CN117736318B - 一种抗肉毒毒素的纳米抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗肉毒毒素的纳米抗体及其应用，所述纳米抗体具有如SEQ ID NO：2~4所示的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列。本发明同时提供了编码所述纳米抗体的核酸分子、含有所述核酸分子的表达载体和宿主细胞。本发明的纳米抗体具有较高的结合活性。

Description

一种抗肉毒毒素的纳米抗体及其应用

技术领域

本发明属于细胞免疫学、基因工程领域，涉及一种抗肉毒毒素的纳米抗体及其应用。

背景技术

肉毒神经毒素(botulinumneurotoxins，BoNT)，也被叫作肉毒毒素，它是一种外毒素。肉毒毒素已经被研究的很多了，目前发现它有多个亚型即 A-G七个血清型。毒素类型A、B、E、F是导致人类疾病的主要类型，毒素类型C、D是导致其他动物致病的主要因素，而毒素类型G尚未有报道其有致病记录。肉毒毒素可在人和动物的神经肌肉接头处抑制神经递质乙酰胆碱的释放，导致以弛缓性麻痹为特征的一系列症状和体征，如引起头晕，呼吸困难，肌肉无力等症状。因肉毒杆菌可以阻断神经和肌肉之间的“信息传导”，放松过度收缩的肌肉，可以减轻或消除皱纹，也被广泛的应用于化妆品行业。在日常生活中，由于食物污染肉毒毒素和美容行业不规范注射肉毒毒素导致的中毒事件时有发生，严重威胁人们的生命健康。因此，对于检测和防治肉毒毒素中毒的研究具有十分重要的意义。

纳米抗体，或单域抗体(sdAb)是存在于骆驼科动物体内的重链抗体(HcAb)的可变区(VHH)。尽管它们尺寸很小(15kDa)，分离的纳米抗体可以完全识别它们的同源抗原。此外，由于其较小的尺寸和理化性质，与传统的免疫球蛋白相比具有多种优势。例如，即使从其来源的HcAb的剩余部分中分离出来，它们仍然保持着高度的稳定性。此外，它们可以在高浓度下溶解，并且被认为在体内表现出优异的组织渗透性。因此，纳米抗体已成为一类新型的、有前景的诊断和治疗性抗体。此外，它们可以在大肠杆菌中表达，并且可以很容易地与其他纳米抗体结合以产生多价或多特异性物种。与经典的单克隆抗体相比，纳米抗体的优势之一是可以通过其突出的互补决定区3(CDR3)识别隐性表位。因此在肉毒毒素治疗药物或诊断试剂的研发中，纳米抗体是良好的候选药物。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种纳米抗体，所述纳米抗体具有较高的亲和活性与结合活性，能够有效的检测肉毒毒素。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面提供了一种抗肉毒毒素的纳米抗体，所述纳米抗体包含SEQ IDNO：1所示的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3。

本发明的第二方面提供了一种核酸分子，所述核酸分子包含编码本发明第一方面所述的纳米抗体的核苷酸序列。

本发明的第三方面提供了一种载体，所述载体包含本发明第二方面所述的核酸分子。

本发明的第四方面提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包含本发明第二方面所述的核酸分子，或包含本发明第三方面所述的载体。

本发明的第五方面提供了一种抗体偶联物，所述抗体偶联物含有：

本发明第一方面所述的纳米抗体，以及任选地

选自下组的偶联部分：核酸、多肽或蛋白质、病毒、毒素和化学实体的目标化合物。

本发明的第六方面提供了一种产品，所述产品包含：

本发明第一方面所述的纳米抗体、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的载体、本发明第四方面所述的宿主细胞或本发明第五方面所述的抗体偶联物。

本发明的第七方面提供了如下任一项所述的应用：

1）本发明第一方面所述的纳米抗体、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的载体、本发明第四方面所述的宿主细胞、本发明第五方面所述的抗体偶联物、本发明第六方面所述的产品在检测、富集或纯化肉毒毒素中的应用；

2） 本发明第一方面所述的纳米抗体、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的载体、本发明第四方面所述的宿主细胞或本发明第五方面所述的抗体偶联物在制备诊断肉毒毒素引起的病症的药物中的应用。

本发明第八方面提供了一种检测、富集或纯化肉毒毒素的方法，其特征在于，所述方法包括将包含肉毒毒素的样品与本发明第一方面所述的纳米抗体接触。

本发明的优点和有益效果：

本发明提供了一种抗肉毒毒素的纳米抗体，所述抗体体积小、结构简单、易于表达、耐热、特异性强，具有较高的结合活性和中和活性。

附图说明

图1是Biacore分析结果图。

图2是ELISA检测纳米抗体A1与抗原BoNT/AHC的结合能力图。

具体实施方式

现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。

除非另有说明，用于披露本发明的所有术语(包括技术和科学术语)的意义与本发明所属领域普通技术人员所通常理解的相同。通过进一步的指导，随后的定义用于更好地理解本发明的教导。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

