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CN116334168A - 筛选具有改善肌少症作用的植物提取物的方法 - Google Patents

筛选具有改善肌少症作用的植物提取物的方法 Download PDF

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CN116334168A CN202310567564.2A CN202310567564A CN116334168A CN 116334168 A CN116334168 A CN 116334168A CN 202310567564 A CN202310567564 A CN 202310567564A CN 116334168 A CN116334168 A CN 116334168A
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史仍飞
李涛
王茹
田向阳
于芳芳
李婷婷
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Shanghai University of Sport
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Abstract

一种筛选具有改善肌少症作用的植物提取物的方法，属于治疗肌少症药物领域。筛选方法包括以下步骤：将植物提取物灌喂实验动物后进行采血得到样品血样，对样品血样分离血清得到样品血清；将生理盐水灌喂实验动物后进行采血得到对照血样，对对照血样分离血清得到对照血清；将C2C12成肌细胞培养后进行诱导分化成肌管状态；采用D‑半乳糖对肌管状态的C2C12成肌细胞进行干预得到衰老的C2C12成肌细胞；将含有样品血清的第一培养基与含有对照血清的第二培养基进行干预衰老的C2C12成肌细胞，通过对比干预后的衰老的C2C12成肌细胞的指标筛选出具有改善肌少症作用的植物提取物。其能够有效地筛选出能够改善肌少症的植物提取物。

Description

筛选具有改善肌少症作用的植物提取物的方法
技术领域
本申请涉及治疗肌少症药物领域，具体而言，涉及一种筛选具有改善肌少症作用的植物提取物的方法。
背景技术
人体衰老过程中常伴随的一系列问题症候群，其中最为明显的即为肌肉减少症，这是一种与增龄相关的疾病，以肌肉量减少、肌力进行性下降、躯体功能减退为特征的临床综合征，可导致机体活动能力降低、身体残疾、生活质量下降，可能会增加跌倒风险、甚至导致死亡等不良后果，肌少症已经成为危害老年人健康最重要的慢性病之一。
肌少症的预防和管理已被公认为一个亟待解决的全球性问题。截至目前，临床实践中用于肌少症的治疗方案包括补充营养物质与运动训练两种方式，但运动训练对于肌少症人群实施较为困难。近年来已有大量植物提取物被验证并应用于肌少症，故建立有效的筛选方法筛选出能够达到理想增肌效果的物质对于防治肌少症极为重要。
发明内容
本申请提供了一种筛选具有改善肌少症作用的植物提取物的方法，其能够有效地筛选出能够改善肌少症的植物提取物。
本申请是这样实现的：
本申请提供一种筛选具有改善肌少症作用的植物提取物的方法，包括以下步骤：
将植物提取物灌喂实验动物后进行采血得到样品血样，对样品血样分离血清得到样品血清；将等量生理盐水灌喂实验动物后进行采血得到对照血样，对对照血样分离血清得到对照血清；
将C2C12成肌细胞采用生长培养基培养，培养后进行诱导分化成肌管状态；
采用D-半乳糖对肌管状态的C2C12成肌细胞进行干预得到衰老的C2C12成肌细胞；
将含有样品血清的第一培养基与含有对照血清的第二培养基分别进行干预衰老的C2C12成肌细胞，通过对比干预后的衰老的C2C12成肌细胞的指标筛选出具有改善肌少症作用的植物提取物；指标包括细胞形态、细胞线粒体呼吸功能水平、蛋白合成率和蛋白质合成信号表达情况中的至少一种。
在一种可能的实施方案中，细胞形态指标包括细胞数目和细胞体积；经第一培养基干预后的衰老的C2C12成肌细胞的细胞数目和细胞体积大于经第二培养基干预后的衰老的C2C12成肌细胞的细胞数目和细胞体积，则判定植物提取物具有改善肌少症作用。
