CN118726570B

CN118726570B - 主动脉夹层分子标志物及其应用

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Publication number: CN118726570B
Application number: CN202410987468.8A
Authority: CN
Inventors: 黄福华; 沈冲; 景通; 陈嫦萤; 陈东良; 艾则热提艾力·麦麦提; 周越赟; 李健
Original assignee: Nanjing First Hospital
Current assignee: Nanjing First Hospital
Priority date: 2024-07-23
Filing date: 2024-07-23
Publication date: 2025-09-02
Anticipated expiration: 2044-07-23
Also published as: CN118726570A

Abstract

本发明公开了主动脉夹层分子标志物及其应用，一种检测主动脉夹层分子标志物的物质的应用，其特征在于包括以下应用中的一种或多种：1）在用于制备诊断主动脉夹层的产品中的应用；2）在用于制备筛查主动脉夹层的产品中的应用；3）在用于制备评估主动脉夹层风险的产品中的应用；4）在用于制备鉴别主动脉夹层与急性心肌梗死产品中的应用；所述主动脉夹层分子标志物包括基因EDNRB和KIF19等，其可以作为AD的诊断标志物，还可以作为评估AD患者疾病严重程度的指标之一，具有良好的诊断效能，且将AD患者与AMI患者区分开，使病人得到有效的治疗。

Description

主动脉夹层分子标志物及其应用

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及主动脉夹层分子标志物及其应用。

背景技术

心血管疾病（CVD）是许多国家死亡的主要原因，每年造成1670万人死亡。主动脉夹层（简称为AD）是心血管病中最凶险的疾病之一，是因各种原因导致的主动脉内膜破裂，血液进入中膜而使主动脉血管壁撕裂形成真假腔。按Stanford分型可将AD分为Stanford A型和Stanford B型，其中急性Stanford A型主动脉夹层（acute Stanford type A aorticdissection, ATAAD）在临床上属于危重急症，且具有很高的死亡率，其发病后2天内的死亡率每小时约增加1%，未经手术治疗的患者2周内死亡率高达74%。

ATAAD患者发病时通常表现为剧烈的胸背部疼痛，与之相似的是，急性心肌梗死（acute myocardial infarction, AMI）患者发病时也可表现为胸痛，两者不易鉴别，很容易误诊。尽管ATAAD可以通过主动脉增强CT明确诊断并与AMI相鉴别，但许多医院因为ATAAD较为罕见，故为节省时间经验性急诊行经皮冠状动脉支架植入术；一旦误诊急性心肌梗死，术前应用抗血小板治疗将导致灾难性后果。目前，还没有任何血液的检查指标可以特异且敏感的诊断ATAAD。对于临床医生来说，在急诊室快速鉴别这两种疾病是一个巨大的挑战，因为两者都十分凶险，且有着截然不同的治疗方案，一旦误诊并给予错误的治疗方案，造成的后果往往是灾难性的。因此，寻找通过简单快速的血液检查就能敏感且特异性诊断ATAAD或预测ATAAD发生的标志物尤为重要。

伴随着人类基因组测序计划完成和高通量测序技术的发展，医学领域的科研工作者对人类基因组有了更深入的认识，对疾病相关遗传变异、相关基因的功能及调控网络的认识也逐渐加深，高通量测序得到广泛应用。近年来，越来越多的研究通过高通量测序找到与ATAAD相关的基因，但研究多基于主动脉组织中表达的RNA，由于获取主动脉组织对人体创伤大，难以应用于临床，故将主动脉组织中差异表达的RNA作为AD的生物标志物可能并不合适。

ATAAD的致残率和死亡率高，不易早期发现。主动脉增强CT虽然是诊断ATAAD的金标准，但患者花费大、耗时长并且许多基层医院并没有条件完成该项检查。而主动脉组织难以获得，难以将差异表达的RNA作为生物标志物。故从外周血中筛选出的差异表达RNA就能更方便的作为ATAAD的生物标志物应用于临床。