本发明通过广泛而深入的研究，经过大量的筛选，成功获得一组纳米抗体。具体地，本发明利用获取的天然骆驼VHH基因文库，构建VHH噬菌体文库，然后将抗原A型肉毒毒素（肉毒毒素特别是A型肉毒毒素）包被免疫管，利用抗原抗体结合筛选肉毒毒素特异性的纳米抗体。实验结果表明，本发明获得纳米抗体能够有效地与抗原结合。

本发明提供了一种纳米抗体，所述纳米抗体包含SEQ ID NO：1所示的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3。

在本发明中，“纳米抗体(single domain antibody，sdAb，或VHH)”、“纳米抗体”(nanobody)、“单域抗体”具有相同的含义，指克隆抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的纳米抗体，它是具有完整功能的最小的抗原结合片段。

本发明中涉及的纳米抗体的CDR边界可通过Kabat、IMGT、Chothia或Al- Lazikani的约定来限定或鉴定。三个CDR插在被称为构架区（framework region；FR）的侧翼链段（stretch）之间。

在具体的实施例中，所述CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

在本发明的一实施方式中，纳米抗体还包括骨架区；其重链可变区的结构为：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。

在本发明的一具体实施方式中，框架区FR1-4的序列如SEQ ID NO：5-8所示。

在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的重链包括上述重链可变区和重链恒定区。

在本发明中，术语“抗体”、“蛋白”、或“多肽”可互换使用，都指特异性结合抗原的多肽，例如具有重链可变区的蛋白或多肽。它们可含有或不含起始甲硫氨酸。

本发明还提供了具有本发明抗体的其他蛋白质或融合表达产物。具体地，本发明包括具有含可变区的重链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物)，只要该可变区与本发明抗体的重链可变区相同或至少90％同源性，较佳地至少95％同源性。

本发明不仅包括完整的抗体，还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此，本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。

在本发明中，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明抗体相同的生物学功能或活性的多肽。

本发明抗体指具有肉毒毒素抗原结合活性的、包括上述CDR区的多肽。该术语还包括具有与本发明抗体相同功能的、包含上述CDR区的多肽的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括本发明抗体的活性片段和活性衍生物。

所述多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与本发明抗体的编码DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗本发明抗体的抗血清获得的多肽或蛋白。

可利用取代、缺失、插入或其任意组合来实现最终的衍生物或变体。通常，这些变化在几个氨基酸上进行以使分子的改变最小化，特别是抗原结合蛋白的免疫原性和特异性。然而，在某些情况下可以容忍更大的变化。氨基酸取代通常是单个碱基的；插入通常将为大约一个至大约二十个氨基酸残基的数量级，虽然可能容忍显著更大的插入。缺失的范围为大约一个至大约二十个氨基酸残基，虽然在一些情况下，缺失可以大得多。

本发明提供了编码前述纳米抗体的核酸分子。

在一些实施方式中，核酸包含其保守置换的变体(例如简并密码子的置换)和互补序列，亦包括通过密码子优化以在期望的宿主细胞中更高效表达的变体。核酸分子可以例如通过标准化学合成方法和/或重组方法合成，或半合成地产生，例如通过组合化学合成和重组方法。编码序列与转录调控元件和/或与其他氨基酸编码序列的连接可以使用已确立的方法进行，例如限制酶切消化、连接和分子克隆。

本发明提供了包含前述核酸分子的载体。

在一些实施方式中，载体是表达载体。根据本发明的表达载体能够指导本发明的核酸分子在宿主中的复制和表达，并因此保证由此编码的本发明的抗肉毒毒素的可变链结构域在选择的宿主中的表达。在进一步的实施方案中，一种或多种载体包含进一步的序列以确保不仅表达本发明的所述可变链结构域，而且也表达包含本发明的所述可变链结构域的全长抗体。

表达载体可以例如是克隆载体、双元载体或整合型载体。表达包括核酸分子的转录，例如转录成可翻译的mRNA。载体的非限制性实例包括pQE-12、pUC-系列、pBluescript(Stratagene)、pET-系列表达载体(Novagen)或pCRTOPO (Invitrogen)、λgt11、pJOE、pBBR1-MCS系列、pJB861、pBSMuL、pBC2、pUCPKS、pTACT1、pTRE、pCAL-n-EK、pESP-1、pOP13CAT、E-027 pCAG Kosak-Cherry (L45a)载体系统、pREP (Invitrogen)、pCEP4(Invitrogen)、pMC1neo(Stratagene)、pXT1 (Stratagene)、pSG5 (Stratagene)、EBO-pSV2neo、pBPV-1、pdBPVMMTneo、pRSVgpt、pRSVneo、pSV2-dhfr、pIZD35、Okayama-Berg cDNA表达载体pcDV1(Pharmacia)、pRc/CMV、pcDNA1、pcDNA3 (Invitrogen)、pcDNA3.1、pSPORT1(GIBCO BRL)、pGEMHE (Promega)、pLXIN、pSIR (Clontech)、pIRES-EGFP (Clontech)、pEAK-10 (EdgeBiosystems) pTriEx-Hygro (Novagen)和pCINeo (Promega)。适合于巴斯德毕赤氏酵母（Pichia pastoris）的质粒载体的非限制性实例包括例如质粒pAO815、pPIC9K和pPIC3.5K（全部为Invitrogen）。适合于在爪蟾属（Xenopus）胚胎、斑马鱼胚胎以及各种各样的哺乳动物和禽类细胞中表达蛋白质的另一种载体是多用途表达载体pCS2+。

