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CN117813377A - 聚合酶、组合物和使用方法 - Google Patents

聚合酶、组合物和使用方法 Download PDF

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CN117813377A
CN117813377A CN202280046426.3A CN202280046426A CN117813377A CN 117813377 A CN117813377 A CN 117813377A CN 202280046426 A CN202280046426 A CN 202280046426A CN 117813377 A CN117813377 A CN 117813377A
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CN202280046426.3A
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米沙·戈伦斯基
松浦真理子
所罗伯·尼兰塔
哈米德·塔巴塔巴伊·戈米
塞思·麦克唐纳
瑞安·克雷格
塞尔希奥·佩萨约维奇
凯里·约翰逊
凯·克劳斯
埃里克·慕特菲德
亚历山德拉·埃克斯纳
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Inmair Ltd
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Inmair Ltd
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    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12N9/1252—DNA-directed DNA polymerase (2.7.7.7), i.e. DNA replicase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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Abstract

本文提供了用于改善核苷酸和核苷酸类似物的掺入的经改变的聚合酶，特别是当使用环境储存的聚合酶时维持低预定相率的经改变的聚合酶，以及使用这些聚合酶的方法和试剂盒。

Description

聚合酶、组合物和使用方法
序列表
本申请包含通过EFS-Web电子提交给美国专利商标局(United States Patentand Trademark Office)的序列表，其为ASCII文本文件，名称为“2021-08-13-SeqListing_ST25.txt”，大小为158千字节并且创建于2021年8月13日。序列表中包含的信息以引用方式并入本文。
技术领域
本公开尤其涉及用于进行核苷酸掺入反应的经改变的聚合酶，特别是在通过合成进行核酸测序的情况下。
背景技术
边合成边测序(SBS)通常需要受控制地(即，每次一个)掺入与正在被测序的核酸相反的正确互补核苷酸。这使得能够通过在多个循环中添加核苷酸来准确测序，由于每次只测序一个核苷酸残基，从而防止不受控制地掺入核苷酸序列。使用与掺入的核苷酸附接的适当标记来读取掺入的核苷酸，之后除去该标记部分，并进行随后的下一轮测序。
为了确保在循环期间仅掺入单个核苷酸，在每个标记的核苷酸中包括结构修饰(“保护基团”或“封端基团”)，该结构修饰被添加到生长链以确保仅掺入一个核苷酸。在添加具有经修饰的核苷酸(通常称为全功能核苷酸(ffN))后，在不干扰正在被测序的DNA的完整性的反应条件下除去该封端基团。然后可继续测序循环，掺入下一个封端型标记核苷酸。
在环境温度下运输和储存用于SBS方法中的试剂是令人期望的，因为这减少对资源的依赖。然而，一些SBS试剂在环境温度下具有降低的稳定性。一些ffN在环境温度下较不稳定，并且封端基团丢失，从而导致ffN降解。所得到的未封端的核苷酸被聚合酶识别并且可以在测序反应期间被掺入，但是封端基团的缺失允许下一个核苷酸被掺入，这增加了预定相(pre-phasing)。预定相是非常不期望的，因为它增加噪声，降低测序质量，并且降低测序运行期间的读段长度。
发明内容
本文提供了重组DNA聚合酶，其具有改善的对识别和掺入已降解且不再包括封端基团的核苷酸的抗性。在一些实施方案中，本文的重组DNA聚合酶还提供改善的读段长度。
本公开的聚合酶的一个示例包括与DNA聚合酶氨基酸序列SEQ ID NO:8或12至少80％相同的氨基酸序列，其中该重组DNA聚合酶包括在功能上等同于聚合酶氨基酸序列中选自Ala408、Ala409和Ile410的氨基酸的位置处的至少一个、至少两个或至少三个氨基酸取代突变。在一个实施方案中，在功能上等同于Ala408的位置处的取代突变是对极性或不带电荷的氨基酸(诸如Tyr)的突变。在一个实施方案中，在功能上等同于Ala409的位置处的取代突变是对非极性或疏水性氨基酸(诸如Pro)的突变。在一个实施方案中，在功能上等同于Ile410的位置处的取代突变是对非极性或疏水性氨基酸(诸如Ala或Pro)的突变。在一个实施方案中，聚合酶还包括在功能上等同于聚合酶氨基酸序列中选自Ala129、Ala141、Ala143、Ser223、Val485、Gly497、Tyr247、Asp599和Gly633的氨基酸的位置处的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个或至少九个氨基酸取代突变。
还提供了编码本文所述的聚合酶的核酸分子、包含所述核酸分子的表达载体和包含所述载体的宿主细胞。
还提供了方法。在一个实施方案中，方法用于将经修饰的核苷酸掺入DNA中，并且包括允许以下组分相互作用：(i)本文所述的聚合酶，(ii)DNA模板；以及(iii)核苷酸溶液。
还提供了试剂盒。在一个实施方案中，试剂盒用于进行核苷酸掺入反应。该试剂盒可以包含本文所述的聚合酶和核苷酸溶液。
术语“和/或”意指所列要素中的一个或全部，或所列要素中的任何两个或更多个的组合。
词语“优选的”和“优选地”是指在某些情况下可提供某些益处的本发明的实施方案。然而，在相同或其他情况下，其他实施方案也可以是优选的。此外，对一个或多个优选实施方案的表述并不暗示其他实施方案是不可用的，并且并非旨在将其他实施方案排除在本发明的范围之外。
术语“包含”及其变型在说明书和权利要求书中出现这些术语时不具有限制的含义。
应当理解，在本文以语言“包括”、“包含”或“含有”等描述实施方案的任何地方，还提供了以“由…组成”和/或“基本上由…组成”描述的其他类似实施方案。
除非另外指明，否则“一个”、“一种”、“该”和“至少一个”可互换使用，表示一个或多于一个。
用于待发生事件的“适合”的条件或“合适的”条件是不阻止此类事件发生的条件。因此，这些条件允许、增强、促进和/或有利于事件。
如本文所用，在组合物、制品、核酸或细胞核的上下文中，“提供”意指制备组合物、制品、核酸或细胞核，购买组合物、制品、核酸或细胞核，或以其他方式获得化合物、组合物、制品或细胞核。
同样如本文所用，通过端点表述的数值范围包括该范围内所包含的所有数值(例如，1至5包括1、1.5、2、2.75、3、3.80、4、5等)。
本说明书通篇提及的“一个实施方案”、“实施方案”、“某些实施方案”或“一些实施方案”等意指结合该实施方案描述的特定特征、构型、组成或特性包括在本公开的至少一个实施方案中。因此，本说明书通篇的多处出现的此类短语不一定指本公开的相同实施方案。此外，在一个或多个实施方案中，特定特征、构型、组成或特性可以任何合适的方式组合。
附图说明
当结合以下附图阅读时，可最好地理解本公开的例示性实施方案的以下详细描述。
图1是示出来自嗜热球菌(Thermococcus sp.9°N-7)(9°N，SEQ ID NO:1)、海岸嗜热球菌(Thermococcus litoralis)(Vent，SEQ ID NO:2和Deep Vent，SEQ ID NO:3)、瓦奥塔普恩斯嗜热球菌(Thermococcus waiotapuensis)(Twa，SEQ ID NO:7)、小宝岛嗜热球菌(Thermococcus kodakaraenis)(KOD，SEQ ID NO:5)、激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)(Pfu，SEQ ID NO:4)、深海火球菌(Pyrococcus abyssi)(Pab，SEQ ID NO:6)的聚合酶氨基酸序列的比对的示意图。“*”(星号)表示在所有聚合酶之间具有单个完全保守残基的位置。“:”(冒号)表示具有以下强相似性质的组之间的保守性-大致等同于Gonnet PAM 250矩阵中的得分>0.5。“.”(句号)表示具有以下弱相似性质的组之间的保守性-大致等同于GonnetPAM 250矩阵中的得分＝<0.5且>0。
图2示出了所选择的本公开的经改变的聚合酶的错误率、定相水平和预定相水平。“Pol A”鉴定具有SEQ ID NO:1的聚合酶，其具有以下取代突变：Met129Ala、Asp141Ala、Glu143Ala、Cys223Ser、Leu408Ala、Tyr409Ala、Pro410Ile、Ala485Val；Pol H是具有取代突变Tyr291Cys的SEQ ID NO:12；Pol I是具有取代突变Gly427Glu的SEQ ID NO:12；Pol B是SEQ ID NO:24；Pol C是具有取代突变Tyr291Cys和Gly427Glu的SEQ ID NO:24；Pol D是具有取代突变Tyr291Cys、Gly427Glu和Ala485Gly的SEQ ID NO:24；“错误率”、“定相权重”和“预定相权重”是指读段1期间的错误率、定相率和预定相率。
图3示出了Pol A和Pol B聚合酶的错误率、定相水平和预定相水平。Pol A和Pol B在图2的简要说明中有所描述。第1列和第6列示出了在没有添加dNTP的条件下的对照，并且第2列至第5列示出了在含有0、2.5％、5％和10％dNTP:ffN的掺入混合物中的Pol A和Pol B聚合酶。在第2列至第5列中，虚线表示Pol A聚合酶，并且实线表示Pol B聚合酶。“错误率”、“定相”和“预定相”是指读段1期间的错误率、定相率和预定相率。
示意图未必按比例绘制。附图中使用的类似标号是指类似的部件、步骤等。然而，应当理解，在给定附图中使用数字来指代部件并非旨在限制在另一附图中用相同数字标记的部件。此外，使用不同的数字来指代部件并非旨在指示不同编号的部件不能与其他编号的部件相同或类似。
具体实施方式
可以通过新一代聚合酶来辅助当使用在环境温度下储存的经修饰的核苷酸时维持或超越当前性能水平。本文提供了当使用环境储存的经修饰的核苷酸时在SBS条件下具有显著改善的性能的聚合酶。本发明人已鉴定了赋予聚合酶对掺入已失去封端基团的核苷酸的抗性的突变。赋予这类活性的突变的类型是令人惊讶的。还发现一些突变改善读段长度。
定相(phasing)和预定相(pre-phasing)是本领域技术人员已知的术语，并且用于描述在簇的序列拷贝的读出中同步的丢失。定相和预定相导致特定循环的提取强度包括当前循环的信号以及来自前一个和后一个循环的噪声。因此，如本文所用，术语“定相”是指SBS中的一种现象，其是由于在给定的测序循环中通过聚合酶在簇内的DNA链的一些部分中不完全掺入核苷酸而引起的，并且因此是簇内的单分子失去彼此同步时的速率的量度。定相可以在每个循环的簇信号的检测期间被测量，并且可以被报告为与簇中的信号不同步的来自簇的可检测信号的百分比。作为示例，在循环N期间通过“绿色”荧光基团信号来检测簇。在随后的循环(循环N+1)中，在“红色”通道中检测到99.9％的簇信号，0.1％的信号仍来自前一个循环并且在“绿色”通道中被检测到。这一结果将表明发生了定相，并且其可以报告为数值，诸如0.1的定相值，表明簇中0.1％的分子在每个循环中落后。
如本文所用，术语“预定相”是指SBS中的一种现象，其是由于掺入没有有效3'终止子的核苷酸从而导致掺入事件提前一个循环而引起的。随着循环的数量增加，受到预定相影响的每个簇的序列分数增加，从而妨碍对正确碱基的鉴定。预定相可通过测序仪器检测并以数值报告，诸如0.1的预定相值，表明簇中0.1％的分子在每个循环中超前运行。
定相和预定相的检测可以根据本领域已知的任何合适的方法进行和报告，例如，如美国专利第8,965,076号和美国专利申请公开号2018/0057018中所述。预定相可在SBS测序运行期间在测序仪器上常规地检测和报告，该测序仪器诸如为来自Illumina,Inc.(SanDiego,CA)的HiSeqTM、Genome AnalyzerTM、NextSeqTM、NovaSeqTM、iSeqTM、MiniSeqTM或MiSeqTM测序平台或本领域已知的任何其他合适的仪器。
错误率是指在测序反应期间鉴定正确碱基(即特定位置处的模板序列的互补序列)的错误频率的量度。测序文库与原始基因组序列匹配的保真度可根据从核酸提取到其在测序平台上测序的任何阶段发生的碱基突变的频率而变化。该频率对测序碱基正确的概率设置了上限。在一些实施方案中，质量得分以数值形式提供。例如，质量得分可以被引用为QXX，其中XX是得分并且它意味着该特定调用具有10-xx/10的错误概率。因此，作为示例，Q30等于1/1000或0.1％的错误率，并且Q40等于1/10,000或0.01％的错误率。
在环境温度下运输用于测序反应的试剂是非常理想的，但可能会导致经修饰的核苷酸因失去封端基团而降解。然而，在测序反应中使用降解的核苷酸可能会增加预定相的发生，这促成错误率。在降解的核苷酸存在下降低预定相的经改变的聚合酶的发现是出乎意料的，并且提供了在环境温度下运输和储存试剂的优点。
聚合酶
本文提供了聚合酶、包含聚合酶的组合物以及使用聚合酶的方法。本文所述的聚合酶是DNA聚合酶。在一个实施方案中，本公开的聚合酶(在本文中也可互换地称为“经改变的聚合酶”和“重组聚合酶”)基于参考聚合酶的氨基酸序列。当与参考聚合酶相比时，经改变的聚合酶包括在一个或多个残基处的取代突变。与参考聚合酶相比，取代突变可以在相同的位置或功能上等同的位置处。本文详细描述了参考聚合酶和功能上等同的位置。本领域技术人员将容易理解本文所述的经改变的聚合酶并非天然存在的。
本文所述的参考聚合酶在SBS反应期间以可用于SBS反应中的速率掺入核苷酸；然而，参考聚合酶也以与含有封端基团的核苷酸的掺入速率类似的速率掺入失去封端基团的核苷酸，例如，参考聚合酶不区分这两种类型的核苷酸。相反，本文所述的经改变的聚合酶维持参考聚合酶中观察到的经修饰的核苷酸的优异掺入速率，但具有降低已失去封端基团的核苷酸的掺入速率的优点。用于确定经改变的聚合酶是否对经修饰的和降解的核苷酸具有不同的掺入速率的方法可以在实施例中找到。
在一个实施方案中，当使用快速掺入时间测试经改变的聚合酶时，会出现降低的预定相率。掺入是指DNA聚合酶与模板接触的时间量。如本文所用，缓慢掺入时间是在使用MiniSeqTM台式测序系统的标准循环下使用的掺入时间。缓慢掺入时间包括40秒至100秒。如本文所用，快速循环时间是指10秒至40秒的掺入步骤。
本文所述的经改变的聚合酶可用于不同长度运行的SBS反应。“运行”是指在模板上鉴定的核苷酸的数量。运行通常包括基于读取模板的一条链的第一引物(例如，readl引物)的运行和基于读取模板的互补链的第二引物(例如，read2引物)的运行。在一个实施方案中，使用第一引物或第二引物鉴定的核苷酸的数量可以是10个至300个核苷酸。在一个实施方案中，使用第一引物或第二引物鉴定的核苷酸的数量可以是不大于300个核苷酸、不大于260个核苷酸、不大于240个核苷酸、不大于200个核苷酸、不大于160个核苷酸、不大于120个核苷酸、不大于80个核苷酸或不大于40个核苷酸。在一个实施方案中，使用第一引物或第二引物鉴定的核苷酸的数量可以是至少10个、至少40个、至少80个、至少120个、至少160个、至少200个、至少240个、至少260或至少300个核苷酸。
在某些实施方案中，经改变的聚合酶基于B家族型DNA聚合酶。经改变的聚合酶可以基于例如B家族古细菌DNA聚合酶、人DNA聚合酶-α或噬菌体聚合酶。
B家族古细菌DNA聚合酶是本领域熟知的，如通过美国专利第8,283,149号的公开内容所例示的。在某些实施方案中，古细菌DNA聚合酶来自超嗜热性古细菌并且是热稳定的。
