CN117904068A - 甲基转移酶突变体及其编码基因、载体、重组菌与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种针对L‑色氨酸甲基化的甲基转移酶突变体及其编码基因、载体、重组菌与应用。本发明通过对来自Mycolicibacterium smegmatis ATCC700084的甲基转移酶进行突变，将163位Thr突变为Gly,252位Met突变成Val和282位Glu突变成Ala，使其能以L‑色氨酸为底物经三次迭代甲基化催化合成L‑刺桐碱，有望实现利用E.coli全细胞合成L‑刺桐碱，为建立生产成本低、生产强度高和环境污染小的工业化生产L‑刺桐碱工艺提供理论和技术基础。

Description

甲基转移酶突变体及其编码基因、载体、重组菌与应用

技术领域

本发明属于酶工程技术领域，具体涉及到一种甲基转移酶突变体及其编码基因、载体、重组菌与应用。

背景技术

L-刺桐碱(L-Hypaphorine，L-HYP)，分子式为C₁₄H₁₈N₂O₂，是一种在刺桐属植物中发现的天然小分子吲哚生物碱，又称三甲基甜菜碱、云甘定，是以L-色氨酸为底物，在甲基转移酶的作用下，迭代进行三次甲基化所生成。L-刺桐碱微溶于甲醇、乙醇、DMSO等有机溶剂，在pH为7.2的PBS溶液中溶解度为5mg/mL。研究发现，L-刺桐碱有很多的药用价值，其能作用于啮齿类动物神经系统并降低血糖，通过影响肌动蛋白的组织并抑制吲哚-3-乙酸的作用，对癌症治疗具有潜在意义。其次，它能够显著延长非快速眼动睡眠时间，对小鼠的睡眠具有促进作用。除此之外，它还对中枢神经系统和认知功能有影响，可以抑制小脑中的乙酰胆碱酯酶(AchE)活性，且并未观察到对正常人体细胞存在毒害作用，可用于治疗阿兹海默症^[3]。鉴于L-刺桐碱在促进睡眠、消炎和影响认知方面的医疗作用，L-刺桐碱在失眠、癌症和阿兹海默症等病症治疗的临床应用和制剂开发方面具有较大研究潜力。

由L-色氨酸定向生成L-刺桐碱的过程，需要利用S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)依赖的甲基转移酶参与迭代催化三次转甲基反应，其中SAM是甲基供体，L-色氨酸及其衍生物是甲基受体。因此，要实现以L-色氨酸为底物合成L-刺桐碱，筛选或构建能特异性催化L-色氨酸甲基化的甲基转运酶至关重要。Alastair Murchie-陈东戎课题组运用人工筛选SELEX技术筛选到了以SAM为甲基供体的核酶，它可以催化特定序列的鸟嘌呤的7-位N原子发生甲基化。此外，Blei等人报道了裸盖菇的SAM依赖型甲基转移酶TrpM的功能和系统发育特征，该酶催化L-色氨酸通过迭代N-甲基化形成叔胺，在L-刺桐碱合成中具有重要意义。有研究报道指出，来自MycolicibacteriumsmegmatisATCC700084的甲基转运酶EgtD以L-组氨酸为底物进行迭代甲基化合成麦角硫因。值得指出的是，将来自M.smegmatisATCC700084的EgtD氨基酸序列中第252和282位氨基酸进行定点突变为Val和Ala，可以使其以L-色氨酸为底物进行迭代甲基化合成L-刺桐碱。然而，携带有252和282位氨基酸突变的EgtD(即：EgtD_M252V,E282A)虽然可以以L-色氨酸为底物合成L-刺桐碱，但是其催化效率太低而无法满足工业化应用。

目前L-刺桐碱的生产方式有炮制法、化学合成法和植物提取法等，其中以植物提取法为主。然而，植物提取法存在提取步骤繁琐、生产效率低和环境污染大等问题。鉴于微生物污染小、成本低、繁殖快等优点以及可以通过对关键酶进行定点突变改变其底物偏好性，本研究旨在通过筛选最佳甲基转运酶EgtD突变体，提高该突变体催化L-色氨酸合成L-刺桐碱效率，而实现利用微生物全细胞体外合成L-刺桐碱。

