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CN117059161B - 一种筛选蜂胶提取物中抗肌少症成分的方法及应用 - Google Patents

一种筛选蜂胶提取物中抗肌少症成分的方法及应用

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CN117059161B
CN117059161B CN202310991149.XA CN202310991149A CN117059161B CN 117059161 B CN117059161 B CN 117059161B CN 202310991149 A CN202310991149 A CN 202310991149A CN 117059161 B CN117059161 B CN 117059161B
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Abstract

本发明公开了一种筛选蜂胶提取物中抗肌少症成分的方法及应用，过程包括：蜂胶提取物作用靶点基因筛选；肌少症的基因靶点的获取；绘制VEN NY图，导入STRING数据库，得到蛋白间的相互作用信息，将STRING数据库中获得的数据导入Cytoscape3.9.1软件得到每个靶点的Degree值；PE作用于肌少症的靶点基因富集分析；分子对接；通过D‑gal诱导的C2C12细胞模型验证预测结果；通过该方法，发现蜂胶提取物中的有效成分为芹菜素，发现了芹菜素对肌少症的防治作用，为临床上肌少症的治疗提供了理论基础。

Description

一种筛选蜂胶提取物中抗肌少症成分的方法及应用
技术领域
本发明涉及肌少症药物研发技术领域，更具体地说是涉及一种筛选蜂胶提取物中抗肌少症成分的方法及应用。
背景技术
蜂胶具有多种生物活性，包括抗菌、抗氧化、抗炎等，因此被广泛应用于功能性食品和药物中。研究表明，蜂胶醇提取物可以缓解衰老小鼠的肌肉萎缩，因此具有潜在的优势用于缓解肌少症。
但是，目前还没有特效药被批准用于治疗肌少症，因此寻找新的治疗肌少症的药物具有重要意义。天然产物是发现新药的一个很有希望的来源。作为一种重要的功能性食品和药物，蜂胶自古以来就被广泛使用。蜂产品富含类黄酮、酚类和氨基酸等多种成分，具有多种药理活性如：抗衰老、抗炎、抗癌、抗菌等，已被用于治疗多种易引起肌少症的慢性病如：高血压、糖尿病、心血管疾病和癌症。由于具有促进健康的作用，蜂胶在许多国家被广泛用作膳食补充剂。肌少症是一个公共卫生问题，它会导致老年人活动能力逐渐下降，增加老年人跌倒和住院的风险。因此，确定蜂胶对肌少症的作用机制并发现其中的有效成分具有重要意义。我们前期的研究发现蜂胶提取物可以通过调节肌肉蛋白代谢和激素水平缓解衰老小鼠的肌肉萎缩。然而，由于蜂胶组成成分复杂，其作用于肌少症的有效成分及其作用机制尚未完全明确。
因此，如何筛选蜂胶提取物中抗肌少症的成分，并将其核心成分应用于制备抗肌少症的药物中是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明通过网络药理方法对蜂胶提取物缓解肌少症的活性成分和作用机制进行预测，并将获得的主要成分与关键靶点进行分子对接验证，最后通过D-gal诱导的C2C12细胞模型验证了预测结果，发现蜂胶提取物中芹菜素为抗肌少症的核心成分，为肌少症的防治提供了理论依据。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种筛选蜂胶提取物中抗肌少症成分的方法，过程包括：
(1)蜂胶提取物作用靶点基因筛选；
(2)肌少症的基因靶点的获取；
(3)使用BioVenn在线平台获得药物靶点与疾病靶点交集靶点并绘制V ENNY图，然后将交集靶点导入STRING数据库，将物种限制为Homo sapie ns，最低要求的作用值设置为medium confidence，得到蛋白间的相互作用信息，将STRING数据库中获得的数据导入Cytoscape3.9.1软件得到每个靶点的Degree值；
(4)将交集靶点输入DAVID数据库，物种限定为Homosapiens，进行G O功能富集分析和KEGG通路富集。以P<0.05为基本标准，筛选GO功能富集分析通路，以条形图的形式展示结果；以P<0.01为基本标准，筛选KEGG功能富集分析通路，以气泡图的形式展示结果；将GO富集分析结果、交集靶点和交集靶点对应的蜂胶提取物成分信息导入Cytoscape3.9.1软件进行拓扑分析，构建PE“成分-靶点-通路”网络，根据Degree网络拓扑参数判断PE的核心靶点和主要活性成分；
(5)在PubChem数据库下载PEE成分中的主要活性成分和核心靶点蛋白的3D结构，通过AutoDock软件进行分子对接，根据低能量和构象合理的原则选择最佳对接构象，并计算PEE主要活性成分与核心靶点的结合能力；