在某些实施方案中，B家族古细菌DNA聚合酶来自一个属，诸如例如，嗜热球菌属、火球菌属、甲烷球菌属(Methanococcusm)、火棒菌属(Pyrobaculum)、隐蔽热网菌(Pyrodictium occultum)和敏捷气火菌(Aeropyrum pemix)。嗜热球菌属的成员是本领域熟知的，并且包括但不限于T.4557、嗜压嗜热球菌(T.barophilus)、耐γ射线嗜热球菌(T.gammatolerans)、纽氏嗜热球菌(T.onnurineus)、西伯利亚嗜热球菌(T.sibiricus)、小宝岛嗜热球菌(T.kodakarensis)、古股纳斯热球菌(T.gorgonarius，TGO)和瓦奥塔普恩斯嗜热球菌。火球菌属的成员是本领域熟知的，并且包括但不限于P.NA2、深海火球菌、激烈深海火球菌、掘越氏热球菌(P.horikoshii)、亚氏火球菌(P.yayanosii)、奋进热球菌(P.endeavori)、食糖火球菌(P.glycovorans)和沃氏火球(P.woesei)。甲烷球菌属的成员是本领域熟知的，并且包括但不限于艾氏甲烷球菌(M.aeolicus)、海沼甲烷球菌(M.maripaludis)、万氏甲烷球菌(M.vannielii)、沃氏甲烷球菌(M.voltae)、热自养甲烷球菌(M.thermolithotrophicus)和詹氏甲烷球菌(M.jannaschii)。火棒菌属的成员是本领域熟知的，并且包括但不限于杯丰火棒菌(P.calidifontis，Pc)。热网菌属的成员是本领域熟知的，并且包括但不限于隐蔽热网菌。气火菌属的成员是本领域熟知的，并且包括但不限于敏捷气火菌。
在一个实施方案中，经改变的聚合酶基于Deep/>9°N、Pfu、KOD或Pab聚合酶。/>和Deep/>是用于从超嗜热性古细菌海岸嗜热球菌分离的B家族DNA聚合酶的商业名称。9°N聚合酶是从嗜热球菌分离的B家族聚合酶。Pfu聚合酶是从激烈火球菌分离的B家族聚合酶。KOD聚合酶是从小宝岛嗜热球菌分离的B家族聚合酶。Pab聚合酶是从深海火球菌分离的B家族聚合酶。Twa是从瓦奥塔普恩斯嗜热球菌分离的B家族聚合酶。在图1中公开了/>Deep/>9°N、Pfu、KOD、Pab和Twa聚合酶的示例。
在某些实施方案中，B家族DNA聚合酶来自噬菌体，诸如例如，T4、RB69或phi29噬菌体。
图1示出了具有SEQ ID NO:1-7所示氨基酸序列的蛋白质的序列比对。该比对表明在不同B家族聚合酶中保守的氨基酸。本领域技术人员将理解，保守氨基酸和保守区域之所以保守，很可能是因为它们对聚合酶的功能很重要，并且因此显示聚合酶的结构与功能之间的相关性。该比对还显示了跨不同B家族聚合酶的可变性区域。本领域普通技术人员可以根据这些数据推断出其中可以允许取代，特别是保守取代，而不过度影响经改变的聚合酶的生物活性的聚合酶区域。
本文描述的经改变的聚合酶基于已知聚合酶(本文也称为参考聚合酶)的氨基酸序列，并且还包括在一个或多个残基处的取代突变。在一个实施方案中，取代突变位于在功能上等同于参考聚合酶的氨基酸的位置处。“功能上等同”意指经改变的聚合酶在参考聚合酶中的氨基酸位置处具有氨基酸取代，该氨基酸位置在参考聚合酶和经改变的聚合酶中具有相同的功能作用。
通常，两种或更多种不同聚合酶中的功能上等同的取代突变发生在这些聚合酶的氨基酸序列中的同源氨基酸位置处。因此，本文所用的术语“功能上等同”还涵盖与给定突变“位置上等同”或“同源”的突变，而不管突变的氨基酸的特定功能是否已知。可以基于序列比对和/或分子建模来鉴定两种或更多种不同聚合酶的氨基酸序列中功能上等同和位置上等同的氨基酸残基的位置。鉴定位置上等同和/或功能上等同的残基的序列比对的示例示于图1中。例如，图1的Twa、KOD、Pab、Pfu、Deep和/>聚合酶中竖直排列的残基被认为与9°N聚合酶氨基酸序列中的对应残基在位置上等同以及在功能上等同。因此，例如9°N、Twa、KOD、Pfu、Deep/>和Pab聚合酶的残基349与/>聚合酶的残基351在功能上是等同的并且在位置上是等同的。同样，例如9°N、Twa、KOD和Pab聚合酶的残基633、Pfu和Deep/>聚合酶的残基634以及/>聚合酶的残基636在功能上是等同的并且在位置上是等同的。本领域技术人员可以容易地鉴定DNA聚合酶中的功能上等同的残基。
在某些实施方案中，取代突变包括对具有非极性侧链的残基的突变。具有非极性侧链的氨基酸是本领域熟知的，并且包括例如：丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸和缬氨酸。
在某些实施方案中，取代突变包括对具有极性侧链的残基的突变。具有极性侧链的氨基酸是本领域熟知的，并且包括例如：精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、组氨酸、赖氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、酪氨酸和苏氨酸。
在某些实施方案中，取代突变包括对具有疏水侧链的残基的突变。具有疏水侧链的氨基酸是本领域熟知的，并且包括例如：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸和色氨酸。
在某些实施方案中，取代突变包括对具有不带电荷侧链的残基的突变。具有不带电荷侧链的氨基酸是本领域熟知的，并且包括例如：甘氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸和苏氨酸等。
在一个实施方案中，经改变的聚合酶具有与本文公开的参考聚合酶在结构上相似的氨基酸序列。在一个实施方案中，参考聚合酶是SEQ ID NO:1，其具有以下取代突变：Met129Ala、Asp141Ala、Glu143Ala、Cys223Ser、Leu408Ala、Tyr409Ala、Pro410Ile、Ala485Val和Tyr497Gly，以及选自Arg247Tyr、Glu599Asp、Lys620Arg、His633Gly和Val661Asp的至少一个取代突变。参考聚合酶的示例是具有以下取代突变的SEQ ID NO:1：Met129Ala、Asp141Ala、Glu143Ala、Cys223Ser、Leu408Ala、Tyr409Ala、Pro410Ile、Ala485Val、Tyr497Gly、Arg247Tyr、Glu599Asp和His633Gly。该第二参考聚合酶在SEQ IDNO:8中公开。
参考序列的另一个示例是具有以下取代突变的SEQ ID NO:1：Met129Ala、Asp141Ala、Glu143Ala、Cys223Ser、Leu408Ala、Tyr409Ala、Pro410Ile、Ala485Val、Tyr497Gly、Arg247Tyr、His633Gly和Val661Asp。该参考聚合酶在SEQ ID NO:9中公开。
参考序列的另一个示例是具有以下取代突变的SEQ ID NO:1：Met129Ala、Asp141Ala、Glu143Ala、Cys223Ser、Leu408Ala、Tyr409Ala、Pro410Ile、Ala485Val、Tyr497Gly、Arg247Tyr、Glu599Asp、Lys620Arg和His633Gly。该参考聚合酶在SEQ ID NO:10中公开。
参考序列的另一个示例是具有以下取代突变的SEQ ID NO:1：Met129Ala、Asp141Ala、Glu143Ala、Cys223Ser、Leu408Ala、Tyr409Ala、Pro410Ile、Ala485Val、Tyr497Gly、Arg247Tyr和His633Gly。该参考聚合酶在SEQ ID NO:11中公开。
在另一个实施方案中，参考聚合酶是SEQ ID NO:1，其具有以下取代突变：Met129Ala、Asp 141Ala、Glu143Ala、Cys223Ser、Leu408Ala、Tyr409Ala、Pro410Ile、Ala485Val和Tyr497Gly，以及选自Ala281Phe、Phe283Ser、Thr349Lys、Thr349Ser、Thr349Asn、Trp397Cys和His633Thr的至少一个取代突变。参考聚合酶的示例是具有以下取代突变的SEQ ID NO:1：Met129Ala、Asp141 Ala、Glu143Ala、Cys223Ser、Leu408Ala、Tyr409Ala、Pro410Ile、Ala485Val、Tyr497Gly、Arg247Tyr、Glu599Asp、His633Gly和Thr349Lys。该参考聚合酶在SEQ ID NO:12中公开。
参考序列的另一个示例是具有以下取代突变的SEQ ID NO:1：Met129Ala、Asp141Ala、Glu143Ala、Cys223Ser、Leu408Ala、Tyr409Ala、Pro410Ile、Ala485Val、Tyr497Gly、Arg247Tyr、Glu599Asp、His633Gly和Ala281Phe。该参考聚合酶在SEQ ID NO:13中公开。
参考序列的另一个示例是具有以下取代突变的SEQ ID NO:1：Met129Ala、Asp141Ala、Glu143Ala、Cys223Ser、Leu408Ala、Tyr409Ala、Pro410Ile、Ala485Val、Tyr497Gly、Arg247Tyr、Glu599Asp、His633Gly和Phe283Ser。该参考聚合酶在SEQ ID NO:14中公开。
参考序列的另一个示例是具有以下取代突变的SEQ ID NO:1：Met129Ala、Asp141Ala、Glu143Ala、Cys223Ser、Leu408Ala、Tyr409Ala、Pro410Ile、Ala485Val、Tyr497Gly、Arg247Tyr、Glu599Asp、His633Gly和Thr349Ser。该参考聚合酶在SEQ ID NO:15中公开。
参考序列的另一个示例是具有以下取代突变的SEQ ID NO:1：Met129Ala、Asp141Ala、Glu143Ala、Cys223Ser、Leu408Ala、Tyr409Ala、Pro410Ile、Ala485Val、Tyr497Gly、Arg247Tyr、Glu599Asp、His633Gly和Thr349Asn。该参考聚合酶在SEQ ID NO:16中公开。
参考序列的另一个示例是具有以下取代突变的SEQ ID NO:1：Met129Ala、Asp141Ala、Glu143Ala、Cys223Ser、Leu408Ala、Tyr409Ala、Pro410Ile、Ala485Val、Tyr497Gly、Arg247Tyr、Glu599Asp、His633Gly、Thr349Lys和Trp397Cys。该参考聚合酶在SEQ ID NO:17中公开。
参考序列的另一个示例是具有以下取代突变的SEQ ID NO:1：Met129Ala、Asp141Ala、Glu143Ala、Cys223Ser、Leu408Ala、Tyr409Ala、Pro410Ile、Ala485Val、Tyr497Gly、Arg247Tyr、Glu599Asp和His633Thr。该参考聚合酶在SEQ ID NO:18中公开。
其他参考序列包括具有本文所述的取代突变的SEQ ID NO:2、3、4、5、6或7。在一个实施方案中，其他参考序列包括具有取代突变的SEQ ID NO:2、3、4、5、6或7，该取代突变在功能上等同于野生型9°N聚合酶(SEQ ID NO:1)中的以下取代突变：Met129Ala、Asp141Ala、Glu143Ala、Cys223Ser、Leu408Ala、Tyr409Ala、Pro410Ile、Ala485Val和Tyr497Gly，以及选自Arg247Tyr、Glu599Asp、Lys620Arg、His633Gly和Val661 Asp的至少一个取代突变。在一个实施方案中，其他参考序列包括具有取代突变的SEQ ID NO:2、3、4、5、6或7，该取代突变在功能上等同于野生型9°N聚合酶(SEQ ID NO:1)中的以下取代突变：Met129Ala、Asp141Ala、Glu143Ala、Cys223Ser、Leu408Ala、Tyr409Ala、Pro410Ile、Ala485Val和Tyr497Gly，以及选自Ala281Phe、Phe283Ser、Thr349Lys、Thr349Ser、Thr349Asn、Trp397Cys和His633Thr的至少一个取代突变。
如本文所用，如果经改变的聚合酶的氨基酸序列与参考聚合酶相比具有特定量的序列相似性和/或序列同一性，则经改变的聚合酶可与参考聚合酶“在结构上相似”。
两个氨基酸序列的结构相似性可通过以下方式来确定：比对两个序列(例如，本文所述的候选聚合酶和参考聚合酶)的残基以优化沿其序列长度的相同氨基酸的数量；在进行比对时允许任一个序列或两个序列中存在间隙，以优化相同氨基酸的数量，但是每个序列中的氨基酸必须保持其正确的顺序。候选聚合酶是与参考聚合酶进行比较的聚合酶。与参考聚合酶具有结构相似性和聚合酶活性的候选聚合酶是经改变的聚合酶。
除非本文另有说明进行了修改，否则氨基酸序列或核苷酸序列的成对比较分析可例如通过Smith&Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)的局部同源算法；Needleman&Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)的同源比对算法；通过Pearson&Lipman,Proc.Nat'1.Acad.Sci.USA 85:2444(1988)搜索相似法；通过这些算法的计算机化实施(WisconsinGenetics Software Package,Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,Wis.中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)；或通过视觉检查(通常参见，Current Protocols inMolecular Biology,Ausubel等人，编辑，Current Protocols,a joint venture betweenGreene Publishing Associates,Inc.and John Wiley&Sons,Inc.，补充至2004年)进行。
适于确定结构相似性的算法的一个示例是BLAST算法，其描述于Altschul等人，J.Mol.Biol.215:403-410(1990)中。用于执行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心公开获得。该算法包括首先通过识别查询序列中长度为W的短字码来识别高评分序列对(HSP)，当与数据库序列中相同长度的字码对准时，这些高评分序列对匹配或满足某一正值阈值分数T。T被称作邻域字得分阈值(Altschul等人，J.Mol.Biol.215:403-410(1990))。这些初始相邻字码命中充当启动搜索的种子，以寻找含有这些字码命中的更长HSP。然后，这些字码命中沿着每个序列在两个方向上延伸，直到可以增加累积比对分数为止。对于核苷酸序列，使用参数M(对一对匹配残基的奖励得分；始终>0)和N(对错配残基的惩罚得分；始终<0)来计算累积得分。对于氨基酸序列，使用评分矩阵来计算累积分数。当出现以下情况时停止字码命中在每个方向上的延伸：累积比对分数从其最大实现值下降了量X；由于一个或多个负评分残基比对的累积，累积分数降低至零或更低；或到达任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X测定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用字长(W)11、期望(E)10、截止值100、M＝5、N＝-4以及两条链的比较作为默认值。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用字长(W)3、期望值(E)10和BLOSUM62得分矩阵(参见Henikoff和Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915)作为默认值。
除了计算百分比序列同一性之外，BLAST算法还对两个序列之间的类似性进行统计分析(参见，例如，Karlin和Altschul,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 90:5873-5787(1993))。BLAST算法提供的一种相似性量度是最小总和概率(P(N))，该最小总和概率提供了两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率的指示。例如，如果在测试核酸与参考核酸的比较中的最小总和概率小于约0.1，更优选地小于约0.01，并且最优选地小于约0.001，则认为核酸与参考序列相似。
在两个氨基酸序列的比较中，结构相似性可以通过“同一性”百分比来表示或者可以通过“相似性”百分比来表示。“同一性”是指存在相同的氨基酸。“相似性”是指不仅存在相同的氨基酸，而且存在保守取代。蛋白质中氨基酸的保守取代可选自该氨基酸所属类别的其他成员。例如，在蛋白质生物化学领域中众所周知的是，属于具有特定大小或特性(诸如电荷、疏水性或亲水性)的氨基酸组的氨基酸可以被另一种氨基酸取代而不改变蛋白质的活性，特别是在与生物活性不直接相关的蛋白质区域中。例如，非极性氨基酸包括丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸和缬氨酸。疏水性氨基酸包括甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸和色氨酸。极性氨基酸包括精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、组氨酸、赖氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、酪氨酸和苏氨酸。不带电荷的氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸和苏氨酸等。