通常，载体可含有一种或多种用于克隆或表达的复制起点（ori）和遗传系统、一种或多种用于在宿主中选择的标记（例如，抗生素抗性）和一种或多种表达盒。另外，可以使用已确立的方法将载体中包含的编码序列与转录调控元件和/或与其他氨基酸编码序列连接。这种调控序列是本领域技术人员众所周知的，并且包括但不限于确保转录起始的调控序列、内部核糖体进入位点（IRES）和任选的确保转录终止和转录物稳定的调控元件。确保转录起始的这种调控元件的非限制性实例包括启动子、翻译起始密码子、增强子、绝缘子和/或确保转录终止的调控元件，其包括在本发明的核酸分子的下游。进一步的例子包括Kozak序列和侧翼为用于RNA剪接的供体和受体位点的间插序列，编码分泌信号的核苷酸序列，或取决于所用的表达系统的信号序列，其能够将表达的蛋白质引导至细胞区室或培养基。载体也可含有编码一种或多种蛋白伴侣的另外的可表达多核苷酸，以促进正确的蛋白质折叠。

可以设计本发明的核酸分子和/或载体以通过例如基于化学的方法（聚乙烯亚胺、磷酸钙、脂质体，DEAE-葡聚糖、核转染、非化学方法（电穿孔、声孔效应、光转染、基因电转移、流体递或细胞与本发明的核酸分子接触时自然发生的转化）、基于粒子的方法（基因枪、磁转染、穿刺转染）、基于噬菌体载体的方法和病毒方法引入细胞。例如，衍生自诸如反转录病毒、牛痘病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒、Semliki病毒或牛乳头瘤病毒的表达载体可用于将核酸分子递送至靶向的细胞群体中。另外，杆状病毒系统也可以用作本发明核酸分子的真核表达系统中的载体。

为了促进本发明的核酸分子的纯化，可将标签（tag）序列插入表达载体中。标签的实例包括（但不限于）六个组氨酸标签、myc标签或FLAG 标签。可在本发明中使用本领域的技术人员已知的促进纯化的任何标签。

本发明提供了包含前述核酸分子或载体的宿主细胞。任何适当的宿主细胞/载体系统可用于编码本发明的抗体分子的DNA序列的表达。

在一些实施方式中，可使用细菌（例如大肠杆菌）及其它微生物系统，或还可使用真核生物（例如哺乳动物）宿主细胞表达系统。上述细胞包含（但并不限于）哺乳动物细胞、植物细胞、昆虫细胞、真菌细胞或细菌来源的细胞。作为哺乳动物细胞，可优选使用选自（但并不限于）由CHO细胞、F2N细胞、CSO细胞、BHK细胞、Bowes黑色素瘤细胞、HeLa细胞、911细胞、AT1080细胞、A549细胞、HEK293细胞和HEK293T细胞组成的组中的一种作为宿主细胞。在本领域中可使用本领域的技术人员已知的可用作哺乳动物宿主细胞的任何细胞。

本发明提供了包含前述纳米抗体的抗体偶联物，所述抗体偶联物包含抗体与核酸、多肽或蛋白质、病毒、毒素和化学实体的目标化合物直接或间接、共价或非共价地连接。连接可以是共价键，或非共价相互作用，诸如通过静电力。本领域已知的各种接头可用于形成免疫偶联物。接头(L)可以，例如选自下组：可裂解的接头、不可裂解的接头、亲水性接头、带电荷的接头和基于二羧酸的接头。

术语“偶联”具有其在本领域中的一般含义且意指化学偶联或化学交联。许多化学交联方法也是本领域已知的。交联剂可以是同型双功能的(即，具有经历相同反应的两个官能团)或异型双功能的(即，具有两个不同的官能团)。许多交联剂是可商购的。

