CN117778200A - 一株高产生淀粉酶菌株的选育及应用 - Google Patents

Description

一株高产生淀粉酶菌株的选育及应用

技术领域

本发明涉及一株高产生淀粉酶菌株的选育及应用，属于微生物领域。

背景技术

生淀粉酶是淀粉酶的一类，包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、脱支酶等。生淀粉酶是指直接酶解未经糊化淀粉颗粒的酶。生淀粉酶能够直接分解生淀粉为葡萄糖,可以将传统工艺中的淀粉糊化、液化、糖化合并为一步直接进行糖化。

生淀粉酶首先要吸附在淀粉颗粒表面，水解淀粉颗粒后表面出现孔洞结构，然后通过孔道通道进入淀粉颗粒内部，从淀粉颗粒内部水解淀粉，利用糖化酶的外切活力能够使淀粉的表面形成无数个小孔并且将小孔钻得尖和深，而α-淀粉酶的内切活力则能够扩大小孔，两种酶联合催化颗粒淀粉从孔中连续释放葡萄糖。淀粉酶能够将酒曲中的淀粉分解为可发酵的糖分子，如葡萄糖和麦芽糖。这些糖分子是酵母菌发酵所需的营养物质，促进其生长和繁殖。

生淀粉酶活力是酒曲质量的重要指标之一。酒药又称小曲，白药，原料包括生籼米粉、辣蓼草、母曲粉等，是手工黄酒的关键糖化发酵剂，酒药中含有根霉、毛霉、酵母等多种酿酒微生物。故从酒药中筛选高产生淀粉酶菌株是一种好的选择。目前研究报道，黑曲霉和解淀粉芽孢杆菌具有高产生淀粉酶活的特性，但不适合在酒药生产中应用。而印度毛霉(Mucor indicus)，它是一种双晶态、安全性高的非致病性真菌。广泛存在于淀粉类发酵食品中，并有重要的工业应用。在酒药中丰度和数量较低，具有分解生淀粉、产生乙醇和某些特征性风味物质的生成能力，如：2-苯乙醇、异戊醇、油酸乙酯、柠檬烯等。

现有技术中，使用使用印度毛霉Mucor indicus丰度在98％以上的小曲进行房县黄酒生产，提高了酒体稳定性和出酒率。在酒药扩培研究中，通过强化接种扣囊复膜酵母提高扩培酒药的糊化淀粉酶活力为616.01±83.55U/g。但是因为其生淀粉酶活不高，会使得酒药中不能利用淀粉的微生物，例如酿酒酵母、非酿酒酵母、乳酸菌等生长繁育不良。导致生产的酒药不能直接应用于黄酒酿造。因此，急需选育高产生淀粉酶菌株，以解决酒药生淀粉酶活力不高的问题。

发明内容

为了进一步优化扩培酒药品质，加强对制曲过程的调控，解决其生淀粉酶活力不足的问题。

本发明提供了一株印度毛霉，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20231800，保藏日期为2023年9月26日，保藏地址为湖北，武汉，武汉大学。

本发明还提供了含有所述印度毛霉的微生物制剂。

在一种实施方式中，所述微生物制剂是印度毛霉经生产扩繁后制得的活菌制剂。

在一种实施方式中，所述微生物制剂为液体制剂，包括但不限于孢子悬液。

在一种实施方式中，所述微生物为固体制剂，包括但不限于利用多孔的物质作为吸附剂(如草炭、石)，吸附菌体的发酵液制成的活菌制剂。

在一种实施方式中，所述微生物制剂中印度毛霉的含量≥1×10⁷个孢子/g或≥1×10⁷个孢子/mL。

本发明提供了一种强化生淀粉酶活扩培酒药的制作方法，是将产生淀粉酶活高的印度毛霉SYH-1#培养后作为强化菌剂，发酵扩培酒药。

在一种实施方式中，所述培养是在如下条件下培养；

(1)前12h在密闭环境下保温发酵，使温度达30～35℃，湿度达90-95％；

(2)第13-20h，当曲心温度升高至35℃，开启通风，使曲心温度保持在35～37℃；适当翻曲；

(3)第21-25h，间歇性通风，保持温度在30±5℃；

(4)第26-48h，降温保温，使温度为25±5℃；

在一种实施方式中，所述步骤(4)发酵结束后还进行烘干，所述烘干是在38±1℃烘干至水分在8～10％之间，获得成品强化酒药。

在一种实施方式中，所述强化扩培酒药具体包括如下步骤：

S1：使用生籼米粉、麸皮为原料，并将辣蓼草、母曲粉研磨成粉并过筛备用；

S2：将生籼米粉、麸皮、母曲粉、辣蓼草按比例进行混合，制得培养基质，将印度毛霉强化菌剂加入培养基质中，混合均匀后过筛放入固态发酵箱培养，发酵结束后进行降温排湿、通风干燥，即得强化生淀粉酶扩培酒药。

