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CN106754775B - 一种羰基还原酶突变体及其基因与应用 - Google Patents

一种羰基还原酶突变体及其基因与应用 Download PDF

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CN106754775B CN201611203762.7A CN201611203762A CN106754775B CN 106754775 B CN106754775 B CN 106754775B CN 201611203762 A CN201611203762 A CN 201611203762A CN 106754775 B CN106754775 B CN 106754775B
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Abstract

本发明涉及一种羰基还原酶突变体及其基因，包含该羰基还原酶突变体基因的重组表达载体和重组表达转化体，该重组酶的制备方法，以及该重组酶在不对称还原4‑氯‑3‑羰基丁酸乙酯及其他潜手性羰基化合物以制备光学纯(S)‑4‑氯‑3‑羟基‑丁酸乙酯及其他手性仲醇中的应用。与野生型羰基还原酶相比，本发明所述羰基还原酶突变体对4‑氯‑3‑羰基丁酸乙酯的还原活力有大幅提高，且部分突变体的热稳定性也有明显提高，使用该突变体能够更好地催化制备光学纯(S)‑4‑氯‑3‑羟基丁酸乙酯，具有很好的工业应用前景。

Description

一种羰基还原酶突变体及其基因与应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种天蓝色链霉菌羰基还原酶ScCR1突变体及其编码基因，含有所述羰基还原酶突变体基因的重组表达载体和重组表达转化体，该重组羰基还原酶及其制备方法，以及该羰基还原酶突变体在催化4-氯-3-羰基丁酸乙酯不对称还原，制备光学纯(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的应用。
背景技术
(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯[Ethyl(S)-(-)-4-chloro-3-hydroxybutyrate,(S)-CHBE]，分子式：C6H11ClO3，分子量：166.60，CAS号为86728-85-0。光学纯(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯[(S)-CHBE]是合成3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶(HMG-CoA)还原酶抑制剂的重要医药中间体。从药理作用分析看来，该HMG-CoA还原酶抑制剂是药物阿托伐他汀的主要活性成分。阿托伐他汀，商品名“立普妥”，是他汀类血脂调节药物，该药物主要作用于肝脏，口服后，产生的水解物能够竞争性抑制HMG-CoA还原酶，促进低密度脂蛋白受体的合成，由于HMG-CoA还原酶是胆固醇合成所需要的关键酶，所以会导致胆固醇的合成无法正常进行，最终不仅降低了总胆固醇水平，还降低了血清甘油三酯水平，因此能够有效防治动脉粥样硬化和冠心病。目前阿托伐他汀是降胆固醇类药物的首选。
化学催化手性仲醇合成的方法主要是利用过渡态金属或硼烷作为催化剂，与手性配体形成配合物后高效催化硼氢化物等氢供体向潜手性羰基基团的不对称转移，生成光学活性的手性仲醇。然而该方法操作难度大，反应条件苛刻，且产物中可能会残留重金属，因而化学法合成应用受到限制。目前，研究人员已开发多种生物法合成光学活性手性仲醇的方法，包括酶法动力学拆分和酶促不对称还原法。其中，利用潜手性羰基化合物的不对称还原合成光学活性手性仲醇的途径，可实现理论100％的产率，是生产光学活性(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的重要方法。生物不对称还原方法具有绿色高效、选择性高、反应条件温和以及操作简单易于制备等诸多优点，因此近几年来生物催化羰基不对称还原合成手性仲醇的方法越来越受到重视。