在一些实施方式中，目标化合物包括抗原结合结构域试剂，诸如抗体、其变体和片段，尤其是相同或另一种纳米抗体、适体或酶。

如上所述，目标化合物或物质可以是治疗或诊断化合物。治疗化合物尤其包括具有抗癌和/或细胞毒性活性的治疗化合物(即细胞毒性化合物)，且诊断化合物通常包括成像探针。

在一些实施方式中，所述目标物质是药物纳米载体，其可以是有机的物质，诸如脂质体或聚合物实体，或包含或包封诊断或治疗化合物的无机的物质。

有抗癌或细胞毒性活性的治疗化合物例如，可选自下组：V-ATPase抑制剂、促凋亡剂、Bcl2抑制剂、MCL1抑制剂、HSP90抑制剂、IAP抑制剂、mTor抑制剂、微管稳定剂、微管去稳定剂、奥瑞他汀、多拉司他汀、美登素类化合物、MetAP(甲硫氨酸氨肽酶)、蛋白质CRM1的核输出抑制剂、DPPIV抑制剂、蛋白酶体抑制剂、线粒体中的磷酰基转移反应抑制剂、蛋白质合成抑制剂、激酶抑制剂、CDK2抑制剂、CDK9抑制剂、驱动蛋白抑制剂、HDAC抑制剂、DNA损伤剂、DNA烷化剂、DNA嵌入剂、DNA小沟区结合物和DHFR抑制剂。

细胞毒性化合物可以，例如选自下组：紫杉醇；细胞松弛素B；短杆菌肽D；溴化乙锭；依米丁；丝裂霉素；依托泊苷；替尼泊苷；长春新碱；长春碱；秋水仙碱；阿霉素；柔红霉素；dihydroxyanthracindione；微管蛋白抑制剂，诸如美登素或其类似物或衍生物；抗有丝分裂剂，诸如单甲基奥瑞他汀E或F或其类似物或衍生物；多拉司他汀10或15或其类似物；伊立替康或其类似物；米托蒽醌；光神霉素；放线菌素D；1-脱氢睾酮；糖皮质激素；普鲁卡因；丁卡因；利多卡因；普萘洛尔；嘌呤霉素；卡奇霉素或其类似物或衍生物；抗代谢物，诸如甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、氟达拉滨、5-氟尿嘧啶、地卡巴嗪、羟基脲、天冬酰胺酶、吉西他滨或克拉屈滨；烷化剂，诸如氮芥、塞替派、苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(BSNU)、洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲霉素、达卡巴嗪(DTIC)、丙卡巴肼、丝裂霉素C；铂衍生物，诸如顺铂或卡铂；倍癌霉素A、倍癌霉素SA、拉奇霉素(CC-1065)或其类似物或衍生物；抗生素，诸如放线菌素D、博来霉素、柔红霉素、阿霉素、伊达比星、光神霉素、丝裂霉素、米托蒽醌、普卡霉素、氨茴霉素(AMC)；吡咯并[2,1-c][1,4]-苯并二氮杂(PDB)；白喉毒素和相关分子，诸如白喉A链及其活性片段和杂合分子、蓖麻毒蛋白毒素，诸如蓖麻毒蛋白A或去糖基化的蓖麻毒蛋白A链毒素、霍乱毒素、志贺样毒素，诸如SLT I、SLTII、SLT IIV、LT毒素、C3毒素、志贺菌毒素、百日咳毒素、破伤风毒素、大豆Bowman-Birk蛋白酶抑制物、假单胞菌外毒素、alorin、皂草素、膜联蛋白、gelanin、abrin A链、蒴莲素A链、α-sarin、Aleuritesfordii蛋白、dianthin蛋白、美洲商陆蛋白，诸如PAPI、PAPII和PAP-S、momordicacharantia抑制剂、麻风树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草抑制剂；核糖核酸酶(Rase)；DNase I、葡萄球菌肠毒素A；商陆抗病毒蛋白；白喉毒素；和假单胞菌属内毒素。

在一个这样的实施方式中，偶联的核酸是细胞毒性核糖核酸酶(RNase)或脱氧核糖核酸酶(例如，DNase I)、反义核酸、抑制性RNA分子(例如，siRNA分子)或免疫刺激性核酸(例如，含有免疫刺激性CpG模体的DNA分子)。在一些实施方案中，抗体与适体或核酶偶联。

在一些实施方式中，与如本文公开的sdAb偶联或包封在用如本文公开的sdAb官能化的纳米载体中的治疗化合物包括放射性同位素或含放射性同位素的螯合物。例如，所述抗体可偶联至螯合剂接头，例如DOTA、DTPA或tiuxetan，其使得抗体与放射性同位素复合。纳米抗体还可以或可替代地包含或偶联至一个或多个放射性标记的氨基酸或其他放射性标记的分子。放射性同位素的非限制性实例包括3H、14C、15N、35S、90Y、"Tc、125I、131I、186Re、213Bi、225Ac和227Th。为治疗目的，可使用发射β或α粒子辐射的放射性同位素，例如131I、90Y、211At、212Bi、67Cu、186Re、188Re和212Pb。