因此，提及聚合酶，诸如提及本文所述的一个或多个SEQ ID NO的氨基酸序列可包括与参考聚合酶具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％氨基酸序列相似性的蛋白质。
另选地，提及聚合酶，诸如提及本文所述的一个或多个SEQ ID NO的氨基酸序列可包括与参考聚合酶具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％氨基酸序列同一性的蛋白质。
本公开描述了导致聚合酶具有本文所述的一种或多种活性的突变的集合。本文所述的聚合酶可以包括任何数量的取代突变，例如，与参考聚合酶诸如SEQ ID NO:8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18相比，至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个或至少18个突变。同样，本文所述的聚合酶可以包括任何组合的突变。
在一个实施方案中，经改变的聚合酶包括在功能上等同于9°N聚合酶(例如，参考聚合酶SEQ ID NO:8或12)中的Ala408的位置处的取代突变。在一个实施方案中，在功能上等同于Ala408的位置处的取代突变是对极性或不带电荷的氨基酸(例如Tyr)的突变。
在一个实施方案中，经改变的聚合酶包括在功能上等同于9°N聚合酶(例如，参考聚合酶SEQ ID NO:8或12)中的Ala409的位置处的取代突变。在一个实施方案中，在功能上等同于Ala409的位置处的取代突变是对非极性或疏水性氨基酸(例如Pro)的突变。
在一个实施方案中，经改变的聚合酶包括在功能上等同于9°N聚合酶(例如，参考聚合酶SEQ ID NO:8或12)中的Ile410的位置处的取代突变。在一个实施方案中，在功能上等同于Ile410的位置处的取代突变是对非极性或疏水性氨基酸(例如Ala或Pro)的突变。
本公开的经改变的聚合酶包括在功能上等同于Ala408和Ala409、或Ala409和Ile410、或Ala408和Ile410的位置处的取代突变，或在所有三个位置处的取代突变。在一个实施方案中，经改变的聚合酶是具有以下取代突变的SEQ ID NO:8：Ala408Tyr、Ala409Pro和Pro410Ala(SEQ ID NO:19)、Ala408Tyr和Ala409Pro(SEQ ID NO:20)、或Ala408Tyr、Ala409Pro和Ile410Pro(SEQ ID NO:21)。在一个实施方案中，经改变的聚合酶是具有以下取代突变的SEQ ID NO:12：Ala408Tyr、Ala409Pro和Pro410Ala(SEQ ID NO:22)、Ala408Tyr和Ala409Pro(SEQ ID NO:23)、或Ala408Tyr、Ala409Pro和Ile410Pro(SEQ ID NO:24)。
本公开的经改变的聚合酶，例如具有SEQ ID NO:8或12的氨基酸序列以及在功能上等同于Ala408、Ala409、Ile410或其组合的位置处的取代突变的聚合酶，还可以包括一个或多个额外的取代突变。
在一个实施方案中，取代突变位于在功能上等同于参考聚合酶(诸如SEQ ID NO:8或12)中的Ala129的位置处。在一个实施方案中，在功能上等同于SEQ ID NO:8或12中的Ala129的位置处的取代突变是对非极性或疏水性氨基酸的突变。在一个实施方案中，取代突变是对丙氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸或缬氨酸的突变。在一个实施方案中，取代突变是对除甲硫氨酸以外的任何氨基酸的突变。
在一个实施方案中，取代突变位于在功能上等同于参考聚合酶(诸如SEQ ID NO:8或12)中的Ala141的位置处。在一个实施方案中，在功能上等同于SEQ ID NO:8或12中的Ala141的位置处的取代突变是对非极性或疏水性氨基酸的突变。
在一个实施方案中，取代突变位于在功能上等同于参考聚合酶(诸如SEQ ID NO:8或12)中的Ala143的位置处。在一个实施方案中，在功能上等同于SEQ ID NO:8或12中的Ala143的位置处的取代突变是对非极性或疏水性氨基酸的突变。
在一个实施方案中，取代突变位于在功能上等同于参考聚合酶(诸如SEQ ID NO:8或12)中的Ser223的位置处。在一个实施方案中，在功能上等同于SEQ ID NO:8或12中的Ser223的位置处的取代突变是对极性或不带电荷的氨基酸的突变。
在一个实施方案中，取代突变位于在功能上等同于参考聚合酶(诸如SEQ ID NO:8或12)中的Val485的位置处。在一个实施方案中，在功能上等同于SEQ ID NO:8或12中的Val485的位置处的取代突变是对非极性或疏水性氨基酸(诸如Gly)的突变。
在一个实施方案中，取代突变位于在功能上等同于参考聚合酶(诸如SEQ ID NO:8或12)中的Gly497的位置处。在一个实施方案中，在功能上等同于SEQ ID NO:8或12中的Gly497的位置处的取代突变是对非极性、疏水性或不带电荷的氨基酸的突变。
在一个实施方案中，取代突变位于在功能上等同于参考聚合酶(诸如SEQ ID NO:8或12)中的Tyr247的位置处。在一个实施方案中，在功能上等同于SEQ ID NO:8或12中的Tyr247的位置处的取代突变是对极性或不带电荷的氨基酸的突变。
在一个实施方案中，取代突变位于在功能上等同于参考聚合酶(诸如SEQ ID NO:8或12)中的Asp599的位置处。在一个实施方案中，在功能上等同于SEQ ID NO:8或12中的Asp599的位置处的取代突变是对极性氨基酸的突变。
在一个实施方案中，取代突变位于在功能上等同于参考聚合酶(诸如SEQ ID NO:8或12)中的Gly633的位置处。在一个实施方案中，在功能上等同于SEQ ID NO:8或12中的Gly633的位置处的取代突变是对非极性、疏水性或不带电荷的氨基酸的突变。
在一个实施方案中，取代突变位于在功能上等同于参考聚合酶(诸如SEQ ID NO:12)中的Lys349的位置处。在一个实施方案中，在功能上等同于Lys349的位置处的取代突变是对极性或不带电荷的氨基酸(诸如Ser或Arg)的突变。
在一个实施方案中，本公开的经改变的聚合酶包括在功能上等同于参考聚合酶诸如SEQ ID NO:8中的Ala129、Ala 141、Ala143、Ser223、Val485、Gly497、Tyr247、Asp599或Gly633的位置处的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个或至少九个取代突变。在一个实施方案中，本公开的经改变的聚合酶包括在功能上等同于参考聚合酶诸如SEQ ID NO:12中的Ala129、Ala 141、Ala143、Ser223、Val485、Gly497、Tyr247、Asp599、Gly633或Lys349的位置处的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或至少十个取代突变。
在另一个实施方案中，本文所述的经改变的聚合酶还可以包括选自在功能上等同于参考聚合酶(诸如SEQ ID NO:8或12)中的Lys620或Val661的位置的一个或多个额外的取代突变。
在一个实施方案中，取代突变位于在功能上等同于参考聚合酶(诸如SEQ ID NO:8或12)中的Lys620的位置处，是对极性或不带电荷的氨基酸(例如Arg)的突变。
在一个实施方案中，取代突变位于在功能上等同于参考聚合酶(诸如SEQ ID NO:8或12)中的Val661的位置处，是对极性氨基酸(例如Asn)的突变。
在其他实施方案中，本文所述的经改变的聚合酶还可以包括选自在功能上等同于参考聚合酶(诸如SEQ ID NO:8或12)中的Phe152、Val278、Met329、Val471、Thr514、Leu631、Glu734、Lys476、Lys477、Ile521和Thr590的位置的一个或多个额外的取代突变。
在一个实施方案中，取代突变位于在功能上等同于参考聚合酶(诸如SEQ ID NO:8或12)中的Phe152的位置处。在一个实施方案中，在功能上等同于SEQ ID NO:8或12中的Phe152的位置处的取代突变是对非极性、疏水性或不带电荷的氨基酸(例如Gly)的突变。
在一个实施方案中，取代突变位于在功能上等同于参考聚合酶(诸如SEQ ID NO:8或12)中的Val278的位置处。在一个实施方案中，在功能上等同于SEQ ID NO:8或12中的Val278的位置处的取代突变是对非极性或疏水性氨基酸(例如Leu)的突变。
在一个实施方案中，取代突变位于在功能上等同于参考聚合酶(诸如SEQ ID NO:8或12)中的Met329的位置处。在一个实施方案中，在功能上等同于SEQ ID NO:8或12中的Met329的位置处的取代突变是对极性氨基酸(例如His)的突变。
在一个实施方案中，取代突变位于在功能上等同于参考聚合酶(诸如SEQ ID NO:8或12)中的Val471的位置处。在一个实施方案中，在功能上等同于SEQ ID NO:8或12中的Val471的位置处的取代突变是对极性或不带电荷的氨基酸(例如Ser)的突变。
在一个实施方案中，取代突变位于在功能上等同于参考聚合酶(诸如SEQ ID NO:8或12)中的Thr514的位置处。包括在功能上等同于9°N聚合酶(SEQ ID NO:1)中的Thr514的位置处的取代突变的聚合酶是本领域已知的并且通过美国专利申请号2016/0032377例示。在一个实施方案中，在功能上等同于SEQ ID NO:8或12中的Thr514的位置处的取代突变是对非极性或疏水性氨基酸(例如Ala)的突变。在一些实施方案中，可与在功能上等同于Thr514的位置处的非极性或疏水性氨基酸组合使用的其他取代突变包括Phe152、Val278、Met329、Val471、Leu631、Glu734或其组合。在一个实施方案中，在功能上等同于Thr514的位置处的取代突变是对极性或不带电荷的氨基酸(例如Ser)的突变。在一些实施方案中，可与在功能上等同于Thr514的位置处的极性或不带电荷的氨基酸组合使用的其他取代突变包括Lys476、Lys477、Ile521、Thr590或其组合。
在一个实施方案中，取代突变位于在功能上等同于参考聚合酶(诸如SEQ ID NO:8或12)中的Leu631的位置处。在一个实施方案中，在功能上等同于SEQ ID NO:8或12中的Leu631的位置处的取代突变是对非极性或疏水性氨基酸(例如Met)的突变。
在一个实施方案中，取代突变位于在功能上等同于参考聚合酶(诸如SEQ ID NO:8或12)中的Glu734的位置处。在一个实施方案中，在功能上等同于SEQ ID NO:8或12中的Glu734的位置处的取代突变是对极性或不带电荷的氨基酸(例如Arg)的突变。
在一个实施方案中，取代突变位于在功能上等同于参考聚合酶(诸如SEQ ID NO:8或12)中的Lys476的位置处。在一个实施方案中，在功能上等同于SEQ ID NO:8或12中的Lys476的位置处的取代突变是对非极性或疏水性氨基酸(例如Trp)的突变。
在一个实施方案中，取代突变位于在功能上等同于参考聚合酶(诸如SEQ ID NO:8或12)中的Lys477的位置处。在一个实施方案中，在功能上等同于SEQ ID NO:8或12中的Lys477的位置处的取代突变是对非极性或疏水性氨基酸(例如Met)的突变。
在一个实施方案中，取代突变位于在功能上等同于参考聚合酶(诸如SEQ ID NO:8或12)中的Ile521的位置处。在一个实施方案中，在功能上等同于SEQ ID NO:8或12中的Ile521的位置处的取代突变是对非极性氨基酸(例如Leu)的突变。
在一个实施方案中，取代突变位于在功能上等同于参考聚合酶(诸如SEQ ID NO:8或12)中的Thr590的位置处。在一个实施方案中，在功能上等同于SEQ ID NO:8或12中的Thr590的位置处的取代突变是对非极性或疏水性氨基酸(例如Ile)的突变。
在其他实施方案中，在另一个实施方案中，本文所述的经改变的聚合酶还可以包括选自在功能上等同于参考聚合酶(诸如SEQ ID NO:12)中的Ala281、Phe283、Thr349、Trp397或Gly633的位置的一个或多个额外的取代突变。
在一个实施方案中，经改变的聚合酶包括在功能上等同于参考聚合酶(诸如SEQID NO:12)中的Ala281的位置处的取代突变。在一个实施方案中，在功能上等同于Ala281的位置处的取代突变是对非极性、疏水性或不带电荷的氨基酸(例如Gly或Phe)的突变。
在一个实施方案中，经改变的聚合酶包括在功能上等同于参考聚合酶(诸如SEQID NO:12)中的Phe283的位置处的取代突变。在一个实施方案中，在功能上等同于Phe283的位置处的取代突变是对极性或不带电荷的氨基酸(例如Ser)的突变。
在一个实施方案中，经改变的聚合酶包括在功能上等同于参考聚合酶(诸如SEQID NO:12)中的Trp397的位置处的取代突变。在一个实施方案中，在功能上等同于Trp397的位置处的取代突变是对极性或不带电荷的氨基酸(例如Cys)的突变。在一个实施方案中，在功能上等同于Trp397的位置处的取代突变是对非极性或疏水性氨基酸(例如Phe)的突变。
在一个实施方案中，经改变的聚合酶包括在功能上等同于参考聚合酶(诸如SEQID NO:12)中的Gly633的位置处的取代突变。在一个实施方案中，在功能上等同于Gly 633的位置处的取代突变是对极性或不带电荷的氨基酸(例如Thr)的突变。
在一个实施方案中，本公开的经改变的聚合酶包括在功能上等同于参考聚合酶诸如SEQ ID NO:12中的Ala281、Phe283、Trp397或Gly633的位置处的至少一个、至少两个、至少三个、或至少四个、或至少五个取代突变。
在其他实施方案中，本文所述的经改变的聚合酶还可以包括选自在功能上等同于参考聚合酶(诸如SEQ ID NO:8或12)中的Tyr291、Gly427和Asp540的位置的至少一个、至少两个或至少三个额外的取代突变。
在一个实施方案中，经改变的聚合酶包括在功能上等同于参考聚合酶(诸如SEQID NO:8或12)中的Tyr291的位置处的取代突变。在一个实施方案中，在功能上等同于Tyr291的位置处的取代突变是对极性或不带电荷的氨基酸(例如Cys)的突变。
在一个实施方案中，经改变的聚合酶包括在功能上等同于参考聚合酶(诸如SEQID NO:8或12)中的Gly427的位置处的取代突变。在一个实施方案中，在功能上等同于Gly427的位置处的取代突变是对极性氨基酸(例如Glu)的突变。
在一个实施方案中，经改变的聚合酶包括在功能上等同于参考聚合酶(诸如SEQID NO:8或12)中的Asp540的位置处的取代突变。在一个实施方案中，在功能上等同于Asp540的位置处的取代突变是对极性氨基酸(例如Glu)的突变。
经修饰的核苷酸
本文所述的经改变的聚合酶优先掺入经修饰的核苷酸而不是缺乏3'封端的降解的核苷酸，并且因此具有以比缺乏封端基团的降解的核苷酸更快的速率掺入具有封端基团的核苷酸的活性。在一个实施方案中，与降解的核苷酸相比，掺入经修饰的核苷酸的选择性为至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍或至少10倍。在一个实施方案中，与降解的核苷酸相比，掺入经修饰的核苷酸的速率增加至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍或至少10倍。核苷酸在3'糖羟基处被修饰并且包括在3'糖羟基处的修饰，使得封端基团在大小上大于天然存在的3'羟基。封端基团是本领域已知的，并且通常在脱氧核糖的3'-碳原子处连接到核苷酸上(美国专利申请公开号2016/0002721)。封端基团的示例包括但不限于3'-修饰的2-脱氧核糖核苷5'-三磷酸酯(3'-修饰的dNTP)(Metzker等人，1994,Nucleic Acids Research,22(20):4259-4267)、烯丙基保护基团(WO 2002/029003)、形成与核苷酸的3'-碳原子共价连接的结构-O-C(R)2N3的可除去的3'-羟基保护基团(美国专利申请公开号2016/0002721)、热稳定封端基团(WO 2014/139596)和缩醛或硫代氨基甲酸酯3'-OH封端基团，诸如烯丙氧基甲基封端基团(WO 2020/136170)。封端基团的示例还描述于美国专利第7,427,673号和第7,057,026号以及国际申请公开号WO 2014/139596中。在一个实施方案中，3'-OH封端基团是单氟甲基取代的叠氮基甲基保护基、C-酰胺基取代的叠氮基甲基保护基团、或二氟甲基取代的叠氮基甲基保护基团(美国专利申请公开号2016/0002721和国际申请公开号WO 2004/018497)。