采用酶法不对称还原法制备(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯，一般采用的是羰基还原酶，催化4-氯-3-羰基丁酸乙酯(简写为COBE)的不对称还原。Kita等人用赭色掷孢酵母来源的羰基还原酶AR不对称还原COBE合成(S)-CHBE，产物的对映体过量值(ee)为93％(J.Mol.Catal.B.Enzym.,1999,6:305-313)，Kataoka等用马其顿假丝酵母来源的羰基还原酶CmMR不对称合成(S)-CHBE，其产物的对映体过量值(ee)仅为92％(EnzymeMicrob.Technol.,2006,38:944-951)。Ye等人通过对毕赤酵母中基因数据库挖掘，筛选得到了两种新型羰基还原酶PsCRI和PsCRII，其催化还原COBE后产物的对映体过量值(ee)均>99％(Appl.Microbiol.Biotechnol.,2011,89:513-522)。何等人用来源于重组大肠杆菌CCZU-Y10的PgCR在邻苯二甲酸二丁酯-水两相体系中催化COBE不对称还原制备(S)-CHBE，底物浓度为1000mM,产物的ee值高于99％，转化率高达99％(Appl.Biochem.Biotechnol.,2014,173:2042-2053)。
从天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)中克隆得到的羰基还原酶ScCR1能够催化多种高浓度羰基化合物的高立体选择性不对称还原，制备相应的光学手性醇，该酶已经在大肠杆菌(Escherichia coli)中重组过量表达(Bioresour Technol.2011,102:7023-7028)。但该酶对4-氯-3-羰基丁酸乙酯的活力中等，纯酶的比活力仅有16U/mg，且该羰基还原酶的热稳定性也不够好，(保温15min后残余活力仅有一半时对应的温度)也只有47.4℃，表征对底物耐受性的(保温15min后残余活力仅有一半时对应的底物浓度)也仅为34mM。通过定点突变、随机突变等蛋白质工程的手段对ScCR1进行催化性能(催化活力、稳定性)的改造，提高其催化活力及其反应稳定性，将具有较高的工业应用价值。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：羰基还原酶ScCR1催化还原4-氯-3-羰基丁酸乙酯活力低及反应稳定性差的问题。针对该问题，提供一种催化性能提高的羰基还原酶突变体蛋白质、编码该突变体蛋白质的核酸序列，含有该核酸序列的重组表达载体和重组表达转化体，该羰基还原酶突变体的制备方法及其在催化羰基不对称还原，制备光学纯手性醇中的应用。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
本发明采取的技术方案之一是：提供一种对4-氯-3-羰基丁酸乙酯催化活性提高，稳定性提高的羰基还原酶ScCR1突变体蛋白质。
对具有如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的蛋白质进行突变，将第158位的异亮氨酸替换为缬氨酸，或者在此基础上，对第168位的脯氨酸、第60位的丙氨酸分别或同时进行氨基酸残基的替换，获得由ScCR1衍生的且羰基还原酶活性提高的突变体蛋白质。
突变体ScCR1I158V所示的氨基酸序列组成的蛋白质是从由ScCR1构建的定点饱和突变库中筛选得到。在筛选获得对4-氯-3-羰基丁酸乙酯催化活力有明显提高的突变体ScCR1I158V的基础上，继续对ScCR1I158V进行改造，主要采取随机突变的手段以进一步强化该酶的催化活力并提高它的稳定性。
优选的，所述羰基还原酶突变体，为野生羰基还原酶ScCR1的氨基酸残基发生如下任意一种情况的突变所获得的突变体；
(1)野生型羰基还原酶ScCR1的氨基酸序列中第158位异亮氨酸替换为缬氨酸，命名为ScCR1I158V；
(2)野生型羰基还原酶ScCR1的氨基酸序列中第158位异亮氨酸替换为缬氨酸，且第168位脯氨酸替换为丝氨酸，命名为ScCR1I158V/P168S；
(3)野生型羰基还原酶ScCR1的氨基酸序列中第158位异亮氨酸替换为缬氨酸，且第168位脯氨酸替换为丝氨酸，且第60位丙氨酸替换为苏氨酸，命名为ScCR1A60T/I158V/P168S。
所述突变体的获得方法具体为：以来源于天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)中的羰基还原酶野生酶ScCR1基因为模板，利用含有突变点的突变引物(选取需要进行突变的氨基酸位点上下游各15～20bp的一段碱基序列，将突变位点的碱基替换为突变后氨基酸的密码子，作为PCR正向引物，其反向互补序列即为PCR反向引物)构建定点饱和突变库，对所得到的突变基因库进行高通量筛选，得到对4-氯-3-羰基丁酸乙酯催化活力提高的突变体ScCR1I158V(kcat/KM为89s-1mM-1)；以突变体ScCR1I158V基因为模板，利用随机突变引物进行易错PCR构建随机突变库，对所得到的突变基因库进行高通量筛选，得到活力提高的且稳定性提高的突变体ScCR1I158V/P168S(kcat/KM为196s-1mM-1,为49.2℃,为122mM)；以突变体ScCR1I158V/P168S基因为模板，利用随机突变引物进行易错PCR构建随机突变库，对所得到的突变基因库进行高通量筛选，得到了稳定性显著提高且催化活力提高的突变体ScCR1A60T/I158V/P168S(kcat/KM为234s-1mM-1,为53.6℃，为162mM)。
