CN118006750A - 一种基于Cxorf65基因的脑卒中诊断试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于Cxorf65基因的定量聚合酶链式反应（qPCR）扩增试剂盒及其在脑卒中诊断中的应用。相比健康人，脑卒中病人外周血细胞显著降低表达Cxorf65。应用脑卒中病人外周血细胞显著降低表达Cxorf65基因的特点制备基于Cxorf65基因的脑卒中诊断试剂盒。所述试剂盒包含用于扩增Cxorf65基因和管家基因（β‑actin）的引物对及qPCR反应体系（SYBR Green荧光染料、PCR缓冲液、dNTPs）。利用该试剂盒可以快速定量检测Cxorf65的表达情况，从而检测脑卒中情况。本发明为早期诊断脑卒中提供了结果更为灵敏与稳定、操作更为简便与快速的诊断试剂盒。
Description
技术领域
本发明属于脑卒中发病相关基因检测领域，更具体地说是本发明以Cxorf65基因在脑卒中病人外周血细胞中表达显著下降为基础，涉及一种基于Cxorf65基因的脑卒中诊断试剂盒及Cxorf65基因在制备脑卒中诊断试剂盒中的应用，本发明也涉诊断脑卒中的方法。
背景技术
“脑卒中”（cerebral stroke）又称“中风”、“脑血管意外”（cerebralvascularaccident，CVA）。是一种急性脑血管疾病，是由于脑部血管突然破裂或因血管阻塞导致血液不能流入大脑而引起脑组织损伤的一组疾病，包括缺血性和出血性卒中。缺血性卒中的发病率高于出血性卒中，占脑卒中总数的60%～70%。颈内动脉和椎动脉闭塞和狭窄可引起缺血性脑卒中，年龄多在40岁以上，男性较女性多，严重者可引起死亡。出血性卒中的死亡率较高。调查显示，城乡合计脑卒中已成为我国第一位死亡原因，也是中国成年人残疾的首要原因，脑卒中具有发病率高、死亡率高和致残率高的特点。
不同类型的脑卒中，其治疗方式不同。由于一直缺乏有效的治疗手段，认为预防是最好的措施，要提早预防就需要尽早诊断。诊断技术包括神经学检查，电脑断层扫描（多数情况下没有对比增强）或核磁共振，多普勒超声和造影，主要靠临床症状，辅以成像技术。成像技术也可帮助确定卒中的亚型和原因。此外血液测试也可以帮助诊断。
然而，由于脑卒中的发病机制仍然不清等问题，使得这种疾病不能有效地被诊断。因此，需要研究脑卒中的关键发病基因和以关键发病基因为基础的诊断方法被认为是至关重要的。寻找早期诊断指标就显得非常重要。
本发明通过对健康人和脑卒中病人临床样本进行高通量mRNA表达谱测序分析，发现Cxorf65是脑卒中患者中一个显著降低表达的新基因。我们研究进一步表明，一种基于Cxorf65基因的脑卒中诊断试剂盒及Cxorf65基因在制备脑卒中诊断试剂盒中的应用。因此，该基因可能成为脑卒中一个新的诊疗靶点。
发明内容
为了弥补现有脑卒中诊断靶点的不足，本发明的目的在于提供一种基于Cxorf65基因的定量聚合酶链式反应（qPCR）扩增试剂盒及其在脑卒中诊断中的应用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明通过对健康人和脑卒中病人外周血细胞样本进行高通量mRNA表达谱测序分析，发现Cxorf65是脑卒中患者中一个显著降低表达的新基因。通过检测Cxorf65基因转录水平的表达情况，可以判断受试者是否患有脑卒中。
由于Cxorf65基因的在脑卒中患者外周血细胞样本中转录水平较健康人外周血细胞样本显著降低，可以根据这一特点，以Cxorf65基因为基础为制备基于Cxorf65基因的脑卒中诊断试剂盒提供依据。Cxorf65基因在制备基于Cxorf65基因的脑卒中诊断试剂盒中的应用，其特征在于所述诊断试剂盒包含使用qPCR扩增Cxorf65基因用的引物对，所述引物分别为：
上游引物序列：5’- ccttacagctcgaagcacct -3’，如SEQ ID NO：1所示；
下游引物序列：5’- aggctccggattcttgagga -3’，如SEQ ID NO：2所示。
本发明的另一目的是提供一种基于Cxorf65基因的脑卒中诊断试剂盒，所述试剂盒包含qPCR扩增Cxorf65基因用的引物，引物可以根据引物设计的常规设计原则设计。优选的实施方案中所述引物分别为：
上游引物序列：5’- ccttacagctcgaagcacct -3’，如SEQ ID NO：1所示；
下游引物序列：5’- aggctccggattcttgagga -3’，如SEQ ID NO：2所示。
所述诊断试剂盒还包含管家基因β-actin引物，引物对可以根据引物设计的常规设计原则设计。优选的实施方案中所述引物分别为：