在一种实施方式中，各原料的重量份数如下：

籼米粉1000份、麸皮300份、母曲粉10份、辣蓼草7.5份、印度毛霉菌剂(孢子浓度1×10⁷CFU/mL)100份、清水500份。其中母曲粉和辣蓼草粉末以50目筛为宜。

在一种实施方式中，所述强化酒药制作原料麸皮可以是生料，或经过高压蒸汽灭菌处理。

在一种实施方式中，母曲粉包括但不限于获取自中国境内的酿酒小曲，例如浙江绍兴酒药、孝感凤窝酒曲、湖南新化小曲、贵州小曲、厦门白曲、宁波白药、四川小曲和苏州甜酒药等。

在一种实施方式中，母曲粉获取自绍兴黄酒厂，母取粉中细菌总量约为1.5×10⁸CFU/g，含有包括但不限于戊糖片球菌、食窦魏斯氏菌、融合魏斯氏菌等微生物；真菌总量约为4.5×10⁷CFU/g，含有包括但不限于扣囊复膜酵母、酿酒酵母、小孢根霉、印度毛霉等微生物。

本发明还提供印度毛霉CCTCC NO：M 20231800或其代谢物在发酵领域提高生淀粉酶、糊化淀粉酶活力方面的应用

在一种实施方式中，所述发酵领域包括但不限于酒药、生麦曲、熟麦曲、麸曲、腐乳曲、大曲等。

在一种实施方式中，所述的印度毛霉强化扩培酒药在发酵食品应用包括但不限于：黄酒、生料黄酒、料酒、甜酒酿或米酒、食醋、酱油、白酒等。

有益效果：

(1)本发明提供了一种从酒药中筛选的高产生淀粉酶的印度毛霉SYH-1#，可应用于麦曲、麸曲、酱油曲、腐乳等的生产及发酵食品(黄酒、米酒、酱油、醋等)中，提高原料利用率和品质，节能节源。

(2)本发明筛选获得的印度毛霉SYH-1#具有高产生淀粉酶的特性，可应用于强化扩培酒药。将印度毛霉SYH-1#应用于强化扩培酒药中，可使酒药的生淀粉酶活为160.18±7.42U/g，糊化淀粉酶活达到706.94±19.33U/g，所生产的强化酒药可以应用于黄酒、米酒、醋等发酵食品的酿造中，同时也为生料黄酒的酿造提供了可能性，可以替代熟麦曲直接应用于黄酒酿造。

(3)本发明提供了应用所述印度毛霉SYH-1#制备强化扩培酒药的方法，该方法制备的强化酒药可显著提高黄酒的出酒率(1.92±0.02)，比使用印度毛霉酒药酿造的房县黄酒中的出酒率(1.87±0.05)更高。对比未强化酒药酿造的黄酒，使用印度毛霉SYH-1#强化酒药可以显著提高黄酒的挥发性香气物质。

生物材料保藏

印度毛霉(Mucor indicus)SYH-1#，分类命名为印度毛霉(Mucor indicus)SYH-1#，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20231800，保藏日期为2023年9月26日，保藏地址为湖北，武汉，武汉大学。

附图说明

图1：固态发酵的生淀粉酶活力与液化力。

图2：印度毛霉SYH-1#菌落与镜检图；其中，从左向右依次为菌落形态、显微镜160倍镜检图、显微镜400倍镜检图。

图3：印度毛霉SYH-1#分子鉴定进化树。

图4：黄酒的挥发性风味物质。

具体实施方式

(一)技术术语：

酒药：本发明所述“酒药”是指酿酒用糖化发酵剂，具有糖化和发酵的作用，也可称为小曲、白药、酒饼。在本发明的一些实施方式中，酒药主要含有戊糖片球菌、扣囊复膜酵母、小孢根霉、印度毛霉、酿酒酵母等微生物。在本发明的一些实施方式中，强化印度毛霉SYH-1#酒药即为增加了印度毛霉SYH-1#菌体数量的酒药，可用于黄酒、甜酒酿、米酒等发酵酒精饮品，或食醋、酱油等发酵调味品的发酵过程。

强化菌剂：本发明所述“强化菌剂”是指在原体系(液体、半固体或固体环境)使用的含有有益功能微生物菌株的微生物制剂，将强化菌剂按照一定比例加入体系中，从而发挥特定的作用。

本发明中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。

本发明中，涉及到数值区间(也即数值范围)，如无特别说明，该数值区间内可选的数值的分布视为连续，且包括该数值区间的两个数值端点(即最小值及最大值)，以及这两个数值端点之间的每一个数值。如无特别说明，当数值区间仅仅指向该数值区间内的整数时，包括该数值范围的两个端点整数，以及两个端点之间的每一个整数，相当于直接列举了每一个整数。

本发明中的温度参数，如无特别限定，既允许为恒温处理，也允许在一定温度区间内存在变动。应当理解的是，所述的恒温处理允许温度在仪器控制的精度范围内进行波动。允许在如±5℃、±4℃、±3℃、±2℃、±1℃的范围内波动。

