述10-50中的具体点值可以选择10、20、30、40、50等。
优选的，所述反应液中TritonⅩ-100的含量为0.1-1％。
上述0.1-1中的具体点值可以选择0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1等。
优选的，所述反应液中Tween-20的含量为0.01-1％。
上述0.01-1中的具体点值可以选择0.01、0.05、0.08、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1等。
优选的，所述反应液中NP-40的含量为0.01-1％。
上述0.01-1中的具体点值可以选择0.01、0.05、0.08、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1等。
优选的，所述反应液中dATP的含量为0.2-8mM，优选为2-4mM。
上述0.2-8中的具体点值可以选择0.2、0.3、0.4、1、2、3、4、5、6、7、8等。
上述2-4中的具体点值可以选择2、3、4等。
所述反应液中dNTP的含量为0.02-2mM，优选为0.02-1mM。
上述0.02-2中的具体点值可以选择0.02、0.03、0.4、0.8、1、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2等。
所述反应液中ATP的含量为5-15mM。
上述5-10中的具体点值可以选择5、6、7、8、9、10、11、15等。
第三方面，本发明提供了一种构建测序文库的方法，所述方法包括：将靶核酸加入如第一方面所述的酶组合物和第二方面所述的反应液的混合液中，孵育，进行靶核酸的片段化、末端修复、5’磷酸化和3’加A尾。
第四方面，本发明提供了一种用于构建测序文库的试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述的酶组合物或第二方面所述的反应液。
优选地，所述试剂盒还包括测序接头和连接反应试剂。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明开发的一管法基因组片段化、末端修复和加A尾模块，包括酶组合物及其反应液，针对目前酶法建库存在的问题和不足，通过对各组分进行优化探究，搭配连接模块使用，并通过对待测DNA样本完成二代测序全流程实验，从最终测序结果来验证本发明提供的酶组合物及其反应液的效果，进一步证实了其在二代测序的生产中具有切实的应用价值。
(2)本发明提供的方案，通用性好，适用于各种的类型的二代测序反应。在PCRfree文库的构建应用中，靶基因经过片段化、末端修复和加A和接头连接反应两个步骤得到的未经PCR扩增的文库。构建PCR free文库进行测序的好处是更加快速高效，并且可以避免PCR扩增带来的保真性差等问题，本发明提供的酶组合物及其反应液解决了在PCR free建库的过程中，高投入量下酶切位点偏好性和GC偏好性高问题。
附图说明
图1为实施例1酶切建库测序reads碱基分布图；
图2为实施例2酶切建库测序reads碱基分布图；
图3为实施例3酶切建库测序reads碱基分布图；
图4为实施例4酶切建库测序reads碱基分布图；
图5为实施例5酶切建库测序reads碱基分布图；
图6为实施例6酶切建库测序reads碱基分布图；
图7为12619酶切建库测序reads碱基分布图；
图8为实施例1酶切建库测序不同GC区域覆盖度分布图；
图9为实施例2酶切建库测序不同GC区域覆盖度分布图；
图10为实施例3酶切建库测序不同GC区域覆盖度分布图；
图11为实施例4酶切建库测序不同GC区域覆盖度分布图；
图12为实施例5酶切建库测序不同GC区域覆盖度分布图；
图13为实施例6酶切建库测序不同GC区域覆盖度分布图；
图14为12619酶切建库测序不同GC区域覆盖度分布图。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例涉及的蛋白酶来源如表1所示。
表1
Figure BDA0004132082990000091
实施例1
本实施例提供一种酶组合物及其反应液：DNaseⅠ1.5U/μL，Taq DNA聚合酶1U/μL，DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段2U/μL，T4多聚核苷酸激酶1U/μL，反应液：Tris-Acetate 75mMpH7.5，CaCl220 mM，MgCl245 mM，NaCl 20mM，ZnCl250 mM，TritonⅩ-1000.1％，Tween-200.01％，dATP 2mM，dNTP 0.2mM，ATP 9mM。
实施例2