其中所述定点突变PCR扩增为本领域常规技术，PCR扩增程序(50μl)为：模板0.5～20ng，5μl 10×KOD plus buffer，5μl dNTP(各2.0mM),2μl MgSO4(25mM),一对突变引物各1μl(20μM)，1个单位的KOD酶(TOYOBO CO.,LTD.,Osaka，Japan)，加灭菌蒸馏水至50μl。
所述定点突变PCR扩增的程序为：(1)95℃变性3min；(2)98℃变性10sec，(3)55℃退火20sec，(4)72℃延伸90sec，步骤(2)～(4)共进行3个循环，(5)98℃变性10sec，(6)54℃退火20sec，(7)72℃延伸90sec，步骤(5)～(7)共进行3个循环，(8)98℃变性10sec，(9)53℃退火20sec，(10)72℃延伸90sec，步骤(8)～(10)共进行3个循环，(11)98℃变性10sec，(12)52℃退火20sec，(13)72℃延伸90sec，步骤(11)～(13)共进行21个循环，最后72℃延伸10min，12℃保藏产物。
其中所述易错PCR扩增为本领域常规技术，PCR反应的体系(50μl)为：模板0.5～20ng，5μl 10×rTaq buffer，5μl dNTP(各2.0mM)，2μl MgSO4(25mM),5μl MnCl2(100μM)，一对突变引物各1μl(20μM)，1个单位的rTaq酶(TaKaRa，Japan)，1μl DMSO，加灭菌蒸馏水至50μl。
所述易错PCR扩增的程序为：(1)95℃变性3min；(2)98℃变性10sec，(3)55℃退火20sec，(4)72℃延伸90sec，步骤(2)～(4)共进行3个循环，(5)98℃变性10sec，(6)54℃退火20sec，(7)72℃延伸90sec，步骤(5)～(7)共进行3个循环，(8)98℃变性10sec，(9)53℃退火20sec，(10)72℃延伸90sec，步骤(8)～(10)共进行3个循环，(11)98℃变性10sec，(12)52℃退火20sec，(13)72℃延伸90sec，步骤(11)～(13)共进行21个循环，最后72℃延伸10min，12℃保藏产物。
本发明采取的技术方案之二是：一种分离的核酸，所述核酸是编码如技术方案之一所述突变体蛋白质的核酸。
本发明所述核酸的制备方法为本领域常规制备方法，所述制备方法较佳地包括：通过基因克隆技术获得编码所述羰基还原酶突变体的核酸分子，或者通过人工全序列合成的方法得到编码所述羰基还原酶突变体的核酸分子。
本发明所述核酸较佳地为具有点突变的核酸分子，所述具有点突变的核酸分子的制备方法为本领域常规的制备方法，所述制备方法较佳地为：以技术方案一获得的突变体DNA序列为模板，利用两端引物进行PCR扩增所需目的基因，即得到带有点突变的核酸分子：ScCR1I158V、ScCR1I158V/P168S和ScCR1A60T/I158V/P168S。
其中所述PCR扩增为本领域常规技术，PCR扩增程序(50μl)为：模板0.5～20ng，5μl10×KOD plus buffer，5μl dNTP(各2.0mM),2μl MgSO4(25mM),一对突变引物各1μl(20μM)，1个单位的KOD酶(TOYOBO CO.,LTD.,Osaka,Japan)，加灭菌蒸馏水至50μl。
所述易错PCR扩增的程序为：(1)95℃变性3min；(2)98℃变性10sec，(3)55℃退火20sec，(4)72℃延伸90sec，步骤(2)～(4)共进行3个循环，(5)98℃变性10sec，(6)54℃退火20sec，(7)72℃延伸90sec，步骤(5)～(7)共进行3个循环，(8)98℃变性10sec，(9)53℃退火20sec，(10)72℃延伸90sec，步骤(8)～(10)共进行3个循环，(11)98℃变性10sec，(12)52℃退火20sec，(13)72℃延伸90sec，步骤(11)～(13)共进行21个循环，最后72℃延伸10min，12℃保藏产物。
本发明采取的技术方案之三是：一种包含上述核酸的重组表达载体。
其中所述重组表达载体可通过本领域常规方法获得，即：将本发明所述的羰基还原酶突变体基因的核酸分子连接于各种表达载体上构建而成。本发明所述载体优选地为质粒pET-28a(+)。较佳地，可通过下述方法制得本发明的重组表达载体：将通过PCR扩增所得的核酸产物与表达载体pET-28a分别用限制性内切酶Nde I和Hind III双酶切，形成互补的粘性末端，经T4DNA连接酶连接，形成含有本发明的羰基还原酶基因的重组表达质粒pET28a-ScCR1I158V、pET28a-ScCR1I158V/P168S和pET28a-ScCR1A60T/I158V/P168S。
本发明采取的技术方案之四是：一种包含上述重组表达载体的重组表达转化体。