通过本文所述的经改变的聚合酶鉴定的经修饰的多核苷酸还可以包括染料，诸如荧光团，其特异性地鉴定所掺入的碱基。在一个实施方案中，荧光团可通过可切割接头连接到核苷酸碱基。在测序反应的循环期间，所掺入的碱基被鉴定，然后接头可被切割，从而允许荧光团被除去并为下一个碱基的连接和鉴定做好准备。切割后会在每个检测到的核碱基上留下一个剩余的“疤痕”或“悬垂臂”部分。接头的示例包括但不限于国际申请公开号WO2004/018493和WO 2019/012080以及美国专利第10,526,648号。
突变聚合酶
在本公开中任选地使用各种类型的诱变，以例如根据本文所讨论的经改变的聚合酶或使用随机或半随机突变方法对聚合酶进行修饰，以例如产生变体。通常，可以使用任何可用的诱变程序来制备经改变的聚合酶。此类诱变程序任选地包括针对一种或多种所关注的活性(例如，当使用环境储存的经修饰的核苷酸时减少的预定相)选择突变核酸和多肽。可以使用的程序包括但不限于：位点定向点诱变、随机点诱变、体外或体内同源重组(DNA改组和组合重叠PCR)、使用含尿嘧啶的模板的诱变、寡核苷酸定点诱变、硫代磷酸酯修饰的DNA诱变、使用缺口双链体DNA的诱变、点错配修复、使用修复缺陷型宿主株的诱变、限制性选择和限制性纯化、缺失诱变、全基因合成诱变、简并PCR、双链断裂修复以及许多其他技术人员已知的程序。用于突变的起始聚合酶可以是本文提到的那些聚合酶中的任何一种，包括可用的聚合酶突变体，诸如在美国专利第8,460,910号和美国专利第8,623,628号中鉴定的那些。
任选地，诱变可以由来自天然存在的聚合酶分子的已知信息或已知经改变的聚合酶(例如，使用现存的突变聚合酶)的已知信息指导，这些已知信息例如为上文所讨论的序列、序列比较、物理性质、晶体结构等。然而，在另一类实施方案中，修饰可以基本上是随机的(例如，如在经典或“家族”DNA改组中，参见例如，Crameri等人(1998),Nature 391:288-291；或通过易错诱变，参见例如，McCullum等人，(2010),Methods Mol Biol.,634:103-109)。
有关突变格式的额外的信息可在以下文献中找到：Sambrook等人，MolecularCloning-A Laboratory Manual(第3版)，第1-3卷，Cold Spring Harbor Laboratory,ColdSpring Harbor,N.Y.,2000("Sambrook")；Current Protocols in Molecular Biology,F.M.Ausubel等人，编辑，Current Protocols,a joint venture between GreenePublishing Associates,Inc.and John Wiley&Sons,Inc.,(补充至2011年)("Ausubel"))以及PCR Protocols A Guide to Methods and Applications(Innis等人编辑)AcademicPress Inc.San Diego,Calif.(1990)("Innis")。以下所引用的出版物和参考文献提供了有关突变格式的额外细节：Arnold,Protein engineering for unusual environments,Current Opinion in Biotechnology 4:450-455(1993)；Bass等人，Mutant Trprepressors with new DNA-binding specificities,Science 242:240-245(1988)；Bordo和Argos(1991)Suggestions for"Safe"Residue Substitutions in Site-directedMutagenesis217:721-729；Botstein和Shortle,Strategies and applications of invitro mutagenesis,Science 229:1193-1201(1985)；Carter等人，Improvedoligonucleotide site-directed mutagenesis using M13 vectors,Nucl.Acids Res，13:4431-4443(1985)；Carter,Site-directed mutagenesis,Biochem.J.237:1-7(1986)；Carter,Improved oligonucleotide-directed mutagenesis using M13 vectors,Methods in Enzymol.154:382-403(1987)；Dale等人，Oligonucleotide-directed randommutagenesis using the phosphorothioate method,Methods Mol.Biol.57:369-374(1996)；Eghtedarzadeh和Henikoff,Use of oligonucleotides to generate largedeletions,Nucl.Acids Res，14:5115(1986)；Fritz等人，Oligonucleotide-directedconstruction of mutations:a gapped duplex DNA procedure without enzymaticreactions in vitro,Nucl.Acids Res，16:6987-6999(1988)；Grundstrom等人，Oligonucleotide-directed mutagenesis by microscale'shot-gun'gene synthesis,Nucl.Acids Res，13:3305-3316(1985)；Hayes(2002)Combining Computational andExperimental Screening for rapid Optimization of Protein Properties PNAS 99(25)15926-15931；Kunkel,The efficiency of oligonucleotide directedmutagenesis,in Nucleic Acids&Molecular Biology(Eckstein,F.和Lilley,D.M.J.编辑，Springer Verlag,Berlin))(1987)；Kunkel,Rapid and efficient site-specificmutagenesis without phenotypic selection,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:488-492(1985)；Kunkel等人，Rapid and efficient site-specific mutagenesis withoutphenotypic selection,Methods in Enzymol.154,367-382(1987)；Kramer等人，Thegapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction,Nucl.Acids Res，12:9441-9456(1984)；Kramer和Fritz Oligonucleotide-directedconstruction of mutations via gapped duplex DNA,Methods in Enzymol.154:350-367(1987)；Kramer等人，Point Mismatch Repair,Cell 38:879-887(1984)；Kramer等人，Improved enzymatic in vitro reactions in the gapped duplex DNA approach tooligonucleotide-directed construction of mutations,Nucl.Acids Res，16:7207(1988)；Ling等人，Approaches to DNA mutagenesis:an overview,Anal Biochem.254(2):157-178(1997)；Lorimer和Pastan Nucleic Acids Res.23,3067-8(1995)；Mandecki,Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids ofEscherichia coli:a method for site-specific mutagenesis,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,83:7177-7181(1986)；Nakamaye和Eckstein,Inhibition ofrestriction endonuclease Nci I cleavage by phosphorothioate groups and itsapplication to oligonucleotide-directed mutagenesis,Nucl.Acids Res，14:9679-9698(1986)；Nambiar等人，Total synthesis and cloning of a gene coding for theribonuclease S protein,Science 223:1299-1301(1984)；Sakamar和Khorana,Totalsynthesis and expression of a gene for the a-subunit of bovine rod outersegment guanine nucleotide-binding protein(transducin),Nucl.Acids Res，14:6361-6372(1988)；Sayers等人，Y-T Exonucleases in phosphorothioate-basedoligonucleotide-directed mutagenesis,Nucl.Acids Res，16:791-802(1988)；Sayers等人，Strand specific cleavage of phosphorothioate-containing DNA by reactionwith restriction endonucleases in the presence of ethidium bromide,(1988)Nucl.Acids Res，16:803-814；Sieber等人，Nature Biotechnology,19:456-460(2001)；Smith,In vitro mutagenesis,Ann.Rev.Genet.19:423-462(1985)；Methods inEnzymol.100:468-500(1983)；Methods in Enzymol.154:329-350(1987)；Stemmer,Nature370,389-91(1994)；Taylor等人，The use of phosphorothioate-modified DNA inrestriction enzyme reactions to prepare nicked DNA,Nucl.Acids Res，13:8749-8764(1985)；Taylor等人，The rapid generation of oligonucleotide-directedmutations at high frequency using phosphorothioate-modified DNA,Nucl.AcidsRes，13:8765-8787(1985)；Wells等人，Importance of hydrogen-bond formation instabilizing the transition state of subtilisin,Phil.Trans.R.Soc.Lond.A 317:415-423(1986)；Wells等人，Cassette mutagenesis:an efficient method forgeneration of multiple mutations at defined sites,Gene 34:315-323(1985)；Zoller和Smith,Oligonucleotide-directed mutagenesis using M 13-derivedvectors:an efficient and general procedure for the production of pointmutations in any DNA fragment,Nucleic Acids Res.10:6487-6500(1982)；Zoller和Smith,Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13vectors,Methods in Enzymol.100:468-500(1983)；Zoller和Smith,Oligonucleotide-directed mutagenesis:a simple method using two oligonucleotide primers and asingle-stranded DNA template,Methods in Enzymol.154:329-350(1987)；Clackson等人(1991)"Making antibody fragments using phage display libraries"Nature352:624-628；Gibbs等人(2001)"Degenerate oligonucleotide gene shuffling(DOGS):amethod for enhancing the frequency of recombination with family shuffling"Gene 271:13-20；以及Hiraga和Arnold(2003)"General method for sequence-independent site-directed chimeragenesis:J.Mol.Biol.330:287-296。有关上述许多方法的额外细节可以在Methods in Enzymology第154卷中找到，该文献还描述了用于各种诱变方法的故障排除问题的有用对照。
制备和分离重组聚合酶
通常，编码如本文所提供的聚合酶的核酸可以通过克隆、重组、体外合成、体外扩增和/或其他可用方法来制备。多种重组方法可以用于表达编码如本文所提供的聚合酶的表达载体。用于制备重组核酸、表达和分离表达产物的方法是本领域熟知的并进行了描述。本文描述了许多示例性突变和突变组合以及用于设计期望突变的策略。在本文中以及例如在国际申请号WO 2007/076057和WO 2008/051530中发现了用于在聚合酶的活性位点中制造和选择突变的方法，包括用于修饰活性位点中或附近的空间特征以允许核苷酸类似物的改善的接近。
有关突变、重组和体外核酸操作方法(包括克隆、表达、PCR等)的额外的有用参考文献包括Berger和Kimmel,Guide to Molecular Cloning Techniques,Methods inEnzymology第152卷Academic Press,Inc.,San Diego,Calif.(Berger)；Kaufman等人(2003)Handbook of Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine第二版Ceske(编辑)CRC Press(Kaufman)；The Nucleic Acid Protocols Handbook RalphRapley(编辑)(2000)Cold Spring Harbor,Humana Press Inc(Rapley)；Chen等人(编辑)PCR Cloning Protocols，第二版(Methods in Molecular Biology，第192卷)HumanaPress；以及Viljoen等人(2005)Molecular Diagnostic PCR Handbook Springer,ISBN1402034032。
此外，市面上有大量试剂盒可用于从细胞中纯化质粒或其他相关核酸(参见，例如，Easy PrepTM和FlexiPrepTM，均来自Pharmacia Biotech；StrataCleanTM，来自Stratagene；以及QIAprepTM，来自Qiagen)。任何分离和/或纯化的核酸可以被进一步操纵以产生其他核酸，被掺入相关载体中以转化细胞进行表达等。典型的克隆载体含有转录和翻译终止子、转录和翻译起始序列以及可用于调节特定靶核酸的表达的启动子。载体任选地包含通用表达盒，这些通用表达盒含有至少一个独立终止子序列、允许在真核生物或原核生物或两者中的盒复制的序列(例如，穿梭载体)以及用于原核体系和真核体系二者的选择标志物。载体适用于在原核生物、真核生物或两者中复制和整合。