发明内容

本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本发明。

因此，本发明的目的是，克服现有技术中的不足，提供一种甲基转移酶突变体，其特征在于，所述的甲基转移酶突变体为EgtD_M252V,E282A或EgtD_{T163a,M252V,E282A}，所述EgtD_M252V,E282A为将序列如SEQ ID NO.1所示的EgtD亲本序列的252位Met突变成Val和282位Glu突变成Ala；所述EgtD_{T163a,M252V,E282A}为将序列如SEQ ID NO.1所示的EgtD亲本序列的163位Thr突变成a、252位Met突变成Val和282位Glu突变成Ala；其中，a为Ala或Val或Leu或Ile或Gly或Pro或Ser或Cys或Asp。

作为本发明所述甲基转移酶突变体的一种优选方案，其中：所述EgtD_M252V,E282A的序列如SEQ ID NO.2所示，所述EgtD_{T163a,M252V,E282A}的序列分别如SEQ ID NO.3～SEQ ID NO.11所示。

本发明的另一个目的是，克服现有技术中的不足，提供一种含有所述的甲基转移酶突变体的编码基因。

本发明的另一个目的是，克服现有技术中的不足，提供一种携带所述的编码基因的表达载体。

作为本发明所述表达载体的一种优选方案，其中：所述表达载体为细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒或哺乳动物细胞病毒。

本发明的再一个目的是，克服现有技术中的不足，提供一种表达所述的甲基转移酶突变体的重组菌。

作为本发明所述重组菌的一种优选方案，其中：所述重组菌是以细菌、真菌、植物、昆虫或动物细胞为宿主细胞。

本发明的再一个目的是，克服现有技术中的不足，提供一种所述的甲基转移酶突变体在以L-色氨酸为底物催化合成L-刺桐碱中的应用。

本发明的再一个目的是，克服现有技术中的不足，提供一种包含所述的甲基转移酶突变体的酶制剂。

作为本发明所述酶制剂的一种优选方案，其中：所述酶制剂为固态酶制剂或液态酶制剂。

本发明有益效果：

本发明通过对来自M.smegmatisATCC700084的甲基转移酶EgtD进行突变，将252位Met突变成Val和282位Glu突变成Ala，使其能以L-色氨酸为底物，并显著提高催化效率，高效合成L-刺桐碱，这可能有望实现利用E.coli全细胞合成L-刺桐碱，为建立生产成本低、生产强度高和环境污染小的工业化生产L-刺桐碱工艺提供理论和技术基础。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：

图1为egtD在BL21(DE3)中的表达。

图2为163位氨基酸残基饱和突变体的酶活和L-刺桐碱产量。

图3为EgtD转甲基酶及其突变体的结构分析。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。

在本发明中，出发菌为大肠杆菌BL21(DE3)是野生型大肠杆菌。

底物与产物的定性与定量分析以及菌体生长情况的监测：菌液浓度测定：吸取样品菌液，用蒸馏水稀释一定倍数，以蒸馏水作为空白对照，采用分光光度计于600nm和1cm光程测定OD₆₀₀。L-色氨酸、L-相思豆碱和L-刺桐碱含量的测定采用高效液相色谱(HPLC)，并参照标准曲线来测定其含量。粗酶液根据pET-28a上的His标签，经亲和层析柱纯化。

实施例1：表达质粒pET-egtD的构建

来源于M.smegmatisATCC700084的甲基转移酶EgtD编码基因egtD由苏州金唯智生物科技有限公司合成，并对序列进行密码子优化，将其通过限制性酶切位点BamHI和SalI连接在pET-28a质粒上，其中，EgtD的序列如SEQ ID NO.1所示。

实施例2：将质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)进行表达

重组表达质粒pET-egtD化转至大肠杆菌BL21(DE3)，37℃培养条件下经LB+Kan固体培养基培养筛选出重组表达菌株。将出发菌株与重组菌株接种至液体TB培养基，IPTG诱导后收集菌体经超声波破碎后，将上清液和沉淀进行SDS-PAGE电泳，结果检测到一条分子量约35kDa的特异性条带(图1)，与报道的目标蛋白大小一致，说明egtD可以在大肠杆菌BL21(DE3)中正确表达。