其中所述重组表达转化体的制备方法较佳地为：将上述重组表达载体转化至宿主微生物中制得。其中所述宿主微生物较佳地为：大肠杆菌(E.coli)，更佳的为大肠杆菌BL21(DE3)或大肠杆菌DH5α。将前述重组表达质粒转化至E.coli BL21(DE3)中，即可得本发明优选的基因工程菌株，即E.coli BL21(DE3)/pET28a-ScCR1I158V、E.coli BL21(DE3)/pET28a-ScCR1I158V/P168S和E.coli BL21(DE3)/pET28a-ScCR1A60T/I158V/P168S。转化方法可选择本领域常规方法，如电转法，热激法等，较佳地选择热激法进行转化即可，热激条件较佳的是：42℃，热激90秒。
本发明采取的技术方案之五是：一种羰基还原酶突变体的制备方法，其中包括如下步骤：培养上述的重组表达转化体，从培养物中获得重组羰基还原酶突变体。
其中所述制备方法较佳地为：将上述重组大肠杆菌接种至含有卡那霉素(50μg/ml)的LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，pH7.0)中，37℃振荡培养过夜，按1％(v/v)的接种量接入装有100mL LB培养基的500mL三角瓶中，置于37℃、180rpm摇床振荡培养，当培养液的吸光密度OD600达到0.8时，加入终浓度为0.1mM的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行诱导，诱导温度为16℃，诱导24小时后，将培养液离心，收集细胞，并用生理盐水洗涤两次，得静息细胞。将所得的静息细胞悬浮于10mL缓冲液(pH 8.0)中，在冰水浴中超声破碎，离心收集上清液，即为重组酶的粗酶液，粗酶液经聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，重组蛋白在细胞中以部分可溶的形式存在，另外有部分蛋白存在于细胞碎片中。
本发明中催化潜手性羰基化合物进行不对称还原反应形成光学活性手性醇的催化剂，可以是上述重组羰基还原酶突变体蛋白，或者是包含重组羰基还原酶突变体的转化体静息细胞。
本发明采取的技术方案之六是：上述蛋白质或上述重组大肠杆菌整细胞作为催化剂催化潜手性羰基化合物进行不对称还原反应，形成手性醇中的应用。
所述的蛋白质优选本发明所述的羰基还原酶突变体或者是重组羰基还原酶突变体。所述的潜手性羰基化合物较佳地是4-氯-3-羰基丁酸乙酯(COBE)，还可以是2,3-二庚酮，1-苯基-1,2-丙二酮或2-甲基-2-庚烯-6-酮。
本发明所述的不对称还原反应的各项条件可按本领域此类反应的常规条件进行选择，较佳地，所述的应用包括下述步骤：反应在两相体系中进行，两相反应体系为甲苯与水，所述潜手性羰基化合物的浓度为50～200g/L(有机相)，异丙醇的摩尔浓度为底物浓度的1.0～1.5倍，所述羰基还原酶突变体用量为15～65kU/L，额外添加的NAD+的浓度是0～0.1mM，反应水相缓冲液pH为6.0～7.0，反应温度为25～35℃。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：与野生型羰基还原酶相比，本发明所述羰基还原酶突变体具有更高的催化活性和稳定性，对底物4-氯-3-羰基丁酸乙酯(COBE)的还原活力由野生型的38.8U/mg的比活力提升至最高达260U/mg，并且稳定性也有大幅提高，Tm(蛋白解链温度)由野生型的50.7℃提高到最高达58.1℃，对底物的耐受性也由野生型的34mM提高至最高达162mM。本发明所获得的多个羰基还原酶突变体特别适用于催化还原COBE制备光学纯的立普妥药物前体化合物(S)-CHBE，具有很好的工业应用前景。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
羰基还原酶ScCR1的定点突变
定点突变采用II Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene,Catalog#200522)方案进行操作。
首先设计含有突变点的简并突变引物如下：
5’-ACGTCGCCTCCNNKCTCGGCTCGGTCGGCT-3’，
5’-AGCCGACCGAGCCGAGMNNGGAGGCGACGT-3’。
其中N代表A、T、C、G四种碱基的混合；K代表G、T两种碱基的混合；M代表A、C两种碱基的混合。
其中所用的模板为：野生型羰基还原酶重组质粒，包含如SEQ ID No.1所示的基因序列。
PCR扩增程序(50μl)为：模板0.5～20ng，5μl 10×KOD plus buffer，5μl dNTP(各2.0mM)，2μl MgSO4(25mM)，一对突变引物各1μl(20μM)，1个单位的KOD酶(TOYOBO CO.,LTD.,Osaka，Japan)，加灭菌蒸馏水至50μl。