(6)通过D-gal诱导的C2C12细胞模型验证预测结果。
优选地，蜂胶提取物作用靶点基因筛选具体为：依据蜂胶提取物的成分信息，从PubChem数据库获取其InChI结构信息。将这些信息输入BATMA N数据库，“Scorecutoff”设置为20，P-value设置为0.05，确定PE成分的作用靶点。
优选地，肌少症的基因靶点的获取具体为：在DisGeNET数据中输入“Sa rcopenia”限定物种为“Homo sapiens”，获得Sarcopenia的基因靶点。
优选地，通过D-gal诱导的C2C12细胞模型验证预测结果具体为：
C2C12细胞中加入生长培养基(高糖DMEM培养基+10％胎牛血清)，于37℃，5％CO2的恒温培养箱中孵育。培养细胞至85％左右，收集细胞并分组，分为对照组(Ctrl)、衰老模型组(D-gal)、筛选成分组(D-gal+Screen ing components)；随后将各组培养基换为分化培养基(高糖DMEM培养基+2％马血清)，根据试验目的，在试验结束前向生长/分化培养基中添加D-gal、筛选得到的成分等药物处理，衰老模型组向培养基中加浓度为111mM的D-gal，处理时间为48h，筛选成分组先向培养基中加2.5μM筛选成分组处理24h，之后换成含111mM的D-gal的培养基处理48h，然后CCK-8检测不同组细胞的活力，Western Blotting检测筛选靶点对衰老细胞模型的作用效果。
作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护任一所述的方法筛选到的有效成分在制备抗肌少症药物中的应用；其中，所述有效成分为芹菜素。
优选地，芹菜素促进衰老C2C12细胞的增殖和分化。
优选地，芹菜素下调衰老C2C12细胞中EGFR、IFNγ、TNFα和IL6蛋白的表达。
优选地，芹菜素抑制衰老C2C12细胞中JAK-STAT信号通路的激活。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明通过网络药理方法对蜂胶提取缓解肌少症的活性成分和作用机制进行预测，并将获得的主要成分与关键靶点进行分子对接验证，最后通过D-gal诱导的C2C12细胞模型验证了预测结果，发现蜂胶提取物中的有效成分为芹菜素，并发现了芹菜素新的应用，为芹菜素进一步用于肌少症的防治提供理论依据。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为PPI网络构建与核心靶点筛选图；其中，A：蜂胶提取物-肌少症交集靶点的韦恩图；B：蜂胶提取物-肌少症交集靶点蛋白互作网络；
图2附图为交集靶点的GO和KEGG通路分析图；A：蜂胶提取物-肌少症交集靶点的GO富集分析；B：蜂胶提取物-肌少症交集靶点的KEGG通路富集分析；C：“成分-靶点-通路”网络绿色、黄色和蓝色分别代表成分、交集靶点和信号通路；
图3附图为芹菜素与TNFα和IL6的分子对接结果；A为Ap与TNFα蛋白的对接结果；B为Ap与IL6的对接结果；
图4附图为芹菜素对衰老C2C12细胞增殖和分化的影响；A：芹菜素的结构式；B：芹菜素对D-gal诱导C2C12细胞活力的影响；C：芹菜素对D-g al诱导C2C12细胞分化标志蛋白的影响；D：芹菜素处理D-gal诱导C2C12细胞的倒置光学显微镜形态学变化；
图5附图为芹菜素对衰老C2C12细胞中EGFR、IFNγ、TNFα和IL6表达的影响；
图6附图为芹菜素抑制衰老C2C12细胞中JAK-STAT信号通路的激活。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1蜂胶提取物中抗肌少症的成分的预测
(1)PE成分作用靶点及肌少症(Sar)的靶点的获取
(2)依据蜂胶提取物(Propolis Extract，PE)的成分信息，从PubChem数据库获取其InChI结构信息。将这些信息输入BATMAN数据库，“Scorecut off”设置为20，P-value设置为0.05，确定PE成分的作用靶点，在DisGeNE T数据中输入“Sarcopenia”限定物种为“Homosapiens”，获得Sarcopenia的基因靶点。具体为：
将蜂胶提取物(PE)的20种成分(表1)通过BATMAN数据库筛选后，共得到15种有效活性成分，将成分间的重复靶点删除后得到155个靶点。整合DisGeNET数据库中收集到的疾病靶点，进行去重整理，共收集得到164个肌少症疾病靶点。
表1试验中PE的组成成分及含量
(2)PPI网络构建与核心靶点筛选