实施例3：egtD编码蛋白EgtD第252位和第282位氨基酸残基的定点突变

以表达质粒pET-egtD为模板，依次以MT252-F/MT252-R和ET282-F/ET282-R(引物序列如表1所示)为引物进行PCR扩增，并用DpnI消化酶去除质粒模板。随后，对PCR产物进行纯化并将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中涂布培养。利用测试引物(即：EgtD-F/EgtD-R；引物序列如表1所示)筛选目标重组菌株并测序，获得目标重组质粒pET-egtD_M252V,E282A和目标重组菌株E.coli/pET-egtD_M252V,E282A。

表1PCR扩增所需引物序列

实施例4：egtD编码蛋白EgtD第163位氨基酸残基定点饱和突变

以表达质粒pET-egtD_M252V,E282A为模板，TT_X-163-F/TT_X-163-R(注：X代表Thr以外的其他19种氨基酸；引物序列如表1所示)为引物进行PCR扩增，并用DpnI消化酶去除质粒模板。随后，对PCR产物进行纯化并将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中涂布培养。利用测试引物(即：EgtD-F/EgtD-R；引物序列如表1所示)筛选目标重组菌株并测序，获得目标重组质粒pET-egtD_{T163x,M252V,E282A}和目标重组菌株E.coli/pET-egtD_{T163x,M252V,E282A}。

实施例5：野生型EgtD及EgtD突变体酶活测定

将目标重组菌株E.coli/pET-egtD_M252V,E282A和E.coli/pET-egtD_{T163x,M252V,E282A}在10mLLB液体小瓶培养9-10h，然后取1mL转接进入TB培养基，37℃培养至OD₆₀₀在0.5～0.6之间，加入终浓度为0.1mmol/LIPTG，在16℃诱导表达24h。表达过后收集菌体，用PBS缓冲液洗涤两次，将菌体悬浮并控制在相同OD₆₀₀，然后用超声破碎仪破碎菌体，离心取上清获得粗酶液。

酶活测定反应体系：200μL反应液里面包含了Tris·HCl 50mM(pH 7)、NaCl50mM、MnBr₂100μM、SAM 150μM、S-腺苷高半胱氨酸水解酶(SAHH)10μM、L-色氨酸50μM和100μL粗酶液，35℃反应并265nm条件下监测10min。酶活单位(U)定义为在上述反应条件下每分钟消耗1μmolL-色氨酸所需的酶量。野生型EgtD和不同EgtD突变体的酶活性如图2所示。从图2中发现野生型EgtD不具有催化L-色氨酸合成L-刺桐碱能力，而当将第252位和第282位氨基酸残基变成Val和Ala时，EgtD突变体(即：EgtD_M252V,E282A)表现出13.3±0.82U/mL酶活力。此外，将EgtD_M252V,E282A中第163位Thr突变成Ala或Gly可以显著提升催化L-色氨酸合成L-刺桐碱能力，而突变成其他氨基酸残基则起负作用。

实施例6：不同EgtD对L-刺桐碱合成的影响

酶转化体系：200μL反应液里面包含了Tris·HCl 50mM(pH 7)、SAM 1.5mM、S-腺苷高半胱氨酸水解酶(SAHH)1.5mM、L-色氨酸500mM和100μL粗酶液，35℃反应2h。反应结束后，采用高效液相色谱(HPLC)的测定L-刺桐碱含量，结果如图2所示。

从图2可知，L-刺桐碱产量与酶活水平一致，即酶活高的EgtD突变体也表现出高的L-刺桐碱产量。综上可知，突变体EgtD_{T163G,M252V,E282A}(即将EgtD的序列第163位Thr突变成Gly、252位Met突变成Val和282位Glu突变成Ala)表现出最高的酶活(25.1±0.6U/mL)和L-刺桐碱产量(22.6±0.9mg/L)，突变体EgtD_M252V,E282A、EgtD_{T163A,M252V,E282A}、EgtD_{T163V,M252V,E282A}、EgtD_{T163L,M252V,E282A}、EgtD_{T163I,M252V,E282A}、EgtD_{T163P,M252V,E282A}、EgtD_{T163S,M252V,E282A}、EgtD_{T163C,M252V,E282A}、EgtD_{T163D,M252V,E282A}也表现出较佳的酶活和L-刺桐碱产量；