本发明中，涉及数据范围的单位，如果仅在右端点后带有单位，则表示左端点和右端点的单位是相同的。比如，20～200rpm表示左端点“20”和右端点“200”的单位都是rpm。“数据范围”中的“数据”可以为任意的定量值，比如数字、百分比、比例等。“数据范围”允许广义地包括百分比区间，比例区间，比值区间等定量区间。

本发明中，采用筛网目数定义粒径时，如采用50目，表示可以通过50目筛。

本发明中，术语“室温”一般指4℃～35℃，较佳地指20℃±5℃；在本发明的一些实施方式中，室温是指20℃～25℃。

(二)培养基：

富集培养基(g/L)：葡萄糖20.0，蛋白胨20.0，可溶性淀粉5.0，NaCl 10.0，pH 7.0，121℃灭菌20min。

筛选培养基(g/L)：生籼米粉20.0，NaNO₃ 3.0，K₂HPO₄ 1.0，MgSO₄·7H₂O 0.5，KCl0.5，FeSO₄·7H₂O 0.01，琼脂15.0，pH 5.5；其中籼米粉需经过160℃干热灭菌2h，在灭菌后的其他组分冷却至45℃时采用无菌操作加入灭菌的培养基中，快速振荡混匀倒平板，冷却凝固后备用。

马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)：马铃薯(去皮)200g/L制成浸出液、葡萄糖20g/L，15g/L琼脂(固体)。

液体发酵培养基(g/L)：液体发酵培养基为不添加琼脂的筛选培养基。发酵条件为30℃、200r/min。121℃灭菌20min。

模拟固态培养基：籼米30g，麦麸9g，辣蓼草0.22g，160℃干热灭菌2h。

(三)检测方法：

生淀粉酶活测定：

准确吸取25mL 2％籼米粉悬浮液(超声溶解)置于50mL比色管中；加5mL乙酸-乙酸钠缓冲溶液pH＝4.6摇匀，于40℃恒温水浴摇床中预热5min；然后加入2mL发酵上清液，立即摇匀计时；于40℃、160r/min反应1h，每20min搅拌一次。结束后加入0.2mL 20％(质量体积比)NaOH终止反应。取1mL反应液，立即加入1mL DNS溶液摇匀。沸水浴中煮沸5min，立即在冰水中冷却。同样条件下，空白组为先添加0.2mL 20％(质量体积比)NaOH，后加入2mL发酵上清液。上述反应体系加蒸馏水补足体积至10mL，混匀后用1cm比色皿在540nm波长下测吸光度，以葡萄糖标准曲线计算还原糖生成量。

精确称取1.00g固体发酵曲(计算时换算成绝干曲)，置于50mL经过高压蒸汽灭菌的离心管中，加入18mL去离子水和2mL乙酸-乙酸钠缓冲溶液，于40℃恒温水浴锅中浸提1h，将浸提液经10000r·min^-1，4℃下离心10min，取上清液即为粗酶液，分别测定待测产酶菌株的生淀粉酶活力。

酶活力(U)定义为：1mL发酵液或1g绝干曲在pH 4.0和40℃的条件下，水解生(籼米、木薯、玉米等)淀粉或糊化淀粉1h释放出1mg还原糖(等量于葡萄糖)所需要的酶量为1个酶活力单位(U)。粗酶液的酶活单位为U/mL，曲的酶活单位为U/g。

糊化淀粉酶活力的测定：

除反应底物生籼米粉替换为糊化可溶性淀粉外，其余与生淀粉酶活力的测定方法相同。

生淀粉降解能力(Raw starch digestion ability，RDA)计算：RDA＝B/A×100％；其中，B为降解生淀粉酶活，A为降解糊化淀粉酶活。

生淀粉酶菌株的形态学和分子生物学鉴定：

霉菌形态观察：将菌株用接种环挑取后点涂于PDA平板培养基中央，28℃培养3～5d，观察菌落形态，并记录菌落形状、菌落色泽、边缘状态。用接种环从菌落的边缘挑取少量带有孢子的菌丝，放入加有乳酸石炭酸棉蓝染液的洁净载玻片中，把菌丝挑散开后加盖玻片，用显微镜观察，并记录孢子与孢子囊形态和菌丝形态。

参照CTAB方法提取菌株的基因组DNA，鉴定采用ITS通用引物进行扩增。

其中扩增引物序列为ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')和ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')。PCR反应体系为：2×San Taq PCR Mix 12.5μL，ITS1和ITS4各1μL，DNA模板1μL，ddH₂O补齐至25μL。PCR扩增的反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s，58℃退火15s，72℃延伸45s，35个循环，最后72℃延伸10min。琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物的浓度和质量，将检测条带大小正确、浓度适合的PCR扩增产物送至上海生工进行DNA序列测定。将得到的微生物序列在NCBI数据库进行Blast同源性比对，选择和待检菌株同源性匹配度最高的已知序列，根据比对结果确定微生物的种属。并利用MEGA11.0软件构建菌株的系统发育树，研究待测菌株于其他菌种之间的亲缘关系进行菌种鉴定。