PCR扩增程序：(1)95℃变性3min；(2)98℃变性10sec，(3)55℃退火20sec，(4)72℃延伸90sec，步骤(2)～(4)共进行3个循环，(5)98℃变性10sec，(6)54℃退火20sec，(7)72℃延伸90sec，步骤(5)～(7)共进行3个循环，(8)98℃变性10sec，(9)53℃退火20sec，(10)72℃延伸90sec，步骤(8)～(10)共进行3个循环，(11)98℃变性10sec，(12)52℃退火20sec，(13)72℃延伸90sec，步骤(11)～(13)共进行21个循环，最后72℃延伸10min，12℃保藏产物。
扩增得到的PCR产物在37℃经内切酶Dpn I消化2h后转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，并均匀涂布含有50μl/mg卡那霉素的LB琼脂平板。37℃过夜培养后，挑选单克隆96株至深孔板进行培养及诱导表达。根据分光光度计法进行突变库的活力筛选，得到的活力显著提高的突变体，送上海美吉生物医药科技有限公司进行测序。测序结果用DNAMAN软件与羰基还原酶ScCR1序列进行比对，158位突变为缬氨酸。得到的突变体命名为ScCR1I158V。
实施例2
羰基还原酶ScCR1的随机突变
利用易错PCR技术向羰基还原酶基因引入随机核苷酸突变，其中所用引物如下：
上游引物：GGAATTCCATATGACTGTCGAAACCGCCACC
下游引物：CGCGGATCCCTAGACAGAACAGTAACCACCT
其中模板为：实施例1获得羰基还原酶突变体质粒pET28a-ScCR1I158V。
PCR反应的体系(50μl)为：模板0.5～20ng，5μl 10×rTaq buffer，5μl dNTP(各2.0mM)，2μl MgSO4(25mM)，5μl MnCl2(100μM)，一对突变引物各1μl(20μM)，1个单位的rTaq酶(TaKaRa，Japan)，1μl DMSO，加灭菌蒸馏水至50μl。
所述易错PCR扩增的程序为：(1)95℃变性3min；(2)98℃变性10sec，(3)55℃退火20sec，(4)72℃延伸90sec，步骤(2)～(4)共进行3个循环，(5)98℃变性10sec，(6)54℃退火20sec，(7)72℃延伸90sec，步骤(5)～(7)共进行3个循环，(8)98℃变性10sec，(9)53℃退火20sec，(10)72℃延伸90sec，步骤(8)～(10)共进行3个循环，(11)98℃变性10sec，(12)52℃退火20sec，(13)72℃延伸90sec，步骤(11)～(13)共进行21个循环，最后72℃延伸10min，12℃保藏产物。
PCR扩增产物纯化之后，用Nde I和Hind III这两个限制性内切酶分别对易错PCR扩增产物和载体pET28a于37℃双酶切12h，两者的回收产物，用T4连接酶16℃下过夜连接，转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，并均匀涂布于含有50μl/mg卡那霉素的LB琼脂平板，37℃过夜培养，构建随机突变体文库，并进行筛选。筛选得到一个对COBE催化活力有大幅提高的突变体(对底物COBE的比活力高达168U/mg，而母本只有38.4U/mg)，经DNA测序发现其突变位点为P168S，命名为ScCR1I158V/P168S。
实施例3
随机突变
利用易错PCR技术向羰基还原酶基因引入随机核苷酸突变，其中所用引物如下：
上游引物：GGAATTCCATATGACTGTCGAAACCGCCACC
下游引物：CGCGGATCCCTAGACAGAACAGTAACCACCT
其中模板为：实施例2获得羰基还原酶突变体质粒pET28a-ScCR1I158V/P168S。
PCR反应的体系(50μl)为：模板0.5～20ng，5μl 10×rTaq buffer，5μl dNTP(各2.0mM)，2μl MgSO4(25mM)，5μl MnCl2(100μM)，一对突变引物各1μl(20μM)，1个单位的rTaq酶(TaKaRa，Japan)，1μl DMSO，加灭菌蒸馏水至50μl。
所述易错PCR扩增的程序为：(1)95℃变性3min；(2)98℃变性10sec，(3)55℃退火20sec，(4)72℃延伸90sec，步骤(2)～(4)共进行3个循环，(5)98℃变性10sec，(6)54℃退火20sec，(7)72℃延伸90sec，步骤(5)～(7)共进行3个循环，(8)98℃变性10sec，(9)53℃退火20sec，(10)72℃延伸90sec，步骤(8)～(10)共进行3个循环，(11)98℃变性10sec，(12)52℃退火20sec，(13)72℃延伸90sec，步骤(11)～(13)共进行21个循环，最后72℃延伸10min，12℃保藏产物。