发明内容

解决的技术问题：针对上述技术问题，本发明提供主动脉夹层分子标志物及其应用，能有效解决现有方法对A型主动脉夹层检测时间长，与急性心肌梗死难以辨别的不足之处。

技术方案：第一方面，本发明提供一种检测主动脉夹层分子标志物的物质的应用，包括以下应用中的一种或多种：

1）在用于制备诊断主动脉夹层的产品中的应用；

2）在用于制备筛查主动脉夹层的产品中的应用；

3）在用于制备评估主动脉夹层风险的产品中的应用；

4）在用于制备鉴别主动脉夹层与急性心肌梗死产品中的应用；

所述主动脉夹层分子标志物包括基因EDNRB（Gene ID: 1910）和基因KIF19（GeneID: 124602）。

优选的，所述主动脉夹层分子标志物还包括基因METTL7B（Gene ID: 196410）。

进一步的，所述主动脉夹层分子标志物还包括基因PRR35（Gene ID:146325）。

优选的，所述物质为用于检测主动脉夹层分子标志物表达量，或特异性识别主动脉夹层分子标志物的试剂，或用于检测主动脉夹层分子标志物含量的试剂。

优选的，所述物质为用于检测主动脉夹层分子标志物的物质为下述a）、b）或c）：

a）用于检测主动脉夹层分子标志物表达量的引物；或特异性识别主动脉夹层分子标志物的引物；

b）含有所述a）的试剂组；

c）含有所述a）或所述b）的试剂盒。

进一步的，所述引物包括扩增基因EDNRB的上游引物和下游引物，其核苷酸序列如SEQ ID No.1-SEQ ID No.2所示；扩增基因KIF19的上游引物和下游引物，其核苷酸序列如SEQ ID No.3-SEQ ID No.4所示；扩增基因METTL7B的上游引物和下游引物，其核苷酸序列如SEQ ID No.5-SEQ ID No.6所示；扩增基因PRR35的上游引物和下游引物，其核苷酸序列如SEQ ID No.7-SEQ ID No.8所示：

SEQ ID No.1：TGCTGGGGATCATCGGGAA；

SEQ ID No.2：GCGATCAAGATATTGGGACCGT；

SEQ ID No.3：GGAGATGGTGTATCAGGCCAC；

SEQ ID No.4：CGTTGAGGGTCTGAACATAGATG；

SEQ ID No.5：TGGAGAGGACATGAGACAGC；

SEQ ID No.6：TGCTCCCAGAAAAAGAGCACA；

SEQ ID No.7：CTGCCTGAGTCGTGGAAGC；

SEQ ID No.8：GGCTGAGCGGGTAGTTGAC。

有益效果：1）本发明保护的基因EDNRB、基因KIF19、基因METTL7B和基因PRR35可以作为AD的生物标志物；

2）本发明保护的基因EDNRB、基因KIF19、基因METTL7B和基因PRR35可以作为评估AD患者疾病严重程度的指标之一；

3）本发明保护的基因EDNRB、基因KIF19、基因METTL7B和基因PRR35组成的不同组合的标志物组具有良好的诊断AD患者的潜能，且具有良好的诊断效能，将AD患者与AMI患者区分开，使病人得到有效的治疗。

附图说明

图1为差异表达基因的火山图（A）和聚类热图（B），其中L表示夹层病例组，HC表示正常对照组；

图2为本发明中主动脉夹层及急性心梗死病例组与正常对照组间各基因mRNA表达水平特异性验证qPCR结果，其中CON：正常对照组（n=64）；AMI：急性心梗死病例组；ATAAD：主动脉夹层病例组（n=64），*：P<0.05；**：P<0.01；***：P<0.001；ns：差异无统计学意义；

图3为特异性基因mRNA表达量与ATAAD关联的限制性立方样条回归分析曲线；

图4为本发明不同基因组合的分子标志物诊断主动脉夹层的ROC曲线图；

图5为本发明不同基因组合的分子标志物鉴别主动脉夹层与急性心肌梗死的ROC曲线图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作详细说明：

