CN116768906A - 一种三并环化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于化合物技术领域，提供了一种三并环化合物及其制备方法和应用。本发明提供了一种具有式Ⅰ所示分子结构的三并环化合物，具有优良的抑制USP1的活性以及对MDA‑MB‑436细胞的增长抑制作用，具有较好的应用前景，可用于制备治疗和/或者预防哺乳动物与USP1相关的疾病的药物。

Description

一种三并环化合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及化合物技术领域，更具体地，涉及一种三并环化合物及其制备方法和应用。

背景技术

USP1(Ubiquitin specific protease 1，泛素特异性蛋白酶1)是一种定位于细胞核的参与DNA修复过程的去泛素化酶，在Fanconi贫血通路(FANCD2和FANC1)和跨损伤合成(TLS)通路(PCNA(增殖细胞核抗原))中起作用。它催化特定的单泛素信号去除过程，是保证基因组完整性的关键调节剂。USPl是DUBs(去泛素化酶)中USP(泛素特异性蛋白酶)亚家族的半胱氨酸异肽酶。全长人类USP1由785个氨基酸组成，包括一个由Cys90、His593和Asp751组成的催化三元组。USP1在DNA损伤修复中发挥作用，阻断USP1以抑制DNA修复，可以在多发性骨髓瘤细胞中诱导细胞凋亡，也可以增强肺癌细胞对顺钳的敏感性。在肿瘤的治疗中，USP1功能障碍与癌症的发生发展密切相关。此外，USP1是BRCA1缺失突变的新型合成致死成分，具有治疗对PARP抑制剂耐药的癌症患者的潜力。

专利WO2020132269公开了一种作为USP1抑制剂的化合物，代号为KSQ-4279，其作为USP1抑制剂可用于治疗肿瘤，但目前还处于临床I期研究。化合物KSQ-4279具体结构如下：

USP1抑制剂具有重大应用前景，因此，合成一种对USP1抑制效果显著的结构新颖的化合物具有重要意义。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种三并环化合物及其制备方法和应用。本发明提供的三并环化合物具有优良的抑制USP1的活性以及对MDA-MB-436细胞的增长抑制作用，能够用于制备治疗和/或预防哺乳动物与USP1介导的相关疾病的药物，例如实体瘤、腺癌、血液学癌症，具体如乳腺癌、多发性骨髓癌等。

本发明的第一方面提供一种三并环化合物。

具体地，一种三并环化合物，具有如下式Ⅰ所示分子结构：

其中，为单键或双键；

Z₁选自CR₁或-C(＝O)-；R₁选自H、CH₃；

Z₂选自N、NH或CH；

环A选自6-10元芳环或6-10元杂芳基，所述环A被一个或多个R_a取代，其中，R_a选自H、卤素、-CN、-OH、-NH₂、C_l-C₆烷基、C_l-C₆烷氧基、C₃-C₁₀环烷基中的至少一种；

环B选自6-10元芳环或6-10元杂芳基，所述环B被一个或多个R_b取代，其中，R_b选自H、卤素、-CN、-OH、-NH₂中的至少一种；

环C选自4-6元芳环或4-6元杂芳基，所述环C被一个或多个R_c取代，其中，R_c选自H、卤素、-CN、-CF₃、C_l-C₆烷基、C_l-C₆烷氧基、C₃-C₁₀环烷基中的至少一种。

优选地，所述三并环化合物具有如下式Ⅰa、Ⅰb、Ⅰc所示任意一种结构式：

其中，R1选自H、CH₃；

环A选自6-10元芳环或6-10元杂芳基，所述环A被一个或多个R_a取代，其中，R_a选自H、卤素、-CN、-OH、-NH₂、C_l-C₆烷基、C_l-C₆烷氧基、C₃-C₁₀环烷基中的至少一种；

环B选自6-10元芳环或6-10元杂芳基，所述环B被一个或多个R_b取代，其中，R_b选自H、卤素、-CN、-OH、-NH₂中的至少一种；

环C选自4-6元芳环或4-6元杂芳基，所述环C被一个或多个R_c取代，其中，R_c选自卤H、卤素、-CN、-CF₃、C_l-C₆烷基、C_l-C₆烷氧基、C₃-C₁₀环烷基中的至少一种。

进一步优选地，所述三并环化合物具有如下式Ⅰa、Ⅰb、Ⅰc所示任意一种结构式：

其中，R₁选自H、CH₃；

X₁，X₂各自独立选自CH或N；

R_a选自C_l-C₆烷基、C_l-C₆烷氧基、C₃-C₁₀环烷基中的至少一种；

R_b选自H或F；

R_c选自C_l-C₆烷基、C_l-C₆烷氧基、C₃-C₁₀环烷基中的至少一种。

更优选地，所述三并环化合物具有如下式1-12化合物所示任意一种结构式：

本发明的第二方面提供一种三并环化合物的制备方法。

一种三并环化合物的制备方法，包括如下步骤：

利用氨基乙酸乙酯盐酸盐与取代醛基化合物发生还原氨化反应生成中间体2，中间体2和2,4-二氯-5-硝基嘧啶发生亲核取代反应生成中间体3，中间体3在铁粉和醋酸的作用下发生闭环反应生成中间体4，中间体4在五硫化二磷的作用下生成中间体5，中间体5与氨基化合物反应生成中间体6，中间体6与取代硼酸发生偶联反应，生成所述三并环化合物。