上游引物序列：5’- gcaggagtacgatgagtccg -3’，如SEQ ID NO：3所示；
下游引物序列：5’- acgcagctcagtaacagtcc -3’, 如SEQ ID NO：4所示。
所述诊断试剂盒还包含qPCR扩增反应体系，所述qPCR扩增反应体系包含SYBRGreen荧光染料、PCR缓冲液、dNTPs。
上述技术方案中，所述PCR缓冲液为本领域的公知现有技术，优选地，PCR缓冲液包含：200 mM (NH4)2SO4、20mM KCl、2.5mM MgCl2。
在本发明的一个具体实施方案中，本发明的诊断试剂盒还包含M-MLV逆转录体系，该逆转录体系包含：、逆转录反应液、M-MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂、dNTPs、Oligo(dT)。
优选逆转录反应液包含： 15 mM的MgCl2、370 mM的KCL、250 mM PH8.3的Tris-HCL、50 mM的DTT。
RNA酶抑制剂可选用本领域常用的RNA酶抑制剂，优选为大肠杆菌表达的重组RNA蛋白酶抑制剂。
在本发明的一个具体的实施方案中，本发明的诊断试剂盒还包含RNA提取试剂，RNA提取试剂包含Trizol、氯仿、异丙醇、75％乙醇。
本发明的诊断试剂盒保存于-20℃，尽量减少反复冻融。
本发明还提供了诊断脑卒中的方法，所述方法包括：
(1) 利用RNA提取试剂提取样本总RNA；
(2) 将步骤(1)获得的RNA逆转录成cDNA；
(3) 在qPCR仪上将Cxorf65基因和管家基因进行扩增；
(4) 通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量；
(5) Cxorf65基因表达显著降低，表明研究对象为脑卒中患者。
本发明的优点和有益效果在于：
（1）本发明首次发现了外周血细胞Cxorf65的表达水平与脑卒中的关系，通过检测受试者中Cxorf65基因表达的水平，可以判断其是否患有脑卒中，从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案；
（2）本发明首次为以Cxorf65基因为靶点在制备诊断试剂盒或治疗试剂等方面提供依据；
（2）本发明发现Cxorf65诊断试剂盒诊断脑卒中，相比现有的诊断手段，该方法准确性高、副作用低，有利于实现脑卒中的早期筛查及准确判断是否脑卒中。
附图说明
图1显示了脑卒中病人外周血细胞中Cxorf65 mRNA表达水平显著降低。Health代表25例健康人外周血细胞样本，Stroke代表25例脑卒中病人外周血细胞样本，Cxorf65mRNA (Relative expression) 代表健康人和脑卒中病人外周血细胞样本中Cxorf65 mRNA与各自样本中内参β-actin mRNA 比值然后各样本比值除以第一个健康人样本比值。图中每个点代表一个样本，***表示显著性统计分析p值 < 0.001。
具体的实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。本发明的实施例仅用于解释本发明而不用于限制本发明的范围。
下述实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册（New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1 脑卒中病人显著降低表达Cxorf65
一、材料与方法
1、材料
6例脑卒中病人外周血和6例对照健康人外周血
2、方法
2.1、脑卒中病例组和健康人外周血细胞分离
按照外周血细胞分离试剂盒说明书分离脑卒中病例组和健康人外周血细胞，主要操作步骤如下：
(1).抽取人的外周血于肝素抗凝管中，取足5 mL新鲜血液，加入PBS按1：1稀释血液（一般采血管2 mL+2 mL）。
(2).取淋巴细胞分离液5 mL于15 mL灭菌离心管中待用。
(3).吸取稀释血液，在离分层液上方1 cm处，沿试管壁徐徐加入，使稀释血液重叠于分层液上，并与分离液形成明显界面。
(4).室温，离心2000 rpm，20 min。此时离心管中形成5层：最上面是血浆，血浆层和淋巴细胞分离液之间是淋巴细胞层呈白膜状。
(5).小心吸取中间呈白膜状的单个核细胞层，尽量全部吸出单个核细胞。加5倍以上体积的PBS洗2次，每次离心1500 rpm，10 min。
(6).去上清液，加入1640培养基1 mL混匀，取少量进行细胞计数。
(7).用台盼蓝染液检查所分离的细胞活性：取2滴细胞悬液加1滴2%台盼蓝染液，5-10 min后取样作湿片高倍镜检。活细胞不着色，死细胞染成蓝色。计数200个细胞，计算活细胞百分率，活性应在95％以上。