理化指标测定：扩培酒药的液化力、发酵力按照QBT4257-2011中方法进行测定。酸性蛋白酶活力按照GB1886.174-2016中方法进行测定。采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用(HS-SPME-GC/MS)技术定量测定挥发性风味物质

出酒率：黄酒的出酒率通常表示为出酒总液体与糯米原料重量的百分比，例如：1kg糯米压榨出酒的总液体重量为2kg，出酒率即为2.00。

出醋率：按照下式计算：

X＝(X₁×M)÷(3.5×m)；

式中：X─转换成酸度为3.5g/100mL食醋的出醋率，kg/kg；X₁─试样中总酸的含量(以乙酸计)，g/100g；M─成熟醋醅的质量，kg；m─发酵前加入的所有干物料的总质量，kg。

实施例1：酒药中高产生淀粉酶菌株筛选

1.平板初筛

称取2g酒药放入100mL锥形瓶，加入25mL富集培养基，然后在30℃、200r/min富集培养2h。取富集培养菌液进行梯度稀释(10^-3、10^-4、10^-5)，取稀释液100μL涂布在以籼米粉为唯一碳源的平板筛选培养基上，30℃培养3d。观察菌落生长情况，挑取菌落形态差异的菌株，分离纯化为单菌落。分离纯化后的单菌落于PDA斜面固体培养基，4℃下暂存。

经平板初步筛选，共有8个形态略有差异的菌株和8株霉菌，用无菌牙签沾取平板上的菌株点接于筛选培养基上，于30℃培养箱中培养2d后，滴加0.05％稀碘液，使用游标卡尺测定菌落周围的透明圈直径(Dh)和菌落直径(Dc)，计算其比值。其中菌落直径大的为霉菌。选取比值大的菌落作为初筛菌株。平板中的透明圈越大代表淀粉被分解的越多，菌株产淀粉酶能力越强。

表1生淀粉酶产生菌初筛结果

2.菌株发酵复筛

选取Dh/Dc>1.8的4株菌株，和Dh/Dc>1.00的8株霉菌，共12株，点取单菌落或是孢子接种至液体发酵培养基中以评价其在液态条件下产酶能力。并计算出生淀粉降解能力。

初筛的菌株接种到发酵培养基中进行培养，30℃、200r/min振荡培养3d。调整各菌株至同一浓度(1×10⁷CFU/mL)，吸取10mL培养液，经过12 000r/min离心5min收集上清液，测定发酵上清液中的生淀粉酶活力和糊化淀粉酶活力。每株菌三个平行，计算平均值。如表2所示，选取生淀粉酶活力大于100U/mL的菌株，以及RDA>30％的7株菌株进行固态产酶评价。

表2生淀粉酶产生菌复筛结果

单菌固态发酵筛选：在模拟固态发酵培养基中加入50％无菌水，按5％的接种量接种浓度为1×10⁷CFU/mL的种子液用已灭菌的药匙捣散使之混合均匀，包裹封口膜放置于培养箱30℃，相对湿度80％静置培养3d。期间培养18h后，待菌丝生长结成块曲后进行第一次摇瓶，28h后进行摇瓶和扣瓶倒置培养，40h后进行水平横放培养。发酵完成后的曲分别放置于曲盘中，在烘箱中38℃烘干12h。后续测定其生淀粉酶活力和液化力。每株菌三个平行，计算平均值。结果如图1所示，SYH-1#菌株单菌固态发酵的生淀粉酶活力和液化力最高，分别为227.29U/g，0.9186U/g。

实施例2：高产生淀粉酶菌株鉴定

将实施例1筛选的菌株SYH-1#接种于PDA固体平板培养基上培养并观察其菌落形态特征，结果如图2所示。菌落松散，呈白色或灰白色絮状，质地疏松，边缘整齐，菌丝可下扎培养基。后期在发达的菌丝顶部有黑色孢子，其显微特征表现为分生孢囊梗直立，多分枝，孢子囊较大、球形、顶生内含孢子量多，初步确定该菌株属于毛霉属。

经过提取菌株的总DNA作为模板扩增其ITS1～ITS4区，测定菌株的扩增序列，测定结果在NCBI数据库中进行blast，结果表明ITS核苷酸序列与GenBank数据库中的Mucorindicus显示出98％的同源性，它们的分子进化树如图3所示。结合菌株的形态学分析，SYH-1#被鉴定为印度毛霉(Mucor indicus)。

实施例3：印度毛霉微生物制剂的制备

从甘油管中分离纯化印度毛霉SYH-1#，在无菌状态下接种于PDA固体平板培养基中进行活化传代，挑取菌丝接种于PDA液体培养基中于30℃培养箱培养48h，获得孢子浓度为1×10⁷CFU/mL的孢子悬液。

实施例4：强化接种印度毛霉制作扩培酒药工艺

菌株种子液制备：从甘油管中分离纯化印度毛霉SYH-1#，在无菌状态下接种于PDA固体平板培养基中进行活化，点取孢子接种于PDA液体培养基中于30℃培养箱培养48h，孢子浓度调整至1×10⁷CFU/mL作为菌剂。