优选地，所述还原氨化反应的反应温度为0-4℃，反应时间为1-3小时。

优选地，所述亲核取代反应的反应温度为0-4℃，反应时间为1-3小时。

优选地，所述闭环反应的反应温度为80-100℃，反应时间为11-13小时。

优选地，所述在五硫化二磷的作用下，在70-90℃下，反应3-5小时。

优选地，所述氨基化合物包括氨基乙二醛二甲酯、酰肼、肼甲酸乙酯中的至少一种。

优选地，所述酰肼为甲酰肼和/或乙酰肼。

优选地，所述氨基化合物为氨基乙二醛二甲酯，所述中间体5与氨基乙二醛二甲酯在三乙胺和乙醇中，在60-80℃反应1-3小时，或者，所述中间体5与氨基乙二醛二甲酯在冰醋酸中，在90-110℃反应0.1-3小时。

优选地，所述氨基化合物为酰肼，所述中间体5与酰肼在110-130℃下，反应10-15小时。

优选地，所述氨基化合物为肼甲酸乙酯，所述中间体5与肼甲酸乙酯在110-130℃反应10-15小时。

优选地，所述三并环化合物具有式Ⅰa、Ⅰb、Ⅰc所示任意一种结构式，所述式Ⅰa、Ⅰb、Ⅰc的制备方法，包括如下步骤：

先将氨基乙酸乙酯盐酸盐与取代醛基化合物发生还原氨化反应生成中间体2(对应以下反应式中编号2的化合物)，中间体2和2,4-二氯-5-硝基嘧啶发生亲核取代反应生成中间体3(对应以下反应式中编号3的化合物)，中间体3在铁粉和醋酸的作用下发生闭环反应生成中间体4(对应以下反应式中编号4的化合物)，中间体4在五硫化二磷的作用下生成中间体5(对应以下反应式中编号5的化合物)，中间体5分别与氨基乙二醛二甲酯、酰肼、肼甲酸乙酯反应，分别生成中间体6i、中间体ii或中间体iii(对应以下反应式中编号6i、6ii、6iii的化合物)，中间体6i、中间体ii或中间体iii分别与取代硼酸发生偶联反应，分别生成化合物Ia、Ib或Ic。

上述制备式Ⅰa、Ⅰb、Ⅰc的反应式如下：

其中，上述涉及到的反应条件和试剂如下：a.氰基硼氢化钠，二氯甲烷，0℃，2小时；b.碳酸钾，氮氮二甲基甲酰胺，0℃，2小时；c.铁粉，醋酸，90℃，12小时；d.五硫化二磷，三乙胺，乙腈，80℃，4小时；ei.I、三乙胺，乙醇，70℃，2小时；II、冰醋酸，100℃，1小时；eii.环己醇，120℃，12小时；f.碳酸铯，醋酸钯，Xantphos(,5-双二苯基膦-9,9-二甲基氧杂蒽)，二氧六环和水(二氧六环和水的体积比＝10/1)，100℃，2小时。

本发明的第三方面提供一种三并环化合物的应用。

一种三并环化合物在制备预防和/或治疗与USP1相关的疾病药物中的应用。

一种预防和/或治疗与USP1相关的疾病药物，包括所述三并环化合物。

优选地，所述药物还包括药学上可接受的载体和/或辅料。

一种USP1抑制剂，包括所述三并环化合物。

相对于现有技术，本发明的有益效果如下：

本发明提供了一种具有式Ⅰ所示分子结构的三并环化合物，具有优良的抑制USP1的活性以及对MDA-MB-436细胞的增长抑制作用，具有较好的应用前景，可用于制备治疗和/或者预防哺乳动物与USP1相关的疾病的药物，例如实体瘤、腺癌、血液学癌症，具体如乳腺癌、多发性骨髓癌等。

具体实施方式

为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例对本发明要求的保护范围不构成限制作用。

以下实施例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。

术语“卤”或“卤素”是指氟、氯、溴或碘。

术语“芳基”是指具有共轭的π电子体系的全碳单环或稠合多环的芳香环基团。

术语“杂芳基”是指具有芳香性的单环或稠合多环体系，其中含有至少一个选自N、O、S的环原子，其余环原子为C的芳香环基。

术语“C₁-C₆烷基”表示直链或支链的含有1-6个碳原子的烷基，具体实例包括但不限于：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、2-甲基丁基、新戊基、1-乙基丙基、正己基、异己基、3-甲基戊基、2-甲基戊基、1-甲基戊基、3,3-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、1,2-二甲基丙基等。