诊断化合物可选自酶、荧光团、NMR或MRI造影剂、放射性同位素或纳米颗粒。例如，诊断化合物可选自下组：

-酶，诸如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸酶或β-半乳糖苷酶；

-荧光团，诸如绿色荧光蛋白(GFP)，在光谱的紫外(UV)部分中的波长处激发的蓝色荧光染料(例如，AMCA(7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酸)；Alexa Fluro®350)，由蓝光激发的绿色荧光染料(例如，FITC、Cy2、Alexa Fluro®488)，由绿光激发的红色荧光染料(例如，罗丹明、德克萨斯红、Cy3、Alexa Fluro染料546、564和594)，或用远红光激发的染料(例如Cy5)以用电子检测器(CCD相机、光电倍增管)可视化；

-放射性同位素，例如可用于PET成像的18F、nC、13N、150、68Ga、82Rb、44Sc、64Cu、86Y、89Zr、124I、152Tb，或可用于SPECT/闪烁照相研究的67Ga、81mKr、99mTc、mIn、123I、125I、13Xe、201T1、155Tb、195mPt，或可用于放射自显影或原位杂交的14C、3H、35S、31P、125I，或可用于标记化合物的At-、Bi-、Br-、Br-、I-、In、177Lu-、212Pb-、186Re-、188Re-、153Sm-、0Y；

-NMR或MRI造影剂，诸如顺磁剂钆(Gd)、镝(Dy)和锰(Mn)，和基于氧化铁(诸如MION、SPIO或USPIO)或铂化铁(SIPP)的超顺磁剂，以及X-核，诸如18F、13C、23Na、17O、15N；

-纳米颗粒，诸如金纳米颗粒或量子点。

在一些实施方式中，当目标化合物是异源多肽时，本公开的纳米抗体可(可选地或另外地)与一个或多个异源多肽融合以形成融合蛋白(在本文中也称为“融合多肽”或“多肽”)。“融合”或“嵌合”蛋白或多肽包含与第二氨基酸序列连接的第一氨基酸序列，其在自然界中并非天然连接的。通常存在于分离的蛋白质中的氨基酸序列可在融合多肽中集合在一起。融合蛋白或多肽例如通过化学合成产生，或通过产生和翻译，多核苷酸，其中多肽区以期望的关联编码。

融合蛋白可包含至少一种前述的纳米抗体，其直接或通过间隔子在其C端和/或其N端融合，尤其是在其C端融合至异源多肽的N端，和/或在其N端融合至异源多肽的C端。如本发明所用，术语“直接”是指人源化纳米抗体末端(N或C端)的(第一个或最后一个)氨基酸与异源多肽末端(N或C端)的(第一个或最后一个)氨基酸融合。换言之，在该实施方案中，所述sdAb的C端的最后一个氨基酸通过共价键与所述异源多肽的N端的第一个氨基酸直接连接，或者所述sdAb的N端的第一个氨基酸通过共价键与所述异源多肽的C端的最后一个氨基酸直接连接。如本发明所用，术语“间隔子”也称为“接头”，是指将本公开的sdAb连接至异源多肽的至少一个氨基酸的序列。这种间隔子可用于防止空间位阻。接头的实例具有以下序列：(Gly3-Ser)4、(Gly3-Ser)、Ser-Gly或(Ala-Ala-Ala)。

在一些实施方式中，目标化合物可以是包含另一个或相同抗原结合结构域的一种或多种多肽。尤其是，目标化合物可以是或不是本文公开的一个或多个纳米抗体。所得的包含两个或更多个抗原结合结构域(尤其是包含两个或更多个纳米抗体，或基本上由两个或更多个纳米抗体组成)的融合蛋白或多肽，在本文中称为“多价”多肽或抗原结合化合物。在一些实施方案中，所述融合蛋白或多肽可包含至少一个具有如本文所述的第一结合结构域的纳米抗体和至少一个其他结合结构域(例如抗相同或另一表位、抗原、靶标、蛋白质或多肽)，其通常也是纳米抗体。“多特异性”(融合)多肽是指包含至少两个不同抗原结合结构域(即靶向不同表位、抗原或靶标)的多肽，其与包含类似抗原结合结构域的多肽相反，尤其是包含相同的单一区域抗体的多肽(“单特异性”(融合)多肽)。

在一些实施方案中，一个或多个另外的结合结构域可包含常规链抗体(且特别是人抗体)和/或重链抗体的一个或多个部分、片段或结构域。例如，本文定义的纳米抗体可任选地通过接头序列与常规(通常地，是人)VH或VL连接。

本发明提供了包含前述纳米抗体、核酸分子、载体、宿主细胞或抗体偶联物的产品。

所述产品可以是任何形式，包括但不限于试剂、试剂盒或芯片。

本发明提供了前述纳米抗体、核酸分子、载体、宿主细胞、抗体偶联物或产品在检测、富集或纯化肉毒毒素中的应用。

本发明提供了前述纳米抗体、核酸分子、载体、宿主细胞或抗体偶联物在制备诊断肉毒毒素引起的病症的药物中的应用。

本发明还提供了一种检测、富集或纯化肉毒毒素特别是A型肉毒毒素的方法，所述方法包括将包含肉毒毒素特别是A型肉毒毒素的样品与前面所述的纳米抗体或前面所述的抗体接触。

本发明还提供了前面所述的纳米抗体在制备治疗肉毒毒素引起的病症的药物中的应用。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，优先参考本发明中给出的指引，还可以按照本领域的实验手册或常规条件，还可以参考本领域已知的其它实验方法，或者按照制造厂商所建议的条件。