可选地，经第一培养基干预后的衰老的C2C12成肌细胞的细胞数目与经第一培养基干预后的衰老的C2C12成肌细胞的细胞数目相差≥20％，经第一培养基干预后的衰老的C2C12成肌细胞的细胞体积与经第一培养基干预后的衰老的C2C12成肌细胞的细胞体积相差≥5％，则判定植物提取物具有改善肌少症作用。
在一种可能的实施方案中，经第一培养基干预后的衰老的C2C12成肌细胞的线粒体呼吸功能水平比经第二培养基干预后的衰老的C2C12成肌细胞的线粒体呼吸功能水平高，则判定植物提取物具有改善肌少症作用。
可选地，经第一培养基干预后的衰老的C2C12成肌细胞的线粒体呼吸功能水平与经第二培养基干预后的衰老的C2C12成肌细胞的线粒体呼吸功能水平相差≥20％，则判定植物提取物具有改善肌少症作用。
在一种可能的实施方案中，经第一培养基干预后的衰老的C2C12成肌细胞的蛋白合成率比经第二培养基干预后的衰老的C2C12成肌细胞的蛋白合成率高，则判定植物提取物具有改善肌少症作用。
可选地，经第一培养基干预后的衰老的C2C12成肌细胞的蛋白合成率与经第二培养基干预后的衰老的C2C12成肌细胞的蛋白合成率相差≥20％，则判定植物提取物具有改善肌少症作用。
在一种可能的实施方案中，蛋白质合成信号表达情况的测定包括以下步骤：分别提取经第一培养基、第二培养基干预后的衰老的C2C12成肌细胞的蛋白作为第一蛋白和第二蛋白，测试第一蛋白和第二蛋白的mTOR/P-mTOR值和Akt/P-Akt值，第一蛋白的mTOR/P-mTOR值和Akt/P-Akt值大于第二蛋白的mTOR/P-mTOR值和Akt/P-Akt值，则判定植物提取物具有改善肌少症作用。
可选地，第一蛋白的mTOR/P-mTOR值与第二蛋白的mTOR/P-mTOR值相差≥20％，第一蛋白的Akt/P-Akt值与第二蛋白的Akt/P-Akt值相差≥20％，则判定植物提取物具有改善肌少症作用。
在一种可能的实施方案中，第一培养基包括DMEM、青链霉素和10wt％的样品血清。
在一种可能的实施方案中，第二培养基包括DMEM、青链霉素和10wt％的对照血清。
在一种可能的实施方案中，其特征在于，D-半乳糖的浓度为20g/L。
在一种可能的实施方案中，衰老的C2C12成肌细胞的鉴定步骤包括：
采用D-半乳糖对肌管状态的C2C12成肌细胞进行干预后得到第一细胞样品；
采用生长培养基对肌管状态的C2C12成肌细胞进行培养后得到第二细胞样品；
将第一细胞样品和第二细胞样品分别进行β-半乳糖苷酶染色、观察总体细胞数目和细胞体积、检查衰老蛋白P16和P53表达情况来鉴定细胞衰老情况。
在一种可能的实施方案中，第一细胞样品的β-半乳糖苷酶染色结果为蓝色，第一细胞样品比第二细胞样品的细胞数目和细胞体积减小，衰老蛋白P16和P53的蛋白印迹结果升高，则判定第一细胞样品为衰老细胞。
本申请实施例的筛选具有改善肌少症作用的植物提取物的方法至少具有如下有益效果：
本申请应用C2C12成肌细胞，将其诱导分化成肌管状态，该过程在肌肉再生中起重要作用，它是通过一种高度协调的序列程序来产生成熟的骨骼肌的过程，然后再采用D-半乳糖对其进行干预得到衰老的细胞模型模拟肌肉减少症，通过含有样品血清的第一培养基与含有对照血清的第二培养基分别进行干预衰老的C2C12成肌细胞，通过对比干预后的衰老的C2C12成肌细胞的指标则能够有效地筛选出具有改善肌少症作用的植物提取物，且该方法避免了直接对具有肌少症的动物进行干预，时间成本会更低。
附图说明
图1为实施例1中第一培养基和第二培养基中的细胞情况；
图2为实施例1中第一培养基和第二培养基中的蛋白合成率情况；
图3为实施例1中第一培养基和第二培养基中的蛋白表达情况；
图4为实施例2中第一培养基和第二培养基中的蛋白合成率情况；
图5为实施例2中第一培养基和第二培养基中的蛋白表达情况；
图6为对比例1中第一培养基和第二培养基中的蛋白合成率情况；
图7为对比例1中第一培养基和第二培养基中的的蛋白表达情况。
具体实施方式
下面将结合实施例对本申请的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本申请，而不应视为限制本申请的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下针对本申请实施例进行具体说明：