术语“C₁-C₆烷氧基”是指以C₁-C₆烷基-O-方式形成的基团，其中“C₁-C₆烷基”的定义如前文所述。

术语“C₃-C₁₀环烷基”是指包含特定数目的C原子的环状烷基或环状杂烷基且不具有芳香性，其可以是单环(如C_3-C₆环烷基)，也可以是双环形式。

本发明包括本发明化合物的所有可能的立体异构体，可以是单一立体异构体，或任何比例的所述立体异构体，例如R或S异构体，或E或Z异构体的任何混合物。利用任何合适的本领域说明的方法，例如，色谱，尤其是手性色谱，可以实现本发明化合物的单一立体异构体的分离，例如，单一对映异构体或单一非对应异构体的分离。

本发明还涉及本文公开的化合物的可用形式，例如，代谢物、水合物、溶剂化物、前药、盐，尤其是药学上可接受的盐，以及共沉淀。

本发明的化合物可以以水合物或溶剂化物形式存在，其中，本发明的化合物含有极性溶剂，尤其是水、甲醇或乙醇，例如，作为化合物的晶格的结构要素。极性溶剂尤其是水的量，可以以化学计量或非化学计量的比例存在。化学计量的溶剂化合物例如水合物的情况下，可以分别是半(部分)、一、一又二分之一、二、三、四、五溶剂化合物或水合物，等等。本发明包括所有这种水合物或溶剂化物。

进一步地，本发明的化合物可以游离形式存在，例如，作为游离碱或游离酸或两性离子，或可以以盐形式存在。所述盐可以是药学通常使用的任何盐，有机或无机加成盐，尤其是任何药学上可接受的有机或无机加成盐。

本发明化合物的药学上可接受的盐可以是，例如，链或环中携带氮原子的本发明化合物的酸加成盐，例如，充分碱性的本发明化合物的酸加成盐，例如，与无机酸形成的酸加成盐，例如，盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、重硫酸、磷酸或硝酸，或与有机酸形成的酸加成盐，例如，甲酸、乙酸、乙酰乙酸、丙酮酸、三氟乙酸、丙酸、丁酸、己酸、庚酸、十一烷酸、月桂酸、苯甲酸、水杨酸、2-(4-羟基苯甲酰基)-苯甲酸、樟脑酸、肉桂酸、环戊酸、二葡糖酸、3-羟基-2-萘酸、烟酸、双羟萘酸、果胶酯酸、过硫酸、3-苯基丙酸、苦味酸、新戊酸、2-羟基乙磺酸、衣康酸、氨基磺酸、三氟甲磺酸、十二烷基硫酸、乙磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、甲磺酸、2-萘磺酸、萘二磺酸、樟脑磺酸、柠檬酸、酒石酸、硬脂酸、乳酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、苹果酸、己二酸、马来酸、富马酸、D-葡糖酸、扁桃酸、抗坏血酸、葡庚糖酸、甘油磷酸、天冬氨酸、磺基水杨酸、半硫酸或硫氰酸。

本发明的化合物可以在一个或者多个构成该化合物的原子上包含非天然比例同位素，例如用重氢取代氢形成氘代药物。

在本发明的背景下，术语“治疗”包括抑制、延迟、检查、缓解、减弱、限制、减少、压制、抵制或治愈疾病(术语“疾病”包括但不限于病状、病症、损失或健康问题)，或者这种状态和/或这种状态的症状的发展、进程或进展、术语“疗法”在本文理解为与术语“治疗”同义。

术语“防止”、“预防”或“阻止”在本发明的背景下是同义使用的，并且是指避免或减少感染、经历、患有或具有疾病的风险或者这种和/或这种状态的症状的发展或进展。治疗或预防疾病可以是部分或完全的。

在下列具体实施例中，对制备化合物检测鉴定的液相条件为：岛津LCMS2020，G1322A脱气机，G1312二元高压泵，G1329A自动进样器，G1316A柱温箱，G4212B二极管阵列检测器。色谱柱为XbridgeC18(50mm×4.6mm，5.0μm)，以去离子水为流动相A，以含0.1％的三氟乙酸的乙腈为流动相B，按下表进行梯度洗脱：

流速为1.5mL/min，柱温为40℃，检测波长为254nm。

实施例1

一种三并环化合物，名称为3-(4-环丙基-6-甲氧基嘧啶-5-基)-5-(4-(1-异丙基-4-(三氟甲基)-1氢-咪唑-2-基)苄基)-5,6-二氢咪唑[1,2-f]蝶啶(简称为化合物1)，具有如下所示分子结构：