下述的具体实施例中，涉及原料组分的量度参数，如无特别说明，可能存在称量精度范围内的细微偏差。

实施例一 天然骆驼VHH文库的获取

一、材料

骆驼L9的外周血 100 mL；骆驼淋巴细胞分离液为天津市灏洋生物制品科技有限责任公司产品；RNA Easy Fast动物组织/细胞总RNA提取试剂盒和FastKing cDNA 第一链合成试剂盒为天根生化科技有限公司产品；PCR Primer Max酶为TAKARA公司产品；基因测序由苏州金唯智生物科技有限公司完成；其它相关试剂均为市购。

二、方法和结果

1、骆驼L9外周血的获取

采用EDTA涂层的采血管从骆驼颈静脉收集100 mL血液，倒置两次防止凝血，将血液样本转移到实验室。

2、淋巴细胞的分离

采用15 ml离心管，按照分离液5 mL，血液5 mL，室温600 g离心25 min。离心后，离心管由上至下分为四层。第一层为血浆层，第二层为环状乳白色骆驼淋巴细胞层，第三层为透明分离液层，第四层为红细胞层。小心吸取骆驼淋巴细胞，加入新的50 mL离心管中，加入清洗液，250 g离心15 min，弃去上清。重复清洗两遍，重悬所得细胞为骆驼淋巴细胞。

3、天然VHH文库的调取

取上述淋巴细胞6×10⁷按照RNA Easy Fast动物组织/细胞总RNA提取试剂盒说明书操作获得总RNA，按照FastKing cDNA 第一链合成试剂盒说明书，获得cDNA文库。

利用引物CALL001（5’-GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG-3’）和CALL002（5’-GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC-3’）扩增来自cDNA的所有免疫球蛋白重链（VH，VHH）的可变区结构域，经琼脂糖凝胶电泳，约1000bp的片段代表常规重链抗体，约750bp的片段代表仅重链抗体即纳米抗体；胶回收750bp处的片段，获得纯化的DNA片段。利用引物VHH-Back（5’- CCGTGGCCCAGGCGGCCGTCCTGGCTGCTCTTCTACA -3’ ）和VHH-For（5’-TGCTGGCCGGCCTGGCCTGAGGAGAYGGTGACCWGGGT -3’ ）进行巢式PCR，最终获得纳米抗体的基因文库。

实施例二 天然骆驼VHH噬菌体文库的构建

一、材料

天然纳米抗体的基因文库；PCR Primer Max酶为TAKARA公司产品；T4 DNA连接酶为NEB公司产品；基因测序由苏州金唯智生物科技有限公司完成；其它相关试剂均为市购。

二、方法和结果

1、纳米抗体库构建

a）纳米抗体文库片段酶切，连接pComb3XTT载体：

纳米抗体库PCR产物 10 μL

Shif I 1 μL

Cutstmart 5 μL

无菌水补足总体积为 50 μL

上述体系在37℃孵育6 h，经普通DNA产物纯化试剂盒进行回收。

b) 上述酶切产物，连接pComb3XTT载体：

纳米抗体库PCR产物 1 μL

pComb3XTT载体 5 μL

T4连接酶 1 μL

T4 Buffer 1 μL

无菌水补足总体积为 10 μL

16℃连接过夜，连接产物电转化TG1大肠杆菌，涂布在含有100 μg/mL氨卞青霉素（终浓度）和2%葡萄糖的2YT琼脂培养基上。同时进行梯度稀释，获得滴定板计算库容量，挑取单克隆菌落进行测序。获得的噬菌体纳米抗体库菌在含有100 μg/mL氨卞青霉素（终浓度）的2%葡萄糖的2YT液体培养基中培养过夜，用PEG沉淀的方法获得噬菌体纳米抗体库。

纳米抗体文库经过酶切，酶连等分子生物学技术构建至噬菌体载体上，噬菌体纳米抗体库菌落经过测序鉴定多序列比对，鉴定库质量；噬菌体库经扩增、PEG沉淀，成功获得噬菌体纳米抗体库，用于后续筛选。