PCR扩增产物纯化之后，用Nde I和Hind III这两个限制性内切酶分别对易错PCR扩增产物和载体pET28a于37℃双酶切12h，两者的回收产物，用T4连接酶16℃下过夜连接，转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，并均匀涂布于含有50μl/mg卡那霉素的LB琼脂平板，37℃过夜培养，构建随机突变体文库，并进行筛选。筛选得到一个稳定性有大幅提高的突变体，Tm(蛋白解链温度为58.1℃，而母本的Tm为50.7℃；对底物COBE的耐受性为162mM，而母本的为34mM。经DNA测序发现其突变位点为A60T，命名为ScCR1A60T/I158V/P168S。
实施例4
重组表达载体的构建和重组表达转化体的制备
将实施例1、2和3中所得的羰基还原酶突变体基因DNA片段在37℃分别用限制性内切酶Nde I和Hind III双酶切12h，经琼脂糖凝胶电泳纯化，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目标片段。将目标片段在T4DNA连接酶的作用下，与同样经Nde I和Hind III双酶切后的质粒pET28a，在4℃连接过夜得到重组表达质粒。
将上述重组表达质粒转化到E.coli DH5α感受态细胞中，转化条件为45℃热激90秒，在含有卡那霉素的抗性平板上对阳性重组进行筛选，挑取单克隆，菌落PCR验证阳性克隆。培养重组菌，待质粒扩增后提取质粒，重新转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，转化液涂布到含有卡那霉素的LB平板上，37℃倒置培养过夜，即获得阳性重组转化体E.coliBL21(DE3)/pET28a-ScCR1突变体，菌落PCR验证阳性克隆。
实施例5
羰基还原酶ScCR1突变体的表达、纯化和酶活性与稳定性测定
将实施例4中所得羰基还原酶突变体的表达菌株接种于100ml含50μl/mg卡那霉素的LB液体培养基中，37℃200rpm培养至OD600达到0.6～0.8，降温至16℃并加入终浓度为0.1mM的IPTG，继续培养20h进行诱导表达。6000×g离心10min收集菌体，并用生理盐水洗涤两次，得静息细胞。将所得的静息细胞悬浮于pH 6.5的缓冲液中，在冰浴中超声破碎，离心收集上清液，即为重组羰基还原酶突变体的粗酶液。将粗酶液冻干，即为冻干粗酶粉。
用磷酸钠缓冲液(50mM，pH8.0，含500mM NaCl和5mMβ-巯基乙醇)重悬所得静息细胞，超声破碎，30000×g离心45min离心后取上清，即可得到羰基还原酶突变体蛋白的粗酶液。使用Ni亲和柱(1ml)纯化羰基还原酶突变体蛋白，具体方法如下：
(1)用磷酸钠缓冲液(50mM，pH8.0，含有500mM NaCl和5mMβ-巯基乙醇)平衡亲和Ni柱；
(2)将上述方法所得的羰基还原酶突变体蛋白的粗酶液以1ml/min的流速通过Ni柱，使目的蛋白挂载到Ni柱上；
(3)用含有0～50mM咪唑的磷酸钠缓冲液(50mM，pH8.0，含有500mM NaCl和5mMβ-巯基乙醇)洗脱与Ni柱没有结合能力的杂蛋白；
(4)用含有200mM咪唑的磷酸钠缓冲液(50mM，pH8.0，含有500mM NaCl和5mMβ-巯基乙醇)洗脱目的蛋白；
(5)用磷酸钠缓冲液(50mM，pH8.0，含有500mM NaCl和5mMβ-巯基乙醇)平衡Ni柱，以备后用。
(6)用垂直电泳仪进行SDS-PAGE检测收集到的蛋白样品。取20μl样品加入5μl 5×SDS上样缓冲液进行处理，上样量均为10μl，标准分子量蛋白(Protein Molecular WeightMarker)，购于美国Thermo公司。SDS-PAGE胶浓度为12％，选用110V电压进行浓缩电泳，再改为200V电压进行分离电泳。结果表明通过上述方法纯化获得高纯度的突变体蛋白，分子量大小在26kDa左右。
通过检测340nm处吸光值变化的方式进行重组羰基还原酶活力测定。具体方法如下：于1ml反应体系(50mM磷酸钠缓冲液，pH 6.5)中，加入终浓度为2mM的底物4-氯-3-羰基丁酸乙酯(COBE)，终浓度为0.1mM的NADH，30℃保温2分钟后加入适量纯酶溶液或细胞破碎后的粗酶液，迅速混匀，检测340nm处吸光值的变化。酶活力的计算公式为：酶活力(U)＝EW×V×103/(6220×l)；式中，EW为1min内340nm处吸光度的变化值；V为反应液的体积，单位ml；6220为NADH的摩尔消光系数，单位L/(mol·cm)；l为光程距离，单位cm。每单位(U)羰基还原酶的定义为上述条件下，每分钟催化1μmol NADH氧化所需的酶量。对各突变体进行测活，结果参见表1。
羰基还原酶突变体稳定性表征：根据文献(Angew.Chem.Int.Ed.2006,27,7745-7751)测定羰基还原酶的值，用类似方法测定羰基还原酶的值。
表1 ScCR1及其突变体性质
实施例6-8