使用BioVenn在线平台获得药物靶点与疾病靶点交集靶点并绘制VENN Y图。然后将交集靶点导入STRING(https://www.string-db.org/)数据库，将物种限制为人类(“Homosapiens”)，最低要求的作用值设置为：medium confidence，得到蛋白间的相互作用信息，将STRING数据库中获得的数据导入Cytoscape3.9.1软件得到每个靶点的Degree值；Venn分析(图1A)得到的12个交集靶点。通过这些靶点构建的PPI网络具有12个节点的42个交互关系(连接)(图1B)。各个靶点Degree值和betweenness centrality(BC)信息见表2。
表2PPI网络中交叉靶点的拓扑特性
(3)GO和KEGG通路分析
将交集靶点输入DAVID数据库，物种限定为“Homosapiens”，进行GO功能富集分析和KEGG通路富集。以P<0.05为基本标准，筛选GO功能富集分析通路，以条形图的形式展示结果。以P<0.01为基本标准，筛选KEGG功能富集分析通路，以气泡图的形式展示结果。将GO富集分析结果、交集靶点和交集靶点对应的蜂胶提取物成分信息导入Cytoscape3.9.1软件进行拓扑分析，构建PEE“成分-靶点-通路”网络。根据Degree网络拓扑参数判断PEE的核心靶点和主要活性成分。如图2A，GO分析包括生物学过程、分子功能和细胞组分3个方面，分别得到10，4，2个条目。对于生物学过程，主要与“炎症反应的正向调节”(Positive regulationof inflammatory response)相关的基因显着富集。对于细胞组分，靶点与“细胞外空间”(Extracellular space)密切相关。对于分子功能，主要与“细胞因子活动”(Cytokineactivity)相关的基因显着富集。KEGG通路得到30种通路(图2B)，主要通路如下：癌症通路(Pathways in cancer)、JAK-STAT信号传导通路(JAK-STAT signa ling pathway)、炎症性肠病(Inflammatory bowel disease)、冠状病毒病COVID-19(Coronavirus diseaseCOVID-19)、查加斯病(Chagas disease)、细胞因子-细胞因子受体的相互作用(Cytokine-81cytokine receptor interaction)。随后，通过Cytoscape3.9.1软件建立“成分-靶点-通路”网络(图2C)。将Degree值排序最高的确定为PE缓解肌少症的核心成分和核心靶点，根据表3所示，芹菜素(Apigenin，Ap)可判断为核心成分，TNFα与IL-6为主要核心靶点。
表3 CTP网络的拓扑特性
(4)分子对接验证
将筛选出的主要核心成分与核心靶点进行分子对接。结果如图3所示Ap与TNFα蛋白的结合能为-4.09Kcal/mol，结合位点位于TNFα的“口袋”中。Ap与TNFα的ARG-63形成一个长度为的氢键。Ap与IL-6的结合能力为-3.46Kcal/mol。Ap与IL-6的Glu-30形成三个长度为的氢键。这些结果说明Ap可以与TNFα与IL-6紧密结合，这可能是PE缓解肌少症的主要依据。
实施例2验证芹菜素对抗肌少症的作用
实验过程：C2C12细胞中加入生长培养基(高糖DMEM培养基+10％胎牛血清)，于37℃，5％CO2的恒温培养箱中孵育。培养细胞至85％左右，收集细胞并分组，分为对照组(Ctrl)、衰老模型组(D-gal)、筛选成分组(D-gal+Screening components)。随后将各组培养基换为分化培养基(高糖DM EM培养基+2％马血清)，根据试验目的，在试验结束前向生长/分化培养基中添加D-gal、筛选得到的成分等药物处理。衰老模型组向培养基中加浓度为111mM的D-gal，处理时间为48h。筛选成分组先向培养基中加2.5μM筛选成分组处理24h，之后换成含111mM的D-gal的培养基处理48h，以CCK-8检测不同组细胞的活力，WesternBlotting检测筛选靶点对衰老细胞模型的作用效果；结果为：
1、芹菜素(Apigenin)对衰老C2C12细胞增殖和分化的影响
芹菜素结构式如图4A所示，采用CCK-8检测Ap对D-gal诱导的C2C12细胞活力的影响。结果发现2.5μM的芹菜素处理显著增加了D-gal诱导的C2C12细胞的活力(P<0.05)(图4B)。显微镜观察也看到2.5μM的Ap处理显著增加了细胞的数量(图4D)。此外，我们还发现在分化培养基中添加2.5μM的Ap显著增加了C2C12细胞分化标记蛋白MyoD1和Myogenin的表达(P<0.01)(图4C)。显微镜观察也发现2.5μM的Ap处理显著的增加了融合肌管的数量(图4D)。这些结果说明Ap能促进衰老C2C12细胞的增殖和分化，Ap可能是PEE中缓解肌少症的有效成分。
2、芹菜素(Apigenin)下调衰老C2C12细胞中EGFR、IFNγ、TNFα和I L6蛋白的表达