表3强化扩培酒药原料配比

按照表3原料配比，将籼米粉、麸皮及五分之四总量的母曲酒药粉(其中，酒药母曲粉获取自绍兴黄酒厂)混合均匀获得混合培养料，再将清水缓慢地加入前述混合培养料中，一边搅拌一边加入清水，顺时针方向搅动拌匀，并将成团的培养料过10目筛。在固体发酵箱里铺上四层纱布(或两层粗纱蒸笼布)，将混合均匀的原料堆积至固体发酵箱中至2～3cm厚，再在表面均匀地撒上余下的五分之一酒药粉，盖上箱盖开始发酵，在曲的四周及中点(曲心、曲表)放置温湿度计，记录温发酵温度。

固态发酵过程如下：

(1)第0-12h为前酵升温阶段，微生物生长产热，发酵在曲箱内进行保温发酵，温度逐渐升高至30～35℃，湿度可达90-95％，湿度大有利于微生物传播与生长。

(2)第13-20h为连续通风控温阶段，当曲心温度升高至35℃时，开启连续通风，曲心的温度在通风控制良好的情况下保持在35～37℃，温度过高则需要进行翻曲，一方面是降温，温度过高则会抑制真菌的生长。一方面是提高曲箱氧气含量，也可以排出曲箱内多余的水分。此时曲心曲表的湿度骤降，因为微生物生长吸水过程。

(3)第21-25h为间歇性通风控温阶段，需要人工控制，保持温度在30±5℃，湿度逐渐上升。

(4)第26-48h为后酵降温保温阶段，温度为25±5℃。此阶段温湿度较为稳定，微生物正进行代谢产酶阶段。

(5)发酵结束后以38℃放置烘箱约12h，烘干至水分在8～10％之间，即为成品扩培酒药。然后将其装于自封袋内储存至4℃冷库内保存备用。

对比例1：未接种强化扩培酒药

具体实施方式同实施例4，区别在于，将印度毛霉SYH-1#菌液替换为相同体积无菌水，结果如表4所示。

对比例2：强化印度毛霉JM25扩培酒药

具体实施方式同实施例4，区别在于，将印度毛霉SYH-1#替换为印度毛霉JM25(公开于论文《酒药核心微生物及可控固态发酵的研究》)，使用相同体积和浓度的菌液扩培酒药。

对以上扩培酒药进行理化指标的测定如表4，与对比例1未强化的扩培酒药相比，实施例4制备的强化酒药的生淀粉酶活为160.18±7.42U/g，约提高了314.6％。且糊化淀粉酶活力约提高了57.03％，同时液化力、酸性蛋白酶力和发酵力也显著提高。与对比例2相比，生淀粉酶提高了181.3％，糊化淀粉酶提高了20.15％。

表4强化酒药的理化指标

注：同列数据的不同上标表示数据之间有显著性差异，p＜0.05，下同。

实施例5：强化印度毛霉SYH-1#扩培酒药在黄酒中的应用

按实施例4的方法制备强化酒药，并用于黄酒酿造，具体步骤为：

(1)浸米：用足量的去离子水将10kg糯米于室温条件下浸泡2～3天。

(2)洗米：将米浆水缓缓倒掉后，用自来水进行淋洗，静置待水沥干。

(3)蒸饭：用蒸饭机进行蒸饭30min，做到米饭熟而不糊，内无夹心。

(4)摊饭：将蒸饭降温至30℃～35℃。

(5)新配方落料混合：由于实施例4制得了具有较高生淀粉酶活和糊化淀粉酶活的酒药，便省略使用酿造机械黄酒所需的熟麦曲(提供高糖化力)。按照表5的配料表进行落料，混合均匀后置于恒温发酵罐发酵。总发酵时间为20天。发酵过程注意开耙搅拌，前发酵温度控制在30±2℃，前发酵5天，每天早晚各开耙一次；后发酵的温度为15±2℃，发酵15天；5天开耙一次。

表5黄酒酿造配料表

对比例3：非强化扩培酒药酿造黄酒

具体实施方式同实施例5，区别在于，使用对比例1所制备的酒药替代强化印度毛霉SYH-1#酒药。

对比例4：强化印度毛霉JM25扩培酒药酿造黄酒

具体实施方式同实施例5，区别在于，使用对比例2所制备的酒药替代强化印度毛霉SYH-1#酒药。

发酵后的黄酒理化指标如表6，结果显示，对比例3的黄酒在相同条件下酿造黄酒容易产生酸败的现象。可能是原料中没有足够的碳源，导致酵母生长不良。实施例5强化接种印度毛霉SYH-1#不仅能够在酒药中产生淀粉酶，分解淀粉产生葡萄糖，为酵母提供良好的生长能源，还能在黄酒发酵过程中产生乙醇和多种风味物质，如图4所示，显著提高了黄酒中酯类(乙酸乙酯、丙酸乙酯、乳酸乙酯等)、醇类(正丙醇、异丁醇、2-苯乙醇等)、醛类(糠醛、桂醛、香兰醛等)等挥发性风味物质。酿造出的黄酒酒精度更高，糖度低；出酒率更高，说明充分利用了原料。黄酒理化性质符合黄酒国标GBT13662-2018要求，且酒香浓郁，酒体平衡，入口柔顺。