实施例1

首先，通过8例ATAAD病例及20例正常对照进行高通量转录组测序，筛选出ATAAD病例差异表达的基因mRNA。筛选测序结果中差异表达最显著的上调及下调基因各20种纳入验证工作。紧接着采用3组病例对照研究设计，一阶段使用ATAAD病例及对照样本共84对进行验证，验证结果与测序方向一致且有统计学意义的基因mRNA纳入二阶段验证；二阶段使用ATAAD病例及对照样本共94对进行验证，验证结果与测序方向一致且有统计学意义的基因mRNA纳入特异性验证。特异性验证使用AMI及对照各64例，在ATAAD和AMI病例组间存在差异表达的基因mRNA作为ATAAD的特异性基因mRNA。通过实时荧光定量 PCR（QuantitativeReal-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）检测待验证基因mRNA的表达水平。最后采用相对定量法2-ΔΔCT计算mRNA表达量。采用Mann-Whitney U检验比较病例组与对照组间基因表达差异。采用限制性立方样条回归（restricted cubic spline, RCS）探讨基因mRNA表达水平与ATAAD之间的剂量反应关系；采用受试者工作特征曲线 (Receiveroperating characteristic curve, 简称 ROC曲线) 评价特异性基因mRNA对ATAAD和正常人群的判别能力及ATAAD和AMI的判别能力，分析其灵敏度、特异度及 ROC 曲线下面积（Area Under Curve，AUC），构建不同模型分析其对 ATAAD发病判别价值。具体数据如下：

特异性 mRNA 表达与急性Stanford A 型主动脉夹层之间的关联：病例对照研究。

1.临床样本：

收集南京市第一医院2019～2022年心血管外科主要诊断为AD住院的178名患者外周血。使用EDTA抗凝管收集外周血1.5mL，并加入4.5mL全血 RNA保存液（南京翼宁辅生生物科技有限公司）充分混匀后，保存至-20℃冰箱，用于RNA的提取。入组标准：

ATAAD病例纳入标准：①年龄18-85岁的汉族人群；②主动脉全程增强扫描确诊并在术中确认的ATAAD患者。病例排除标准：①排除遗传性疾病导致的心血管疾病或遗传性心血管疾病如：马凡氏综合征、Ehlers-Danlos综合征、家族性胸主动脉瘤、创伤所导致夹层等；②术中证明非ATAAD的患者；③患有恶性肿瘤；④研究者认为有其他不适合入组该研究情况的患者等。

AMI病例纳入标准：①年龄18-85岁的汉族人群；②南京市第一医院AMI住院的患者，急性心肌梗死诊断（I型心肌梗死）采用第四版“全球心肌梗死定义”标准，即急性心肌损伤[血清心脏肌钙蛋白（cardiac troponin，cTn）增高和/或回落，且至少1 次高于正常值上限（参考值上限值的99 百分位值）]，同时有急性心肌缺血的临床证据，包括：I.急性心肌缺血症状；II.新的缺血性心电图改变；III.新发病理性Q 波；IV.新的存活心肌丢失或室壁节段运动异常的影像学证据；V.冠状动脉造影或腔内影像学检查。病例排除标准：①近2周内服用抗血小板药物及调脂药物；②严重肝肾功能不全（ALT>5倍ULN，eGFR<30mL/min/1.73mm²）；③患有恶性肿瘤；④已知出血性疾病或活动性出血；⑤参加其他干预性临床试验的患者。

本发明与南京医科大学公共卫生学院合作，对照来源为其2018-2019年在江苏省句容市开展的前瞻性队列研究人群。

对照纳入标准：与ATAAD及AMI病例按年龄（±2岁）、性别一致的方式按个体进行1：1匹配。

对照排除标准：患有严重心、脑、肺、肾脏疾病及肿瘤者。

2.实验方法：

2.1 RNA提取：

外周血总RNA的提取采用磁珠法（Cat#Yu-BR02-1，中国无锡昱安生物技术有限公司），具体步骤如下：

(1)样本处理：将冷冻的保存液样本室温解冻，上下颠倒混匀，向1.5mL离心管中加入样本800μL，再加入异丙醇600μL，上下颠倒混匀。放入4℃离心机7230rpm离心10min；