本申请提供一种筛选具有改善肌少症作用的植物提取物的方法，包括以下步骤：
(1)将植物提取物灌喂实验动物后进行采血得到样品血样，对样品血样分离血清得到样品血清；将等量生理盐水灌喂实验动物后进行采血得到对照血样，对对照血样分离血清得到对照血清；
具体地，将植物提取物灌胃喂养实验动物(例如小鼠)2周，于末次灌胃后2h心脏采血，室温下静置4h，2400r/min离心10min，分离血清，0.22um微孔滤膜无菌过滤，得到样品血清，在-20℃冰箱保存备用。
普通小鼠以等量生理盐水灌胃，其余均与以上步骤相同，无菌过滤后得到对照血清，在-20℃冰箱保存备用。
(2)将C2C12成肌细胞采用生长培养基培养，培养后进行诱导分化成肌管状态。
具体地，将培养皿中的C2C12成肌细胞，以1*105密度，种于6孔板上，C2C12成肌细胞采用生长培养基培养，待C2C12细胞生长至汇合度为80％左右时，即可进行诱导分化。示例性地，以重量份数计，生长培养基包括90重量份的DMEM和10重量份的胎牛血清和1重量份的青链霉素。
诱导分化的具体步骤包括：丢弃旧培养基，用PBS清洗两次；换分化培养基(高糖DMEM+2％马血清+1％青链霉素)诱导，每孔2mL，然后置于CO2恒温培养箱中进行培养，培养箱温度为37°,空气占比95％，CO2占比5％，每24h换液一次，在显微镜下观察细胞形态和生长状况，诱导分化为肌管状态成功时，可以看见肌管表现为厚的管状结构，有时为多核。
(3)采用D-半乳糖对肌管状态的C2C12成肌细胞进行干预得到衰老的C2C12成肌细胞。
示例性地，每孔加入2mL浓度为20g/L的D-半乳糖培养液对肌管状态的C2C12成肌细胞进行干预。
其中，需要说明的是，是否得到衰老的C2C12成肌细胞需要进行鉴定，鉴定的步骤包括：
采用D-半乳糖对肌管状态的C2C12成肌细胞进行干预后得到第一细胞样品；
采用生长培养基对肌管状态的C2C12成肌细胞进行培养后得到第二细胞样品；
将第一细胞样品和第二细胞样品分别进行β-半乳糖苷酶染色、观察总体细胞数目和细胞体积、检查衰老蛋白P16和P53表达情况来鉴定细胞衰老情况。
其中，如果第一细胞样品的β-半乳糖苷酶染色结果为蓝色，第一细胞样品比第二细胞样品的总体细胞数目和细胞体积减小，衰老蛋白P16和P53的蛋白印迹结果升高，则判定第一细胞样品为衰老细胞。通过蛋白质印迹技术检查衰老蛋白P16、P53表达情况，衰老细胞会上调P16、P53相关蛋白表达，P16、P53蛋白印迹结果会明显升高。示例性地，总体细胞数目和细胞体积采用细胞计数仪进行测定。
(4)将含有样品血清的第一培养基与含有对照血清的第二培养基分别进行干预衰老的C2C12成肌细胞，通过对比干预后的衰老的C2C12成肌细胞的指标筛选出具有改善肌少症作用的植物提取物；指标包括细胞形态、细胞线粒体呼吸功能水平、蛋白合成率和蛋白质合成信号表达情况中的至少一种。
具体地，使用含有样品血清的第一培养基与含有对照血清的第二培养基分别干预衰老的C2C12成肌细胞，对照组使用生长培养基每孔2ml，进行培养干预24h后，去除干预培养基，然后进行测定。示例性地，以重量份数计，生长培养基包括90重量份的DMEM和10重量份的胎牛血清和1重量份的青链霉素；以重量份数计，第一培养基中含有90重量份DMEM、10重量份样品血清和1重量份青链霉素；以重量份数计，第二培养基中含有90重量份DMEM、10重量份对照血清和1重量份青链霉素。
进一步地，采用细胞计数仪对细胞形态进行测定，细胞形态指标包括细胞数目和细胞体积；经第一培养基干预后的衰老的C2C12成肌细胞的细胞数目和细胞体积大于经第二培养基干预后的衰老的C2C12成肌细胞的细胞数目和细胞体积，则判定植物提取物具有改善肌少症作用。
其中，经第一培养基干预后的衰老的C2C12成肌细胞的细胞数目和细胞体积大于经第二培养基干预后的衰老的C2C12成肌细胞的细胞数目和细胞体积，则说明第一培养基中的样品血清对应的植物提取对于衰老细胞具有促进生长的作用，因而可以判定植物提取物具有改善肌少症的作用。