本实施例提供一种酶组合物及其反应液：热不稳定性耐高盐核酸内切酶HL-SAN0.5U/μL，Taq DNA聚合酶5U/μL，DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段2U/μL，T4多聚核苷酸激酶1U/μL；反应液：HEPES 120mM pH7.5，CaCl235 mM，MgCl235mM，NaCl 30mM，KCl 60mM，TritonⅩ-1000.1％，Tween-200.05％，NP-400.05％，dATP 2mM，dNTP 0.2mM，ATP 15mM。
实施例3
本实施例提供一种酶组合物及其反应液：DNaseⅠ1U/μL，核酸内切酶Ⅳ0.05U/μL，Taq DNA聚合酶9U/μL，DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段2U/μL，T4 DNA聚合酶0.5U/μL，T4多聚核苷酸激酶2U/μL；反应液：Tris-HCl 100mM pH7.5，CaCl215 mM，MgCl250 mM，NaCl 30mM，NP-400.02％，Tween-200.01％，dATP 2mM，dNTP 0.2mM，ATP 9mM。
实施例4
本实施例提供一种酶组合物及其反应液：DNaseⅠ1.5U/μL，Taq DNA聚合酶1U/μL，DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段2U/μL，T4多聚核苷酸激酶1U/μL，反应液：蔗糖50mM，Tris-Acetate 75mM pH7.5，CaCl220 mM，MgCl245 mM，NaCl 20mM，ZnCl250 mM，TritonⅩ-1000.1％，Tween-200.01％，dATP 2mM，dNTP 0.2mM，ATP 9mM。本实施例与实施例1的区别仅在于：反应液中还添加蔗糖50mM。
实施例5
本实施例提供一种酶组合物及其反应液：热不稳定性耐高盐核酸内切酶HL-SAN0.5U/μL，Taq DNA聚合酶5U/μL，DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段2U/μL，T4多聚核苷酸激酶2U/μL；反应液：蔗糖120mM，HEPES 120mM pH7.5，CaCl235 mM，MgCl235mM，NaCl 30mM，KCl 60mM，TritonⅩ-1000.1％，Tween-200.05％，NP-400.05％，dATP 2mM，dNTP 0.2mM，ATP 15mM。本实施例与实施例2的区别仅在于：反应液中还添加蔗糖120mM。
实施例6
DNaseⅠ1U/μL，核酸内切酶Ⅳ0.05U/μL，Taq DNA聚合酶9U/μL，DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段2U/μL，T4 DNA聚合酶0.5U/μL，T4多聚核苷酸激酶12U/μL；反应液：水苏糖30mM，Tris-HCl 100mM pH7.5，CaCl215 mM，MgCl250mM，NaCl 30mM，NP-400.02％，Tween-200.01％，dATP 2mM，dNTP 0.2mM，ATP 9mM。本实施例与实施例3的区别仅在于：反应液中还添加水苏糖30mM。
实施例7
构建PCR free测序文库。
本实例以human female gDNA为模板，起始投入量为1000ng，使用实施例1-6中的不同酶组合物及其搭配的反应液对gDNA模板进行片段化/末端修复/5’磷酸化/3’加A尾，搭配翌圣生物
Figure BDA0004132082990000111
Rapid DNA Ligation Module for kit(#13580)和华大智造MGIEasyPFAdapters(#1000013460)进行接头连接反应，使用/>
Figure BDA0004132082990000112
Smarter DNAClean Beads(#12600)对接头连接产物进行纯化分选，获得可供测序的PCR free文库。
本实例还使用商业化翌圣生物
Figure BDA0004132082990000113
OnePot Pro DNA FragmentationReagent(#12619)进行对比。对gDNA模板进行片段化/末端修复/5’磷酸化/3’加A尾，搭配翌圣生物/>
Figure BDA0004132082990000114
Rapid DNA Ligation Module for kit(#13580)和华大智造MGIEasyPF Adapters(#1000013460)进行接头连接反应，使用翌圣生物/>
Figure BDA0004132082990000121
Smarter DNAClean Beads(#12600)对接头连接产物进行纯化分选，构建PCR free文库，具体操作步骤参考说明书。
靶DNA的片段化/末端修复/5’磷酸化/3’加A尾反应体系如表2所示，其中，酶组合物的配方分别采用实施例1-6，反应条件为30℃孵育15min、65℃孵育20min。