(2)弃去上清液，保留沉淀，向其中依次加入400μL裂解吸附液、10μLRNA保护剂以及10μL混匀的磁珠。合盖，将离心管放置于震荡仪上震荡10min，取出离心管，瞬时离心；

(3)将离心管置于磁力架，静置2min，开盖，移液枪吸走液体并丢弃，保留磁珠；

(4)加入Buffer AW1 600μL，合盖，将离心管放置于震荡仪上震荡1min；

(5)将离心管放置于磁力架，静置1min后上下快速颠倒磁力架，使离心管盖上的磁珠充分回收。再静置1min。开盖，移液枪吸走液体并弃去，保留磁珠；

(6)加入80% DEPC乙醇600μL，合盖，将离心管放置于震荡仪上震荡1min；

(7)将离心管放置于磁力架，静置1min后上下快速颠倒磁力架，使离心管盖上的磁珠充分回收。再静置1min。开盖，移液枪吸走液体并弃去，保留磁珠；

(8)重复步骤(6)-(7)；

(9)将离心管置于泡沫板上，放入50℃恒温水浴锅，烘干2min；

(10)取回离心管，加入洗脱液A 50μL，充分吹打磁珠使其分散至洗脱液中，合盖，将离心管置于泡沫板上，放入52℃恒温水浴锅，水浴2min；

(11)将离心管置于磁力架，静置2min至液体澄清，开盖，用移液枪吸取液体转移至另一个新的离心管中，弃磁珠；

(12)使用紫外分光光度法（核酸蛋白分析仪Thermo Nano Drop 2000）检测RNA浓度和纯度，RNA 纯度以OD值（260/280）在1.8-2.0之间为合格。

2.2 RNA逆转录合成cDNA

采用TAKARA逆转录试剂盒(RR047A Takara PrimeScript™RT reagent Kitwith gDNA Eraser，Japan)合成cDNA。具体步骤如下：

(1)根据所测得的浓度，将不同浓度样本的RNA平衡至10ng/μL、30ng/μL、50ng/μL以及100ng/μL四个固定值。根据浓度算出需要加入洗脱液A的体积；

(2)向200μL离心管中加入2μL逆转录体系1；

(3)向离心管中加入RNA样本（体积根据浓度计算所得），离心，42℃水浴2min；

(4)加入10μL逆转录体系2，离心；

(5)PCR扩增，程序设置为37℃ 15min，85℃ 5s，15℃∞；

(6)逆转录完成后放入-80℃冰箱保存，供后续实验用。

2.3 qRT-PCR

根据mRNAs引物设计原则设计mRNAs引物序列；

mRNA的相对定量检测通过qPCR完成，使用SYBR Green法检测。实验使用384孔板，每个样本设置3个平行复孔，使用GAPDH作为内参基因。一阶段的检测使用ABIQuantStudio7荧光定量PCR系统完成，二阶段及特异性验证通过福生FS384实时荧光定量PCR仪完成。每个样本复孔之间CT值标准差小于0.5，最终读数取三个复孔的平均值；

体系采用cDNA样本1.5μL、RNase-free H₂O 1.3μL、SYBR Green Master Mix 2.8μL、正向及反向引物各0.2μL，共6μL体系；

qPCR程序设置为：①预变性：95℃，5min；②变性：95℃，10s；③退火：57℃，20s；④延伸：72℃，20s；⑤熔解曲线：仪器默认设置。其中②-④步依次循环40次，其余步骤只进行一次。