上述化合物1的制备方法，包括如下步骤：

(1)向反应瓶中加入4-(1-异丙基-4-(三氟甲基)-1H-咪唑-2-基)苯甲醛(1g，3.54mmol)、二氯甲烷(50mL)、冰乙酸(2mL)和甘氨酸乙酯盐酸盐(741.74mg，5.31mmol)，搅拌降温至0℃，分次加入氰基硼氢化钠(445.27mg，7.09mmol)，加毕，保存0℃反应2小时，薄层色谱(TLC)点板监控原料完全反应后，用饱和碳酸氢钠溶液调节反应液pH＝7，分液，用二氯甲烷萃取三次(30mL*3)，合并有机相，饱和食盐水洗一次，硅胶柱层析纯化(乙酸乙酯：石油醚＝1:1)，得到无色油状中间体2(1.1g，收率84.06％)。LCMS：(MS-ESI,m/z):[M+H]⁺＝370.2。

(2)向反应瓶中加入2,4-二氯-5-硝基嘧啶(500.00mg，2.58mmol)和氮氮二甲基甲酰胺(30mL)搅拌降温至0℃，加入中间体2(952.17mg，2.58mmol)、碳酸钾(534.38mg，3.87mmol)，搅拌反应30分钟，TLC点板监控，原料反应完全后停止反应，加入50mL水淬灭反应，分液，乙酸乙酯萃取3次(30mL*3)，合并乙酸乙酯相，减压浓缩，用柱层析硅胶过柱，用乙酸乙酯：石油醚体系洗脱(PE:EA体积比＝3:1)，得黄绿色粉末状固体中间体3(1.1g，收率80.99％)。液相色谱质谱联用(LCMS)测试结果：(MS-ESI,m/z):[M+H]⁺＝527.2。

(3)室温下，向反应瓶中加入中间体3(1.1g，2.09mmol)、醋酸(20mL)搅拌溶解，加入铁粉(349.76mg，6.26mmol)，升至90℃反应2小时，TLC监控，原料反应完全后，降温至25℃，浓缩除去醋酸，随后向浓缩液中加入100mL水，乙酸乙酯萃取3次(30mL*3)，合并乙酸乙酯相，减压浓缩，用甲醇(5mL)打浆的得白色粉末状固体中间体4(0.9g，收率95.62％)。LCMS：(MS-ESI,m/z):[M+H]⁺＝450.2。

(4)室温下，向反应瓶中加入三乙胺(20mL)和乙腈(30mL)搅拌溶解，分批次加入五硫化二磷(665.49mg，2.99mmol)，待五硫化二磷完全溶解后，加入中间体4(900.00mg，2.00mmol)，氮气保护下，升至80℃继续反应5小时，TLC监控，原料反应完全后，降温至25℃，加入硅胶拌样浓缩，用柱层析硅胶过柱，用乙酸乙酯：石油醚体系洗脱(PE:EA＝5:1)，得亮黄色粉末状中间体5(850.00mg，收率91.02％)。LCMS：(MS-ESI,m/z):[M+H]⁺＝467.2。

(5)室温下，向反应瓶中加入中间体5(100mg，214.17μmol)和乙醇(5mL)搅拌溶解，随后加入氨基乙二醛二甲酯(33.78mg，321.26μmol)以及0.5mL三乙胺，升至70℃继续反应2小时，TLC监控，原料反应完全后，降温至25℃，减压浓缩反应液。随后，用醋酸(5mL)溶解浓缩反应液，升至100℃反应2小时，TLC监控，原料反应完全后，降温至25℃，加入硅胶拌样浓缩，用柱层析硅胶过柱，用二氯甲烷：甲醇体系洗脱(DCM:MeOH＝20:1)，得黄色固体中间体6i(70.00mg，收率68.97％)。LCMS：(MS-ESI,m/z):[M+H]⁺＝474.2。

(6)向反应瓶中加入中间体6(70.00mg，147.71μmol)、(2-环丙基-6-甲氧基嘧啶)硼酸(34.11mg，221.57μmol)、醋酸钯(3.32mg，14.77μmol)、碳酸铯(40.22mg，295.43μmol)、Xantphos(8.55mg，14.77μmol)和二氧六环(5mL)，抽真空氮气置换3次，在氮气保护下，搅拌升温至100℃反应2小时，TLC监控，原料反应完全后，降温至25℃，用柱层析硅胶过柱，用二氯甲烷：甲醇体系洗脱(DCM:MeOH体积比＝10:1)得白色固体化合物1(40mg，收率46.08％)。LCMS：(MS-ESI,m/z):[M+H]⁺＝588.2核磁氢谱¹H NMR：(400MHz,DMSO-d₆,ppm):δ8.69(s,1H),8.24(s,1H),7.93(s,1H),7.69(d,J＝8.2Hz,2H),7.45(d,J＝8.2Hz,2H),7.21(d,J＝8.1Hz,1H),7.01(d,J＝8.1Hz,1H),4.83(s,2H),4.25(s,2H),4.01(m,1H),3.89(s,3H),1.79(m,1H),1.62(m,6H),1.00(m,2H),0.84(m,2H)。

上述化合物1的制备过程反应式如下：

其中上述反应式中对应的反应条件和试剂如下：a.氰基硼氢化钠，二氯甲烷，0℃，2小时；b.碳酸钾，氮氮二甲基甲酰胺，0℃，2小时；c.铁粉，醋酸，90℃，12小时；d.五硫化二磷，三乙胺，乙腈，80℃，4小时；ei.冰醋酸，100℃，1小时；f.碳酸铯，醋酸钯，Xantphos，二氧六环/水的体积比＝10/1，100℃，2小时。