该实验检测了Ap对“成分-靶点-通路”网络中Degree值排名前4(表3)的靶点蛋白表达的影响。Western blotting结果表明D-gal处理显著增加了C2C12细胞中EGFR、IFNγ、TNFα和IL6蛋白的表达(P<0.01)，而添加2.5μM的芹菜素则显著降低了细胞中EGFR、IFNγ、TNFα和IL6蛋白的表达(P<0.05)(图5)。
3、芹菜素(Apigenin)抑制衰老C2C12细胞中JAK-STAT信号通路的激活
根据KEGG分析结果，推测JAK-STAT信号通路可能是参与PEE缓解肌少症一个关键通路。因此，检测了PEE中的核心成分Ap对D-gal诱导的C2C12细胞JAK-STAT信号通路的影响。如图6所示，与对照组相比，D-gal组的JAK2和STAT3磷酸化水平均显著升高(P<0.01)，说明D-gal激活了C2C12细胞中的JAK-STAT信号通路。然而，与单加D-gal组相比，添加2.5μM的Ap后，JAK2和STAT3磷酸化水平均显著降低(P<0.01)，说明芹菜素可以抑制衰老C2C12细胞中的JAK-STAT信号通路的激活。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (6)

1.一种筛选蜂胶提取物中抗肌少症成分的方法，其特征在于，过程包括：
（1）蜂胶提取物作用靶点基因筛选；
（2）肌少症的基因靶点的获取；
（3）使用BioVenn在线平台获得药物靶点与疾病靶点交集靶点并绘制VENNY图，然后将交集靶点导入STRING数据库，将物种限制为Homo sapiens，最低要求的作用值设置为medium confidence，得到蛋白间的相互作用信息，将STRING数据库中获得的数据导入Cytoscape3.9.1软件得到每个靶点的Degree值；
（4）将交集靶点输入DAVID数据库，物种限定为Homosapiens，进行GO功能富集分析和KEGG通路富集；以P<0.05为基本标准，筛选GO功能富集分析通路，以条形图的形式展示结果；以P<0.01为基本标准，筛选KEGG功能富集分析通路，以气泡图的形式展示结果；将GO富集分析结果、交集靶点和交集靶点对应的蜂胶提取物成分信息导入Cytoscape3.9.1软件进行拓扑分析，构建PE“成分-靶点-通路”网络，根据Degree网络拓扑参数判断PEE的核心靶点和主要活性成分；
（5）在PubChem数据库下载PEE成分中的主要活性成分和核心靶点蛋白的3D结构，通过AutoDock软件进行分子对接，根据低能量和构象合理的原则选择最佳对接构象，并计算PEE主要活性成分与核心靶点的结合能力；
（6）通过D-gal诱导的C2C12细胞模型验证预测结果；
步骤（1）中，蜂胶提取物作用靶点基因筛选具体为：依据蜂胶提取物的成分信息，从PubChem数据库获取其InChI结构信息；将这些信息输入BATMAN数据库，“Scorecutoff”设置为20，P-value设置为0.05，确定PE成分的作用靶点；
步骤（6）中，通过D-gal诱导的C2C12细胞模型验证预测结果具体为：
C2C12细胞中加入生长培养基，所述生长培养基的组成为高糖DMEM培养基+10%胎牛血清，于37℃，5%CO2的恒温培养箱中孵育；培养细胞至85%左右，收集细胞并分组，分为对照组（Ctrl）、衰老模型组（D-gal）、筛选成分组（D-gal+Screening components）；随后将各组培养基换为分化培养基，所述分化培养基的组成为高糖DMEM培养基+2%马血清，根据试验目的，在试验结束前向生长/分化培养基中添加D-gal、筛选得到的成分等药物处理，衰老模型组向培养基中加浓度为111mM的D-gal，处理时间为48h，筛选成分组先向培养基中加2.5μM筛选成分组处理24h，之后换成含111mM的D-gal的培养基处理48 h，然后CCK-8检测不同组细胞的活力，Western Blotting检测筛选靶点对衰老细胞模型的作用效果。
2.根据权利要求1所述的一种筛选蜂胶提取物中抗肌少症成分的方法，其特征在于，肌少症的基因靶点的获取具体为：在DisGeNET数据中输入“Sarcopenia”限定物种为“Homosapiens”，获得Sarcopenia的基因靶点。
3.权利要求1-2任一所述的方法筛选到的有效成分在制备抗肌少症药物中的应用；其中，所述有效成分为芹菜素。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，芹菜素促进衰老C2C12细胞的增殖和分化。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，芹菜素下调衰老C2C12细胞中EGFR、IFNγ、TNFα和IL6蛋白的表达。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，芹菜素抑制衰老C2C12细胞中JAK-STAT信号通路的激活。
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