示例性地，经第一培养基干预后的衰老的C2C12成肌细胞的细胞数目与经第一培养基干预后的衰老的C2C12成肌细胞的细胞数目相差≥20％，例如为20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％中的任一者或者任意两者之间的数值，经第一培养基干预后的衰老的C2C12成肌细胞的细胞体积与经第一培养基干预后的衰老的C2C12成肌细胞的细胞体积相差≥5％，例如为5％、10％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％中的任一者或者任意两者之间的数值，则判定植物提取物具有改善肌少症作用。需要说明的是，本申请实施例中的经第一培养基干预后的衰老的C2C12成肌细胞以及经第二培养基干预后的衰老的C2C12成肌细胞之间的细胞体积、细胞数量、线粒体呼吸功能水平、蛋白合成率、mTOR/P-mTOR值、Akt/P-Akt值的相差百分比是以第一培养基的对应结果为基准的，即是说，其计算方式是：(第一培养基对应结果-第二培养基对应结果)/第一培养基对应结果。
进一步地，如果经第一培养基干预后的衰老的C2C12成肌细胞的线粒体呼吸功能水平比经第二培养基干预后的衰老的C2C12成肌细胞的线粒体呼吸功能水平高，则判定植物提取物具有改善肌少症作用。
可选地，经第一培养基干预后的衰老的C2C12成肌细胞的线粒体呼吸功能水平与经第二培养基干预后的衰老的C2C12成肌细胞的线粒体呼吸功能水平相差≥20％，例如为20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％中的任一者或者任意两者之间的数值，则判定植物提取物具有改善肌少症作用。
其中，经第一培养基干预后的衰老的C2C12成肌细胞的线粒体呼吸功能水平比经第二培养基干预后的衰老的C2C12成肌细胞的线粒体呼吸功能水平高，则说明第一培养基中的样品血清对应的植物提取物对于衰老细胞具有改善线粒体功能的作用，因而可以判定植物提取物具有改善肌少症的作用。示例性地，本申请实施例对O2k线粒体呼吸功能水平进行测定。
进一步地，如果经第一培养基干预后的衰老的C2C12成肌细胞的蛋白合成率比经第二培养基干预后的衰老的C2C12成肌细胞的蛋白合成率高，则判定植物提取物具有改善肌少症作用。
可选地，经第一培养基干预后的衰老的C2C12成肌细胞的蛋白合成率与经第二培养基干预后的衰老的C2C12成肌细胞的蛋白合成率相差≥20％，例如为20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％中的任一者或者任意两者之间的数值，则判定植物提取物具有改善肌少症作用。
经第一培养基干预后的衰老的C2C12成肌细胞的蛋白合成率比经第二培养基干预后的衰老的C2C12成肌细胞的蛋白合成率高，说明第一培养基中的样品血清对应的植物提取物对于衰老细胞具有促进蛋白质合成的作用，因而可以判定植物提取物具有改善肌少症的作用。
进一步地，蛋白质合成信号表达情况的测定包括以下步骤：分别提取经第一培养基、第二培养基干预后的衰老的C2C12成肌细胞的蛋白作为第一蛋白和第二蛋白，测试第一蛋白和第二蛋白的mTOR/P-mTOR值和Akt/P-Akt值，第一蛋白的mTOR/P-mTOR值和Akt/P-Akt值分别大于第二蛋白的mTOR/P-mTOR值和Akt/P-Akt值，则判定植物提取物具有改善肌少症作用。
可选地，第一蛋白的mTOR/P-mTOR值与第二蛋白的mTOR/P-mTOR值相差≥20％，例如为20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％中的任一者或者任意两者之间的数值，第一蛋白的Akt/P-Akt值与第二蛋白的Akt/P-Akt值相差≥20％，例如为20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％中的任一者或者任意两者之间的数值，则判定植物提取物具有改善肌少症作用。
其中，Akt通过引起mTOR的磷酸化来控制蛋白质合成和细胞生长，二者的表达量与蛋白合成情况呈正相关，P-mTOR/mTOR、P-Akt/Akt比值高，则说明药物对于衰老细胞具有促进蛋白质合成的作用。
综上，与含有对照血清(普通小鼠血清)的第二培养基相比，含有样品血清(含植物提取物喂养小鼠血清)的第一培养基干预的衰老C2C12成肌细胞形态更好、线粒体呼吸功能水平更高、蛋白合成率更高、相关蛋白合成信号的表达量更高，说明样品血清对于衰老C2C12成肌细胞的蛋白质合成及细胞生长具有促进作用，能够有效防治肌少症。