其中，突变体EgtD_M252V,E282A的序列如SEQ ID NO.2所示；突变体EgtD_{T163A,M252V,E282A}的序列如SEQ ID NO.3所示；突变体EgtD_{T163V,M252V,E282A}的序列如SEQ ID NO.4所示；突变体EgtD_{T163L,M252V,E282A}的序列如SEQ ID NO.5所示；突变体EgtD_{T163I,M252V,E282A}的序列如SEQ IDNO.6所示；突变体EgtD_{T163G,M252V,E282A}的序列如SEQ ID NO.7所示；突变体突变体EgtD_{T163P,M252V,E282A}的序列如SEQ ID NO.8所示；突变体EgtD_{T163S,M252V,E282A}的序列如SEQ IDNO.9所示；突变体EgtD_{T163C,M252V,E282A}的序列如SEQ ID NO.10所示；突变体EgtD_{T163D,M252V,E282A}的序列如SEQ ID NO.11所示。

实施例7：野生型EgtD及EgtD突变体纯化及其动力学参数分析

将上述突变酶表达获得的粗酶液用亲和层析柱纯化。分别配制质量浓度为0.5mg/mL、1.0mg/mL、1.5mg/mL、2.0mg/mL、2.5mg/mL、3.0mg/mL的L-色氨酸溶液和100mmol/L SAM加入1mg纯化后的酶，根据Lineweaver-Burk双倒数法作图，可计算出以L-色氨酸为底物时EgtD及其突变体的米氏常数(K_m)、最大反应速率(V_max)以及催化常数(k_cat)。结果发现突变163位Thr突变成Gly、252位Met突变成Val和282位Glu突变成Ala可以有效提高甲基转移酶催化L-色氨酸合成L-刺桐碱能力，结果如表2所示。根据以上结果可知，163位、252位和282位是EgtD重要的底物识别位点，与底物的迭代甲基化具有很大关系，将突变体与底物进行分子对接，结果如图3所示。突变后的底物结合口袋明显发生了变化，163位Thr突变为Gly之后，对空腔的位阻减小，底物拥有更宽敞的结合口袋，更有利于中间体的方向调转以接受甲基，从而提高酶活和产量。所以将其位点突变成其他结构简单的氨基酸可以改变酶空腔结构，对提高以L-色氨酸为底物的酶催化效率产生很大影响，这对酶的研究以及工业生产上有很大影响。

表2SAM转甲基反应中转甲基酶及其突变体的动力学参数

注：ND未检测出

综上，本发明首次将来自M.smegmatisATCC700084的甲基转移酶EgtD氨基酸序列的163位Thr突变成Gly、252位Met突变成Val和282位Glu突变成Ala，并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行过表达，结果表明EgtD突变体显著提高了以L-色氨酸为底物催化合成L-刺桐碱的能力。

应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的范围当中。

Claims (10)

1.一种甲基转移酶突变体，其特征在于，所述的甲基转移酶突变体为EgtD_M252V,E282A或EgtD_{T163a,M252V,E282A}，所述EgtD_M252V,E282A为将序列如SEQ ID NO.1所示的EgtD亲本序列的252位Met突变成Val和282位Glu突变成Ala；所述EgtD_{T163a,M252V,E282A}为将序列如SEQ ID NO.1所示的EgtD亲本序列的163位Thr突变成a、252位Met突变成Val和282位Glu突变成Ala；其中，a为Ala或Val或Leu或Ile或Gly或Pro或Ser或Cys或Asp。

2.如权利要求1所述的甲基转移酶突变体，其特征在于：所述EgtD_M252V,E282A的序列如SEQID NO.2所示，所述EgtD_{T163a,M252V,E282A}的序列分别如SEQ ID NO.3～SEQ ID NO.11所示。

3.一种含有如权利要求1或2所述的甲基转移酶突变体的编码基因。

4.一种携带权利要求3所述的编码基因的表达载体。

5.如权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒或哺乳动物细胞病毒。

6.一种表达权利要求1所述的甲基转移酶突变体的重组菌。

7.如权利要求6所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌是以细菌、真菌、植物、昆虫或动物细胞为宿主细胞。

8.如权利要求1所述的甲基转移酶突变体在以L-色氨酸为底物催化合成L-刺桐碱中的应用。

9.一种包含权利要求1所述的甲基转移酶突变体的酶制剂。

10.如权利要求9所述的酶制剂，其特征在于，所述酶制剂为固态酶制剂或液态酶制剂。