其他有用的参考文献，例如用于细胞分离和培养(例如，用于随后的核酸分离)，包括Freshney(1994)Culture of Animal Cells,a Manual of Basic Technique，第三版，Wiley-Liss,New York及其中引用的参考文献；Payne等人(1992)Plant Cell and TissueCulture in Liquid Systems John Wiley&Sons,Inc.New York,N.Y.；Gamborg和Phillips(编辑)(1995)Plant Cell,Tissue and Organ Culture；Fundamental Methods SpringerLab Manual,Spring er-Verlag(Berlin Heidelberg New York)；以及Atlas和Parks(编辑)The Handbook of Microbiological Media(1993)CRC Press,Boca Raton,Fla。采用本领域已知的标准连接技术构建含有编码本文所述的经改变的聚合酶的核酸的载体。参见，例如，Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual.,Cold Spring HarborLaboratory Press(1989)或Ausubel,R.M.编辑Current Protocols in MolecularBiology(1994)。
本发明还包括编码本文所公开的经改变的聚合酶的核酸。特定的氨基酸可以由多个密码子编码，并且某些翻译体系(例如，原核细胞或真核细胞)常常表现出密码子偏倚，例如，不同的生物体常常优选编码相同氨基酸的若干同义密码子之一。因此，如本文所提供的核酸任选地是“经密码子优化的”，这意味着合成核酸以包括用于表达聚合酶的特定翻译系统优选的密码子。例如，当期望在细菌细胞(或甚至特定细菌菌株)中表达聚合酶时，可以合成核酸以包括在该细菌细胞的基因组中最常见的密码子以用于有效表达聚合酶。当期望在真核细胞中表达聚合酶时，可以采用类似的策略，例如，核酸可以包括该真核细胞优选的密码子。
多种蛋白质分离和检测方法是已知的，并且可以用于(例如，从表达本文所提供的重组聚合酶的细胞的重组培养物中)分离聚合酶。多种蛋白质分离和检测方法是本领域熟知的，并且包括例如在以下文献中阐述的那些：R.Scopes,Protein Purification,Springer-Verlag,N.Y.(1982)；Deutscher,Methods in Enzymology第182卷：Guide toProtein Purification,Academic Press,Inc.N.Y.(1990)；Sandana(1997)Bioseparationof Proteins,Academic Press,Inc.；Bollag等人(1996)Protein Methods，第2版Wiley-Liss,NY；Walker(1996)The Protein Protocols Handbook Humana Press,NJ,Harris和Angal(1990)Protein Purification Applications:A Practical Approach IRL Pressat Oxford,Oxford,England；Harris和Angal Protein Purification Methods:APractical Approach IRL Press at Oxford,Oxford,England；Scopes(1993)ProteinPurification:Principles and Practice第3版Springer Verlag,NY；Janson和Ryden(1998)Protein Purification:Principles,High Resolution Methods andApplications，第二版Wiley-VCH,NY；以及Walker(1998)Protein Protocols on CD-ROMHumana Press,NJ；及其中引用的参考文献。关于蛋白质纯化和检测方法的额外细节可以在Satinder Ahuja编辑，Handbook of Bioseparations,Academic Press(2000)中找到。
使用方法
本文所提供的经改变的聚合酶可用于测序程序，诸如边合成边测序(SBS)技术。简言之，SBS可通过使靶核酸与一种或多种核苷酸、DNA聚合酶等的混合物接触来启动。使用靶核酸作为模板延伸引物的那些特征将掺入可被检测到的标记核苷酸。标记的核苷酸通常包括可逆的终止部分(例如，3'封端)，一旦将核苷酸添加到引物，该部分就会终止进一步的引物延伸。例如，可以将具有可逆终止子部分的核苷酸类似物添加到引物，使得后续的延伸直到递送解封闭剂以去除该部分才发生。因此，可以将解封闭剂递送到流通池(在检测发生之前或之后)。洗涤可以在各个递送步骤之间进行。然后可以重复该循环n次以使引物延伸n个核苷酸，从而检测长度为n的序列。可以容易地适于与通过本公开的方法产生的阵列一起使用的示例性SBS程序、流体系统和检测平台在例如以下文献中描述：Bentley等人，Nature456:53-59(2008)；WO 04/018497；WO 91/06678；WO 07/123744；美国专利第7,057,026号、第7,329,492号、第7,211,414号、第7,315,019号、第7,405,281号和第8,343,746。可使用本文所述的经改变的聚合酶显著减少当使用环境储存的经修饰的核苷酸时通常观察到的预定相。
可以使用利用循环反应的其他测序程序，诸如焦磷酸测序。焦磷酸测序检测当特定核苷酸掺入新生核酸链中时无机焦磷酸盐(PPi)的释放(Ronaghi等人，AnalyticalBiochemistry 242(1),84-9(1996)；Ronaghi,Genome Res.11(1),3-11(2001)；Ronaghi等人，Science 281(5375)，363(1998)；美国专利第6,210,891号；第6,258,568号和第6,274,320号)。在焦磷酸测序中，所释放的PPi可通过ATP硫酸化酶转化成三磷酸腺苷(ATP)来检测，并且所得ATP可经由荧光素酶产生的光子来检测。因此，可经由发光检测系统来监测测序反应。用于基于荧光的检测系统的激发辐射源不是焦磷酸测序程序所必需的。可用于将焦磷酸测序应用于本公开的阵列的有用的流体系统、检测器和程序描述于例如国际申请WO2012/058096、美国专利申请公开号2005/0191698 A1以及美国专利第7,595,883号和第7,244,559号中。
一些实施方案可使用涉及DNA聚合酶活性的实时监测的方法。例如，可以通过带有荧光团的聚合酶与γ-磷酸标记的核苷酸之间的荧光共振能量转移(FRET)相互作用或者利用零模式波导来检测核苷酸掺入。用于基于FRET的测序的技术和试剂在例如以下文献中描述：Levene等人Science 299,682-686(2003)；Lundquist等人，Opt.Lett.33,1026-1028(2008)；Korlach等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 105,1176-1181(2008)。
一些SBS实施方案包括检测在核苷酸掺入延伸产物时释放的质子。例如，基于释放质子的检测的测序可使用可从Ion Torrent公司(Guilford，CT，Life Technologies子公司)商购获得的电检测器和相关技术或在美国专利第8,262,900号、第7,948,015号、第8,349,167号以及美国公开专利申请号2010/0137143Al中描述的测序方法和系统。
因此，本文提供了用于将核苷酸类似物掺入DNA中的方法，该方法包括允许以下组分相互作用：(i)根据上述实施方案中任一项所述的经改变的聚合酶；(ii)DNA模板；以及(iii)核苷酸溶液。在某些实施方案中，DNA模板包括成簇阵列。在某些实施方案中，核苷酸在3'糖羟基处被修饰，并且包括在3'糖羟基处的修饰，使得封端基团在大小上大于天然存在的3'羟基。
编码经改变的聚合酶的核酸
本公开还包括编码本文所述的经改变的聚合酶的核酸分子。对于任何给定的经改变的聚合酶，其是氨基酸序列(以及在一些实施方案中，编码该聚合酶的野生型核苷酸序列)已知的聚合酶的突变形式，根据分子生物学的基本原理获得编码该突变体的核苷酸序列是可能的。例如，假设编码9°N聚合酶(SEQ ID NO:1)的野生型核苷酸序列是已知的，则可以使用标准遗传密码来推导出编码具有一个或多个氨基酸取代的9°N的任何给定突变版本的核苷酸序列。类似地，对于突变形式的其他聚合酶，诸如例如聚合酶、Deep/>聚合酶、Pfu聚合酶、KOD聚合酶、Pab聚合酶等，可以容易地获得核苷酸序列。然后可使用本领域已知的标准分子生物学技术构建具有所需核苷酸序列的核酸分子。
根据本文所提供的实施方案，定义的核酸不仅包括相同的核酸，而且还包括任何微小的碱基变化，该变化特别包括在由于保守的氨基酸取代中的简并密码而产生同义密码子(指定相同氨基酸残基的不同密码子)的情况下的取代。术语“核酸序列”还包括与关于碱基变化而给出的任何单链序列的互补序列。
本文所述的核酸分子还可以有利地包括在合适的表达载体中以在合适的宿主中表达由其编码的聚合酶蛋白。将克隆的DNA掺入到合适的表达载体中以用于后续转化所述细胞和后续选择所转化的细胞是本领域技术人员熟知的，如Sambrook等人(1989),Molecular cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory中所提供的。
此类表达载体包括具有根据本文所提供的实施方案的核酸的载体，该核酸有效连接到能够实现所述DNA片段的表达的调节序列，诸如启动子区域。术语“可操作地连接”是指其中所描述的组分处于允许它们以它们预期方式起作用的关系中的并置。可以将此类载体转化为合适的宿主细胞以提供根据本文所提供的实施方案的蛋白质的表达。合适的宿主包括真核和原核细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是大肠杆菌(E.coli)。另选地，载体可用于体外系统中以表达聚合酶。
核酸分子可以编码成熟蛋白质或具有前序列的蛋白质，包括编码前蛋白上的前导序列的核酸，然后该前导序列被宿主细胞裂解以形成成熟蛋白质。载体可以是例如质粒、病毒或噬菌体载体，该质粒、病毒或噬菌体载体提供有复制起点，和任选地用于表达所述核苷酸的启动子以及任选地该启动子的调节物。载体可以含有一种或多种选择性标记，诸如例如抗生素抗性基因。
表达所需的调节元件包括用于结合RNA聚合酶并且引导适当水平的转录起始的启动子序列，以及核糖体结合的翻译起始序列。例如，细菌表达载体可以包括启动子，诸如lac启动子，以及用于翻译起始的Shine-dalarno序列和起始密码子AUG。类似地，真核表达载体可以包括用于RNA聚合酶II的异源或同源启动子，下游多聚腺苷酸化信号，起始密码子AUG和用于分离核糖体的终止密码子。此类载体可以商购获得或由本领域众所周知的方法所描述的序列组装。
由较高级真核生物转录编码聚合酶的DNA可以通过在载体中包括增强子序列来优化。增强子是作用在启动子上以增加转录水平的DNA的顺式作用元件。载体通常还包括除选择性标记之外的复制起点。
本公开还提供了一种用于进行核苷酸掺入反应的试剂盒。该试剂盒包括至少一种本文所述的经改变的聚合酶和在合适的包装材料中的核苷酸溶液，其量足以进行至少一个核苷酸掺入反应。任选地，还包括了使用经改变的聚合酶和核苷酸溶液所需的其他试剂，诸如缓冲液和溶液。通常还包括包装组件的使用说明。
在某些实施方案中，核苷酸溶液包括标记的核苷酸。在某些实施方案中，核苷酸是合成的核苷酸。在某些实施方案中，核苷酸是经修饰的核苷酸。在某些实施方案中，经修饰的核苷酸已在3'糖羟基处被修饰，使得取代基在大小上大于天然存在的3'羟基。在某些实施方案中，经修饰的核苷酸包括经修饰的核苷酸或核苷分子，该分子包括嘌呤或嘧啶碱基和核糖或脱氧核糖部分，该部分具有与其共价连接的可除去的3'-OH封端基团，使得3'碳原子连接有以下结构的基团：
-O-Z
其中Z是-C(R')2-O-R"、-C(R')2-N(R")2、-C(R')2-N(H)R"、-C(R')2-S-R"和-C(R')2-F中的任一者，
其中每个R"是可除去的保护基团或是可除去的保护基团的一部分；
每个R'独立地为氢原子、烷基、经取代的烷基、芳烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂环基、酰基、氰基、烷氧基、芳氧基、杂芳氧基或酰胺基，或通过连接基团连接的可检测标记；或者(R')2表示式＝C(R"')2的亚烷基，其中每个R"'能够相同或不同，并且选自包括氢原子、卤素原子和烷基的组；并且其中该分子能够反应以产生中间体，其中每个R"被交换为H或，其中Z是-C(R')2-F，F被交换为OH、SH或NH2，优选OH，该中间体在水性条件下解离以提供具有游离3'OH的分子；
条件是当Z是-C(R')2-S-R"时，两个R'基团都不是H。
在某些实施方案中，经修饰的核苷酸或核苷的R'是烷基或经取代的烷基。在某些实施方案中，经修饰的核苷酸或核苷的-Z具有式-C(R')2-N3。在某些实施方案中，Z是叠氮甲基。
在某些实施方案中，经修饰的核苷酸被荧光标记，以允许它们的检测。在某些实施方案中，经修饰的核苷酸包括具有通过可切割接头与可检测标记连接的碱基的核苷酸或核苷。在某些实施方案中，可检测标记包括荧光标记。
如本文所用，短语“包装材料”是指用于容纳试剂盒内容物的一种或多种物理结构。包装材料通过已知方法来构建，优选地用于提供无菌、无污染物的环境。包装材料具有指示这些组分可用于进行核苷酸掺入反应的标记。此外，包装材料含有指示如何使用试剂盒内的材料进行核苷酸掺入反应的说明。如本文所用，术语“包装”是指固体基质或材料诸如玻璃、塑料、纸材、箔等，该固体基质或材料能够在固定范围内容纳多肽。“使用说明”通常包括描述试剂浓度或至少一个测定方法参数的有形表达，诸如待混合的试剂和样品的相对量、试剂/样品混合物的维持时间段、温度、缓冲条件等。
本发明在权利要求书中限定。然而，下文提供了非限制性示例性方面的非穷举性列表。这些方面的特征中的任何一个或多个特征可与本文所述的另一示例、实施方案或方面的任何一个或多个特征组合。
示例性方面
方面1是一种重组DNA聚合酶，其包含与DNA聚合酶氨基酸序列SEQ ID NO:8或12至少80％相同的氨基酸序列，其中所述重组DNA聚合酶包含在功能上等同于所述DNA聚合酶氨基酸序列中选自Ala408、Ala409和Ile410的氨基酸的位置处的至少一个、至少两个或至少三个氨基酸取代突变。
方面2是根据方面1所述的重组DNA聚合酶，其中在功能上等同于Ala408的位置处的所述取代突变包括对极性或不带电荷的氨基酸的突变。
方面3是根据方面1至2中任一项所述的重组DNA聚合酶，其中在功能上等同于Ala408的位置处的所述取代突变包括对Tyr的突变。
方面4是根据方面1至3中任一项所述的重组DNA聚合酶，其中在功能上等同于Ala409的位置处的所述取代突变包括对非极性或疏水性氨基酸的突变。
方面5是根据方面1至4中任一项所述的重组DNA聚合酶，其中在功能上等同于Ala409的位置处的所述取代突变包括对Pro的突变。
方面6是根据方面1至5中任一项所述的重组DNA聚合酶，其中在功能上等同于Ile410的位置处的所述取代突变包括对非极性或疏水性氨基酸的突变。
方面7是根据方面1至6中任一项所述的重组DNA聚合酶，其中在功能上等同于Ile410的位置处的所述取代突变包括对Ala或Pro的突变。
方面8是一种重组DNA聚合酶，其包含与DNA聚合酶氨基酸序列SEQ ID NO:8或12至少80％相同的氨基酸序列，其中所述重组DNA聚合酶包含在功能上等同于所述DNA聚合酶氨基酸序列中选自Ala408、Ala409和Ile410的氨基酸的位置处的至少一个、至少两个或至少三个氨基酸取代突变，并且还包含在功能上等同于所述DNA聚合酶氨基酸序列中选自Ala129、Ala141、Ala143、Ser223、Val485、Gly497、Tyr247、Asp599和Gly633的氨基酸的位置处的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个或至少九个氨基酸取代突变。
方面9是根据方面8所述的重组DNA聚合酶，其中在功能上等同于Ala129的位置处的所述取代突变包括对除Met以外的任何氨基酸的突变。
方面10是根据方面8至9中任一项所述的重组DNA聚合酶，其中在功能上等同于Ala141的位置处的所述取代突变包括对非极性或疏水性氨基酸的突变。
方面11是根据方面8至10中任一项所述的重组DNA聚合酶，其中在功能上等同于Ala143的位置处的所述取代突变包括对非极性或疏水性氨基酸的突变。
方面12是根据方面8至11中任一项所述的重组DNA聚合酶，其中在功能上等同于Ser223的位置处的所述取代突变包括对极性或不带电荷的氨基酸的突变。