以下结合实施例对本申请的筛选具有改善肌少症作用的植物提取物的方法作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供一种筛选具有改善肌少症作用的植物提取物的方法，其包括以下步骤：
S1：将黄芪提取物灌喂小鼠2周，每天一次，剂量为50mg/kg体重，于末次灌胃后2h心脏采血，室温下静置4h，2400r/min离心10min，分离血清，0.22um微孔滤膜无菌过滤，得到样品血清，在-20℃冰箱保存备用；
将等量生理盐水灌喂小鼠2周，于末次灌胃后2h心脏采血，室温下静置4h，2400r/min离心10min，分离血清，0.22um微孔滤膜无菌过滤，得到对照血清；在-20℃冰箱保存备用。
S2：将培养皿中的C2C12成肌细胞，以1*105密度，种于6孔板上，C2C12成肌细胞采用生长培养基培养，待C2C12成肌细胞生长至汇合度为80％左右时，即可进行诱导分化。
诱导分化的具体步骤包括：丢弃旧培养基，用PBS清洗两次；换分化培养基诱导，每孔2mL，然后置于CO2恒温培养箱中进行培养，培养箱温度为37°,空气占比95％，CO2占比5％，每24h换液一次，在显微镜下观察细胞形态和生长状况，确保将C2C12成肌细胞诱导分化为肌管状态。
S3：每孔加入2mL浓度为20g/L的D-半乳糖培养液对肌管状态的C2C12成肌细胞进行干预，得到第一细胞样品；采用生长培养基对肌管状态的C2C12成肌细胞进行培养后得到第二细胞样品；48h后，更换为完全培养液，进行细胞衰老鉴定。具体地，将第一细胞样品和第二细胞样品分别进行β-半乳糖苷酶染色、观察总体细胞数目和细胞体积、检查衰老蛋白P16和P53表达情况来鉴定细胞衰老情况。其中，以重量份数计，生长培养基包括90重量份的DMEM和10重量份的胎牛血清和1重量份的青链霉素；
其中，第一细胞样品的β-半乳糖苷酶染色结果为蓝色，第一细胞样品比第二细胞样品的总体细胞数目和细胞体积减小，衰老蛋白P16和P53的蛋白印迹结果升高，第一细胞样品确保已成为衰老细胞。
S4：将含有样品血清的第一培养基与含有对照血清的第二培养基分别进行干预衰老的C2C12成肌细胞，对照组使用生长培养基每孔2ml，进行培养干预24h后，去除干预培养基，然后测定干预后的衰老的C2C12成肌细胞的细胞形态、细胞线粒体呼吸功能水平、蛋白合成率和蛋白质合成信号表达情况。其中，以重量份数计，第一培养基中含有90重量份DMEM、10重量份样品血清和1重量份青链霉素；以重量份数计，第二培养基中含有90重量份DMEM、10重量份对照血清和1重量份青链霉素。
另外，蛋白质合成信号表达情况的测定包括以下步骤：分别提取经第一培养基、第二培养基干预后的衰老的C2C12细胞的蛋白作为第一蛋白和第二蛋白，测试第一蛋白和第二蛋白的mTOR/P-mTOR值和Akt/P-Akt值。
结果显示：经第一培养基干预后的衰老的C2C12细胞的细胞数目和细胞体积明显大于经第二培养基干预后的衰老的C2C12细胞的细胞数目和细胞体积(如图1示)。经第一培养基干预后的衰老的C2C12细胞的线粒体呼吸功能水平比经第二培养基干预后的衰老的C2C12细胞的线粒体呼吸功能水平高。经第一培养基干预后的衰老的C2C12细胞的蛋白合成率远大于经第二培养基干预后的衰老的C2C12细胞的蛋白合成率，相差超过20％(如图2示)，蛋白质合成率采用翻译表面感应(surface sensing of translation,SUnSET)手段，依靠嘌呤霉素(puromycin)实现快速、准确测定机体蛋白质合成。第一蛋白的mTOR/P-mTOR值和Akt/P-Akt值分别显著大于第二蛋白的mTOR/P-mTOR值和Akt/P-Akt值，mTOR/P-mTOR值相差超过20％，Akt/P-Akt值相差超过40％(如图3示)。说明黄芪提取物经本实施例的方法验证是可以改善肌少症的。
实施例2
本实施例提供一种筛选具有改善肌少症作用的植物提取物的方法，其包括以下步骤：
S1：将当归提取物灌喂小鼠2周，每天一次，剂量为80mg/kg体重，于末次灌胃后2h心脏采血，室温下静置4h，2400r/min离心10min，分离血清，0.22um微孔滤膜无菌过滤，得到样品血清，在-20℃冰箱保存备用；