2.2、脑卒中病例组和健康人外周血总RNA的提取
按Trizol试剂盒说明书提取脑卒中病例组和健康人外周血B细胞的RNA，主要操作步骤如下：
(1).用胞裂解液裂解组织细胞，离心取上层细胞。在上层细胞中加入l ml的Trizol，用带针头的一次性注射器抽打裂解物10次。
(2).静置5分钟后，加入200 μl的氯仿，用力颠倒离心管混匀后，室温静置使之分层，12000 g离心5分钟，小心移取水相至1.5 ml的离心管中。
(3).加入等体积的异丙醇，彻底混匀后，取出750μl移入吸附柱，离心30秒，倒掉收集管中的液体，将吸附柱移入同一收集管中，将剩余的全部将入吸附柱中，离心30秒。倒掉收集管中的液体，将吸附柱移入同一个收集管中。
(4).加入500 μl RP液，离心30秒。倒掉收集管中的液体，将吸附柱移入同一收集管中。
(5).加入500 μl的W3液，静置1分钟，离心15秒。将吸附柱移入一个干净的收集管中，加入500 μl W3液，离心15秒。
(6).倒掉收集管中的液体，再将吸附柱移入同一收集管中，离心1分钟。
(7).将吸附柱放入另一个干净的1.5 ml的离心管中，在吸附膜中央加入50μl纯水，室温静置l分钟后，离心1分钟。将RNA贮存于-70℃。
(8).总RNA完整性鉴定：取2 μl RNA样品在1.5％琼脂糖凝胶电泳(80 v，15 min)，分出区带后，EB染色，紫外灯下观察电泳区带。
(9).用核酸蛋白仪测定RNA的浓度和纯度
2.3、脑卒中病例组和健康人外周血mRNA转录组文库的构建及测序
按转录组文库的构建及测序试剂盒说明书对脑卒中病例组和健康人外周血B细胞的总RNA进行转录组文库的构建及测序，主要操作步骤如下：
(1).利用QIAGEN公司的RNeasy MinElute Cleanup Kit从上述得到的总RNA纯化转录mRNA，具体步骤见说明书。
(2).利用Single-end library建库方法，共得到脑卒中病例组和健康人外周血B细胞mRNA转录组文库。
(3).将上述mRNA转录组文库进行高通量测序，在Illumina HiSeq 4000上进行测序，以获得150bp的配对末端读数。
(4).Illumina Casava1.8软件对适配器序列的序列读取进行修剪，对低复杂度或低质量序列进行过滤。使用Bowtie 2版本2.2.2将人类基因组hg19 Refseq进行比对。使用Genome_build:hg19计算序列大小（FPKM）。
(5).使用独立工具FastQC对每个样品进行预校准QC，独立进行正向和反向读取。
(6).使用Trimmomatic去除Illumina适配器并丢弃长度小于50个碱基的读数来修剪读数。
(7).使用HISAT2将读数与参考基因组（hg19）对齐。
(8).使用Picards Tools中的MarkDuplicates功能去除PCR重复。
(9).使用来自UCSC的人类hg19-RefSeq使用HTSeq生成计数。
2.4、脑卒中病例组和健康人外周血mRNA转录组分析
(1).通过使用Illumina HiSeq 4000测序平台，采用单端测序方法，测到脑卒中病例组和健康人外周血B细胞的mRNA转录组数据。
(2).利用Single-end library建库方法，共得到两个mRNA转录组数据，分别为：脑卒中病例组mRNA转录组数据，健康人的mRNA转录组数据。
(3).为了分析脑卒中病例组和对照健康人mRNA的差异表达，先将脑卒中病例组和对照健康人两个mRNA转录组的各个mRNA标准化，标准化之后的表达量＝实际表达量×1,000,000/转录组中reads的总数。
(4).倍数变化(fold-change)计算为Log2(实验组/对照组),倍数变化值大于1则认为mRNA表达上调，倍数变化值小于-1则认为mRNA表达下调。
(5).利用微阵列显著性分软件(significance analysis of microarray,SAM)对p值做多重检验校正，分析过程中设定假阳性率(false discovery rate,F.D.R)为≤0.01。
(6).对与脑卒中关联性基因进行分析时，发现Cxorf65基因存在显著相关性，如表1。
二、结果
脑卒中病例组和健康人外周血细胞中mRNA转录组分析结果显示，一个新基因即Cxorf65，在脑卒中病例组显著降低（表1），可以看作一个可行的用于诊断脑卒中的一个分子标志物。