实施例2

一种三并环化合物，名称为3-(4-环丙基-6-甲氧基嘧啶-5-基)-5-(4-(1-甲基-4-(三氟甲基)-1氢-咪唑-2-基)苄基)-5,6-二氢咪唑[1,2-f]蝶啶(简称为化合物2)，具有如下所示分子结构：

上述三并环化合物的制备方法，与实施例1的区别在于，将步骤(1)中替换为

化合物2(40mg，收率40.1％)。LCMS：(MS-ESI,m/z):[M+H]⁺＝560.2核磁氢谱¹HNMR：(400MHz,DMSO-d₆,ppm):δ8.64(s,1H),8.16(s,1H),7.93(s,1H),7.67(d,J＝8.2Hz,2H),7.48(d,J＝8.2Hz,2H),7.22(d,J＝8.1Hz,1H),7.02(d,J＝8.1Hz,1H),4.81(s,2H),4.23(s,2H),3.86(s,3H),3.76(s,3H),1.79(m,1H),1.00(m,2H),0.82(m,2H)。

实施例3

一种三并环化合物，名称为5-(4-(1-异丙基-4-(三氟甲基)-1氢-咪唑-2-基)苄基)-3-(2-异丙基苯基)-5,6-二氢咪唑[1,2-f]蝶啶(简称为化合物3)，具有如下所示分子结构：

上述三并环化合物的制备方法，与实施例1的区别在于，将步骤(6)中替换为

化合物3(37mg，收率39.2％)。LCMS：(MS-ESI,m/z):[M+H]⁺＝558.3 ¹HNMR：(400MHz,DMSO-d₆,ppm):δ8.68(s,1H),7.91(s,1H),7.68(d,J＝8.2Hz,2H),7.55(d,J＝8.2Hz,2H),7.41(m,4H),7.21(d,J＝8.1Hz,1H),7.01(d,J＝8.1Hz,1H),4.83(s,2H),4.25(s,2H),4.01(m,1H),2.88(m,1H),1.62(m,12H)。

实施例4

一种三并环化合物，名称为7-(4-环丙基-6-甲氧基嘧啶-5-基)-5-(4-(1-异丙基-4-(三氟甲基)-1氢-咪唑-2-基)苄基)-4,5-二氢-[1,2,4]三氮唑[4,3-f]蝶啶(简称为化合物4)，具有如下所示分子结构：

上述三并环化合物的制备方法，与实施例1的区别在于，将步骤(5)中替换为

化合物4(43mg，收率52.6％)。LCMS：(MS-ESI,m/z):[M+H]⁺＝589.2 ¹H NMR：(400MHz,DMSO-d₆,ppm):δ8.69(s,1H),8.24(s,1H),7.93(s,1H),7.69(d,J＝8.2Hz,2H),7.45(d,J＝8.2Hz,2H),7.21(s,1H),4.81(s,2H),4.24(s,2H),4.01(m,1H),3.89(s,3H),1.80(m,1H),1.62(m,6H),1.02(m,2H),0.82(m,2H)。

实施例5

一种三并环化合物，名称为7-(4-环丙基-6-甲氧基嘧啶-5-基)-5-(4-(1-甲基-4-(三氟甲基)-1氢-咪唑-2-基)苄基)-4,5-二氢-[1,2,4]三氮唑[4,3-f]蝶啶(简称为化合物5)，具有如下所示分子结构：

上述三并环化合物的制备方法，与实施例1的区别在于，将步骤(1)中替换为并把步骤(5)中替换为

化合物5(39mg，收率39.2％)。LCMS：(MS-ESI,m/z):[M+H]⁺＝560.2 ¹H NMR：(400MHz,DMSO-d₆,ppm):δ8.67(s,1H),8.17(s,1H),7.93(s,1H),7.67(d,J＝8.2Hz,2H),7.48(d,J＝8.2Hz,2H),7.22(s 1H),4.81(s,2H),4.21(s,2H),3.86(s,3H),3.76(s,3H),1.79(m,1H),1.02(m,2H),0.84(m,2H)。

实施例6

一种三并环化合物，名称为5-(4-(1-异丙基-4-(三氟甲基)-1氢-咪唑-2-基)苄基)-7-(2-异丙基苯基)-4,5-二氢-[1,2,4]三氮唑[4,3-f]蝶啶(简称为化合物6)，具有如下所示分子结构：

上述三并环化合物的制备方法，与实施例1的区别在于，将步骤(5)中替换为并将步骤(6)中替换为

化合物6(42mg，收率49.1％)。LCMS：(MS-ESI,m/z):[M+H]⁺＝559.2 ¹H NMR：(400MHz,DMSO-d₆,ppm):δ8.64(s,1H),7.91(s,1H),7.64(d,J＝8.2Hz,2H),7.55(d,J＝8.2Hz,2H),7.41(m,4H),7.23(s,1H),4.85(s,2H),4.25(s,2H),4.01(m,1H),2.88(m,1H),1.67(m,12H)。