将等量生理盐水灌喂小鼠2周，于末次灌胃后2h心脏采血，室温下静置4h，2400r/min离心10min，分离血清，0.22um微孔滤膜无菌过滤，得到对照血清；在-20℃冰箱保存备用。
S2：将培养皿中的C2C12细胞，以1*105密度，种于6孔板上，C2C12细胞采用生长培养基培养，待C2C12细胞生长至汇合度为80％左右时，即可进行诱导分化。
诱导分化的具体步骤包括：丢弃旧培养基，用PBS清洗两次；换分化培养基诱导，每孔2mL，然后置于CO2恒温培养箱中进行培养，培养箱温度为37°,空气占比95％，CO2占比5％，每24h换液一次，在显微镜下观察细胞形态和生长状况，确保将C2C12细胞诱导分化为肌管状态。
S3：每孔加入2mL浓度为20g/L的D-半乳糖培养液对肌管状态的C2C12细胞进行干预，得到第一细胞样品；采用生长培养基对肌管状态的C2C12细胞进行培养后得到第二细胞样品；48h后，更换为完全培养液，进行细胞衰老鉴定。具体地，将第一细胞样品和第二细胞样品分别进行β-半乳糖苷酶染色、观察总体细胞数目和细胞体积、检查衰老蛋白P16和P53表达情况来鉴定细胞衰老情况。其中，以重量份数计，生长培养基包括90重量份的DMEM和10重量份的胎牛血清和1重量份的青链霉素；
其中，第一细胞样品的β-半乳糖苷酶染色结果为蓝色，第一细胞样品比第二细胞样品的总体细胞数目和细胞体积减小，衰老蛋白P16和P53的蛋白印迹结果升高，第一细胞样品确保已成为衰老细胞。
S4：将含有样品血清的第一培养基与含有对照血清的第二培养基分别进行干预衰老的C2C12成肌细胞，对照组使用生长培养基每孔2ml，进行培养干预24h后，去除干预培养基，然后测定干预后的衰老的C2C12成肌细胞的细胞形态、细胞线粒体呼吸功能水平、蛋白合成率和蛋白质合成信号表达情况。其中，以重量份数计，第一培养基中含有90重量份DMEM、10重量份样品血清和1重量份青链霉素；以重量份数计，第二培养基中含有90重量份DMEM、10重量份对照血清和1重量份青链霉素。
另外，蛋白质合成信号表达情况的测定包括以下步骤：分别提取经第一培养基、第二培养基干预后的衰老的C2C12成肌细胞的蛋白作为第一蛋白和第二蛋白，测试第一蛋白和第二蛋白的mTOR/P-mTOR值和Akt/P-Akt值。
结果显示：经第一培养基干预后的衰老的C2C12细胞的线粒体呼吸功能水平比经第二培养基干预后的衰老的C2C12细胞的线粒体呼吸功能水平高。经第一培养基干预后的衰老的C2C12细胞的蛋白合成率远大于经第二培养基干预后的衰老的C2C12细胞的蛋白合成率(如图2示)，蛋白质合成率采用翻译表面感应(surface sensing of translation,SUnSET)手段，依靠嘌呤霉素(puromycin)实现快速、准确测定机体蛋白质合成。第一蛋白的mTOR/P-mTOR值和Akt/P-Akt值分别显著大于第二蛋白的mTOR/P-mTOR值和Akt/P-Akt值经第一培养基干预后的衰老的C2C12成肌细胞的细胞数目和细胞体积明显大于经第二培养基干预后的衰老的C2C12成肌细胞的细胞数目和细胞体积。经第一培养基干预后的衰老的C2C12成肌细胞的线粒体呼吸功能水平比经第二培养基干预后的衰老的C2C12成肌细胞的线粒体呼吸功能水平高。经第一培养基干预后的衰老的C2C12细胞的蛋白合成率远大于经第二培养基干预后的衰老的C2C12细胞的蛋白合成率，相差超过40％(如图4示)。第一蛋白的mTOR/P-mTOR值和Akt/P-Akt值分别显著大于第二蛋白的mTOR/P-mTOR值和Akt/P-Akt值，mTOR/P-mTOR值相差超过20％，Akt/P-Akt值相差超过45％(如图5示)。说明黄芪提取物经本实施例的方法验证是可以改善肌少症的。
对比例1
本实施例提供一种筛选具有改善肌少症作用的植物提取物的方法，其包括以下步骤：
S1：将金银花提取物灌喂小鼠2周，于末次灌胃后2h心脏采血，室温下静置4h，2400r/min离心10min，分离血清，0.22um微孔滤膜无菌过滤，得到样品血清，在-20℃冰箱保存备用；
将等量生理盐水灌喂小鼠2周，于末次灌胃后2h心脏采血，室温下静置4h，2400r/min离心10min，分离血清，0.22um微孔滤膜无菌过滤，得到对照血清；在-20℃冰箱保存备用。