方面13是根据方面8至12中任一项所述的重组DNA聚合酶，其中在功能上等同于Val485的位置处的所述取代突变包括对非极性或疏水性氨基酸的突变。
方面14是根据方面8至13中任一项所述的重组DNA聚合酶，其中在功能上等同于Gly497的位置处的所述取代突变包括对非极性、疏水性或不带电荷的氨基酸的突变。
方面15是根据方面8至14中任一项所述的重组DNA聚合酶，其中在功能上等同于Tyr247的位置处的所述取代突变包括对极性或不带电荷的氨基酸的突变。
方面16是根据方面8至15中任一项所述的重组DNA聚合酶，其中在功能上等同于Asp599的位置处的所述取代突变包括对极性氨基酸的突变。
方面17是根据方面8至16中任一项所述的重组DNA聚合酶，其中在功能上等同于Gly633的位置处的所述取代突变包括对非极性、疏水性或不带电荷的氨基酸的突变。
方面18是根据方面1至17中任一项所述的重组DNA聚合酶，其中所述DNA聚合酶为SEQ ID NO:12，并且其中所述DNA聚合酶还包含在功能上等同于Lys349的位置处的氨基酸取代突变，其中所述取代突变为Ser或Asn。
方面19是根据方面1至18中任一项所述的重组DNA聚合酶，其中所述聚合酶还包含在功能上等同于所述DNA聚合酶氨基酸序列SEQ ID NO:8或12中选自Lys620和Val661的氨基酸的位置处的至少一个或至少两个氨基酸取代突变，其中Lys620处的所述取代突变为Arg，并且其中Val661处的所述取代突变为Asp。
方面20是根据方面1至19中任一项所述的重组DNA聚合酶，其中所述聚合酶还包含在功能上等同于所述DNA聚合酶氨基酸序列SEQ ID NO:12中选自Ala281、Phe283、Trp397和Gly633的氨基酸的位置处的至少一个、至少两个、至少三个或至少四个氨基酸取代突变，其中Ala281处的所述取代突变为Phe，其中Phe283处的所述取代突变为Ser，其中Trp397处的所述取代突变为Cys，并且其中Gly663处的所述取代突变为Thr。
方面21.一种重组聚合酶，其包含选自SEQ ID NO:9、10、11、13、14、15、16、17和18的氨基酸序列。
方面22是根据方面1至20中任一项所述的重组DNA聚合酶，其中所述重组聚合酶是B家族型DNA聚合酶。
方面23是根据方面22所述的重组DNA聚合酶，其中所述B家族型DNA聚合酶选自B家族古细菌DNA聚合酶、人DNA聚合酶-α、T4聚合酶、RB69聚合酶和phi29噬菌体DNA聚合酶。
方面24是根据方面22或23所述的重组DNA聚合酶，其中所述B家族古细菌DNA聚合酶来自选自嗜热球菌、火球菌、火棒菌、热网菌、气火菌和甲烷球菌的属。
方面25是根据方面1至24中任一项所述的重组DNA聚合酶，其中所述聚合酶包含与野生型聚合酶相比降低的外切核酸酶活性。
方面26是一种核酸分子，其编码如方面1至25中任一项所定义的重组DNA聚合酶。
方面27是一种表达载体，其包含根据方面26所述的核酸分子。
方面28是一种宿主细胞，其包含根据方面27所述的载体。
方面29是一种用于将经修饰的核苷酸掺入DNA中的方法，其包括允许以下组分相互作用：(i)根据方面1至25中任一项所述的重组DNA聚合酶；(ii)DNA模板；以及(iii)核苷酸溶液。
方面30是根据方面29所述的方法，其中所述DNA模板包含成簇阵列。
方面31是一种用于进行核苷酸掺入反应的试剂盒，其包含：如方面1至25中任一项所定义的重组DNA聚合酶和包含经修饰的核苷酸的溶液。
方面32是根据方面31所述的试剂盒，其中所述经修饰的核苷酸包含可检测标记。
方面33是根据方面31或32所述的试剂盒，其中所述经修饰的核苷酸已在3'糖羟基处被修饰，使得取代基在大小上大于天然存在的3'羟基。
方面34是根据方面31至33中任一项所述的试剂盒，其中所述经修饰的核苷酸包含经修饰的核苷酸或核苷分子，所述经修饰的核苷酸或核苷分子包含嘌呤或嘧啶碱基和核糖或脱氧核糖部分，所述核糖或脱氧核糖部分具有与其共价连接的可除去的3'-OH封端基团，使得3'碳原子连接有以下结构的基团：
-O-Z
其中Z是-C(R')2-O-R"、-C(R')2-N(R")2、-C(R')2-N(H)R"、-C(R')2-S-R"和-C(R')2-F中的任一者，其中每个R"是可除去的保护基团或是可除去的保护基团的一部分；
每个R'独立地为氢原子、烷基、经取代的烷基、芳烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂环基、酰基、氰基、烷氧基、芳氧基、杂芳氧基或酰胺基，或通过连接基团连接的可检测标记；或者(R')2表示式＝C(R”')2的亚烷基，其中每个R”'相同或不同，并且选自包括氢原子、卤素原子和烷基的组；并且其中所述分子能够反应以产生中间体，其中每个R"被交换为H或，其中Z是-C(R')2-F，F被交换为OH、SH或NH2，优选OH，所述中间体在水性条件下解离以提供具有游离3'OH的分子；
条件是当Z是-C(R')2-S-R"时，两个R'基团都不是H。
方面35是根据方面34所述的试剂盒，其中所述经修饰的核苷酸或核苷的R'为烷基或经取代的烷基。
方面36是根据方面31至35中任一项所述的试剂盒，其中所述经修饰的核苷酸或核苷的Z具有式-C(R')2-N3。
方面37是根据方面31至36中任一项所述的试剂盒，其中Z是叠氮甲基。
方面38是根据方面31至37中任一项所述的试剂盒，其中所述经修饰的核苷酸包含具有通过可切割接头与可检测标记连接的碱基的核苷酸或核苷。
方面39是根据方面31至38中任一项所述的试剂盒，其中所述可检测标记包含荧光标记。
方面40是根据方面31至39中任一项所述的试剂盒，其还包含一种或多种DNA模板分子和/或引物。
实施例
通过以下实施例说明本公开。应当理解，应当根据如本文所述的本公开的范围和实质广义地解释特定实施例、材料、量和程序。
实施例1
一般测定方法和条件
除非另有说明，否则本节描述了本文所述实施例中使用的一般测定条件。
A.聚合酶的克隆和表达
用于制备重组核酸、表达和分离表达产物的方法是本领域已知的并进行了描述。使用标准定点诱变方法在编码9°N聚合酶(SEQ ID NO:1)的编码区上进行诱变。对于所进行的每个突变，通过确定克隆的DNA的序列来确认经改变的编码区的正确序列。
将His-标记的突变聚合酶编码区亚克隆到pET11a载体中，并转化到Acella表达细胞(Edge Bio,San Jose,CA)中。将来自单个挑选的菌落的冷冻原种用于在2.8L烧瓶中接种过夜表达培养物。将培养物在37℃下生长直至OD600为约0.9-1.0，然后用0.2mM IPTG诱导蛋白质表达，随后再生长4小时。将培养物以5,000xg离心20分钟。将细胞沉淀物储存在-20℃下直至纯化。
将沉淀物冻融，并根据制造商的建议在存在Ready-Lyse和Omnicleave试剂(Epicentre.Madison,WI)的情况下用5x w/v裂解缓冲液(50mM Tris-HCl pH7.5、1mMEDTA、0.1％v/v BME和5％甘油)裂解。将最终NaCl浓度升至500mM，并将裂解物在冰上温育5分钟。离心后，将上清液在80℃下温育约70分钟。所有进一步纯化在4℃下进行。将上清液冷冻30分钟，然后离心并用3mL HisPur Ni-NTA Spin柱(Thermo-Fisher)纯化。将柱用HIS缓冲液A(50mM Tris-HCl pH 7.5、5％甘油、500mM NaCl和10mM咪唑)预平衡。将柱用3×3mLHIS缓冲液B(50mM Tris-HCl pH 7.5、5％甘油、500mM NaCl和500mM咪唑)洗脱。将洗脱后的级分合并，并用改良的SP缓冲液A(50mM Tris-HCl pH 7.5、ImM EDTA、5％甘油)稀释以匹配SP缓冲液A(50mM Tris-HCl pH 7.5、150mM NaCl、1mM EDTA、5％甘油)的电导率，并加载到5mL SP Sepharose柱(GE)上。使用从150至1000mM NaCl的100mL梯度洗脱该柱。合并峰级分，使用15mL 10kDa离心过滤柱(Millipore)将缓冲液交换到2x储存缓冲液(20mM Tris-HCl pH 7.5、600mM KC1、0.2mM EDTA)中，然后用100％甘油稀释2x，以产生最终的1x储存缓冲液(10mM Tris-HCl pH 7.5、300mM KCl、0.1mM EDTA、50％甘油)。然后将样品储存在-20℃下。
B.错误率和定相分析
使用测序实验比较错误率、定相值和预定相值。除非另有说明，否则根据制造商的说明书在MiniSeqTMsystem系统(Illumina,Inc.,San Diego,Calif)上进行实验。例如，对于每种聚合酶，制备单独的掺入混合物(IMX)并用于短运行(读段1中的61个循环)或长运行(读段1中的151个循环运行和读段2中的151个循环运行)。在61个循环运行的情况下，前25个循环使用标准筒调配物来建立基线，并且剩余36个循环使用含有经改变的聚合酶和不同dNTP:ffN比率的定制调配物。使用标准MiniSeq中通量输出试剂筒调配物，以90μg/mL的浓度用待测聚合酶替代标准聚合酶。IMX的温育时间和流动池上IMX中dNTP:ffN的比率如本文实施例中所述变化。为了评估预定相性能改善，将不同量的脱氧核苷酸(dNTP)(NewEngland Biotech)滴定到标准MiniSeq中通量输出试剂筒调配物中，以产生具有0％至10％dNTP:ffN比率的定制调配物，同时使用经取代的聚合酶来挑战聚合酶。
所使用的DNA文库按照标准TruSeqTMNano方案(Illumina,Inc.)使用大肠杆菌基因组DNA制备的，具有350bp的目标插入片段大小；将PhiX DNA(Illumina,Inc.)以约1:10的摩尔比添加到所得文库中。使用Illumina RTA软件评估两个基因组的错误率以及预定相和定相水平。
实施例2
具有改善的预定相指标的所选经改变的聚合酶的测序性能
鉴定了几种经改变的聚合酶，与在具有标准掺入混合物的较长运行(92秒)中使用的对照聚合酶(Pol A)相比，其在较长掺入时间(例如92秒)下在短运行中具有低的预定相水平。用于评价经改变的聚合酶的质量指标是大肠杆菌和噬菌体PhiX测序对照的预定相率(“预定相权重”)、定相率(“定相权重”)和累积错误率(“错误率”)。结果总结在图2中，并且包括具有改善的预定相的三种聚合酶(Pol B、Pol C和Pol D)的示例，其中两种酶除了较低的预定相之外，还表现出良好的定相和错误率(Pol B和Pol C)。
实施例3
在dNTP存在下Pol B的优异测序性能
为了比较对照聚合酶对一种经改变的变体的dNTP敏感性，在含有0、2.5％、5％和10％dNTP:ffN的掺入混合物中测试Pol A和Pol B聚合酶。图3示出了一个示例，其中当掺入混合液中的dNTP为0％时，聚合酶表现出相同的性能，但当dNTP的百分比增加时，Pol B性能的下降速度比Pol A慢得多。与带有封端基团的核苷酸相比，Pol B具有改善的对识别和掺入带有游离3'OH的核苷酸的抗性。
实施例4
在2x151运行中改善的预定相PolB
在传统的较长运行中比较Pol B和Pol A，以测试该突变体上的突变是否可证明有利于改善的预定相。当使用读段1的150个循环和读段2的150个循环的较长运行时，Pol B可以通过两个读段保持较低的预定相(数据未示出)。
本文引用的所有专利、专利申请和出版物的完整公开内容，以及以电子方式获得的材料(包括，例如，在例如GenBank和RefSeq中的核苷酸序列提交，在例如SwissProt、PIR、PRF、PDB中的氨基酸序列提交，以及来自GenBank和RefSeq中的注释编码区的翻译)全文以引用方式并入。出版物中引用的补充材料(诸如补充表、补充图、补充材料和方法和/或补充实验数据)同样全文以引用方式并入。在本申请的公开内容与以引用方式并入本文的任何文献的公开内容之间存在任何不一致性的情况下，应以本申请的公开内容为准。上述详细描述和实施例仅为了清楚地理解本发明而给出。不应将其理解为不必要的限制。本公开不限于所示和所述的确切细节，因为对本领域技术人员显而易见的变型将包括在由权利要求所限定的公开内容内。
除非另外指明，否则本说明书和权利要求书中所用的表示组分的量、分子量等的所有数字在所有情况下均应理解为由术语“约”修饰。因此，除非有相反的说明，否则本说明书和权利要求书中列出的数值参数均为近似值，这些近似值可根据本公开寻求获得的期望性质而变化。至少，并非试图将等同原则限制在权利要求的范围之内，每个数值参数应至少根据所报告的有效数位的数目并通过应用惯常的四舍五入法来解释。
尽管阐述本公开的广义范围的数值范围和参数是近似值，但是在具体实施例中所列出的数值被尽可能精确地报告。然而，所有数值固有地包含一个范围，该范围必然是由存在于其相应测试测量中的标准偏差引起。
除非另外指明，否则所有标题都是为了方便读者，而不应用于限制该标题后面的文本的含义。
SEQUENCE LISTING
<110> 因美纳有限公司
因美纳剑桥有限公司
因美纳新加坡私人有限公司
<120> 聚合酶、组合物和使用方法
<130> P231110146WP
<160> 24
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 775
<212> PRT
<213> 嗜热球菌属（Thermococcus sp.）
<400> 1
Met Ile Leu Asp Thr Asp Tyr Ile Thr Glu Asn Gly Lys Pro Val Ile
1 5 10 15
Arg Val Phe Lys Lys Glu Asn Gly Glu Phe Lys Ile Glu Tyr Asp Arg
20 25 30
Thr Phe Glu Pro Tyr Phe Tyr Ala Leu Leu Lys Asp Asp Ser Ala Ile
35 40 45
Glu Asp Val Lys Lys Val Thr Ala Lys Arg His Gly Thr Val Val Lys
50 55 60
Val Lys Arg Ala Glu Lys Val Gln Lys Lys Phe Leu Gly Arg Pro Ile
65 70 75 80
Glu Val Trp Lys Leu Tyr Phe Asn His Pro Gln Asp Val Pro Ala Ile
85 90 95
Arg Asp Arg Ile Arg Ala His Pro Ala Val Val Asp Ile Tyr Glu Tyr
100 105 110
Asp Ile Pro Phe Ala Lys Arg Tyr Leu Ile Asp Lys Gly Leu Ile Pro
115 120 125
Met Glu Gly Asp Glu Glu Leu Thr Met Leu Ala Phe Asp Ile Glu Thr
130 135 140
Leu Tyr His Glu Gly Glu Glu Phe Gly Thr Gly Pro Ile Leu Met Ile
145 150 155 160
Ser Tyr Ala Asp Gly Ser Glu Ala Arg Val Ile Thr Trp Lys Lys Ile
165 170 175
Asp Leu Pro Tyr Val Asp Val Val Ser Thr Glu Lys Glu Met Ile Lys
180 185 190
Arg Phe Leu Arg Val Val Arg Glu Lys Asp Pro Asp Val Leu Ile Thr
195 200 205
Tyr Asn Gly Asp Asn Phe Asp Phe Ala Tyr Leu Lys Lys Arg Cys Glu
210 215 220
Glu Leu Gly Ile Lys Phe Thr Leu Gly Arg Asp Gly Ser Glu Pro Lys
225 230 235 240
Ile Gln Arg Met Gly Asp Arg Phe Ala Val Glu Val Lys Gly Arg Ile
245 250 255
His Phe Asp Leu Tyr Pro Val Ile Arg Arg Thr Ile Asn Leu Pro Thr
260 265 270
Tyr Thr Leu Glu Ala Val Tyr Glu Ala Val Phe Gly Lys Pro Lys Glu
275 280 285
Lys Val Tyr Ala Glu Glu Ile Ala Gln Ala Trp Glu Ser Gly Glu Gly
290 295 300
Leu Glu Arg Val Ala Arg Tyr Ser Met Glu Asp Ala Lys Val Thr Tyr
305 310 315 320
Glu Leu Gly Arg Glu Phe Phe Pro Met Glu Ala Gln Leu Ser Arg Leu
325 330 335
Ile Gly Gln Ser Leu Trp Asp Val Ser Arg Ser Ser Thr Gly Asn Leu
340 345 350