实施例7

一种三并环化合物，名称为7-(4-环丙基-6-甲氧基嘧啶-5-基)-5-(4-(1-异丙基-4-(三氟甲基)-1氢-咪唑-2-基)苄基)-1-甲基-4,5-二氢-[1,2,4]三氮唑[4,3-f]蝶啶(简称为化合物7)，具有如下所示分子结构：

上述三并环化合物的制备方法，与实施例1的区别在于，将步骤(5)中替换为

化合物7(39mg，收率47.6％)。LCMS：(MS-ESI,m/z):[M+H]⁺＝603.2 ¹H NMR：(400MHz,DMSO-d₆,ppm):δ8.63(s,1H),8.24(s,1H),7.93(s,1H),7.69(d,J＝8.1Hz,2H),7.44(d,J＝8.1Hz,2H),4.81(s,2H),4.24(s,2H),4.01(m,1H),3.89(s,3H),3.01(s,3H),1.81(m,1H),1.62(m,6H),1.00(m,2H),0.86(m,2H)。

实施例8

一种三并环化合物，名称为7-(4-环丙基-6-甲氧基嘧啶-5-基)-1-甲基-5-(4-(1-甲基-4-(三氟甲基)-1氢-咪唑-2-基)苄基)-4,5-二氢-[1,2,4]三氮唑[4,3-f]蝶(简称为化合物8)，具有如下所示分子结构：

上述三并环化合物的制备方法，与实施例1的区别在于，将步骤(1)中替换为将步骤五的替换为

化合物8(44mg，收率48.6％)。LCMS：(MS-ESI,m/z):[M+H]⁺＝575.2 ¹H NMR：(400MHz,DMSO-d₆,ppm):δ8.63(s,1H),8.24(s,1H),7.93(s,1H),7.69(d,J＝8.1Hz,2H),7.44(d,J＝8.1Hz,2H),4.81(s,2H),4.24(s,2H),3.79(s,3H),4.01(m,1H),3.89(s,3H),3.01(s,3H),1.81(m,1H),1.01(m,2H),0.82(m,2H)。

实施例9

一种三并环化合物，名称为5-(4-(1-异丙基-4-(三氟甲基)-1氢-咪唑-2-基)苄基)-7-(2-异丙基苯基)-1-甲基-4,5-二氢-[1,2,4]三氮唑[4,3-f]蝶啶(简称为化合物9)，具有如下所示分子结构：

上述三并环化合物的制备方法，与实施例1的区别在于，将步骤(5)中替换为将步骤(6)的替换为

化合物9(39mg，收率38.4％)。LCMS：(MS-ESI,m/z):[M+H]⁺＝573.2 ¹H NMR：(400MHz,DMSO-d₆,ppm):δ8.65(s,1H),7.91(s,1H),7.67(d,J＝8.2Hz,2H),7.55(d,J＝8.2Hz,2H),7.41(m,4H),4.83(s,2H),4.25(s,2H),4.01(m,1H),3.79(s,3H),2.88(m,1H),1.62(m,12H)。

实施例10

一种三并环化合物，名称为5-(4-(1-异丙基-4-(三氟甲基)-1氢-咪唑-2-基)苄基)-7-(2-异丙基苯基)-4,5-二氢-[1,2,4]三氮唑[4,3-f]蝶啶-1(2氢)-酮(简称为化合物10)，具有如下所示分子结构：

上述三并环化合物的制备方法，与实施例1的区别在于，将步骤(1)中步骤(5)的替换为将步骤(6)的替换为

化合物10(55mg，收率48.2％)。LCMS：(MS-ESI,m/z):[M+H]⁺＝575.2 ¹H NMR：(400MHz,DMSO-d6,ppm):δ11.63(s,1H)，8.68(s,1H),7.94(s,1H),7.63(d,J＝8.2Hz,2H),7.52(d,J＝8.2Hz,2H),7.43(m,4H),4.83(s,2H),4.25(s,2H),4.01(m,1H),2.88(m,1H),1.60(m,12H)。

实施例11

一种三并环化合物，名称为7-(4-环丙基-6-甲氧基嘧啶-5-基)-5-(4-(1-异丙基-4-(三氟甲基)-1氢-咪唑-2-基)苄基)-4,5-二氢-[1,2,4]三氮唑[4,3-f]蝶啶-1(2氢)-酮(简称为化合物11)，具有如下所示分子结构：

上述三并环化合物的制备方法，与实施例1的区别在于，将步骤(5)中替换为

化合物11(47mg，收率48.9％)。LCMS：(MS-ESI,m/z):[M+H]⁺＝605.2 ¹H NMR：(400MHz,DMSO-d6,ppm):δ11.68(s,1H)，8.61(s,1H),8.25(s,1H),7.91(s,1H),7.67(d,J＝8.2Hz,2H),7.45(d,J＝8.2Hz,2H),4.79(s,2H),4.30(s,2H),4.01(m,1H),3.89(s,3H),1.80(m,1H),1.62(m,6H),1.02(m,2H),0.82(m,2H)。