S2：将培养皿中的C2C12细胞，以1*105密度，种于6孔板上，C2C12成肌细胞采用生长培养基培养，待C2C12细胞生长至汇合度为80％左右时，即可进行诱导分化。
诱导分化的具体步骤包括：丢弃旧培养基，用PBS清洗两次；换分化培养基诱导，每孔2mL，然后置于CO2恒温培养箱中进行培养，培养箱温度为37°,空气占比95％，CO2占比5％，每24h换液一次，在显微镜下观察细胞形态和生长状况，确保将C2C12成肌细胞诱导分化为肌管状态。
S3：每孔加入2mL浓度为20g/L的D-半乳糖培养液对肌管状态的C2C12成肌细胞进行干预，得到第一细胞样品；采用生长培养基对肌管状态的C2C12成肌细胞进行培养后得到第二细胞样品；48h后，更换为完全培养液，进行细胞衰老鉴定。具体地，将第一细胞样品和第二细胞样品分别进行β-半乳糖苷酶染色、观察总体细胞数目和细胞体积、检查衰老蛋白P16和P53表达情况来鉴定细胞衰老情况。其中，以重量份数计，生长培养基包括90重量份的DMEM和10重量份的胎牛血清和1重量份的青链霉素；
其中，第一细胞样品的β-半乳糖苷酶染色结果为蓝色，第一细胞样品比第二细胞样品的总体细胞数目和细胞体积减小，衰老蛋白P16和P53的蛋白印迹结果升高，第一细胞样品确保已成为衰老细胞。
S4：将含有样品血清的第一培养基与含有对照血清的第二培养基分别进行干预衰老的C2C12细胞，对照组使用生长培养基每孔2ml，进行培养干预24h后，去除干预培养基，然后测定干预后的衰老的C2C12成肌细胞的细胞形态、细胞线粒体呼吸功能水平、蛋白合成率和蛋白质合成信号表达情况。其中，以重量份数计，第一培养基中含有90重量份DMEM、10重量份样品血清和1重量份青链霉素；以重量份数计，第二培养基中含有90重量份DMEM、10重量份对照血清和1重量份青链霉素。
另外，蛋白质合成信号表达情况的测定包括以下步骤：分别提取经第一培养基、第二培养基干预后的衰老的C2C12成肌细胞的蛋白作为第一蛋白和第二蛋白，测试第一蛋白和第二蛋白的mTOR/P-mTOR值和Akt/P-Akt值。
结果显示：经第一培养基干预后的衰老的C2C12成肌细胞的细胞数目和细胞体积与经第二培养基干预后的衰老的C2C12成肌细胞的细胞数目和细胞体积大体一致。经第一培养基干预后的衰老的C2C12成肌细胞的线粒体呼吸功能水平与经第二培养基干预后的衰老的C2C12成肌细胞的线粒体呼吸功能水平大体一致。经第一培养基干预后的衰老的C2C12成肌细胞的蛋白合成率与经第二培养基干预后的衰老的C2C12成肌细胞的蛋白合成率大体一致，两者相差不超过15％(如图6示)。第一蛋白的mTOR/P-mTOR值和Akt/P-Akt值分别与第二蛋白的mTOR/P-mTOR值和Akt/P-Akt值大体一致，相差不超过15％(如图7示)。说明金银花提取物经本实施例的方法验证是不能改善肌少症的。
结果分析：黄芪提取物和当归提取物是现有的已知晓的能够改善或治疗肌少症的药物，而金银花提取物是已知晓的具有清热解毒的功效，不能改善或治疗肌少症。通过上述的实验结果可以得知，本申请的筛选具有改善肌少症作用的植物提取物的方法能够有效地筛选出具有改善肌少症作用的植物提取物，例如黄芪提取物和当归提取物，该筛选方法可以用来筛选一些具有未知效果的提取物以判断出其是否具有改善肌少症作用。
以上仅为本申请的具体实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种筛选具有改善肌少症作用的植物提取物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将植物提取物灌喂实验动物后进行采血得到样品血样，对所述样品血样分离血清得到样品血清；将等量生理盐水灌喂实验动物后进行采血得到对照血样，对所述对照血样分离血清得到对照血清；
将C2C12成肌细胞采用生长培养基培养，培养后进行诱导分化成肌管状态；
采用D-半乳糖对所述肌管状态的所述C2C12成肌细胞进行干预得到衰老的C2C12成肌细胞；