Val Glu Trp Phe Leu Leu Arg Lys Ala Tyr Lys Arg Asn Glu Leu Ala
355 360 365
Pro Asn Lys Pro Asp Glu Arg Glu Leu Ala Arg Arg Arg Gly Gly Tyr
370 375 380
Ala Gly Gly Tyr Val Lys Glu Pro Glu Arg Gly Leu Trp Asp Asn Ile
385 390 395 400
Val Tyr Leu Asp Phe Arg Ser Leu Tyr Pro Ser Ile Ile Ile Thr His
405 410 415
Asn Val Ser Pro Asp Thr Leu Asn Arg Glu Gly Cys Lys Glu Tyr Asp
420 425 430
Val Ala Pro Glu Val Gly His Lys Phe Cys Lys Asp Phe Pro Gly Phe
435 440 445
Ile Pro Ser Leu Leu Gly Asp Leu Leu Glu Glu Arg Gln Lys Ile Lys
450 455 460
Arg Lys Met Lys Ala Thr Val Asp Pro Leu Glu Lys Lys Leu Leu Asp
465 470 475 480
Tyr Arg Gln Arg Ala Ile Lys Ile Leu Ala Asn Ser Phe Tyr Gly Tyr
485 490 495
Tyr Gly Tyr Ala Lys Ala Arg Trp Tyr Cys Lys Glu Cys Ala Glu Ser
500 505 510
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515 520 525
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530 535 540
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545 550 555 560
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565 570 575
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580 585 590
Lys Tyr Ala Val Ile Asp Glu Glu Gly Lys Ile Thr Thr Arg Gly Leu
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610 615 620
Arg Val Leu Glu Ala Ile Leu Lys His Gly Asp Val Glu Glu Ala Val
625 630 635 640
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645 650 655
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675 680 685
Arg Gly Val Lys Ile Arg Pro Gly Thr Val Ile Ser Tyr Ile Val Leu
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Lys Gly Ser Gly Arg Ile Gly Asp Arg Ala Ile Pro Ala Asp Glu Phe
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<210> 2
<211> 774
<212> PRT
<213> 人工的（artificial）
<220>
<223> 经改变的聚合酶
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<210> 3
<211> 777
<212> PRT
<213> 人工的（artificial）
<220>
<223> 经改变的聚合酶
<400> 3
Met Ile Leu Asp Ala Asp Tyr Ile Thr Glu Asp Gly Lys Pro Ile Ile
1 5 10 15
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<220>
<223> 经改变的聚合酶
<400> 13
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<223> 经改变的聚合酶
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<212> PRT
<213> 人工的（artificial）
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<223> 经改变的聚合酶
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<212> PRT
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<211> 775
<212> PRT
<213> 人工的（artificial）
<220>
<223> 经改变的聚合酶
<400> 17
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740 745 750
Glu Asp Leu Arg Tyr Gln Lys Thr Lys Gln Val Gly Leu Gly Ala Trp
755 760 765
Leu Lys Val Lys Gly Lys Lys
770 775
<210> 23
<211> 775
<212> PRT
<213> 人工的（artificial）
<220>
<223> 经改变的聚合酶
<400> 23
Met Ile Leu Asp Thr Asp Tyr Ile Thr Glu Asn Gly Lys Pro Val Ile
1 5 10 15
Arg Val Phe Lys Lys Glu Asn Gly Glu Phe Lys Ile Glu Tyr Asp Arg
20 25 30
Thr Phe Glu Pro Tyr Phe Tyr Ala Leu Leu Lys Asp Asp Ser Ala Ile
35 40 45
Glu Asp Val Lys Lys Val Thr Ala Lys Arg His Gly Thr Val Val Lys
50 55 60
Val Lys Arg Ala Glu Lys Val Gln Lys Lys Phe Leu Gly Arg Pro Ile
65 70 75 80
Glu Val Trp Lys Leu Tyr Phe Asn His Pro Gln Asp Val Pro Ala Ile
85 90 95
Arg Asp Arg Ile Arg Ala His Pro Ala Val Val Asp Ile Tyr Glu Tyr
100 105 110
Asp Ile Pro Phe Ala Lys Arg Tyr Leu Ile Asp Lys Gly Leu Ile Pro
115 120 125
Ala Glu Gly Asp Glu Glu Leu Thr Met Leu Ala Phe Ala Ile Ala Thr
130 135 140
Leu Tyr His Glu Gly Glu Glu Phe Gly Thr Gly Pro Ile Leu Met Ile
145 150 155 160
Ser Tyr Ala Asp Gly Ser Glu Ala Arg Val Ile Thr Trp Lys Lys Ile
165 170 175
Asp Leu Pro Tyr Val Asp Val Val Ser Thr Glu Lys Glu Met Ile Lys
180 185 190
Arg Phe Leu Arg Val Val Arg Glu Lys Asp Pro Asp Val Leu Ile Thr
195 200 205
Tyr Asn Gly Asp Asn Phe Asp Phe Ala Tyr Leu Lys Lys Arg Ser Glu
210 215 220
Glu Leu Gly Ile Lys Phe Thr Leu Gly Arg Asp Gly Ser Glu Pro Lys
225 230 235 240
Ile Gln Arg Met Gly Asp Tyr Phe Ala Val Glu Val Lys Gly Arg Ile
245 250 255
His Phe Asp Leu Tyr Pro Val Ile Arg Arg Thr Ile Asn Leu Pro Thr
260 265 270
Tyr Thr Leu Glu Ala Val Tyr Glu Ala Val Phe Gly Lys Pro Lys Glu
275 280 285
Lys Val Tyr Ala Glu Glu Ile Ala Gln Ala Trp Glu Ser Gly Glu Gly
290 295 300
Leu Glu Arg Val Ala Arg Tyr Ser Met Glu Asp Ala Lys Val Thr Tyr
305 310 315 320
Glu Leu Gly Arg Glu Phe Phe Pro Met Glu Ala Gln Leu Ser Arg Leu
325 330 335
Ile Gly Gln Ser Leu Trp Asp Val Ser Arg Ser Ser Lys Gly Asn Leu
340 345 350
Val Glu Trp Phe Leu Leu Arg Lys Ala Tyr Lys Arg Asn Glu Leu Ala
355 360 365
Pro Asn Lys Pro Asp Glu Arg Glu Leu Ala Arg Arg Arg Gly Gly Tyr
370 375 380
Ala Gly Gly Tyr Val Lys Glu Pro Glu Arg Gly Leu Trp Asp Asn Ile
385 390 395 400
Val Tyr Leu Asp Phe Arg Ser Tyr Pro Ile Ser Ile Ile Ile Thr His
405 410 415
Asn Val Ser Pro Asp Thr Leu Asn Arg Glu Gly Cys Lys Glu Tyr Asp
420 425 430
Val Ala Pro Glu Val Gly His Lys Phe Cys Lys Asp Phe Pro Gly Phe
435 440 445
Ile Pro Ser Leu Leu Gly Asp Leu Leu Glu Glu Arg Gln Lys Ile Lys
450 455 460
Arg Lys Met Lys Ala Thr Val Asp Pro Leu Glu Lys Lys Leu Leu Asp
465 470 475 480
Tyr Arg Gln Arg Val Ile Lys Ile Leu Ala Asn Ser Phe Tyr Gly Tyr
485 490 495
Gly Gly Tyr Ala Lys Ala Arg Trp Tyr Cys Lys Glu Cys Ala Glu Ser
500 505 510
Val Thr Ala Trp Gly Arg Glu Tyr Ile Glu Met Val Ile Arg Glu Leu
515 520 525
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530 535 540
His Ala Thr Ile Pro Gly Ala Asp Ala Glu Thr Val Lys Lys Lys Ala
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Lys Glu Phe Leu Lys Tyr Ile Asn Pro Lys Leu Pro Gly Leu Leu Glu
565 570 575
Leu Glu Tyr Glu Gly Phe Tyr Val Arg Gly Phe Phe Val Thr Lys Lys
580 585 590
Lys Tyr Ala Val Ile Asp Asp Glu Gly Lys Ile Thr Thr Arg Gly Leu
595 600 605
Glu Ile Val Arg Arg Asp Trp Ser Glu Ile Ala Lys Glu Thr Gln Ala
610 615 620
Arg Val Leu Glu Ala Ile Leu Lys Gly Gly Asp Val Glu Glu Ala Val
625 630 635 640
Arg Ile Val Lys Glu Val Thr Glu Lys Leu Ser Lys Tyr Glu Val Pro
645 650 655
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660 665 670
Tyr Lys Ala Thr Gly Pro His Val Ala Val Ala Lys Arg Leu Ala Ala
675 680 685
Arg Gly Val Lys Ile Arg Pro Gly Thr Val Ile Ser Tyr Ile Val Leu
690 695 700
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705 710 715 720
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725 730 735
Val Leu Pro Ala Val Glu Arg Ile Leu Lys Ala Phe Gly Tyr Arg Lys
740 745 750
Glu Asp Leu Arg Tyr Gln Lys Thr Lys Gln Val Gly Leu Gly Ala Trp
755 760 765
Leu Lys Val Lys Gly Lys Lys
770 775
<210> 24
<211> 775
<212> PRT
<213> 人工的（artificial）
<220>
<223> 经改变的聚合酶
<400> 24
Met Ile Leu Asp Thr Asp Tyr Ile Thr Glu Asn Gly Lys Pro Val Ile
1 5 10 15
Arg Val Phe Lys Lys Glu Asn Gly Glu Phe Lys Ile Glu Tyr Asp Arg
20 25 30
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35 40 45
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Ser Tyr Ala Asp Gly Ser Glu Ala Arg Val Ile Thr Trp Lys Lys Ile
165 170 175
Asp Leu Pro Tyr Val Asp Val Val Ser Thr Glu Lys Glu Met Ile Lys
180 185 190
Arg Phe Leu Arg Val Val Arg Glu Lys Asp Pro Asp Val Leu Ile Thr
195 200 205
Tyr Asn Gly Asp Asn Phe Asp Phe Ala Tyr Leu Lys Lys Arg Ser Glu
210 215 220
Glu Leu Gly Ile Lys Phe Thr Leu Gly Arg Asp Gly Ser Glu Pro Lys
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Ile Gln Arg Met Gly Asp Tyr Phe Ala Val Glu Val Lys Gly Arg Ile
245 250 255
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Tyr Thr Leu Glu Ala Val Tyr Glu Ala Val Phe Gly Lys Pro Lys Glu
275 280 285
Lys Val Tyr Ala Glu Glu Ile Ala Gln Ala Trp Glu Ser Gly Glu Gly
290 295 300