实施例三 抗A型肉毒毒素纳米抗体的噬菌体天然纳米抗体库筛选

一、材料

噬菌体天然纳米抗体库；A型肉毒毒素抗原(BoNT/A-HC)；PBS；Tween-20；TG1；辣根酶标记的抗M13抗体；其他试剂为市购产品。

二、方法

1、淘洗

1.1 10 μg/mL无菌PBS稀释BoNT/A-HC抗原包被免疫管，500 μL每管，4℃包被过夜（抗原总量为5 μg）。

1.2 弃去抗原溶液，加入无菌PBST配置的4%牛奶，室温封闭1 h。同时准备500 μL4%牛奶稀释的噬菌体抗体库5×10¹² cfu室温孵育1 h。

1.3 在封闭的同时，接种200 μL TG1至50 mL 2YT液体培养基中，培养至OD600为0.8。

1.4 弃去牛奶, 在免疫管中加入500 μL 封闭后的噬菌体溶液，室温孵育1 h。

1.5 PBST洗管15次，然后用PBS洗管10次。

1.6 500 μL 0.1 M HCL-Gly洗脱噬菌体，室温洗脱10 min（中间轻微晃动以检查）。加入100 μL 1 M Tris-HCl，以调整洗脱液pH值至pH 7.5。

1.7 再次使用500 μL 0.1 M HCL-Gly洗脱噬菌体，室温10 min，将二次洗脱液加入第一次洗脱液和Tris的混合溶液中。

1.8 将上述获得的噬菌体取500 μL加入10 mL对数生长期的TG1中，37℃静置培养0.5 h。

1.9 4000 rpm 20℃离心15 min。

1.10 弃去上清，将所有沉淀涂布于2YTAG（2YT+Amp 100 μg/mL+ 2%葡萄糖）平板（15 cm大平板）上，37℃培养过夜。

1.11 将所有TG1菌株从平板上刮下后加入至50 mL 2YTAG（2YT+Amp 100 μg/mL +2%葡萄糖）培养中，37℃，220 rpm培养2.5 h使OD值达到约0.1。

1.12菌株生长到达对数期后取10 mL，在其中加入20~200 μL M13KO7辅助噬菌体，37℃静置培养0.5h。

1.13 4000 rpm 20℃离心15 min。

1.14 弃去上清，50 mL 2YTAK（2YT+Amp 100 μg/mL+Kana 70 μg/mL）培养基重悬，28℃震荡培养过夜。

1.15 如上所述沉淀噬菌体进行下一轮淘洗，共进行3轮淘洗，富集挑取单克隆进行ELISA验证。

2、ELISA方法分析单克隆噬菌体

2.1 在96深孔板中生产单克隆噬菌体

2.1.1 40 μL TG1接种于10 mL新鲜 2YT 培养基中, 37℃ 220 rpm 培养3 h。

2.1.2 将洗脱后的噬菌体500 μL加入10 mL TG1中，37℃ 孵育0.5 h。

2.1.3 将感染后的菌液十倍倍比稀释(10^-1，10^-2…10^-8)于2YT培养基中，每个稀释样品取50 μL，涂布于2YTAG（2YT+Amp 100 μg/mL）固体培养基上，37℃过夜。

2.1.4 96孔深板中每孔加入900 μL 2YTAG（2YT+Amp 100 μg/mL）培养基，每个平板挑取单克隆，在96孔深板中37℃，220 rpm，培养4 h。

2.1.5 每孔吸出100 μL与96孔板保存，用于后续测序。

2.1.6 每孔加入10倍稀释的M13KO7 100 μL （1.2 mL M13KO7辅助噬菌体+12 mL2YT培养基），37℃静置孵育0.5 h。

2.1.7 96孔深板1800 rmp 4℃离心15 min。

2.1.8 弃去上清，板子置于28℃摇动10 min。

2.1.9 每孔加入1 mL新鲜的2YTAK（2YT+Amp 100 μg/mL + Kana 70 μg/mL）培养基，28℃培养过夜。

2.1.10 96孔深板1800 rmp 4℃离心15 min，获得单克隆噬菌体上清。

2.2 ELISA验证

2.2.1 板条中包被A型肉毒毒素抗原、阴性对照和阳性对照，4℃包被过夜。

2.2.2 每孔加入200 μL PBSM（PBS配置的4%脱脂牛奶）室温封闭1 h。

2.2.3 弃去孔内溶液后每孔加入100 μL 噬菌体，室温孵育1 h。

2.2.4 0.1% Tween-20去离子水配置洗液洗板3次。

2.2.5 每孔加入100 μL anti-M13/HRP抗体（1:5000 稀释），室温孵育45 min。

2.2.6 0.1% Tween-20去离子水配置洗液洗板5次。

2.2.7 每孔加入100 μL TMB显色。

2.2.8 加入中止液后酶联仪测OD450 nm。

筛选与抗原结合的抗体，命名为A1；对纳米抗体A1进行测序，测序鉴定结果如下：

抗体A1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，其中 CDR1-3的氨基酸序列分别如SEQID NO:2-4所示。FR1-4的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:5-8所示。

实施例四 抗A型肉毒毒素纳米抗体的表达及性质评价

一、材料

真核表达载体pFRT-IgG1由本室保存；引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成；转染试剂为Invitrogen公司产品，羊抗人IgG、及辣根酶标记的羊抗人IgG购自Thermo；内切酶为NEB公司产品；质粒提取试剂盒购自天根生化科技有限公司；CHO细胞购自ATCC；CD-1小鼠购自维通利华，其他试剂为市购产品。