实施例12

一种三并环化合物，名称为7-(4-环丙基-6-甲氧基嘧啶-5-基)-5-(4-(1-甲基-4-(三氟甲基)-1氢-咪唑-2-基)苄基)-4,5-二氢-[1,2,4]三氮唑[4,3-f]蝶啶(简称为化合物12)，具有如下所示分子结构：

上述三并环化合物的制备方法，与实施例1的区别在于，将步骤(1)中替换为将步骤(5)的替换为

化合物12(39mg，收率37.3％)。LCMS：(MS-ESI,m/z):[M+H]⁺＝577.2 ¹H NMR：(400MHz,DMSO-d₆,ppm):δ11.67(s,1H)，8.69(s,1H),8.20(s,1H),7.92(s,1H),7.67(d,J＝8.2Hz,2H),7.48(d,J＝8.2Hz,2H),4.81(s,2H),4.21(s,2H),3.86(s,3H),3.76(s,3H),1.79(m,1H),1.00(m,2H),0.87(m,2H)。

产品效果测试

1、USP1体外酶学检测

检测本发明化合物1-12对USP1酶活性的抑制作用，检测方法如下：

将USP1酶(Recombinant Human His6-USPl/His6-UAFl Complex Protein，R&D,Cat No.E-568-050)、检测试剂盒(Ub-CHOP2-Reporter Deubiquitination Assay Kit，Lifesensors，Cat No.PR1101)在冰上融化，试剂盒包含泛素化的报告酶，当被USP1/UAF1去泛素化后，产生活性，催化底物后，使底物受485nm激光激发产生531nm的发射光信号。分别取1μL/孔待测化合物(化合物1-12和阳性对照物，阳性对照物为KSQ Therapeutics公司的USP1抑制剂，代号为KSQ-4279)工作液加入到384微孔板中，用新鲜配制的反应液(20mMTris-HCl(pH 8.0)、2mM CaCl₂、2mMβ-巯基乙醇、0.05％ CHAPS、去离子水)稀释USP1酶。每个孔加入5μL稀释好的酶反应液，离心震荡混合酶与化合物。用反应液稀释试剂盒体系和底物，每个孔加入5μL稀释好的液体，离心混合，室温孵育30min后进行测试。荧光信号使用Envision读板仪(PerkinEhner激发光波长480nm，发射光波长540nm)测量每个孔中的荧光信号。使用Nivo进行Luminescence检测，读取发光值(RLU)。按下列公式计算抑制率，抑制率(Inibition)％＝(1-(各孔531nm/485nm信号值-低对照组平均值)/(高对照组平均值-低对照组平均值))*100。其中高对照组为没有加化合物处理，仅用等量浓度USP1酶反应液加入反应体系组；低对照组为没有USP1酶反应液，只加入等量新鲜配制的反应液。拟合量效曲线：以浓度的log值作为X轴，百分比抑制率为Y轴，采用分析软件GraphPad Prism 5的log(inhibitor)vs.response Variable slope拟合量效曲线，从而得出各个化合物对酶活性的IC₅₀值。

实验结果如表1所示。

表1 USP1激酶活性测定结果

化合物编号	IC50(nM)
		化合物1	12
化合物2	14.5
		化合物3	22.1
化合物4	27.2
		化合物5	26.5
化合物6	33.9
		化合物7	41.4
化合物8	45.4
		化合物9	67.2
化合物10	9.9
		化合物11	7.6
化合物12	5.2
		KSQ-4279	32.9

由上表可知，本发明化合物对USP1酶活性具有很好的抑制作用。

2、MTT细胞毒性测试

应用MTT(化学名称为3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐，商品名为噻唑蓝)检测法测定化合物1-12对MDA-MB-436细胞(人乳腺癌细胞)增长的抑制作用。实验步骤如下：

MDA-MB-436细胞以4000细胞/孔接种于96孔板中，150μL/孔，37℃培养24h。按照浓度设置进行化合物1-12配置，化合物1-12用无血清培养基梯度稀释，加药量为50μL/孔。药物处理72h后，每孔加入10μL MTT溶液，37℃孵育4h。仔细吸去上清，每孔加入150μL DMSO，轻轻振荡以使甲臜溶解。1h内在检测波长570nm处用酶标仪测定OD值。采用Graphpad Prism软件进行分析计算。

抑制率的计算公式如下：

抑制率(％)＝(100-OD_样品/OD_溶媒)×100％，其中OD_样品为添加各浓度受试物后检测到的吸光度值，OD_溶媒为溶媒组(添加溶媒，不加受试物)检测到的吸光度值。