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740 745 750
Glu Asp Leu Arg Tyr Gln Lys Thr Lys Gln Val Gly Leu Gly Ala Trp
755 760 765
Leu Lys Val Lys Gly Lys Lys
770 775
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.一种重组DNA聚合酶，其包含与DNA聚合酶氨基酸序列SEQ ID NO:8或12至少80％相同的氨基酸序列，其中所述重组DNA聚合酶包含在功能上等同于所述DNA聚合酶氨基酸序列中的氨基酸Ala408和Ala409的位置处的至少两个氨基酸取代突变，其中在功能上等同于Ala408的位置处的所述取代突变包括对极性或不带电荷的氨基酸的突变。
2.根据权利要求1所述的重组DNA聚合酶，其中在功能上等同于Ala408的位置处的所述取代突变包括对Tyr的突变。
3.根据权利要求1所述的重组DNA聚合酶，其中在功能上等同于Ala409的位置处的所述取代突变包括对非极性或疏水性氨基酸的突变。
4.根据权利要求3所述的重组DNA聚合酶，其中在功能上等同于Ala409的位置处的所述取代突变包括对Pro的突变。
5.根据权利要求1所述的重组DNA聚合酶，其中在功能上等同于Ile410的位置处的所述取代突变包括对非极性或疏水性氨基酸的突变。
6.根据权利要求5所述的重组DNA聚合酶，其中在功能上等同于Ile410的位置处的所述取代突变包括对Ala或Pro的突变。
7.一种重组DNA聚合酶，其包含与DNA聚合酶氨基酸序列SEQ ID NO:8或12至少80％相同的氨基酸序列，其中所述重组DNA聚合酶包含在功能上等同于所述DNA聚合酶氨基酸序列中的氨基酸Ala408和Ala409的位置处的至少两个氨基酸取代突变，其中在功能上等同于Ala408的位置处的所述取代突变包括对极性或不带电荷的氨基酸的突变，并且还包含在功能上等同于所述DNA聚合酶氨基酸序列中选自Ala129、Ala141、Ala143、Ser223、Val485、Gly497、Tyr247、Asp599和Gly633的氨基酸的位置处的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个或至少九个氨基酸取代突变。
8.根据权利要求7所述的重组DNA聚合酶，其中在功能上等同于Alal29的位置处的所述取代突变包括对除Met以外的任何氨基酸的突变。
9.根据权利要求7所述的重组DNA聚合酶，其中在功能上等同于Ala141的位置处的所述取代突变包括对非极性或疏水性氨基酸的突变。
10.根据权利要求7所述的重组DNA聚合酶，其中在功能上等同于Ala143的位置处的所述取代突变包括对非极性或疏水性氨基酸的突变。
11.根据权利要求7所述的重组DNA聚合酶，其中在功能上等同于Ser223的位置处的所述取代突变包括对极性或不带电荷的氨基酸的突变。
12.根据权利要求7所述的重组DNA聚合酶，其中在功能上等同于Val485的位置处的所述取代突变包括对非极性或疏水性氨基酸的突变。
13.根据权利要求7所述的重组DNA聚合酶，其中在功能上等同于Gly497的位置处的所述取代突变包括对非极性、疏水性或不带电荷的氨基酸的突变。
14.根据权利要求7所述的重组DNA聚合酶，其中在功能上等同于Tyr247的位置处的所述取代突变包括对极性或不带电荷的氨基酸的突变。
15.根据权利要求7所述的重组DNA聚合酶，其中在功能上等同于Asp599的位置处的所述取代突变包括对极性氨基酸的突变。
16.根据权利要求7所述的重组DNA聚合酶，其中在功能上等同于Gly633的位置处的所述取代突变包括对非极性、疏水性或不带电荷的氨基酸的突变。
17.根据权利要求1所述的重组DNA聚合酶，其中所述DNA聚合酶为SEQ ID NO:12，并且其中所述DNA聚合酶还包含在功能上等同于Lys349的位置处的氨基酸取代突变，其中所述取代突变为Ser或Asn。
18.根据权利要求1所述的重组DNA聚合酶，其中所述聚合酶还包含在功能上等同于所述DNA聚合酶氨基酸序列SEQ ID NO:8或12中选自Lys620和Val661的氨基酸的位置处的至少一个或至少两个氨基酸取代突变，其中Lys620处的所述取代突变为Arg，并且其中Val661处的所述取代突变为Asp。
19.根据权利要求1所述的重组DNA聚合酶，其中所述聚合酶还包含在功能上等同于所述DNA聚合酶氨基酸序列SEQ ID NO:12中选自Ala281、Phe283、Trp397和Gly633的氨基酸的位置处的至少一个、至少两个、至少三个或至少四个氨基酸取代突变，其中Ala281处的所述取代突变为Phe，其中Phe283处的所述取代突变为Ser，其中Trp397处的所述取代突变为Cys，并且其中Gly663处的所述取代突变为Thr。
20.一种重组聚合酶，其包含选自SEQ ID NO:9、10、11、13、14、15、16、17和18的氨基酸序列，其中在功能上等同于Ala408的位置处的取代突变包括对极性或不带电荷的氨基酸的突变，其中在功能上等同于Ala409的位置处的取代突变包括对非极性或疏水性氨基酸的突变，并且其中在功能上等同于Ile410的位置处的取代突变包括对非极性或疏水性氨基酸的突变。
21.根据权利要求1所述的重组DNA聚合酶，其中所述重组聚合酶是B家族型DNA聚合酶。
22.根据权利要求21所述的重组DNA聚合酶，其中所述B家族型DNA聚合酶选自B家族古细菌DNA聚合酶、人DNA聚合酶-α、T4聚合酶、RB69聚合酶和phi29噬菌体DNA聚合酶。
23.根据权利要求22所述的重组DNA聚合酶，其中所述B家族古细菌DNA聚合酶来自选自嗜热球菌、火球菌、火棒菌、热网菌、气火菌和甲烷球菌的属。
24.根据权利要求1所述的重组DNA聚合酶，其中所述聚合酶包含与野生型聚合酶相比降低的外切核酸酶活性。
25.一种核酸分子，其编码如权利要求1所定义的重组DNA聚合酶。
26.一种表达载体，其包含根据权利要求25所述的核酸分子。
27.一种宿主细胞，其包含根据权利要求26所述的载体。
28.一种用于将经修饰的核苷酸掺入DNA中的方法，其包括允许以下组分相互作用：(i)根据权利要求1所述的重组DNA聚合酶；(ii)DNA模板；以及(iii)核苷酸溶液。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述DNA模板包含成簇阵列。
30.一种用于进行核苷酸掺入反应的试剂盒，其包含：如权利要求1所定义的重组DNA聚合酶和包含经修饰的核苷酸的溶液。
31.根据权利要求30所述的试剂盒，其中所述经修饰的核苷酸包含可检测标记。
32.根据权利要求30所述的试剂盒，其中所述经修饰的核苷酸在3'糖羟基处被修饰以包含取代基，其中所述取代基在大小上大于天然存在的3'羟基。
33.根据权利要求32所述的试剂盒，其中所述经修饰的核苷酸包含经修饰的核苷酸或核苷分子，所述经修饰的核苷酸或核苷分子包含嘌呤或嘧啶碱基和核糖或脱氧核糖部分，所述核糖或脱氧核糖部分具有与其共价连接的可除去的3'-OH封端基团，使得3'碳原子连接有以下结构的基团：
-O-Z
其中Z是-C(R')2-0-R"、-C(R')2-N(R")2、-C(R')2-N(H)R"、-C(R')2-S-R"和-C(R')2-F中的任一者，其中每个R"是可除去的保护基团或是可除去的保护基团的一部分；
每个R'独立地为氢原子、烷基、经取代的烷基、芳烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂环基、酰基、氰基、烷氧基、芳氧基、杂芳氧基或酰胺基，或通过连接基团连接的可检测标记；或者(R')2表示式＝C(R"')2的亚烷基，其中每个R"'能够相同或不同，并且选自包括氢原子、卤素原子和烷基的组；并且
其中所述分子能够反应以产生中间体，其中每个R"被交换为H或，其中Z是-C(R')2-F，F被交换为OH、SH或NH2，优选OH，所述中间体在水性条件下解离以提供具有游离3'OH的分子；条件是当Z是-C(R')2-S-R"时，两个R'基团都不是H。
34.根据权利要求33所述的试剂盒，其中所述经修饰的核苷酸或核苷的R'为烷基或经取代的烷基。
35.根据权利要求33所述的试剂盒，其中所述经修饰的核苷酸或核苷的Z具有式-C(R')2-N3。
36.根据权利要求35所述的试剂盒，其中Z是叠氮甲基。
37.根据权利要求30所述的试剂盒，其中所述经修饰的核苷酸包含具有通过可切割接头与可检测标记连接的碱基的核苷酸或核苷。
38.根据权利要求37所述的试剂盒，其中所述可检测标记包含荧光标记。
39.根据权利要求30所述的试剂盒，其还包含一种或多种DNA模板分子和/或引物。

Claims (40)

1.一种重组DNA聚合酶，其包含与DNA聚合酶氨基酸序列SEQ ID NO:8或12至少80％相同的氨基酸序列，其中所述重组DNA聚合酶包含在功能上等同于所述DNA聚合酶氨基酸序列中选自Ala408、Ala409和Ile410的氨基酸的位置处的至少一个、至少两个或至少三个氨基酸取代突变。
2.根据权利要求1所述的重组DNA聚合酶，其中在功能上等同于
Ala408的位置处的所述取代突变包括对极性或不带电荷的氨基酸的突变。
3.根据权利要求2所述的重组DNA聚合酶，其中在功能上等同于
Ala408的位置处的所述取代突变包括对Tyr的突变。
4.根据权利要求1所述的重组DNA聚合酶，其中在功能上等同于
Ala409的位置处的所述取代突变包括对非极性或疏水性氨基酸的突变。
5.根据权利要求4所述的重组DNA聚合酶，其中在功能上等同于
Ala409的位置处的所述取代突变包括对Pro的突变。
6.根据权利要求1所述的重组DNA聚合酶，其中在功能上等同于Ile410的位置处的所述取代突变包括对非极性或疏水性氨基酸的突变。
7.根据权利要求6所述的重组DNA聚合酶，其中在功能上等同于Ile410的位置处的所述取代突变包括对Ala或Pro的突变。
8.一种重组DNA聚合酶，其包含与DNA聚合酶氨基酸序列SEQ ID NO:8或12至少80％相同的氨基酸序列，其中所述重组DNA聚合酶包含在功能上等同于所述DNA聚合酶氨基酸序列中选自Ala408、Ala409和Ile410的氨基酸的位置处的至少一个、至少两个或至少三个氨基酸取代突变，并且还包含在功能上等同于所述DNA聚合酶氨基酸序列中选自Ala129、Ala141、Ala143、Ser223、Val485、Gly497、Tyr247、Asp599和Gly633的氨基酸的位置处的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个或至少九个氨基酸取代突变。
9.根据权利要求8所述的重组DNA聚合酶，其中在功能上等同于Ala129的位置处的所述取代突变包括对除Met以外的任何氨基酸的突变。
10.根据权利要求8所述的重组DNA聚合酶，其中在功能上等同于Ala
141的位置处的所述取代突变包括对非极性或疏水性氨基酸的突变。
11.根据权利要求8所述的重组DNA聚合酶，其中在功能上等同于Ala143的位置处的所述取代突变包括对非极性或疏水性氨基酸的突变。
12.根据权利要求8所述的重组DNA聚合酶，其中在功能上等同于Ser223的位置处的所述取代突变包括对极性或不带电荷的氨基酸的突变。
13.根据权利要求8所述的重组DNA聚合酶，其中在功能上等同于Val485的位置处的所述取代突变包括对非极性或疏水性氨基酸的突变。
14.根据权利要求8所述的重组DNA聚合酶，其中在功能上等同于Gly497的位置处的所述取代突变包括对非极性、疏水性或不带电荷的氨基酸的突变。
15.根据权利要求8所述的重组DNA聚合酶，其中在功能上等同于Tyr247的位置处的所述取代突变包括对极性或不带电荷的氨基酸的突变。
16.根据权利要求8所述的重组DNA聚合酶，其中在功能上等同于Asp599的位置处的所述取代突变包括对极性氨基酸的突变。
17.根据权利要求8所述的重组DNA聚合酶，其中在功能上等同于Gly633的位置处的所述取代突变包括对非极性、疏水性或不带电荷的氨基酸的突变。
18.根据权利要求1所述的重组DNA聚合酶，其中所述DNA聚合酶为SEQ ID NO:12，并且其中所述DNA聚合酶还包含在功能上等同于Lys349的位置处的氨基酸取代突变，其中所述取代突变为Ser或Asn。
19.根据权利要求1所述的重组DNA聚合酶，其中所述聚合酶还包含在功能上等同于所述DNA聚合酶氨基酸序列SEQ.ID NO:8或12中选自Lys620和Val661的氨基酸的位置处的至少一个或至少两个氨基酸取代突变，其中Lys620处的所述取代突变为Arg，并且其中Val661处的所述取代突变为Asp。
20.根据权利要求1所述的重组DNA聚合酶，其中所述聚合酶还包含在功能上等同于所述DNA聚合酶氨基酸序列SEQ.ID NO:12中选自Ala281、Phe283、Trp397和Gly633的氨基酸的位置处的至少一个、至少两个、至少三个或至少四个氨基酸取代突变，其中Ala281处的所述取代突变为Phe，其中Phe283处的所述取代突变为Ser，其中Trp397处的所述取代突变为Cys，并且其中Gly663处的所述取代突变为Thr。
21.一种重组聚合酶，其包含选自SEQ ID NO:9、10、11、13、14、15、16、17和18的氨基酸序列，其中在功能上等同于Ala408的位置处的取代突变包括对极性或不带电荷的氨基酸的突变，其中在功能上等同于Ala409的位置处的取代突变包括对非极性或疏水性氨基酸的突变，并且其中在功能上等同于Ile410的位置处的取代突变包括对非极性或疏水性氨基酸的突变。
22.根据权利要求1所述的重组DNA聚合酶，其中所述重组聚合酶是B家族型DNA聚合酶。
23.根据权利要求22所述的重组DNA聚合酶，其中所述B家族型DNA聚合酶选自B家族古细菌DNA聚合酶、人DNA聚合酶-α、T4聚合酶、RB69聚合酶和phi29噬菌体DNA聚合酶。
24.根据权利要求23所述的重组DNA聚合酶，其中所述B家族古细菌DNA聚合酶来自选自嗜热球菌、火球菌、火棒菌、热网菌、气火菌和甲烷球菌的属。
25.根据权利要求1所述的重组DNA聚合酶，其中所述聚合酶包含与野生型聚合酶相比降低的外切核酸酶活性。
26.一种核酸分子，其编码如权利要求1所定义的重组DNA聚合酶。
27.一种表达载体，其包含根据权利要求26所述的核酸分子。
28.一种宿主细胞，其包含根据权利要求27所述的载体。
29.一种用于将经修饰的核苷酸掺入DNA中的方法，其包括允许以下组分相互作用：(i)根据权利要求1所述的重组DNA聚合酶；(ii)DNA模板；以及(iii)核苷酸溶液。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述DNA模板包含成簇阵列。
31.一种用于进行核苷酸掺入反应的试剂盒，其包含：如权利要求1所定义的重组DNA聚合酶和包含经修饰的核苷酸的溶液。
32.根据权利要求31所述的试剂盒，其中所述经修饰的核苷酸包含可检测标记。
33.根据权利要求31所述的试剂盒，其中所述经修饰的核苷酸在3'糖羟基处被修饰以包含取代基，其中所述取代基在大小上大于天然存在的3'羟基。
34.根据权利要求33所述的试剂盒，其中所述经修饰的核苷酸包含经修饰的核苷酸或核苷分子，所述经修饰的核苷酸或核苷分子包含嘌呤或嘧啶碱基和核糖或脱氧核糖部分，所述核糖或脱氧核糖部分具有与其共价连接的可除去的3'-OH封端基团，使得3'碳原子连接有以下结构的基团：
-O-Z
其中Z是-C(R')2-O-R"、-C(R')2-N(R")2、-C(R')2-N(H)R"、-C(R')2-S-R"和-C(R')2-F中的任一者，其中每个R"是可除去的保护基团或是可除去的保护基团的一部分；
每个R'独立地为氢原子、烷基、经取代的烷基、芳烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂环基、酰基、氰基、烷氧基、芳氧基、杂芳氧基或酰胺基，或通过连接基团连接的可检测标记；或者(R')2表示式＝C(R"')2的亚烷基，其中每个R"'能够相同或不同，并且选自包括氢原子、卤素原子和烷基的组；并且
其中所述分子能够反应以产生中间体，其中每个R"被交换为H或，其中Z是-C(R')2-F，F被交换为OH、SH或NH2，优选OH，所述中间体在水性条件下解离以提供具有游离3'OH的分子；
条件是当Z是-C(R')2-S-R"时，两个R'基团都不是H。
35.根据权利要求34所述的试剂盒，其中所述经修饰的核苷酸或核苷的R'为烷基或经取代的烷基。
36.根据权利要求34所述的试剂盒，其中所述经修饰的核苷酸或核苷的Z具有式-C(R')2-N3。
37.根据权利要求36所述的试剂盒，其中Z是叠氮甲基。
38.根据权利要求31所述的试剂盒，其中所述经修饰的核苷酸包含具有通过可切割接头与可检测标记连接的碱基的核苷酸或核苷。
39.根据权利要求38所述的试剂盒，其中所述可检测标记包含荧光标记。
40.根据权利要求31所述的试剂盒，其还包含一种或多种DNA模板分子和/或引物。
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