表1. 脑卒中病例组和健康人外周血细胞中Cxorf65的表达变化。FPKM：totalexon fragments/mapped reads (millions)/exon length (KB), Fragments per Kilobases per Million reads. P值显示是脑卒中病例组外周血细胞中Cxorf65基因表达量与和健康人外周血细胞中Cxorf65中基因表达量的统计差异性。
实施例2 基于Cxorf65基因的脑卒中诊断试剂盒的制备
根据Cxorf65基因表达与脑卒中的相关性，可以通过检测Cxorf65基因的表达情况来诊断脑卒中。因此本发明提供了一种基于检测Cxorf65基因表达来诊断脑卒中的试剂盒，该诊断试剂盒中的组分如下：包含qPCR反应体系、扩增Cxorf65基因和β-actin基因的引物对。
扩增Cxorf65基因引物对：
上游引物序列：5’- ccttacagctcgaagcacct -3’，如SEQ ID NO：1所示；
下游引物序列：5’- aggctccggattcttgagga -3’，如SEQ ID NO：2所示。
扩增β-actin的引物对：
上游引物序列：5’- gcaggagtacgatgagtccg -3’，如SEQ ID NO：3所示；
下游引物序列：5’- acgcagctcagtaacagtcc -3’, 如SEQ ID NO：4所示。
qPCR反应体系：
(1).PCR缓冲液：20 mM KCL，2.5 mM MgCL2、200 mM (NH4)2SO4
(2).dNTPs
(3).SYBR Green荧光染料。
使用时，提前将逆转录的Cxorf65基因cDNA与PCR反应体系中的试剂融合，在qPCR仪上进行PCR反应，设置为95 ℃10 min，(95℃ 15 s，60℃ 60 s)*45个循环。以SYBR Green作为荧光标记物，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。
实施例3 应用Cxorf65基因诊断试剂盒诊断脑卒中
一、材料和方法
1、材料
收集25个脑卒中病人和25个健康人外周血。
2、方法
采用荧光实时定量PCR即qPCR进行，具体操作步骤如下所示：
2.1、脑卒中病例组和健康人外周血细胞分离
按照外周血细胞分离试剂盒说明书分离脑卒中病例组和健康人外周血细胞，主要操作步骤如实施例1：2.1、脑卒中病例组和健康人外周血细胞分离。
2.2、提取脑卒中病例组和健康人外周血细胞总RNA
按照RNA提取试剂盒说明书提取脑卒中病例组和健康人外周血细胞，主要操作步骤如下：
(1).将细胞样本加入Trizol，室温保存5 min；
(2).加氯仿0.2 ml，用力振荡离心管，充分混匀，室温下放置5 – 10 min；
(3).12000 rpm高速离心15 min后吸取上层水相(吸70％)到另一新离心管中，注意不要吸到两层水相之间的蛋白物质。移入新管，加入等体积的-20 ℃预冷异丙醇，充分颠倒混匀，置于冰上10 min；
(4).12000 rpm高速离15 min后小心弃掉上清液，按1 ml/ml Trizol的比例加入75％DEPC乙醇洗涤沉淀(4 ℃保存)，洗涤沉淀物，振荡混合，4℃下12000 rpm高速离心5min；
(5).弃去乙醇液体，室温下放置5 min以充分晾干沉淀，加入DEPC处理过的水溶解沉淀；
(6).用Nanodrop2000紫外分光光度计测量RNA纯度及浓度，冻存于-70℃。
2.3、总RNA逆转录
用逆转录缓冲液对l μg总RNA进行逆转录合成cDNA。采用25 μl反应体系，每个样品取1 μg总RNA作为模板RNA，在PCR管中分别加入以下组分：DEPC水，5 × 逆转录缓冲液，10 mmol/L dNTP，0.1 mmol/l DTT，30 μmmol/l OligodT，200 U/μl M-MLV，模板RNA。42℃孵育1h，72℃10min，短暂离心。
2.4、qPCR扩增反应
采用25 μl反应体系，每个样本设置3个平行管，所有扩增反应均重复三次以上以保证结果的可靠性。配制以下反应体系：qPCR反应体系12.5 μl，正向引物(5 μM/μl) 1 μl，反向引物(5 μM/μl) 1 μl，模板cDNA 2.0 μl，无酶水8.5 μl；
扩增Cxorf65基因引物对：
上游引物序列：5’- ccttacagctcgaagcacct -3’，如SEQ ID NO：1所示；
下游引物序列：5’- aggctccggattcttgagga -3’，如SEQ ID NO：2所示。
扩增β-actin的引物对：
上游引物序列：5’- gcaggagtacgatgagtccg -3’，如SEQ ID NO：3所示；
下游引物序列：5’- acgcagctcagtaacagtcc -3’, 如SEQ ID NO：4所示。