ScCR1A60T/I158V/P168S催化不同羰基化合物的不对称还原
于1ml反应体系(50mM磷酸钠缓冲液，pH 6.5)中，加入终浓度为2mM的底物2,3-二庚酮，1-苯基-1,2-丙二酮和2-甲基-2-庚烯-6-酮，终浓度为0.1mM的NADH，30℃保温2分钟后加入适量实施例4获得的突变体ScCR1A60T/I158V/P168S酶液，迅速混匀，检测340nm处吸光值的变化。同时参考Bioresour.Technol.2011,102,7023-7028的方法，测定产物的ee值。，结果见表2。
表2 ScCR1A60T/I158V/P168S对不同羰基化合物的活性和立体选择性
实施例9
ScCR1A60T/I158V/P168S催化4-氯-3-羰基丁酸乙酯的不对称还原
称取40mg如实施例5制备的ScCR1A60T/I158V/P168S冻干粗酶粉溶解于5mL的KPB缓冲液(pH 6.5)，加入5mL含有浓度为200g/L底物COBE的甲苯，1.5倍底物当量的辅底物异丙醇，在磁力搅拌下分别于30℃进行反应，反应时间为2小时。反应结束后用等体积乙酸乙酯进行萃取，萃取两次，合并萃取液，加无水硫酸钠干燥过夜，之后分析测定底物转化率和还原产物的ee值，分别为99.9％和>99％(S)。而相同条件下，使用野生型酶ScCR1催化反应的底物转化率仅为70.1％。
实施例10
(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的十克级制备
反应在500mL的反应器中进行，称取1.24g如实施例5制备的ScCR1A60T/I158V/P168S静息细胞催化剂，其活力约为8.1U/mg静息细胞，加入150mL KPB缓冲液(50mM,pH6.5)，加入150mL甲苯和30g底物COBE，16.4g异丙醇，终浓度0.1mM的NAD+，在30℃恒温，200rpm机械搅拌下反应，反应9h后反应转化率达到99％，使用乙酸乙酯萃取反应得到的产物，加入适量无水硫酸钠干燥过夜，旋转蒸发除去溶剂，得到28.5g产物(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯，分离得率为95％，光学纯度高于99％。
上述对实施例的描述是为了便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明的范畴所作出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
<110> 华东理工大学
<120> 一种羰基还原酶突变体及其基因与应用
<160> 2
<170> PatentIn version3.3
<210> 1
<211> 792
<212> DNA
<213> Streptomyces coelicolor
<220>
<223> 野生型羰基还原酶
<400> 1
atgagcacca ccggaaccac ccccgccacc accgggtacg ccgccgagtt cgccggccgt 60
accgccctcg tcaccggtgc cgcctccggt atcggcctgg ccaccgcccg ccggctcggc 120
gccggcggcg cccgggtcgt cgtcgccgac ttcaacgccg agggcgccga gaaggccgcc 180
gccgagctgc gggccggtgg cgtcgaggcc gccgcggtcg agctggacgt cacccgtccg 240
gagtccgtcg aggcggccgt cgggttcgcc gtcgacacgt tcggctcgct ggacctcgcc 300
gtcaacaacg ccggcatcgg cggccccagc gccccgaccg gcgagtacga cgtggcggcc 360
taccagcgcg tcgtgcgcac caacctcgac ggcgtcttct actcgatgcg ctacgaactg 420
cccgccatcg aggcggccgg caagggcggc tcgatcgtga acgtcgcctc catcctcggc 480
tcggtcggct tcgccggctc ccccgcctac gtcgccgcca agcacggcgt ggtcgggctg 540
acgaaggcgg ccgccgccga gtacgccgcc cgcggcatcc ggatcaacgc ggtcggtccg 600
ggcttcatcg acacccccct gctcaagacc atggacgagg ccgcctacaa ggggctggtc 660
gccctgcacc cggccggccg cctcgggcgc tccgaggagg tcgcggagct gatcgccttc 720