表6黄酒理化指标

实施例6：强化印度毛霉SYH-1#酒药在生料黄酒中的应用

原料碎糯米10kg(过20目筛)：要求精白新鲜、无霉变、无杂质。

浸米、拌药：将碎糯米入缸浸泡2天，捞出沥干，转入洁净大缸中，添加糯米质量的6％的印度毛霉SYH-1#强化酒药混匀，然后中间挖出喇叭状窝，保温培菌，糖化24～28h后，加入清水，粮水质量比例为1:1.1，同时加入15.6％麦曲、复合酶，搅拌均匀；所述复合酶由α-淀粉酶和淀粉葡糖苷酶组成，α-淀粉酶和淀粉葡糖苷酶的添加量均为发酵体系质量的0.1‰；所述α-淀粉酶购自上海源叶生物科技有限公司，酶活浓度≥3500U/mL；所述淀粉葡糖苷酶购自北京伊诺凯科技有限公司，酶活浓度≥100000U/mL。

发酵：总发酵时间为20天。发酵过程注意开耙搅拌，前发酵温度控制在30±2℃，前发酵5天，每天早晚各开耙一次；后发酵的温度为15±2℃，发酵15天；5天开耙一次。

因为印度毛霉的高生淀粉酶活的作用，在该工艺下，不需要大量使用酶制剂分解原料生淀粉，即可酿造生料黄酒，所酿生料黄酒甜美爽口、风格独特。酒精度为12.5％vol，总酸5.15±0.30g/L，总糖6.70±0.20g/L的干型黄酒。

实施例7：强化印度毛霉SYH-1#酒药在甜酒酿中的应用

将适量糯米在常温下浸泡24h；沥干水分于常压下蒸煮30～40min至米饭内无白心；将米饭摊晾后加入30％～40％生米重的凉白开浇淋，将糯米打散，糯米温度降低至28～30℃并拌入0.5％～1％强化酒药，翻拌均匀后，转入发酵容器中，轻轻压平，并在中间挖出一个酒窝，于28～30℃恒温密闭发酵48～72h，所得甜酒酿呈乳白色，发酵状况好，香气协调，甜型，酒精度约为3.0％vol，总糖为110±5.80g/L。使用对比例1的酒药则无法使甜酒酿成功发酵，导致酸败。强化印度毛霉酒药的出酒率为1.60，而使用对比例2印度毛霉JM25强化酒药酿成酒度为2.5％vol，总糖为102±8.40g/L，出酒率为1.53，酒精度、总糖和出酒率均不及应用强化印度毛霉SYH-1#酒药发酵的甜酒酿。

实施例8：强化印度毛霉SYH-1#酒药在米酒中的应用

将适量糯米在常温下浸泡24h；浸米程度要求米粒完整，用手掐米粒成粉状，无硬粒芯；将浸泡后的米粒用清水冲洗沥干；常压下蒸煮30～40min左右至米饭熟而不糊、饭粒松软、内无白芯；用冷白开将蒸熟的米粉冷淋至28～30℃，拌入0.5％～1％糯米质量的强化酒药搭窝糖化36～48h，窝内出现4/5甜液后，加入用米量100％～120％比例的水，搅拌均匀后进入前发酵于28℃培养4～6天，主发酵结束后进行低温(15℃)后发酵，发酵周期大约15～20天。待发酵结束后进行压榨过滤煎酒后取得酒液即为米酒。米酒富含酒香浓厚，香气协调，口感丰富，酒精度为12.0％vol，出酒率为1.85，且出酒率高。而使用对比例2印度毛霉JM25强化酒药酿成酒度为10.5％vol，出酒率为1.76。

实施例9：强化印度毛霉SYH-1#酒药在食醋中的应用

S1.发酵准备：选择优质糯米10kg，浸米24h，然后淋米至无白浆后沥干，蒸熟淋水冷却至25～30℃；糯米入缸前先拌入强化印度毛霉SYH-1#酒药0.15～0.2kg，低温糖化72～96h；

S2.酒精发酵：糖化结束后加水3kg，加入麦曲0.6kg，28℃下发酵144～168h，即得成熟酒醅；

S3.制醅：在发酵池内投入麸皮15kg，摊平，将发酵成熟的酒醅打入池内并搅拌均匀，取稻壳0.5kg均匀摊于池内上层，再取发酵成熟的醋醅0.5kg，搅拌均匀，覆盖0.5kg稻壳，撒匀即完成制醅；

S4.醋酸发酵：每发酵24h进行翻醅，每次翻醅完都加稻壳进行保温保湿，发酵第11天起不再添加稻壳，翻醅使品温冷却，20天后检测酸度不再上升时，加盐0.4kg，密封45天；