将含有所述样品血清的第一培养基与含有所述对照血清的第二培养基分别进行干预所述衰老的C2C12成肌细胞，通过对比干预后的所述衰老的C2C12成肌细胞的指标筛选出具有改善肌少症作用的植物提取物；所述指标包括细胞形态、细胞线粒体呼吸功能水平、蛋白合成率和蛋白质合成信号表达情况中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的筛选具有改善肌少症作用的植物提取物的方法，其特征在于，所述细胞形态指标包括细胞数目和细胞体积；经所述第一培养基干预后的所述衰老的C2C12成肌细胞的细胞数目和细胞体积大于经所述第二培养基干预后的所述衰老的C2C12成肌细胞的细胞数目和细胞体积，则判定所述植物提取物具有改善肌少症作用；
可选地，经所述第一培养基干预后的所述衰老的C2C12成肌细胞的细胞数目与经所述第一培养基干预后的所述衰老的C2C12成肌细胞的细胞数目相差≥20％，经所述第一培养基干预后的所述衰老的C2C12成肌细胞的细胞体积与经所述第一培养基干预后的所述衰老的C2C12成肌细胞的细胞体积相差≥5％，则判定所述植物提取物具有改善肌少症作用。
3.根据权利要求1所述的筛选具有改善肌少症作用的植物提取物的方法，其特征在于，经所述第一培养基干预后的所述衰老的C2C12成肌细胞的线粒体呼吸功能水平比经所述第二培养基干预后的所述衰老的C2C12成肌细胞的线粒体呼吸功能水平高，则判定所述植物提取物具有改善肌少症作用；
可选地，经所述第一培养基干预后的所述衰老的C2C12成肌细胞的线粒体呼吸功能水平与经所述第二培养基干预后的所述衰老的C2C12成肌细胞的线粒体呼吸功能水平相差≥20％，则判定所述植物提取物具有改善肌少症作用。
4.根据权利要求1所述的筛选具有改善肌少症作用的植物提取物的方法，其特征在于，经所述第一培养基干预后的所述衰老的C2C12成肌细胞的蛋白合成率比经所述第二培养基干预后的所述衰老的C2C12成肌细胞的蛋白合成率高，则判定所述植物提取物具有改善肌少症作用；
可选地，经所述第一培养基干预后的所述衰老的C2C12成肌细胞的蛋白合成率与经所述第二培养基干预后的所述衰老的C2C12成肌细胞的蛋白合成率相差≥20％，则判定所述植物提取物具有改善肌少症作用。
5.根据权利要求1所述的筛选具有改善肌少症作用的植物提取物的方法，其特征在于，所述蛋白质合成信号表达情况的测定包括以下步骤：分别提取经所述第一培养基、所述第二培养基干预后的所述衰老的C2C12成肌细胞的蛋白作为第一蛋白和第二蛋白，测试所述第一蛋白和所述第二蛋白的mTOR/P-mTOR值和Akt/P-Akt值，所述第一蛋白的mTOR/P-mTOR值和Akt/P-Akt值大于第二蛋白的mTOR/P-mTOR值和Akt/P-Akt值，则判定所述植物提取物具有改善肌少症作用；
可选地，所述第一蛋白的mTOR/P-mTOR值与第二蛋白的mTOR/P-mTOR值相差≥20％，所述第一蛋白的Akt/P-Akt值与第二蛋白的Akt/P-Akt值相差≥20％，则判定所述植物提取物具有改善肌少症作用。
6.根据权利要求1～5任一项所述的筛选具有改善肌少症作用的植物提取物的方法，其特征在于，所述第一培养基包括DMEM、青链霉素和10wt％的所述样品血清。
7.根据权利要求1～5任一项所述的筛选具有改善肌少症作用的植物提取物的方法，其特征在于，所述第二培养基包括DMEM、青链霉素和10wt％的所述对照血清。
8.根据权利要求1～5任一项所述的筛选具有改善肌少症作用的植物提取物的方法，其特征在于，所述D-半乳糖的浓度为20g/L。
9.根据权利要求1～5任一项所述的筛选具有改善肌少症作用的植物提取物的方法，其特征在于，所述衰老的C2C12成肌细胞的鉴定步骤包括：
采用所述D-半乳糖对所述肌管状态的所述C2C12成肌细胞进行干预后得到第一细胞样品；
采用生长培养基对所述肌管状态的所述C2C12成肌细胞进行培养后得到第二细胞样品；
将所述第一细胞样品和所述第二细胞样品分别进行β-半乳糖苷酶染色、观察总体细胞数目和细胞体积、检查衰老蛋白P16和P53蛋白表达情况来鉴定细胞衰老情况。
10.根据权利要求9所述的筛选具有改善肌少症作用的植物提取物的方法，其特征在于，所述第一细胞样品的所述β-半乳糖苷酶染色结果为蓝色，所述第一细胞样品比所述第二细胞样品的细胞数目和细胞体积减小，衰老蛋白P16和P53的蛋白印迹结果升高，则判定所述第一细胞样品为衰老细胞。
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