半抑制浓度(IC₅₀)可以作为药物抗肿瘤活性的指标，能指示某一药物或者抑制剂在抑制某些物质如酶、细胞受体或者微生物的半量。测定IC₅₀值的时候，可以通过把药品稀释成不同的浓度，然后计算各自的抑制率，以药品的浓度为横坐标，抑制率为纵坐标，采用graphpad prism软件的Dose-response-Inhibition选项下的Log(inhibitor)vs.response—Variable slope(four parameters)作图，然后得到50％抑制率时候的药品浓度。

化合物1-12对MDA-MB-231细胞的细胞毒性测试结果如表2所示。阳性对照物为KSQ-4279。

表2 MTT细胞毒性测试结果

化合物	IC50(nM)
		化合物1	78.6
化合物2	159.4
		化合物3	177.3
化合物4	415.6
		化合物5	519.1
化合物6	385.6
		化合物7	201.5
化合物8	233.7
		化合物9	176.9
化合物10	32.8
		化合物11	41.7
化合物12	59.6
		KSQ-4279	81.9

由上表可知，本发明化合物对MDA-MB-436细胞的增长具有很好的抑制活性。

综合以上结果表明，相较于阳性对照物KSQ-4279，本发明化合物具有相当甚至更好的抑制USP1激酶活性以及对MDA-MB-436细胞的增长抑制作用，具有较好的应用前景。

Claims (10)

1.一种三并环化合物，其特征在于，具有如下式Ⅰ所示分子结构：

其中，为单键或双键；

Z₁选自CR₁或-C(＝O)-；R₁选自H、CH₃；

Z₂选自N、NH或CH；

环A选自6-10元芳环或6-10元杂芳基，所述环A被一个或多个R_a取代，其中，R_a选自H、卤素、-CN、-OH、-NH₂、C_l-C₆烷基、C_l-C₆烷氧基、C₃-C₁₀环烷基中的至少一种；

环B选自6-10元芳环或6-10元杂芳基，所述环B被一个或多个R_b取代，其中，R_b选自H、卤素、-CN、-OH、-NH₂中的至少一种；

环C选自4-6元芳环或4-6元杂芳基，所述环C被一个或多个R_c取代，其中，R_c选自H、卤素、-CN、-CF₃、C_l-C₆烷基、C_l-C₆烷氧基、C₃-C₁₀环烷基中的至少一种。

2.根据权利要求1所述的三并环化合物，其特征在于，所述三并环化合物具有如下式Ⅰa、Ⅰb、Ⅰc所示任意一种结构式：

其中，R₁选自H、CH₃；

环A选自6-10元芳环或6-10元杂芳基，所述环A被一个或多个R_a取代，其中，R_a选自H、卤素、-CN、-OH、-NH₂、C_l-C₆烷基、C_l-C₆烷氧基、C₃-C₁₀环烷基中的至少一种；

环B选自6-10元芳环或6-10元杂芳基，所述环B被一个或多个R_b取代，其中，R_b选自H、卤素、-CN、-OH、-NH₂中的至少一种；

环C选自4-6元芳环或4-6元杂芳基，所述环C被一个或多个R_c取代，其中，R_c选自H、卤素、-CN、-CF₃、C_l-C₆烷基、C_l-C₆烷氧基、C₃-C₁₀环烷基中的至少一种。

3.根据权利要求2所述的三并环化合物，其特征在于，所述三并环化合物具有如下式Ⅰa、Ⅰb、Ⅰc所示任意一种结构式：

其中，R₁选自H、CH₃；

X₁、X₂各自独立地选自CH或N；

R_a选自C_l-C₆烷基、C_l-C₆烷氧基、C₃-C₁₀环烷基中的至少一种；

R_b选自H或F；

R_c选自C_l-C₆烷基、C_l-C₆烷氧基、C₃-C₁₀环烷基中的至少一种。

4.根据权利要求3所述的三并环化合物，其特征在于，所述三并环化合物具有如下式1-12化合物所示任意一种结构式：

5.权利要求1-4任一项所述的三并环化合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

利用氨基乙酸乙酯盐酸盐与取代醛基化合物发生还原氨化反应生成中间体2，中间体2和2,4-二氯-5-硝基嘧啶发生亲核取代反应生成中间体3，中间体3在铁粉和醋酸的作用下发生闭环反应生成中间体4，中间体4在五硫化二磷的作用下生成中间体5，中间体5与氨基化合物反应生成中间体6，中间体6与取代硼酸发生偶联反应，生成所述三并环化合物。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述还原氨化反应的反应温度为0-4℃，反应时间为1-3小时。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述氨基化合物包括氨基乙二醛二甲酯、酰肼、肼甲酸乙酯中的至少一种。

8.权利要求1-4任一项所述的三并环化合物在制备预防和/或治疗与USP1相关的疾病药物中的应用。

9.一种预防和/或治疗与USP1相关的疾病药物，其特征在于，包括权利要求1-4任一项所述的三并环化合物。

10.一种USP1抑制剂，其特征在于，包括权利要求1-4任一项所述的三并环化合物。