各项操作均于冰上进行。
扩增程序为：95 ℃，10 min，(95 ℃，15 s，60 ℃，60 s)*45个循环。以SYBR Green作为荧光标记物，在Light Cycler荧光实时定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。
二、结果
通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量结果如图1所示。结果显示：与健康对照人群相比，脑卒中病人外周血细胞中Cxorf65 mRNA表达水平显著下降（图1）。这样，以Cxorf65基因检测为基础的qPCR诊断试剂盒可以应用于脑卒中诊断。
本发明利用高通量基因表达谱测序发现：与健康对照人群相比，脑卒中病人外周血细胞中Cxorf65 mRNA表达水平显著下降（表1）。这个结果显示了研制以Cxorf65 mRNA检测为基础的qPCR试剂盒对诊断脑卒中的可行性。通过研制以Cxorf65 mRNA检测为基础的qPCR试剂盒并且该试剂盒能有效地检测脑卒中的发生（图1）。这些结果显示，以Cxorf65基因检测为基础的qPCR诊断试剂盒可以应用在脑卒中的诊断上。此外，本发明为脑卒中的诊断与治疗提供了新方法及新靶点。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，仅仅是帮助本领域的普通技术人员更好地理解本本发明的技术方案，并非对本发明作任何形式上的限制。本发明不限于上述的实施例，任何本领域技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述技术内容做出些许改动或修饰为同等变化的等效实施例。但凡是未脱离本发明的技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
Claims (7)
1.一种基于Cxorf65基因的的定量聚合酶链式反应（qPCR）扩增试剂盒在脑卒中诊断中的应用，其特征在于，所述诊断试剂盒包含可用于扩增Cxorf65基因的qPCR引物，所述引物分别为：
上游引物序列：5’- ccttacagctcgaagcacct -3’，如SEQ ID NO：1所示；
下游引物序列：5’- aggctccggattcttgagga -3’，如SEQ ID NO：2所示。
2.一种基于Cxorf65基因的脑卒中诊断试剂盒，其特征在于，所述诊断试剂盒包含Cxorf65基因的qPCR引物，所述引物分别为：
上游引物序列：5’- ccttacagctcgaagcacct -3’，如SEQ ID NO：1所示；
下游引物序列：5’- aggctccggattcttgagga -3’，如SEQ ID NO：2所示。
3.根据权利要求2所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述诊断试剂盒还包含管家基因β-actin引物对，所述引物分别为：
上游引物序列：5’- gcaggagtacgatgagtccg -3’，如SEQ ID NO：3所示；
下游引物序列：5’- acgcagctcagtaacagtcc -3’, 如SEQ ID NO：4所示。
4.根据权利要求1-3所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述诊断试剂盒还包qPCR的反应体系：SYBR Green荧光染料、PCR缓冲液、dNTPs。
5.根据权利要求1-4所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述PCR缓冲液包含：200 mM(NH4)2SO4、20 mM KCL、2.5 mM MgCL2。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述诊断试剂盒还包含M-MLV逆转录体系；所述逆转录体系包含T重复寡核苷酸OligodT、M-MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂、dNTPs及逆转录反应液（15mM的MgCL2、370mM的KCL、50mM的DTT、 250mM PH8.3的Tris-HCL）。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述诊断试剂盒还包含RNA提取试剂，所述RNA提取试剂包含Trizol、氯仿、异丙醇、75％乙醇。
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