S5.淋醋与煎醋：取陈酿结束的醋醅，采用套淋法循环泡淋，得到的醋汁加入食糖调配，澄清后进行煎醋，等品温降至75～80℃后罐装密封保存。印度毛霉强化扩培酒药酿造食醋的总酸为5.25±0.42g/100mL，氨基酸态氮为1.08±0.16g/100mL，可溶性无盐固形物为1.38±0.32g/100mL，出醋率3.12kg/kg。

对比例5：印度毛霉JM25酒药制备酿造食醋

按照实施例9相同方法酿造食醋，区别在于，使用对比例2制作的印度毛霉JM25酒药代替强化印度毛霉SYH-1#酒药。结果显示，制备的酿造食醋总酸为4.86±0.65g/100mL，氨基酸态氮为0.85±0.32g/100mL，可溶性无盐固形物为1.20±0.28g/100mL，出醋率2.96kg/kg。因此将印度毛霉应用到固态食醋发酵过程中，可提高醋的品质和出醋率，降低生产成本，并在一定程度上提升食醋的口感。

实施例10：印度毛霉SYH-1#制作生麦曲工艺

生麦曲在黄酒的酿造过程中所占比例超过1/10，工厂麦曲生淀粉酶活不高大约40～50U/g，所含的生淀粉难以被分解完全，原料利用率低。通过接种印度毛霉SYH-1#可以提高生淀粉酶活，提升原料的利用率。具体步骤如下：

(1)印度毛霉SYH-1#种子液的制备，同实施例4。

(2)将50kg小麦适度粉碎后喷水，粉碎时确保每粒小麦粉碎至3～5片。

(3)将步骤(1)得到的印度毛霉SYH-1#种子液按照20％(v/m)的量加入到步骤(2)得到的粉碎后的小麦中，搅拌均匀，特别注意不要产生淀粉团吸水形成的白心结块，在固态发酵箱中培养，堆积厚度为10cm；其中，曲的培养过程分为四个阶段：启动升温阶段、自升温发酵阶段、降温阶段和干燥阶段，干燥完成后的块曲即为成品曲，发酵过程控制如下：

S1.第0～24h为启动升温阶段：曲房启动温度为25℃，曲心温度在12～24h内由室温缓慢升高至30℃，此阶段曲房相对湿度维持在95±2％；

S2.第25～72h为自升温发酵阶段：曲块的温度从30℃升至40℃；当温度检测装置发现曲心温度高于曲表时(温差大于3℃)，关闭控温装置，仅靠微生物生长的生物热维持温度，当温度过高时，通风自动调整至高档位，当温度过低时，低档位通风或不通风，相对湿度95～99％，此阶段维持24～48h；

S3.第73～90h为降温阶段：即温度缓慢下降阶段，曲块的温度从35～40℃开始下降，在18h内缓慢降至约28～30℃；并维持相对湿度低于85％；

S4.第91～120h为干燥阶段：等相对湿度逐渐下降至65％时，维持此条件约12h后，取出成品曲于38℃烘干，完成曲干燥。制得麦曲的生淀粉酶活力为148.82±12.50U/g。

对比例6：印度毛霉JM25麦曲制作工艺

具体实施方式同实施例10，区别在于，将印度毛霉SYH-1#替换为印度毛霉JM25相同体积和浓度的菌液。结果显示，印度毛霉JM25制备的麦曲的生淀粉酶活力为：77.50±4.18U/g。

实施例11：印度毛霉SYH-1#制作麸曲工艺

将1kg麦麸干热灭菌后，添加水含量50％左右，接入5％麦麸重量的印度毛霉SYH-1#菌液(制备方法同实施例4)，在固态发酵箱中，维持温度30±5℃，发酵60h即为成曲。制得麸曲的生淀粉酶活为105.60±15.20U/g。

对比例7：印度毛霉JM25麸曲制作工艺

具体实施方式同实施例11，区别在于，将印度毛霉SYH-1#替换为印度毛霉JM25相同体积和浓度的菌液。结果显示，印度毛霉JM25麸曲的生淀粉酶活力为40.60±2.85U/g。

实施例12：强化印度毛霉SYH-1#制作酱油曲工艺

S1.种曲：将麸皮、豆饼粉、面粉和水以8：1：1：10的质量比装入大三角瓶，将原料与水混合均匀摊平，塞好棉塞，灭菌后摇松曲料,待凉后将已灭菌瓶在无菌状况下，接入米曲霉(CCTCC NO：M 2015201)和印度毛霉SYH-1#菌液(相同浓度1×10⁷CFU/mL)以1：3的比例，直立放入30℃恒温箱中培养，15～24h培养基出现白点菌落，开始结饼时，轻摇三角瓶打散结块，平摊于三角瓶的底部。培养24～48h，菌丝大量繁殖，培养基已经结饼。此时进行扣瓶，倒置进行培养约72h。

S2.酱油曲制作：挑选饱满干净的大豆20kg，洗净后加水浸泡5～10h，等豆粒完全吸水膨胀后沥水后加压蒸熟；热豆出锅后，冷却至70～80℃左右，加入面粉30～40％(按照大豆质量计)，搅拌均匀，继续冷却至30℃，然后加入5％的种曲，翻拌均匀，保持品温28～30℃左右进行发酵，在发酵培养箱中通风制曲，经72～96h后获得酱油曲。