ctgctgtccg accgcgcgtc cttcgtcgcg ggcagctatc acctggtcga cggcgcctac 780
accgccgtct ga 792
<210> 2
<211> 263
<212> PRT
<213> Streptomyces coelicolor
<220>
<223> 突变型羰基还原酶
<400> 2
Met Ser Thr Thr Gly Thr Thr Pro Ala Thr Thr Gly Tyr Ala Ala
5 10 15
Glu Phe Ala Gly Arg Thr Ala Lys Val Thr Gly Ala Ala Ser Gly
20 25 30
Ile Gly Leu Ala Thr Ala Arg Arg Leu Gly Ala Gly Gly Ala Arg
35 40 45
Val Val Val Ala Asp Phe Asn Ala Glu Gly Ala Glu Lys Ala Ala
50 55 60
Ala Glu Leu Arg Ala Gly Gly Val Glu Ala Ala Ala Val Glu Leu
65 70 75
Asp Val Thr Arg Pro Glu Ser Val Glu Ala Ala Val Gly Phe Ala
80 85 90
Val Asp Thr Phe Gly Ser Leu Asp Leu Ala Val Asn Asn Ala Gly
95 100 105
Ile Gly Gly Pro Ser Ala Pro Thr Gly Glu Tyr Asp Val Ala Ala
110 115 120
Tyr Gln Arg Val Val Arg Thr Asn Leu Asp Gly Val Pro Tyr Ser
125 130 135
Met Arg Tyr Glu Leu Pro Ala Ile Glu Ala Ala Gly Lys Gly Gly
140 145 150
Ser Ile Val Asn Val Ala Ser Ile Leu Gly Ser Val Gly Phe Ala
155 160 165
Gly Ser Pro Ala Tyr Val Ala Ala Lys His Gly Val Val Gly Leu
170 175 180
Thr Lys Ala Ala Ala Ala Glu Tyr Ala Ala Arg Gly Ile Arg Ile
185 190 195
Asn Ala Val Gly Pro Gly Phe Ile Asp Thr Pro Leu Leu Lys Thr
200 205 210
Met Asp Glu Ala Ala Tyr Lys Gly Leu Val Ala Leu His Pro Ala
215 220 225
Gly Arg Leu Gly Arg Ser Glu Glu Val Ala Glu Leu Ile Ala Phe
230 235 240
Leu Leu Ser Asp Arg Ala Ser Phe Val Ala Gly Ser Tyr His Leu
245 250 255
Ver Asp Gly Ala Tyr Thr Ala Val
260

Claims (8)

1.一种羰基还原酶突变体，其特征在于，其是如下新氨基酸序列组成的活性提高的羰基还原酶突变体：
(1) 将如序列表中SEQ ID No. 2所示氨基酸序列的第158位异亮氨酸替换为缬氨酸；
(2) 将如序列表中SEQ ID No. 2所示氨基酸序列的第158位异亮氨酸替换为缬氨酸，第168位脯氨酸替换为丝氨酸；
(3) 将如序列表中SEQ ID No. 2所示氨基酸序列的第60位丙氨酸替换为苏氨酸，第158位异亮氨酸替换为缬氨酸，第168位脯氨酸替换为丝氨酸。
2.一种分离的核酸，其特征在于，所述的核酸编码如权利要求1所述的羰基还原酶突变体蛋白质。
3.一种包含如权利要求2所述核酸的重组表达载体。
4.一种包含如权利要求3所述重组表达载体的重组表达转化体。
5.一种羰基还原酶突变体的制备方法，其特征在于，培养如权利要求4所述的重组表达转化体，从培养物中获得羰基还原酶突变体。
6.如权利要求1所述羰基还原酶突变体在催化潜手性羰基化合物不对称还原制备光学活性(S)-手性仲醇中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述羰基还原酶突变体以羰基还原酶突变体蛋白，或者是包含羰基还原酶突变体的转化体静息细胞形态使用。
8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的潜手性羰基化合物为4-氯-3-羰基丁酸乙酯、2,3-二庚酮、1-苯基-1,2-丙二酮或者2-甲基-2-庚烯-6-酮。
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