表2
组分 用量
靶DNA 1000ng
酶组合物 5μL
反应液 10μL
1×TE 补齐至60μL
将得到的片段化/末端修复/5’磷酸化/3’加A尾产物直接进行接头连接反应，反应体系如表3，反应条件为20℃孵育15min。
表3
组分 用量
片段化/末端修复/5’磷酸化/3’加A尾 60μL
连接反应缓冲液(Ligation Enhancer) 30μL
MGIEasy PF Adapters 5μL
连接酶(Rapid T4 DNA Ligase2.0) 5μL
孵育后得到的接头连接产物使用
Figure BDA0004132082990000122
Smarter DNA Clean Beads进行分选，分选比例为0.7/0.2×，22μL无菌ddH2O洗脱，回收20μL，即为可供上机测序的PCRfree文库，测序使用MGI DNBSEQ-T7平台，模式为PE150。
对测序数据进行分析，使用fastp 0.23.1过滤原始数据中包含接头序列和低质量的Reads，得到高质量的测序数据(Clean Reads)，每个样本取相同Clean Reads数据量，使用FastQC 0.11.9分析选取后的Clean Reads，根据分析结果中的Perbase sequencecontent指标对应的碱基波动的大小作为酶切打断偏好性的指标，波动程度大，酶切打断偏好性越严重。实验分析结果如图1-7所示。
使用bwa0.7.17将选取的Clean Reads与hg38参考基因组进行比对，使用Samtools1.16.1对比对文件进行排序，使用picard.jar 1.86.0的Collect GC Bias Metrics模块分析基因组不同GC区域的覆盖度信息，根据展示的基因组不同GC区域覆盖度的结果判断酶切对于基因组不同GC含量区域的打断偏好。实验分析结果如图8-14所示。
结果：由图7可知翌圣生物
Figure BDA0004132082990000131
OnePot Pro DNA FragmentationReagent(#12619)酶切位点碱基波动值为4-50％；本发明中应用实施例1酶切位点碱基波动值为12-42％(图1)，对应添加二糖的实施例4酶切位点碱基波动值为16％-38％(图4)；实施例2酶切位点碱基波动值为16％-40％(图2)，对应添加二糖的实施例5酶切位点碱基波动值为18％-39％(图5)；实施例3酶切位点碱基波动值为15％-40％(图3)，对应添加二糖衍生物的实施例6酶切位点碱基波动值为18％-36％(图6)。和/>
Figure BDA0004132082990000132
OnePot Pro DNAFragmentation Reagent(#12619)相比，本发明中的实施例在酶切位点偏好性上有很大程度的改善。其中实施例1-6选用不同的酶组合物结果酶切位点碱基波动减小，偏好性降低；进一步地，实施例4、实施例5、实施例6分别添加二糖或二糖衍生物结果比单纯酶组合物效果更好，酶切位点碱基波动进一步减小，偏好性进一步降低，实施例6选用的酶组合物及其反应液为最优选的组合，结果酶切位点碱基波动最小，偏好性最低。
不同GC区域的覆盖度越接近平均值1，GC偏好性越小，均一性越好，实施例1-6的GC偏好性结果如图8-13所示。
结果：实施例1-6的GC偏好性结果(图8-图13)均好于翌圣生物
Figure BDA0004132082990000141
OnePot Pro DNAFragmentation Reagent(#12619)(图14)说明利用本发明的酶组合物及反应液能够最终获得具有低偏好性的DNA片段，产出的文库均一性更高，在二代测序中具有广阔的应用前景。其中实施例4的GC偏好性相较于实施例1结果更好，实施例5的GC偏好性相较于实施例2结果更好，实施例6的GC偏好性相较于实施例3结果更好。实施例6的GC偏好性最低，结果最好，说明实施例6的酶组合物及反应液能够最终获得具有低偏好性的DNA片段，产出的文库均一性最佳，在二代测序中具有广阔的应用前景。
综上所述，在二代测序文库构建的流程中，第一步片段化、末端修复、加A尾反应对最终的文库质量起到非常重要的作用，本发明通过对该步骤的酶组合物及其对应的反应液进行探究，对各组分浓度、种类、数量进行协同优化，最终解决了高投入量下，酶切法建库产出的文库均一性差的问题，很大程度上降低了文库酶切位点偏好性和GC偏好性。并通过对待测DNA样本完成二代测序全流程实验，从最终测序结果来验证本发明提供的酶组合物及其反应液的效果，进一步证实了其在二代测序的生产中具有切实的应用价值。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种低偏好性DNA片段化的酶组合物，其特征在于，所述酶组合物包括核酸内切酶、核苷酸激酶和DNA聚合酶；
所述核酸内切酶包括DNaseⅠ、热不稳定性耐高盐核酸内切酶HL-SAN或核酸内切酶Ⅳ中的任意一种或至少两种的组合；