2.4 mRNA表达量计算方法

采用相对定量法(2-ΔΔCT)计算各mRNA表达量，具体方法如下：

(1)ΔCT=目的基因CT值-内参基因CT值；

(2)批次系数fn=各批次对照组ΔCT平均值/总对照ΔCT平均值；

(3)ΔCT核= ΔCT/fn；

(4)ΔΔCT核=ΔCT核-总对照ΔCT平均值；

(5)mRNA表达量=2(-ΔΔCT核)。

2.5 数据整理与统计分析

所有实验数据均由双人独立整理并核查其一致性。各基因mRNA的表达量采用相对定量法计算，分析前以ΔCT值均数正负三个标准差校正极值。病例组与对照组之间各mRNA表达水平差异采用Mann-Whitney U检验比较。使用限制性立方样条回归（Restrictedcubic spline, RCS）分析mRNA表达水平与ATAAD患病的剂量反应关系。绘制ROC（receiveroperating characteristic）曲线分析特异性mRNA对ATAAD和正常人群的判别能力及ATAAD和AMI的判别能力，得出其灵敏度、特异度及曲线下面积（area under curve, AUC）。以上分析均使用SPSS 24或R 4.2.2统计软件进行。统计分析结果以双侧P<0.05为差异有统计学意义。

3. 实验结果：

如图1所示：RNA-Seq共检测到19548个mRNA，其中3634个mRNA明显失调（Padj<0.05，|log2FC|>1）；与正常对照组相比，ATAAD组有1923个mRNA显著上调，1711个mRNA显著下调。火山图（图1A）和热图（图1B）显示了ATAAD和正常对照之间mRNAs的表达谱。

如图2所示：AMI病例组与对照组相比，EDNRB和KIF19基因mRNA呈差异上调（P<0.05），METTL7B基因mRNA差异无统计学意义（P>0.05）；ATAAD病例组与AMI病例组相比，METTL7B基因mRNA呈差异上调（P<0.05），KIF19基因mRNA呈差异下调（P<0.05）；ATAAD病例组与对照组相比，各基因mRNA呈差异表达。

如图3所示：上调基因mRNA总体都表现为ATAAD患病风险随表达量增高而增大，其中ATAAD的风险随着EDNRB表达水平的增加而增加；随着METTL7B表达水平的增加，ATAAD的风险显示疾病风险增加，当表达量达到一定水平时，风险不再增加；PRR35随表达水平升高而初始风险增加，随后随着表达水平升高而略有降低，但风险仍远高于低表达水平；下调基因mRNA总体都表现为ATAAD患病风险随表达量增高而降低，其中KIF19先随表达水平升高而降低风险，然后随着表达水平升高而略有增加，最后显示出有害作用（OR>1）。

如图4所示：基因EDNRB和基因KIF19的AUC值＞0.81，基因EDNRB、基因KIF19和基因METTL7B的AUC值＞0.95，基因EDNRB、基因KIF19、基因METTL7B和基因PRR35的AUC值＞0.95，表明上述基因组合具有良好的诊断AD的潜能，且具有良好的诊断效能，而且ACU值越大则相应基因组合的诊断能效越大。

如图5所示：基因EDNRB和基因KIF19的AUC值＞0.93，基因EDNRB、基因KIF19和基因METTL7B的AUC值＞0.96，基因EDNRB、基因KIF19、基因METTL7B和基因PRR35的AUC值＞0.97，表明上述基因组合具有良好的鉴别主动脉夹层与急性心肌梗死的的潜能，且AUC值越大则相应基因组合的鉴别能力越大。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种检测主动脉夹层分子标志物的物质的应用，其特征在于，包括以下应用中的一种或多种：

1）在用于制备诊断主动脉夹层的产品中的应用；

2）在用于制备筛查主动脉夹层的产品中的应用；

3）在用于制备评估主动脉夹层风险的产品中的应用；

所述主动脉夹层为Stanford A型，检测样本为外周血全血RNA，所述物质为下述a）、b）或c）：

a）用于检测主动脉夹层分子标志物mRNA表达量的引物；

b）包含a）的试剂组；

c）包含a）或b）的试剂盒；

所述主动脉夹层分子标志物为以下组合之一：

①基因EDNRB和基因KIF19；

②基因EDNRB、基因KIF19和METTL7B；

③基因EDNRB、基因KIF19、METTL7B和基因PRR35。

2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于：扩增基因EDNRB的上游引物和下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1-SEQ ID No.2所示；扩增基因KIF19的上游引物和下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.3-SEQ ID No.4所示；扩增基因METTL7B的上游引物和下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.5-SEQ ID No.6所示；扩增基因PRR35的上游引物和下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.7-SEQ ID No.8所示。