二、方法

1、抗体的表达

1.1 抗体真核表达载体的构建

pFRT-IgG1是含有人IgG1抗体恒定区基因的高效表达载体。将实施例二所述获得的纳米抗体基因克隆载体用相应的内切酶消化（纳米抗体基因用Nhe I和Xho I消化）后，依次与经相同内切酶消化的载体连接，获得真核表达载体。具体实施如下：

1.1.1 如实施例二所述，获得的纳米抗体基因经PCR获得带有酶切位点的目的片段；

1.1.2 取 PCR产物用Nhe I 和 Xho I消化；

1.1.3 取1 μg pFRT-IgG1载体，用Nhe I和Xho I消化。用DNA连接酶T4连接所得的经Nhe I及Xho I消化的pFRT-IgG1载体和用Nhe I及Xho I消化的 PCR产物。连接产物转化TOP10大肠杆菌，涂布在含有100 μg/mL氨卞青霉素（终浓度）的LB琼脂培养基上。获得的克隆在含有100 μg/mL氨卞青霉素（终浓度）的LB液体培养基中培养，用质粒提取试剂盒（天根生化科技有限公司）提取质粒。所提取的质粒经Nhe I和Xho I消化后，用1%琼脂糖凝胶电泳分析，选择一个携带有纳米抗体A1基因的克隆。

作为上述程序的结果，获得的携带A型肉毒毒素纳米源抗体A1基因的质粒。

1.2 纳米抗体的表达

将获得的携带A型肉毒毒素纳米源抗体A1基因的质粒，通过脂质体介导的方法瞬时转染至CHO细胞，8天后收获上清，利用羊抗人IgG以及辣根酶标记的羊抗人IgG进行双夹心ELISA法检测上清中抗体的含量。利用Mabselect Sure亲和层析柱纯化抗体。利用SDS-PAGE电泳检测纯化后抗体，结果表明抗体表达成功。

2、Biacore检测纳米抗体的亲和力

2.1步骤：

a） 开机

Biacore T200按照操作手册进行开机。

b） 样品稀释

将10·HBS-EP+（pH7.4）用去离子水稀释10倍，配制200mL。用运行缓冲溶液稀释抗体至0.3μg/mL，样品BoNT/A-HC稀释浓度为80nM，40nM，20nM，10nM，5nM，2.5 nM，1.25 nM，0.625 nM，0.3125nM。

c） 样品检测并分析

运行Kinetics/Affinity程序进行测定并分析结果。

2.2结果

结果如图1所示，纳米抗体与抗原结合的KD（M）为3.62E-10。

3、ELISA检测纳米抗体的亲和力

3.1方法

利用ELISA法检测纳米抗体A1与BoNT/A-HC的结合。BoNT/A蛋白包被后，依次与梯度稀释的A1和特异性HRP标记抗人多抗孵育，利用TMB法显色并测定吸光度值。

3.2结果

结果如图2所示，纳米抗体A1能够特异性识别BoNT/A-HC，与BoNT/A-HC的结合呈剂量依赖性，且纳米抗体A1结合BoNT/A-HC的EC50值为0.0544 μg/mL。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (11)

1.一种抗肉毒素的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体包含重链可变区CDR1、CDR2、CDR3，所述CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:2、3、4所示。

2.根据权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

3.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包含编码权利要求1-2任一项所述的纳米抗体的核苷酸序列。

4.一种载体，其特征在于，包含权利要求3所述的核酸分子。

5.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含权利要求3所述的核酸分子，或包含权利要求4所述的载体。

6.一种抗体偶联物，其特征在于，所述抗体偶联物含有：

权利要求1-2任一项所述的纳米抗体，以及任选地

选自下组的偶联部分：核酸、多肽或蛋白质。

7.一种抗体偶联物，其特征在于，所述抗体偶联物含有：

权利要求1-2任一项所述的纳米抗体，以及任选地

选自下组的偶联部分：病毒或毒素。

8.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含：

权利要求1-2任一项所述的纳米抗体、权利要求3所述的核酸分子、权利要求4所述的载体、权利要求5所述的宿主细胞或权利要求6-7任一项所述的抗体偶联物。

9.权利要求1-2任一项所述的纳米抗体、权利要求3所述的核酸分子、权利要求4所述的载体、权利要求5所述的宿主细胞、权利要求6-7任一项所述的抗体偶联物或权利要求8所述的试剂盒在制备检测、富集或纯化肉毒素产品中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，检测、富集或纯化肉毒素的方法包括将包含肉毒素的样品与权利要求1-2任一项所述的纳米抗体接触。

11.权利要求1-2任一项所述的纳米抗体、权利要求3所述的核酸分子、权利要求4所述的载体、权利要求5所述的宿主细胞、权利要求6-7任一项所述的抗体偶联物在制备诊断肉毒素引起的肉毒素中毒的药物中的应用。