所述核苷酸激酶包括T4多聚核苷酸激酶；
所述DNA聚合酶包括TaqDNA聚合酶、DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段或T4DNA聚合酶中的任意一种或至少两种的组合。
2.根据权利要求1所述的酶组合物，其特征在于，所述酶组合物包括以下组合物的任意一种：
(1)DNaseⅠ、TaqDNA聚合酶、DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段和T4多聚核苷酸激酶的组合物；
(2)热不稳定性耐高盐核酸内切酶HL-SAN、TaqDNA聚合酶、DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段和T4多聚核苷酸激酶的组合物；
(3)DNaseⅠ、核酸内切酶Ⅳ、TaqDNA聚合酶、DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段、T4DNA聚合酶和T4多聚核苷酸激酶的组合物。
3.根据权利要求1或2所述的酶组合物，其特征在于，所述酶组合物中DNaseⅠ的浓度为0.1-3U/μL；
优选地，所述酶组合物中热不稳定性耐高盐核酸内切酶HL-SAN的浓度为0.01-3U/μL；
优选地，所述酶组合物中核酸内切酶Ⅳ的浓度0.005-2U/μL；
优选地，所述酶组合物中TaqDNA聚合酶的浓度2-35U/μL；
优选地，所述酶组合物中DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段的浓度为0.01-7.8U/μL；
优选地，所述酶组合物中T4DNA聚合酶的浓度0.3-40U/μL；
优选地，所述酶组合物中T4多聚核苷酸激酶的浓度为0.1-3U/μL。
4.一种酶组合物的反应液，其特征在于，所述反应液包括：二糖和/或二糖衍生物；
优选地，所述二糖包括蔗糖；
优选地，所述二糖衍生物包括水苏糖；
优选地，所述反应液中蔗糖的浓度为50-120mM；
优选地，所述反应液中水苏糖的浓度为30-80mM。
5.根据权利要求4所述的反应液，其特征在于，所述反应液还包括缓冲液、金属盐离子、去垢剂、ATP、dATP和dNTP。
6.根据权利要求5所述的反应液，其特征在于，所述缓冲液包括三羟甲基氨基甲烷醋酸盐、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐或4-羟乙基哌嗪乙磺酸中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述反应液中三羟甲基氨基甲烷醋酸盐的含量为50-200mM，pH为7-8.5；
优选地，所述反应液中三羟甲基氨基甲烷盐酸盐的含量为100-150mM，pH为7-9；
优选地，所述反应液中4-羟乙基哌嗪乙磺酸的含量为100-180mM，pH为7-9。
7.根据权利要求5或6所述的反应液，其特征在于，所述金属盐离子包括CaCl2、MgCl2、ZnCl2、NaCl或KCl中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述反应液中CaCl2的含量为15-50mM；
优选地，所述反应液中MgCl2的含量为35-200mM；
优选地，所述反应液中ZnCl2的含量为20-80mM；
优选地，所述反应液中NaCl的含量为20-200mM；
优选地，所述反应液中KCl的含量为30-80mM。
8.根据权利要求5-7中任一项所述的反应液，其特征在于，所述所述去垢剂包括DTT、TritonⅩ-100、Tween-20或NP-40中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述反应液中DTT的含量为10-50mM；
优选地，所述反应液中TritonⅩ-100的含量为0.1-1％；
优选地，所述反应液中Tween-20的含量为0.01-1％；
优选地，所述反应液中NP-40的含量为0.01-1％；
优选地，所述反应液中dATP的含量为0.2-8mM，更优选为2-4mM；
优选地，所述反应液中dNTP的含量为0.02-2mM，更优选为0.02-1mM；
优选地，所述反应液中ATP的含量为5-15mM。
9.一种构建测序文库的方法，其特征在于，所述方法包括：将靶核酸加入如权利要求1-3中任一项所述的酶组合物和4-8中任一项所述的反应液的混合液中，孵育，进行靶核酸的片段化、末端修复、5’磷酸化和3’加A尾。
10.一种用于构建测序文库的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-3中任一项所述的酶组合物或4-8中任一项所述的反应液；
优选地，所述试剂盒还包括测序接头和连接反应试剂。
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