对酱油曲的品质进行检测，结果显示，酱油曲的生淀粉酶活为126.18±10.22U/g，酸性蛋白酶活为75.76±6.48U/g。

对比例8：印度毛霉JM25制备酱油曲

具体实施方式同实施例12，区别在于，将印度毛霉SYH-1#替换为印度毛霉JM25相同体积和浓度的菌液。

对比例8获得的酱油曲生淀粉酶活为105.24±9.58U/g，酸性蛋白酶活为60.76±4.95U/g。印度毛霉SYH-1#的加入使得淀粉糖化、液化反应更完全，且提高了酸性蛋白酶活，曲中的功能微生物(霉菌、酵母、乳酸菌)生长良好，对后期酱油的色、香、味、体均有重要影响。

实施例13：印度毛霉SYH-1#制作腐乳工艺

S1.生豆浆制备：大豆进行浸泡，出现泡涨现象后取出，磨浆，滤布过滤，得到生豆浆。

S2.豆腐坯的制备：将混合均匀后煮沸20min，静置除渣，豆浆中缓慢加入0.96％冰醋酸点浆，80℃保温30min。压制，切块，得到豆腐坯；

S3.腐乳毛坯的制备：将印度毛霉SYH-1#菌悬液(1×10⁷CFU/mL)喷洒在豆腐坯表面呈不滴水状态，随后进行发酵，温度为25 32℃，湿度为80 90％，发酵时间为35-40h，豆腐坯表面生成毛霉菌丝，即得到腐乳毛坯；

S4.腐乳毛坯的腌制：将腐乳毛坯表面的菌丝搓平，食盐添加量为5％，进行腌制。

对腐乳的品质进行检测分析，结果显示，应用印度毛霉SYH-1#制作的腐乳氨基酸态氮含量为0.50±0.12g/100g，水溶性蛋白含量为1.65±0.16g/100g。

对比例9：印度毛霉JM25制备腐乳工艺

具体实施方式同实施例13，区别在于，将印度毛霉SYH-1#替换为印度毛霉JM25相同体积和浓度的菌液。

对比例9发酵的腐乳，氨基酸态氮含量为0.41±0.09g/100g，水溶性蛋白含量为1.32±0.15g/100g。而印度毛霉SYH-1#所制备的腐乳发酵过程中的稳定性更好，滋味鲜美，品质更佳。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (15)

1.一种印度毛霉(Mucor indicus)SYH-1#，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20231800，保藏日期为2023年9月26日，保藏地址为湖北，武汉，武汉大学。

2.含有权利要求1所述印度毛霉SYH-1#的微生物制剂。

3.根据权利要求2所述的微生物制剂，其特征在于，所述微生物制剂是印度毛霉经生产扩繁后制得的活菌制剂。

4.根据权利要求3所述的微生物制剂，其特征在于，所述微生物制剂为液体制剂，包括但不限于孢子悬液。

5.根据权利要求3所述的微生物制剂，其特征在于，所述微生物为固体制剂，包括但不限于利用多孔的物质作为吸附剂，吸附菌体的发酵液制成的活菌制剂。

6.根据权利要求3～5任一所述的微生物制剂，其特征在于，所述微生物制剂中印度毛霉的含量≥1×10⁷个孢子/g或≥1×10⁷个孢子/mL。

7.一种强化酒药生淀粉酶活性的方法，其特征在于，应用权利要求1所述的印度毛霉SYH-1#发酵扩培酒药。

8.一种强化酒药的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1：以生籼米粉、麸皮为原料，将原料研磨成粉并过筛备用；

S2：将原料与母曲粉、印度毛霉SYH-1#混合，在一定条件下培养，获得生淀粉酶活力提高的强化酒药。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，在如下条件下培养；

(1)前12h在密闭环境下保温发酵，使温度达30～35℃，湿度达90-95％；

(2)第13-20h，当曲心温度升高至35℃，开启通风，使曲心温度保持在35～37℃；适当翻曲；

(3)第21-25h，间歇性通风，保持温度在30±5℃；

(4)第26-48h，降温保温，使温度为25±5℃。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤(4)发酵结束后在38±1℃烘干至水分在8～10％之间，获得成品强化酒药。

11.应用权利要求8～10任一所述方法制备的印度毛霉SYH-1#强化酒药。

12.权利要求1所述的印度毛霉SYH-1#或其代谢物在发酵领域提高生淀粉酶、糊化淀粉酶活力方面的应用。

13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，所述发酵领域包括但不限于制备酒药、生麦曲、熟麦曲、麸曲、腐乳曲或大曲。

14.权利要求1所述的印度毛霉SYH-1#在发酵食品生产中的应用。

15.根据权利要求14所述的应用，其特征在于，所述发酵食品包括但不限于：黄酒、生料黄酒、料酒、白酒、甜酒酿、米酒、食醋或酱油。